Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики и сероэпидемиологических исследований кори

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики и сероэпидемиологических исследований кори"

Ахадення недичинских наук СССР Институт поллониелита и вирусных энцефалитов

на правах рукописи

ведунова Светлана Леонардовна

разработка иикукофернентных тест-систем для диагностики и серсэпидшио/югкческих исследований КОРИ

( 03. 00. Об - ВИРУСОЛОГИЯ )

Автореферат диссертатаи на соискание ученой степени кандидата биологииских наук

Москва - 1991

Работа виполнена в Научно-исслэдовательском институте вирус1шх препаратов АНН СССР.

научный руководитель:

доктор медицинских наук н. н. мальцева

официальные оппоненты:

ведущее учреждение:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник М.Б.Королев

доктор биологических наук Н.Т.Тихонова

Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов ЫЗ СССР

зашита состоится "-¿^¿С^^/ЗА^-__199/г. в /Стасов

на заседании специализированного совета при институте полиониели и вируспых энцефалитов АНН СССР (142784 Московская область. Почтовое отделение - Институт полиомиелита).

с диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке института полиомиелита и вирусных энцефалитов анн ссср.

Автореферат разослан " JZ&"199/ г.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

О. А. недведкина

Ц/

ОБИЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активно проходящая кампания ликвидации шилемической кори в рамках расширенной Программы имнунизапии. разра->отаниой Всемирной организацией здравоохранения, требует осуществления юстоянного надзора за эпидситузнией в отношении этой инфекции с по-юшью современных экспресс-методов, доступных в каждоп практической 1або?атории. Анализ заболеваености по клиническим и серологическин каннкм. проводимый в последние годы, показал, что в странах, осушест-!ляюших массовую ваккинопрофилактику кори, неняэтся характер клини-(еского течения болезни (возрастает процент легких, стертых Форн. а :акже тяжелых случаев, нередко с летальный исходом) и происходит :двиг пика заболеваености на более старшие возрастные группы, это выдает значительные трудности при диагностике кори и ее дифференциа-1ии от других э'оантекных заболевания, что также заставляет проводить >азработку современных серологических нетодов.

до настоящего времени в нашей стране широко используется реакция •орможения гемагглютинапии (РТГА). а в последние годы для этих целей :тая использоваться отечественный диагностику» для реакции непрянок "емагглютинапии (РИГА). Несмотря на высокую чувствительность и спе-щфичность. ни один из этих нетодов не отвечает современным требова-[иям по ряду критериев, так, для РТГА необходимы эритроциты обезьян, [едоступные практическим лабораториям, а РИГА имеет ограничения при ^агностических исследованиях, т. к. выявляет преимущественно поздние дтитела. кроме того, оба метода характеризуются некоторым субьекти-(ИЗ:?он в опенке результатов и для них необходима предварительная об-■аботка сывороток, что ограничивает возможности их использования для • ироких серо?пидемиологических исследования.

В связи с вышеизложенный постоянно идут поиски более чувстви-■ельных. специфичных, воспроизводимых, быстрых, а главное, стандарт-ых и поддающихся автоматизации нетодов диагностики кори и проведе-

3.

ния эпидемиологических исследований при этой инФектаи. Всей этан Т1 бованиян отвечает имнукоферментный анализ (ИФА). разработанный в на чале 70-х годов, одним из существенных пгеинупеств ИФА перед другю' методами является возможность без проведения какой-либо обработки с вороток выявлять специфические протиговирусные иммуноглобулина клас и. что открывает новые перспективы для проведения экспресс-диагксст ки кори. В последнее вреня за рубежом большое внимание уделяется рэ работке различных вариантов КФА для выявления противокоревых антите однако отечественные аналоги таких имнуноферментных тест-систем от сутствуот. Указанные причины делают конструирование инмунофернентнк тест-систем для диагностических и сероэпидениологических исследован ксри весьма актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы были:

1. Разработка иммунофернентной тест-системы для выявления антител вирусу кори. Для достижения этой дели необходимо было решить еле дуглме задачи: определить методику приготовления твердофазного и иуносорбентг и отработать оптиналькые условия постановки ифа; ус танозить пригодность и стабильность ряда ингредиентов (твердофаз ных носителей - нккротитроваяьных пластин, пероксидаэкых коньюга тов. индикаторного и других необходимых растворов), определить чувствительность, специфичность, воспроизводимость разработанной тест-системы в сравнении с другими серологическими метгаами и аа логичными зарубежными системами.

2. Разработка отечественной иммунофернентной тест-ситены для вкявле ния 18И антител к вирусу корк для экспресс-диагностики этой инФе; ции. Для этого нужно было определить условия создания твердоФазк-го имкунг.сорбента. получить и отобрать коноклональные антител (МкаТ). пригодные для эффективного выявления 1еН антител, пригож нить и оценить пероксидазяые коньюгаты на основе различных сроти вокоревых НкАТ. отработать способы получения антигенов вируса ко

ри. определить оптимальные условия постановки ИФА. изучить в сравнительных исследованиях различные варианты иннунофернентныя тест-систем для выявления igfí антител.

Научная новизна. Впервые проведено вкрокое сравнительное изу->ние различных антигенных препаратов вируса кори с целью создания «унофернентной тест-системы для выявления противокорезых антител. :тановлено преимущество нативнкх инФипированных вирусом кори клеток ?го для получения твердофазного иннуноссрбента. Высокая чувствитель-эсть инмуноФерментной тест-системы для выявления антител к вирусу эри. по которой она не отличается от тест-системы аналогичной налра-аенностн производства фнрны Behring-werKe (фрг). достигается полной ахразгкостью антигенных детернинант вируса, которые экспрессируются а поверхности клетки и играют решающую роль в иммуногенезе, высокая пепиФичность тест-системы определяется включением в качестве контро-я исследования сывороток с антигеном незараженных клеток Vero, обра-отанных аналогично вируснону антигену, что позволяет исключить полу-ение ложно яоложительных результатов при связывании антител сыворо-ок с неспепиФическини белкани клеток. Определены обпие принципы оп-инкзапии ифа: показано, что чувствительность и специфичность инмуно-ерментной тест-систены зависит не только от специфических биологи-еских Факторов (степень очистки и свойства антигенов, сорбированных а твердой Фазе, качества пероксндазных коньюгатов и ряда других!, но : от системы учета результатов и правильно выбранного разведения ис-ледуекых сывороток.

Впервые в нашей стране получена панель ккАТ. направленных к ген-¿тлстинину (ГА) вируса кори, с помощью конкурентного ИФА установлено. iTo на молекуле ГА имеются, по крайней мере, три неперекрывающихся штигенных сайта.

для экспресс-диагностики кори впервые сконструированы и изучены i строго контролируемых условиях три варианта иинуноферментяых тест-:истем для выявления внрусспецифических иммуноглобулинов Н: два из

них основаны на варианте "захвата" ИФЛ. и отличаются друг от.друг, детекторной системой, а один - на непрямой варианте ИФЛ с использов; ниен антигенного ккнуносорбента и антител к иммуноглобулинам н человека, меченых пероксидазоя. показано, что для первого варианта ИФ> могут быть с успехом использованы 3 из полученных нами нкат. направленных к различным антигенным детернинантан ГА вируса кори. Специфи* ность зточ тест-системы может быть значительно повышена при использ« вании очищенного вируса кори по сравнению с лизатнын антигеном и koi центрированным неочищенным вирусом, для создания второго варианта и< на основе нечекых пероксидазоя антигенов вируса кори установлено пр< имущество использования нуклеокапсидного антигена в качестве коныог; та для детекции iím антител, что доказывает ведущую роль нуклеокап-сидных белков в иммуногенезе на раннем этапе инфекции, в третьем непрямом варианте ИФА показана возможность использования антигенноп иинуносорбента на основе нативных зараженных вирусом кори клетм vero. На большом полевом материале установлено, что оба варианта *з< хвата" по чувствительности и специфичности не отличались друг от дрз га и значительно превосходили непрямой вариант ИФЛ.

Практическая ценность, впервые в нашей стране разработана рентабельная технология изготовления иммунофернентной тест-системы для выявления антител к вирусу кори, система изучена на 5456 сыворотках людей различных контингентов. Показано, что чувствительность ее составляет 10 + 5 нг. специфичность - 100 г.. натериалы исследования лег ли в основу нормативно-технической документации на тест-систему иммз ноферментную для выявления антител к вирусу кори: Технического задания на научно-техническую разработку, инструкции по изготовлению и контролю, инструкции по применению. Временной Фармакопейной статьи (ВФС). пояснительной записки к ВФС и экспериментально-производственного регламента. Иниуноферментная тест-система для выявления антите; к вирусу кори прошла комиссионные испытания, рекомендовано ее внедр< ние в практику.

Впервые в нашей стране разработана технология получения имнуно-^ернентеой тест-скстекн адя busгвдешш 1еП антител к виргсг коря из ?снове вирусспедиФических ноноклональных антител, при исследовании на ■>тся тест-системе 716 сывороток больных корье людей показана ее высосал чувствительность к специфичность. Составлена норнатавно-техничес-<ая документация на тест-систему инмуноферментную для выявления иммуноглобулинов N к вирусу кори на основе вирусспедиФических монокло-¿альша антител: Инструкция по изготовлению и контролю и инструкция ю применению, утвержденные на 'Ученом совете ниивп АМН СССР «протокол г 1 от 24.01. 19911. На этот препарат полгчены положительные отзывы из ряда практических учреждений здравоохранения (инфекционная больница i з г. Москвы, нниизй им. г. н. Габричевского Минздрава рсфср. городская ;эс г.Москвы). Получено авторское свидетельство на изобретение "Втанн гибридных клеток кышеп £Миз Kuscuii.3) ВК-93. 2. используемый для водг-ченкя ноноклональных антител к генагглютинину вируса кори (Л-16)".

публикация результатов исследования и апробация работы. По тепе диссертации опубликовано 16 печатных работ. Материалы н основные результата работы аологезы кг республиканской конференции "Актуальные вопросы этиологии, патогенеза, диагностики, эпидемиологии и профилактики зирускых инфекпия" (г.Одесса. 19«с г. ). на проблемной комиссии "Корь, краснуха, паротит" !г. Москва. 1936 г.), на региональном сенина ре пс применению кфа а диагностике вирусных инфекция (Г. Петрозаводск, J 983 г.). на Всесоюзной конференции "Современные направления создания ьедкшшск-лх дяагностикуксв* (г. Москва. 1988 г.). диссертация апробирована на конференции киява АМН ссс? 14 ноября 1990 г.

Обьен и структура работы, диссертация изложена на г01 странице напкноыигного текста, включая иллюстрации (18 рисунков и 35 таблиц). Она состоит из следгахих разделов: введение, обзор литературы (3 главы), ргзультаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы включает зп источников. из которых 270 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении исследований использовали вирус кори штанм Л-16 который выращивали на перевиваемой культуре клеток vero или первичной культуре клеток анбрионов японских перепелов, в процессе работы использовали различные вирусологические, биохимические, иммунологические и серологические методы исследования, среди которых: аффинная хроматография, анализ белков в ПААГ. имкунсблоттинг, коньюгиро-вание иммуноглобулинов и антигенов с пероксидазой, твердофазный ин-иуноферментный анализ, реакция нейтрализации, реакция тормохения ге) агглютинации, реакция непрямой генагглютинадяи, инмуноФлюоресцешшя. получение- коноклональных антител и поликлокзльных сывороток хивотшд статистическую обработку ре'-'льтатов исследований проводили по о fie-принятии методам (Каминский л. с.. 1959. Рокицкий н. ф.. 1961 г.. Ла-• кин г. . 1973 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ

i. разработка иимуноФернентной тест-систены для выявления антител к вирусу кори

С целы) выбора оптимального способа получения антигена вируса кори для сорбции на твердой Фазе были получены и оценены следующие препараты вируса: очинённый с покоеыэ градиента плотности сахарозы (OBI. концентрированные путек ультрацентркфугкрования (VU) или при добазлении полиэтиленгликоля с н. в. 6000 (ПЭГ;. выделенный после разрушения инфицированных клеток ультразвуком (УЭ). а такхе использовал нативные зараженные вирусом кори клетки vero, пассивно сорбированные в лунках пластин ШСК). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

сравнение икнуносорбентов. подученных яа основе различных антигенных препаратов вируса кори

сорбируемые Концентрация Титры сывороток Величиналоп значение антигены по белку ♦ - в сыворотках ОПср в

нкг/лунку ♦(!: 100) -а: 10) КХ

УЦ 30 ■ ■ 32 800 <10 0. 66 0. 08 0. 11

УЗ 15 • • 50 400 <10 0. 6Т 0. 09 0. 12

ПЭГ 35 ■ • 38 1600 <10 0. 95 0. 04 0. 14

ПСК 35 ■ - 40 3200 <10 1. 23 0. 05 0. 08

ОВ 3 • - 5 3200 <10 1. 29 0, 03 0. 06

Тктрн антител даны в величинах, обратных разведению. КК-контроль кокьпгата. (+) и (-) - положительная и отрицательная сыворотки. АОП - разность ОП при реакции сывороток с вируснын и контрольным энтигена.чи.

Наивысшие показатели оптической плотности (ОШ для положительной контрольной сыворотки при минимальных показателях ОП для отрицательной сыворотки наблюдались на инмуносорбентах с ОВ и ПСХ антигенами. По чувствительности эти инмуносорбенты практически не отличались, однако способ приготовления ПСК антигена был значительно проше к рентабельнее. поэтону он был использован для дальнейшей работы.

Применение антигена нативных. зараженных вирусом кори клеток было обосновано, т. к. известно, что на поверхности шгтактных клеток представлены все антигенные детернинанты вируса, к который идет наработка антител, играющих ключевую роль в иммуногенезе. С целью исключения ложно положительных результатов, связазяых с присутствием з препаратах клеточных белков, в систему был включен контрольный антиген незасаженных клеток Vero, который готовили аналогично вирусному.

в последующем были отработаны условия, которые бы обеспечивали

высокую чувствительность и специфичной имигноФернектноя тест-системы.

4

в повтс-гных опытах было установлено, что сорбпия г г № клеток, среди которых не ненее 80 х вируссодержащих, (что контролировали методом инмунофлюореснендии), позволяла выявлять антитела не только з высокотитражных сыворотках, но и в низкотитрахпых. При повышении концентрации клеток в лунках увеличивались фонов?-® значения ОП. сии-

' жение дозы клеток приводило к уменьшению чувствительности реакции.

' При испытании различных полистироловых пластин в качестве тзердо ♦азы было показано, что отечественные пластины не отличались от зару бежных как по величине оп при исследовании положительных и отрицательных сывороток, так и по коэффициенту вариации результатов.

Чувствительность и специфичность иимунофернентных диагностикуно в большой степени зависит от системы учета и интерпретации результатов. Учитывая, что в нашем препарате сыворотки были исследованы с ви русныи и с контрольный антигевани. для калибрования системы была вычислена пороговая величина ОП. разграничивавшая положительные и отри пательные результаты. С этой целью были исследованы 125 сывороток от рицательных в других серологических тестах. Показано, что у большей части сывороток (5Е X) разность оп при реакции с вирусным и с контрольным антигенами (ДОШ была ниже или равна о. а у остальных сывороток - от С. 001 до 0.089. Средняя величина ДЭП с учетом утроенного • значения квадратичного отклонения составила о. 097. что обосновывало правомерность использования в качестве пороговой величины ОП значени 0.1. Использование этой величины позволяло улавливать весь спектр титров противокоревых антител - от минимальных (1:4 в РТГА) до высоких.

Важным Фактором, влияющим на чувствительность системы является выбор разведения иссдедуекых сывороток в серозпидемиологических исследованиях. С этой пелью проводили тестирование группы вакцинирован ных против кори детей в ифа и ртга. Было показано, что титры в ифа были выше, чем в ртга. При этом с повышением титров антител увеличивалась и разница между двуня сравниваемыми тестами, так при титрах антител в ртга 1:4-1:1с различия составляли в основной от 1.5 до 2,5 раз. а яри высоких титрах антигенагглютининов эти различия возрастал до 20-30 раз. Учитывая, что среди вакцинированных против кори детей большой процент обычно составляют низкоактивные сыворотки, для прове

ю.

деиия сероэпидемиологических исследования было выбрано разведение 1:10. Широкие испытания инмуноферментноа тест-системы на 1380 сыворотках для определения иммунного статуса вакцинированных против кори детей параллельно с РТГЛ и/или РИГА доказали правильность выбранных критериев. Установлена корреляция результатов ИФЛ с РТГА (г=0.79) н с РИГА (г-0.56). совпадение положительных и отрицательных результатов с РТГА и РИГА наблюдалось в 97-100 х случаев. Подобные закономерности были отмечены рядон авторов при выявлении противокоревых антител (апе1ег е1 аь . 1963; пехтап е< а1.. 1961: Нешпапп е! а1.. 1985). Полученные отличия (1-3 у.) касались только низких уровней антител в РТГА/РНГЛ и могут быть связаны с неполный удалением ингибиторов в сыворотках для этих тестов. Более существенным Фактором является отсутствие ложно положительных результатов в ИФЛ.

чтобы определить пригодность разработанной кимуноФернентной тест-системы для диагностики кори и выбрать интервал разведения для исследования парных сывороток с целью выявления 4-кратного и более нарастания противокоревых антител, в ИФЛ к в РТГА было обследовано иг больных корью людей в динамике заболевания. Было показано, что клинический диагноз *корь* подтвержден с лоноиью обоих тестов в 98.2 х случаев. V двух больных и. а *) 4-кратное и более нарастание титров антител было выявлено только в ИФА. а в РТГА наблюдалось диво 2-кратное нарастание, либо высокие титры анткгенагглютининов в обоих парта сыворотках (1:1024). средняя величина титров антител к вирусу кори сила выше в ИФА по сравнению с РТГА как в первой, так и во второй парны» сыворотках (в 26 и 38 раз, соответственно). Установлено, что с целью диагностики кори в ИФА сыворотки необходимо было исследовать в интервале разведений 1:100 - 1:"3200 при оптимальном сроке взятия сывороток (1-я через 1-5 дней от начала болезни. 2-я с интервалов т-ю дней). при исследовании на тест-системе сывороток от больных краснухой и другими зкзантеккыки заболеваниями ни в одном случае не было откече-

п.

во ложно положительных результатов. Сравнение ИФ.\ и РИГА для диагнос тики кори пмсазало большую чувствительность ИФА, т. к. в РИГА в 35. в cusopotck больных корью людей ае было выявлено 4-кратного или более нарастания титров противокоревых антител, что может быть связано с преимущественный выявлением в РИГА поздних антител. Дополнительное тестирование зтих сывороток в РТГА подтвердило результаты ИФА.

Основные характеристики иимуноФернентной тест-системы для выявления антител к вирусу кори представлены в таблице 2.

таблиоа г.

Основные характеристики кмнукофермезтной тест-системы для выявления антител к вирусу кори

Основные параметры Результат исследования

Чувствительность ю ± 5 пг/лунку

Специфичность loo х Воспроизводимость

на разных сериях иниунэсорбента CY - i г, 6 г.

в нескольких местах пластины cv = 5,1 *

в различных опытах CV = 26.2 х

Стабильность не менее двух лет.

Чувствительность разработанной инмумоферментной тест-системы была определена ери титровании очищенных методой аффинное хроматограФш препаратов Икат к га вируса кори, она была равна ю ¿ 5 нг, что не уступало чувствительности других иннунофернеатных диагнос тикумов.

специфичность тест-систены для выявления антител к вирусу кори была определена при исследовании кроличьих сывороток, ислученяьж до иккунизапии. гипериннукних кроличьих сывороток к гетерологичвым виру-caí:: краснухи, герпеса простого и осповакпкны. и, кроне того, сывороток людей, не содержащих антител к вирусу хори при тестировании в различите серологических реакциях, а также сывороток больше краснухой иди другими зкзантенными заболеваниями, ни в одной случае se был« получено ложно положительных результатов.

Воспроизводимость препарата оценивали при исследовании контрольх положительных и отрицательных сывороток <36 раз в течение 4 дней), тахже 1в низкотитражных сывороток на разных сериях инмуносорбента и , различных участках одной пластины, во всех случаях коэффициент ва-¡ахши (су) не прельщал ¿о х. что указывает яа хорошую воспроизводись результатов опытов.

стабильность тест-системы определяли при граяешш ее в различных

■нпературных режимах. Показано, что активность препарата не изненя-

о

1сь после 2 дет хранения при температуре <1 с.

В сравнительных исследованиях при тестировании 93 сывороток для 1редедения икнунного статуса и 12 сывороток полученных от больных >рью людей а динамике заболевания было показано, что разработанная шуноферментяая тест-система не уступала по основным критериям одно-щравленному препарату Фирмы ВеЬгшв-иегКе (ФРГ).

г. разработка иммуноФерментных тест-систем для выявления Хви антител к вирусу кори

Второе направление исследований - создание препаратов для экс-ресс-диагностики кори яа основе выявления ранних 1ви антител при кс-педованки одного образца сыворотки от больного. С этой целью были конструированы три различных варианта ЕФЛ - в двух из них (вариантах захвата"I на тг .рдоя Фазе были сорбированы иммуноглобулины к 1вН чв-овека. а выявление образовавшегося комплекса проводили двумя спосо-ани: при последовательном добавлении вирусных антигенов я меченых ероксидазой вирусспециФических Ккат. либо мечеными перохсидаэоЯ вкусными антигенами, в третьем (непрямом) варианте на твердой Фазе выи сорбированы вирусные антигены, а комплекс антиген-антитело выявля-к с помощью коньюгата гзта-ни антител человека с пероксидазой.

Для конструирования одного из вариантов ЕФЛ подучена панель из 9

гибридом продуцирующих Нклт к вирусу кори, показано, что все они в инмуноблоттинге реагировали с белком, тешки иолекулярную кассу 79 и являющимся генагглютининон вируса кори, при постановке конкурента« го варианта ифа с мечеными пероксидазои и немечеными нклт была установлена их специфичность по отношению к трем неперекрывающимся антигенный детерминантам га вируса кори. Полученные нкЛТ были активны в различных серологических реакциях (PH. ртга. иф. ифа) за исключение* одного (ВК-59). которое не имело геиагглютиниргаией активности.

для двух вариантов "захвата* была показана вознохность конструл рования твердофазных иммуносорбевтов на основе отечественных, полученных в нашей институте препаратов Нкат к 1еМ человека и подикпонал ных козьих, которые по чувствительности и специфичности не отличали« от системы на основе аяти-lsr" антител фирмы ОаКо (Дания). Необходимс отметить, что нклт к 1вМ человека имели ряд преииушеств. как в отношении стандартности, так и рентабельности их получения. Так. минимальной концентрацией нклт. при которой удавалось выявлять 1еМ антитела являлась 5 нг/лунку. а для поликлональнса сыворотки необходимо было сорбировать не менее 4 мкг/лунку козьих иди кроличьих антител.

в третьем (непрямом) варианте ифа установлена возможность приме нения в качестве твердофазного инмувосорбента антигенного препарате нативных. зараженных вирусом кори клеток Vero, пассивно сорбироваынь в лунках полистироловых пластин.

для первого варианта ИФА на основе пяти отобранных кклт были пс дучены пероксидазные коньюгаты. в сравнительных исследованиях показа что лишь три из них обеспечивали высокую чувствительность и спепифде ность тест-системы, параллельно с этой хе целью были использован! аффиино очииенные антитела из поликлональной кроличьей сыворотки.

Результаты представлены на рис. 1.

Рис. i. сравнение кояьегатов на основе трех нкат и поли-клональноя сыворотки к вирусу кори в ифа для выявления противокоревых 1ви антител.

как можно видеть, применение кояыогата на основе полкклональиой кроличьей сыворотки сопровождалось высоким несоеоифическим «сном при исследовании как положительных, так и отрицательных сывороток, использование же всех трех коньюгатов на основе икат к вирусу кори давало возможность успешно выявлять специфические антитела класса П у больных корью людей. В качестве антигена в этом варианте ИФА при сравнении препаратов лиэатного антигена, очиаенного и концентрированного с помощью ПЭГ вкусов выл выбран очищенный вирус, обеспечивающий большую чувствительность системы. Чтобы исключить получение ложно положительных реакций, обусловленных качеством сывороток (гемолиз, бактериальное загрязнение и др. ) в систену был включен дополнительный контроль - исследование образцов с нормальным антигеном, полученным аналогично вирусному. Применение специфических Мкат при конструировании тест-системы обеспечивало не только ее высокую чувствительность и специфичность, а также стандартность и рентабельность технологии изготовления. но и позволяло сократить время постановки теста с 4 до £.5 часов за счет совмеиения двух этапов.

^ в качестве критерия, разграничивающего положительные и отгипа-тельные результаты (порогового значения 0П>, была выбрана разность ! показателях ОП при реакции сывороток с вируснык и контрольным антип нами, для ее определения в системе были исследованы 45 сыеороток от здоровых доноров, с учетом Утроенного значения квадратичного отклск! ния пороговая величина ОП составила о, 2. коэффициенты вариации, опр| деленные нзхду разными постановками и на одной пластине не превышал 20 У: что свидетельствовало о хорошея воспроизводимости результатов.

Высокая чувствительность инмуноферментной тест-системы была ус тановлена при исследовании 372 сывороток от больных корью людей с подтвержденной этиодог'ей заболезания. в проведенных эксперимента: показано преимущество разработанной тест-системы для выявления 1вм антител к вирусу кори по ср,__шению с другини методами, как по во: о; ности значительно сократить время исследования для постановки диагн за. так и по количеству лип с подтвержденным диагнозом кори (наприм у 103 человек, у которых сыворотки были получены в поздние сроки за болевания или взяты однократно, выявить 4-кратное нарастание против коревых антител не представлялось возможный, в то жэ время 1еМ анти тела были обнаружены», специфичность разработанной тест-системы для выявления противокорезых антител класса н подтверждена отсутствием ложно положительных результатов при исследовании сывороток больных краснухой, сывороток здоровых доноров с высокими титрами 1к2 антите к вирусу кори и без них. а также сывороток лип с аутоиммунными забо леваяиями. в крови которых были выявлены .знпш/клеарные антитела ил ревматоидный Фактор.

При анализе зависимости выявления ин антител к вирусу кори разработанной тест-систене от стадии заболевания было показано, что 7*е ка второй день после появления клинических признаков можно было обнаружить специфические антитела класса м. Согласно нашим наблюде ниян, к ноненту появления сыпи практически у всех больных в сыворот

:е крови содержались антитела. у 5 больных 1£н антитела к вирусу :ори были выявлены через 37 дней после начала заболевания (последний ток наблюдения).

При конструировании второго варианта ИФА сравнивали коньюгаты юлучеккыг при нетке персксидазся очипеняого вируса кори, его нухлео-:апсида и лизатного антигена. Параллельно сыворотки были исследованы контрольными антигенами незараженкых клеток, меченых аналогично, езультата представлены на рис. г.

Рис. г. сравнение тест-систем на основе различных антигенных препаратов вируса кори, неченых пероксидазой.

Как видно, использование лизатного антигена не обеспечивало дос-атсчноя чувствительности тест-систекы. При сравнении двух других репаратов установлено, что возможно использование обоих, но большую увствительность систены обеспечивает коньюгат на основе нуклеокап-ндногс вирусного антигена, который и был использован для создания гст-системы. В последующих опытах были отработаны основные этапы по-гановки ИФА. Установлено, что исследование сывороток в разведении :too с г-часовык периодом инкубашш и последующая детекдия образо-

вавшегося комплекса нуклеокапсидяын пероксидазнын коньюгатои в тече о

ние 16-20 часов при 4 С позволяет получить достоверные результаты даже при исследовании сывороток взятых в первые два дня после начала заболевания^ когда содержание 1вМ антител невелико, при тестир! вании группы сывороток, не содержащих специфических антител класса 1 была определена пороговая величина оп системы, равная о, г. Исзользо ванне полученных критериев позволяло эффективно выявлять противокор* вые Ich антитела в сыворотках больных корью людей. При исследовании 204 образцов, взятых в различные сроки заболевания у людей этой грэт пы. положительные результаты баля выявлены в ico х случаев. В контрольной группе сывороток от больных краснухой, аутоннкунныкм заболеваниями и здоровых доноров положительные результаты отсутствовали.

В дальнейшем было провалено сравнительное испытание трех вариа] тов икнунофериентных тест-систеи для выявления IsH антител к вирусу - кори. Результаты представлены з таблице 3.

Таблица 5.

Сл

Исследование сывороток в трех вариантах кммуноферментшд тест-систеи дли выявления 1вп антител к вирусу корк

Тест-система с использованием коньюга-та ва основе Выявлены 1йН антитела к вирусу хори в сыворотках

больных здоровых • доноров

корью краснухой аутоиннунными заболеваниями

йкат к вирусу кори 140/140 0/59 0/33 0/41 0/9

нуклеокапсида вируса кори Í4C/Í4G 0/5? 0/33 0/41 0/9

антк-lsK человека 138/140 0/39 18/33 0/41 0/9

(♦) - сыворотки, содержание líg антитела к зкрусу корн; (-1 - сыворотки, не содержащие яротивокоревых антител.

как ножно видеть, по чувствительности три зарианта инмунофер

иентвых тест-систем отличались незначительно: в группе больных керы

слей противокоревые ieíi антитела в двух вариантах 'захвата" били вы-влены в юо х случаев, а в непрямом варианте ИФА в 96. б х случаев (2 бразда, полученных на ранней стадии болезни, дали здесь отрицательный езультат). Специфичность же иммунофернентных тест-систем была раз-ичной, что установлено при исследовании сывороток больных аутоинмтв-ыни заболеваниями. Бели в первых двух вариантах не было выявлено ни дного ложно положительного результата, то в непрямом варианте йФА в 3 из 33 исследуемых сывороток этой группы были получены лохно поло-ительные результаты, таким образом показано, что оба варианта "зах-ата" обладают преимуществом перед непрямым вариантом ИФА. что выра-ается в большей чувствительности и специфичности, оценивая два раз-асотаяных варианта "захвата" нежду собой, необходимо отметить, что о основным показателяя они не отличались друг от друга, однако вари-лт. основанный ла использовании НкАТ к вирусу кори, требует для по-[учения ответа меньше вренени.

ВЫВОДЫ

. впервые разработана и внедрена в практику отечественная высокочувствительная. специфичная и воспроизводимая иннуноФерментная тест-система для выявления антител к вирусу кори, не уступающая по основным показателям однонаправленному препарату фирмы Behrlns-verne (ФРГ), пригодная для сероэпидениологических и диагностических исследований при кори. 1. отработаны условия приготовления твегюфазяого иммуносорбента и всех этапов постановки теста. В результате сравнения 5 антигенных препаратов вируса кори, подученных разными методами очистки и концентрации. установлено, что использование только двух из них (очинённого вируса и натизных зараженных вирусом клеток Vero) обеспечивает получение высокочувствительной, специфичной и воспроизводимой иммуноФернентной тест-системы для выявления антител к вирусу кори. Учитывая простоту, экономичность и рентабельность получения ;

нативных зараженных вирусом кори клеток vero, этот антиген реко мендован для конструирования твердофазного инмуносорбента.

3. Установлена корреляция результатов при исследовании гзсю сыворо ток от вакцинированных против кори детей параллельно в ИФЛ и в р и/или РИГА <г=0,79 к г=0,56, соответственно), совпадение результ тов тестов получено в 99,4 (с РТГА) и в 97.4 у. (с РИГА).

4. Получена и охарактеризована оригинальная панель из 5 ноноклокаль ных антител (МкАТ) к генагглютинину вируса кори, относящихся классу G. на основе трех из них приготовлены высокоактивные и сп цкФичные пероксидазкые коньюгаты.

5. Разработана и внедрена в практику чувствительная, специфичная и воспроизводимая иммуноферментная тест-система для выявления 18] антител к вирусу кори с использованием вирусспецифических Мкат, меченых пероксидазой. оптимизированы условия изготовления, контр ля и применения всех компонентов тест-системы на основе МкАТ. Пр: конструировании диагностики« показано преимущество использовани очищенного вируса кори по сравнению с лизатным антигеном и неочи шенныи концентрированным вирусом. Установлено, что детекторная система на основе вирусспедифических Нкат позволяет не только по высить чувствительность и специфичность теста по сравнению с пре паратом, основанном на поликлональной сыворотке, но и сократить время исследования.

6. сконструирована иин/нофернентная тест-система для выявления ieM антител к вирусу кори на основе неченых пероксидазой антигенов в руса корн, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью воспроизводимостью. Б сравнительных исследованиях установлено пр имущество нуклеокапсидного антигена вируса кори, по сравнению с очишеннын вирусом и лизатным антигеном.

список работ, опубликованных по тене диссертации:

1. Ведунова с. л., Мальцева И. Н.. Решетникова В. И. Сравнительно? изучение иммунофериентных тест-систем для быстрого выявления антител < вирусу кори. // Вопр. вирусол. - 1986. - Я С. - С. 752 - 755.

2. Ведукова с. л.. карих л. П. Изучение корреляции титров антител к зирусу кори методами ифа и ртга. // х. никробиол., эпидемиол. и ин-^УHOбиoлoгmI. - 1937. • К 6. - С. 83 - 91.

3. ведукова с. л. Быстрый серологический скрининг сывороток людей за наличие антител к вирусу кори в твердофазном имнунофернентнон ана-пизе. // X. микробнол. . эпидемиол. и иммунобиологии. - 1987. - л 9. -

:. 81 - 85.

1. Костиков м. п.. ведунова с. л.. садыкова д. к. сравнительная опенка в РИГА и ИФА показателей коревого иммунитета у детей привитых 1KB. '/ Нед. реферат, журн. - 1988. - К 8. - публ. 3057.

5. ведунова с. л. использование ифа для диагностики и серозпидеми-элогии ко^и. // В. сб. : "Иммунопрофилактика детских болезней". -•кЛма-Ата, 1988. - с. 52 - 57.

6. Ведунова с. л., Нагиева Ф. г.. Никулина в. Г.. нальцева Н. Н.. Борисова т. К., Маклаков А. и. Имнуноферментная тест-система для выявле-яия 1вМ антител к вирусу кори на основе ионоклональных антител. //

В сб. : "Современные направления создания медицинских диагносткунов" - М. . 1988. - С. 32.

7. Анджапаридзе о. г.. Нагиева Ф. г.. Мальцева Н. Н. . Ведунова С. л. . Зпонарев А. ю.. Краснова Н. И.. Никулина в. Г. ■ Кузнецова Е. И.. Баркова Е. П.. Ходарозская Е. Г. . зткинд Г. В. Получение и свойства гибридом. продуцирующих моноклональные антитела к вирусу кори Ленинград-16. // вопр. вирусол. - 1989.- Н 2. - С. 204 - 208.

8. жаров с. Н.. красавцев Е. Л., Ведунова С. Л.. Лучшев В. И., Сайки Б. И.. Шукуров а. Д. . ЛУбова В. В.. слеппов а. а. ИнмуноФерненткыя анализ в диагностике кори у взрослых. // В сб. : "Новое в лабораторной пиагностике солезней внутренних органов (в раннем и восстановитель-яом периоде болезни)*. - Ворошиловград. 1989.- С. 512 - 513.

9. харов С. н., санин Б. и.. Лучшее в. и. , Силина а. г.. Ведунова с. Л.. Змельченко в. с., Яковлева а. а. Динамика Формирования иммунного ответа при кори у взрослых. // 3 сб. :"факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных Физиологических и патологических состояниях. " - Челябинск. 1990. - С. 53 - 54.

ю. жаров с. н.. Лучше в В. И.. Санин Б. И.. Мальцева н. Н. > Ведунова с. Л., Яковлев а. а. Особенности гуморального иммунитета при кори у

взрослого городского населения. // в сб. : "Влияние факторов внепн среды на реактивность оргаяизиа". - Ккев-шродяяовград. 1990. - С. z

и. Анджапаридзе о. г.. Нагиева Ф. г.. Мальцева H.H.. Ведунова С. Звонарев А. Ю., Краснова Н. И.. Никулина В. Г. . Баркова Е. П., Эткинд Г. Кузнецова Е. И.. Ходоровская Е. Г. штанн гибридных клеток животных М musculls. используемый для получения моноклональных антител к гена глютинйну вируса кори. // Авторское свидетельство на изобретение К 1518369.- Приоритет 19.10.1989.

1г. "edunova s. L.. HiKheeva I.V., Maitseva H.H. Enzrae lmupoas say - a method of serological survey of measles vaccination. // Ac Virol. - 1990.- V. 34.- К 1. - P. 95 - 98.

13. Ведунова с. л.. Мальцева H.H. экспресс-диагностика кори с по мошью имкуноферненткого анализа на основе неченых пероксидазой вир: ных антигенов. // I. микробиол. . эпидемиол. и иммунобиологии. - 199! - Н 8. - С. тч - 7S.

14. Ведунова С. Л.. Мальцева H.H.. Раппопорт И. С. новые препарап для диагностических и сероэпидемиологических исследования ври кори. // В сб. : "Вопросы эпидемиологии, иммунологии, диагностики вкруснш инфекций". - Свердловск. 1990. - с. 83 - 87.

15. Нагиева Ф. Г.. Краснова Н. И.. Никулина В. Г., Мальцева н. Н.. Ведунова с. л.. Юнинова Н. В. иммуноферментная тест-система на ochoi вируса кори, полученного при культизировании клеток на никроносите; цитолар-г. // Вопр. вирусол. - 1991. - N 4. - с. 334 - ЗЗЬ.

Подписано к печати 10.10.91 г. Заказ № 141. Тираж 100 экз.

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР