Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная)

Лаврова, Наталия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная)
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная)"

На правах рукописи

Лаврова Наталия Владимировна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ РАСТЕНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ (ГАПЛОИДНАЯ) И ОГУРЦА (МЕРИСТЕМНАЯ, КАЛЛУСНАЯ И МИКРОСПОРОГЕННАЯ)

03.00.23. - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант - доктор биологических наук, академик РАСХН, B.C. Шевелуха

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

З.Б. Шамина

доктор биологических наук, Т.И. Дьячук

доктор биологических наук, А.К. Гапоненко

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита диссертации состоится ¿£,6_октября 2006 года в

часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва И-550, ул.Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «¿Z-JL » сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.И. Карлов

ZLooG fr

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Основной целью селекционных программ является повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание новых сортов и гибридов, обладающих улучшенными качествами продукта, комплексной устойчивостью к болезням, вредителям и стрессовым факторам среды, менее требовательных к условиям возделывания соответствующих регионов страны.

Важнейшей задачей селекции по-прежнему остается сокращение сроков создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Создание их традиционными методами требует длительного времени и значительно больших затрат. Так, для получения одного районированного сорта озимой пшеницы, селекционеру Д.Л.Рудзинскому пришлось проработать сотни гибридных комбинаций и изучить десятки тысяч селекционных номеров, на что потребовалось 10 лет работы (Б.И.Сандухадзе, М.И.Рыбакова, З.А.Морозова,2003). Современные уровень и темпы развития сельскохозяйственного производства диктуют поиск новых путей не только в селекции, но и в первичном и промышленном семеноводстве.

Из семейства Мятликовых (Роасеае) в структуре зерновых площадей России наиболее распространена пшеница (Triticum L.). Из сем. Тыквенных (Cucurbitaceae) - огурец. Посевы огурца и зерновых культур на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются грибными болезнями. Среди них наиболее вредоносными являются фузариозные корневые гнили, септориоз и склеротиния, на огромных площадях поражающие посевы зерновых культур, в том числе озимой пшеницы и наносящие ущерб на сумму около 5 млрд. долларов (Сидоров A.A., 2001).

Несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции озимой пшеницы на устойчивость к болезням, до сих пор не удалось вывести сортов или гибридов этой культуры, высокоустойчивых к фузариозным корневым гнилям. Использование генетических исследований и нетрадиционных методов селекции могут обеспечить решение этой задачи (Chepra,1996).

Большой теоретический и практический интерес для селекции представляет использование гаплоидии. Для получения гаплоидов методами биотехнологии в культуре in vitro злаковых применяют: метод «бульбозум» (В.Н. Чистякова,2000), культивирование изолированных пыльников и микроспор - андрогенез in vitro (Batygina, Vasilyeva, 2003), андроклиния (Хохлов, 1976) - при этом растения образуются двумя путями - путем эмбриоидогенеза в пыльцевых зернах и через образование каллуса из клеток пыльника; культивирование неоплодотворенных завязей и семяпочек

1'ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ' 3 БИБЛИОТЕКА

С.-Петербург ОЭ 2«0<W?O2.

(В.Ы.Чистякова, Э.Д. Неттевич, Г.В. Гуляев, 1994). Диплоидизация гаплоидов, получаемых на основе F1, сокращает сроки создания гомозиготных линий до 12 лет (В.Н. Чистякова, 2000). Быстрое создание гомозигот, обладающих комплексной устойчивостью к корневым гнилям и септориозу, позволяет опережать формообразовательный процесс в популяциях этих патогенов, что особенно важно при работе с озимыми, двулетними и многолетними культурами. Культивирование генеративных структур in vitro, в частности пыльника, напрямую связано с решением проблем морфогенеза, которые зависят от внутренних и внешних факторов. Для изучения андрогенеза in vitro и его использования в селекции озимой мягкой пшеницы необходима разработка теоретических и практических основ культивирования генеративных структур in vitro и, в первую очередь, изучение проблем эмбриоидогенеза пыльника, выявление критических периодов его развития, связанных с переключением программы с гаметофитного пути на спорофитный и образованием гаплоидных растений-регенерантов.

На основе дигаплоидов, полученных методом культуры пыльников, в Китае создана серия новых сортов яровой пшеницы и риса (Zhao et al., 1990), а во Франции зарегистрирован новый сорт пшеницы Florin (De Buyser Y,Henry Y. et al.). В России создан сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (Kusmenko,Dj.atchouk, 1997). Проблеме получения гаплоидов зерновых злаков посвящено множество экспериментальных работ, обзорных статей и монографий (Бутенко Р.Г.,1975; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук,1989; Pauk, 1996 и др.). Однако, несмотря на определенные успехи метода культуры пыльников, пока не создано сортов озимой мягкой пшеницы. Это связано с тем, чю до нас тоящего времени не разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников различных генотипов зерновых культур, нет воспроизводимых составов индукционных сред, не решены проблемы регенерации, альбинизма и др.

Обзор нерешенных методологических проблем по вопросу культивирования in vitro пыльников и микроспор яровой мягкой пшеницы четко определил для нас фаницы изучения проблемы андрогенеза in vitro в селекции озимой пшеницы, имеющей большое народнохозяйственное значение в Центральном Нечерноземье. Применение классических методов получения исходного материала для селекции этой культуры пока не дали необходимого результата.

Цель и задачи исследований

Цель наших исследований заключалась в обобщении теоретических и разработке прикладных аспектов применения гаплоидной биотехнологии на основе метода культивирования пыльников и микроспор, изучения особенностей андрогенеза in vitro сортов озимой пшеницы селекции НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область), обладающих повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

Работа с огурцом предполагала разработку и применение меристемной, каллусной и микроспорогенной биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений, отобранных на фильтратах культуральной жидкости (КФ) гриба Fusarium sp. и токсине Т-2 из Fusarium sp.

В процессе реализации поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Разработать биотехнологию получения андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы.

2. Изучить возможности морфогенеза в культуре эмбриоидов и каллусных тканей мягкой пшеницы с озимым типом развития на основе собственных разработок.

3. Оценить влияние внутренних и внешних факторов, способствующих повышению уровня выхода гаплопродукции в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы.

4. Изучить взаимовлияние органических добавок и ацетона в составе жидких и агаризованных питательных сред на выход гаплопродукции в процессе андрогенеза in vitro озимой пшеницы.

5. Выявить факторы, положительно влияющие на теплопродукцию озимой пшеницы и определить лимитирующие, затрудняющие процесс выхода зеленых регенерантов в культуре изолированных пыльников и микроспор.

6. Провести цитологический мониторинг этапов андрогенеза in vitro озимой пшеницы и цитофотометрический анализ ДНК с использованием возможностей светового микроскопа «Opton-15» и цитоспектрофотометра SMP-20 «Opton».

7. Разработать гаплоидную и микроспорогенную биотехнологии получения новых форм озимой пшеницы и огурца, отличающихся повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

8. Создать линии удвоенных гаплоидов, устойчивых к фузариозным корневым гнилям с целью использования их в селекционных программах лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка, Московская обл.).

9. Получить семена от устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы и огурца путем искусственного скрещивания и оценить полученное семенное поколение на устойчивость к патогену.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологии получения гаплоидов озимой пшеницы для сортов высокой хозяйственной ценности.

2. Разработка и обоснование технологических аспектов для культуральной системы in vitro: пылышк-микроспора - на основе разработки условий стерилизации эксплантов, подбора компонентов индукционных сред, включая различные виды органических добавок.

3. Экспериментальное подтверждение значимости низкотемпературного стресса и ацетона для массового выхода зеленых регенерантов в культуральной системе пыльник-микроспора.

4. Отработка схем селекции in vitro с использованием токсина патогена фузариозной корневой гнили для отбора каллусирующих гаплоидных структур озимой пшеницы и микроспорогенных тканей огурца.

5. Оценка форм озимой пшеницы и огурца, полученных в культуре in vitro, и передача их производству (лаборатория селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ, п.Немчиновка, Московская обл.; ГУСХП «Высоковский», Костромская обл.).

Научная новизна

пшеницы с озимым типом развития и положительная роль присутствия в среде ацетона. Определены пути морфогенеза и основные факторы, как ускоряющие, так и лимитирующие процесс регенерации зеленых гаплоидов в культуре in vitro. Изучено морфологическое строение каллусных и эмбриоидогенных структур в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы и выявлены новые их типы. В процессе разработки эмбриологических основ андроклинии озимой мягкой пшеницы, установлены четыре типа апертур микроспор, нехарактерных для этой культуры.

Таким образом, впервые предложена технология получения диплоидизированных гаплоидов мягкой пшеницы с озимым типом развития, позволяющая максимально сократить сроки создания чистых гомозиготных линий до 1-го года, что особенно важно для этой культуры в условиях Центрального Нечерноземья.

Предложен экспресс-метод оценки огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастаншо пыльцевых трубок на средах, содержащих токсин гриба Fusarium sp.

Практическая ценность работы.

Разработанные технология создания андрогенных гомозиготных линий и методы тестирования гаплоидных растений озимой пшеницы по характеристикам андрогенеза и устойчивости к грибным болезням использованы в селекционном процессе лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка, Московская обл.) для создания сортов, устойчивых к корневой гнили. В Федеральный институт промышленной собственности поданы заявки на «Технологию (Способ) создания форм мягкой пшеницы с озимым типом развития методами гаплоидной биотехнологии» и «Состав индукционной среды для получения гаплоидных растений озимой мягкой пшеницы». Полученные теоретические и практические разработки по сравнительному влиянию различных органических добавок, включая ацетон, аминокислоты, крахмалы и др., активно используются при чтении лекционного курса по предмету «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» на кафедре хранения, переработки и товароведения продукции растениеводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, а также отражены в 8-ми лабораторно-практических занятиях в разделе «Клеточная биотехиология и биоинженерия» Лабораторного практикума по сельскохозяйственной биотехнологии, изданного коллективом авторов под редакцией зав.кафедрой с/х биотехнологии РГАУ - Московская с/х академия имени К.А. Тимирязева, академика РАСХН B.C. Шевелухи для студентов, бакалавров, магистров и аспирантов агрономических специальностей (Москва, 2004); в разделе

«Микробиотехнология» Тестовых заданий по дисциплине «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» для студентов высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности 311200 (110305) - Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции.

A.c. №1720595 (СССР) на «Способ клонального микроразмножения растений огурца ( Cucumis sativus L.)». Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г. (1991) и методика экспресс-анализа огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастающим на токсичных средах пыльцевым трубкам применяется в селекционной работе ГУСХГ1 «Высоковский» Костромской обл., Костромского р-на для размножения оздоровленного селекционного материала (JI42<$ и Л 292 ) в семеноводстве широкорайонированного для зимних теплиц гибрида Fl Грибовчанка-безвирусная.

Апробация работы

Результаты работы и основные положения диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях факультета Агробизнеса Костромской ГСХА (1999-2003 гг.), Ш-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, октябрь 2004), научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Технологического факультета РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева (Москва, декабрь 2004), on the Third Moskow international Congress: «Biotechnology: state of the art and prospects of development», March, 14-18, 2005), заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева (2003-2006 гг.).

Личный вклад соискателя Разработка программы исследований по докторской диссертации с озимой мягкой пшеницей, се выполнение и использование в селекционном процессе НИИСХ ЦР113 проводились автором во время обучения в очной докторантуре на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии. При оформлении научных публикаций, постановке проблемы диссертации участие автора было определяющим.

Связь работы с крупными научными программами

Диссертационная работа выполнялась в соответствии с утвержденной 24.03.2003 г. темой докторской диссертации и Программой лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРГ13 (Московская область, п.Немчиновка) «Селекция озимой пшеницы в создании форм, устойчивых к болезням».

Автор выражает глубокую и сердечную благодарность: научному консультанту, академику РАСХН, заведующему кафедрой сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н., профессору Виктору Степановичу Шевелухе за постоянное внимание к работе по теме диссертации; академику РАСХН, Президенту союза селекционеров России и зав. лабораторией селекции озимой пшеницы, д. с,-х.наук Баграту Исменовичу Сандухадзе и ст.н.с. этой лаборатории, к.с.-х.н. Бугровой Валентине Васильевне за подбор хозяйственно-ценного селекционного материала озимой пшеницы (семена и растения-доноры) в годы исследований; доктору биологических наук Чистяковой Валентине Николаевне, к сожалению, безвременно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе в 2000 году.

Автор также благодарит коллег, которые принимали участие в обсуждении результатов экспериментов: д.б.н. Каранову Светлану Лаврентьевну (Институт физиологии растений РАН), зав.отделом биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН, д.б.н., профессора МГУ имени М.В. Ломоносова Александра Михайловича Носова; профессора Венского Университета микробиологии и генетики (Австрия), д.б.н. A.A. Тураева; научных сотрудников отделов Болезней зерновых культур и Микологии и иммунитета ВНИИ фитопатологии (п.Голицино, Московская обл.), к.б.н. Коломиец Тамару Михайловну, к.б.н.Санину A.A. и к.б.н. Койду М.А.; профессора факультета биохимии и биотехнологии Университета им. Мартина Лютера (г.Халле, Германия) Юргена Кранца, завлабораторией биотехнологии ВНИИ риса (г.Краснодар), к.б.н. Мухину Ж.М., декана технологического факультета РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, д.б.н., профессора Новикова Николая Николаевича; профессора кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, д.с.-х.н. Пронину Наталию Борисовну; за методическую помощь при микроскопировании - руководителя центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, к.б.н Карлова Геннадия Ильича и ст.н.с. этого центра Андрееву Галину Николаевну, а также всех сотрудников кафедры с.-х. биотехнологии Университета за предоставленную возможность проведения данных исследований.

мой первый научный руководитель и наставник, академик РАСХН и чл,-корреспондент РАН, д.б.н., профессор Раиса Георгиевна Бутенко, безвременно ушедшая от нас в 2004 году.

Публикации. Полученные экспериментальные данные подтверждены 32 печатными работами, из них 2 - в зарубежных изданиях, включая A.c. на изобретение и 2 заявки на единый патент РФ. Учебно-методическая литература представлена 5 изданиями.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературных источников по проблеме, материалы и методы исследования и 5 глав с результатами исследований и обсуждениями. Имеется также заключение, выводы, список цитированной литературы и приложения. Объем основного текста работы составляет 455 страниц, включая 62 рисунка и 50 таблиц. Список использованной литературы включает 420 наименований, в том числе 370 на иностранных языках.

2. Материалы и методы исследований Условия проведения исследований и методики

Эксперименты по культивированию изолированных тканей, клеток, органов мягкой пшеницы и огурца, тестированных на устойчивость к Fusarium, проводились в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии, организованной автором на базе Костромской ГСХА при кафедре агрохимии, почвоведения и защиты растений. Исследования по теме докторской диссертации, включающие создание удвоенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы, отобранных на средах с токсином Fusarium sp., с 2003 по 2006 годы продолжали на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХЛ имени К.А.Тимирязева.

Цитологическая часть исследований выполнялась с использованием возможностей микроскопов МБИ-15 и «Opton»-15. Анализ интерфазных ядер -с помощью цитоспектрофотометра SMP-20 «Opton».

Исходный материал и объекты исследований

Исходными формами для отработки метода культуры изолированных пыльников и микроспор, получения листообразных структур из эмбриогенпой ткани озимой пшеницы, отработки схем клеточной селекции in vitro с токсином фузариевой кислоты, служили растения 5-ти сортов озимой мягкой пшеницы (2п=42): Немчиновская 24, Галина, Инна, Московская 39 и Памяти Федина, подобранные по принципу их селекционной ценности, с контрастной устойчивостью к фузариозной корневой гнили и септориозу. Коллекция изучаемых сортов озимой пшеницы в течение ряда лет исследовалась на скороспелость и приспособленность к условиям Нечерноземной зоны России, а также на устойчивость к грибным болезням, продуктивность, качество зерна и наследование количества белка (Марченкова, Сандухадзе, Чавдарь, 1996), т.е. оценивались те признаки, которые в условиях Центрального Нечерноземья

являются лимитирующими и представляют интерес для селекции (Сандухадзе, Рыбакова, Морозова,2003).

Селекционный материал прошел предварительную оценку на устойчивость к патогенам во ВНИИ фитопатологии, п.Голицино (Московская обл.): слабоустойчивые к корневой гнили сорта: Немчиновская 24 и Галина (контроль); среднеустойчивые - Инна, Память Федина и устойчивый на уровне стандарта сорт Московская 39.

Селекционный материал огурца - селекционные линии Л 42(5 и Л 29$ широкорайонированного для зимних теплиц Грибовчанка любезно предоставлен гл. агрономом ГУСХП «Высоковский», к. с-х. н Долгим Василием Викторовичем.

В качестве объекта исследований в экспериментах по морфогенезу использовали:

1. пыльники, микроспоры и семяпочки, изолированные из стерильных колосьев-доноров озимой мягкой пшеницы в различные фазы онтогенеза растений;

2. меристемы молодых и плодоносящих растений огурца;

3. каллусирующие листовые экспланты стерильных проростков огурца;

4. пыльцу молодых огуречных растений

Схемы экспериментальных исследований Схема исследований в 2003 - 2006 годах включала следующие этапы:

1. Подбор селекционных генотипов озимой мягкой пшеницы (лаборатория селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка);

2. Отбор в поле колосьев с сортов-доноров в фазе выхода в трубку по морфологическим признакам (июнь-июль);

3. Анализ стадии развития микроспоры под микроскопом;

4. Холодовую предобработку колосьев при пониженной положительной температуре +4-7оС в течение 4 - 17 дней (и без холодовой предобработки);

5. Подготовку колосьев к стерилизации;

6. Подбор стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации колосьев;

7. Подбор питательных сред для культивирования эксплантов;

8. Последовательное выделение пыльников, семяпочек и культивирование их на жидких питательных средах для голодания и кондиционирования (совместно с семяпочками);

9. Выделение микроспор в среду центрифугированием;

10.Эксплантирование пыльников, микроспор и семяпочек в темноте при температуре 28-32 оС на жидких и агаризованных питательных средах

для каллусо- и морфогенеза; на средах с токсином фузариевой кислоты, содержащих в своем составе фиколл-400, ацетон, MES и мальтозу;

11.Отбор эмбриоидных структур и дальнейшее культивирование их на средах для регенерации с минеральной основой солей по Гамборгу, Блейдзу, дополненных 20% картофельным экстрактом и ацетоном в объеме 2,5% при температуре 23-25 оС в условиях интенсивного освещения;

12.Цитологический анализ плоидности полученных растений-регенерантов;

13.Яровизацию полученных растений-регенерантов при температуре 2 -4 оС не менее 60 дней, колхицинирование (0,2% раствор колхицина в смеси с 0,03% папаином) и цитологический контроль плоидности.

14.Пересадку регенерантов в почву (подогреваемые теплицы лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ, п.Немчиновка, Московская обл.) для получения семенного материала и внедрения в селекционные программы.

Частный протокол экспериментальной работы с пыльниками и микроспорами озимой пшеницы представлен на рис. 1.

Колосья-доноры анализировали в поле по морфологическим признакам растений-доноров: размер и цвет пыльника, степень плотности чешуй колоса. Указанные морфологические критерии различались в зависимости от селекционного генотипа и метеорологических условий года. Детально стадию развития микроспор анализировали в лаборатории с/х биотехнологии под микроскопом на давленых препаратах по методу Паушевой З.И. (1988).

Стерильные колосья помещали в среду (а не в стерильную воду!), содержащую Уг солей МС без регуляторов роста и выдерживали при пониженных положительных температурах +2-4 оС в течение 0-17 дней, что исключало затраты труда на подрезание подгнивающих стеблей, продлевало жизнеспособность микроспор и их «готовность» к высыпанию на поверхность жидких/агаризованных сред.

Подбор условий стерилизации колосьев в нашем эксперименте (97-100% неинфицированных эксплантов), обеспечил возможность культивирования целых цветков, полностью освободил нас от трудоемкой процедуры вычленения пыльников, исключая механическое их травмирование.

Рис. 1. Протокол получения растений-регенерантов озимой мягкой пшеницы в культуре пыльников и микроспор in vitro

Андроклинные структуры (каллусные, эмбриоидные, глобулярные), через 25-35 дней пересаживали на модифицированные среды для регенерации и культивировали при +9-16 оС, 16-час. фотопериоде и освещенности 20 тыс.лкс до образования растений-регенерантов.

Каллусные культуры выращивали в темноте при температуре 28-33 оС, с периодичностью освещения 16/8 час/сутки и относительной влажностью 80%. Андрогенные новообразования (эмбриоиды и каллусы) для последующего гистологического анализа фиксировали на разных стадиях развития как in vitro, так и in vivo в фиксаторах Чемберлена и FAA (Батыгина и др., 1974). Гаплоидные регенеранты укореняли на агаризованных/жидких средах до образования хорошей корневой системы и яровизировали.

Методы изучения андрогенных каллусирующих структур на устойчивость

к фузариозу

Работу по селекции гаплоидных клеток озимой пшеницы in vitro на устойчивость к фузариозным корневым гнилям вели с чистым токсином фузариевой кислоты, полученным из Института льна (г.Торжок). За основу в работе по созданию устойчивых к фузариозу форм озимой пшеницы была принята методика, разработанная нами в ИФР РАН под руководством чл.-корр. РАН и академика РАСХН Р.Г.Бутенко для семейства тыквенные (Cucurbitaceae) и примененная во ВНИИССОК (Московская обл.) для создания устойчивых к этому патогену сортов и гибридов огурца (Маркова (Лаврова) Н.В., 1990) с использованием токсина Т-2 из Fusarium spp.

Гаплоидные растения-регенеранты, достигшие фазы трех листьев и имеющие хорошо развитую корневую систему, колхицинировали с целью их диплоидизации (5 часов на свету в смеси, состоящей из 0,2% колхицина и 0,03% папаина) и яровизировали не менее 60 дней при t +2 - +4 °С.

Диплоидные растения-регенеранты высаживали в почву. В первые 3-5 дней растения содержали в щадящем температурном и световом режимах. Дальнейшую вегетацию проводили при температуре +17 - +21 оС, 16-часовом фотопериоде и освещенности 20-25 тыс. люкс в условиях подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ (п. Нсмчиновка, Московская обл.).

Особенности техники in vitro и условия выращивания эксплантов селекционных линий огурца, а также методы оценки интенсивности роста регенератов в селекции огурца in vitro на устойчивость к фузариозу, приведены в А,С. №1720595 (СССР) на Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.). Маркова (Лаврова) Н.В., БутенкоР.Г. (1991).

Цитологические методы исследовании

Для цитоэмбриологических исследований отбирали генеративные органы (пыльники, микроспоры) озимой пшеницы непосредственно перед введением их в культуру in vitro, развивающиеся в культуре in vitro, анализировали также андроклинные структуры (эмбриоиды, глобулы, каллусные ткани), зиготические зародыши и полученные из них растения-регенеранты. Для фиксации культивируемых пыльников мягкой озимой пшеницы и образующихся морфогенных структур использовали фиксаторы Чемберлена и FAA (Батыгина с соавт., 1974).

Методика для окрашивания веретена деления любезно предоставлена д.б.н. В.Н.Чистяковой (неопубликованные данные).

Полученные временные давленые препараты просматривали при помощи микроскопа МБИ-15 при увеличении объекта в 25х, 63х и под масляной иммерсией 100х при зеленом светофильтре.

Цитофотомстрия ДНК

Анализ интерфазных ядер в корнях через 72 часа от начала замачивания проводили методом цитофотометрии ДНК. После фиксации корня в смеси этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 3 час., зону корневой меристемы (до 1-2 мм) отделяли и помещали на 2 часа при 37 оС в мацерирующую смесь, содержащую целлюлазу и пектиназу (0,4 %), затем окрашивали по методу Фельгена в течение 4 часов. Окрашенные ядра клеток меристемы фотометрировали на цитоспектрофотометре SMP-20 «Opton» с объективом х16, окуляром хЮ и зондом 8 х 10 мм. Стандарт 2С определяли по среднему содержанию ДНК в телофазе митоза, что соответствует G1 фазе, а 4С ДНК - по содержанию ДНК в метафазе, что соответствует G2 фазе. Ядра по содержанию ДНК, находящиеся между 2С и 4С, рассматривали как пребывающие в S-фазе. Выборка для каждой экспериментальной точки составляла не менее 70 ядер из 10 корешков.

Определение жизнеспособности клеток и продуктивности эмбриоидогенеза

Жизнеспособность клеток определяли по методу В.С.Шердакова (Паушева, 1974), основанном на выявлении фермента пероксидазы в жизнеспособных клетках. Использовали также красители: амидовый черный, эозин, анилиновый синий. При использовании этих красителей живые клетки не окрашивались, а мертвые, наоборот, окрашивались.

Для каждого генотипа учитывали общее количество гаплоидных структур (каллусов, эмбриоидов), а также зеленых регенерантов и альбиносов. Единицей учета являлся гаплоидный каллус, из которого регенерировало

растение. При необходимости, каждая линия могла быть размножена с использованием культуры ткани растений.

Статистическую обработку полученных результатов вели с применением программы Excel.

3. Технологические условия и показатели получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития

В процессе экспериментов нами разработаны критерии оценки стадий развития микроспор в пыльниках озимой мягкой пшеницы in vitro. Анализ микроспор, проведенный с использованием возможностей светового микроскопа, позволил установить, что для одной выборки характерно наличие микроспор сЗ-5и 6-8 периодами развития (рис. 2).

Цитологические характеристики периодов развития изолированных микроспор озимой мягкой пшеницы in vitro: 3 -превакуолярный; 4 - ранний вакуолярный; 5 - средний вакуолярный; 6 - поздний вакуолярный; 7 - ранний период созревания; 8 - поздний период созревания. Я - ядро; В - вакуоль; П -пора

Рис. 2

В данном случае становится возможным соотнести каждую из стадий с длиной пыльника и, тем самым, представить как происходит процесс развития пыльцы озимой мягкой пшеницы во времени.

Анализ этапов развития пыльцы озимой мягкой пшеницы in vitro позволяет заключить, что продолжительность периода тетрад составляет 5 дней, тогда как период высвобождения микроспоры из каллозной оболочки происходит на 5-6-й дни. Превакуолярный период микроспора проходит между 6 и 8 днями развития; ранний, средний и поздний вакуолярный периоды развития микроспор озимой мягкой пшеницы по продолжительности, как правило, составляют 9-11,11-16 и 16-18 дней соответственно.

Таким образом, наиболее продолжительными по времени оказались два важных для развития микроспор периода: вакуолярный период и период созревания. Продолжительность периода созревания микроспор у озимой мягкой пшеницы в культуре in vitro составляла 9-18 дней. Как известно, именно в этот промежуток времени происходят важные процессы синтеза запасных веществ и частичного обезвоживания пыльцы. Представленные нами схемы развития микроспор озимой мягкой пшеницы могут иметь важное значение для селекционера при проведении работ, связанных с выявлением причин стерильности зерновых злаковых культур, в том числе озимой мягкой пшеницы.

Установлено, что к повышению продуктивности эмбриоидогенеза in vitro у изученных сортов озимой мягкой пшеницы приводит культивирование пыльников, у которых значительная часть микроспор находится в поздней фазе развития (продуктивность эмбриоидогенеза достигала более 50% от числа культивируемых пыльников). Эмбриоиды в этом случае образовывались из микроспор более поздних фаз развития. Такая же закономерность наблюдалась и у других сортов во все годы исследований.

В данном случае сильновакуолизированная фаза микроспорогенеза принята за наиболее оптимальную для индукции прямого андрогенеза (эмбриоидогенеза) in vitro у изученных сортов озимой мягкой пшеницы, именно эта фаза оценивается нами как морфогенная.

Все изученные сорта различались также размерами микроспор, находящихся в сильновакуолизированной фазе развития. Имелись сорта с очень мелкими (сорт Галина) и крупными микроспорами (Инна, Московская 39). Доля их в выборке была различна. Установлено, что размеры микроспор и их ядер у этих сортов не могут служить диагностическим признаком при определении их компетентности к морфогенезу in vitro, так как и в слабовакуолизированной, и в сильновакуолизированной фазах микроспорогенеза имеются как мелкие, так и крупные микроспоры.

На экспериментальном материале изучались выборки культивируемых пыльников, продуцирующих и не продуцирующих эмбриоиды. Результаты исследования показали, что по морфометрическим характеристикам различий

между эмбриоидогенными и неэмбриоидогенными пыльниками внутри изученных сортов не обнаружено (табл.1).

Внутрисортовые различия у эмбриоидогенных и неэмбриоидогенных популяций микроспор укладываются в пределы ошибки эксперимента.

Таблица 1

Размеры микроспор и их ядер у эмбриоидогенных и неэмбриоидогенных популяций микроспор у культивируемых пыльников озимой мягкой пшеницы

Сорт Характеристика Кол-во пылыш ков, шт. Размеры, мкм Изменчивость

микроспор ядер микроспор ядер

(Х±ш) (Х±ш)

Инна Эмбриоидогенная 240 42,5+0,6 12,4+0,6 40-48 6-16

Инна Неэмбриоидогенная 159 42,05+0,4 i 0,7+0,4 28-48 6-18

Нем. 24 Эмбриоидогенная 127 38,2±0,3 10,2+0,3 28-48 4-18 ~ 8-16

Нем.24 Неэмбриоидогенная 126 40,2+0,3 11,5+0,3 32-48

Таким образом, согласно полученным данным, оптимальной для индукции прямого андрогенеза (эмбриоидогенсза) и каллусогенеза in vitro у исследованных сортов озимой мягкой пшеницы является фаза сильновакуолизированной микроспоры. Морфомстрический анализ свидетельствует о том, что размеры микроспор и их ядер не могут служить диагностическим критерием компетентности микроспор к эмбриоидогенезу in vitro.

Влияние температурных воздействий

Началом культивирования пыльников многие авторы считают воздействие на изолированные колосья низкими положительными температурами (+3 - +7 оС) в течение определенного времени (Горбунова и соавт., 1994, 1995, 1997; Круглова и соавт.; Анапияев, 2001; Дьячук, 2003).

Рассмотрев вышеприведенные литературные источники, хотелось бы обосновать нашу, несколько отличающуюся точку зрения на роль холодовой предобработки срезанных колосьев донорных растений до инокуляции их на питательные среды.

На примере культивирования изолированных пыльников некоторых сортов озимой мягкой пшеницы мы оценивали длительность воздействия низкой положительной температурой на колосья стерильных донорных растений, помещенных в безгормональную среду МС для «голодания». При этом учитывалось время, прошедшее от момента срезания колосьев до инокуляции пыльников на питательные среды. В результате исследований было отмечено,

что холодовая предобработка колосьев у всех изучаемых сортов озимой пшеницы не оказывала существенного влияния на выход новообразований -каллусов и эмбриоидов (табл. 2), но сохраняла жизнеспособность микроспор в изолированной культуре от 2-х недель до 3-х и более месяцев в зависимости от сорта. Этот момент является важным, так как позволял снизить аврал работы в сезон и использовать материал по мере необходимости. Мы считаем, что это качество значительно отличает мягкую озимую пшеницу от мягкой пшеницы яровых форм, у которых уже при продолжительности воздействия пониженными положительными температурами в течение 3-5 дней жизнеспособность микроспор снижается от 1% до 0% (Дьячук Т.И., 2003).

Доказано, что холодовое воздействие на эксиланты перед инокуляцией их на питательные среды является большим стрессом для микроспор. Вопрос состоит в том, как реагируют микроспоры на действие температурного шока. Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что деление ядер микроспор происходит только в тех из них, которые отрываются от орбикул, «выпадают» в полость гнезда пыльника (рис. За,б), а те микроспоры, которые остаются прикрепленными к орбикулам и через них - к стенке гнезда пыльника, к делению не приступают.

Микроспоры, находящиеся на средней фазе микроспорогенеза, чаще всего, остаются прикрепленными к тапетуму, и поэтому редко приступают к делению. Характерной особенностью микроспор поздней, сильновакуолизированной стадии развития является появление большого числа делящихся клеток, таких,

Рис. 3 а, б. Разрыв стенки пыльника и «самопроизвольный» выход микроспор из камер гнезда пыльника на индукционную среду (15 - 17 сутки культивирования). П - пыльник; М - микроспора; КМ - колония «самопроизвольно» вышедших на среду микроспор.

как клетки, находящиеся на разных фазах митотического цикла, двуядерные, с равными и неравными ядрами.

Таблица 2

Влияние продолжительности воздействия пониженной положительной

температурой на частоту индукции андрогенеза in vitro у озимой мягкой

пшеницы

№ Сорт Продолжительность воздействия, сутки

п / н 0 4 9 15 17

п\ шт. Н' 1UT./% п, шт. 11 1ИТ./% П, шт. II, шт./% п, шт. Н, шг./% П. шт. н, шт./%

1 Нсмчино вская 24 500 60/12,0 500 59/! 1,8 500 58/11,6 500 55/)1, 0 500 42/8,4

2 Галина 500 35/7,0 500 29/5.8 500 27/5,4 500 21/4,2 500 18/3,6

3 Инна 500 75/15,0 500 60/12,0 ^ 500 53/10,6 500 47/9,4 500 40/8.0

4 Московс кая 39 500 115/23,0 500 102/20,4 500 100/20.0 500 82/16, "1 4 500 1 82/16, 4

5 Памяти Фелина 500 50/10.0 500 49/9,8 500 50/10.0 500 37/7,4 500 29/5,8

П* - пыльников высажено Н* - новообразований получено

Предобработка холодом пыльников в фазе раннего и среднего периодов созревания микроспоры (без фиброзных утолщений в клетках эндотеция стенки гнезда пыльника) не проводит к эмбриоидогенезу in vitro. Культивирование изолированных пыльников озимой пшеницы в поздней фазе микроспорогенеза индуцирует прямой андрогенез in vitro (рис. 4, в).

Рис. 4 (а-г). Каллусогенез и регенерация in vitro: Э

- эмбриоид, Р - регенерация.

Наши исследования убеждают в том, что холодовая предобработка колосьев растений-доноров, напрямую не влияют на продуктивность эмбриоидогенеза in vitro, и ее влияние заключается лишь в том, чтобы извлечь резервную спорофитную генетическую информацию, способную предотвратить развитие микроспоры по гаметофитному пути и продолжить реализацию спорофитной программы.

Влияние состава питательных сред Нами была исследована возможность повышения продуктивности эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников при их культивировании на агаризованной и/или жидкой питательной среде с ацетоном (табл. 3).

Таблица 3

Влияние жидких и агаризованных питательных сред на эффективность эмбриоидогенеза in vitro (в %) в культуре изолированных пыльников

Сорта Жидкая+Фиколл 400, 5% Жидкая (крахмал кукурузн., без ацетона) Агаризованная (0,7% агароза/ агар+ацстон)

Галина 1,2 1,2 5,7

Инна 0,7 0,2 4,3

Московская 39 1,3 1,3 7,2

Памяти Федина 1,8 1,9 6,7

Немчиновская 24 0,3 0,3 7,5

Как видно из таблицы 3, продуктивность андрогенеза in vitro у пыльников, культивируемых на жидкой питательной среде без ацетона ниже, чем у пыльников, культивируемых на агаризованной или агарозной индукционных средах с ацетоном. Объяснение этому явлению открылось позже, когда мы

освоили цитологический мониторинг процесса культивирования. Микроскопические исследования на световом микроскопе показали, что в самые первые дни культивирования стенки гнезда пыльника открываются из-за повышения тургора и старения эндотеция и все микроспоры «высыпаются» на поверхность индукционной среды.

Жидкая среда, вернее, прямой контакт с ней, по-видимому, оказывает губительное действие для большинства микроспор вследствие того, что большинство их тонет в питательной среде, и даже внесение крахмала, рассчитанное только на то, чтобы удерживать пыльники на поверхности раздела среда-воздух, не сохраняет их жизнеспособности. Введение кетонов (ацетон) в агаризованные и агарозные питательные среды способствовало увлажнению поверхности сред, предотвращая их от пересыхания.

Микроскопический анализ позволил также заключить, что в культуре «самопроизвольно» вышедших микроспор деление и развитие их начинается еще до выхода из полости камер пыльников. Это обусловлено новыми, подобранными нами условиями выдерживания стерильных колосьев-доноров на средах без регуляторов роста при низких положительных температурах, вызывающих низкотемпературный стрессовый шок для содержащихся внутри колосьев пыльников и их «голодание».

Характерно, что через 20-25 дней от начала культивирования пыльников всех сортов озимой мягкой пшеницы на среде с ацетоном всегда наблюдали формирование, на которых в условиях освещения через 15-18 дней формировались плотные структуры округло-овальной формы - эмбриоиды. Пересадка эмбриоидов зеленого цвета на среды для регенерации приводила к формированию морфогенных структур, из которых впоследствии получали полноценные растения-регенеранты, большая часть из которых по результатам цитологического анализа имела гаплоидный набор хромосом.

Кроме вышеназванных условий, особое место в литературе отводится углеводам, являющимся и источниками углерода, и осмотиком. В результате проведенного нами эксперимента подтвердилось, что индукция процесса эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой пшеницы зависит от введения в среду сахарозы, мальтозы и ацетона. При молярной концентрации ацетона в среде 0,34 М была получена наибольшая продуктивность эмбриоидогенеза - до 23,5% у сорта 1 алина (таблица 4).

Таблица 4

Влияние углеводов в составе питательной среды на эффективность эмбриоидогенеза in vitro (%) при стерилизации среды методом фильтрации

Сорта Глюкоза (0,26 М) Глюкоза (0,52 М) Сахароза (0,26 М) Мальтоза (0.26 М) Диоксиацетон (0.34 М)

Галина 1.3 0.02 14.3 16,8 23,5

Инна 2,1 0,1 16,2 18,5 22,7

Московская 39 2,4 0,8 22,2 15,7 20,2

Памяти Федина 1.2 0,4 5,6 7,8 18,5

Немчиновская 24 0,7 0,06 2,4 12.8 10,3

Исследованиями Датта и Вензел (Datta,Wenzel, 1987) установлено, что при автоклавировании часть дисахарида - сахарозы расщепляется на глюкозу и фруктозу, что делает данную среду наиболее благоприятной для культивирования микроспор in vitro даже при высокой концентрации сахарозы, так как расщепление ее на фруктозу и глюкозу происходит постепенно, в процессе культивирования. Поэтому, при повышенном содержании углеводов осмотическое давление среды увеличивается незначительно. Ацетон в подогретой до 45 °С среде разрушается, обогащая ее СОг и увлажняя НгО. Последний фактор является наиболее важным для сохранения жизнеспособности микроспор озимой мягкой пшеницы при культивировании их на индукционных средах №№8, 9 и 10 (Лаврова, 2005,2006).

В научной литературе встречаются сообщения, что с помощью манипулирования концентрациями сахарозы можно получать растения пшенично-пырейных гибридов, у которых листья имеют вид «зебры», то есть идет чередование зеленых и белых полос. Такие растения получали Тувессон и соавт. (Tuvesson et al., 1993; В.Н.Чистякова, 2000 (личное сообщение).

Было интересно исследовать реакцию сортов на содержание в составе индукционной среды различных форм аммонийного и нитратного азота. Пыльники растений 5-ти сортов озимой пшеницы культивировались по схеме: 1) контроль - на индукционной среде с ацетоном; 2) на среде с ацетоном и заменой всех нитратных солей на аммонийные; 3) на среде с ацетоном и заменой всех аммонийных солей на нитратные. Все другие компоненты сохранены без изменения во всех вариантах эксперимента (pH среды 5,7 ед., 2,4-Д - 3,5 мг/л среды).

Как видно из таблицы 5, у большинства сортов озимой мягкой пшеницы эмбриоидогенез был значительно более продуктивен на среде, в которой аммонийные соли заменены на нитратные формы. У этих сортов продуктивность эмбриоидогенеза на контрольной среде с ацетоном была ниже, чем на среде с нитратной формой, но выше, чем на аммонийной форме. Результаты культивирования пыльников сортов Московская 39 и Инна

показывают преимущество культивирования на контрольной среде с ацетоном. Пыльники сорта Памяти Федина проявили большую отзывчивость при инокуляции их на питательную среду с ацетоном и аммонийными солями (табл. 5). У сорта Галина процент эмбриоидогенеза был наибольшим на среде, дополненной ацетоном и нитратным азотом (14,7%).

Таблица 5

Интенсивность эмбриоидогенеза (%) в культуре изолированных пыльников _озимой мягкой пшеницы на средах с разными формами азота_

Сорта Эмбриоидогенсз при 3,5 мг/л 2,4-Д

с ацетоном (NH4)+ с ацетоном (N03)- с ацетоном

Московская 39 4,05 1,2 6,2

Галина 3,07 2,3 14,7

Немчиновская 29 5,36 3,6 9,7

Инна 8,9 3,97 4,78

Памяти Федина 6,1 24,2 6,2

Этот эксперимент далее будет нами продолжен и углублен в плане расширения изучения регенерационной способности сортов и гибридов озимой мягкой пшеницы, выращенной в условиях in vitro, на разных минеральных фонах культуральной среды.

Ацетон как фактор эффективности андрогенеза in vitro озимой мягкой

пшеницы

Продолжая исследования, направленные на оптимизацию питательной среды, мы изучали действие различных концентраций ацетона, добавленных к основе минеральных солей по прописи МС (№8,9,10). Различия сортов пшеницы в способности к эмбриоидогенезу, на наш взгляд, обусловлены генетически. В процессе экспериментов нами обнаружена различная способность одного и того же copra к образованию эмбриоидов на средах, отличающихся содержанием в них ацетона. Это может говорить: во-первых, о необходимости подбора оптимальных условий индивидуально для каждого сорта; во-вторых, о возможности значительно увеличить выход в культуре in vitro эмбриоидогенных структур, а, следовательно, и растений. Так, при использовании вариантов сред с концентрациями ацетона 0,26 М и 0,34 М, у сортов Московская 39 и Инна часть микроспор подвергается дополнительным равным делениям, что ведет к формированию многоклеточных структур, которые в дальнейшем дают начало эмбриоидам. Таким образом, входящий в состав питательной среды ацетон в этих концентрациях способствует инициации дополнительных равных делений микроспор в пыльниках пшеницы изученных сортов, тем самым оказывая воздействие на развитие микроспор по нетрадиционному спорофитному пути, что говорит о возможности регуляции

эмбриоидогенеза в культуре пыльников пшеницы путем подбора оптимальной для каждого сорта концентрации ацетона в составе основной индукционной среды.

Таким образом, очевидна различная чувствительность сортов озимой мягкой пшеницы in vitro к содержанию ацетона в составе основной индукционной среды для культивируемых пыльников и микроспор.

Цитологический мониторинг процессов культивирования изолированных пыльников пшеницы copra Московская 39, характеризующегося высоким уровнем выхода эмбриоидов, свидетельствует, что при культивировании пыльников с использованием индукционных сред с малыми концентрациями 0,02-0,04 М ацетона, наблюдается дегенерация абсолютного большинства микроспор уже к концу 3 суток эксперимента; при этом отмечена дегенерация связника и тканей стенки гнезда пыльников.

Характерно, что в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой пшеницы всех 5-ти сортов мы наблюдали образование каллусной ткани сферического типа, на поверхности которой впоследствии возникали эмбриоидные структуры узловатой формы.

Интересен тот факт, что в доступной научной литературе мы не встретили ни одного описания подобных эмбриоидогенных структур у сем.Роасеае. В дальнейших наших исследованиях мы планируем детально изучить этот тип эмбриоидогенеза. Полноценные эмбриоиды возникали только на индукционных средах, содержащих в своем составе диоксиацетон в концентрациях 0,17 - 0,34 М.

4. Морфогенез в культуре андрогенной каллусной ткани озимой мягкой

пшеницы и цитологические особенности начальных этапов развития

микроспор

Достаточно высокая концентрация ацетона в среде для культивирования вызывает у сортов оба типа морфогенеза в культуре микроспор: прямого (эмбриоидогенез непосредственно на экспланте) и непрямого (в каллусной ткани) андрогенеза in vitro (Лаврова, 2004,2005). Обращает на себя внимание тог факт, что начальные этапы непрямого андрогенеза in vitro приводят к неравным делениям клеток, а эмбриоид уже на ранних этапах своего развития (4 клетки) представлен четко организованной структурой, характеризующейся регулярными клеточными делениями. Эта тенденция сохраняется и в ходе дальнейшего развития эмбриоидов. Каллусогенез характерен только для тех случаев, когда воздействие ацетоном инициирует у микроспор усиленную пролиферацию и рост каллусной массы.

В культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы имеют место различные типы гаплоидных структур: прозрачный

рыхлый каллус желтоватого цвета, как правило, не морфогенный; светло-желтый каллус, представленный оводненными клетками; глобулы и эмбриоиды на поверхности плотного гаплоидного каллуса; морфогенный каллус плотной консистенции, цвет которого варьирует от молочно-белого до желтого. Именно этот тип каллусной ткани был способен регенерировать полноценные гаплоидные растения в культуре in vitro озимой пшеницы.

Морфогенный каллус всех изученных сортов имеет сферическую структуру, светло-желтый цвет и плотную консистенцию.

Наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каллусы на культивируемых изолированных пыльниках всех 5-ти изученных сортов озимой мягкой пшеницы появляются позднее эмбриоидов (обычно на 30-45 сутки от начала культивирования). Однако, культивирование сортов Московская 39 и Инна при концентрации ацетона в среде 0,26М приводит к интенсивному каллусогенезу уже в первые дни культивирования. Дальнейшее развитие эмбриоида выражается в образовании зародышеподобной структуры, которая возникала даже на питательной среде, индуцирующей эмбриоидогенез, а не регенерацию!

На поверхности пыльцевого зерна однодольных растений содержатся участки, лишенные экзины, иногда прикрытые оперкулумом. Через эти участки (апертуры) прорастают (при попадании пыльцы во влажную среду) пыльцевые трубки. Тип микроспоры закладывается еще на стадии тетрады. Известны четыре основных варианта расположения апертур, различающиеся друг от друга по ориентации борозд относительно экваториальной плоскости микроспоры.

В результате исследований по андрогенезу in vitro с озимой мягкой пшеницей было установлено, что на стадии тетрад (рис. 5, а), в период молодой микроспоры (рис. 5, б) и в поздний вакуолярный период могут быть выявлены все четыре типа апертур. В научной литературе мы не нашли ни одного установленного факта такого явления.

В целом, как в условиях in vivo, так и в культуре in vitro, для прорастания пыльцевой трубки необходимы вода или высокая относительная влажность, и в любом случае, обеспечение углеводами и минеральными солями. В культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы, примененная нами добавка во все индукционные среды ацетона в концентрациях 0,26-0,34М), обеспечила высокий выход новообразований как в каллусной ткани пыльников, так и в каллусной ткани микроспор (рис. 6, а, б). Именно ацетон, введенный в индукционные среды, обеспечивал их молекулярным кислородом и поддерживал высокую относительную влажность сред, приближая условия культивирования in vitro к стандартным полевым (in vivo). Дополнительное

введение в модифицированные нами среды по прописи Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) кукурузного крахмала, маннита, MES, мальтозы и

О ^

.^-.v: -

Четыре варианта расположения апертур на поверхности микроспоры озимой мягкой пшеницы: моносулькатные(А), монокольпатные (Б), трехкольпатные(В), и пентакольпатные (Г).

а)Формирование тонкой экзины - прммзизины (ПЭК) микроспоры, синтез и отложение спорополленинового полимера (период тетрад)

б) Формирование экзины (ЭК) в процессе отложения на поверхности спорополленина, синтезируемого клетками тапетума (период молодой микроспоры и поздний вакуолярный период - яйцевидное пыльцевое зерно) Рис. 5 а, б

Рис. 6 а, б . Андрогепез in vitro озимой пшеницы в: а) культуре пыльников; б) культуре микроспор

сахарозы в полной мере способствовало обеспечению минерального и углеводного питания культивируемого объекта - изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы.

5. Регенерация растений при андрогспезе in vitro у озимой пшеницы Как известно, лимитирующим фактором в развитии технологии культивирования изолированных пыльников и микроспор у мягкой пшеницы является низкая регенерационная способность генотипов.

Из всех исследованных генотипов наибольшей отзывчивостью в культуре in vitro обладали сорта Галина, Московская 39 и Инна (рис. 7).

Рис. 7 Продуктивность морфогенеза у различных сортов озимой мягкой пшеницы: 1 -Галина, 2-Инна, З-Московская 39,4-Памяти Федина, 5-Немчиновская 24

Кроме подбора специальных сред для регенерации растений, исследователю приходится также разрабатывать технологию укоренения, яровизации и колхицинирования полученных гаплоидов, так как гаплоидные растения, полученные в культуре in vitro массово гибнут при колхицинировании, и кроме того, не все генотипы имеют тенденцию к удвоению числа хромосом. Возможно, среди погибших растений имелись генотипы с разной плоидностью. Однако, выжившие после колхицинирования растения, имели всегда диплоидный набор хромосом 2п=42, что подтверждает и цитофотометрический анализ ДИК (рис. 8).

Gl 9% S 33% G2 57% Poly 2%

Gi 20% S 26% G2 40%

Poly 14% В

Gi 22% S 51% G2 22% Poly 6%

1С 20

G1 26% S 26% G2 35% Poly

13% Г

Распределение ядер клеток по периодам интерфазы в корневой меристеме гаплоидов (а, б, в, г) озимой пшеницы, а - Галина; б -Рис. 8 Памяти Федина; в Инна, г - Московская 39.

Сроки яровизации для каждого сорта подбирали отдельно. Установлено, что яровизация растений-регенерантов в течение 40 дней недостаточна для дальнейшего хорошего роста и развития растений в условиях in vivo, что сказывается на свертывании листьев и ухудшении общего состояния растений вплоть до полной их гибели. По нашему мнению, именно вопрос

продолжительности яровизации растений-регенерантов озимой мягкой пшеницы является головным в проблеме укоренения растений и получения полноценного колоса.

В течение вегетационного периода у регенерантов замеряли высоту куста (Ь), подсчитывали количество стеблей, И колосьев, количество колосков и зерен в колосе. Для всех высаженных в грунт теплицы регенерантов было характерно хорошее развитие вегетативной массы листьев и усиленное кущение растений.

В зависимости от сорта регенеранты различались по количеству стеблей и почти не различались по высоте куста. Наибольшую высоту колоса отмечали у растений-регенерантов сорта Инна (7 см). Высота колосьев сортов Московская 39 и Памяти Федина составила только 2,0 и 1,5 см соответственно, однако они имели выполненное зерно.

Рис. 9. Гаплоидная биотехнология создания форм озимой мягкой пшеницы

Из полученного зерна были выделены зародыши, от которых получены растения R1, размноженные in vitro. Эндосперм зерна изучается на содержание глиадинов (совместная работа с Институтом общей генетики, г. Москва) подэтапы (рис. 9).

Схема гаплоидной биотехнологии создания андрогенных дигаплоидов озимой мягкой пшеницы для применения в практической селекции этой культуры включает 8 основных этапов, каждый из которых подразделяется на

1 этап - полевой отбор колосьев озимой пшеницы остистых и безостых сортов-доноров озимой пшеницы по комплексу морфологических признаков в фазе сильновакуолизированной микроспоры (1); подготовка колосьев к стерилизации (обрезка остей и колосковых чешуи); стерилизация цветков и/или выделение пыльников (2);

2 этап - эксплантирование цветков, пыльников и семяпочек in vitro в жидкой индукционной среде: разрыв стенки пыльника и «самопроизвольный» выход микроспор в среду (3), осаждение микроспор центрифугированием и определение стадии развития микроспор под микроскопом (4);

3 этап - культивирование микроспор на средах для эмбриоидогенеза до образования многоклеточных комплексов (5) и пыльников до образования каллусирующих гаплоидных структур сферического типа (6), последовательный отбор плотных эмбриоидоподобных структур пересадка их на среды для регенерации; /

4 этап - органогенез в культуре андрогенной каллусной ткани и получение растений-регенерантов (8);

5 этап - укоренение регенерантов in vitro (9);

6 этап - цитологический и цитофотометрический контроль плоидиости регенерантов (10) и яровизация андрогенных гаплоидов при температуре 2-4 оС в течение 60 дней;

7 этап - диплоидизация регенерантов колхицином, пересадка в почву и доращивание (в зависимости от сезона) в поле или в условиях подогреваемой теплицы (11) до получения колосьев (R0); (12) -R1 и R2 поколений;

8 этап - размножение растений-регенерантов R1 и R2 поколений методами биотехнологии: андрогенез или эмбриокультура зародыша.

Преимущество гаплоидных культур состоит в том, что при диплоидизации гаплоидных растений образуются автоплоидпые регенерапты, позволяющие гомозигогизировать любые, даже рецессивные мутации. Анализ плоидности морфогенных структур в культуре изолированных пыльников затрудняется тем, что необходимо подбирать специфические условия для отбора проб, не нарушая целостности структуры. Используя методы суспензирования клеток мы исследовали плоидпость эмбриоидов, морфогенных и неморфогенных

каллусов. Оказалось, что все полученные в культуре in vitro новообразования -гаплоидной природы, а это значит, что ни клетки гнезда пыльника, ни связника, ни тычиночной нити не участвовали в морфогенетических процессах.

б. Клеточные технологии в селекционной работе с растениями семейства Тыквенные (Cucurbitaceae)

В процессе проведенной работы удалось разработать и апробировать методику для создания в культуре ткани in vitro устойчивых к фузариозу растений огурца в расщепляющихся популяциях гибридов и популяциях коллекционных образцов (Markova (Lavrova) N.V. et al., 1989; Лаврова H.B., 2002). Полученные результаты позволили нам использовать возможные генетические изменения длительнокультивируемых клеток огурца в нашей дальнейшей работе с культурами и тканями огурца в пределах производственно-семеноводческих теплиц ГУСХП совхоза «Высоковский» Костромского района Костромской области, специализирующегося на выращивании овощной продукции.

Объектами исследований in vitro служили каплусные ткани; меристемы, вычлененные из 3-х-дневных семенных проростков и взрослых плодоносящих тепличных растений огурца 2-х селекционных линий (J1 42^ и Л 29у) широкорайонированного для теплиц Нечерноземной зоны F1 гибрида Грибовчанка, (Маркова (Лаврова), Бутенко Р.Г., 1990). В 2002 году для 3-го блока зимних теплиц тепличного комбината «Высоковский» в Лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской ГСХА нами была оздоровлена и размножена партия селекционного материала огурца материнской (Л 29 и отцовской (Л 42 S ) линий F1 гибрида Грибовчанка, получившего название F1 Грибовчанка - безвирусная. Семена селекционных линий (только 10 г) были предоставлены главным агрономом Государственного унитарного сельскохозяйственного предприятия - ГУСХП «Высоковский» Костромского района Костромской области, к. с-х. н. Долгим Василием Викторовичем в 2002 году.

Л 42с? - генетически без горечи, устойчива только к оливковой пятнистости. Промежуточного типа цветения.

Л 29$ - генетически без горечи, устойчива к оливковой пятнистости и аскохитозу. Женского типа цветения. Гибрид F1 Грибовчанка при скрещивании этих линий характеризуется повышенной устойчивостью к резким колебаниям температур и обладает высокими вкусовыми качествами.

Предлагаемая биотехнология размножения растений огурца из каллусной и меристемной тканей, а также клональное размножение полученных экземпляров может представлять интерес для ускоренной селекции плохоплодоносящих и трудноразмножаемых гибридов, т.к. в процессе

селекционной работы с огурцом часто возникает необходимость "спасения" генотипов, отобранных в процессе селекционной работы, когда они находятся уже в фазе цветения или плодоношения, а также в конце вегетации, когда растения гибнуг от инфекции, вызываемой грибами из рода Fusarium sp. (рис.

Рис. 10 Технологическая схема регенерации растений огурца (Cucumis sativus L.) из каллусной и меристемной ткани и клональное микроразмноженис: 1) стерильные проростки огурца;

2) а - регенерирующая каллусная культура из листовых эксплантов; б - мсристсмная культура; 3) а - цветение укорененных рсгенсрантов огурца, полученных в каллусной культуре (без размножения); б - укорененные регенеранты, полученные из меристем (перед размножением;

4) мериклоны огурца в культуре in vitro;

5) высаженные в почву регенеранты;

6) начало плодоношения регенератов;

7) полное плодоношение регенерантов огурца л условиях теплицы

7. Селекционные и биотехнологические методы в создании форм озимой пшениць^огурца, устойчивых к фузариозу Использование клеточных технологий в селекции на фитоустойчивость возможно в отношении только тех растений, для которых разработаны условия дифференциации и вторичной дифференцировки.

10).

Разработанные ранее условия морфогенеза растений огурца из каллусных и меристемных тканей, а также найденные условия эмбриоидогенеза в гаплоидной каллусной ткани озимой пшеницы, использовались нами в программе по созданию устойчивых к фузариозу форм растений.

Экспресс-оценку линейного материала огурца на устойчивость к фузариозу через культуру меристем проводили на средах с КФ и токсином Т-2 из Fusarium sp. Концентрация КФ Fusarium составляла 20% - для первичного культивирования и 50% - для повторных циклов. Оценка растений в конце вегетации в теплицах ГУСХП «Высоковский» показала 82,5 % не пораженных фузариозом растений. Пересаженные в грунт теплицы регенераты нормально развивались и не имели признаков поражения фузариозом (бурой окраски корней).

Материал in vitro 2-х селекционных линий: JI 42 <3 и J1 29 §, охарактеризованный нами по устойчивости к КФ Fusarium sp., тестировали на средах с токсином Т-2 из Fusarium sp. При проращивании семян (для получения апикальной ткани) мы наблюдали совпадение между отбором на КФ и токсине Т-2. Так, обе линии были достаточно устойчивы к токсину Т-2 (едва заметное снижение жизнеспособности проростков наблюдали при концентрации токсина 50 мкг/мл у женской линии).

Для более-жесткого отбора концентрация токсина Т-2 была увеличена до 100 мкг/мл. Интересно, что введение в селективную среду токсина Т-2 в этой концентрации вызывало изменение морфологии меристем, а длительное культивирование - нарушение полярности роста корней, утолщение стебля, изменения листовой пластинки и образование розеток листьев на апикальном конце. В данном случае подтверждается мутагенное действие токсина Т-2 в концентрации выше 70 мкг/мл среды.

Морфологическое описание растений гибрида Грибовчанка Fl-безвирусная, полученном от скрещивания женской (J1 29 $) и мужской (JI 42 S) линий, выращенных в культуре in vitro из меристем и отобранных на селективных средах показало, что они имели угловатосердцевидную форму листа, простой тип опушения завязи, белое опушение, гладкую поверхность, темно-зеленую окраску зеленца и др. показатели. По урожайности плодов оздоровленный гибрид Fl Грибовчанка-безвирусная значительно превысил стандарт. Урожайность плодов с куста составила 7,1 кг/м (st - 3,2 кг/кв.м). Плоды имели длину 22 см, ширину - 4,5 см, диаметр семенной камеры - 5 см. Семена R1 поколения были выполненными, их всхожесть составила 100%. Устойчивость R1 поколения также подтвердилась. Кариотипический анализ подтвердил диплоидный характер полученных регенератов (2п=14).

Селекцию in vitro с сортами озимой пшеницы проводили на сублетальной и летальной концентрациях токсина - 50 и 100 мкг/мл соответственно, введенных в индукционные среды МС№10+2,4-Д с ацетоном (0,36 М) и без него. Доказано преимущественное влияние ацетона на выход стеблевых структур в каллусной ткани как изолированных пыльников, так и микроспор (в количестве от 5 до 9 штук в зависимости от сорта), тогда как на среде МС без добавления ацетона число стеблевых структур у растений-регенерантов озимой мягкой пшеницы сокращалось до 3 - 4 штук.

Селективный отбор на этапе формирования первичного каллуса на среде МС№10, содержащей фузариевую кислоту в концентрации 50 мкг/мл, приводил к снижению образования андрогенной каллусной ткани у сорта Немчиновская 24 до 57,2 %, а у сорта Памяти Федина - до 26,1 % (табл. 6). Однако, при этом у всех сформированных каллусных структур визуально можно было видеть ярко-зеленые меристематичсские очаги, из которых впоследствии регенерировали полноценные зеленые растения.

Таблица 6

Влияние токсина фузариевой кислоты на морфогенез андрогенных структур озимой пшеницы, контрастных по устойчивости к патогену корневой гнили

Сорт Концентрация фузариевой к-ты, мкг/мл Культивируемых каллусов, шт. Получено морфогенных каллусов, шт. Гибель клеток, %

Немчиновская 24 (контроль) 0 27 25 0

50 21 9 57,2

Памяти Федина 0 23 27 0

50 23 17 26,1

Для подтверждения устойчивости in vitro, последующий жесткий отбор каллусирующих андрогенных структур проводили на селективной среде с концентрацией токсина фузариевой кислоты 100 мкг/мл. В результате были отобраны резистентные гаплоидные каллусирующие структуры, выдерживающие концентрацию токсина 100 мкг/мл среды.

Каллус, сохранивший жизнеспособность в течение 2-3 пассажей на среде с токсином фузариевой кислоты в концентрации 100 мкг/мл, регенерировал побеги, которые развивались в полноценные растения и были также устойчивы к токсину гриба. Регенераты сорта Московская 39, полученные в результате отбора на токсичных средах при летальной концентрации токсина фузариевой кислоты 100 мкг/мл, в культуре in vitro различались разным типом листовой пластинки.

Таким образом, и в экспериментах с тканями огурца, и с озимой пшеницей, подтверждается мутагенное действие токсина фузариевой кислоты, введенного в селективные среды в концентрациях больше 70 мкг/мл.

Необходимо добавить, что у высаженных в условия подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ резистентных регенерантов озимой пшеницы сорта Московская 39 при прохождении этапов онтогенеза произошел разрыв листовой пластинки по средней жилке.

Использование культуры пыльников н токсинов патогенов в работе по созданию форм огурца, устойчивых к грибным болезням

В современной биотехнологии значительный интерес представляют вопросы, связанные с более детальным изучением репродуктивных органов, в частности, пыльцы овощных растений. Известно, что в отдельном пыльцевом зерне содержится вся генетическая информация, необходимая для формирования гаплоидного растения, что широко используется в селекции для получения гомозиготных линий в системах in vitro. В этой связи может быть интересна пыльцевая селекция.

Многие авторы подчеркивают, что гаметофитная селекция имеет сходные подходы с культурой тканей и клеток растений in vitro (Лапченко, 1991). В обоих случаях селективный фактор применяется не на целом растении, а только на его части - ткани, клетке, небольшой группе генеративных клеток (в данном случае - пыльце).

Работу по пыльцевой селекции селекционных линий огурца начинали с отработки методики определения жизнеспособности пыльцы огурца. Для этого, в среду для культивирования жизнеспособной пыльцы МС-3 (Маркова (Лаврова), 1991) вводили раствор сахарозы в концентрации не менее 25%. Далее под микроскопом МБС-10 определяли жизнеспособную пыльцу (не позднее, чем через 30 мин. после помещения препарата под окуляр микроскопа). Недостатком метода являлся тот факт, что при помещении пыльцы в индукционную среду, пыльцевые трубки начинали лопаться, а поэтому сложно было промерить их первоначальные размеры и описать форму пыльцевых зерен, поэтому мы увеличили концентрацию сахарозы в питательной среде до 35%, при этом разрыва пыльцевых трубок не получали, а время просмотра образцов в этом варианте увеличивалось от 2 до 3-х часов.

Результаты наших исследований показали, что наиболее продуктивной была свежая пыльца, взятая с нижних ярусов цветков тепличных растений огурца. В результате экспериментов было установлено, что пыльца, взятая через 24 и 48 часов после раскрытия цветка, практически не прорастала на среде с сахарозой в любой концентрации (прорастало только около 1%

пыльцевых зерен). Не наблюдали также и прорастания пыльцы огурца, взятой за 24 часа до раскрытия мужского цветка.

Вторым этапом работы являлись исследования по изучению действия различных концентраций токсина фузариевой кислоты - Т-2 на жизнеспособность пыльцы огурца и подбор дифференцирующей концентрации. В работе также использовали пыльцу 2-х селекционных линий огурца - Л 42г? и Л 29? ^ Для которых было характерно значительное снижение ее жизнеспособности с увеличением концентрации токсина в срсдс. Причем, уменьшение жизнеспособности пыльцы сопровождалось увеличением показателя деформации пыльцевых трубок (табл. 7).

Таблица 7

Влияние различных концентраций токсина Т-2 в среде МС-3 на

жизнеспособность пыльцы огурца 2-х селекционных линий

Показатели Концентрация токсина Т-2, мкг/мл

Контроль(без токсина Т-2) 20 40 60 80

с? ¥ с? $ <? ? 3 2 с? 6^5~

Процент проросших пыльцевых зерен: Всего 86,0 81,5 2,9 70,7 0,6 55,6 1,7 27,3 2,8

Нормальных 100 92,5 0 8,4 0 5,1 0 3,3 0 1,3

Деформированных 0 7,5 100 91,6 100 94.9 100 96,7 100 98,7

Полученные данные позволяют заключить, что в качестве дифференцирующей концентрации в работах по пыльцевой селекции огурца на селективных средах с токсинами патогена необходимо использовать концентрацию не менее 40 мкг/мл токсина Т-2, которая и является оптимальной для пыльцевой селекции огурца in vitro.

Распространение корневых гнилей в теплицах часто провоцируют пониженные температуры воздуха и резкие перепады температур. По-видимому, общая устойчивость растений к пониженным температурам может способствовать повышению устойчивости растений к корневым гнилям. Поэтому параллельно с оценкой селекционных образцов на токсине Т-2 проводили отбор пыльцы огурца при пониженных положительных температурах.

Предварительная оценка показала, что прорастание пыльцы при пониженной температуре было замедленным у обеих селекционных линий (табл. 8). Однако, в течение дальнейшего культивирования (более 3-х часов культивирования) пыльцы наблюдалась тенденция к увеличению числа проросших пыльцевых зерен. Поэтому для более точной оценки мы решили анализировать рост пыльцевых трубок в динамике с большей временной

экспозицией (до 24 часов). Пыльца линии Л 29 $ за сутки почти достигала контрольных показателей (74,1 %). Это мы объясняем тем, что микрогаметофит растения огурца менее чувствителен к пониженной температуре воздуха теплицы, чем растения in vivo.

Таблица 8

Холодостойкость пыльцы селекционных линий огурца на среде МС-3+25 % сахарозы в зависимости от временной экспозиции (2/24 часа)

Показатели Температура +23-25 оС Время, час. Температура +12-14 оС

(kohti роль)

<5 $ $

Непроросших 11,7 11,7 2 88,1 86,9

пыльцевых 3 61,9 65,9

зерен, % 24 41,4 24,7

Проросших 87,5 83,4 2 2,5 7,0

пыльцевых 3 29,3 16,5

зерен, %: 24 51,5 74,1

а) нормальных 0,8 4,9 2 9,4 6.1

б) отстающих 3 8,8 17,6

в росте 24 7,1 1,2

Таким образом, метод пыльцевой селекции позволяет значительно сократить время отбора селекционных генотипов по устойчивости к грибным болезням и может использоваться в селекции как экспресс-метод оценки селекционного материала на'иммунитет.

Оценка устойчивости регенерантов в условиях подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ (озимая пшеница) и ГУСХП «Высоковскнй» Костромского р-на Костромской обл. (огурец) и получение семян Ш поколения

Регенеранты озимой пшеницы резистентных форм пересаживали в вазоны с почвой, содержащей споры патогена корневой гнили (Лаврова, 2000), а 23 марта 2006 года - в грунт теплицы лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ. Регенеранты огурца, размноженные микрочеренкованием (Ш и Я2 поколений) - в грунт экспериментальных теплиц ГУСХП «Высоковский» (Костромская обл). В конце вегетационного периода селекционный материал был оценен на устойчивость к фузариозу по 4-х-балльной шкале (Лаврова, 2002). Поражение корневой системы растений фузариозом у сортов озимой пшеницы Инна и Памяти Федина составило 1 балл. Сорт Московская 39 не имел видимых симптомов поражения фузариозом - 0 баллов. Восприимчивый (Немчиновская 24) и среднеустойчивый (Галина) сорта - погибли. Регенеранты Л 42(5* не имели видимых симптомов поражения фузариозом - 0 баллов, процент поражения женской линии Л 29$ составил 1 балл.

При оценке на патогенном фоне, регенеранты озимой пшеницы, отобранные на уровне гаплоидных каллусов на селективных средах с 50 - 100 мкг/мл

токсина фузариевой кислоты, и регенеранты огурца, отобранные на уровне меристем на селективных средах с 50% КФ Fusarium sp. и 50 мкг/мл токсина Т-2 из Fusarium sp., сохранили достаточно высокую степень устойчивости к патогену фузариозной корневой гнили, а также они сохранили устойчивость к поражению мучнистой росой - 0,5 балла, бактериозом - 2 балла (огурец).

В фазе 1-го настоящего листа проводили учеты погибших от патогена растеиий и оценивали поражение корней. Проведенная предварительная оценка после однократного отбора показала, что R1 семенное поколение растений Fl Грибовчанка-безвирусная не имело видимых симптомов поражения фузариозной корневой гнилыо (0 баллов) по сравнению с контролем, корневая система которого имела поражение фузариозом - 3 балла.

Для предварительной оценки R1 поколения озимой пшеницы на устойчивость к фузариозу, из семян R1 поколения были вычленены зрелые зародыши (эмбриокультура), которые культивировали на среде MC без регуляторов роста, содержащей ацетон в концентрации не менее 1,5 % от объема среды. Растения-регенеранты были размножены в культуре in vitro по методу С. Беккужиной (1999) и отобраны на средах с токсином фузариевой кислоты в концентрации 50 мкг/мл. Устойчивость регенерантов к токсину in vitro также подтвердилась.

Оценка устойчивости растений огурца, полученных от семян R1 поколения в условиях инфекционного фона зимней теплицы и получение семян R2 поколения

Семена R1 поколения Fl Грибовчанка - безвирусная высевали в 2002 году в зимней блочной теплице ГУСХП «Высоковский» Костромского р-на Костромской обл. на фузариозном фоне с местной популяцией гриба Fusarium sp. (I'.oxysporum, F.solani и F.moniliforme).

Исследования проводили путем постановки лабораторных опытов в соответствии с требованиями «Методических рекомендаций по проведению опытов с овощными культурами в сооружениях защищенного грунта» (] 976).

Тепличный грунт состоял из торфа и компоста (содержание органического вещества - 30 %), который отвечал требованиям такой овощной культуры, как огурец. Во всех опытах проведены фенологические наблюдения, при которых отмечены даты посева семян, появление единичных и массовых всходов, пикировки, бутонизации посадки, начала и массового цветения, первого и последнего сбора плодов (Долгий В.В., 2003).

В конце вегетационного периода все растения были описаны и оценены по устойчивости корневой системы к фузариозу. Растения были слабо- и

средневетвистые, смешанного типа цветения. Форма листовой пластинки 5-угольная, завязь над 9 листом. Плоды имели цилиндрическую форму, по характеру поверхности были крупнобугорчатые без рисунка, и гладкие с рисунком в виде белых полос до середины плода. Кора плодов тонкая. Вкус плодов - 5 баллов. Из плодов были получены семена R2 поколения в количестве 600 шт. Морфологических изменений от размножения растений методом культуры меристем с последующим отбором на селективных средах с КФ гриба и традиционным способом (через семена) у растений не отмечено.

После отбора устойчивых образцов на полулетальных и летальных концентрациях КФ гриба растения размножали с использованием метода культуры меристемы, а регенерированные из них растения -микрочеренкованием (лаборатория с/х биотехнологии Костромской ГСХА). Укорененные мериклоны передавали в ГУСХП «Высоковский» для получения семенного материала и изучения признака устойчивости к фузариозу в поколениях растений огурца, полученных методом отбора эксплантов меристем на селективных средах с КФ Fusarium sp.

Заключение

Суммируя экспериментальный материал можно заключить, что в селекции озимой мягкой пшеницы и огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям, наряду с традиционными методами работы, эффективно применение методов in vitro с использованием селективных питательных сред, содержащих КФ и токсины грибов из Fusarium sp.

Селекция in vitro огурца по устойчивости пыльцевых трубок к токсинам Fusarium sp. позволит ускорить выведение устойчивых к фузариозу сортов и гибридов, тем более, что в результате проведенных исследований установлена положительная корреляция между угнетением роста пыльцевых трубок, интенсивностью прорастания пыльцы при пониженных положительных температурах и поражаемостью эксплантов на селективной среде с токсином in vitro.

Работу по созданию фузариозоустойчивых сортов (гибридов) озимой пшеницы целесообразно начинать с последовательного отбора каллусирующих и морфогенных пыльников селекционных и коллекционных образцов на питательных средах с добавлением токсина фузариевой кислоты из Fusarium sp. Получение жизнеспособных регенерантов из морфогенных структур и оценку их устойчивости можно использовать как экспресс-метод в селекции озимой пшеницы для более точной и быстрой оценки селекционного материала на устойчивость к грибным болезням, что значительно ускорит и упростит селекционный процесс, сократит затраты на подготовку инфекционного фона с

патогеном и проведение заражения культурой патогена, что достаточно трудоемко.

Рекомендации по использованию результатов исследований

Новая схема создания фузариозоустойчивых форм мягкой озимой пшеницы биотехнологическими методами включает 9 основных этапов:

1 этап - отбор колосьев озимой мягкой пшеницы с сортов-доноров в поле по комплексу морфологических признаков; подготовка колосьев к стерилизации; стерилизация цветков и/или выделение пыльников; определение эмбриогенной стадии развития пыльцы под микроскопом;

2 этап - эксплантирование пыльников и семяпочек in vitro в жидкой индукционной среде; осаждение микроспор центрифугированием;

3 этап - культивирование микроспор на средах для эмбриоидогенеза до образования многоклеточных комплексов и пыльников до образования каллусирующих гаплоидных структур различного типа (наращивание материала), селекция in vitro морфогенных гаплоидных структур на средах, содержащих ацетон+токсин гриба, пересадка крупных эмбриоидов на среды для регенерации растений с токсином гриба и без него;

4 этап - получение устойчивых растений-регенерантов;

5 этап укоренение устойчивых регенерантов in vitro;

6 этап - цитологический контроль плоидности регенерантов и яровизация при температуре 2-4 оС в течение не менее 60 дней;

7 этап - диплоидизация регенерантов колхицином (0,02%, 4-5 часов), пересадка регенерантов в почву и доращивание в теплице в естественных условиях или в условиях инфекционной теплицы с патогеном гриба; отбор устойчивых растений по хозяйственно-ценным и морфологическим признакам;

8 этап - оценка растений в конце вегетации с осмотром корневой системы и общей оценкой на устойчивость к фузариозу;

9 этап - получение семенного материала Ro, отбор ценных АДГ-линий (R1-R2) линий и передача селекционеру. Внедрение в селекционные программы по созданию сортов, устойчивых к грибным болезням.

ВЫВОДЫ

1. На основе выявления цитоэмбриологических особенностей процессов эмбриоидогенеза и морфогенеза создана система культивирования in vitro изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития на селективных средах с токсином патогена фузариозной корневой гнили и разработана гаплоидная биотехнология для прямого использования в практической селекции для создания хозяйственно-ценных сортов этой культуры, устойчивых к F.oxysporum, F.moniliforme и F.solani. Доказана целесообразность последовательного

отбора гаплоидных каллусных структур на селективных средах с высокими концентрациями токсина фузариевой кислоты (50 - 100 мкг/мл), возникающих в культивируемых клетках, способных к регенерации растений.

2. Впервые показано, что выдерживание стерильных колосьев озимой пшеницы в культуре in vitro на агаризованных питательных средах при низких положительных температурах (2-4 оС) сохраняет жизнеспособность микроспор до 3-х и более месяцев.

3. Впервые на озимой мягкой пшенице показано, что частота формирования андроклинных структур зависит от комплекса взаимосвязанных факторов: условий стерилизации донорных растений, предобработки колосьев низкими положительными температурами и выдерживания на средах МС без регуляторов роста, стадии развития микроспор и состояния стенок гнезда пыльника, а также применения ацетона в составе индукционных питательных сред.

4. Впервые показано, что микроспоры, находящиеся на поздней стадии развития, под действием индукционных сред МС №№ 8 - 10, содержащих ацетон, и низкотемпературного стресса перемещаются в полость гнезда пыльника. Только на индукционных средах с добавлением ацетона в концентрации 0,26 - 0,34 М микроспоры образуют эмбриогенные комплексы как путем прямого эмбриоидогенеза, так и в культуре длительнокультивируемой каллуспой ткани.

5. Впервые в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы на среде с ацетоном в концентрации не менее 0,26 М получены эмбриоиды, морфогенные и неморфогенные каллусы нового типа, отличающиеся но морфологическим свойствам и анатомическому (сферическому) строению.

6. Впервые в культуре in vitro озимой мягкой пшеницы выявлены 4 типа апертур микроспор: моносулькатные, монокольпатные, трехкольпатные и пентакольпатные, через которые при культивировании микроспор in vitro на индукционных средах с ацетоном происходит прорастание пыльцевых трубок.

7. Впервые в изолированной культуре микроспор озимой мягкой пшеницы получены морфогенные каллусы с высокой способностью к эмбриоидогенезу (более 37,2 % в расчете на общее число культивируемых пыльников) на средах №8, 9 и 10, дополненных ацетоном, MES, агарозой и мальтозой.

8. Установлено мутагенное действие чистого токсина фузариевой кислоты при отборе in vitro резистентных андрогенных линий, что проявилось в рассеченности листовой пластинки регенерантов сорта Московская 39, отобранных в жестких селективных условиях (100 мкг/мл токсина).

9. Разработан ускоренный метод оценки селекционных генотипов огурца и АДГ-линий озимой мягкой пшеницы на средах с токсином гриба Fusarium sp. по темпу прорастания пыльцевых трубок в селективной среде. Предложен экспресс-метод оценки селекционного материала огурца (на примере JI 42<f? и Л 29$ Fl Грибовчанка-безвирусная) на устойчивость к фузариозу in vitro с использованием КФ из F.oxysporum, F.moni Ii forme, F.solani и токсина патогена.

10. Доказано, что показатели устойчивости к токсину фузариевой кислоты изолированных меристем, каллусных тканей и пыльцевых трубок (некротические явления, летальный исход) коррелируют с устойчивостью всгетирующих растений, выращенных на инфекционном фоне с патогенами корневой гнили.

11. Разработанные биотехнологии огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная) позволяют сократить селекционный процесс и включать в него цепные малосемянные линии и сильно пораженные грибными болезнями плодоносящие растения при необходимости их размножения для селекционных целей в работе на иммунитет.

Список основных работ по теме диссертации Научные:

1. Маркова (Лаврова) Н.В., Бутепко Р.Г., Донец Н.В. Использование культуры меристемы для клонального размножения огурца in vitro // Доклады ВАСХНИЛ. - М., 1989. - №8. - С. 11 - 14.

2. Markova (Lavrova) N.V., Butenko R.G., Donets N.V. Use of meristem culture for clonal propagation of cucumber in vitro // Soviet Agricaltural sciences. - New-York, 1989. - №8.-P. 14-18.

3. Маркова (Лаврова) H.B. Клональпое размножение огурца (Cucumis sativus L.), как метод сохранения ценных селекционных генотипов // Тр. Всесоюзной конференции: Роль науки в интенсификации сельского хозяйства. Омск, 1990. С. 114- 115.

4. Маркова (Лаврова) Н.В. Размножение in vitro селекционных линий огурца (Cucumis sativus L.), устойчивых к фузариозу // Тр. Научно-производственной конференции Одинцовского р-на Московской обл.: Ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны. М., 1990. С. 120 -122.

5. Маркова (Лаврова) H.B. Использование биотехнологических методов в селекции огурца (Cucumis sativus L.) на резистентность к фузариозу, вызываемому грибами рода Fusarium // Тр. 1Y Всесоюзной конференции ученых по физиологии растительной клетки. Минск, 1990. С. 119 -121.

6. Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г., Донец Н.В. Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.) // Заявка на изобретение РФ №4773443. Заявлено 12.12.89., положительное решение 31.01.91.-12с.

7. A.C. №1720595 (СССР) на Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.). Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г., Донец Н.В. - Зарегистрировано в Госкомизобретений и открытий приГКНТРФ, 1991 -3 с.

8. Лаврова Н.В. Экспресс-метод оценки селекционного материала огурца (Cucumis sativus L.) на устойчивость к фузариозу in vitro с использованием культурального фильтрата (КФ) и Т-2 токсина из Fusarium sp. // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2000. С. 43 - 45.

9. Лаврова Н.В, Использование методов in vitro в селекционной работе с растениями огурца (Cucumis sativus L.) // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2000. С. 32 - 35

10. Лаврова Н.В. Биотехнологические методы в клеточной селекции пшеницы на устойчивость к септориозу, вызываемому возбудителем Septoria nodorum II В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2002. С. 33 - 35

11 .Лаврова Н.В. Селекция пшеницы in vitro на устойчивость к фузариозу // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2002. С. 36-38

12. Lavrova N.V. The working out biotechnology receiving haploided plants of winter wheat (Triticum aestivum L.) // Third Moskow international ment, March, 14-18, Moskow, Russia, 2005. Past 1. P. 264 - 265.

13. Лаврова H.B., Баранова E.H., Гулевич A.A. Динамика утилизации запасных веществ в условиях действия солей и осмотика //Известия ТСХА. - 2005. - №4 - С. 174-178

14. Лаврова Н.В. Практические аспекты андрогенеза in vitro озимой мягкой пшеницы // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова. - Кострома, 2005. - №11 - С. 124 - 126

15.Лаврова Н.В. Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова. - Кострома, 2005. - №11 - С. 134 -137

16. Лаврова H.B. Культивирование изолированных пыльников и микроспор озимой пшеницы in vitro // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова. - Кострома, 2005. - №12 - С. 115 117

17.Лаврова Н.В. Цитологические особенности начальных этапов спорофитного пути развития микроспор озимой пшеницы // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова. -Кострома, 2005.-№12-С. 125-127

18.Лаврова Н.В. Методы in vitro в селекции огурца (Cucumis sativus L.) на иммунитет // Монография. - Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в ПТЦ «Информрегистр» №50 ВС - 2006 от 13.07.06. - М. -№3.2-120 с.

19.Лаврова Н.В. Теоретические и технологические аспекты андроклинии мягкой пшеницы с озимым типом развития // Монография. - Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200570769 в НТЦ «Информрегистр» №45 ВС - 2006 от 13.07.06 - М. - №3.2 - 183 с.

20.Лаврова Н.В. Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибным болезням // Практический комментарий. - Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №49 ВС - 2006 Ol 15.07.06. - М. - №3.2 - 53 с.

21.Лаврова Н.В. Биотехнологичсские методы в создании форм злаковых растений, устойчивых к корневым гнилям: токсины патогенов, экспериментальная гаплоидия и генетическая трансформация // Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №47 ВС-2006 от 15.07.06. - М. -№3.2 - 26 с.

22.Лаврова Н.В. Перспективы развития гаплоидной биотехнологии в России для интенсификации генетико-селекционных работ с зерновыми колосовыми злаками // Обзорная статья. - Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №46 ВС-2006 от 15.07.06.-М.-№3.2- 20 с.

23. Лаврова Н.В. Перспективы использования культуры пыльников (микроспорогенез) и токсинов патогенов в селекции огурца на устойчивость к грибным болезням // Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №48 ВС-2006 от 13.07.06. - М. -№3.2 - 8 с.

24.Лаврова Н.В. Технология (способ) получения новых селекционных генотипов озимой мягкой пшеницы in vitro // Заявка на патент РФ № гос. регистрации 2006/11207534

25.Лаврова Н.В. Состав индукционной среды для получения гаплоидов озимой мягкой пшеницы in vitro // Заявка на патент РФ № гос. регистрации 2006/17500291

26.Лаврова Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы // Монография. - М.: изд. ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2006 -125 с.

27.Лаврова Н.В. Практические аспекты андрогенеза in vitro озимой мягкой пшеницы // Известия ТСХА. - 2006. - №4 (в печати)

Учебио-методические:

28.Лаврова Н.В. Сельскохозяйственная биотехнология. Часть 1. Клеточная инженерия: учебно-методическое пособие, Кострома: изд. КГСХА, 2000. -32 с.

29.Лаврова Н.В. Вопросы проведения учебной практики по фитопатологии для студентов факультета Агробизнеса // В кн.: Современные образовательные технологии в учебном процессе, Кострома: изд. КГСХА, 2001. С. 72-74

30.Лаврова Н.В. Программа учебной практики по фитопатологии: Учебная программа, Кострома: изд. КГСХА, 2002 - 19 с.

31 .Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии: Учебное пособие, М.: изд. МСХА, 2004, С. 11-31 (под редакцией академика РАСХН B.C. Шевелухи, в соавторстве - всего 8 авторов)

32.0сновы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции; Тестовые задания, М.: изд. МСХА, 2005, 17 с. (электронное изд. размещено на сервере дистанционного обучения РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева, М. - 2006 - 17 с.

Зак. 652.

2,75 печ. л.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

ÍLOOCft

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лаврова, Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. Обзор литературы по изучаемой проблеме 25

1.1 .Предпосылки развития гаплоидной биотехнологии для интенсификации генетико-селекционных работ с зерновыми колосовыми злаками

1.2.Генетические предпосылки возникновения гаплоидов в системе in vivo

1.3.Получение гаплоидов сельскохозяйственных растений с использованием метода культуры изолированных клеток и тканей растений in vitro:

1.3.1.Получение гаплоидов в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек (гиногенез)

1.3.2. Получение гаплоидов в культуре изолированных пыльников и микроспор (андрогенез)

1.4. Влияние различных факторов на индукцию гаплоидного каллуса и регенерацию гаплоидных растений в культуре изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы

1.5. Цитологические особенности эмбриоидогенеза in vitro у мягкой пшеницы

1.6. Гормональная регуляция андрогенеза in vitro у мягкой пшеницы

1.7. Эффективность морфогенеза и регенерации растений в культуре 109 изолированных пыльников мягкой пшеницы

1.8. Возможности гаплоидной биотехнологии и пыльцевой селекции в создании сельскохозяйственных растений, устойчивых к грибным болезням ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА П. Материал и методы исследований 136

2.1. Условия проведения исследований, исходный материал, схемы и методики проведения исследований

2.1.1. Исходный материал и объекты исследований

2.1.2. Генеалогия сортов озимой мягкой пшеницы, представляющих практический интерес для селекции in vitro

2.1.3. Схемы экспериментальных исследований

2.1.4. Методики проведения исследований

2.1.4.1. Выращивание донорных растений озимой мягкой пшеницы Метеорологические условия в годы проведения исследований

2.1.4.2. Определение стадии развития пыльцы

2.1.4.3. Холодовая предобработка колосьев, выделение и культивирование пыльников, микроспор, семяпочек мягкой озимой пшеницы

2.1.4.4. Культура изолированных микроспор мягкой озимой пшеницы

2.1.4.5. Пересадки андроклинных структур в культуре in vitro и получение растений-регенерантов мягкой озимой пшеницы

2.1.4.6. Методы изучения андрогенных каллусирующих структур на устойчивость к фузариозу

2.2. Методы проведения исследований

2.2.1. Культивирование изолированных пыльников озимой пшеницы

2.2.2. Индукция андрогенеза in vitro и получение растений-регенерантов мягкой озимой пшеницы

2.2.3. Цитологические методы исследований. Цитофотометрия ДНК

2.2.4. Определение жизнеспособности клеток и продуктивности эмбриоидогенеза

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА Ш. Технологические условия и показатели получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития 182

3.1. Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспор и состояния стенок гнезда пыльника

3.2. Влияние температурных воздействий

3.3. Влияние состава питательных сред 209 3.3.1. Влияние концентраций ацетона на андрогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор in vitro

3.3.2. Влияние органических добавок, фитогормонов и температуры на андрогенез in vitro мягкой озимой пшеницы in vitro

ГЛАВА 1Y. Морфогенез в культуре андрогенной каллусной ткани озимой мягкой пшеницы

4.1. Цитологические характеристики прямого и каллусирующего андрогенеза in vitro у озимой мягкой пшеницы

4.1.1. Цитологические особенности начальных этапов спорофитного пути развития микроспор

4.2. Особенности строения клеток морфогенного/неморфогенного каллуса и эмбриоидов, полученных в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы

ГЛАВА Y. Регенерация растений при андрогенезе in vitro у озимой мягкой пшеницы 253

5.1. Регенерационная способность селекционных генотипов озимой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников и микроспор

5.2. Проявление генетической изменчивости в условиях андрогенеза in vitro у озимой мягкой пшеницы

ГЛАВА Y1. Клеточные технологии в селекционной работе с растениями сем.Тыквенные (Cucurbitaceae) 272

6.1. Реализация морфогенного потенциала органов и тканей огурца (Cucumis sativus L.) селекционных линий JI42 S и JI29 $

ГЛАВА У11. Селекционные и биотехнологические методы в создании форм озимой мягкой пшеницы и огурца, устойчивых к фузариозу 293

7.1. Вредоносность заболеваний, вызываемых почвенными Фитопатогенами

7.1.1. Диагностика заболеваний злаковых и тыквенных культур фузариозными корневыми гнилями

7.1.2. Состав и биологические свойства почвенных фитопатогенов - возбудителей болезней (корневые гнили)

7.1.3. Динамика заболевания отдельных структур злакового растения

7.2. Прямые и косвенные методы оценки устойчивости фузариозных корневых гнилей

7.2.1. Использование токсинов в традиционной селекции растений in vitro. Оценка растений по устойчивости к токсинам

7.3. Генетика озимой пшеницы и селекционный метод повышения устойчивости злаковых растений к корневым гнилям

7.3.1. Маркеры устойчивости злаковых растений к корневым гнилям

7.4. Биохимия взаимоотношений в системе растение - паразит 326 7.4.1. Использование токсинов патогенов в селекции in vitro овощных и злаковых растении на устойчивость к грибным патогенам

7.5. Биотехнологические методы в создании форм овощных и злаковых растений, устойчивых к корневым гнилям

7.6. Селекция огурца in vitro на устойчивость к культуральным фильтратам (КФ) гриба Fusarium sp.

7.7. Использование чистого токсина Т-2 из Fusarium sp. («Serva») в программах ускоренного создания форм огурца и озимой пшеницы, устойчивых к фузариозу: 355

7.6.1. Огурец

7.6.2. Озимая пшеница

7.8. Использование культуры пыльников и токсинов патогенов в работе по созданию форм огурца, устойчивых к грибным болезням

7.8.1. Микроспорогенез огурца в создании форм, устойчивых к фузариозу

7.9. Оценка устойчивости регенерантов в условиях подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ (озимая пшеница) и ГУСХП «Высоковский» Костромского р-на Костромской обл. (огурец) и получение семян R1 поколения

7.10. Оценка устойчивости растений огурца, полученных от семян R1 поколения в условиях инфекционного фона зимней теплицы и получение семян R2 поколения

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 399

ВЫВОДЫ 414

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная)"

Актуальность темы диссертации. Основной целью селекционных программ является повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание новых сортов и гибридов, обладающих улучшенными качествами продукта, комплексной устойчивостью к болезням, вредителям и стрессовым факторам среды, менее требовательных к условиям возделывания соответствующих регионов страны.

По-мнению Борланга (Вог1ап§,2000), в 21 веке в обеспечении продуктами питания растущего быстрыми темпами населения Земли, решающая роль будет принадлежать современным усовершенствованным биотехнологическим методам, включающим клеточную и генетическую инженерию, и методологиям создания новых форм и сортов важных сельскохозяйственных растений, в том числе основной зерновой культуры пшеницы. Внедрение новых клеточных технологий в сочетаний с методами классической генетики и селекции открывает большие перспективы как для практического использования, так и для решения фундаментальных проблем генетики, биотехнологии, физиологии и биохимии злаковых растений.

Современная биотехнология оказывает существенное влияние на развитие АПК страны. В селекции и растениеводстве основные исследования биотехнологов направлены на создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим или абиотическим факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Эпифитотийный характер распространения наиболее опасных грибных,. вирусных и бактериальных заболеваний сельскохозяйственных растений, уничтожающих до 30% урожая, создали в стране ситуацию, при которой потребность в обновлении сортовых ресурсов сельскохозяйственных культур на основе новых методов биотехнологии, включая гаплоидию и трансгеноз стала исключительно острой. Посевы зерновых на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются корневыми гнилями, ржавчинами, склеротинией. Поражение посевов озимой пшеницы на Северном Кавказе фузариозом колоса приводит к накоплению в зерне опасных для здоровья людей микотоксинов. В отдельные годы фузариозом поражается до половины собранного урожая зерна. Огурцы и томаты повсеместно поражаются фитофторозом, что резко снижает урожай этих ценных продовольственных культур и приводит к большим потерям при их хранении. Корневые гнили и переноспороз почти ежегодно уничтожают на больших площадях посевы огурцов и лука. Частые обширные и жесточайшие засухи, особенно в Поволжье, на Урале, в Сибири и других регионах страны вызывают повреждения и гибель посевов зерновых культур, резко снижают валовые сборы зерна и продукции растениеводства. Низкие температуры и различные неблагоприятные факторы перезимовки приводят к изреживанию и гибели посевов озимых зерновых на больших площадях, достигающих 50% и более. Недобор урожая имеет место на кислых и засоленных почвах, площади которых составляют соответственно 68,9 и 16,3 млн. га сельскохозяйственных угодий. Значительная часть земель в западном и центральном регионах России загрязнена радионуклидами и другими ядовитыми соединениями. Важнейшей задачей генетиков, биотехнологов и селекционеров была и остается идентификация эффективности генов, детерминирующих важнейшие признаки устойчивости растений к стрессовым факторам среды. В ведущих биотехнологических центрах мира ведутся работы по созданию новых форм сельскохозяйственных растений методами генетической трансформации (Альферманн, 1997).

Большой теоретический и практический интерес для селекции представляет, в частности, использование гаплоидии. Применение гаплоидов в селекции позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сократить время для создания сортов. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для получения гаплоидов методами биотехнологии в культуре in vitro злаковых применяют: метод селективной элиминации хромосом в гибридном зародыше с последующей эмбриокультурой (В.Н. Чистякова,2000), культивирование изолированных пыльников и микроспор (Б,Б. Анапияев,2001), где растения образуются двумя путями - путем эмбриоидогенеза в пыльцевых зернах и через образование каллуса из клеток пыльника; культивирование неоплодотворенных завязей и семяпочек (В.Н. Чистякова, Э.Д. Неттевич, Г.В. Гуляев,1994). Диплоидизация гаплоидов, получаемых на основе Fl, сокращает сроки создания гомозиготных линий до 1-2 лет (В.Н. Чистякова, 2000). Быстрое создание гомозигот, обладающих комплексной устойчивостью к корневым гнилям и септориозу, позволяет опережать формообразовательный процесс в популяциях этих патогенов.

Гаплоиды представляют собой наиболее подходящий материал для всех клеточных и генных манипуляций, в том числе и для клеточного мутагенеза (Хинковски Д.,Стоянова И., 1990). Мутации, возникающие на уровне гаплоидов, быстродоступны для отбора и диагностики (Лобанок и соавт., 1988). Это связано с тем, что в диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах, при этом проявляется действие только доминантного гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков. Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения. Гаплоиды также могут возникать спонтанно. Удвоенные гаплоиды могут успешно использоваться при отборе мутантов и из клеточных культур (СЬа1е£Г 11.8., 1983). Исключительная эффективность мутагенеза на гаплоидном уровне определена тем, что диплоидным клеткам необходима двойная мутация в одном и том же локусе с последующим удвоением хромосом. Отборами мутантных клеток из культуры гаплоидных в селективных условиях и далее на инфекционно-провокационном фоне с патогеном фузариума, созданы высокоустойчивые к фузариозному увяданию линии удвоенных гаплоидов льна на базе слабоустойчивых за 1-2 поколения (Поляков А.В.,2002). Таким путем получены также формы риса, рапса, ячменя, устойчивые к грибным патогенам. Однако, большинство мутационных экспериментов проводится только в культуре диплоидных соматических клеток. Это объясняется тем, что в настоящее время лишь у некоторых видов с/х культур из гаплоидных мутационных клеток удалось регенерировать целые растения, хотя устойчивые к биотическим факторам среды мутантные клеточные линии из каллусных суспензионных культур и протопластов получены.

Существуют положительные примеры использования гаплоидов и в биохимической селекции. Так, применение в качестве селективного агента аминокислотных аналогов позволило улучшить состав белков риса (Schaffer G.W.,1982), а культивируя пыльники ячменя на средах с высокими концентрациями солей, удалось получить солеустойчивые растения (Ye J.M.,Kao K.N.,1987). В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом аминокислот. Так, отобраны штаммы клеток моркови и табака, синтезирующие в 20-30 раз больше свободного триптофана по-сравнению с родительскими формами. Этим способом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, способных к сверхсинтезу лизина, » метионина, пролина, фенилаланина и глицина. Использование гаплоидов в биохимической селекции представляет реальный путь создания растений с повышенным содержанием особенно незаменимых аминокислот (Долгих Ю.И.ДБамина З.Б.,1991).

Однако, главным преимуществом удвоенных гаплоидов является быстрое достижение гомозиготных линий, что особенно важно при работе с озимыми, двулетними и многолетними культурами. Наиболее интересен в этой связи метод культивирования изолированных пыльников и микроспор. Используя пыльники F1- растений для получения удвоенных гаплоидов, можно на ранних этапах селекционного процесса отбирать в относительно небольших популяциях рекомбинантные генотипы, несущие желаемые признаки, в том числе устойчивые к болезням. На основе дигаплоидов, полученных методом культуры пыльников, в Китае создана серия новых сортов яровой пшеницы и риса, а во Франции зарегистрирован новый сорт пшеницы Florin (De Buyser Y,Henry Y. et al., 1987, табл.1). Проблеме получения гаплоидов зерновых злаков посвящено множество экспериментальных работ, обзорных статей и монографий (Бутенко Р.Г., 1975; Хохлов и др., 1976; Суханов,1983; Дьячук,

Дьячук,1989; Picard et al.,1990). Однако, несмотря на перспективы метода культуры пыльников, использование его на многих культурах все еще достаточно ограничено. Это связано с тем, что до настоящего времени не разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников различных генотипов зерновых культур (Foroughi-Wehr, 1979; Heberle-Bors, 1998), не решены проблемы регенерации, альбинизма и другие.

Таблица 1

Сорта зерновых культур, созданные на основе гаплоидии (Цит. по: Дьячук Т.И., 2003)

Культура Метод Сорт Страна Источник

Озимая пшеница Культура пыльников Florin Франция DeBuyseret al., 1987

-II- Культура : пыльников Ambitus Венгрия Pauk, 1996

-II- Культура пыльников Delibab Венгрия Pauk, 1996

-II- Культура пыльников Jinghua 1 Китай Hu et al, 1986

-II- . Культура пыльников Jinghua 3 Китай Hu et al, 1986

-II- Культура пыльников Anther Culture 28 Китай Zhao et al, 1990

Яровая пшеница Культура пыльников Саратовская 64 Россия Kusmenko, Djatchouk, 1997

Ячмень «бульбозум» Исток СССР Наволоцкий, 1986.

-//- «бульбозум» Одесский 115 СССР Наволоцкий, 1986

-II- «бульбозум» Биос, Вулкан, Рахат Россия Чистякова, 2001

-II- «бульбозум» Мураш Россия Иванов и соавт, 2001

-II- «бульбозум» Нутанс 240 Россия Ильин и соавт, 2000

-II- «бульбозум» Mingou Канада Но, Jones, 1980

-II- «бульбозум» • Gwilan Новая Зеландия Цит. по Baenzieger et al, 1985

-II- ' «бульбозум» Doublett ' Англия Цит. по Baenzieger et al, 1985

-II- «бульбозум» Rodeo Канада Campbell et al., 1984

Рис Культура пыльников Марианна Болгария Бояджиев, 1990

-II- Культура пыльников Tanfeng 1, Zoughua 2, Hua Yu 1, 2 и др. Китай Ни Han, 1985

Метод изолированных пыльников и микроспор основан на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений и предложен Гуха и Махешвари (Guha,Maheshvari) в 1964 году. Это уникальное явление связано с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vitro, здесь не происходит, а производные спорогенных клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам (Батыгина,1978-1992; Горбунова и др.,1993). Поэтому, по мнению Суханова (1983), андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений, позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолированных пыльников.

Культивирование изолированных пыльников основано на использовании явления прямого, и непрямого андрогенеза in vitro (Vasil,Nitsch,1975; Sangwan, Sangwan-Norrel,1987). При прямом андрогенезе in vitro образование гаплоидного растения происходит за счет микроспор или клеток пыльцевого зерна, развивающихся в эмбриоиды. Прямой андрогенез in vitro связан с явлением эмбриоидогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina,1990). В свою очередь, эмбриоидогенез рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Batygina, 1984,1986; Kudarov et al.,1990).

При непрямом андрогенезе in vitro микроспоры или клетки пыльцевого зерна образуют недифференцированный каллус, который после переноса на среду, индуцирующую органогенез, дает начало растениям-регенерантам различной степени плоидности. Непрямой андрогенез in vitro связан с явлением гемморизогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina,1990), в то же время, гемморизогенез (органогенез) рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Kudarov et al.,1990). Необходимо отметить, что прямой эмбриоидогенез является наиболее выгодным способом получения гаплоидов in vitro (Суханов, 1983; Шамров и др.,1988; Горбунова и др.,1988; Батыгина и др.,1992), поскольку он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры неоднократного пассирования.

В современной мировой научной литературе уделяется достаточно внимания гаплоидной биотехнологии, однако остается множество проблем, препятствующих широкому внедрению гаплоидии в селекционную практику. Это, в первую очередь, связано с тем, что все еще слабо изучены как теоретические, так и практические вопросы экспериментальной гаплоидии. Не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений злаков. Основная причина этого - методические и технические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителя именно этого семейства - пшеницы. Предлагаемые в литературе прописи культивируемых сред на практике часто не воспроизводимы, нет четких биотехнологических регламентов массового получения гаплоидов в культуре in vitro, нет рекомендаций применительно к условиям культивирования эксплантов - пыльников и микроспор, не указаны факторы, отвечающие за выход зеленых растений-регенерантов пшеницы. Отсюда, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями на сегодняшний день - это низкая продуктивность андрогенеза in vitro у пшеницы. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sanderland, 1977; Heberle-Bors, 1983). Традиционные методы изучения фитогормонов не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фитогормональной регуляции андрогенеза и ризогенеза in vitro.

Имеющиеся публикации о цитологических особенностях разных этапов андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы достаточно разрознены (Размологов и соавт.,1979; Shumann et al., 1986; Kruger et al., 1988; Barnabas et al.,1988; Higuchi,1991).

Аналогичные вопросы андрогенеза in vitro по озимой пшенице в литературе не рассматривались. Нет единого подхода к унификации процесса культивирования изолированных пыльников мягкой пшеницы, что приводит к невозможности сравнения экспериментальных данных, полученных разными авторами, успешно работающими в данной области (Дьячук Т.Н.,2003; Приходько,1988; Barnabas et al.,1989; Foroughi-Wehr, et al.,1990; Loschenberger et al.,1992; Shimada et al.,1993; Henry et al.,1993; Горбунова, 1993; Першина и соавт.,1993; Datta,Wenzel,1986; Reynolds, 1993; Touraev,Indrianto,Wratschko et al., 1996). Не решена и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути развития на спорофитный путь. Не исследованы вопросы о предпосылках этого явления в условиях in vivo, начальных этапах дифференциации микроспор на путь эмбриоидогенеза или каллусогенеза, об эндогенных факторах, предопределяющих выбор различных путей морфогенеза.

Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генетических особенностей ответной реакции экспланта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогормонов как в момент инокуляции экспланта на питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания дифференциальных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение в решении фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

Из семейства Мятликовых (Роасеае) в структуре зерновых площадей России наиболее.распространена пшеница (Triticum L.). Из сем. Тыквенных (Cucurbitaceae) - огурец. Посевы огурца и зерновых культур на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются грибными болезнями. Среди них наиболее вредоносными являются фузариозные корневые гнили, септориоз и склеротиния, на огромных площадях поражающие посевы зерновых культур, в том числе озимой пшеницы, и наносящие ущерб на сумму около 5 млрд. долларов (Сидоров А А., 2001).

Обзор нерешенных методологических проблем по вопросу культивирования пыльников и микроспор яровой мягкой пшеницы in vitro четко определил для нас границы изучения проблемы андрогенеза in vitro в селекции озимой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение в Центральном Нечерноземье. Разработку гаплоидной биотехнологии и ее применение в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибным болезням предполагалось начать с отработки простой и надежной методики культивирования пыльников и микроспор для массового получения, идентификации и диплоидизации гаплоидных растений с использованием андрогенеза in vitro, создания рецепта универсальной среды, способной направлять развитие микро- и макроспор по пути каллусо- или эмбриоидогенеза, изучения цитофизиологических закономерностей андрогенеза in vitro и создания сортов, устойчивых к фитопатогенам.

Цель и задачи исследований. Цель наших исследований заключалась в обобщении теоретических и разработке прикладных аспектов применения гаплоидной биотехнологии на основе метода культивирования пыльников и микроспор, изучения особенностей андрогенеза in vitro сортов озимой пшеницы селекции НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область), обладающих повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

В процессе реализации поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Разработать биотехнологию получения андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы.

5. Выявить факторы, положительно влияющие на гаплопродукцию озимой пшеницы и определить лимитирующие, затрудняющие процесс выхода зеленых регенерантов в культуре изолированных пыльников и микроспор.

Провести цитологический мониторинг этапов андрогенеза in vitro озимой пшеницы и цитофотометрический анализ ДНК с использованием возможностей светового микроскопа «Opton-15» и цитоспектрофотометра SMP-20 «Opton».

Разработать гаплоидную и микроспорогенную биотехнологии получения новых форм озимой. пшеницы и огурца, отличающихся повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

3. Создать линии удвоенных гаплоидов, устойчивых к фузариозным корневым гнилям с целью использования их в селекционных программах лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка, Московская обл.).

2. Разработка и обоснование технологических аспектов для культуральной системы in vitro: пыльник-микроспора - на основе разработки условий стерилизации эксплантов, подбора компонентов индукционных сред, включая различные виды органических добавок.

Научная новизна

Впервые для мягкой пшеницы с озимым типом развития разработана и использована биотехнология, обеспечивающая получение гаплоидов и дигаплоидов в генетико-селекционных программах НИИСХ ЦРНЗ для ускоренного создания форм, устойчивых к фузариозным корневым гнилям. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей андрогенеза in vitro и установлены общие принципы образования гаплоидов озимой пшеницы в системе андрогенез-гиногенез. При этом изучены 30 вариантов культуральных сред, содержащих различные виды органических добавок, а также ацетона, предложена универсальная базовая среда для конвейерного отбора эмбриоидогенных структур, способных к развитию зеленых растений-регенерантов. Проведено комплексное изучение как внешних, так и внутренних факторов, влияющих на эффективность гаплопродукции озимой пшеницы в культуре пыльников и микроспор, показана относительно слабая роль низких положительных температур для эффективности андрогенеза пшеницы с озимым типом развития и положительная роль присутствия в среде ацетона. Определены пути морфогенеза и основные факторы, как ускоряющие, так и лимитирующие процесс регенерации зеленых гаплоидов в культуре in vitro. Изучено морфологическое строение каллусных и эмбриоидогенных структур в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы и выявлены новые их типы. В процессе разработки эмбриологических основ андроклинии озимой мягкой пшеницы, установлены четыре типа апертур микроспор, нехарактерных для этой культуры.

Предложен экспресс-метод оценки огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастанию пыльцевых трубок на средах, содержащих токсин гриба Fusarium sp.

Практическая ценность работы. Разработанные технология создания андрогенных гомозиготных линий и методы тестирования гаплоидных растений озимой пшеницы по характеристикам андрогенеза и устойчивости к грибным болезням использованы в селекционном процессе лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п. Немчиновка, Московская обл.) для создания сортов, устойчивых к корневой гнили. В Федеральный институт промышленной собственности поданы заявки на «Технологию (Способ) создания форм мягкой пшеницы с озимым типом развития методами гаплоидной биотехнологии» и «Состав индукционной среды для получения гаплоидных растений озимой мягкой пшеницы». Полученные теоретические и практические разработки по сравнительному влиянию различных органических добавок, включая ацетон, аминокислоты, крахмалы и др., активно используются при чтении лекционного курса по предмету «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» на кафедре хранения, переработки и товароведения продукции растениеводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, а также отражены в 8-ми лабораторно-практических занятиях в разделе «Клеточная биотехнология и биоинженерия» Лабораторного практикума по сельскохозяйственной биотехнологии, изданного коллективом авторов под редакцией завкафедрой с/х биотехнологии РГАУ - Московская с/х академия имени К.А. Тимирязева, академика РАСХН B.C. Шевелухи для студентов, бакалавров, магистров и аспирантов агрономических специальностей (Москва, 2004); в разделе «Микробиотехнология» Тестовых заданий по дисциплине «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» для студентов высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности 311200 (110305) - Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции.

A.c. №1720595 (СССР) на «Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.)». Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г. (1991) и методика экспресс-анализа огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастающим на токсичных средах пыльцевым трубкам применяется в селекционной работе ГУСХП «Высоковский» Костромской обл., Костромского р-на для размножения оздоровленного селекционного материала (Л 42$ и Л 29$ ) в семеноводстве широкорайонированного для зимних теплиц гибрида Fl Грибовчанка-безвирусная.

Личный вклад соискателя Разработка программы исследований по докторской диссертации с озимой мягкой пшеницей, ее выполнение и использование в селекционном процессе НИИСХ ЦРНЗ проводились автором во время обучения в очной докторантуре на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии. При оформлении научных публикаций, постановке проблемы диссертации участие автора было определяющим.

Связь работы с крупными научными программами.

Диссертационная работа выполнялась в соответствии с утвержденной 24.03.2003 г. темой докторской диссертации и Программой лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (Московская область, п.Нёмчиновка) «Селекция озимой пшеницы в создании форм, устойчивых к болезням».

Автор выражает глубокую и сердечную благодарность: научному консультанту, академику РАСХН, заведующему кафедрой сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н., профессору Виктору Степановичу Шевелухе за постоянное внимание к работе по теме диссертации; академику РАСХН, Президенту союза селекционеров России и зав. лабораторией селекции озимой пшеницы, д. с.-х.наук Баграту Исменовичу Сандухадзе и ст.н.с. этой лаборатории, к.с.-х.н. Бугровой Валентине Васильевне за подбор хозяйственно-ценного селекционного материала озимой пшеницы (семена и растения-доноры) в годы исследований; доктору биологических наук Чистяковой Валентине Николаевне, к сожалению, безвременно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе в 2000 году.

Университета им. Мартина Лютера (г.Халле, Германия) Юргена Кранца, завлабораторией биотехнологии ВНИИ риса (г.Краснодар), к.б.н. Мухину Ж.М., декана технологического факультета РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, д.б.н., профессора Новикова Николая Николаевича; профессора кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, д.с.-х.н. Пронину Наталию Борисовну; за методическую помощь при микроскопировании -руководителя центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, к.б.н Карлова Геннадия Ильича и ст.н.с. этого центра Андрееву Галину Николаевну, а также всех сотрудников кафедры с.-х. биотехнологии Университета за предоставленную возможность проведения данных исследований.

С особой теплотой и благодарностью отмечаю большое внимание и помощь, которые оказала мне в научном творчестве, особенно в выборе дальнейших научных исследований с изолированными клетками и тканями растений in vitro, мой первый научный руководитель и наставник, академик РАСХН и чл.-корреспондент РАН, д.б.н., профессор Раиса Георгиевна Бутенко, безвременно ушедшая от нас в 2004 году.

Публикации. Полученные экспериментальные данные подтверждены 33 печатными работами, из них 2 - в зарубежных изданиях, включая A.C. на изобретение и 2 заявки на единый патент РФ. Учебно-методическая литература представлена б изданиями.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературных источников по проблеме, материалы и методы исследования и 5 глав с результатами исследований и обсуждениями. Имеются также: заключение, выводы, список цитированной литературы и приложения. Объем основного текста работы составляет 470 страниц; включая 62 рисунка и 51 таблицу. Список использованной

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лаврова, Наталия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. На основе выявления цитоэмбриологических особенностей процессов эм-бриоидогенеза и морфогенеза создана система культивирования in vitro изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития на селективных средах с токсином патогена фузариозной корневой гнили и разработана гаплоидная биотехнология для прямого использования в практической селекции для создания хозяйственно-ценных сортов этой культуры, устойчивых к F.oxysporum, F.moniliforme и F.solani. Доказана целесообразность последовательного отбора гаплоидных каллусных структур на селективных средах с высокими концентрациями токсина фузариевой кислоты (50 - 100 мкг/мл), возникающих в культивируемых клетках, способных к регенерации растений.

4. Впервые показано, что микроспоры, находящиеся на поздней стадии развития, под действием индукционных сред МС №№ 8-10, содержащих ацетон, и низкотемпературного стресса перемещаются в полость гнезда пыльника. Только на индукционных средах с добавлением ацетона в концентрации 0,26 - 0,34 M микроспоры образуют эмбриогенные комплексы как путем прямого эмбриоидогенеза, так и в культуре длительнокультивируемой каллус-ной ткани.

5. Впервые в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы на среде с ацетоном в концентрации не менее 0,26 M получены эмбриоиды, морфогенные и неморфогенные каллусы нового типа, отличающиеся по морфологическим свойствам и анатомическому (сферическому) строению.

6. Впервые в культуре in vitro озимой мягкой пшеницы выявлены 4 типа апертур микроспор: моносулькатные, монокольпатные, трехкольпатные и пен-такольпатные, через которые при культивировании микроспор in vitro на индукционных средах с ацетоном происходит прорастание пыльцевых трубок.

8. Разработан ускоренный метод оценки селекционных генотипов огурца и АДГ-линий озимой мягкой пшеницы на средах с токсином гриба Fusarium sp. по темпу прорастания пыльцевых трубок в селективной среде. Предложен экспресс-метод оценки селекционного материала огурца (на примере JI 42$ и JI 29$ Fl Грибовчанка-безвирусная) на устойчивость к фузариозу in vitro с использованием КФ из F.oxysporum, F.moniliforme, F.solani и токсина патогена.

9. Доказано, что показатели устойчивости к токсину фузариевой кислоты изолированных меристем, каллусных тканей и пыльцевых трубок (некротические явления, летальный исход) коррелируют с устойчивостью вегетирующих растений, выращенных на инфекционном фоне с патогенами корневой гнили.

10. Разработанные биотехнологии огурца (меристемная, каллусная и микро-спорогенная) позволяют сократить селекционный процесс и включать в него ценные малосемянные линии и сильно пораженные грибными болезнями плодоносящие растения при необходимости их размножения для селекционных целей в работе на иммунитет.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лаврова, Наталия Владимировна, Москва

1. Абрамова З.Б. Практикум по генетике. М.: Наука, 1987. С.216

2. A.c. СССР № 1036306. Способ получения растений пшеницы в культуре пыльников. Авторы: Суханов В.М., Тырнов B.C., Салтыкова H.H. Заявл.01. 04. 1981 г. Опубл. 23. 08. 1983 г. Бюл. № 31.

3. Александрова Л.Г., Лукьянюк С.Ф. Пыльниковая культура ячменя: эффективность, воспроизводимость // Материалы научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии. Целиноград. - 1991. - С. 63-65.

4. Анапияев Б.Б. Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы. // Монография (Ред. Рахимбаев И.Р). Алматы. - 2001. - 220 с.

5. Анапияев Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы // Автореф. дис. . докт. биол. наук. -М., -2001. 50 с.

6. Аникеева Н.В. Использование клеточной селекции для создания форм пшеницы, устойчивых к корневой гнили // Тезисы докладов Всероссийского съезда: Защита растений в условиях реформирования АПК. СП б, 1995. С. 83-84.

7. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы: Изд. Колос, Л., - 1974. - 206 с.

8. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Атлас: Изд. Наука. Л., -1987. -108 с.

9. Батыгина Т.Б., Шамров И.И., Дьячук Т.И. Эмбриогенный тип бесполого размножения и классификация аномалий в культуре пыльников на примерепшеницы // Биология культивируемых клеток и биотехнология.

10. Новосибирск.- 1988.-С. 210-211.

11. Батыгина Т.Б., Круглова H.H., Горбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриогении растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.

12. Бояджиев Петьр. "Мариана", нов сорт ориз, получен по метода на антерните култури // Растениевод. Науки Болг., 1990. -Т. 27. - С. 11-113.

13. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М., - 1964. - Наука. - .272 с.

14. Бутенко Р.Г. Дифференциация и морфогенез в культуре тканей, клеток ипротопластов //Биология развития растений. М.: Наука, 1975. С. 48-65.

15. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке ипрактике //Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Агропромиздат, 1990. С. 154-235.

16. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе // Уч. пособие. М,: ФБК-ПРЕСС. -1999. -160 с.

17. Вавилов Н.И. Роль Центральной Азии в происхождении культурных растений // Избр. произв. в 2-х томах. Л.Б - 1967.

18. Васильева (Горбунова) В.Ю., Ильина Л.Б. К изучению наследования продуктивности, содержания белка и признаков, определяющих технологические свойства у гибридов мягкой пшеницы //Проблемы генетики и селекции на Урале. Свердловск, 1976. С. 24.

19. Васильчук Н.С. Селекция яровой твердой пшеницы. Саратов. - 2001. -123с.

20. Внучкова В.А., Анащенко A.B. Создание перспективных линий яровой пшеницы при использовании метода гаплоидии in vitro //Доклады РАСХН. 1993. №1. С. 12-15.

21. Володарский А.Д., Чаянова С.С., Хебер У., Халлиер У.В., Шмитт Ю. Определение содержания ферментных белков с помощью иммунохимической тест-системы // Физиология растений. 1979. - т. 26. -С. 71-74.

22. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. - 1982. - 448 с.

23. Голубовская И.Н. Генетический контроль мейоза. Автореф. дис. . докт. биол. наук. Новосибирск. - 1983. -32 с.

24. Горбунова В.Ю. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницыцитолого-гиотологические аспекты.-Уфа.-1992. 62 с.

25. Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы // Автореф.дис. докт. биол. наук. Санкт-Петербург. -2000. - 48 с.

26. Гостимский С.А., Багрова A.M., Ежова Т.А. Обнаружение и цитогенетический анализ изменчивости, возникающей при регенерациирастений из культуры тканей // Доклады АН СССР. 1985. Т.283. №4. С.1007 -1011.

27. Дмитриева H.H. Особенности метаболизма белка и нуклеиновых кислот в процессе дедифференциации клеток сердцевинной паренхимы стебля табака //' Труды 1-й Всес. конф. "Культура изолированных органов и клеток растений". М.; Наука.-1970. - С. 101-106.

28. Данвелл ДЖ. М. Культуры гаплоидных клеток //Биотехнология растений: культура клеток /Пер. с англ. Негрука В.И., под ред. Р.Г. Бутенко М.: ВО Агропромиздат, 1989. С. 33-51.

29. Дунаева С.Е. Использование различных клонов Hordeum bulbosum в качестве опылителей для получения гаплоидов культурного ячменя // Научно-технический бюл. ВИР им. Н.И. Вавилова. Л., - 1990. - Вып.204. С.12-16.

30. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г. , Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. Пособие. М. Изд-во Общества фитопатологов, 2001. - 302 с.

31. Дьячук Т.И., Дьячук П.А., Столярова C.B. Получение гаплоидных растений яровой мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. 1986. - № 10. - С. 2-3.

32. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Культура пыльников злаков современное состояние, проблемы, перспективы // С/х биология. - 1989. - № 5.- С. 3-10.

33. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников // Всероссийское отделение ВАСХНИЛ: НПО " Элита Поволжья". -М., -1989. -36 с.

34. Дьячук Т.И., Столярова C.B., Носова О.Н. Культура пыльников межвидовых гибридов пшеницы и тритикале // Биологические основы селекции. -Саратов,-1991.-С. 29-35.

35. Дьячук Т.И. Культура пыльников и формообразовательный процесс у яровой мягкой пшеницы // Генетика. -1994. -Т. 30. С. 45.

36. Дьячук Т.Н., Сафронова Н.Ф. Об использовании метода культуры пыльников для получения гаплоидов ячменя // С/х биология. 1996. - №5 - С. 72-75.

37. Дьячук Т.И. Технологические и селекционные аспекты гаплоидии (на примере пшеницы и ячменя): Автореф. дис.докт.биол.наук. Саратов, 2003.-49 с.

38. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М.: Высшая школа, 1987,-54 с.

39. Игитирякова Ф.К. Изоферментные спектры эстеразы пшеницы и эгилопсов при патогенезе, вызываемом возбудителями корневой гнили, в качестве критерия оценки заболевания //С.-х. биология. Сер. Биология растений. 1993. №3. С.62-66.

40. Ильина Л.Г. Селекция яровой пшеницы в НИИСХ Юго-Востока // Научные труды НИИСХ Юго-Востока. Саратов. - 1970. - Вып. 27. - С. 5-126.

41. Ильина Л.Г. Селекция саратовских яровых пшениц. Саратов: Изд. СГУ. -1996.-130 с.

42. Ильина Л.Г. Саратовской селекции яровой пшеницы 90 лет // Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье. Научные труды. Саратов. - 2000. -С. 7-13.

43. Ильин A.B., Калинин Ю.А., Степанова Т.И. Селекция ярового ячменя на продуктивность и качество зерна на Краснокутской станции // Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье. Саратов. - 2000. - С. 186-194.

44. Ильин A.B. Селекция ярового ячменя в Поволжье // Автореферат дис. докт; с.х. наук. Саратов. - 2000. - 48 с.

45. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка. - 1980. - 399 с.

46. Карабаев М. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты: Автореф. дис.докт.биол.наук. -М., 1994. -49 с.

47. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К., Дарканбаева Г.Ё., Шегебаев О.Ш. Изучение генетической обусловленности и наследуемости каллусообразования и регенерационной способности пшеницы // Материалы

48. Всесоюзной конф. по сельскохозяйственной биотехнологии. -Целиноград. -1991.-С. 29-30.

49. Калинина Р.Г. Определение патогенности и наличия фитотоксинов у грибов рода Fusarium возбудителей корневой гнили озимой пшеницы //Микология и фитопатология. 1980. Т.14. Вып. 1. С. 51-56.

50. Козловская В.Ф. Преодоление межвидовой несовместимости пшениц // Рос. вестн. с.-х. наук. 1992. - № 6. - С. 18-19.

51. Круглова H.H., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков //Успехи соврем. Биологии. 1997. Т.117. Вып. 1. С. 83-94.

52. Круглова H.H., Сельдимирова O.A. Культура изолированных пыльников злаков: точка зрения эмбриолога. 2. Характеристика эмбриолога // Клеточные культуры. 2000. - Вып. 15. - С. 9-12.

53. Крупнов В.А. Генная и цитоплазматическая мужская стерильность растений. М.: Колос. 1973:277с.

54. Крупнов В.А., Мартынов С.П., Седловский А.И., Добротовская Т.В. Методические указания по использованию метода ОСП (одно семя с растения на потомство) в селекции самоопыляющихся культур. М.: ВАСХНИЛ. 1983.36 с.

55. Крупнов В.А. Сравнительная оценка биотехнологических методов в селекции злаков //Вестн. С.-х. науки. 1989. №3. С. 24-29.

56. Куперман Ф.М. Теория индивидуального развития и пути управления природой организма // М.: Изд-во МГУ, 1962. 78 с.

57. Лаврова Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы, Монография. М;: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2006.

58. Лаврова Н.В. Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибным болезням // Практический комментарий. Дел. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №49 ВС - 2006 от 15.07.06.-М.-№3.2-53 с.

59. Лаврова Н.В. Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибным болезням // Практический комментарий. Деп. в электронном изд. БД «Агрос» №02200510769 в НТЦ «Информрегистр» №49 ВС -2006 от 15.07.06.-М.-№3.2-53 с.

60. Лаврова Н.В. Сельскохозяйственная биотехнология. Часть 1. Клеточная инженерия: учебно-методическое пособие, Кострома:1. Изд. КГСХА, 2000. 32 с.

61. Лаврова Н.В. Состав индукционной среды на получение гаплоидов озимоймягкой пшеницы in уИго//заяв. в Роспатент, № госрегистрации2006134941.- 10 с.

62. Лаврова Н.В. Способ получения селекционных генотипов озимой мягкойпшеницы in vitro //заяв. в Роспатент, № госрегистрации 2006134942. 13 с.

63. Лаврова Н.В. Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции; Тестовые задания, М.: изд.1. МСХА, 2005, 17 с.

64. Лаптев Ю.П. Гетероплоидия в селекции растений. М., Колос. -1984.-248 с.

65. Лисовская Т.В. Биотехнология и сорта растений (обзор патентной информации)-М.: Полиграф-ресурсы, 2001.

66. Лобачев Ю.В. Проявление генов низкорослости у яровых пшениц в нижнем Поволжье.( Ред. Крупнов В.А.). -Саратов: СГАУ. 2000.-264 с.

67. Лукьянюк С.Ф. Разработка приемов in vitro для получения гаплоидов ячменя и тритикале: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М., 1983. 18 с.

68. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Методы культуры тканей и органов в селекции растений/Методические рекомендации. Одесса, 1980.-21 с.

69. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб.: Изд. С.

70. Петерб. Ун-та, 2003. 228 с.

71. Мазин В.В. Методические указания по иммунологической оценке клевералугового, устойчивого к склеротиниозу и фузариозу. М., 1984. 24 с.78. .Маркова H.B. Методы in vitro в селекционной работе с растениями огурца

72. Cucumis sativus L). Автореферат дис.к.б.н. -М., 1991, С.32.

73. Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений /Пер. с англ. Попова В.В.-М.: Колос, 1980.- 127 с.

74. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений.М.: Колос, 1980, 304 с.

75. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии,- М.: Наука, 1988.

76. Поляков A.B. Биотехнологические методы в селекции льна-долгунца: Автореф. дис.докт.биол.наук, 1999, 49 с.

77. Поляков A.B. Биотехнология в селекции льна. Тверь: Формат, 2000. - 179 с.

78. Приходько Н.И. Получение гаплоидных растений из пыльцевых зерен мягкойпшеницы Triticale aestivum L. //Тр. по прикл. бот., ген. и сел. 1980. Т. 67. №3. С.75-79.

79. Приходько Н.И. Получение гаплоидов в культуре пыльников мягкой яровойпшеницы //Науч.-техн. .Бюлл. ВНИИ растениеводства. 1988. № 174. С. 51-59.

80. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М.: Высшая школа, 1960.206 с.

81. Размологов В.П., Пухальский В.А. Культура пыльцевого зерна Triticumaestivum L. in vitro //Докл. Акад. Наук СССР, 1979. Т.244, №5. С.1278-1280.

82. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш.Ю Кударов Б.Р. Экспериментальная гаплоидия вкультуре пыльников и микроспор зерновых злаков (обзор) //С.-х. биол., 1990. №3.№ 44-49.

83. Сандухадзе Б.И., Рыбакова М.И., Морозова З.А. Научные основы селекцииозимой пшеницы в Нечерноземной зоне России. М.: МГИУ, 2003. 426с. ■

84. Сидоров A.A. Селекция на иммунитет. М., МОО «Общество фитопатологов»,2001, 179 с.

85. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Гл. 2.

86. Сомаклональная изменчивость. Киев, Наукова думка, 1990, с. 29-49.

87. Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы: Автореф.дис.канд. биол.наук. -М., 1984.- 17 с.

88. Суханов В.М., Тырнов B.C. Получение гаплоидов in vitro из соматическихклеток //Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. С.99-110.

89. Тураев A.M., Шамина З.Б. Оптимизация состава среды для культивированияпыльников хлопчатника//Физиология растений, 1986, Т. 33, №3, с. 565 -571.

90. Тураев A.M. Молекулярная генетика и биотехнология пыльцыпокрытосеменных: Автореф. дис.докт.биол.наук. Ташкент. 1998. 42 с.

91. Тырнов B.C. Андрогенез in vivo у растений //Биология развития и управлениенаследственностью. М.: Наука, 1986. С. 138 164.

92. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. Гаплоидия и селекция /Под ред.д.б.н. В.А. Крупнова/- М., Наука, 1976,221 с.

93. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников имикроспор //Культура клеток растений.- М.: Наука, 1981. С. 124-136.

94. Шаяхметов И.Ф., Сурина О.Б., Мулюкова Г.А. Клеточная селекция яровойпшеницы на устойчивость к корневым гнилям //Генетика. 1994. Т. 30. С. 181.

95. Шкаликов В.А. Комплексный метод защиты зерновых культур от корневыхгнилей: Автореф. дис. .докт. биол. наук/ТСХА. М., 1996. 40 с.

96. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидиплоидов,мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование. М.: МАКС-Пресс, 2000.

97. Эльконин JI.A. Морфогенез и стабильная регенерация растений в каллусныхкультурах //Ботанич. журнал. 1989, №74, с. 1740.

98. Юрина О.В., Пивоваров П.Ф., Балашова Н.Н. Селекция и семеноводствотыквенных культур в России. М., 1998, 424 с.

99. Agache S., Bachelier В, de Buyser J, Непту У and Snape J. Genetic analysis ofanther culture response in wheat using aneuploid, chromosome substitution and translocation lines / Theor.Appl.Genet., 1989. V. 77. P.7-14.

100. Andersen S.B., Due L.K and Olsen A. The response of anther culture in agenetically wide material of winter wheat (Triticum aestivum L.) //Plant Breed.,1987. У. 99. P. 181-186.

101. Armstrong T.A., Metz S.G., Mascia P.N. Two regeneration systems for theproduction of haploid plants from wheat anther culture / /Plant Sci. 1987. V. 51, N3. P. 231-237.

102. Aruga K., Nakajima Т., Yamamoto K. Embryogenic Induction in pollen Prains of

103. Nicotiana tabacum IV/Japan. J. Breed., 1985a, V. 35, N 1, P. 50-58.

104. Aruga K., Nakajima T. Role of Anther on Pollen Embryogenesis in Anther = > of

105. Nicotiana Tabacum//Japan. J. Breed. 1985a, V. 35. N. 4. P.390-397.

106. Atzorn R., Weiler E.W. The immunoassay of gibberellins // Planta. 1983. V.159.1. N1.P.7.

107. Baenziger P.S., Wesenberg D.M., Schaffer G.W., Galun E. Feldman M. variation among anther culture derive doubled haploids of "Kitt" wheat //Proc. Intern. Sympl. Wheat Genetics. Kyoto. 1983. P.575-581.

108. Baenzieger P.S. and Schaeffer G.W. Dihaploids via anthers cultured in vitro// Genetic engineering: application to agriculture. Beltsville Symposium 7 (ed. D. Owens). Rowman and Ahanheld: (Totowa) 1985, P. 269-284.

109. Baenziger P.S., Peterson C.J., Morris M.R., Mattern P.J. Quantifying , gametoclonal variation in wheat doubl haploids / / Current options for cereal improvement. Advances in agricultural biotechnology. 1989. P. 343-356.

110. Baenziger P.S. The effects of interaction of culture environment with genotype on wheat anther culture response //Plant Cell Repts. 1990. V.9. P. 525-529.

111. Ball.E. Hydrolysis of sucrose by autoclaving media, a neglected aspect of the technique of culture of plant tissues // Bull. Torrey Bot. Club 80. 1953. V. 4. P. 409411.

112. Barclay I.R., Shepherd W.E. and Sparrow D.H. Control of chromosome elimination in Hordeum vulgare H. bulbosum hybrids // Barley Genet. Newsletter. 1975. V.1256. P. 410-411.

113. Barloy D., Denis L., and Beckert M. Comparison of the aptitude for anther culture in some androgenetic doubled haploid maize lines // Maydica. 1989. Y.39.1. P,303-308.

114. Barnabas B., Fransz P., Schell J. Ultrastructural studies on pollen embryoginesis in maize.(Zea mays L.) //Plant Cell Repts. 1987. Vol.6. N 3.212-215.

115. Barnabas B., Szakacs E., Liszt K. Cytological aspects of in vitro androgenesis in cereals//Sexual reproduction in higher plants. Berlin, 1988. P. 113-118.

116. Barnabas B., Szakasz E., Kovacs G. Induction of haploid plants from wheat Triticum aestivum L.) anther culture//Sver. Utsadesforen. Tidskr. 1989. Y. 99. N . P. 115-123.

117. Barnabas B.P., Pahler P.L., Kovacs G. Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihapldd plants in wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet., 1991. V.81. P. 675-678.

118. Batygina T.B. Tfye place of embryoidogeny in system of flowering plant' reproduction // Abstr. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". Leningrad: Nauka, 1990. P. 17.

119. Beaumont V.H., Rocheford T.R., and Widholm J.M. Mapping the anther culture response genes in maize (Zea mays L.)// Genome 1995.V.38.- P.968-975.

120. Becraft P.W., Taylor J.A. Effects of nucleus, cytoplasm and male sterile nucleus cytoplasm combination on callus initiation in anther culture of wheat//Suphytica. 1989. V.44. P. 235-240.

121. Bennet MIL, Hughes W.G. Abnormal mitosis in wheat pollen induced by ethrel // Nature. 1972. V. 240. P. 566-568.

122. Bennet MIL, Finch R.A., Barclay I.R. The time and mechanism of chromosome elimination in Hordeum hybrids // Chromosoma. 1976. V. 54. P. 175-200.

123. Bernard S. In vitro androgenesis in hexaploid Triticale: determination of Physical condition increasing embryoid and green plant production// Pflanzenzucht.1980. V. 85. P.308-321.

124. Bhojwani S.S., Dunwell J.M., Sunderland N. Nucleic acid and protein contents of embryogenic tobacco pollen //J. Exp. Bot. 1973. V.24. N.13. P.863-871.

125. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of coybean tissues// Physiol. Plant. 1966. V.19. N. 3. P.748-753.

126. Bojadjiev P., Cuong Ph. V. Cytological and physiological studies of some varieties and F1 hubrids of rice, Oruza sativa, uging the method of anther culture //Bionature. 1988. V. 8. N 1. P. 41-46.

127. Borkird C., Choi H., Sung Z.R., Effect of 2,4-dichlorophenozyacetic acid on the expression of embryogenic programm in carrot// Plant Phisiol. 1986, 81, N. 4, 11431146.

128. Bullock W., Baenziger P., Schaeffer G. Anther culture in wheat (Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses//Teor. And Appl. Genet. 1982. V.62. N.2. P.155-159.

129. Brian R.Orshinsky, McGregor L.J., Johnson G.I., Hucle P, and Kartha K. Improved embryoid induction and green shoot regeneration from wheat anthers cultured in medium with maltose // Plant Cell Reports. 1990. V. 9. P. 365-369.

130. Bullock P. and P.S.Baenziger. Anther culture of wheat ( Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses // Theor.Appl.Genet., 1982. V. 62. P. 155-159.

131. Bushuk W., Zillmann R. Wheat cultivar identification by gliadin electroforegrams. 1. Apparatus, method and nomenclature // Can. J. Plant Sci. 1978. V. 58. P. 505-507.

132. Buyser J., Henry Y., Taleb G. Wheat androgenesis: cytogenetical analysis and agronomie perfomance of doubled haploids // Z. Pflanzenzucht. 1985 V.95. P. 23-34.

133. Buyser J., Henry Y. Wheat: productoin of haploids, performans of doubled haploids and yield trials // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin. 1986. V.2. P. 73-88.

134. Buyser J., Henry Y., Lonnet P., Hertzog R., and Hespel A. "Florin": a doubled haploid wheat variety developed by the anther culture method / / Plant Breed. 1987. V.98. N 1. P.53-56.

135. Buyser J., Bachelier B., Henry Y. Gametic selection during wheat anther culture // Genome. 1989. V.32. P. 54-56.

136. Buyser J., Touraine P, Ambroise A. and Picard E. Induction of androgenetic embryos and chlorophyllian plants of Triticum aestivum from isolated microspore culture // Proceedings of the 9th Int.Wheat Genet. Symp. Saskatoon. Saskatchevan.

137. Canada. 1998. V.3. P. 175-177.

138. Caetano-Anolles 0., Bassam B.J., Gresshoff P. DNA amplification , syngerprinting using very shot arbitrary oligonucleotide primers/ /Byo/Technology. 1991. V.9.-P.553- 557.

139. Campbell K. W., Brawn R.J and Ho k.m. "Rodeo" barley // Canad. J. Plant Sci., 1984. V. 64. P. 203-205.

140. Chaemi m., Sarrafi A. Pollen derived plants from F1 hexaploid/tetraploid wheats //Genet, and Breed., 1994a. V. 48. P. 87-93.

141. Chaemi M., Sanafi A. The effect of the "D" genome from synthetic wheat lines in anther culture responses//Plant Breed., 1994 b. V. 112. P. 76-79.

142. Charmet G., Bernard S. Diallel analysis of androgenetic plant production in . hexaploid triticale (Triticosecale Wittmack) // Theor. Appl. Genet., 1984. V. 69. P.55.61.

143. Charlnet Gilles, Hemard Sylvie, Hemard Michel. Origin of aneuploid plants obtained by anther culture in tritilcale // Can. J. Genet, and Cytol., 1986,28, N 3, P. 444-452.

144. Gharsynska M., Pfnenko. Inhibition of cytokinesis in the microspores of Tradescantia bracteata Small. By caffeine //Acta Soc. Bot. Pol. 1976. V.45. P. 469476.

145. Chen C., Chen C. Changes in chromosome number in microspore callus on . raceduring successive subcultures // Can.J.Genet.and Cytol. 1980. V.22. N4. 607-614.

146. Chen C .M., Chen C.C. Genetic analysis of anther-derived plants of rice // J.

147. Hered., 1982. V. 73. P. 49-52.

148. Chen C.C., Howarth M.J., Peterson R.L., Kasha K.J. Ultrastructure of androgenetic microspores of barley during the early stages of anther culture Canad. J. Genet.Cytol. 1984. Vol. 26. N 4. P.484-491.

149. Chen Y. Anther and pollen culture of rice // Haploids in higher plants in vitroed. by Hu Han and Jang Hongyan). Springer Verlag Publishers: Berlin New York-Tokyo., 1986. P.3-25.

150. Chen F.Q. and Hayes P.M. A comparison of Hordeum bulbosum mediated haploid production efficiency in barley using in vitro floret and tiller culture // Theor. Appl. Genet., 1989. V. 77. P. 701-704.

151. Chen Chi- Chang, Hsin-Sheng Tsay and Chien-Rong Huang. Rice (Oryza sativa): factors affecting androgenesis 7/ Biotechnology in agriculture and forestry, (ed. By Y.P.S.Bajaj). Springer Verlag: Berlin Heidelberg., 1986. V.2. P. 123-137.

152. Chi V.H., Ziauddin A., Simon E., Kasha K. Ethylene production and its effect on androgenesis in barley pollen cultures // VII Intern. Congr/Plant Tissue and Cell culture: abstracts. Amsterdam. 1990. P. 185.

153. Cho M.S., Zapata F.J. Plant regeneration from isolated microspore of indica rice //Plant and Cell Physiol., 1990. V. 31. N 6, P. 885.

154. Choo U.H., Kasha K.J. Ethylene production and embryogenesis from anther cultures of barley (Hordeum vulgare) // Plant Cell Reports. ,1989. V. 8. P.415-417.

155. Choo T.M., Reinbergs E., Park S. Comparison of frequency distributions of doubled haploid and single seed descent lines in barley // Theor. Appl. Genet., 1982.y. 61. P.215-218.

156. Choo T.M., Reinberg E., Kasha K.J. Use of haploids in breeding barley //Plant Breeding Rev., 1985. - Y. 3. - P. 219-252

157. Chu Ch.-Ch. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice though comparativ experiments on the nitrogen soureces // Sei. Sinica. 1975. V. 18. N. 5. P.659-668.

158. Chu C.C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Proc. of symp. on plant tissue culture / Science Press: Peking. 1978. - P. 43-50.

159. Chua B.-Kh., Chen Y.-H., Omar 0. Anther culture of rice hybrids 1854 and 1856 //MARDI Res. Bull. 1984. V. 12. N 3. P. 275-280.

160. Chuang C.C., Ouyang J.-W. A set of Potato medium for wheat anther culture //Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking. 1978. - P. 51-56.

161. Clapham D. In vitro development of callus from the pollen of Lolium and Hordeum // Z. Pflanzenzucht., 1971. - Y. 65. - P. 285-292.

162. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzenzucht. -1973.-Y. 69.-P. 142-155 .

163. Collins G.M. Production and utilization of anther derived haploids in crop plants //Crop Sei., 1977. - Y. 17. - P. 583-586.

164. Cordewener J.H.G., Busink R., Traas J.A., Custers J.B.M., Dons H.J.M., Compagne M.M.L. Induction of microspore embryogenesis in Brassica napus L. Is accompained by specific changes in protein synthesis // Planta. 1994. V.195. P. 50-56.

165. Corduan G. Regeneration of anther-derived plants of Hyoscyamus niger L. // Planta. 1975. Y. 127. N 1. P. 27-36.

166. Cowen N.M., Johnson C.D., Annstrong K., Miller M., Woosley A., Peseitelli S., Shokut M.,Belmar S., Petolino J. P. Mapping genes conditioning in vitro androgenesis in maize using RELP analysis // Theor. Appl. Genet., 1992. - Y. 84. - P. 720-724.

167. Dale R.J. Pollen dimorphism and anther culture in barley // Planta. 1975. Y.27. -P. 213-220.

168. Darvey N.L . Doubled haploid technology : an interactive model for germoplasm enhancement // Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Symp. Canada. Saskatoon. Saskatehevan.- 1998.-Y 1. P. 148-151.

169. Datta S.K. and Wenzel G. Isolated microspore derivded plant formation via embryogenesis in Triticum aestivum L. // Plant Sei., 1987. - Y. 48. - P. 49-54.

170. Datta S.K. Plant regeneration by pollen embryogenesis from cultured whole spikes of barley (Hordeum vulgare L.) // Theor. Appl. Genet., 1987. - Y. 74.P. 121124.

171. Datta S.K. and Wenzel G. Single mierospore derived embryogenesis and plant formation in barley (Hordeum vulgare L.) // Arch. Zuehtungsforseh., ~ 1988. Berlin. -B.18. S.125-131.

172. Datta S.K., Potrykus J. Artifieial seeds in barley: encapsulation of microspore-derived embryos // Theor. Appl. Genet., 1989. - Y. 77. - N 2. P. 820-824.

173. Davis D.R. Male parthenogenesis in barley // Heredity. 1958. - Y.12. - P.493-498.

174. Day A., Ellis T.H. Chloroplast DNA deletions associated with wheat plantsregenerated from pollen: possible basis for material in heritance // Cell. 1984. - Y. 39.-P. 359-368.

175. De Buyser J. Gametic selection during wheat anther culture//Genome. 1985. V 32. N 1. P.54-56.

176. De Fossard R.A. Summation: method for producting of haploids/lHaploids in higher plants: advances and potential. Proc. 1-st Intern. Symp. Guelph: University of Guelph. 1974. P. 145-150.

177. De la Pena. "In vitro" culture of isolated meiocytes of rye, Secale cereale L.//Environ. And Exp. Bot. 1986. Y.26. N21. P.17-23.

178. Devaux P. Variation in the Proportion of Fertile Colchicine Treated Haploid Plants Derived from Whinter Barley Hybrids // Plant Breed. 1989. Y.103.N 3. P.247-250.

179. Dickinson H.G. The physiology and biochemistry of meiosis in the anther //Intern. Rev, Cytol. 1987. Y. 107. P. 79.

180. Dixin X., W. Manli, H. Qiung. Comparison of several characters between the pollen-derived hybrid plants and the conventional P2 hybrids in rice // 3rd Int.Symp. of haploidy. 1- st Int. Symp. of somatic cell genetics. Beijing (China). 1984. - P. 134.

181. Djatchouk T.I., Kusmenko A.I. Agronomic performances of a wheat crosses using anther culture method // Ann.Wheat Newsletter. KSU (USA). 1995. - V.41. -P. 165

182. Djatchouk T.I., Stoljarova S.V. Response of differen wheat species in antherculture.// Ann.Wheat Newsletter. KSU (USA). 1996. - V.42. - P. 175-176.

183. Djatchouk T.I., Kusmenko A.I. Haploid breeding for dry regions of Russia //5th Int.Wheat Confer., June 10-14. Ankara. Turkey. - 1996. - P. 354.

184. Dodds J.H.j Roberts L. W. Anther and pollen cultures // Experiments in plant Tissue culture. Cambridge: Cambridge Univ. press, 1985. P. 157-171:

185. Dodds J.M., Reynolds T.L. A scanning electron microscope study of pollen embryogenesis in Hyosciamus niger / Z. Ptlanzenphysiol.Bd. 97. S 271-276. 1980.

186. Doves K., Gale M. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheatJ/Theor. Appl. Genet.- 1992.-y.84.-P.567-572.

187. Dunwell J.M. Embryogenesis from pollen in vitro // Biotechnology in Plant Science. Relevance to Agriculture in the Eighties: Academic Press., 1985. P.49-76.

188. Dunwell J.M. Antherand ovary culture // Cereal tissue and cell culture. Horwich: Nijhoff Publ., 1985. P. 1-44.

189. Dunwell J.M., Sunderland N. Pollen ultrastructure in anther culture of Nicotiana tabacum. 1. Early stages of culture//J. Exp. Bot. 1974. V.25. N 85. P .862-861.

190. Dunwell J.M., Francis R.J., Powell W. Anther culture of Hordeum vulgare L.: a genetic study of microspore callus production and differentiation // Theor. Appl. Genet., 1987.-y. 74.-P. 60-64.

191. Eberle J., Arnsheidt A., Klix D., Weiler E.W. Monoclonal antibodies to plant regulators // Plant. Physiol. 1986. y.81. N22. P.516.

192. Ekiz H., Konzak C.P. Nuclear and cytoplasmic control of anther cultureresponse in wheat: 1. Analyses of alloplasmic lines // Crop. Sci. 1991. V. 31. P. 1421-1427.

193. Ekiz H., Konzak C.P. Preliminary diallel analysis of anther culture response in wheat (Triticum aestivum L.)//Plant Breed., 1994.-Y. 113.-N. 1,-P. 47-52.

194. Evans D.A., Sharp W.R., Medina-Filho H.P. Somaclonal and gametoclonal variation/Amer.J.Bot. 1984. Y.71. P.759-764.

195. Evans M.L. Function of hormones at the cellular level of organization // Hormonal Regulation of Development, n. Berlin ect: Springer-Verlag, 1984. P. 47.

196. Falk D.E., Kasha K.J. Comparison of crossability of rye (Secale cereale) and Hordeun bulbosum into wheat (Triticum aestivum) // Canad. J. Genet. Cytol., 1981. -Y. 23.-P. 81-88.

197. Falk D.E., Kasha K.E. Genetic studies of the crossability of hexaploid wheat with rye and Hordeum bulbosum // Theor. Appl. Genet., 1983. - Y. 64. - P.303-307.

198. Fang G.- W., Liang H.-M. Influence of cold pretreatment on the efficiency anther culture of rice//Acta phytophysiol. Sin. 1985. V. 11. N. 4. P. 366-380.

199. Fedak G. Haploids from barley x rye crosses // Canad. J. Genet. Cytol., 1977. -P. 15-19.

200. Fedak G. Haploids in Triticum ventricosum via intergeneric hybridization with Hordeum bulbosum // Can. J. Genet. Cytol., 1983. - Y. 25. - P. 104-106.

201. Finch R.A. Tissue-specific elimination of alternative whole parental genomes in one barley hybrid // Chromosoma. 1983. - Y: 88. - P. 49-76.

202. Finnie S.J., Powell W. and Dyer A.F. The effect of carbollydrate composition and concentration on anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.) //Plant Breed., 1989. - y.IO. - P. 110-118.

203. Foroughi- Wehr B., Friedt W., Wenzel G. On the genetic improvement of androgenetic haploid formation in Hordeum vulgare L.11 Theor. Appl. Genet., 1982. -Y. 62.-P. 233-239.

204. Foroughi-Wehr B. and Zeller F.J. In vitro microspore reaction of different german wheat cultivars // Theor. Appl. Genet., 1990. - Y. 79. - P. 77-80.

205. Foroughi Wehr B., Mix G., Gaul H., Wilson H.M. Plant prodaction from cultured anther of Hordeum vulgare L. //Z.Pflanzenzucht. 1976. Y.ll. P.198-204.

206. Fried W. and Foroughi-Wehr B. Field perfomanse of androgenetic doubled Haploids spring barley from F 1 hybrids 11 Z. Pflanzenzuchtg. y90. P .177-184.

207. Friedt W., Braun J., Zuchner S., Foroughi-Wehr B. Comparative value of spring barley lines // Plant Breeding. 1986. - Y. 97. - N 1 - P.56-64.

208. Futchs S., Futchs G. Immunological assay for plant hormone using specific antibodies to indoleacetic acid and gibberelic, acid / IBiochem. Biophys. Acta. 1969. y.192. N3. P.528.

209. Galieva E.R., Gorbunova V.Ju.,Kruglova N.N. Ultrastructre of spring wheatembryoid and callus cells // Proc. Int. "Embriol. and Seed Reprod." Leningrad, Juli 3-7,1990. St. Petersburg. 1992. P. 164-165.

210. Gallais A. Quantitativ Genetics of Doubled Haploid Population and applicatoin to the Theory of Line Development // Genet. 1990. y, 124. N21. P. 199-206.

211. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and defection of glucanases in cultures of wheat and barley //Canad. J. Biochem. 1968. y. 46. N 5. P. 417-421.

212. Genovesi A.D; and Collins G.W. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture // Crop Sei., 1982. - y. 6. - P. 1137-1143.

213. Geler T., Kohlenbach H.W. Entwicklung von Embryonen und embryogenem cullus ans pollen kornern von. Datura meteloides and D. innoxie / /Protoplasma. 1973. y.78. N2. P.381-396.

214. Gentzbittel L., Perrault A., Nicolas P. Molecular phylogeny of the Helianthus genus, based on nuclear restriction fragment length polymorphism (RFLP)// Mol. Biol,. Evol.- 1992.- y.9.- P.872- 892.

215. Gibbs R.A., Chemberlain J.8. The polimerase chein reaction: a meeting report.l// Genes and Development. 1989.y.3. P. 1095-1098.

216. Gerashchenkov and N. Rozhnova. Subtractive self-hybridization for the isolation of differentially expressed genes in cob of AT -1 line of maize with the automous development of embryo //Apomixis Newsletter. 1990. N11. P.21-25.

217. Giura A. In vitro chromosome doubling of the wheat polyhaploids // Proc. of the 11- th EW AC Conference. Novosibirsk 24-28 July 2000. E WAC Newsletter.- 2001. -P. 70-76.

218. Goorg H.,A. Hu and Hoang Tang. Direct generation of wheat haploids via anther culture// Crop Sei., 1987. - Y. 27. - N 2. - P. 330-339.

219. Guha S.S., Maheshvari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura //Nature. London. - 1964. -Y. 204. - P. 497.

220. Guha S., Maheshvari S.C. Cell division and differentiation of embiyos in the pollen grains of Datura in vitro //Nature. London. - 1966. - Y.212 - P. 97-98.

221. Guo H. W. and J. Oujang. TLe effect of KNÜ3 concentration in callus induction medium for wheat anther culture // Plant, Cell, Tissue and Organ culture. 1988. -y.12. - P.3-12.

222. Harmants KJ, Vanes A. The influence of growth regulators GA3, ABA, kinetin and IAA on sprout and root growth and plant development using excised potato buds //Potato Res., 1979. - Y. 22. - P. 319-332.

223. Hasan M., Pauk J., Jankulosky L., Mihaly R., Toth-Lokos K., Falusi J. Comparison of in vitro androgenetic response and F 1 seed production in wheat (Triticum aestivum L.) // Cer. Ree. Cot., 2001. Y. 29. - P. 297-305.

224. Hassavi D.S., Liang G.H. Antimitotic agents: effects on doubled haploid production in wheat // Crop Sei., -1991. Y. 31. - P. 723-726.

225. He D.G. and J. Oujang. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at different developmental stages // Plant Sei. Letters. 1984. - Y. 33. P.71-79.

226. Hadwiger M.A., Heberle-Bors E. Pollen plant production in Triticum gurgidum ssp. Durum //Proc. Intern, sympos. "Genetic manipulation of plant breedings". Berlin; New York: Waler de Gruyter, 1986. P. 303.

227. Halperin W. Alternative morphogenetic events in cell suspensions //Amer. J. Bot. 1966. Y. 53. N5. P. 443-453.

228. Halperin W. Embryos from somatic plant cells//Proceed. Symp. of Intern. C. CeB BiQl. "Control Mechanism in the Expression of Cellular Phenotypes". New-York; London: Acad. Press, 1970. P. 169-191.

229. Haploids ofhigher plants in vitro. Berlin et al.: Springer-Verlag, 1986.203 p.

230. Hassawi D.S., Liang G.H. Effect of cultivar, incubation temperature and stage of microspore development on anther culture in wheat and triticale/ /Plant Breed. 1990. Y. 105. N4. P. 335.

231. Hassawi D.S., Sears R.G., Liang G.H. Micrispore development in the anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) // Cytologia. 1990. y. 55. N 3. P. 475.

232. He D.-G., Ouyang J.- W He D.-G., Ouyang J. Observation of androgenesis in culture wheat anthers //Acta bot. sin. 1985. y. 27. N 5. P. 469-475.

233. He D.G., Tanner G., Scott K.J. Somatic embryogenesis and morphogenesis in callus derived from the epiblast of immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.) //Plant Sei., 1986. y.45. - P. 119-124.

234. He P., Shen L., Lu S., Xhu L. Analysis of qualitative trait loci wich contribute to anther culturability in rice Orysa sativa L.) // Molecular Breed., 1998. Y4. - P. 165172.

235. Heberle-Bors E. Induction of embryogenic pollen in situ and sabsequent in vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum by treatments of the pollen donor plants with feminizing agents // Physiol, plant. 1983. y.59. N 1. p.67-72.

236. Heberle-Bors E. Genotypic control of pollen plant formation in Nicotiana Tabacum L.//Theor. Appl. Genet. 1984. Yol. 68. N 1. P. 475-479

237. Heberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review//Theor. and. Appl.,Genet. 1985. y. 71. N. 3. P. 361-375.

238. Heberlé-Bors E. In vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L. and itsi\ h relation to pollen, sex balance, and floral induction of pollen donor plants//Planta.1982a. Y1.156. N 5. P. 396-401.

239. Heberle-Bors E. and Reinert J. Isolated pollen cultures and pollen dimiorphism // Naturwissenschaften. 1980. - y. 67. - P. 311- 316.

240. Heberle-Bors E. and Reinert J. Environmental control and evidence for predetermination of pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L. pollen // Protoplasma. -1981. y. 109. - P. 249-255.

241. Heberle-Bors E. On the time of embryogenic pollen grain induction during sexual development of Nicotiana tabacum L. plants // Planta. 1982. - y. 156. - P. 402-406.

242. Heberle-Bors E. In vitro haploid formation: a critical review // Theor. Appl. Genet., 1985. - y. 71. - P.361-374.

243. Heberle-Bors E. and Odenbach W. In vitro pollen embryogenesis and cytoplasmic male sterility in Triticum aestivum L. // z. Pflanzenzucht., 1985. - y. 95.-P. 14-22.

244. Henry y., de Bayser J. Float culture of wheat anthers // Theor. And Appl. Genet. 1981. y.60. N2. P77-79.

245. Henry y., de Bayser J., Guenegou T., Ory c. Wheat microspore embryogenesis during in vitro anther culture//Theoret. and Appl. Genet. 1984. y. 67. N 5. P. 439442.

246. Henry y., Marcotte J.-L., de Bayser J. Nuclear gametophytic genes from chromosome arm 1RS improve regeneration of microspore-derived embryos//Genome. 1993. y. 36. N 5. P. 808-811.

247. Henry Y., Vain P., de Buyser J. Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities // Euphytica. 1994. - Y. 79. - P. 45-58.

248. Higgins P. and Mathias R. The effect of 4B chromosome of hexaploid wheat on the growth and regeneraton of callus cultures // Theor. Appl. Genet., 1987. - Y. 74. -p. 439-444.

249. Heslop-Harrison J. Compartmentation in anther development and pollen wall morphogenesis/ /Proc. intern, sympos. "Cell compart mental and metabolic channeling. Jena, 1980. P. 471.

250. Higuchi N., Masda E. Reobservation with light microscope of scanning electron microscopic speciments in rice callus cultures//Jap. Journ. Crop Sci. 1.991. Y. 60. N 2. P. 278-282

251. Hlasnikova A. Androgenesis in vitro evalusted ftom aspects of genetics/ /Z. Pflianzenzacht. 1977. Y.88. N21. P.44-56.

252. Ho K.M. and Jones G.E. "Mingo" barley // Canad. J. Plant. Sci., 1980. - Y. 60. -P. 279-280.

253. Hoffmann B., Schumann O., Kruger H.-U. In vitro androgenesis in wheat (Triticurh aestivum L.). 1. Effects of donor plant genotype on the development of pollen derived macrostructures and plantlets // Arch. Zucht. 1991. Y. 21. N. 3. P. 153159.

254. Hoffmann B., Schumann O., Kruger H.-U. In vitro androgenesis in wheat. 2. The influence of donor peant growth environment // Arch. Zucht 1990. Bd. 20. H. 3.P. 179.

255. Homes J.L., Guillaume M. // Bull. Soc. Roy.Bot.Beigigue.1967. T. 100. N2. P.79

256. Hu H. Use of haploids in crop improvement. In: Biotechnology in interrnational agricultural research// Int.Res.Rise Inst.l985.P. 75-84.

257. Horner M. and Street H.E. Pollen dimorphism origin and significance in pollen plant formation by anther culture // Ann. Bot.( London). - 1978. - Y.42.- P. 763-771.

258. Horner M. and Mott R.L. The frequency of embryogenic pollen grains is not increased by in vitro anther culture in Nicotiana tabacum L. / / Planta. 1979. Y. 147. - P.156-158.

259. Hu Daofen,Yuan Thendong,Tang Yunlian, Lie Tianping. "Yinghua 1" a winter wheat variety derived from pollen sporophyte jj Scientica Sinica. - 1986.- Y. 29. - N4 -P. 733-745.

260. Hu Han. Genetic stability and variability of pollen-derived plants // Plant Cell Cult.Crop Improv.Proc. Int.Symp: Calcutta, 6-10 Dec. -1981. P. 145-157.

261. Hu Han. Use of haploids in crop improvement // Biotechnology in international agricultural research: Int. Res. Rice Inst., 1985. - P. 75-84.

262. Hu Han. Wheat: improvement through anther culture // Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S.Eajaj). Springer-Velag: Berlin Heidelberg. -1986. - Y. 2. - P.55-71.

263. Hu Han and Bin Huang. Application of pollen derived plants to crop improvement //International Reviev of cytology. 1987. - Y. 107. - P. 293313.

264. Hu Han. Gametic analysis and gametoclonal variation in Triticeae // Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat). Ed. by Y.P.S. Eajaj. 1990. -Y.13.-P. 539-548.

265. Hu H., Jing J., Xi Z., Wang X. Production of aneuploids and heteroploids of pollen derived plants // Proc. 5-th Intern. Cong. Plarit Tissue and Cell Culture. Peking. 1982. P. 421-424.

266. Hu H., Huang B. Application of pollen-derived plants in crop improvement/llntem. Rev. Cyto 1. 1987. Y. 107. P. 293-299.

267. Hu H„ Liu C., Tan X., Zhou Q. Anther-Pollen Culture in Cereals // Proc. of international symposium "Wheat breeding prospects and future approaches", Albena, 1990. P. 129-132.

268. Huang E., Sunderland N. Temperature-stress pretreatment in barley anther culture // Ann. Got., 1982. -Y. 49. - P. 77-88.1. N.

269. Huang E., Dunwell J.M. The relative efficiency of microspore culture and chromosome elimination as methods of haploid production in barley // Z.

270. Pflanzenzucht., 1984. - Y.92. - N 1. - P. 22-29.

271. Huang B. Haploids in higher plants in vitro //Eds Hu H., Yang H.Y. New-York; Heidelberg; Berlin: Springer-Verlag, 1986. P.91.

272. Huang D., Gu M., Zhang X., Guo C., Cao Z. Variability of DNA and protein contents in pollen callus of corn. Acta genet, sim. 1987, 14, N 2, P. 114-120.

273. Huang. B. Wheat anther culture: effect of temperature // Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat) (ed.by Y.P.S. Bajaj). Springer-Verlag: BerlinNew York Tokyo - Heidelberg. - 1990. -Y.13. - P. 403-415.

274. Hunter. C.P. The effect ofanther orientation on the production ofmicrospore-derived embrioids and plants of Hordeum vulgare cy. Sabarlis // Plant Cell Reports. -1985.-Y. 4.-P. 267-268.

275. Idzikowska K., Mlodzianowski F. Cell formation in multinucleate pollen rains of Hordeum vulgare anthers cultured in vitro//Acta Soc. bot. polon. 1979. V.48. N 1. P. 377-380.

276. Idzikowska K., Ponitka A., Mlodzianowski, F .Pollen dimorfism and androgenesis in Hordeun vulgare// Acta Soc. Pol. 1982. Y.51. N. 2 P.153-156.

277. Idzikowska K., Ponitka A., Zenktelei M., Mlodzianowski P. The fnst stages of microspore division in anthers of Hordeum vulgare cultured in vitro//Flora. 1981. Y.171.N1.P. 11.

278. Immonen S. Androgenetic green plants from winter rye of diversed origin // Plant Breed., 1999. - y.l 18.-N 4. - P. 319-322

279. Inagaki. M.N. Chromosome doubling of the wheat haploids obtained from crosses with Hordeum bulbosum L. // Jpn. J. Breed., 1985. - Y. 35. - P. 193-195

280. Inagaki. M.N. Variation in plant height of doubled haploid lines of wheat from intergeneric crosses with Hordeum bulbosum L. // Jpn. J. Breed., 1987. Y. 37. - N 3. -P. 275-282.

281. Inagaki.M.N. Wheat haploids through the bulbosum technigue // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin New York - Tokyo. - 1990. - Y 13. - P. 448-459.

282. Inagaki M.N. Comparison of crossabilities of tetraploid wheat with Hordeum bulbosum and maize // Cereal Res. Com., 1995. - Y. 25. -N 4. - P. 339-343.

283. Inagaki M.N and Mujeeb-Kazi A. Polyhaploid production in hexaploid wheat crosses with stored pearl millet pollen // 5-th Int. Wheat Conference, June 10-14. 1996. Ankara.Turkey. - 1996. - P. 363.

284. Inagaki M.N., Nagamine T. and A. Mujeeb-Kazi. Use of pollen storage and detached-tiller culture in wheat polyhaploid production through wide crosses // Cereal. Res.Com., 1997. - Y 25. - N1. - P.7-13.

285. Inagaki M.N., Tahir M. Production of haploid wheat through intergeneric crosses //Hereditas. V.116. N 1-2. P 117-120.

286. Inagaki M.N. Production of wheat haploids using wide crosses and its application to breeding programs // Proseedings of the 9th Int. Wheat Genet. Symp. Saskatoon. Saskatchevan. Canada. 1998. - Y.2. - P. 225-226.

287. Islam A.K.M.R., Shepherd K. W. Wheat-barley addition lines: their use in genetic and evolutionary studies of barley // Barley Genet., 1982. -Y. 4. - P. 729739.

288. Jacobson B., Sopory S.K The influence and possible recombination ofgenotypes on the production of microspore embryoids in anther cultures of Solanum tuberosum and dihaploid hybrids // Theor. Appl. Genet. 1978. V.52. P. 119-123.

289. Jensen C.J. Barley monoploids and doubled monoploids // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture (Eds.Reinert J., Bajaj Y.P.S.) Berlin -Heidelberg- New York: Springer-Verlag. 1977. - P. 316-343.

290. Johri M.M. Development and differentiation in plants. Biosci, Repts.- 1988.-N6,- P.553-564.

291. Kao K.N., Horn D.C. Induction of pollen plant formation in barley anther culture //Int. Symp. on genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China. 1984. -P.64.

292. Kasha K.S. Kao K.N. High freuqency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) //Nature. -1970. Y. 225. - P. 874-876.

293. Kasha K. J. and Reinbergs E. Recent development in the production and application of haploid in barley // 4-th Int. Barley Genet. Symp. Edinburgh University Press, (ed. by Asher M.J. and Ellis P.P.). 1981. - P. 655-665.

294. Kasha K.J., Hu T.C., Simion E and Oro R. Cytological development of wheat microspores in culture // Proceeding of the 9th Int. Wheat Genet Symp. Saskatoon. Saskatchevan. Canada. 1998. - P.152-155.

295. Kaul B.L., Zutshi N. Dimethyl sulfoxide as an adjuvant of colchicine in the production of poliploid in crop plants // Indian J. Exp. Bot. Biol., 1971. - Y.9. - P. 522-533.

296. Keller J. Some results and problems of culture // 3-rd Symp Young Sci. "Physiol. And Biochem. Plants": Abstracts.- Lublice, 1986.- p.52.

297. Keller E.R., Schmidt J. Effect of a gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum / / Gen. Manipulat. Plant. Breed. Proc. Int. Symp. Berlin (West), Sept. 8-13.1985. Berlin-New York. 1986. - P.347-349.

298. Kihara H.,Tsunewaki K.Use of an alien cytoplasm as a new method of producinghaploids // Jpn. J. Genet., 1962. -Y.37. - P. 310-313.

299. Khan S.K., Sen O., Ghosh P .D. Scanning electron microscopic analysis during embryogenesis of Cicer arietium L. anthers in vitro//DAE Symp. Adv. Mol. Biol. Bombay, 1990. P. 411-412.

300. Kao K.N. Plant formation from barley anther cultures with ficol media//Z. Pflanzenzucht. 1981. Y. 103. N 5. P. 437-443.

301. Karsia I., Bedo Z., BaHa L. The effekt of repeated anter cultural on in vitro ahclrogenesis of wheat (Triticum aestivum L.) // Cereal Res. Commun. 1991. V 19. N4. P. 425-430.

302. Kleijer G., Schmid J., Winzeier H., Fried P.M. La culture ed antheres: possibilités et limites dans la selection du ble et de 1 epeautre//Rev. suisse Agr. 1986. Y. 18. N6. P. 305.

303. Knudsen S., Due J.K., Andersen S.B. Components of response in barley anther culture //Plant Breed., 1989. - Y. 103. - P. 241-246

304. Konzak C.F., Randolph L.E. and Ensen N.E. Embryo culture of barley species hybrids, cytological studies of Hordeun sativum x Hordeum bulbosum // J. Heredity. -1951.-Y. 42. P.124-134.

305. Kruger H. Zytologische Charakterisierung androgenetischer Entwicklungsphasen bei Weizen //Arch. Zuchtungsforsch., Berlin. - 1987. B. 5. - S.297-307.

306. Kruger H. Ein Beitrag zum Ferlauf der Androgenese bei Weizen (Triticum aestivum L.)//Archiv Zuchtungsforsch., 1988. -B. 3. - S .133-138.

307. Kruse A. An in vitro embryo culture technique // Hereditas. 1974. - Y. 77. -P. 157-161.

308. Kuckuck H. Artkreuzungen by Gerste II Zuchter. Berlin. 1934. - B. 6. - S. 270271.

309. Kudirka D.T., Schaeffer G.W. and Beanziger P.S. Wheat: genetic variabilitythrough anther culture // Biotechnology in agricnltHre and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.). Springer Verlag. Berlin New York - Tokyo - Heidelberg - 1986. V.2. - Crops 1. -P.39-54.

310. Lange W. Crosses between Hordenm viilgare L. and H. bulbosum L. Elimination of chromosomes in hybrid tissues // Enphitica. 1971. - V. 20. - P. 181-194 .

311. Laurie D.A., Bennet M.D. Cytological evidence for fertilization in hexaploid wheat x sorghum crosses //Plant Breed., 1988. - V. 100. - P. 73-82.

312. Laurie D.A. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses // Theor. Appl. Genet., 1988. - V. 76. - N3. - P. 393-397.

313. Laurie D.A. Factors affecting fertilization frequency in crosses of Triticum . aestivum C.v. Highbury x Zea mays cv. Seneca 60 // Plant Breed., 1989. - V. 103. -P.133-140.

314. Laurie D.A., Bennet M.D. The timing of chromosome elimination in hexaploid wheat x maize crosses // Genome. 1989. - V. 32. - NQ6. - P. 953 -961.

315. Laurie D.A. The frequency of fertilization in wheat x pearl millet crosses // Genome. 1989.-V. 32.-N6.- P. 1063-1067.

316. Lazar M.D., Baenziger P.S. and Schaeffer G.W. Combining abilities and heritability of callus formation and plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum) anther culture//Theor. Appl. Genet, 1984a. -V. 68. - P. 131-134.

317. Lazar M.D, Schaeffer G.W, Baenzieger P.S. Cultivar and cultivar x environment effects on the development of callus and polyhaploid plants from anthercultures ofwheat // Theor. Appl. Genet., -1984b. V. 67. - P.273-277.

318. Lazar M.D., Chen T.H., Scooles G.J., Kharta K.K. Immature embryo and anther culture of chromosome eddition lines of rye in Chinese Cpring wheat // Plant Sei., -1987. Y. 51. - P.77-81.

319. Lei Z.S., Zhou y., He X.C., Lin Z.J., Zhang S.C.,Yang H.M., Huang B.Y., Lai Q.R. Efficient wheat haploid production by wheat x maize // 5th Int. Wheat Conference. June 10-14. 1996. Ankara. Turkey. - 1996. - P.374.

320. Leike H. Bedeutung der haploiden fur die Pflanzenzuchtung // Akademie der landwirtschaft DDR. 1985. -N 5. - 52 S.

321. Lettre J.J., Kelly S.L., Kasha K.J. Wheat anther culture using liguid media // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.) (Wheat). Springer Verlag. Berlin -New York Tokyo - Heidelberg. - 1990. -Y. 13. - P.416-423.

322. Li D.W., He Z.Y., Hh O.D. The crossability of Triticum aestivum with tetraploid Hordeum bulbosum // Anna. Rep. Inst. Genet. Acad. Sinica. 1981 - 1982. - P. 136138.

323. Liang G.H., Xu H.-T. Direct generation ofwheat haploids via anther culture // Crop Sei., 1987. - Y. 27. - P.336-339.

324. Loo S.W. and Xu Z.H. Rice anther culture for rice improvement in China // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.). Springer Verlag Berlin -Heidelberg. 1986. - Crops 1. - P 139-156.

325. Lorenz 1. Ergebnisse zur Induction der androgenetischer Entwicklung in Wintenoggenantheren //Arch. Zuchtungforch., Berlin. - 1989. - B. 19. - 6,- S. 415420.

326. Lorz H., Gobel E., Brown P. Advances in tissue culture and progress towards genetic transformation of cereals // Plant Breed., 1988. - Y. 100. - P. 1-25.

327. Lyne R.L., Bennet R.I., Hunter C.P. Embryoid and plant production from cultured barley anthers / / Plant tissue culture and its agricultural applications (ed.

328. Alderson P.G.) Butterworth. London. - 1984. - P. 405-411.

329. Maheshvaari S. C., Tyagi A.K. and Malhotra K. Induction of haploidy from pollen grains in angiosperms the cunent status // Theor. Appl. Genet., - 1980.- P. 193-206.

330. Maheshvari S.C., Rashid A.K. and Tyagi A.K. Haploids from pollen grains -retrospect and prospect // Amer.J. Bot., 1982. - Y. 69. - .N 25. - P. 865-879.

331. Marburger J.E., Sammons D.J and Schaeffer G.W. Effect of modified potato medium on anther culture of wheat // Crop. Sci., 1987. - Y. 27. - .N2 2. - P. 351-354.

332. Marsolais A.A., Kasha K.J. Callus induction from barley microspores. The role of sucrose and auxin in a barley anther culture medium // Can. J. Bot., 1985. Y. 63. -P.2209-2212.

333. Mathias R.J., Fikui K. The effect of specific chromosome and cytoplasmic substitutions on the tissue culture response of wheat (Triticum aestivum L.) callus // Theor. Appl. Genet., 1986. - Y. 71. - P. 797-800.

334. Mathias R.J., Higgins P., Atkinson E. Genetic control of wheat (Triticum destivum) tissue culture response // Pros, ih Int. Wheat Genet. Symp., Cambridge, (eds. Miller TE and Koebner R.M.D.). 1988. - P. 763-768.

335. Nitsch J.P., 'Nitsch C. Auxin-dependent growth of excised Helianthus tuberosus tissnes //AmerJ.Bot. 1956. - Vol.43, 10. - P. 839-851."

336. Nitch J.P. Haploid plants from pollen // Z. Pflanzenzucht. 1972.Y.67. P.-18.

337. Nitch C. La culture de pollen isole sur milien syntetique //C. R. Acad. Sri. D. 1974. Y. 278. N28. P. 1031-1034.

338. Nuti y., Giorgetti L., Martini G. // Proc. XI internat, sympos. "Embryology 24td seed reproduction". St. Petersburg.: Nauka. 1992. P.409.

339. Orias-Akins P., Vasil I.K. In vitro regeneration and genetic manipulation of rasses //Physiol, plant. 1982. y.73. N4. P.565-569.

340. Ouyang T. W., Hung T.Y., Chuang C.C., Tseng C.C. Induction of pollen plants from anthers of Triticum aestivum L. Cultured in vitro//Sci. Sin. 1973. Y. 16. N 1. p.79.

341. Ouyang J. W., Zhou S.M., Lia S.E. The response of anther culture to culture temperature in Triticum aestivum / / Theor. Appl. Genet. 1983. Y.66. P.I O 1-1 09.

342. Ouyang J.W. Induction of pollen plants in Triticum aestivum //Haploids in higher plants in vitro. Beijing: China acad. Publ., 1986. P. 26-41.

343. Ottaviano E., Mulcahy D. Gametophytic selection as a factor of crop plant evrolutionl/Origin and domestical cultivated plants. Amsterdam, 1986. P. 101-134.

344. Ouyang J.-W. Induction of pollen plants in Triticum aestivum //Haploids in higher plants in vitro. Beijing: China acad. Publ., 1986. P. 26-41.

345. Ouyang T.W. Haploids in higher plants in vitro/Eds Hu H., Yang HY. New-York; Heidelberg; Berlin: Springe Verlag, 1986. P. 26.

346. Pace G.M., Reed J.N., Ho L.C., Pabey J.W. Anther culture of the usialization of embryogenic microspores by fluorescent microscopy//Theoret. and Appl. Genet. Í987.Y.73.N6.P. 863-869.

347. Pan Ch., Kao K. The production of wheat pollen embryo and the influence of YJ Te factors on its frequency of induction / / Proc. Sino-Austral. Symp. "Plant Tissueculture". Boston: Pitman Publ. Ltd., 1981. 133-142.

348. Pang Hanhua, Shu Lihui, Wu Miaoxin, Sun Huihong. Studies on the anther Cu lture of Oryza rufipogen Griffil. Studies on the induction rate of callus and the di fferentiation rate of green plantlet. Acta Agron. Sin. 1991. 17, N 6. p. 436-443.

349. Park S.J., Walsh E.J., Rembergs E., Song L.S.P., Kasha -K.J. Field perfomance of doubled haploid barley lines in comparison with lines developed by the pedigree and single descent methods // Can. J. Plant Sei. 1976. Y.56. P.467.

350. Pease D.C. In Histological Tehniques for Electron Microscopy. New -York and London, Academic Press, 1964.

351. Pechan P .M., . Keller W.A., Mandy F., Bergerson M. Selection of Brassica napus L. embryogenic microspores by flow sorting // Plant Cell Rep. 1988. Y. 7. N 6. P.396-398.

352. Pauk,, J Breeding with half the genes : GK "Delibab" released, patented and OK "Ambitus" patented new winter wheat varieties // Ann.Wheat Newslet., KSU (U8A). -1996.-Y. 42.-P.159.

353. Peterka H. Die Bedeutung der Haploiden-methode fur commergerstenzuchtung. Nutzung biotechnologisher Methoden in der Pflanzenzuchtung // Ein Tagungsbericht Akademie der Landwirtsch. DDR. 1987. 8.85-98.

354. Philip V.J., chraudolf.// Beitr. Biol. Planzen. 1987. B.62. H.l. S.9.

355. Philpott D.E., A rapid method for staining plastic-embedded tissue for light microscopy, Scientific Instruments, 1966, 11, P. 11-12.

356. Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants. Dordrecht: M. Nijhoff Publ.,987344 p.

357. Picard E., de Buyser J. Obtention de plarifules haploides de Triticum aestivum a partiv de culture d'antheres in vitro // C.R.Acad Se. Paris. 1973.V.277. 1463-1466.

358. Picard E., de Buyser J Nouveaux resaltuts concemoung la culture de anthers in vitro de tendro (Triticum aestivum) effects d un choe termigue et de la position de 1 antheredans 1 epi//C.R.Acad. Sei. 1975. Ser. D. 281. N 2-3, P.127-130.

359. Picard E., de Buyser J., Henry V. Technique de Production dihaploides de culture d'antheres in vitro // Selec. Franc. 1978. N2 26. P. 25-37.

360. Picard E., Hours C., Gregoire S.,Phan T.H., Meunier J.P. Significant improvement of dndrogenetic haploids and doubled haploid induction from wheat plants treated with a chemical hybrization agent // Theor. Appl. Genet. J987. V.74. P. 289-297.

361. Picard E., Hours C., Gregoire S. Significant improvement of androgenetic haploid and doubled haploid induction from wheat plants treated with a chemical hybridization agent // Theor. Appl. Genet., -1987. V. 74. - N3. P.289-297.

362. Picard E., Touraine P., Ambroise A. and de Buyser J. Chlorophyillian, anthocyanic and albinos Triticum durum plants derived from isolated microsporeculture. Proc. of the 9th Int. Wheat'" Genet. Symp. Saskatoon. Saskatchevan. 1998. -V. 3. - P. 44-45.

363. Pickering R.A. The location of a gene for incompatibility in crosses between Hordeum vulgare L. and Hordeum bulbosum L. // Heredity. 1983. - V. 51. P.455-459.

364. Pickering R.A. The influence of genotype on doubled haploid barley production // Euphytica. 1983. -V. 32. -N3. - P. 863-876.

365. Pickering R.A. Crossability relationships between species in Hordeae //Barley Genet. Newslet., 1984. - V. 14. - P. 14-17.

366. Raghavan V. Role of the generative celf in androgenesis in herbane // Science.1976. V.191. - P. 388-389.

367. Raghavan V. Origin and development of pollen and pollen calluses in cultured anthers segments of Hyoscyamus niger (Henbane) // Amer. J. Bot., 1978. V. 65. - N 9.-P. 984-1002.

368. Raghavan V. Pollen development biology in cultured anthers // Cell culture and somatic genetic ofplants. Academic Press. -1986. V. 3. - P. 275-304.

369. Raghavan V. Variability through wide crosses and embryo rescue / / Cell culture and somatic genetic ofplants. Academic Press. -1986. V. 3. - P. 613-633.

370. Rahgavan V. Developmental stages of the angiosperm pollen: a biochemical perspective // Cell Differentiation. 1987. - V. 21. - P. 213-226.

371. Raquin C. Utilization of different sugars of carbon sourses for in vitro anther . culture of Petunia// Z. Pflanzenphysiol., 1983. - P.453-457.

372. Rashid A. Pollen dimorphism in relation to pollen plant formation / / Physiol. Plant.,- 1983. V. 58. - P. 544-548.

373. Rashid A. Angiosperm pollen a system for cell differentiation // Cun. Sci. (India), - 1983.-V. 52. - P.964-967.

374. Riley R., Chapman V. The inheritance in wheat of crossability with rye //Genet. Res.,- 1967.-V. 9.-P. 259-267.

375. Rines H. W. Oat anther culture genotype effects on callus initiation and production of a haploid plant // Crop Sci.:.Cl J83. - V. 23. - P. 268-27.

376. Reddy V.S., Leelavathi S., Sen S.K. Influense of genotype and culture medium on microspore callus induction and green plant regeneration in anthers of Oryzasativa//Physiol. plant. 1985. V. 63. N.3. P. 309-314.

377. Reinbergs E:, Song L.S.P., Choo T.M., Kasha J. Yield stability of double Naploid lines ofbarley// Can. J. Plant Sci. 1978. V.58. P.929-933.

378. Reineri J. Untersuchungen uber die Morphogenese an Gewebekulturen / /Berl.deutsch, bot. Ges. 1958. Bd. 71. H. 1. S. 218-226.

379. Reynolds T. Pollen embryogenesis in anther cultures of Solanum Carolinense //Plant Cell Repts. 1986. Vol. 5. N4. P. 273-275:

380. Reynolds Th.L. Ethelene effects of pollen, callus formation and organogenesis anther culture of Solanum Carolinense L. //Plant' Sei. 1989. V.61. N 1. P. 131 -136.

381. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain electron microscopy, Journal ofCell Biology, 1963, 17, P. 208-214.

382. Rode Andre, Hartmann Caroline, Falconet Denis, Lejeune Bernard, Quetier F

383. Benslimane Abdelali, Henri Yves. Exstensive mitochondrial DNA variation in somatic tissue cultures initiated from wheat immature embryos. Cun. Genet. 1987, 12, N5 p. 369-376.

384. Rogowsky P., Shepherd K., Zangridze P. Polymerase chain reaction based A-apping oC involving repeated DNA sequences// Genome.- 1992.- Y.35. P.612- 626.

385. Rose Ju.B., Dunwell J.M.,. Sunderland N. Anther culture of Sorghum bicolor Maench. 1. Effect of panicle pretreatment, anther incubatoin temperature and concentration //Plant Cell Tissue Organ Culture. 1986. Y. 6. N 1. P. 15-22.

386. Sadasivaiah R.S., Orshinsky B.R., Pecovic S.M., Beres B.L. Colchicine induced chromosome doubling in wheat haploids // Wheat Information Service. I- 2001. -N2 93.- P. 1-4.

387. Sagi L., Barnabas B. Evidence for cytoplasmic control of in vitro microspore eMbriogenesis in the anther culture of wheat (Triticum avestivum L.) // Theor. Apl. Genet. 1988. Y. 78. N2 . P. 867-872.

388. Sangwan R.S., Camerfort H. Tbe Tonoplast, a Specific Marker of e.rnbriogenic Microspores pf Datura cultured in vitro ^Histochemistry. 1983. Y.78. P.473-480.

389. Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Biochemical cytology of pollen embryogenesis //Intern. Rev. Cytol. Orlando 1987. Y. 107. P. 221-272.

390. Sangwan-Norreel B.S. Male gametophyte nuclear DNA content evolution during androgenetic induction in Datura innoxia Mill. // Z. Pflanzenphysiology, 1983. -Y. 111.-P. 47-54.

391. Schäeffer G.W., Baenziger P.S., Worley J.Haploid plant development from ' in vitro emrio culture of wheat// Crop Sei. 1979.-19.-P.687-702.

392. SchJnid J., Keller E.H. Etfect of gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum // Genet. Manipul. Plant Breeding Proceeding of Intern. Symp. Berlin, N.York: Walter de Giuyter. 1986b. P.347-350.

393. Schooler A.B. Interspecific Hybrids in Hordeum // Barley Newslet., -1963. Y. 6. -P. 47-48.

394. Schumann G. Beeinflussung morphogenetischer Prozesse dure Temperaturvorstimulation in Antherenkulturen Yon Triticale // Arch. Zucht. 1986. p. 16. N3.S. 153-159.

395. Schumann G. Zur Morphologie und Entwicklung androgenetischer akrostrukturen inntherenkulturen yon Triticale. Arch Zuhtungsforsch.l987.Bb.l7,H.4. s.245-257.- Bibliogr: S.256 257.

396. Schumann G. Zytologish-histologishe Untersuchungen in Triticale antheren culture// Arch. Zuchtungsforsh., (Berlin). -1987. -Y. 17. -S. 17-25.

397. Schumann G. Zur Morphologie und Entwicklung androgenetisher Makrostrukturen in Antherenkulturen Yon Triticale // Arch. Zuchtungforsh., (Berlin). 1987. - Y. 17. - S. 245-257.

398. Schumann G. In vitro haploid production in Triticale // Biotechnology in agriculture and forestry. Y. 13. Wheat (ed. Bajaj P.S.). Springer-Verlag: Berlin Heidelberg.- 1990.-P. 383-401.

399. Schumann G. Untersuchungen zum Albinismus in Antherenkulturen yon

400. Triticale // Arch. Zuchtungsforsch., Berlin. - 1988. - Y. 18. -B.2. - S. 115-122.

401. Schumann G., Hoffman B., Kruger H.-U. Histological observations on morphogenesis from androgenetic tissues of Triticum aestivum L. n. Embryoids and embryo cell complexes//Arch. Zuchtung. 1991. Bd. 21. H. 3. S. 161-168.

402. Schaeffer G.W., Baenziger P.S., Worley J. Haploids plant development from anther and in vitro embryo culture ofwheat // Crop. Sci. 1979. P.697-702.

403. Sharma K.K., Bhojwani 8.8. Histological and histochemical investigations of pollen embryos of Brassica juncea (L.) Czern. //Biol. plant. 1989. Y. 31. N 4. P. 276279.

404. Shimada T. Haploid plants regenerated from the pollen callus of wheat (Triticum aestivum L.) // Jap. J. Genet., 1981. - Y. 56. - 6. - P. 581-588.

405. Sibikeeva Ju.E., Sibikeev S.N. Genetic analysis of anther culture response in wheat carrying alien translocations // Theor. Appl. Genet., 1996. - Y. 92. P.782-785.

406. Shimada T., Otani M., Hatanaka H. Genetic factors of the anther culture response in Japanese winter wheat cultivars//Bull. Res. Inst. Agr. Resour. 1993. N 3. P. 1-4.

407. Simola L. Ultrastricture of callus culture from Betula pendula and Picea abies //proc. V intern, congr. "Plant tissue and ceH culture". Tokyo: Maruzen Co. Ltd., i982. P. 173-174.

408. Skoog P., Miller C.O. Chemical regulation of grouwth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. Cambridge: Univ. Press, 1957. -Vol. ll.P.118-131. .

409. Simpson E., Snape J.W. and Finch R.A. Variation between Hordeum bulbosum genotypes in their ability to produce haploids in barley (Hordeum vulgare L.) // Z. Pflanzenzucht., 1980. - Y. 85. - S. 205-211.

410. Singh N., Behl R.K., M.S. Punia. Production of double haploids via maizepollination in wheat // Cer. Res. Cot., 2001. - V. 29. - P. 289-296

411. Sitch L.A., Snape J.W. Factors affecting haploid production in wheat using Hordeum bulbosum system. 1. Genotypic and environmental effects on pollen

412. Smith D.L., Krikorian A.D. Production of somatic embryos from carrot tissues in hormone-free medium. Plant Sci., 1988, N1, P.103-110.grain gennination, pollen tube growth and frequency of fertilization // Euphytica. -1987. -Y. 36. -P. 483-496.

413. Snape J.W. A theoretical comparison of diploidized haploid and single seed descent populations // Heredity. 1976. - y. 36. - P. 275-277.

414. Snape J.W., Chapman y., Moss J., Blandchard C.E., Mitter T.E. The crossabilities of wheat varieties with Hordeum bulbosum // Heredity. 1979. y. 42. -P. 292-298.

415. Sopory S.K., Maheshwari S.C.I Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia ffects of growth hormones//J. Exptl Bot. 1975. y. 7. N 96. P. 58-68.

416. Stanley R.G. Pollen chemistry and tube growth in Pollen: development and rhysiology. London: Butterworth, 1971. P. 131-155.

417. Sorvari S. The effect of starch gelatinized nutrient media in barley anther cultures //Annales Agr. Fenniae. 1986a. - y. 25. - P. 127-133.

418. Sorvari S. Comparison of anther cultures of barley cultivars in barley starch and agar gelatinized media //Annales Agr. Fenniae. 1986b. - y. 25. - P. 249-254.v

419. Sorvari S. and Schieder Q. Influence of sucrose and melibiose on barley anther cultures in starch media // Plant Breed., 1987. - V. 99. - P. 164-171.

420. Stanley R.G., Linskens H.F. Pollen: biology, biochemistry, management. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1974. 181 p.

421. Subrahmanyam N.C Haploidy from interspecific crosses. 1. Polyhaploids of H.parodii and H.procerwm // Theor. Appl. Genet., 1977. - V. 49. - P. 209-217.

422. Subrahmanyam N.C. Haploidy from interspecific crosses. 2. Dihaploids of H. brachyantherum and H.depressum // Theor. Appl. Genet., 1979. - Y. 55. - P. 139144.

423. Subrahmanyam N.C. Haploidy from interspecific crosses. 3. Trihaploids of H. arisonicum and H. lechleri // Theor. Appl. Genet., 1980. - Y. 56. - P. 257-263.

424. Sun Ch.-Sh. Androgenesis of cereal crops/ZProc. sino-austral. sympos. "Plant tissue culture". Boston: Pitman publ. Ltd., 1981. P. 117-124.

425. Sun C., Wang C and Chn C. Cell division and differentiation of pollen grains Triticale antheres cultured in vitro // Sci. Sin., 1974.: Y. 17. P. 47-54.

426. Sunderland N. Anther culture: a progress report // Science progress (Oxford). . 1971. Yol. 59. N236. P. 527-549.

427. Sunderland N., Wicks F.N. Embryiod formation in pollen grains of Nicotiana tabacum // J. Exp. Bot,. 1971. - Y. 22. - P. 213-226.

428. Sunderland N. Pollen and anther cnltHre/ /Plant tissue and cell culture. Oxford: Oxford Univ. press, 1973. P. 205-239.

429. Sunderland N. Anther culture as a means of haploid induction //Haploides in igher plants: advances potential. Guelph: University of Guelph Press. 1974. P.92-122.

430. Sunderland N. Anther and pollen culture // The plant genome. Norwich: Inn Inst, press, 1980. P. 171-183.

431. Sunderland N. Induction of growthin the culture of pollen.l/ In: Differentiation in vitro (eds Zeoman M., Trumen D.).Cambrige. Cambrige Univ. press. 1982. p .1-24.

432. Sunderland N. The concept of morphogenic competence with referent ' to anther and pollen culture//Plant cell culture in crop improvement. New York; London: Plenum press, 1983. P. 125.

433. Sunderland N., Collins a.B., Dunwell J.M. The role of nuclear fusion in pollen embryogenesis of Datura innoxia Mill.l /Planta. 1974. Y. 117. N 3. P. 227.

434. Sunderland N., Dunwell J.M. Anther and pollen culture//Plant tissue and cell culture. Oxford: Blackwell, 1977. P. 223-265.

435. Sunderland N., Roberts M. Cold pretreatment of excised flower buds in float culture of tobacco anthers //Ann. Bot., 1979. -Y. 43. - P. 405-414.

436. Sunderland N., Evans L. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers//J. Exp. Bot., 1980. - Y. 31. - P.501-514.

437. Sunderland N., Huang B., Hills B. Disposition of pollen in situ and its relevance to anther pollen culture // J. Exp. Bot., 1984. - Y. 35. - P. 521-530.

438. Sunderland N., Huang B. Barley anther culture the switch program and albinism // Hereditas. - 1985. -N 3. - P. 27-40.

439. Sunderland N., Roberts M., Evans L.J. Wildon D.C. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. 1. Independent division of the generative and vegetative cells//J. Exp. Bot. 1975. Y. 30. N 119. P. 1133-1144.

440. Sunderland N., Roberts M. New approach to pollen culture // Nature/ 1977. V.279. N2 . P.236-238.

441. Sunderland N., Wicks F .M. Embryoid formation in pollen grains of Nicotiana . tabacum//J. Exp. Bot. 1971. V. 22. N 70. P. 213-226.

442. Sung P., Chiang Ch., Pen W. The induction effect of somatic tissue in the Anther cultured in vitro on androgenesis // Proc. Sino-Ausrtal. symp."Plant tissue Culture". Boston: Pitman Publ. Ltd., 1981. P. 143-149.

443. Sungwan R.S., Sangwan-Noneel. Biochemical cytology of pollen embryogenesis //Int. Rev. Cytol., 1987. - Y. 107. - P. 221-272.

444. Szigat G. Abtbastardierung by Gerste // Tag. Ber. Akad. Landwirtschaft DDR.

445. Berlin,. 1984. - y. 225. - S. 201-207.

446. Szigat G., Pohler W. Hordeum bulbosum x Hordeum vulgare hybrids and their baccrosses with cultivated barley// Cereal Res.Commun., 1982. Szeget. - y.IO. - N1. -P. 73-78.

447. Tautz O. Hypervariability of simple sequences as source for polimorfic DNA Markers//Nucl. Acids Res -1988.- y.16 N216.-P.6463-6470.

448. Tautz O. Trick M., Dover D.A. Criptic simplicity DNA is a major sours of genetic variation// Nature.- 1986.- V .22. P 652-656.

449. Teplitskaya L.M. Investigation of critical events in androgenesis process in Nicotiana tabacum L. plants/ /Proceed. XI internat. sympos. "Embryology and seed reproduction". St. Petersburg: Nauka, 1992. P. 553.

450. Terzi M., Sung Z. Somatic cells, genetics 01 plants // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. V.3. N24. P.303-310.

451. Tinker N., Fortin M., Mather D. Random amplified DNA and pedigree relationships in spring barley// Theor. Appl. Genet.- 1993.- Y.85.- P.976- 984.

452. Torp A.M., Hansen A.L., Holm I.B. and Andersen S.B. Genetic markers forhaploid formation in wheat anther culture // Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Symp., Saskatoon. Sask.,Canada. 1998. - y. 3. - P.159-161.

453. Toney J.G. Morphogenesis in relation to chromosomal constitution in tongtenn plants tissue cultures // Physiol, plant. 1967. Y.20. №2. P.265-275.

454. Tsay S.S., Tsay H.S., Chao C.y. Cytochemical studies of callus developmeni from microspore in cultured antheres of rice // Plant Cell Reports. 1986. - y. 5. - N 2.-P. 119-123.

455. Tsukahara M., Hirosawa T. Simple dehydration treatment promotes tegeneration of rise (Oryza satyva L.) callus. Plant Cell Repts. 1992, N1, P. 550-553.

456. Touraev A., Fink Ch., Stoeger B. and Heberle-Bors B. Pollen selection: a transgenic- reconstruction approach.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. y. 92. p.12165-12169.

457. Touraev A., Vicente 0. and Heberle-Bors B. Stress induced Microspore embryogenesis from tobacco microspores: an optimized system for molecular studies. //Plant Cell Rept. 1996a. y. 15. P.561-565.

458. Touraev A. Indrianto A., Wratscko 1., Vicente 0. and Heberle-Bors B. Officient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum) induced by starvation at high temperatures.//Sex. Plant Repr. 1996b. y. 9.P.209-215.

459. Touraev A., Pfosser M., Vicente 0. and Heberle-Bors B. Stress as the major S ignal controlling the developmental fate of tobacco microspores: towards a . enified model of induction of pollen embryogenesis. //Planta. 1996c. y. 200. P. 44-152.

460. Touraev A. Stoeger B., Voronin y. and Heberle-Bors B.Plant male genn line iransformation. // Planta. 1997. y. 12. P. 949-956.

461. Tsunewaki K. Genetic studies of a 6-x derivate from an 8-x Triticale // Canad. Cytology.- 1964.-Y. 6.-P. 1-11.

462. Tsunewaki k., Noda K., .Fujisava T. Haploid and twin formation in a wheatstrain Salmon with alien cytoplasms // Cytologia. 1968. - У. 33. - P. 526-538.

463. Tsunewaki K, Tsujimoto H. Genetic diversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops //Proc. of the 6th Int .Genet. Symp, Kyoto. - 1983. - P. 1139-1144.

464. Tsunewaki К and Mukai У. Wheat haploids through Salmon method // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.). Springer Verlag: Berlin -Heidelberg. -1990. У. 13. - P. 460-477.

465. Trewavas A J. How do plant growth substances woek? // Plant Cell Envir. 981. У. 4. N 1. P. 203 .

466. Tulecke W. A tissue derived пот the pollen of Gingko biloba L. // Science. 1953. У. 117. N3048. P.599-600.

467. Уап Geyt J., D Hlluin K, Jakobs M. Induction of nuclear cell divisions in Wicrospores of sugarbeet (Beta rulgaris L.)//Z. Pflanzenzucht. 1985.У. 95. N 4. P. 325.

468. Vasil I.K, Hildebrandt A.C. Variations of morphogenetic behavior in plant ti ssue cultures. П. Petroselinum hortense //Amer. J. Bot. 1966. У. 53'. N 9. P.869-874.

469. Vasil I.K. The New Biology of Pollen // Naturwissenschschaften. 1973. В. 60.H. 5. S. 247-253.

470. Vasil I.K. Tfie histology and physiology of pollen germination and pollen tube growth on the stigma and in the style//Fertilization in higher plants. , Amsterdam, 1974. P. 105-118

471. Vasil I.K. Androgenetic haploids/ /International review of cytology. Suppl. 11 L. 1980. P. 195-223.

472. Vasil I.K, Nitsch C. Experimental production of pollen haploids and their tesses //Z.Pflanzenphysiol. 1975. N 3. S.191-212.

473. Void B, Nelson J.I. Production and. characterization of antibodies andesteblishment of a radioimmunoassay for ribosylzeatin/ /Plant Physiol. 1981. V.67, N2.-P.401-403.

474. Wan Y., Petolino J.F. and Widholm J.M. Efficient production of doubled haploid plants through colchicine treatment on anther derived callus // Theor. Appl. Genet., -1989.-V. 77.-P. 889-892.

475. Wan y., Raybum A.L., Petolino J.F and Widholm J.M. The use of antimicriotubule herbicides for the production of doudled haploid plants from anther-derived callus //Theor. Appl. Genet., 1991. - V. 81. - P. 205-211.

476. Wang C.C., Sun S., Chu C. Effects of culture factors in vitro on the production of albino pollen-plantlets of rice//Acta Bot. Sinica, 1977. - V. 19. P. 190-199.

477. Wang C.C., Kuang B.J. Induction of haploid plants from the female gametophyte of Hordeum vulgare L. / / Acta Bot. Sinica. -1981. v. 23. - P. 329-330.

478. Wei X.L., Cao H.L., Hh Q.D. Studies on the process of fertilization and the development of haploid embryos and endosperms of Triticum aestivum after crossing with tetraploid Hordeum bulbosum // Acta Genet. Sinica. 1985. - y. 12. - P. 275280.

479. Walton D.C., Dashelc W., Galson E. A radioimmunoassay for abscisic asid//Planta.-1979.-V.146, N21.-P. 139-145. .

480. Wakhlu A.K. Bajwa P.S. Citological analisis in embryogenis callus cultures and regenerated plants of Papaver somniferum L. (Opium poppy). Cytologia.1987. 5'2. X2 3. P.631-638.

481. Wei Z.M. Pollen callus culture in Triticum aestivum // Theor. Appl. Genet., 1982, y. 63, N2 1, P. 71-73.

482. Weiler E.W. An enzyme-immunolassay of cis-(+)-abscisic acid // Physiol. Plant. 1982. V.54.№24.P. 510.

483. Weiler E.W., Joourdan P.S., Conrad W. Levels ofindol-3-acetic acid in intact 0-nd decapitated coleoptiles as determined by a specific and highly sensitive solid Phase immunoassay//Planta. 1981. y. 153. .№4. P. 561.

484. Welsh J., McCleland M. Fingerprinting genome using PCR with arbitrary primers//Nucl. Acids Res. -1990. y.18, N.24. P.7213-7218.

485. Wenzel G., Hoffman F,, Potrykus 1., Thomas E. The separation of viable rye microspores ftom mixed population and their development in culture//Molec. Genet. 1975. y. 138. N1. P. 293-297.

486. Wenzel G., Hoffman F., Thomas E. Increased induction and chromosome doubling of androgenetic haploid rye // Theor. Appl. Genet. 1977. Y. 51. P81-86.

487. Wenzel G. Protoplast techniques incorporated into applied breeding programs // Vlntern. Protoplast Symp.: proceedings. Budapest. 1980. P. 327-340.

488. Wernicke W., Milkovits L. Development gradients in wheat leaves-Response of leaf segments in different genotypes cultured in vitro. J.Plant Physiol. 1984, Y. 115. №2. P. 49-58.

489. Wernicke W., Gorsy J., Milkovits L. The albiguous role of 2,4 dicblorophenoxyacetic acid in wheat tissue culture. Physiol. Plantarum. 1986, Y. 68. № 4. P. 597-602.

490. Wheatley W.G., Marsolais A.A., Kasha K.J. Microspore growth and anther staging in barley anther culture//Plant Cell Repts. 1986. Y. 5. N 1. P. 47.

491. Wheeler A. W. Chandes in Growth Substanses Contents during Growth of Wheat Grains // Ann.Appl.BioI. 1972. Y.12. X23. P.327 334.

492. Williams B.A., Tsang A. Analysis of multiple classes of abscisic acid responsive genes during embryogenesis in Zea mays//Dev. Genet. 1994. Y. 15. N 5: P. 415-424.

493. Wenzel G., Hoffmann F., Potrykus 1., Thomas E. The separation of viable ryemicrospores from mixed populations and their development on culture // Molec. Genet., 1975. - N2 138. - P. 293-297.

494. Wiliams E.G. and de Lautour G. The use of embryo culture with transplanted nurse endosperm for the production of interspecific hybrids in pasture legumes / /Bot. Gaz. Chikago. 1980. -v. 141. - P. 252-257.

495. Winzeler H., Schmid J. and P .M. Fried. Field performance of androgenetic doubled haploid spring wheat lines in comparison with lines selected by the pedigree system //Plant Breeding. 1987. -v. 99. - P. 41-48.

496. Xu Jie and Snape J.W. The cytology of hybrids between Hordeum vulgare and H. bulbosum revisited // Genome. 1987. - V. 30. - P. 486-494.

497. Xu Z.H., Huang B. Anther factors(s) in barley anther culture //Acta Bot. Sinica. -1984. -v. 26 -N21. P. 1-10.

498. Xynias I.N., Zamani I.A., Goul-Vavdinoudi E., Roupakias. Effect of cold pretreatment and incubation temperatute on bread wheat (Triticum aestivum L.) anther culture//Cer. Res. Cot. 2001. - V. 29. - N23 .-P. 331-338.

499. Yamomoto K., Miura H. Influence of the semidwarf genes Rhtl and Rht2 upon embryoid induction from anther culture ofwheat // Wheat Inform. Serv., 1995. V. 81.-P. 6-12.

500. Yang H., Zhou C. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovaries and ovules//Theor.Appl. Genet., 1982.-V. 63. - P.97-104.

501. Zhou J. Pollen dimorphism and its relation to the formation of pollen embryos in anther culture ofwheat (Triticum aestivum L.) // Acta Bot. Sin., 1980. - V. 22. - P. 117-121.

502. Zhou C. and Yang H. Anther culture and androgenesis of Hordeum vulgare L. // Acta Bot. Sin., 1980. - Y. 22. - P. 211-215.

503. Zhou C., Yang H. Induction of haploid rice plantlets by ovary culture // Plant Sciense Letters. -1981. -Y. 20. P. 231-237.

504. Zenkteler M., Straub J. Cytoembryological studies on the process of fertilization and the development of haploid embryos of Triticum aestivum L. (2n=42) after crossing with Hordeumbulbosum (2n=14) // Z. Pflanzenzucht., 1979. Y. 82. - P. 3644.

505. Zhu Z.C., Wu H.S. Induction of haploid plants from unpollinated ovaries of Triticum aestivum cultured in vitro //Acta Genet. Sinica, -1981. Y.8. P.386-390.

506. Zhuang J.J., Jia X. Studies the differentiation of pollen calli of wheat // Ann. Rep. Inst. Genet. Acad. Sin., 1980. - P. 70-71.

507. Ziegler G., Dressier K., Hess D. Investigations of the . anther culture of four german spring wheat cultivars and the influence of light on regeneration of green and albinoplants // Plant Breed., 1990. - Y 105. - P. 40-46.

508. Zhenghua C., Changfa Q., Xuen X., Zhongtao D. Anther culture techniques of rubber tree and sugarcane /Proceed. V Intern. Congr."Plant Tissue and Cell Culture". Tokyo, 1982. P.533-534.

509. Zhou J. Pollen dimorphism and its relation to the formation of pollen embryos in anther culture of wheat (Triticum aestivum)//Acta bot. sin. 1980. Y. 22. N 2. P. 117.

510. Zhu Z.-Q., Sun J.-Sh., Wang J.-J. Cytological investigation on androgenesis of Triticum aestivum//Acta bot. sin. 1978. Y. 20. N 1. P. 6-12.

511. Zimmerman J.L. Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants // Plant Cell. 1993. Y.5. N 10. P.1411-1423.

Информация о работе

Лаврова, Наталия Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы