Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм

Прокофьева, Мария Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм"

005050742

На правах рукописи

ПРОКОФЬЕВА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-СИСТЕМЫ СКРИНИНГА ИНГИБИТОРОВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (Н1У-1) ДИКОГО ТИПА И МУТАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННО-УСТОЙЧИВЫХ ФОРМ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 МАР 2013

Москва

2013

005050742

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель:

Заведующий лабораторией биологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессорВ.С. Прасолов

Официальные оппоненты:

Ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук, профессор Н.О. Калинина

Ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, кандидат биологических наук М.А. Эльдаров

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН.

Защита диссертации состоится « » МО/?/ О 2013 г. в "/У часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук

А.М. Крицын

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Вирус иммунодефицита человека (HIV-1) является возбудителем одного из самых опасных заболеваний человека - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), число HIV-1-инфицированных в мире к концу 2011 года превысило 34 миллиона человек, ежегодно от СПИДа умирает около двух миллионов человек, и число HIV-1 инфицированных постоянно растет.

До сих пор не существует ни одной эффективной терапевтической вакцины против HIV-1. Основным подходом при лечении является использование препаратов, действие которых направлено на подавление различных стадий жизненного цикла HIV-1. В настоящее время существует 25 препаратов, одобренных для применения в клинических условиях. Однако против многих препаратов у вируса возникает лекарственная устойчивость, что требует постоянной разработки и создания новых лекарственных препаратов.

Одновременное применение нескольких соединений, имеющих разные мишени, в рамках высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) позволяет достигать относительно длительного и заметного снижения титра вируса в крови и, как следствие, существенно продлевать жизнь больного. Тем не менее, использование всех этих соединений имеет несколько ограничений. Во-первых, пожизненное носительство вирусной инфекции делает необходимым многолетний прием лекарственных средств, при котором возникают новые мутантные формы вируса, устойчивые к используемым препаратам и способные распространяться в популяции. Во-вторых, необходимость длительной терапии часто ставит на первый план возможное побочное действие противовирусных средств. Таким образом, поиск новых соединений, обладающих анти-HIV-l-активностью, является весьма актуальным и представляет серьезную задачу современной молекулярной биологии, вирусологии и медицинской химии.

Изменчивость HIV-1, приводящая к возникновению лекарственно-устойчивых форм осложняет задачу исследователей.

Важный этап разработки новых антиретровирусных средств — проверка их эффективности. В настоящий момент существуют два основных подхода для определения эффективности потенциальных противовирусных препаратов. Одним из них является ингибиторный анализ in vitro с использованием очищенных вирусных ферментов. Однако при работе с очищенными ферментами невозможно установить эффективность взаимодействия противовирусных препаратов с клеткой in vivo, а именно: способность препарата проникать в клетку, его внутриклеточная стабильность, отсутствие цитотоксического воздействия, эффективность и специфичность противовирусного действия. Второй подход основан на работе с инфекционным вирусом и может быть применен только в ограниченном числе лабораторий, специально предназначенных для работы с опасными патогенами человека. Поиск потенциальных ингибиторов репликации лекарственно-устойчивых штаммов HIV-1 связан с необходимостью использования инфекционного лекарственно-устойчивого вируса, представляющего опасность для персонала лаборатории.

Лентивирусные векторы, функциональная эффективность которых проявляется в результате активности ключевых ферментов HIV-1- обратной транскриптазы, интегразы и протеазы, являются перспективными для быстрого и полностью безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации HIV-1.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования является создание безопасной и эффективной системы скрининга потенциальных ингибиторов жизненного цикла HIV-1 на основе рекомбинантных лентивирусных векторов и ее использование для скрининга потенциальных ингибиторов HIV-1. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить панель псевдо-HIV-l частиц, содержащих вирусные ферменты обратную транскриптазу и интегразу дикого типа или их мутантные лекарственно-устойчивые формы.

2. Для оценки эффективности разработанной системы определить активность известных лекарственных препаратов - ингибиторов жизненного цикла HIV-1 против псевдо-HIV-l частиц и сравнить полученные данные с активностью исследованных препаратов против инфекционного HIV-1, известной по литературным данным.

3. Провести анализ активности потенциальных ингибиторов HIV-1: бензофеноновых производных пиримидинов как ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы HIV-1 и сульфатированных полисахаридов в качестве ингибиторов проникновения HIV-1 в клетку.

Научная новизна работы. Нами разработана система безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации HIV-1, которая позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и интегразу HIV-1 дикого типа, так и на их мутантные формы, свойственные соответствующим лекарственно-устойчивым формам вируса. Ни одна из существующих в настоящее время систем скрининга ингибиторов HIV-1 не позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм HIV-1.

Практическая значимость работы. С использованием ряда коммерческих препаратов, обладающих активностью против HIV-1, доказана адекватность использования псевдо-HIV-l частиц для тестирования ингибиторов HIV-1. Важно, что используемые в нашей системе псевдо-HIV-l частицы не инфекционны и, по сути, представляют собой вирусы одноразового действия, содержащие полный набор вирусных ферментов, обеспечивающих синтез рекомбинантного двухцепочечного ДНК-провируса и его интеграцию в геном клеток-мишеней. Отсутствие в таком рекомбинантном геноме всех генов HIV-1 гарантирует безопасность испытаний эффективности новых анти-HIV-l соединений, с одной стороны, и возможность адекватной оценки действия этих соединений на обратную транскриптазу и интегразу HIV-1 в клетках, трансдуцированных псевдо-HIV-l частицами.

Мы показали возможность формирования псевдо-HIV-l частиц, содержащих мутантную лекарственно-устойчивую обратную транскриптазу или интегразу, что позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм HIV-1. Таким образом, полученная в ходе данной работы система скрининга позволяет проводить исследования потенциальных ингибиторов жизненного цикла HIV-1 как дикого типа, так и распространенных в настоящее время лекарственно-устойчивых форм вируса.

Псевдотипирование лентивирусных частиц белками оболочки ретровирусов различной природы, в том числе и белком оболочки HIV-1 (SUgpl20 + TMgp41), существенно расширяет возможности системы скрининга, позволяя проводить тестирование ингибиторов проникновения вирусов в клетку. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы (животного и растительного происхождения) с разной степенью эффективности подавляют трансдукцию клеток псевдо-HIV-l частицами.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференциях: 11 международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Мурманск, июнь 2012 г.), 1th Symposium on Marine Enzyme and Polysaccharides, Nha Trang, Vietnam, December 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и 2 тезиса докладов в материалах международных конференций.

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка

литературы, включающего 204 источников. Материал иллюстрирован рисунками и £ таблицами.

Работа выполнена при финансовой поддержке Государственных контрактов №16.512.12.2001 и №16.512.12.2006 в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 11-04-01365-а. Часть экспериментов проводилась при использовании оборудования ЦКП «Геном» (ИМБ РАН).

Список использованных сокращений.

ЗТС - ламивудин

eGFP - усиленный зеленый флюоресцирующий белок (enhanced green fluorescent protein)

HIV - вирус иммунодефицита человека

IC50 - концентрация полумаксимального ингибирования

SU - внешняя субъединица белка оболочки

ТМ - трансмембранная субъединица белка оболочки

VSV-G - белок G оболочки вируса везикулярного стоматита

АЗТ - азидотимидин

НИОТ - нуклеозидные (нуклеотидные) ингибиторы реакции обратной транскрипции ННИОТ - ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ОТ - обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика системы.

Псевдо-HIV-l частицы являются рекомбинантными лентивирусными векторами. Для сборки псевдо-HIV-l частиц использовали так называемые упаковывающие клетки, в которых осуществляется синтез вирусоспецифических белков. Процедура получения псевдо-HIV-l частиц заключается во внесении в культивируемые клетки почки эмбриона человека линии НЕК293 методом Са-фосфатной трансфекции плазмид, содержащих а) гены gag-pol HIV-1, кодирующие структурные белки, формирующие капсид вирусной частицы и ферменты HIV-1 (обратную транскриптазу, интегразу и протеазу); б) ген env, кодирующий белок оболочки HIV-1, или ген белка оболочки иного вируса и в) рекомбинантную ДНК, кодирующую РНК-геном псевдо-HIV-l частиц, несущий регуляторные элементы генома HIV-1 и маркерный ген флуоресцентного белка. В работе в основном использовали псевдо-HIV-l частицы, несущие ген зеленого флуоресцентного белка в качестве маркера. После внесения всех перечисленных плазмид в упаковывающие клетки в них происходит синтез вирусных белков и рекомбинантной РНК, обеспечивающих формирование HIV-1-подобных частиц, выходящих в культурапьную среду. Лентивирусная трансдукция клеток-мишеней такими псевдо-HIV-l частицами приводит к тому, что в этих клетках на рекомбинантном РНК-геноме обратная транскриптаза HIV-1 осуществляет синтез ДНК-провируса, содержащего маркерный ген, встраивание которого при участии интегразы HIV-1 в геном клетки-мишени придает ей способность флуоресцировать. Для детекции таких трансдуцированных клеток, экспрессирующих ген флуоресцентного белка, был использован метод проточной цитофлуориметрии.

Функциональная активность псевдо-HIV-l частиц осуществляется за счет вирусных ферментов, входящих в состав частиц, которые обеспечивают синтез рекомбинантного двухцепочечного ДНК-провируса и его интеграцию в геном клеток-мишеней.

Следует особо отметить, что использование плазмидных ДНК, экспрессирующих по отдельности вирусспецифические белки, позволяет осуществлять сборку в упаковывающих клетках любых вариантов псевдо-HIV-l-частиц с одной или несколькими мутациями в любом из ферментов репликации вируса, которые соответствуют лекарственно-устойчивым штаммам HIV-1.

Получаемые псевдо-HIV-l частицы способны переносить и направлять экспрессию маркерного гена, в трансдуцированных клетках-мишенях, но при этом не происходит формирования новых инфекционных вирусных частиц, т.к. рекомбинантный геном не содержит вирусных генов, кодирующих структурные вирусные белки и вирусные ферменты. Иными словами, псевдо-HIV-l-частицы являются «вирусами одноразового действия» и не вызывают развития вирусной инфекции, то есть являются безопасными.

2. Выбор белка оболочки для псевдо-HIV-l частиц.

Важнейшими параметрами лентивирусной системы являются эффективность трансдукции клеток-мишеней псевдо-HIV-l частицами и, как следствие, уровень флуоресценции полученных трансгенных клеток. Эти параметры зависят от состава псевдо-HIV-l частиц (вида белков оболочки) и линии трансдуцируемых клеток-мишеней. В качестве клеток-мишеней мы использовали перевиваемые лимфобластные клетки крови человека Jurkat, СЕМ-SS, РМ1 и МТ-4 (Т-лимфобластный лейкоз, содержат специфические рецепторы HIV-1), клетки-предшественники клеток крови линии Kasumi-1 (острый миелоидный лейкоз), а также фибробласты эмбриона мыши SC-1.

Нами получены и изучены два типа псевдо-HIV-l частиц, отличающихся друг от друга белками оболочки. Частицы первого типа содержат белок оболочки gpl60, состоящий из двух субъединиц, SUgpl20 и TMgp41, HIV-1; частицы второго типа - белок G оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV). Использование частиц первого типа приводило к сравнительно невысокой эффективности трансдукции (рис. 1) и более слабому сигналу

флуоресценции (данные не приведены) от трансдуцированных клеток. Частицы, несущие специфический белок оболочки HIV-1, способны заражать только клетки, содержащие специфический рецептор CD4 и корецепторы CCR5 или CXCR4, к которым относятся культуры клеток Jurkat, СЕМ-SS, РМ1 и МТ-4. В случае псевдо-HIV-l частиц, несущих белок VSV-G, доля инфицированных клеток и уровень экспрессии гена маркерного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) были существенно выше (рис. 1). Кроме того, с помощью частиц, псевдотипированных белком VSV-G, при необходимости можно переносить маркерные гены в клетки широкой видовой и тканевой специфичности, поскольку вирус везикулярного стоматита не имеет специфического рецептора [Coil, 2004]. Такой прием может позволить проводить поиск ингибиторов ретровирусов, поражающих и иные, чем кровь, ткани. Поэтому в большинстве опытов по изучению свойств ингибиторов обратной транскриптазы и интегразы HIV-1 использовали именно псевдо-HIV-l частицы с белком VSV-G. Частицы, содержащие белок оболочки HIV-1 gpl20+gp41, использовали в опытах по изучению свойств ингибиторов проникновения вируса в клетку.

Сравнение псевдо-HIV-l с разными белками оболочки

g юо%

с:

s 80%

s I

=Г

I 60%

gpl20+gp41 (HIV-1) VSV-G

Рисунок 1. Уровень трансдукции клеток линии Jurkat псевдо-HIV-l частицами, содержащими в качестве белка оболочки белок gpl20+gp41 Н1У-1или белок G вируса везикулярного стоматита (VSV).

Использованный нами метод получения лентивирусных частиц позволяет получить частицы, содержащие тот белок оболочки, который удобнее для исследовательских целей. Например, белок оболочки вируса лейкоза мышей Молони (MoMuLV), который является экотропным, и такие частицы способны специфически заражать только клетки грызунов (мышь, крыса), и не заражает клетки приматов, в том числе и человека.

3. НУКЛЕОЗИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ HIV-1. 3.1. Азидотимидин.

Первое и наиболее известное анти-HIV-l-средство данного класса - З'-азидо-З'-дезокситимидин (АЗТ), способно подавлять репликацию вируса дикого типа в наномолярных концентрациях. Мы использовали этот препарат в качестве контрольного соединения для проверки адекватности нашей системы. Полученные данные по ингибиторной активности АЗТ против псевдо-HIV-l частиц сравнивали с известными по литературе данными по ингибиторной активности АЗТ в отношении инфекционного HIV-1 [Smith, 2010] или показанной в отношении обратной транскриптазы HIV-1 in vitro.

Мы изучили противовирусную активность АЗТ в отношении псевдо-HIV-l частиц, несущих белок оболочки VSV-G на своей поверхности. На рисунке 2 показано, как АЗТ влияет на эффективность трансдукции клеток псевдо-HIV-l частицами, содержащими обратную транскриптазу и интегразу дикого типа, и белок оболочки G вируса везикулярного стоматита соответственно. Видно, что АЗТ подавляет трансдукцию эукариотических клеток псевдо-HIV-l частицами, хотя и в более высоких концентрациях, чем инфекционным HIV-1 (таблица 1) [Rosenblum, 2001, Smith, 2010, Paintsil, 2011].

Рисунок 2. Действие АЗТ на эффективность трансдукции клеток разных линий псевдо-НГ\М частицами, содержащими белок оболочки VSV-G.

Опыт проводили на культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии 1игка1, клетки этой культуры содержат специфические для НГ\М рецептор СБ4 и корецептор СХСЯ4.

Были также проведены опыты с участием псевдо-Н^-1 частиц, несущих белок оболочки gpl20+gp41 Н1У-1. Показано, что АЗТ эффективно подавляет трансдукцию клеток такими частицами (данные не приводятся). Белок оболочки псевдо-НГУ-1 частиц, таким образом, не оказывает существенного влияния на эффективность действия АЗТ. В дальнейших опытах были использованы псевдо-НР/-1 частицы, несущие белок VSV-G, поскольку частицы, псевдотипированные этим белком оболочки, значительно эффективнее трансдуцируют клетки (рис.1).

Был проведен эксперимент по сравнению противовирусной активности АЗТ на клетках-мишенях разных линий. В качестве клеток-мишеней были выбраны фибробласты эмбриона мыши линии БСМ, клетки Т-лимфобластного лейкоза человека линий .1игк:а1 и СЕМ-ЭБ, клетки острого миелоидного лейкоза линии Кавшш-!. Установлено, что АЗТ обладает различной эффективностью на разных клеточных линиях. Так, максимальный эффект отмечен на фибробластах мыши 8С-1, а минимальный — при использовании клеток СЕМ-ЭЗ. Причинами подобных различий могут быть разное внутриклеточное содержание нуклеозид- и нуклеотидкиназ - ферментов, необходимых для превращения нуклеозида в соответствующий трифосфат [ОгбйсИе!, 2001], а также от различий в уровнях экспрессии специфических транспортеров, отвечающих за транспорт препарата в клетку или его выведение [Раш1зЦ, 2011].

Полученные данные показывают адекватность системы для предварительной оценки ингибиторной активности потенциальных противовирусных препаратов, поскольку действие АЗТ в нашей системе сходно с показанным на инфекционном Н1У-1 по данным литературы.

3.2. Действие азидотимидина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

Предложенная система позволяет легко конструировать варианты псевдо-HIV-l частиц, несущих ферменты репликации с мутациями, определяющими устойчивость к лекарственным средствам. Это подтверждено получением трех типов псевдо-HIV-l частиц с точечными заменами аминокислотных остатков D67N, R70R, T215F и K219Q в обратной транскриптазе, наиболее характерными для штаммов HIV-1, резистентных к АЗТ [Hooker, 1996, Richman, 1991, Arion, 1999, Isaguliants, 2004].

Было исследовано ингибиторное действие АЗТ на псевдо-HIV-1 частицы с точечными заменами, обеспечивающими устойчивость к нуклеозидным ингибиторам HIV-1. Сравнение противовирусной активности АЗТ в отношении этих вариантов псевдо-HIV-l частиц показало, что препарат гораздо слабее влиял на эффективность трансдукции мутантными частицами (рис. 3), причем падение ингибирующего эффекта зависит от характера мутаций.

Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 3. Действие АЗТ на эффективность трансдукции клеток псевдо-HIV-l частицами, содержащими белок оболочки VSV-G и обратную транскриптазу дикого типа или ее мутантные формы, на клетках линии Jurkat.

Таким образом, полученные нами псевдо-HIV-l частицы, содержащие мутантные формы ОТ, намного менее чувствительны к действию АЗТ, как и ожидалось. Следовательно, наша система позволяет изучать способность веществ ингибировать лекарственно-устойчивые формы вируса.

З.З.Ламивудин (ЗТС).

Другим известным и широко применяемым антиретровирусным препаратом, относящимся к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы HIV-1, является - 2',3'-дидезокси-З'-тиоцитидин (ламивудин, ЗТС). [De Clercq, 2009] Мы оценили противовирусную активность ЗТС на клетках линий Jurkat и СЕМ-SS (рис. 4). Активность препарата в нашей системе была несколько ниже известной из опубликованных данных (таблица 1).

Рисунок 4. Действие ЗТС на эффективность трансдукции клеток линий 1игка1 и СЕМ-ББ лентивирусными частицами, содержащими белок оболочки УЗУ-й.

Также была исследована активность ЗТС в отношении мутантных форм ОТ 06714, 117011, Т215Р и К219С>. Эксперимент проводился на клетках линии .Гигка!, с участием псевдо-Н1У-1 частиц, содержащих описанные выше мутантные формы ОТ. ЗТС проявил низкую эффективность против псевдо-Н1У-1 частиц, несущих лекарственно-устойчивые формы ОТ, сравнимую с эффективностью, показанной АЗТ (рис. 5).

х 100%

л X X

§ 80% о.

5 | 60% 40%

—■»""ОТ дикого типа

.....И"' ОТ с мутациями

067Ы, К70Р

—ОТ с мутациями 0674 К7СЖ, Т215Р, К2190

•ОТ с мутациями Т215Р, К2190

0 2 4 6 8 10 Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 5. Действие ЗТС на эффективность трансдукции клеток лентивирусными частицами, содержащими белок оболочки УЗУ-О и обратную транскриптазу дикого типа или ее мутантные формы, на клетках линии .Іигкаї.

Таблица 1. Противовирусная активность НИОТ в отношении псевдо-Н1У-1 частиц, псевдотипированных белком УЭУ-в и содержащих ОТ дикого типа._

Соединение Экспериментальные данные IC50, мкМ

Клеточная линия 1С5о, мкМ

[Rosenblum , 2001] [Smith, 2010] [Bjerke, 2008] [Daluge, 1997]

АЗТ 1игка1 0,10 ±0,01 0,1 0,1 0,055 0,04

ЭС-1 0,080 ± 0,005

Казштп-1 0,30 ± 0,02

СЕМ-ЭЗ 0,46 ± 0,05

ЗТС .1игка1 0,70 ± 0,05 0,316 0,35 0,019 2,1

СЕМ^ 0,85 ± 0,05

4. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы Н1У-1. 4.1. Невирапин.

Первым одобренным для клинического использования ненуклеозидным блокатором репликации Н1У-1 - ингибитором обратной транскриптазы является невирапин [Эе С1егся, 2009]. Мы исследовали способность невирапина предотвращать трансдукцию клеток-мишеней псевдо-Н1У-1 частицами, несущими обратную транскриптазу дикого типа. Показано, что невирапин проявляет антивирусную активность в отношении псевдо-Н1У-1 частиц, несущих на своей поверхности белок УБУ-в (рис. 6).

Для невирапина также было проведено исследование эффективности его антивирусного действия на разных линиях клеток. В работе были использованы те же линии клеток, что и в аналогичных экспериментах с участием АЗТ. При сравнении результатов, полученных на разных культурах клеток, показано, что эффективность действия невирапина сходна для всех четырех линий клеток. Особо следует подчеркнуть, что активность невирапина в нашей системе была сопоставима с его активностью в отношении инфекционного Н1У-1 по данным литературы (таблица 2).

псевдо-HIV-1

Рисунок 6. Действие невирапина на эффективность трансдукции клеток частицами, содержащими белок оболочки УвУ-в.

100%

1 2 3 4 5

Концентрация ингибитора, мкМ

—Jurkat

.....ш......SC-1

„—Kasumi-1 -Ф-CEM-SS

4.2. Действие невирапина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

В работе было проверено действие невирапина на псевдо-Н1У-1 частицы, содержащие лекарственно-устойчивые формы обратной транскриптазы. Исследование проводилось как на псевдо-ШУ-1 частицах, содержащих обратную транскриптазу с мутациями, придающими устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам, так и на частицах, содержащих указанные выше мутантные формы обратной транскриптазы, устойчивые к действию нуклеозидных ингибиторов. Данный опыт был проверкой специфичности лекарственной устойчивости мутантных форм ОТ.

Показано, что невирапин проявлял ингибиторную активность в отношении всех типов псевдо-ШУ-1 частиц, устойчивых к действию нуклеозидных ингибиторов (рис. 7). Этот результат позволяет нам утверждать, что исследуемые мутантные формы ОТ, содержащие мутации 0671\1, Я70Я, Т215Б и К219<3, специфично устойчивы именно к НИОТ.

ОТ дикого типа

—ШЬ~ОТ с мутациями 06714, К70(*

.....й"" ОТ с мутациями

06714, К70В, Т215Р, К219Ц

О ОТ с мутациями Т215Р, К219Ц

О 0,5 1

Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 7. Действие невирапина на эффективность трансдукции клеток псевдо-НІУ-1 частицами, содержащими белок оболочки У8У-й и ОТ дикого типа или мутантные формы, устойчивые к действию НИОТ НІУ-1, на клетках линий .Гигкаї.

Нами были получены псевдо-НІУ-1 частицы, несущие ОТ с точечными мутациями, придающими ферменту лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам. Всего было получено 3 мутантные формы ОТ с заменой одного из аминокислотных остатков К ЮЗЫ, У106А, У181С, а также форма с двумя мутациями КЮЗЇЧ, У181С, соответствующие распространенным лекарственно-устойчивым штаммам НІУ-1 [сіє Вёйшпе, 2010]. Невирапин не проявил ингибиторной активности в отношении псевдо-Н1У-1 частиц, содержащих ОТ с мутациями, придающими устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам (рис. 8). Эти мутации затрагивают сайт связывания невирапина, точечные мутации препятствуют связыванию ингибитора, и, соответственно, придают ферменту лекарственную устойчивость.

И ОТ с мутацией K103N

«"чйг-ОТ с мутацией V106A

—ф—ОТ с мутацией Y181C

......* ОТ с мутациями

K103N, Y181C

0 1 2 3 4 5 Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 8. Действие невирапина на эффективность трансдукции клеток псевдо-HIV-l частицами, содержащими белок оболочки VSV-G и обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, устойчивые к действию ННИОТ HIV-1, на клетках линии Jurkat.

4.3. Эфавиренз.

Нами был протестирован другой ненуклеозидный ингибитор HIV-1, эфавиренз, также как и невирапин относящийся к первому поколению ненуклеозидных ингибиторов ОТ HIV-1. Было исследовано действие эфавиренза как против псевдо-HIV-l частиц, содержащих ОТ дикого типа, так и против частиц, содержащих описанные выше формы ОТ, устойчивые к действию ННИОТ (рис. 9).

з 100%

80%

S о

60%

с; о

■-Ф........ОТ ДИКОГО

типа

-S—ОТ с

мутацией

111 Лі......ОТ с

40%

20%

мутациеи V106A

шшфш-ОТ С

Концентрация ингибитора, мкМ

мутациеи Y181C

ОТ с

мутациями K103N, Y181C

Рисунок 9. Действие эфавиренза на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat псевдо-HIV-l частицами, содержащими обратную транскриптазу дикого типа или мутантные формы, лекарственно-устойчивые к ненуклеозидным ингибиторам ОТ HIV-1.

Как показано на рисунке 9, эфавиренз проявляет ингибиторную активность как в отношении псевдо-HIV-l частиц, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, так и в отношении псевдо-HIV-l частиц, содержащих ОТ с мутациями, сообщающими

лекарственную устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ Н1У-1. Однако, в случае ОТ дикого типа, эфавиренз эффективен в существенно более низких концентрациях (таблица 2). Две мутантные формы ОТ У106А и У181С сохранили чувствительность к эфавирензу. Более устойчивыми к действию эфавиренза оказались формы ОТ с единичной мутацией КЮЗК и двойной мутацией КЮЗЫ, У181С. Это согласуется с данными других авторов, работающих с инфекционным Н1У-1, по которым устойчивость к эфавирензу придает мутация К103№

Как и в случае с невирапином, активность эфавиренза в нашей системе была сопоставима с его активностью в отношении полноценного инфекционного Н1У-1(таблица 2).

Таблица 2. Противовирусная активность ННИОТ в отношении псевдо-Н1У-1 частиц,

псевдотипированных белком VSV-G и содержащих ОТ дикого типа.

Соединение Экспериментальные данные IC50, мкМ

Клеточная линия IC50, мкМ [Smith, 2010] [Grob, 1992] [Bjerke, 2008] [Novikov, 2011]

Невирапин Jurkat 0,100 ±0,005 0,22 0,04 (в культуре клеток) 0,08 (на очищенном ферменте) 0,0072 0,075

SC-1 0,150 ±0,005

Kasumi-1 0,080 ± 0,005

СЕМ-SS 0,20 ±0,01

Эфавиренз Jurkat 0,0040 ± 0,0003 0,005 0,003

Данные, полученные в результате исследований коммерческих ННИОТ, подтверждают адекватность использования нашей системы для тестирования потенциальных ННИОТ. Следует отметить, что, в отличие от НИОТ (таблица 1), ННИОТ в наших исследованиях проявили ингибиторную активность, близкую к активности против инфекционного HIV-1 по данным других авторов (таблица 2). Подобное различие между двумя группами ингибиторов может объясняться тем, что ННИОТ попадают в клетку уже в активной форме, а НИОТ - в форме пролекарств и для образования активной формы должны быть фосфорилированы клеточными киназами. Следовательно, реальное количество активных форм НИОТ в клетке нам доподлинно неизвестно и может быть ниже, чем количество неактивной формы, добавленное в культуральную среду.

5. Исследование новых ненуклеозидных ингибиторов ОТ.

Кроме коммерческих препаратов невирапина и эфавиренза, мы протестировали потенциальные ненуклеозидные ингибиторы, 1-[2-(2-(3,5-диметилбензил)-4-метилфенокси)этил]урацил, обозначенный Z-3, 1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацил, обозначенный Z-8, и 1-[2-(3,5-дихлорбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацил, обозначенный Z-10, синтезированные и любезно предоставленные нам д.фарм.н. М.С. Новиковым (ВолгГМУ) [Novikov, 2011]. Эти соединения представляют собой N'-замещенные урацилы, несущие бензофеноноксиэтильный (Z-8 и Z-10) или бензилфеноксиэтильный фрагменты (Z-3). Было известно, что эти соединения обладают высокой анти-HIV-l активностью в культуре клеток, инфицированных вирусом дикого типа [Novikov, 2011]. В нашей работе было продемонстрировано, что все три соединения способны предотвращать трансдукцию клеток Jurkat псевдо-HIV-l частицами с белком оболочки VSV-G и ОТ дикого типа, причем активность бензофенон-содержащих соединений (Z-8 и Z-10) существенно превышала

активность бензилфеноксиэтилурацильного производного урадила (2-3) (рис. 10) и была сравнима с активностью невирапина.

Полученные данные хорошо коррелируют с результатами изучения этих веществ в клеточной системе с использованием инфекционного вируса (таблица 3).

-г-з

Z-Ю

Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 10. Действие N -замещенных урацилов 2-3, 2-8, 2-10 на эффективность трансдукции клеток линии .Іигкаї псевдо-НІУ-1 частицами, содержащими белок оболочки У8У-в и ОТ дикого типа.

Таблица 3. Противовирусная активность ІЧ'-замещенньїх урацилов 2-3, 2-8, 2-10 в

Соединение Линия клеток ІС5о (экспериментальные данные), мкМ 1С50, мкМ [ІЧоуікоу, 2011]

г-з .Іигкаї 0,95 ± 0,05 0,13

2-8 Іигкаї 0,080 ±0,001 0,016

2-10 .Іигкаї 0,085 ±0,001 0,018

Соединения 2-8 и 2-10 были выбраны для дальнейшего исследования с участием псевдо-Н1У-1 частиц, содержащих лекарственно-устойчивые формы ОТ с мутациями К103М, У106А, У181С. Кроме того, была исследована активность другого бензофенонового производного 5,6-диметилурацила, 2-157 (1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]-5,6-диметилурацил), также любезно предоставленного М.С. Новиковым (ВолгГМУ). Опыты проводили на клетках линии 1игка1.

В отношении псевдо-Н1У-1 частиц с лекарственно-устойчивыми формами ОТ наибольшую активность проявило соединение 2-157 (рис. 11), хотя и в более высоких концентрациях, чем в отношении псевдо-Н1У-1 частиц, несущих ОТ дикого типа. Соединения 2-8 и 2-10 также были активны против некоторых мутантных форм ОТ в составе псевдо-ШУ-1 частиц (рис. 12, 13). Наиболее устойчивой к действию этих соединений показал себя мутантная форма ОТ У106А, наименее - мутантная форма У181С. Следует отметить, что именно эти мутантные формы ОТ не являются устойчивыми к действию коммерческого ингибитора эфавиренза. Обобщенные данные по действию всех трех соединений приведены в таблице 4.

Рисунок 11. Действие соединения 7-157 на эффективность трансдукции клеток линии 1игка1 псевдо-НР/-1 частицами, содержащими белок оболочки УБУ-в и ОТ дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

Ш ОТ с мутацией КЮЗМ

-^-—ОТ с мутацией У106А

™#™ОТ с мутацией У181С

и ОТ с мутациями КІОЗІЧ, У181С

1 2 3 4 5 Концентрация ингибитора, мкМ

а юо%

X I

о 80% 5 о 60% 40% 20%

аг? *

=1 о

1 01

2 ^ о. х

100%

ОТ дикого типа

М ОТ с мутацией КІОЗМ

• ОТ с мутацией У106А

—#—ОТ с мутацией У181С

-™йн-ОТ с мутациями КІОЗМ, У181С

0 1 2 3 4 5 Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 12. Действие соединения Ъ-10 на эффективность трансдукции клеток линии Іигкаї псевдо-Н1У-1 частицами, содержащими белок оболочки У8У-С и ОТ дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

га m

0 а. s

=Г & *

et о

" к

1 ш го с;

80%

60%

40%

20%

И ОТ с мутацией K103N

А ОТ с мутацией V106A

с мутацией Y181C

—ОТ с мутациями K103N,Y181C

Концентрация ингибитора, мкМ

Рисунок 13. Действие соединения 2-8 на эффективность транедукции клеток линии Іигкаї псевдо-ШЛМ частицами, содержащими белок оболочки У8У-С и ОТ дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

Таблица 4. Противовирусная активность (1С50) бензофеноновых производных пиримидинов 2-157, 2-8, 2-10 в отношении псевдо-Н1У-1 частиц, несущих ОТ дикого типа, или мутантные лекарственно-устойчивые формы._

Обратная транскриптаза 1С50 (мкМ)

Невирапин 2-157 Z-10 2-8

Дикий тип 0,100 ±0,005 0,090 ± 0,005 0,085 ± 0,005 0,080 ± 0,005

K103N >10 1,6 ±0,1 3,1 ±0,2 3,60 ± 0,25

V106A >10 5,50 ±0,25 >10 >10

Y181C >10 0,600 ± 0,035 0,75 ± 0,04 1,5 ± 0,1

K103N, Y181C >10 3,6 ±0,2 4,50 ± 0,25 >10

В нашей работе показано, что бензофеноновые производные пиримидинов высокоэффективны в отношении HIV-1 дикого типа и его обратной транскриптазы, а также умеренно активны в отношении большинства лекарственно-устойчивых форм HIV-1. Низкая растворимость этой группы препаратов в воде является их основным недостатком в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

6. Ингибиторы интегразы HIV-1. 6.1. Ралтегравир и L-731,988.

С целью оценки возможностей разработанной системы для скрининга ингибиторов интегразы использовали коммерческий препарат ралтегравир, разрешенный к применению в клинической практике с октября 2007 года, и известный ингибитор фермента L-731,988 [Hazuda, 2000]. Ралтегравир и L-731,988 блокируют вторую стадию интеграции - перенос цепи, препятствуя связыванию интегразы с клеточной ДНК. На рисунках 14 и 15 приведена зависимость эффективности транедукции клеток псевдо-HIV-l частицами, содержащими

интегразу дикого типа, от концентрации ингибиторов, для ралтегравира и L-731,988 соответственно.

2 100% л

о а.

80%

60%

40%

20%

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 Концентрация ингибитора, мкМ

♦ Jurkat

-Ф-СЕМ-SS

Рисунок 14. Действие ингибитора интегразы НГ\М ралтегравира на эффективность трансдукции клеток разных линий псевдо-Н1У-1 частицами, содержащими белок оболочки УБУ-в и интегразу дикого типа.

Рисунок 15. Действие ингибитора интегразы HIV-1 L-731,988 на эффективность трансдукции клеток линий Jurkat и SC-1 псевдо-HIV-l частицами, содержащими белок оболочки VSV-G и интегразу дикого типа.

Видно, что активность ралтегравира примерно на три порядка выше, чем у L-731,988, что согласуется с данными, полученными на очищенном ферменте [Hazuda, 2000, Summa, 2008]. Сравнительные данные приведены в таблице 6.

Таблица 6. Противовирусная активность ингибиторов интегразы в отношении псевдо-ШУ-1 частиц, псевдотипированных белком УЗУ-О и несущих интегразу дикого типа.

Соединение Экспериментальные данные IC50, мкМ

Линия клеток IC50, мкМ [Summa, 2008] [Smith, 2010] [НагшЗа, 2000]

Ралтегравир Jurkat 0,009 ± 0,0005 0,015 0,0037

SC-1 0,006 ± 0,0005

СЕМ-SS 0,009 ± 0,0005

L-731,988 Jurkat 12 ±0,1 0,1 (на очищенном ферменте) 1 (в культуре клеток)

SC-1 8 ±0,1

Снижение числа флуоресцирующих клеток в присутствии ингибиторов интегразы относительно контрольных клеток свидетельствует о том, что подавление интеграции рекомбинантной ДНК в геном клетки-мишени предотвращает экспрессию маркерного гена. Эти данные подтверждают, что в предложенной нами системе происходит полноценная интеграция рекомбинантной ДНК в геном клетки-мишени.

6.2. Действие ралтегравира на мутантные формы интегразы.

Были получены псевдо-ШУ-1 частицы, несущие ОТ дикого типа, и одну из лекарственно-устойчивых форм интегразы, с мутациями, встречающимися у больных с лекарственной устойчивостью [N1, 2011, Рца11а, 2011]. В работе использовались две формы интегразы, несущие по одной мутации - (2148К и Ш55Н, и три формы интегразы, несущие по две мутации - С>148К, ОНОЭ; 0148К, Е138К; N15511, Е92К. Исследования с участием панели исевдо-Н1У-1 частиц, содержащих мутантные формы интегразы, показали, что ралтегравир частично или полностью теряет свою эффективность в отношении мутантной интегразы (рис. 16).

Концентрация ингибитора, ллкМ

—$—Интеграза дикого типа

—й—Интеграза с

мутацией 0148К

—Интеграза с

мутацией М155Н

10'" Интегразас

мутациями 0148К, С140Б

~*®~-Интеграза с

мутациями 0148К, Е138К » Интеграза с

мутациями М55Н, Е92К

Рисунок 16. Действие раптегравира на эффективность трансдукции клеток линии Jurkat псевдо-HIV-l частицами, содержащими интегразу дикого типа или ее мутантные формы, лекарственно-устойчивые к ингибиторам интегразы HIV-1.

7. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы проникновения вируса в клетку.

Известно, что сульфатированные полисахариды проявляют высокую антивирусную активность, препятствуя проникновению в клетку ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Как правило, полисахариды с высокой молекулярной массой и степенью сульфатирования обладают более выраженной антивирусной активностью.

Была проведена серия опытов для определения противовирусной активности ряда сульфатированных полисахаридов (производных хитозана), структура которых подобна структуре гепарансульфатов, в отношении псевдо-HIV-l частиц, несущих белок оболочки gpl20+gp41 HIV-1 либо белок G оболочки вируса везикулярного стоматита. Выбор белков оболочки обусловлен тем, что у этих двух вирусов различный механизм проникновения в клетку: у HIV-1 клеточными рецепторами для первичного неспецифического связывания вируса с клеткой служат гепарансульфаты, в то время как VSV, предположительно, проникает в клетку путем эндоцитоза, опосредованного контактом белка VSV-G с фосфолипидами клеточной мембраны [Coil, 2004].

В системе были протестированы сульфат хитозана, маленоилхитозан, сульфосукцинилхитозан, сукциноилхитозан, сульфат целлюлозы, декстран сульфат и гепарин. Выбор полисахаридов для исследования был основан на ранее проведенных в нашей лаборатории исследованиях с участием репликационно-компетентного вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MuLV) [Степанов, 2012]. Для тестирования были отобраны препараты, которые эффективно подавляли инфекцию Mo-MuLV (гепарин, сульфат хитозана, сульфосукцинилхитозан, декстран сульфат и сульфат целлюлозы) и для сравнения препараты, не показавшие активности против Mo-MuLV (маленоилхитозан и сукциноилхитозан). Исследования проводились на клетках линии Jurkat. Результаты представлены в таблице 7 и на рисунке 17.

100%

о 80% а. £ 3"

д о 60%

X Щ

Е *

♦ Сульфат хитозана

И Сульфат целлюлозы —-йг— Сульфосукцинил

хитозан —!*>—Сукцинилхитозан

—^-Маленоилхитозан

......Гепарин

> Декстран сульфат

5 10

Концентрация ингибитора, мкг/мл

Рисунок 17. Действие полисахаридов на эффективность трансдукции клеток линии 1игка1 псевдо-ШУ-1 частицами, содержащими белок оболочки Н1У-1.

Нами было показано, что гепарин, декстран сульфат, сульфат хитозана и сульфосукцинилхитозан препятствуют трансдукции клеток псевдо-Н1У-1 частицами с белком оболочки gpl20+gp41 (Н1У-1), сульфат целлюлозы проявляет активность только при максимальной исследованной концентрации 10 мкг/мл. Сукциноилхитозан и маленоилхитозан активностью против псевдо-ШУ-1 частиц с белком оболочки Н1У-1 не обладают. Эти результаты коррелируют с показанными результатами с использованием вируса Мо-МиЬУ [Степанов, 2012]. В случае псевдо-ШУ-1 частиц с белком оболочки УБУв, ни один из препаратов не проявил противовирусной активности. Поскольку, как указано выше, вирус везикулярного стоматита проникает в клетку без участия гепарансульфатов в качестве первичных рецепторов, из полученных результатов и данных литературы [Степанов, 2012] можно сделать вывод, что противовирусное действие использованных препаратов специфично в отношении ретровирусов, первичными клеточными рецепторами для которых являются гепарансульфаты.

Таблица 7. Исследование противовирусной активности сулъфатированных полисахаридов на псевдо-ШУ-1 частицах с белком оболочки gpl20+gp41 Н1У-1 или белком оболочки УвУ-й, на клетках линии ,1игка1.

Название соединения ІС50 мкг/мл

gpl20+gp41 НІУ-1 УБУ-в

Гепарин (М\у 17-30кДа, СЗ 1.0) 0,06±0,01 >100

Сульфат хитозана (Му/ 100 кДа, СЗ 1.5) 0,02±0,01 >100

Сульфосукцинилхитозан (М\у 16.9 кДа, СЗ 0.64) 0,80±0,12 >100

Сукциноилхитозан (М\у 9.6 кДа, СЗ 0.55) >100 >100

Маленоилхитозан (М\у 11 -3 кДа, СЗ 0.98) >100 >100

Сульфат целлюлозы 6,4±0,2 >100

Декстран сульфат 0,095±0,002 >100

Помимо синтетических полисахаридов, были исследованы фукоиданы, выделенные из тихоокеанских бурых водорослей: галактофукан из Sacharina japónica и a-L-фуканы из Sacharina cichorioides и Fucus evanescens, любезно предоставленные нам заведующей лабораторией химии ферментов ТиБОХ, д.х.н., профессором Звягинцевой Т.Н.

Все три соединения были не токсичны в концентрации до 100 мкг/мл. Показано, что исследованные фукоиданы активны против псевдо-HIV-l частиц с белком оболочки HIV-1 (рис.18), но практически не эффективны против псевдо-HIV-l частиц с белком оболочки VSV-G (рис. 19).

100% В

s а-

S *

с£ о

У Р

Z ai

га с;

40%

20%

80%

60%

0,5

Концентрация, мкг/мл

—^—Фукоидан из бурой водоросли Sacharina japónica

Фукоидан из бурой водоросли Sacharina cichorioides

—ir™ Фукоидан из бурой водоросли Fucus

evanescens

Рисунок 18. Действие фукоиданов на эффективность трансдукции клеток линии 1игка1 псевдо-НГУ-1 частицами, содержащими белком оболочки Н1У-1.

100%

80%

о 60% н

ш §

40%

о 2d

20%

—4— Фукоидан из бурой водоросли Sacharina japónica —•—Фукоидан из бурой водоросли Sacharina cichorioides —А^Фукоидан из бурой водоросли Fucus

evanescens

Концентрация, мкг/мл

Рисунок 19. Действие фукоиданов на эффективность трансдукции клеток линии 1игка1 псевдо-Н1У-1 частицами, содержащими белком оболочки Н1У-1.

Таблица 8. Исследование противовирусной активности фукоиданов с использованием псевдо-Н1\М частиц с белком оболочки Н1У-1 или белком оболочки УБУ-в, на клетках линии Juгkat

Бурая водоросль Молекулярный вес, кДа 1С50 (лентивирусные частицы с белком оболочки gpl20+gp41 Н1У-1) 1С50 (лентивирусные частицы с белком оболочки УЗУ-в)

Sacharína japónica 1802 0,001 мкг/мл >100 мкг/мл

Sacharína cichorioides 1159 0,005 мкг/мл >100 мкг/мл

Fucus evanescens 619 0,01 мкг/мл >100 мкг/мл

Все исследованные фукоиданы были близки по эффективности, в то же время фукоиданы более эффективны, чем синтетические полисахариды, описанные выше, и подавляют лентивирусную трансдукцию клеток в более низкой концентрации. Полученные данные позволяют рассматривать фукоиданы в качестве потенциальных анти-ретровирусных препаратов, в том числе анти-Н1У-1.

выводы.

1. Разработана эффективная и безопасная экспресс-система скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов HIV-1, в том числе ингибиторов лекарственно-устойчивых форм вируса. Получена панель псевдо-HIV-l частиц, содержащих ферменты HIV-1 обратную транскриптазу и интегразу как дикого типа, так и мутантных лекарственно-устойчивых форм.

2. С использованием экспресс-системы показано, что коммерческие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы АЗТ и ЗТС, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы невирапин и эфавиренз и ингибитор интегразы ралтегравир эффективно подавляют трансдукцию клеток человека и мыши псевдо-HIV-l частицами, содержащими ферменты дикого типа. В то же время, эти коммерческие ингибиторы неэффективны или малоэффективны в отношении псевдо-HIV-l частиц, содержащих мутантные лекарственно-устойчивые формы ферментов.

3. Установлена ингибиторная активность новых потенциальных ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы HIV-1 - бензофеноновых производных пиримидинов (1 -[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацила, 1 -[2-(3,5-дихлорбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацила и 1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси) этил]-5,6-диметилурацила) в отношении псевдо-HIV-l частиц, несущих обратную транскриптазу HIV-1 дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

4. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы эффективно подавляют трансдукцию клеток псевдо-HIV-l частицами, несущими на своей поверхности белок оболочки gpl20+gp41 HIV-1.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях: Статьи в журналах.

1. Прокофьева М. М., Спирин П. В., Январев Д. В., Иванов А. В., Новиков М. С., Степанов О. А., Готтих М. Б., Кочетков С. Н., Fehse В., Stocking С., Прасолов В. С. Скрининг потенциальных ингибиторов/блокаторов репликации ВИЧ-1 с помощью безопасной лентивирусной системы in vitro. Acta Naturae, 2011. 3(4), 61-71.

2. Степанов O.A., Прокофьева М.М., Stocking С., Варламов В.П., Левов А.Н., Вихорева Г.А., Спирин П.В., Михайлов С.Н., Прасолов B.C. Репликационно-компетентный гамма-ретровирус Mo-MuLV, экспрессирующий ген зеленого флуоресцентного белка, как эффективный инструмент для поиска противовирусных препаратов, использующих гепарансульфаты в качестве первичных клеточных рецепторов. Молекулярная биология, 2012. 46(3), 508-518

3. Zakirova N.F., Shipitsyn A.V., Jasko M.V., Prokofjeva M.M., Andronova V.L., Galegov G.A., Prassolov V.S., Kochetkov S.N. Phosphoramidate derivatives of acyclovir: synthesis and antiviral activity in HIV-1 and HSV-1 models in vitro. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012. 20(19), 5802-5809

4. Прокофьева M. M., Валуев-Эллистон В. Т., Иванов А. В., Кочетков С. Н., Новиков М. С., Прасолов В. С. Бензофеноновые производные пиримидинов - эффективные ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 дикого типа и лекарственно-устойчивых форм. Доклады Академии Наук, 447(3), 338-339. ¿012.г ■

5. Prokofjeva М.М., Riecken К., Spirin P.V., Yanvarev D.V., Diisedau A., Ellinger В., Fehse В., Stocking C., Prassolov V.S. A new system for parallel drug screening against multiple-resistant HIV mutants based on lentiviral self-inactivating (SIN) vectors and multi-colour analyses. AIDS Res Ther. 2013.10(1), 1, doi:10.1186/1742-6405-10-1.

Тезисы конференций.

1. Степанов O.A., Прокофьева M.M., Михайлов С.Н., Левов А.Н., Прасолов B.C. Исследование противовирусной активности производных хитозана. Материалы XI международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит-2012), Мурманск, Россия, 25-30 июня 2012 г.

2. М.М. Prokofjeva, V.S. Prassolov. Screening of potential HIV-1 inhibitors/replication blockers using secure lentiviral in vitro sysrem. 1st Symposium on Marine Enzymes and Polysaccharides, Nha Trang, Vietnam, 10-17 December 2012.

Заказ № 445-i/02/2013 Подписано в печать 14.02.2013 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение.

1. Строение и жизненный цикл ШУ-1.

1.1. Строение ШУ-1.

1.2 Жизненный цикл ШУ-1.

1.3. Ферменты ШУ-1: структура и механизм действия.

1.3.1 Обратная транскриптаза.

1.3.2 Протеаза.

1.3.3 Интеграза.

2. Ингибиторы ШУ-1.

2.1 Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы ОТ ШУ-1.

2.2 Ненуклеозидные ингибиторы ОТ НГУ-1.

2.3 Ингибиторы интегразы ШУ-1.

2.4 Ингибиторы протеазы ШУ-1.

2.5 Ингибиторы проникновения вируса в клетку.

2.6. Сульфатированные полисахариды.

2.7 Высооактивная антиретровирусная терапия.

3. Лентивирусные векторы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

1. Клеточные линии.

2. Плазмиды.

3. Реактивы.

4. Пластиковая посуда, другие материалы.

5. Оборудование.

Методы.

Культивирование клеток.

Пересев клеток.

Криоконсервация клеток.

Приготовление бактериальных культуральных сред.

Трансформация компетентных бактериальных клеток E.coli DH5-oc.

Получение псевдо-HIV-l частиц, несущих маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (eGFP).

Определение титра псевдо-HIV-1 частиц.

Трансдукция прикреплённых клеток псевдо-HIV-l частицами.

Трансдукция суспензионных клеток псевдо-HTV-1 частицами.

Проточная цитофлуориметрия.

Определение цитостатичности и цитотоксичности исследуемых соединений.

Определение количества клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза.

Исследование антивирусной активности соединений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика системы.

2. Выбор белка оболочки для лентивирусных частиц.

3. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы HTV-1.

3.1 Азидотимидин.

3.2 Действие азидотимидина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

3.3 Ламивудин (ЗТС).

3.4 Ставудин (с14Т) и другие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

4. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ЬПУ-1.

4.1 Невирапин.

4.2 Действие невирапина на лекарственно-устойчивые формы ОТ.

4.3 Эфавиренз.■.

5. Исследование новых ненуклеозидных ингибиторов ОТ.

6. Ингибиторы интегразы ШУ-1.

6.1 Ралтегравир и Ь-731,988.

6.2 Действие ралтегравира на лекарственно-устойчивые формы интегразы.

7. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы проникновения вируса в клетку.

8. Получение псевдо-ШУ-1 частиц, несущих гены различных флуоресцентных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм"

НГУ-1 является возбудителем одного из самых опасных заболеваний человека - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). СПИД как заболевание впервые был описан в 1981 году, двумя годами позже был выделен вирус, предполагаемая причина заболевания. За три десятилетия, прошедшие с момента открытия СПИДа, он стал причиной смерти более 25 миллионов человек. Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), число ШУ-1 -инфицированных к концу 2011 года превысило 34 миллиона человек, ежегодно в мире от СПИДа умирает около двух миллионов человек, и число НЗУ-1 инфицированных постоянно растет.

Основной мишенью Н1У-1 являются СБ4+ Т-лимфоциты, особенно Т -хелперы, а также моноциты, макрофаги и дендритные клетки. СБ4+ Т-лимфоциты - главные клетки иммунной системы, обеспечивающие гуморальный (выработка антител) и клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулирующие деятельность клеток других типов. При недостаточном содержании лимфоцитов организм не способен защищаться от многих инфекций. Поражение иммунной системы и падение уровня СБ4+ лимфоцитов ниже критического уровня способствует развитию оппортунистических заболеваний (бактериальная пневмония, папиллома человека, опоясывающий лишай, простой герпес, туберкулез) и злокачественных новообразований.

К настоящему времени еще не разработано ни одной эффективной терапевтической вакцины против ШУ-1. Основным подходом при лечении является использование препаратов, действие которых направлено на подавление различных стадий жизненного цикла ШУ-1. В настоящее время существует 25 препаратов, одобренных для применения в клинических условиях. Однако против многих препаратов у вируса возникает лекарственная устойчивость, что требует постоянного продолжения исследований и создания новых лекарственных препаратов.

Одновременное применение нескольких соединений, имеющих разные мишени, в рамках высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) позволяет достигать относительно длительного и заметного снижения титра вируса в крови и, как следствие, существенно продлевать жизнь больного. Тем не менее, использование всех этих соединений имеет несколько ограничений. Во-первых, пожизненное носительство вирусной инфекции делает необходимым многолетний прием лекарственных средств, при котором возникают новые мутантные формы вируса, устойчивые к используемым препаратам и способные распространяться в популяции. Во-вторых, необходимость длительной терапии часто ставит на первый план возможное побочное действие противовирусных средств. Таким образом, поиск новых соединений, обладающих анти-ШУ-1-активностью, представляет серьезную задачу современной вирусологии и медицинской химии.

Изменчивость ШУ-1, приводящая к возникновению лекарственно-устойчивых форм осложняет задачу исследователей.

Важный этап разработки новых антиретровирусных средств - проверка их эффективности. В настоящий момент существуют два основных подхода для определения эффективности потенциальных противовирусных препаратов. Одним является ингибиторный анализ in vitro с использованием очищенных вирусных ферментов. Однако, при работе с очищенными ферментами невозможно установить эффективность взаимодействия противовирусных препаратов с клеткой in vivo, а именно: способность препарата проникать в клетку, его внутриклеточная стабильность, отсутствие цитотоксического воздействия, эффективность и специфичность противовирусного действия. Второй подход основан на работе с инфекционным вирусом и может быть применен в ограниченном числе лабораторий, специально предназначенных для работы с опасными патогенами человека.

Поиск потенциальных ингибиторов репликации лекарственно-устойчивых штаммов ШУ-1 ограничен не только необходимостью использования инфекционного лекарственно-устойчивого вируса, представляющего опасность для персонала лаборатории, но и сложностью получения штаммов, нечувствительных к препаратам заданной группы.

Большой интерес для быстрого и полностью безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации ШУ-1 представляют лентивирусные векторы, функциональная эффективность которых проявляется в результате активности всех ферментов ШУ-1 - обратной транскриптазы, интегразы и протеазы.

Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования является создание безопасной и эффективной системы скрининга потенциальных ингибиторов жизненного цикла ШУ-1 на основе лентивирусных векторов и скрининг потенциальных ингибиторов ШУ-1. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:

1. Получить панель псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих вирусные ферменты обратную транскриптазу и интегразу дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

2. Определить активность известных лекарственных препаратов -ингибиторов жизненного цикла ШУ-1 против псевдо-НГУ-1 частиц и сравнить с их активностью против инфекционного НГУ-1, известной по литературным данным.

3. Провести анализ активности потенциальных ингибиторов Н1У-1: бензофеноновых производных пиримидинов как ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ШУ-1 и сульфатированных полисахаридов в качестве ингибиторов проникновения ШУ-1 в клетку.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Введение.

Ретровирусы - семейство РНК-содержащих вирусов, вызывающие множество серьезных заболеваний, например, такие опасные заболевания человека, как СПИД и Т-клеточный лейкоз взрослых. Представители этого семейства обнаружены у всех видов позвоночных. Ретровирусы обладают рядом характерных свойств, отличающих их от прочих вирусов. Большинство других типов вирусов убивают зараженную клетку, а ретровирусы, как правило, вызывают хроническую инфекцию клеток-мишеней, причем продолжительная экспрессия генов ретровирусов часто не приводит к цитопатическим эффектам. Однако, некоторые ретровирусы, в частности, ШУ-1, обладают сильным цитопатическим эффектом. Главной особенностью ретровирусов является их уникальная система репликации. Вирусный геном в составе вириона представлен одноцепочечной РНК, но в ходе жизненного цикла он проходит стадию двухцепочечной ДНК (провируса), которая эффективно встраивается в геном хозяйской клетки. Экспрессия ретровирусных генов осуществляется с помощью клеточной системы транскрипции. Синтез ДНК-генома ретровируса, или провируса, осуществляет РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), входящая в состав вириона. Ретровирусы могут существовать в виде эндогенных провирусов и ретровирусоподобных элементов (ретротранспозонов), которые интегрированы в ДНК клеток и передаются по наследству. В геноме человека и других млекопитающих присутствуют полные копии ретровирусных провирусов или их фрагментов [1, 2], доля которых в геномах человека составляет 8%.

Изначально классификация ретровирусов основывалась на морфологических особенностях вирионов, выявляемых с помощью электронной микроскопии. По морфологии ретровирусы делят на 4 типа. Ретровирусы типа А неинфекционны и обнаруживаются только внутри клеток. А-частицы представляют собой продукт экспрессии эндогенных ретровирусоподобных элементов, у которых не происходит протеолиза и созревания вирусных белков, поэтому они не дают продуктивной инфекции. Такие незрелые вирусные частицы накапливаются в эндоплазматическом ретикулуме клетки. Другой тип А-частиц — предшественники вирионов В и D типов. В настоящее время эти частицы не считаются самостоятельными вирусами [3].

Ретровирусы B-типа характеризуются тем, что сборка их нуклеокапсида происходит в цитоплазме, далее нуклеокапсид переносится к плазматической мембране, где формируется вирион, особенностью которого является эксцентричное положение капсида.

К С-типу относят ретровирусы с округлым капсидом в центре вириона, сборка которых происходит непосредственно у плазматической мембраны и окончательное созревание вириона происходит после отпочковывания от мембраны.

Ретровирусы D-типа, как и тип В, тоже созревают в цитоплазме, но в отличие от типа В обладают палочкообразным капсидом [4].

Эта классификация использовалась на ранних стадиях исследования ретровирусов. В настоящее время используется другая классификация, по которой ретровирусы делятся на простые, геном которых содержит только гены gag, pol, и env, кодирующие структурные белки и ферменты вируса, и сложные, геном которых содержат также гены, кодирующие набор регуляторных белков с различными функциями.

К простым ретровирусам относятся альфа-ретровирусы, бета-ретровирусы и гамма-ретровирусы. Альфа-ретровирусы характеризуются С-типом морфологии, типичным представителем этого класса является вирус лейкоза-саркомы птиц (ASLV). Бета-ретровирусы характеризуются либо морфологией B-типа, с круглым капсидом, расположенным по центру, либо морфологией D-типа, с палочкообразным капсидом. Наиболее известными представителями являются вирус опухолей молочной железы мышей (MMTV) и вирус обезьян Мэйзена-Пфейзера (M-PMV). Гамма-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа. Этот род содержит наибольшее количество известных вирусов, в том числе и вирус лейкоза мышей (MuLV), вирус лейкоза кошек (FuLV), и вирус лейкоза гиббонов (GALV).

К сложным ретровирусам относятся дельта-ретровирусы, эпсилон-ретровирусы, лентивирусы и спумавирусы, или пенящие вирусы. Дельта-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа. Наиболее известными представителями этой группы вирусов являются Т-лимфотропный вирус человека (HTLV) и вирус лейкоза коров (BLV). Эпсилон-ретровирусы характеризуются морфологией С-типа, примером является вирус лейкомы роговицы (WDSV). Спумавирусы - вирусы со сложной морфологией вириона, включающей в себя острые выступы на поверхности и центральный неконденсированный кор. Примером может служить пенящийся вирус человека. Лентивирусы также характеризуются уникальной морфологией вириона, с палочкообразным или конусообразным капсидом. Наиболее известным представителем лентивирусов является HIV-1, в основном в эту группу входят вирусы приматов. Из других вирусов, в этот род включают вирус артрита-энцефалита жвачных(САЕУ) и вирус Висны-Маеди [4].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Прокофьева, Мария Михайловна

выводы.

1. Разработана эффективная и безопасная экспресс-система для скрининга потенциальных ингибиторов/блокаторов ШУ-1, в том числе ингибиторов лекарственно-устойчивых форм вируса. Получена панель псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих ферменты ШУ-1 обратную транскриптазу и интегразу как дикого типа, так и мутантных лекарственно-устойчивых форм.

2. Показано, что коммерческие нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы АЗТ и ЗТС, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы невирапин и эфавиренз и ингибитор интегразы ралтегравир эффективно подавляют трансдукцию клеток человека и мыши псевдо-ШУ-1 частицами, содержащими ферменты дикого типа. В то же время, эти коммерческие ингибиторы неэффективны или малоэффективны в отношении псевдо-НГУ-1 частиц, содержащих мутантные лекарственно-устойчивые формы ферментов.

3. Установлена ингибиторная активность новых потенциальных ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ШУ-1 -бензофеноновых производных пиримидинов (1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]урацила, 1-[2-(3,5-дихлорбензоил-4-хлорфенокси)этил] урацила и 1-[2-(3,5-диметилбензоил-4-хлорфенокси)этил]-5,6-диметил-урацила) в отношении псевдо-НГУ-1 частиц, несущими обратную транскриптазу ШУ-1 дикого типа или мутантные лекарственно-устойчивые формы.

4. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы эффективно подавляют трансдукцию клеток псевдо-ШУ-1 частицами, несущими на своей поверхности белок оболочки §р12С^р41 ШУ-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами была разработана система безопасного скрининга потенциальных ингибиторов репликации Н1У-1, которая позволяет проводить испытания ингибиторной активности соединений, действие которых направлено как на обратную транскриптазу и интегразу ШУ-1 дикого типа, так и на их мутантные формы, соответствующие лекарственно-устойчивым формам вируса. С использованием ряда коммерческих препаратов, обладающих анти-ШУ-1 активностью, доказана адекватность использования псевдо-ШУ-1 частиц для тестирования ингибиторов ШУ-1. Важно, что используемые в нашей системе псевдо-ЩУ-1 частицы неинфекционны и, по сути, представляют собой вирусы одноразового действия, содержащие полный набор вирусных ферментов, обеспечивающих синтез рекомбинантного двухцепочечного ДНК-провируса и его интеграцию в геном клеток-мишеней. Отсутствие в таком рекомбинантном геноме полного набора генов ШУ-1 гарантирует безопасность испытаний эффективности новых анти-ШУ-1 соединений, с одной стороны, и возможность адекватной оценки действия этих соединений на обратную транскриптазу и интегразу ШУ-1 в клетках,трансдуцированных псевдо-ЩУ-1 частицами.

Мы показали возможность формирования псевдо-ШУ-1 частиц, содержащих мутантную лекарственно-устойчивую обратную транскриптазу или интегразу, что позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов лекарственно-устойчивых форм ШУ-1.

Псевдотипирование псевдо-ШУ-1 частицы белками оболочки ретровирусов различной природы, в том числе и белком оболочки НГУ-1 (81^р120 + TMgp41), существенно расширяет возможности системы скрининга, позволяя проводить тестирование ингибиторов проникновения вирусов в клетку. Показано, что сульфатированные полисахариды различной природы (животного и растительного происхождения) с разной степенью эффективности подавляют трансдукцию клеток псевдо-ШУ-1 частицами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Михайловна, Москва

1. Stocking C., Kozak C.A. Murine endogenous retroviruses. Cell Mol. Life Sci. 2008. 65, 3383 -3398

2. Jern P., Coffin J.M. Effects of retroviruses on host genome function. Annu. Rev. Genet. 2008. 42, 709-732

3. Kuff E.L., Lueders K.K. The intracisternal A-particle gene family: structure and functional aspects. Adv Cancer Res 1988. 51,183-276

4. Goff S.P. Retroviridae: The Retroviruses and Their Replication. Fields Virology.// Eds. Knipe D.M., Howley P.M., Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. P. 2002-2069

5. Popovic M., Sarin P.S., Robert-Gurroff M., Kalyanaraman V.S., Mann D., Minowada I., Gallo R.C. Isolation and transmission of human retrovirus (human T-cell leukemia virus). Science. 1983. 219, 856-859.

6. Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, Gallo R.C. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science. 1984. 224 (4648), 497-500.

7. Levy J.A., Hoffman A.D., Kramer S.M., Landis J.A., Shimabukuro J.M., Oshiro L.S. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science. 1984. 225 (4664), 840-842.

8. Coffin J, Haase A, Levy JA, Montagnier L., Oroszlan S., Teich N., Temin H., Toyoshima K., Varmus H., Vogt P., et al. Human immunodeficiency viruses. Science. 1986. 232 (4751), 697.

9. Ratner L., Haseltine W., Patarca R., Livak K.J., Starcich B., Josephs S.F., Doran E.R., Rafalski J.A., Whitehorn E.A., Baumeister K., et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985. 313 (6000), 277-284

10. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV. Cell. 1985. 40 (1), 9-17.

11. Clavel F., Guetard D., Brun-Vezinet F., Chamaret S., Rey M.A., Santos-Ferreira M.O., Laurent A.G., Dauguet C., Katlama C., Rouzioux C., et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986. 233 (4761), 343-346.

12. Brady J., Kashanchi F. Tat gets the "Green" light on transcription initiation. Retrovir ology. 2005. 2,1-8

13. Henriet S., Richer D., Bernacchi S., Decroly E., Vigne R., Ehresmann B., Ehresmann C., Paillart J. C., Marquet R. Cooperative and specific binding of Vif to the 5' region of HIV-1 genomic RNA. J.Mol.Biol. 2005. 354, 55-72.

14. Lever A. M., Strappe P. M., Zhao J. Lentiviral vectors. J.Biomed.Sci. 2004. 11,439-449.

15. Das S. R., Jameel S. Biology of the fflV Nef protein. Indian J.Med.Res. 2005. 121,315-332

16. Long D., Berson J.F., Cook D.G., Doms R.W. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 gpl20 binding to liposomes containing galactosylceramide. J. Virol. 1994. 68, 5890-5898

17. WuDunn D., Spear P.G. Initial interaction of herpes simplex virus with cells is binding to heparan sulfate. J. Virol. 1989. 63, 52-58

18. Compton T., Nowlin D.M., Cooper N.R. Initiation of human cytomegalovirus infection requires initial interaction with cell surface heparan sulfate. Virology. 1993.193, 834-841

19. Su C.M., Liao C.L., Lee Y.L., Lin Y.L. Highly sulfated forms of heparin sulfate are involved in Japanese encephalitis virus infection. Virology. 2001. 286, 206-215

20. Klimstra W.B., Ryman K.D., Johnston R.E. Adaptation of Sindbis virus to BHK cells selects for use of heparan sulfate as an attachment receptor. J. Virol. 1998. 72, 7357-7366

21. Clapham P.R., McKnight A. HIV-1 receptors and cell tropism. Br. Med. Bull. 2001. 58, 43-59.

22. Michael N.L. Host genetic influences on HIV-1 pathogenesis. Curr. Opin. Immunol. 1999. 11, 466^74

23. Benkirane M., Jin D.Y., Chun R.F., Koup R.A., Jeang K.T. Mechanism of transdominant inhibition of CCR5-mediated HIV-1 infection by CCR5 delta32. J. Biol Chem. 1997. 272, 30603-30606

24. Scarlatti G., Tresoldi E., Bjorndal A., Fredriksson R., Colognesi C., Deng

25. H.K., Malnati M.S., Plebani A., Siccardi A.G., Littman D.R., Fenyö E.M., Lusso P. In vivo evolution of HIV-1 co-receptor usage and sensitivity to chemokine-mediated suppression. Nat. Med. 1997. 3 (11), 1259-1265

26. Habasque C., Aubry F., Jegou B., Samson M. Study of the HIV-1 receptors CD4, CXCR4, CCR5 and CCR3 in the human and rat testis. Mol. Hum. Reprod. 2002. 8 (5), 419-425.

27. Grivel J., Margolis L.B. CCR5- and CXCR4-tropic fflV-1 are equally cytopathic for their T-cell targets in human lymphoid tissue. Nat. Med. 1999. 5 (3), 344-346.

28. Hunter E., Swanstrom R. Retrovirus envelope glycoproteins. Curr. Top. Microbiol Immunol. 1990. 157, 187-253.

29. Davis C.B., Dikic I., Unutmaz D., Hill C.M., Arthos J., Siani M.A., Thompson D.A., Schlessinger J., Littman D.R. Signal transduction due to HIV-1 envelope interactions with chemokine receptors CXCR4 or CCR5. J. Exp. Med. 1997.186, 1793-1798

30. Chang, M. I., Panorchan P., Dobrowsky T. M., Tseng, Y., Wirt D. Single-molecule analysis of human immunodeficiency virus type 1 gpl20-receptor interactions in living cells. J. Virol. 2005. 79, 14748-14755.

31. McDonald D., Vodicka M.A., Lucero G., Svitkina T.M., Borisy G.G., Emerman M., Hope T.J. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J. Cell. Biol. 2002. 159 (3), 441-452.

32. Roberts J.D., Bebenek K., Kunkel T.A. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1. Science. 1988. 242 (4882), 1171-1173

33. Depienne C., Mousnier A., Leh H., Le Rouzic E., Dormont D., Benichou S., Dargemont C. Characterization of the nuclear import pathway for HTV-1 integrase. J. Biol. Chem. 2001. 276, 18102-18107

34. Piller S.C., Caly L., Jans D.A. Nuclear import of the pre-integration complex (PIC): the Achilles heel ofHTV? Curr. Drug Targets. 2003. 4, 409-429

35. Nakienly S., Dreyfuss G. Transport of proteins and RNAs in and out of the nucleus. 1999. Cell. 99, 677-690

36. Goh W.C., Rogel M.E., Kinsey C.M., Michael S.F., Fultz P.N., Nowak M.A., Hahn B.H., Emerman M. HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle: a mechanism for celection of Vpr in vivo. Nat. Med. 1998. 4, 65-71

37. Delelis O., Carayon K., Saïb A., Deprez E., Mouscadet J.F. Integrase and integration: biochemical activities of HIV-1 integrase. Retrovirology. 2008. 5, 114-126.

38. Schroder A.R., Shinn P., Chen H., Berry C., Ecker J.R., Bushman F. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002. 110, 521-529

39. Mikaélian I., Krieg M., Gait M. J., Karn J. Interactions of INS (CRS) elements and the splicing machinery regulate the production of Rev-responsive mRNAs. J. Mol. Biol. 1996. 257, 246-264.

40. Ott D. E. Cellular proteins detected in MV-1. Rev. Med. Virol. 2008. 18, 159— 175.

41. Willey R.L., Maldarelli F., Martin M.A., Strebel K. Human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein induces rapid degradation of CD4. J. Virol. 1992. 66 (12). 7193-7200

42. Ganser-Pornillos B. K., Yeager M., Sundquist W. The structural biology of HIV assembly. Curr. Opin. Struct. Biol. 2008. 18, 203-217.

43. Briggs J. A. G., Krausslich H. The Molecular Architecture of HIV. J. Mol. Biol. 2011. 410, 491-500

44. McBride M.S., Panganiban A.T. The human immunodeficiency virus type 1 encapsidation site is a multipartite RNA element composed of functional hairpin structures. J. Virol. 1996. 70, 2963-2973.

45. Kohlstaedt L. A., Wang J., Friedman J. M., Rice P. A., Steitz T. A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science. 1992. 256 (5065), 1783-1790

46. Sluis-Cremer N., Arion D., Abram M.E., Parniak M.A. Proteolytic processing of an HIV-1 pol polyprotein precursor: insights into the mechanism of reverse transcriptase p66/p51 heterodimer formation. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. 36(9), 1836-1847.

47. Huang H., Chopra R., Verdine G., Harrison S. Structure of covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science. 1998. 282 (5394), 1669-1675

48. Bavand M.R., Wagner R., Richmond T.J. HIV-1 reverse transcriptase: polymerization properties of the p51 homodimer compared to the p66/p51 heterodimer. Biochemistry. 1993. 32(40), 10543-10552.

49. Zheng X., Mueller G.A., Cuneo M.J., Derose E.F., London R.E. Homodimerization of the p51 subunit of HTV-1 reverse transcriptase. Biochemistry. 2010. 49(13), 2821-2833.

50. Cihlar T., Ray A.S. Nucleoside and nucleotide HIV reverse transcriptase inhibitors: 25 years after zidovudin. Antiviral Res. 2010. 85, 39-58

51. De Clercq E. The history of antiretrovirals: key discoveries over the past 25 years. Rev. Med. Virol. 2009. 19, 287-299.

52. Lavie A., Schlichting I., Vetter I. R., Konrad M., Reinstein J. and Goody R. S. The bottleneck in AZT activation. Nat. Med. 1997. 3, 922-924

53. Lavie A., Vetter I. R., Konrad M., Goody R. S., Reinstein J., Schlichting I. Structure of thymidylate kinase reveals the cause behind the limiting step in AZT activation. Nat. Struct. Biol. 1997. 4, 601-604

54. Schneider B., Xu Y. W., Sellam O., Sarfati R., Janin J., Veron M., Deville-Bonne D. Pre-steady state of reaction of nucleoside diphosphate kinase with anti-HTV nucleotides. J. Biol. Chem. 1998. 273 (19), 11491-11497

55. Rosenblum L.L., Patton G., Grigg A.R., Frater A.J., Cain D., Erlwein O., Hill C.L., Clarke J.R., McClure M.O. Differential susceptibility of retroviruses to nucleoside analogues. Antivir. Chem. Chemother. 2001. 12 (2), 91-97

56. Smith R.A., Gottlieb G.S., Miller A.D. Susceptibility of the human retrovirus XMRV to antiretroviral inhibitors. Retrovirology. 2010. 7, 70-81

57. Dahlberg J. E., Mitsuya H., Blam S. B., Broder S., Aaronson S. A. Broad spectrum antiretroviral activity of 2',3'-dideoxynucleosides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. 84, 2469-2473

58. Doong S.L., Tsai C.H., Schinazi R.F., Liotta D.C., Cheng Y.C. Inhibition of the replication of hepatitis B virus in vitro by 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine and related analogues. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. 88 (19), 8495-8499.

59. Antimicrob. Agents Chemother. 1992. 36 (11), 2423-2431.

60. Schinazi R.F., Boudinot F.D., Ibrahim S.S., Manning C., McClure H.M., Liotta D.C. Pharmacokinetics and metabolism of racemic 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine in rhesus monkeys. Antimicrob. Agents Chemother. 1992. 36, 2432-2438.

61. Richman D. D. Susceptibility to nucleoside analogues of zidovudine-resistant isolates of human immunodeficiency virus. Am. J. Med. 1990. 88 (5B), 8S-10S

62. Anderson P. L., Rower J. E. Zidovudine and Lamivudine for HIV Infection. Clin. Med. Rev. Ther. 2010. 2, a2004.

63. De Clercq E. Emerging antiviral drugs. Exp. Opin. Emerging Drugs. 2008. 13, 393-416.

64. Arion D., Parniak M.A. HIV resistance to zidovudine: the role of pyrophosphorolysis. Drug Resist. Updat. 1999. 2(2), 91-95.

65. Cruchaga C., Anso E., Rouzaut A., Martinez-Irujo J. J. Selective excision of chain-terminating nucleotides by HIV-1 reverse transcriptase with phosphonoformate as substrate. J. Biol. Chem. 2006. 281(38), 27744-27752

66. Coffin J. M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science. 1995. 267 (5197), 483^89

67. Larder B. A., Darby G., Richman D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 1989. 243 (4899), 1731-1734

68. Kellam P., Boucher C. A., Larder B. A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase contributes to thedevelopment of high-level resistance to zidovudine. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. 89, 1934-1938,

69. Larder B. A., Kemp S. D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science. 1989. 246 (4934), 1155-1158

70. Richman D. D., Guatelli J. C., Grimes J., Tsiatis A., Gingeras T. Detection of mutations associated with zidovudine resistance in human immunodeficiency virus by use of the polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 1991. 164, 1075— 1081

71. Larder B. A., Coates K. E., Kemp S. D. Zidovudineresistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture. J. Virol. 1991. 65, 5232-5236

72. Gao Q., Gu Z. X., Parniak M. A., Li X. G., Wamberg M.A. In vitro selection of variants of human immunodeficiency virus type 1 resistant to 3'-azido-3'-deoxythymidine and 2',3'-dideoxyinosine. J. Virol. 1992. 66, 12-19

73. Izopet J., Bicart-See A., Pasquier C., SandRes. K., Bonnet E., Marchou B., Puel J., Massip P. Mutations conferring resistance to zidovudine diminish the antiviral effect of stavudine plus didanosine. J. Med. Virol. 1999. 59 (4), 507511

74. Lacey S. F., Larder B. A. Mutagenic study of codons 74 and 215 of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase, which are significant in nucleoside analog resistance. J. Virol. 1994. 68 (5), 3421-3424

75. Frost S. D., Nijhuis M., Schuurman R., Boucher C. A., Brown A. J. Evolution of lamivudine resistance in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals: the relative roles of drift and selection. J. Virol. 2000. 74 (14), 6262-6268

76. Goldschmidt V., Marquet R. Primer unblocking by HIV-1 reverse transcriptase and resistance to nucleoside RT inhibitors (NRTIs). Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004. 36 (9), 1687-1705

77. Deval J., Courcambeck J., Selmi B., Boretto J., Canard B. Structural determinants and molecular mechanisms for the resistance of HIV-1 RT to nucleoside analogues. Curr. Drug Metab. 2004. 5 (4), 305-316

78. Feng J. Y., Anderson K. S. Mechanistic studies examining the efficiency and fidelity of DNA synthesis by the 3TC-resistant mutant (184V) of HIV-1 reverse transcriptase. Biochemistry. 1999. 38 (29), 9440-9448

79. Larder B.A., Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science. 1989. 246(4934),1155-1158.

80. Pokholok D.K., Gudima S.O., Yesipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochetkov S.N. Interactions of the HTV-1 reverse transcriptase 'AZT-resistant' mutant with substrates and AZT-TP. FEBS Lett. 1993. 325(3), 237241.

81. Hsieh J. C., Zinnen S., Modrich P. Kinetic mechanism of the DNA-dependent DNA polymerase activity of human immunodeficiency virus reverse transcriptase. J. Biol. Chem. 1993. 268 (33), 24607-24613

82. Reardon J. E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase: a kinetic analysis of RNA-dependent and DNAdependent DNA polymerization. J. Biol. Chem. 1993. 268 (12), 8743-8751

83. Naeger L. K., Margot N. A., Miller M. D. ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46 (7), 2179-2184

84. De Clercq E., Holy A., Rosenberg I., Sakuma T., Balzarini J., Maudgal P.C. A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. Nature. 1986. 323 (6087), 464-467.

85. Miyasaka T., Tanaka H., Baba M., Hayakawa H., Walker R.T., Balzarini J., De Clercq E. A novel lead for specific anti-HIV-1 agents: l-(2-hydroxyethoxy)methyl.-6-(phenylthio)thymine. J. Med. Chem. 1989. 32(12),2507-9.

86. Grob P.M., Wu J.C., Cohen K.A., Ingraham R.H., Shih C.K., Hargrave K.D., McTague T.L., Merluzzi V.J. Nonnucleoside inhibitors of HTV-1 reverse transcriptase: nevirapine as a prototype drug. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. 8(2), 145-152

87. Scott L.J., Perry C.M. Delavirdine: a review of its use in HIV infection. Drugs. 2000. 60 (6), 1411-1444

88. De Clercq E. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs): past, present, and future. Chem. Biodivers. 2004. 1 (1), 44-64.

89. Jayaweera D.T., Espinoza L., Castro J. Etravirine: the renaissance of nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors. Exp. Opin. Pharmacother. 2008. 9 (17), 3083-3094

90. Ding J., Das K., Moereels H., Koymans L., Andries K., Janssen P.A., Hughes S.H., Arnold E. Structure of HTV-1 RT/TIBO R 86183 complex reveals similarity in the binding of diverse nonnucleoside inhibitors. Nature Struct. Biol. 1995. 2 (5), 407-415.

91. Tachedjian G., Goff S.P. The effect of NNRTIs on HIV reverse transcriptase dimerization. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2003. 4 (8), 966-73

92. Ren J., Milton J., Weaver K.L., Short S.A., Stuart D.I., Stammers D.K. Structural basis for the resilience of efavirenz (DMP-266) to drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase. Structure. 2000. 8 (10), 1089-1094.

93. Fletcher R.S., Syed K., Mithani S., Dmitrienko G.I., Parniak M.A. Carboxanilide derivative non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase interact with different mechanistic forms of the enzyme. Biochemistry. 1995. 34 (13), 4346-4353.

94. Rittinger K., Divita G., Goody R.S. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase substrate-induced conformational changes and the mechanism of inhibition by nonnucleoside inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92 (17), 8046-8049.

95. Zhou Z., Madrid M., Evanseck J.D., Madura J.D. Effect of a bound non-nucleoside RT inhibitor on the dynamics of wild-type and mutant HIV-1 reverse transcriptase. J. Am. Chem. Soc. 2005. 127 (49), 17253-17260.

96. Hang J.Q., Li Y., Yang Y., Cammack N., Mirzadegan T., Klumpp K. Substrate-dependent inhibition or stimulation of HIV RNase H activity by non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs). Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 352 (2), 341-350.

97. Cheung P.K., Wynhoven B., Harrigan P.R. 2004: which HIV-1 drug resistance mutations are common in clinical practice? AIDS Rev. 2004. 6 (2), 107-16.

98. Pommier Y., Johnson A.A., Marchand C. Integrase inhibitors to treat HIV/AIDS. Nature Rev. DrugDiscov. 2005. 4 (3), 236-248.

99. Di Santo R., Costi R., Artico M., Tramontano E., La Colla P., Pani A. fflV-1 integrase inhibitors that block HIV-1 replication in infected cells. Planning synthetic derivatives from natural products. Pure and Applied Chemistry. 2003. 75 (2-3), 195-206

100. Madruga J.V., Cahn P., Grinsztejn B., Haubrich R., Lalezari J., Mills A., Pialoux G., Wilkin T., Peeters M., Vingerhoets J., de Smedt G., Leopold L., Trefiglio R., Woodfall B.; DUET-1 study group. Efficacy and safety of

101. TMC125 (etravirine) in treatment-experienced HIV-1-infected patients in DUET-1: 24-week results froma randomised, double-blind, placebocontrolled trial. Lancet. 2007. 370 (9581), 29-38.

102. Pauwels R. Aspects of successful drug discovery and development. Antiviral Res. 2006. 71 (2-3), 77-89

103. Roberts N.A., Martin J.A., Kinchington D., Broadhurst A.V., Craig J.C., Duncan I.B., Galpin S.A., Handa B.K., Kay J., Krohn A., et al. Rational design of peptide-based HIV proteinase inhibitors. Science. 1990. 248 (4953), 358-361.

104. Erickson J.W. 2001. HTV-1 protease as a target for AIDS therapy. In Protease Inhibitors in AIDS Therapy. Ogden RC, Flexner CW (eds). Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 1-25.

105. Wensing A.M.J., van Maarseveen N.M., Nijhuis M. Fifteen years of HIV Protease Inhibitors: raising the barrier to resistance. Antiviral Res. 2010. 85 (1), 59-74

106. Clavel F., Hance A.J. HIV drug resistance. N. Engl. J. Med. 2004. 350 (10), 1023-1035.

107. Nijhuis M., van Maarseveen N.M., Boucher C.A. HTV protease resistance and viral fitness. Curr. Opin. HIV AIDS. 2007. 2(2), 108-15.

108. Matthews T., Salgo M., Greenberg M., Chung J., DeMasi R., Bolognesi D. Enfuvirtide: the first therapy to inhibit the entry of HTV-1 into host CD4 lymphocytes. Nature Rev. Drug Discov. 2004. 3 (3), 215-225.

109. Wild С., Greenwell Т., Matthews Т. A synthetic peptide from HIV-1 gp41 is a potent inhibitor of virus-mediated cell-cell fusion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. 9 (11), 1051-1053

110. Briz V., Poveda E., Soriano V. HIV entry inhibitors: mechanisms of action and resistance pathway. J. Antimicrob. Chemother. 2006. 57 (4), 619-627

111. Este J.A., Telenti A. 2007. HIV entry inhibitors. Lancet. 370 (9581), 81-88.

112. Perros M. CCR5 antagonists for the treatment of HIV infection and AIDS. Adv. Antiviral Drug Design 2007. 5, 185-212

113. Pirrone V., Wigdah В., Krebs F.C. The rise and fall of polyanionic inhibitors of the human immunodeficiency virus type 1. Antiviral Res. 2011. 90 (3), 168-182.

114. Ghosh Т., Chattopadhyay K., Marschall M., Karmakar P., Mandal P., Ray B. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: From structure-activity analysis to clinical evaluation. Glycobiology. 2009. 19 (1), 2-15

115. Venkataraman G, Shriver Z, Raman R, Sasisekharan R. Sequencing complex polysaccharides. Science. 1999. 286 (5439), 537-542

116. Painter T.J. Algal polysaccharides. In: Aspinall GO, editor. The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. V. 2, 195-285.

117. Berteau O, Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: Structures,functions and biological functions of sulfated fucans and an overview of enzymes active towards this class of polysaccharides. Glycobiology. 2003. 13 (6), 29R-40R

118. Rabenstein D.L. Heparin and heparan sulfate: structure and function. Nat. Prod. Rep. 2002.19 (3), 312-331

119. Malavaki C.J., Theocharis A.D., Lamari F.N., Kanakis I., Tsegenidis Т., Tzanakakis G.N., Karamanos N.K. Heparan sulfate: biological significance, tools for biochemical analysis and structural characterization. Biomed. Chromatogr. 2011. 25 (1-2), 11-20

120. Kellam P., Larder B. Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates. Antimicrob Agents Chemother. 1994. 38(1),23-30.

121. Walter H., Schmidt В., Korn К., Vandamme A.M., Harrer Т., Uberla К. Rapid, phenotypic HTV-1 drug sensitivity assay for protease and reverse transcriptase inhibitors. J. Clin. Virol. 1999. 13 (1-2), 71-80

122. Garcia-Perez J., Sanchez-Palomino S., Perez-Olmeda M., Fernandez В., Alcami J. A new strategy based on recombinant viruses as a tool for assessing drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1. J. Med. Virol. 2007. 79 (2), 127-137.

123. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F.H., Verma I.M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996. 272 (5259), 263-267

124. Zufferey R., Nagy D., Mandel R.J., Naldini L., Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 1997. 15 (9), 871-875.

125. Poeschla E. M., Wong-Staal F., Looney D.J. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nat. Med. 1998. 4 (3), 354-357.

126. Berkowitz R., lives H., Lin W.Y., Eckert K., Coward A., Tamaki S., Veres G., Plavec I. Construction and molecular analysis of gene transfer systems derived from bovine immunodeficiency virus. J. Virol. 2001. 75 (7), 33713382.

127. Olsen J.C. Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. Gene Ther. 1998. 5 (11), 1481-1487.

128. Metharom P., Takyar S., Xia H.H., Ellem K.A., Macmillan J., Shepherd R.W., Wilcox G.E., Wei M.Q. Novel bovine lentiviral vectors based on Jembrana disease virus. J. Gene Med. 2000. 2 (3), 176-185.

129. Carroll R., Lin J.T., Dacquel E.J., Mosca J.D., Burke D.S., St Louis D.C. A human immunodeficiency virus type 1 (HTV-l)-based retroviral vector system utilizing stable HIV-1 packaging cell lines. J. Virol. 1994. 68 (9), 6047-6051

130. Blomer U., Naldini L., Kafri T., Trono D., Verma I.M., Gage F.H. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 1997. 71 (9), 6641-6649

131. Haselhorst D., Kaye J.F., Lever A.M. Development of cell lines stably expressing human immunodeficiency virus type 1 proteins for studies in encapsidation and gene transfer. J. Gen. Virol. 1998. 79 (2), 231-237.

132. Farson D., Witt R., McGuinness R., Dull T., Kelly M., Song J., Radeke R., Bukovsky A., Consiglio A., Naldini L. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 2001. 12 (8), 981997.

133. Sparacio S., Pfeiffer T., Schaal H., Bosch V. Generation of a flexible cell line with regulatable, high-level expression of HIV Gag/Pol particles capable of packaging MV-derived vectors. Mol. Ther. 2001. 3 (4), 602-612.

134. Ikeda Y., Takeuchi Y., Martin F., Cosset F.L., Mitrophanous K., Collins M. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nat. Biotechnol. 2003. 21 (5), 569-572

135. Coil D.A., Miller A.D. Phosphatisylserine is not the cell surface receptor for vesicular stomatitis virus. J. Virol. 2004. 78, 10920-10926

136. Bjerke M., Franco M., Johansson M., Balzarini J., Karlsson A. Increased mitochondrial DNA copy-number in CEM cells resistant to delayed toxicity of 2'.3'-dideoxycytidine. Biochem. Pharmacol. 2008. 75(6), 1313-1321

137. Groschel B., Hover G., Doerr H.W., Cinatl J. Jr. Zidovudine (AZT) resistance in H9 cells due to decreased TK expression is associated with hypermethylation of TK gene Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. 20(4-7), 487-492

138. Arion D., Parniak M.A. HIV resistance to zidovudine: the role of pyrophosphorolysis. Drug Resist Updat. 1999. 2(2), 91-95.

139. Isaguliants M.G., Belikov S.V., Starodubova E.S., Gizatullin R.Z,. Rollman E., Zuber В., Zuber A.K., Grishchenko O.I., Rytting A.S., Källander

140. C.F., Kochetkov S.N., Karpov V.L., Wahren В. Mutations conferring drug resistance affect eukaryotic expression of HIV type 1 reverse transcriptase. AIDS Res Hum Retroviruses. 2004. 20(2), 191-201.

141. Ni X., Delelis O., Charpentier C., Storto A., Collin G., Damond F., Descamps

142. D. Mouscadet J. G140S/Q148R and N155H mutations render HIV-2 Integraseresistant to Raltegravir whereas Y143C does not. Retrovirology. 2011. 8, 6877

143. Piralla A., Paolucci S., Gulminetti R., Comolli G., Baldanti F. HIV integrase variability and genetic barrier in antiretroviral na'ive and experienced patients. Virology Journal 2011. 8, 149-157

Информация о работе

Прокофьева, Мария Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Разработка экспресс-системы скрининга ингибиторов вируса иммунодефицита человека (HIV-1) дикого типа и мутантных лекарственно-устойчивых форм - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы