Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров

Горюнова, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров"

На правах рукописи Горюнова Ольга Борисовна

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С ЛИЧИНКАМИ КОМАРОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 4 СЕН 2

Москва-2009

003477418

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского Химик Технологического Университета имени Д.И. Менделеева

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат технических наук, доцент

Марквичев Николай Семенович

доктор технических наук, профессор

Бирюков Валентин Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Захарчук Леонид Михайлович

Ведущая организация: ОАО «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ» (ГосНИИсинтезбелок)

Защита диссертации состоится « 20 » октября 2009г. в -(х часов на заседании Об единенного Диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделе ва (125047, г. Москва, Миусская площадь, д.9) в аудитории 443 (конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно - библиотечном цент РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан » СЛ^СГ^^/^ 2009г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета ДМ 212.204.13

И.В. Шак:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Кровососущие комары являются переносчиками таких опасных трансмиссивных заболеваний,как малярия, желтая лихорадка, японский энцефалит и др. Применение химических препаратов для борьбы с комарами не всегда оказывается эффективным, так как у насекомых быстро вырабатывается резистентность к таким препаратам, а это требует увеличения дозировок и постоянной ротации инсектицидов. Кроме того, не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель полезных организмов, а накопление инсектицидов в природных экосистемах (воде, почве) определяет их экологическую опасность.

Для борьбы со взрослыми комарами альтернативы химическим препаратам на сегодняшний день нет. Однако, для уничтожения личинок комаров широко применяют биологические препараты, основным преимуществом которых является избирательность их действия.

Используемые на сегодняшний день биологические инсектициды, основанные на спорокристаллической биомассе бактерий Bacillus thuringiensis var. israe-lensis (Bti) или Bacillus sphaericus, представляют собой сухие порошки, пасты или жидкости. Данные бактерии обладают высокой специфической активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, а препараты на основе Bti и B.sphaericus являются высокоэффективными инсектицидами. Однако, все используемые препаративные формы на основе бактерий обладают рядом существенных недостатков. Прежде всего, это непродолжительное остаточное действие: препараты действуют в течение нескольких дней после внесения в места выплода комаров - поверхность водоема - и быстро оседают на дно, что приводит к необходимости повторных обработок. При этом, доза препарата напрямую зависит от глубины водоема. Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров, лишенного перечисленных выше недостатков, является актуальной задачей, решение которой позволит снизить экологическую нагрузку и экономические затраты.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилась разработка новой формы инсектицидного биологического препарата для борьбы с личинками комаров. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Провести выбор среди грибных культур микроорганизм, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров.

2. Изучить свойства и динамику роста гриба, иммобилизованного в Са-альгинатном геле. Подобрать субстраты, которые метаболизируются грибом внутри гранулы и обеспечивают выход микроорганизма из гранулы в свободное состояние.

3. Исследовать динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы клеток грибов.

4. Оценить возможность иммобилизации бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в Са-альгинатные гранулы с сохранением их свойств и ларвицид-

ной активности. Исследовать и сравнить динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных клеток бактерий.

5. Провести испытания полученного инсектицидного препарата для борьбы с личинками комаров в реальных условиях. Научная новизна. Впервые разработан биопрепарат для борьбы с личинками комаров на основе иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы микроорганизмов с одновременным добавлением субстрата, позволяющего увеличить длительность их ларвицидной активности.

Изучен механизм выхода клеток бактерий и грибов из иммобилизованного состояния в свободное и их воздействие на личинки комаров, что легло в основу создания препаративной формы.

Установлено, что одновременное применение иммобилизованных с субстратом клеток бактерий и грибов, обладающих ларвицидной активностью, способствует увеличению эффективности и длительности действия препарата.

Подобран ингредиент (подсолнечное масло), который одновременно выполняет внутри гранулы две функции: является компонентом, придающим гранулам свойство положительной плавучести и субстратом для роста и развития клеток из гранулы с последующим выходом в окружающую среду без изменения физиологических свойств.

Показано, что применение смеси гранул с различными микроорганизмами, обладающих положительной плавучестью, позволяет увеличить длительность ларвицидной активности препарата до нескольких месяцев. Практическая значимость. Разработаны новый инсектицидный биологический препарат для борьбы с личинками комаров и технология его получения на основе смеси обладающих положительной плавучестью гранул с иммобилизованными в них бактериями или грибами. Определены основные режимы получения гранул, влияющие на характеристики препарата. Наработана и испытана партия нового инсектицидного препарата. Показано, что препарат обладает высокой эффективностью, а норма расхода препарата в результате его локализации на поверхности снижается на порядок по сравнению с уже используемыми биологическими инсе-кицидами.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая, 2006г, г. Санкт-Петербург), на IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта, 2007г, г. Москва), Межрегиональном совещании по вопросам профилактики ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов (2008г, г. Протвино Московской области), V семинаре-совещании «Современные технологии и перспективы использования средств защиты растений, регуляторов роста, агрохимикатов в агроладшафтном земледелии» (2008г, г. Анапа), на V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (16-20 марта 2009г, г. Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журналах ВАК 2 статьи.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ^^ страницах текста и включает^рисунков и /^таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего^&сылки, из которых^^на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили штаммы грибов Lagenidium giganteum, Beau-veri bassiana, Metarhizium anisopliae, Tolypocladium cylindrosporum, штаммы бактерий Bacillus (huringiensis var. israelensis-1223, 162,1568,902,1532. Для культивирования микроорганизмов использовали стандартные и модифицированные жидкие и твердые среды Чапека (для грибов) и L-бульон (для бактерий).

Количественный учет бактерий и грибов проводили по методу Коха путем высева на плотные питательные среды определенного объема исследуемой суспензии клеток и подсчета выросших на них колоний (КОЕ).

Физиологическое состояние микроорганизмов определяли путем микроскопиро-вания препаратов «раздавленная капля» и фиксированных препаратов. Иммобилизацию микроорганизмов проводили в Са-альгинатном геле. Для процесса иммобилизации использовали инжекторную установку, состоящую из перистальтического насоса, инжектора и ротаметра для измерения расхода воздуха. Заранее приготовленную смесь компонентов для иммобилизации из колбы пропускали через установку со скоростью 500 мл/ч, в область отрыва капель подавали воздушную струю из компрессора со скоростью 2*10~3м3/мин. Отрывающиеся капли попадали в 2% раствор хлорида кальция, где происходила полимеризация альгината натрия путем сшивки катионами кальция. Полученные гранулы 30 минут выдерживали в растворе хлорида кальция, после этого декантировали и промывали водопроводной водой и использовали для экспериментов. Оценку ларвицидной активности бактерий и грибов в свободном и иммобилизованном состоянии проводили по следующей методике. В емкости объемом 200 мл добавляли водопроводную воду с осажденными взвешенными частицами, помещали по 20 личинок комаров Aedes aegypty одинакового возраста (1-II возраста) и добавляли в исследуемых концентрациях свободные или иммобилизованные клетки бактерий или грибов. Контролем служили емкости с личинками без добавления каких-либо микроорганизмов. Для препятствования вылета комаров и снижения испарения влаги емкости закрывали непритертым стеклом. Емкости выдерживали при комнатной температуре. Через каждые трое суток проводили подкормку личинок сухим дейтритом, входящим в состав кормов для аквариумных рыбок. Через определенные промежутки времени проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали процент их гибели (ларвицидную активность). Мертвыми считали обездвиженные личинки, не реагирующие на внешние раздражители и свет.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор штамма гриба

Известно большое количество микроскопических грибов, обладающих энто-мопатогенной активностью в отношении личинок двукрылых насекомых. На первом этапе работы были проведены сравнительные анализы ларвицидной активности глубинно выращенных суспензий 4-х видов грибов: Lagenidium giganteum, Beauveri bassiana, Metarhizium anisopliae, Tolypocladium cylindrosporum. В емкости с личинками добавляли суспензии исследуемых грибов, выращенных глубинным способом до стационарной фазы, так, чтобы концентрация клеток в исследуемом объеме составляла 10б КОЕ/мл. Объем вносимой суспензии зависел от исходной концентрации клеток. Эксперименты с каждым штаммом проводили в 3-х повторностях. Через 7 дней подсчитывали живые и мертвые личинки и рассчитывали процент их гибели. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Гибель личинок комаров Aedes aegypty на 7-е сутки под воздействием эитомопатогенных

Название микроорганизма Количество мертвых личинок на 7 сутки, шт Гибель личинок, %

Lagenidium giganteum 9± 1 45 ±5

Beauveria bassiana 15 ± 1 75 ±5

Metarhizium anisopliae 18± 1 90 ± 5

Tolypocladium cylindrosporum 19 ± 1 95 ±5

Из таблицы 1 видно, что максимальная гибель личинок наблюдалась при воздействии грибов М. ат$орГше и Т.су!Шго$рогит. Известно, что гриб М. ап'иор-Нае обладает активностью в отношении более чем 200 видов насекомых различных групп, поэтому, для дальнейших исследований был выбран гриб 71 cylindrosporum, обладающий специфической энтомопатогенной активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, что является особенностью его физиологии.

2. Сравнительный анализ ларвицидной активности гриба То1урос1айшт су-1Мго$рогит, выращенного глубинным и поверхностным способами

Из литературы известно, что у грибов жизнеспособность и активность кони-

диоспор и бластоспор могут существенно различаться. Исследовали ларвицвдную активность гриба Т. су1Мго$рогит, выращенного глубинным и поверхностным способом. Микроорганизм культивировали на жидкой и твердой модифицированной среде Чапека в колбах и на чашках Петри. По окончании поверхностного культивирования споромицелиальную биомассу гриба смывали физиологическим раствором с чашки Петри, определяли концентрацию клеток (КОЕ) гриба, выращенного глубинным и поверхностным способом. Далее проводили оценку ларви-

цидной активности гриба, выращенного как глубинным, так и поверхностным

способом. Гибель личинок на 7-е сутки экспозиции составила 95% ± 5 при ис-

пользовании Т. суИпсЬ-оврогит, выращенного поверхностным способом, и 100% -глубинным способом. Это свидетельствует об отсутствии различий в ларвицид-ной активности Т. суИпс1гоБрогит, выращенного глубинным и поверхностным способом.

3. Исследование особенностей развития и ларвицидной активности глубинной культуры гриба То1урос1айшт суПпс1го5рогит, при росте на различных источниках углерода

Дальнейшие исследования были направлены на изучение особенностей развития Т. су1Мго$рогит при периодическом глубинном культивировании на различных источниках углерода. Глубинное культивирование проводили в периодических условиях в колбах объемом 250 мл со 100 мл питательной среды Чапека при температуре 25°С и постоянном перемешивании на ротационной качалке при скорости 200 об./мин. В качестве источников углерода были использованы сахара, их смеси, крахмал, глицерин, а также растительные масла и н-алканы. При глубинном культивировании исследовали морфо-физиологические свойства гриба, динамику роста и потребления субстратов. Одновременно по стандартной методике оценивали ларвицидную активность клеток Т. су1Мговрогит, выращенных до стационарной фазы развития на различных источниках углерода.

Таблица 2.

Экспериментальные и расчетные данные при культивировании гриба То1урос1шйит суИп-(¡пкрогит иа различных источниках углерода.___

Название субстрата Максимальная концентрация биомассы, X, г/л Время выхода на стационар,ч Удельная скорость роста, р, час1 Лзрвицидная активность, %

Мальтоза 33,18 118 р 1=0,022 р2=0,036 95 ±5

Сахароза 12,0 96 р 1=0,042 Рг=0,004 90 ±5

Глюкоза 20,96 110 р=0,04 95 ±5

Фруктоза 17,3 118 р=0,0244 90 ± 5

Глюкоза + мальтоза 24,5 118 р=0,022 95 ±5

Лактоза -0,1 - т=о -

Глицерин 2% 9,46 81 р=0,029 90 ± 5

Глицерин 6% 9,24 81 р=0,028 90 ± 5

Крахмал 23,2 118 д= 0,030 95 ±5

Подсолнечное масло 34,24 96 - 100 ±5

Кукурузное масло 21,08 96 - 90 ±5

Соевое масло 38,16 96 - 95 ±5

Льняное масло 32,01 96 - 90 ±5

Оливковое масло 22,24 96 - 85 ±5

где р, - удельная скорость роста, Дг - удельная скорость роста при эффекте диауксин.

Во всех исследуемых вариантах, за исключением культивирования на н-алканах, наблюдался рост гриба, который можно охарактеризовать классической 8 - образной кривой. При росте на мальтозе, сахарозе, лактозе и крахмале наблюдался эффект диауксии.

Характер роста гриба при культивировании на средах с различными субстратами был идентичен: в первые сутки культивирования наблюдался незначительный рост мицелия гриба. На вторые-третьи сутки мицелий начинал интенсивно расти и ветвиться. К середине третьих-четвертых суток культивирования наблюдалось образование бластоспор, количество которых в дальнейшем увеличивалось.

Удельная скорость роста, рассчитанная по экспериментальным данным, выход биомассы и ларвицидная активность при культивировании на различных источниках углерода представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, лучшими субстратами для накопления биомассы Т. суГт&озрогит являются мальтоза, глюкоза, смесь глюкозы и мальтозы, крахмал, подсолнечное, соевое и льняное масла. Рост на н-алканах практически отсутствовал. Ларвицидная активность гриба при росте на различных источниках углерода сохранялась и составляла от 85 до 100%. Большая удельная скорость была при культивировании на мальтозе, глюкозе, сахарозе.

4. Иммобилизация То1урос1айшт суНпйговрогит в Са-альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью. Оценка ларвицидной активности гриба в иммобилизованном состоянии

Известно, что иммобилизация микроорганизмов в Са-альгинатные гранулы позволяют сохранить жизнеспособность и активность клеток в течение длительного времени.

С целью создания новой формы биопрепарата, в которой микроорганизм защищен от внешних воздействий окружающей среды при хранении и применении, а также для снижения нормы расхода препарата, была проведена иммобилизация клеток гриба в Са-альгинатные гранулы с субстратом, обладающие положительной плавучестью.

Для этого были проведены исследования по биогенной совместимости альги-ната кальция и гриба Т. су1тс!гояропт.

Биоразлагаемость альгината кальция под воздействием Т. суНпс1го$рогит определяли при культивировании гриба поверхностным способом на твердой питательной среде стандартного состава, где в качестве загустителя использовали аль-гинат кальция. Контролем служило поверхностное культивирование в аналогичных условиях на агаризованной среде Чапека. Характер роста колоний был практически идентичным. При этом не было отмечено разжижения альгината кальция. Двухнедельное культивирование на твердой среде с альгинатом кальция показало отсутствие у гриба ферментов, ответственных за метаболизм альгината. Радиальные скорости роста колоний гриба в эксперименте и контроле в процессе культивирования были практически идентичными. Все это свидетельствует об отсутствии ингибирующего воздействия альгината кальция на развитие гриба Т. суЛп-с1юзрогит и об отсутствии у гриба ферментов, ответственных за его разложение.

Для получения препаративной формы на основе гриба Т. cylindrosporum была использована ранее разработанная методика иммобилизации микроорганизмов в альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, с одновременной иммобилизацией с субстратом. В качестве субстрата был выбран крахмал. В качестве агентов, придающих гранулам положительную плавучесть, были исследованы н-алканы (додекан, пентадекан) и растительные масла (подсолнечное, соевое, льняное).

Иммобилизацию проводили по следующей схеме: 2% раствор альгината натрия смешивали в равном количестве с 2% раствором крахмала и с глубинной культурой гриба Т. cylindrosporum, выращенной на модифицированной среде Чапека с мальтозой в качестве источника углерода (с концентрацией клеток не менее Ю9КОЕ/мл), в объеме не менее 10% от объема смеси альгината и крахмала. К полученному раствору добавляли н-алканы или растительные масла в количестве 10% от общего объема раствора альгината с клеточной суспензией и крахмалом, проводили эмульгирование с помощью интенсивного перемешивания до получения капель масла, размером не более 20-30 им. Полученная эмульсия была устойчива, что позволило провести ее иммобилизацию.

После иммобилизации были получены гранулы правильной сферической формы со следующими характеристиками: средний диаметр 0,1-0,3 мм, концентрация клеток внутри гранулы не менее 108 КОЕ/мл гранул, концентрация альгината -1%, концентрация крахмала ~ 1%, концентрация агента, придающего гранулам положительную плавучесть ~ 10% от общего объема гранулы. Все гранулы независимо от состава обладали положительной плавучестью.

Важнейшей характеристикой новой препаративной формы является сохранение клетками гриба Т. cylindrosporum ларвицидной активности, а также стабильности гриба в иммобилизованном состоянии без потери активности. Для проверки этого были проведены эксперименты по определению ларвицидной активности, в которых вместо суспензии клеток в емкости с личинками вносили гранулы гриба. В емкости с водой помещали по 20 личинок комара Aedes aegypty I-II возраста. Количество гранул, вносимых в емкость, рассчитывали, исходя из концентрации клеток внутри них так, чтобы она не превышала 106 КОЕ/мл объема. Гранулы равномерно распределяли по поверхности воды в емкости. Емкости выдерживали при комнатной температуре в течение 7 суток. Каждые сутки подсчитывали количество живых и мертвых личинок и рассчитывали их процент гибели. Контролем служили емкости без внесения каких-либо микроорганизмов, а также с добавлением гранул, не содержащих микроорганизмов.

Во всех вариантах эксперимента гибель личинок началась на 3-4-е сутки и к концу 1-х суток составила 100%. В контрольных экспериментах гибели личинок не наблюдалось.

Таким образом, можно сделать вывод, что Т. cylindrosporum, иммобилизованный в Са-альгинатном геле с субстратом в плавающие гранулы, сохраняет ларви-цидную активность. В ходе эксперимента было отмечено, что гранулы через 5-7 дней покрывались визуально заметным слоем мицелия гриба. Можно предположить, что образование мицелия на поверхности гранул, происходит за счет мета-

болизма субстрата, локализованного внутри гранулы. На первой стадии развития клеток гриба внутри гранулы происходит секреция ими ферментов, которые гид-ролизуют субстрат внутри гранулы до низкомолекулярных соединений. Низкомолекулярные соединения, в свою очередь, могут метаболизироваться клетками, находящимися внутри гранулы, а также диффундировать из гранулы по градиенту

концентраций. Растущий мицелий раздвигает поверхность гранулы и прорастает наружу, при этом часть мицелия все равно остается внутри гранулы (Рисунок 1). Последующий рост мицелия и его дифференциация на конидиеносцы и споры может происходить за счет метаболизма субстрата мицелием, локализованным внутри гранулы, либо за счет субстрата, диффундированного из гранулы и растворенного в слое свободной воды, окружающей мицелий. Не исключено также одновременное наличие обоих механизмов.

Возрастание концентрации клеток на поверхности гранулы, их локализация на поверхности раздела фаз и спорование гриба могут являться одной из причин усиления ларвицидной активности гриба в иммобилизованном состоянии. Кроме того, большинство мертвых личинок, пораженных грибом, плавали на поверхности, и на них развивался мицелий, который на поверхности раздела фаз споровался и, по всей видимости, мог стать источником нового заражения личинок, что, в свою очередь, могло привести к возникновению эпизоотии.

5. Исследование особенностей роста и развития То1урос1а(Иит суИпс/гозрогит в Са-альгинатных гранулах, различающихся по своим свойствам

Следующим этапом исследований было изучение особенностей роста Т.суГтйгозрогит из Са-альгинатных гранул и при варьировании различных параметров: концентрации альгината, природы и концентрации субстрата внутри гранулы. Для этого гранулы с различными концентрациями альгината и субстратами различной природы внутри гранулы помещали на предметное стекло по 3 штуки, затем во влажную камеру, представляющую собой чашку Петри с влажным тампоном (Рисунок 2.) Чашки Петри инкубировали в термостате в течение 12 суток при температуре 28°С. Через каждые 24 часа гранулы микроскопировали, измеряли длину проросшего из гранулы мицелия и отмечали морфо-физиологические характеристики гриба (Рисунок 3). По результатам измерений длины мицелия, проросшего из гранулы, рассчитывали площадь колонии гриба вокруг гранул.

Рис. 1. Край гранулы с проросшим мицелием гриба То1у-рос1асЧит суНпйгоярогит.

Рис. 3. Образование мицелия Рис. 2. Влажная камера с Са- вокруг гранул с иммобилизо-

альгинатными гранулами. ванными клетками гриба То1у-

рос1айшт су1уп(1гоьрогит

На рисунке 4 представлены кривые изменения площади мицелия Т. суНпйгоэ-рогит вокруг гранул с различным содержанием альгината: 0,5;1,0; 1,5; 2,0%. Концентрацию крахмала внутри гранул составляла 1%.

Рис.4. Динамика изменения площади колонии мицелия То1уросШшт суНпс/гоярогит вокруг гранул с различным содержанием альгината.

Минимальная концентрация альгината натрия, применяемого для иммобилизации, ограничивалась механическими свойствами получаемых гранул: гранулы с содержанием альгината кальция менее 0,5% очень неустойчивы и быстро механически разрушаются. Максимальная концентрация альгината ограничивалась вязкостью раствора: раствор с содержанием альгината натрия более 4% вязкий и его сложно применять в технологии иммобилизации.

Как видно из рисунка 4, площадь мицелия гриба вокруг гранулы уменьшалась пропорционально увеличению концентрации альгината в них. Максимальная площадь колонии на 12-е сутки достигается при росте из гранул с содержанием альгината 1% и равна 7,5 мм2. Формы кривых роста практически не отличались друг от друга и имели Б-образную форму. Можно предположить, что на прорастание и скорость роста мицелия из гранулы накладываются диффузионные ограничения, которые возрастают с увеличением концентрации альгината.

Характер роста и развития мицелия Т.суУтйгозрогит из гранулы аналогичен росту гриба в свободном состоянии: после прорастания мицелия из гранулы происходит его рост, с последующим ветвлением и образованием конидиеносцев и спор гриба.

В дальнейшей работе для иммобилизации использовали альгинат натрия с конечной концентрацией 1%.

Для изучения влияния природы субстрата были выбраны крахмал, с концентрациями в грануле 0,5%; 1%; 1,5%, подсолнечное, соевое и льняное масла, с концентрациями 10%. Данные вещества являются высокомолекулярными или образуют эмульсию внутри гранул, что сводит к минимуму возможность их диффузии из гранулы после иммобилизации. Эксперименты по изучению роста гриба из гранул проводили в аналогичных условиях во влажной камере.

4 5 6 7 Нремн, сутки

-0.5

^ГП

Рис. 5. Динамика изменения площади колонии мицелия То1урос1аШит суИпЛгохрогит вокруг гранул с различным содержанием крахмала.

15|H'MH, су! KU

♦ 11' -ДО - [Н.-ЧН-Ч- MUClo Ш 1 . '-р.".- М.кЬ ■ -ТЙГ-.'1ЬНЩ'1Г МГК' М1

Рис. 6. Динамика изменения площади колонии мицелия гриба Tolypoclaäium tylidrosporum вокруг гранул; содержащих различные масла (концентрация 10%).

На рисунках 5 и 6 представлены кривые изменения площади колоний гриба во времени при росте мицелия из гранул, содержащих различные субстраты. Видно, что наибольшая площадь мицелия к концу 12-х суток, равная 22 мм2, достигалась при росте гриба из гранул, содержащих подсолнечное масло в концентрации 10% от объема (таблица 3) и выражается в сут"1.

При микроскопировании гранул отмечено, что в течение всего эксперимента гриб развивался аналогично росту в свободном состоянии: проросшие гифы начинали увеличиваться и ветвиться, далее образовывались конидиеносцы, и начиналось спорование. При росте Т. cylindrosporum из гранул, содержащих масла, диаметр мицелия был заметно больше, чем при росте из гранул, содержащих крахмал.

Для сравнительной оценки роста гриба вокруг гранул был использован новый показатель - удельная скорость образования колонии. При этом были сделаны следующие допущения: поверхность колонии, растущей на стекле, достаточно однородна, а мицелий находится в.одинаковом физиологическом состоянии в любой момент времени. Расчет данного параметра проводили по тангенсу угла наклона прямой, полученной при обработке S-образной кривой зависимости площади от времени в полулогарифмических координатах (таблица 3).

Из таблицы 3 видно, что расчетные значения удельной скорости роста колоний, выросших вокруг гранул с различными параметрами, имеют практически одинаковые значения для одних субстратов с различными концентрациями. Это свидетельствует, в первую очередь, о том, что диффузионные ограничения, возникающие как внутри гранулы при диффузии компонентов питания к клетке гриба, так и при диффузии компонентов питания из гранулы в окружающую среду и межклеточное пространство, не оказывают существенного влияния на скорость роста мицелия гриба из гранулы.

Таблица 3.

Характеристики роста Tolypocladium cylindrosporum из гранул с различными параметрами.

Удельная скорость роста р, сут"1 Максимальная площадь мицелия вокруг гранул, ммг

Крахмал 1% Альгинат 0,5% 0,04 0,62

1,0% 0,61 7,50

1,5% 0,60 6,90

2,0% 0,59 5,60

г Альги-нат 1% Крахмал 0,5% 0,59 6,79

1,0% 0,60 7,35

1,5% 0,62 4,15

i ^ S о t- ** £ s-< § Масла Подсолнечное, 10% 0,59 22,12

Соевое, 10% 0,50 17,12

Льняное, 10% 0,04 4,56

Следует отметить, что оптимальными характеристиками гранулы для получения максимальной площади колонии вокруг гранулы Т. cylindrosporum являются 1% альгината и 10% подсолнечного масла. При этом масло выполняет в грануле одновременно две функции: агента, придающего гранулам свойство положительной плавучести и субстрата для роста и развития гриба из иммобилизованного состояния в свободное.

6. Исследование ларвицидной активности бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в свободном и иммобилизованном состоянии

Как было показано ранее, гибель первых личинок под воздействием иммобилизованных клеток гриба Т. cylindrosporum начинается на 3-4-е сутки. Для бактериальных препаратов на основе Bti данная характеристика составляет несколько часов. Таким образом, очевидна целесообразность разработки новой препаративной формы по созданной нами технологии с использованием бактерий Bti.

Из нескольких штаммов Bti, полученных из коллекций Центра прикладной микробиологии (г. Оболенск), Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) и ВКПМ (г. Москва), отобрали один, обладающий максимальной ларвицидной активностью.

Для этого провели глубинное культивирование 5 штаммов бактерий на L-бульоне при естественном значении pH 6,5-7,0, температуре 25°С и постоянном перемешивании на ротационной качалке при скорости 200 об/мин. Засев культур осуществляли с косяка из пробирки. Культивирование проводили в течение 48 часов. К этому моменту все клетки бактерий начинали спороваться и параллельно образовывали кристалл S -эндотоксина, что контролировали при микроскопиро-вании фиксированных препаратов.

Оценку ларвицидной активности штаммов Bti проводили на личинках комаров рода A.aegypty I - II возраста в лабораторных условиях по описанной выше методике. В сосуды с личинками вносили по Ю6КОЕ/мл глубинной культуры. В

качестве контроля использовали сосуды с личинками без внесения микроорганизмов. Эксперименты с каждым штаммом проводили в 3-х повторностях. Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и далее рассчитывали процент их гибели. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Гибель личинок комаров Aedes aegypty под воздействием бактерий Buhuringiensis var, israe-lensis_____

Штаммы Bti (коллекционный номер) % гибели личинок Aedes aegypti

B.thuringiensis var. israelensis (162) 85

B.thuringiensis var. israelensis (1223) 100

B.thuringiensis var. israelensis (1568) 95

B.thuringiensis var. israelensis (902) 100

B.thuringiensis var. israelensis (1532) 80

Из таблицы 4 видно, что все исследуемые штаммы Bti обладают достаточно высокой ларвицидной активностью. Для дальнейшей работы был выбран штамм Bti 1223 как один из наиболее активных.

Выбранный штамм иммобилизовали в 1% альгинате натрия с добавлением 10% подсолнечного масла для придания гранулам положительной плавучести. Оценку ларвицидной активности полученных гранул проводили аналогично оценке активности гранул гриба. Доза гранул подбиралась из расчета 1 гранула на 1 см2 поверхности емкости, что соответствовало концентрации Ю6КОЕ/мл. Через 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали процент их гибели. После этого удаляли все личинки из емкости и добавляли аналогичное количество живых личинок того же возраста. Аналогичные операции повторяли в течение всего эксперимента, пока происходила гибель личинок комаров. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Изменение ларвицидной активности иммобилизованных клеток B.thuringiensis var. israe-

Время ч Количество мертвых личинок, ЦГГ Гибель личинок Aedes aegypti, %

24 20 100

48 18 90

72 И 55

168 2 10

240 0 0

Полученные результаты свидетельствовали о том, что бактерии ВЦ, иммобилизованные в Са-альгинатном геле сохраняли ларвицидную активность. Ларви-цидная активность препаративной формы сохранялась в течение 2-3 дней после внесения.

7. Создание препаративной формы

Конечной целью данной работы было создание комплексного препарата, содержащего две культуры микроорганизмов. Важно было исследовать возможность иммобилизации микроорганизмов в одну гранулу и изучить взаимное влияние микроорганизмов.

Для этого были проведены серии экспериментов по изучению:

1. влияния свободных клеток бактерий на рост гриба из гранул. Для этого в чашку Петри с агаризованной средой Чапека засевали 0,1мл выращенной глубинно культуры бактерий Bti и в центр чашки помещали гранулу с иммобилизованным Т. cylindrosporum. Контролем служил рост гриба на среде Чапека без добавления бактерий.

2. влияния на рост гриба клеток бактерий, иммобилизованных в одной грануле. Для этого готовили гранулы с одновременно иммобилизованными клетками бактерий и гриба, помещали их на предметное стекло во влажную камеру и анализировали рост гриба из гранулы. Контролем служили гранулы, с иммобилизованными клетками T.cylindrosporum без добавления бактерий.

В варианте 1 роста гриба из гранулы не наблюдалось, а бактерии покрыли поверхность агара ровным газоном. В варианте 2 при иммобилизации бактерий и гриба в одной грануле отмечено, что рост Т. cylindrosporum из гранулы происходит, при этом мицелий более тонкий и слабый, чем в контроле. Максимальная площадь колонии гриба на 8 сутки при росте из гранул с бактериями почти в два раза меньше, чем при росте из гранул без добавления Bti.

Из проведенных экспериментов можно сделать вывод, что бактерии угнетают рост грибов, поэтому иммобилизацию микроорганизмов Т. cylindrosporum и Bti проводить в одной грануле не целесообразно.

Следующим этапом работы был подбор оптимального соотношения гранул, содержащих только бактерии или только грибы, в препаративной форме. Критериями для оценки эффективности препаративной формы были минимизациия времени начала гибели личинок и продолжительность действия препаративной формы. Для этого готовили смсси с различным процентным содержанием гранул с бактериями или грибами (таблица 6) и проверяли ларвицидную активность полученных препаративных форм. Эксперимент проводили с подсаживанием личинок.

Препаративные формы проверяли на ларвицидную активность по следующей методике. В емкость с водой помещали по 20 личинок комара Aedes aegypty I-II возраста. Далее вносили один из вариантов препаративной формы в концентрации 1 гранула на 1 см2 поверхности емкости.

Таблица 6.

Варианты исследуемых препаративных форм с различным содержанием гранул с Т. cylindrosporum и Bti.___

№ варианта Количество гранул Т. cylindrosporum (%) Количество гранул B.thuringiensis var. israe-lensis (%) Соотношений гранул бактерий и грибов

1 100 0 1:0

2 0 100 0:1

3 50 50 1:1

4 75 25 3:1

5 25 75 1:3

6 90 10 9:1

7 10 90 1:9

Первые 8 суток эксперимента через каждые 24 часа производили подсчет живых и мертвых личинок комаров. Мертвые личинки не удаляли из емкости. На 8-е сутки в емкость были подсажены по 20 личинок комара 1-И возраста. В течение последующих 4-х суток эксперимента через каждые 24 часа проводили подсчет живых и мертвых личинок. На 12, 16 и 20-е сутки эксперимента в емкость проводили подсадку по 20 личинок 1-Й. Подсчет живых и мертвых личинок проводили каждые сутки в течение всего эксперимента. Дополнительное количество препарата в ходе всего эксперимента не вносили. Каждую неделю объем воды в емкостях доводили до первоначального отстоянной водопроводной водой. Личинки подкармливали сухим дейтритом в течение всего эксперимента. Эксперименты с каждой препаративной формой проводили в трех повторностях. В качестве контроля был проведен эксперимент по аналогичной схеме без внесения какой-либо препаративной формы.

Развитие личинок в контрольном эксперименте проходило по стандартным законам: к 8-м суткам в емкости была обнаружена одна мертвая и две окуклившихся личинки. На дне стакана были обнаружены хитиновые оболочки личинок, что свидетельствовало об их переходе в более старшую фазу. Все это свидетельствовало о нормальном развитии популяции личинок. Внесение дополнительного количества личинок на 8-е сутки не изменило общей тенденции развития популяции. К концу 12-х суток было обнаружено 3 мертвых личинок, 2 взрослых особи и 5 куколок. После внесения личинок на 12-е, 16-е и 20 сутки общая тенденция развития личинок сохранилась. После 12-х суток подсчет живых и мертвых личинок был крайне затруднен из-за высокой плотности популяции. Из описанных результатов можно предположить, что процент гибели в контрольном эксперименте не превышал 10% от общего количества личинок на каждой стадии внесения новых. К концу эксперимента окуклилось и образовалось имаго не менее 20 (не менее 25%).

Таким образом, можно сделать вывод, что условия, созданные в контрольном эксперименте, позволяют нормально развиваться личинкам на протяжении 24 дней, проходя характерные для них стадии развития: достижение 4 возраста, стадии окукливания и стадии имаго.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе клеток ВН первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения препарата. К концу первых суток 18-19 личинок (90-95%), не проявляли признаков жизни. В течение последующих 8 суток в одной из экспериментальных повторностей наблюдали 100% гибель личинок, в двух других повторностях -95%. После дополнительного внесения новых личинок в течение первых суток наблюдали незначительную гибель личинок, к 12-м суткам общее количество погибших личинок достигало 24-25 штук, что составляло 25% от вновь внесенных личинок. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне сосуда, среди них наблюдались частично разложившиеся личинки. Единичные мертвые личинки плавали на поверхности воды в емкости. Образование имаго на данной стадии эксперимента не наблюдалось. Внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей картины гибели личинок: на каждом этапе наблюдали гибель 2-4

личинок на следующзие сутки после внесения. Начиная с 16-х, суток во всех по-вторностях наблюдали образование куколок и имаго, к концу эксперимента их количество было 7 и 3, соответственно.

Таким образом, препаративная форма на основе иммобилизованных клеток ВИ воздействовало на личинок комаров в первые моменты времени после внесения. Начиная с 8-х суток эксперимента воздействие клеток ВЦ ослабевает и к 12-м суткам снижалось практически до нулевых значений. Личинки комаров, погибшие под воздействие прапаративной формы на основе клеток бактерий ВИ не являлись источником поражения вновь внесенных личинок, о чем свидетельствовало образование куколок и имаго.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе клеток гриба Т. су1тс1го$рогит первые мертвые личинки были обнаружены на 4-е сутки. К 8-м суткам 18-20 личинок, что составляет 90-100%, было поражено грибом Т .суИп&озрогит. Характерным отличием личинок, пораженных грибом, является их локализация на поверхности раздела фаз, обездвижение и образование характерной «шапки» гриба на поверхности личинки. После внесения на 8-сутки дополнительного количества новых личинок к 12-м суткам практически вся популяция была обездвижена. Визуальный анализ показал, что более 80% процентов всей популяции поражены грибом. Последующее снесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки не изменило общей тенденции в поражении личинок грибом Т. су-¡ШгоБрогит. К концу эксперимента не было выявлено ни одной куколки и имаго. Мертвые личинки, в большинстве своем, были локализованы на поверхности с визуальными признаками поражения грибом.

Эксперимент по применению препаративной формы на основе иммобилизованных клеток гриба Т. суИпс1го.чрогит показал практически 100% эффективность препарата. К недостаткам данной препаративной формы можно отнести то, что начало гибели личинок начиналось на 4-5-е сутки после начала эксперимента, достигая максимальных значений на 8-е сутки.

После внесения в емкость с личинками препаративной формы на основе смеси равных количеств иммобилизованных клеток гриба Т. суНпсЬ-ойрогит и бактерий ВИ первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, а к концу первых суток наблюдали 90-95% гибель личинок. Данное количество оставалось постоянным в течение последующих 8 дней. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества личинок в течение первых суток наблюдали 30-50% гибель личинок. К концу 12-х суток количество мертвых личинок достигало 7080%, 3 личинки окуклились. Большинство мертвых личинок было локализовано на поверхности и на них визуально были видны поражения грибом. Дополнительное внесение личинок на 12, 16 и 20-е сутки не привело к изменению обшей картины гибели личинок. К концу эксперимента было выявлено 5 куколок и 2 имаго. Мертвые личинки были локализованы как на дне емкости, так и на поверхности. Причем, на личинках, плавающих на поверхности, было отмечено развитие гриба Т. суГтсЬоьрогит.

После внесения препаративной формы на основе смеси гранул гриба Т. суГт-(¡гоярогит и бактерий ВН в процентном соотношении 25:75, соответственно, гибель первых личинок была обнаружена через несколько часов. К концу первых суток общее количество мертвых личинок составило 95-100%. Большинство мертвых личинок было локализовано на дне емкости, только 2 из них плавали на поверхности. После дополнительного внесения личинок на 8-е сутки количество живых личинок к концу 12-х суток составило около 10 штук. 8 мертвых личинок были локализованы на поверхности, и на них были видны поражения грибом. Дополнительное внесение новых личинок на 12, 16 и 20-е сутки эксперимента сохранили общую картину гибели. К концу эксперимента количество окуклившихся личинок достигло 10, а количество имаго было равно 3.

При внесении препаративной формы на основе смеси гранул гриба Т. суИп-с1гоярогит и бактерий Вй в процентном соотношении 75:25, соответственно, первые мертвые личинки были обнаружены через несколько часов после внесения, к концу первых суток их количество составило около 90%, и локализованы они были на дне сосуда. После внесения на 8-е сутки дополнительного количества живых личинок через несколько дней практически вся популяция была обездвижена. Половина из них была локализована на поверхности жидкости и поражена грибом. К концу 12-х суток не было выявлено ни одной живой личинки. Данная тенденция сохранилась и после внесения дополнительного количества живых личинок на 12, 16 и 20-е сутки. К концу эксперимента не было обнаружено ни одной куколки и имаго.

Таким образом, эксперименты по определению ларвицидной активности различных препаративных форм показали, что все исследуемые препаративные формы обладают ларвицидной активностью. Эффективность и длительность сохранения ларвицидной активности зависит от микроорганизмов, используемых для иммобилизации. Препаративная форма на основе иммобилизованных клеток ВН имеет очень высокую эффективность применения в первые сутки после внесении и практически теряет ларвицидную активность после 8-12 суток.

Препаративная форма на основе клеток гриба Т. суНп&оярогит начинает действовать начиная с 4-х суток, проявляя максимальную эффективность к 8-м суткам. Сохранение ларвицидной активности в течение не менее месяца может быть обусловлено либо действием самой препаративной формы, либо за счет гриба, развившегося на пораженных личинках, которые также локализованы на поверхности жидкости.

Препаративные формы с разным соотношением гранул гриба Т. суНп&овро-гит и бактерий Вй так же проявили свою ларвицидную активность на высоком уровне. Снижение в препаративной форме гранул с клетками бактерий Вй в 4 раза не привело к снижению ларвицидной активности в первые сутки, но в то же время позволило достичь оптимальных параметров ларвицидной активности на 8-е и последующие сутки эксперимента, когда гибель личинок происходит под воздействием гриба Т. суНпс1гозрогшп.

Таким образов, в качестве базового варианта препаративной формы для борьбы с личинками комаров была принята препаративная форма, состоящая из

25% гранул с иммобилизованными гранулами Ви и 75% гранул гриба Т. суНп&оя-рогит. Всем гранулам были приданы свойства положительной плавучести за счет иммобилизации растительного масла.

8. Определение эффективной дозы препарата.

Определение нормы расхода препарата проводили на базе Испытательного лабораторного центра (ИЛЦ) ГУП «Московский городской центр дезинфекции»

(МГЦД).

Испытания проводили согласно требованиям документа «Нормативные показатели безопасности и эффективности дезинфекционных средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации» (пункт 3.11: «Средства для борьбы с личинками комаров (микробиологические, на основе уротропина и др.»), В качестве показателя эффективности использовли показатель «Гибель личинок через 24 часа, %» для различных концентраций. Эксперименты проводили в 6 повторностях.

Результаты проведенных экспериментов показали, что внесение препарата в дозировке не менее 0,10 мл/м2 (что составляло 1 гранула на 1см2 поверхности) обеспечивает во всех опытах полную гибель личинок комаров при отсутствии гибели в контроле в течение первых 24 часов.

Существующие нормативные документы не предусматривают определения длительности эффективности действия препаратов. Тем не менее длительность действия препарата определяли исходя из натурных испытаний в реальных условиях по обработке затопленных подвалов и водоемов не рыбохозяйственного назначения.

9. Хранение препарата.

В экспериментах по изучению срока хранения препарата в качестве консервирующих агентов исследовали растворы глицерина и лактозы. Глицерин используют как консервирующий агент для препаративных форм на основе иммобилизованных клеток гриба Т. \iride и бактерий Р. Аиопьсепъ. Лактоза была выбрана, исходя из того, что гриб Т. су\Мго$рогит, как было показано ранее, практически не метаболизирует ее.

Изучали следующие варианты стабильности препаративной формы (ПФ) при длительном хранении:

• ПФ в физиологическом растворе;

• ПФ в 15 растворе глицерина в физиологическом растворе;

• ПФ в 30% раствором глицерина в физиологическом растворе;

• ПФ в 15% растворе лактозы в физиологическом растворе;

• ПФ в 30% растворе лактозы в физиологическом растворе.

Исследование всех вариантов на стабильность в процессе хранения проводили в двух вариантах. Первый заключался в том, что ПФ помещали в перечисленные растворы и закладывали на хранение на один год. В течение года через определенные промежутки времени производили отбор проб и определяли концентра-

цию микроорганизмов. В конце года проводили оценку ларвицидной активности ПФ.

Другой вариант заключался в исследовании хранения ПФ по методу «ускоренного старения» при повышенной температуре. Суть метода заключается в том, что препарат, помещенный в растворы исследуемых консервирующих агентов, подвергали цикличному воздействию пониженных (Г=0°С) и повышенных (1=30°С) температур в течение суток. Всего было проведено 30 циклов. Через определенное количество циклов проводили отбор проб гранул и анализировали концентрации клеток бактерий и грибов в них. После последнего цикла проводили изучение ларвицидной активности препарата.

Результаты экспериментов по хранению представлены в таблицах 7 и 8.

Как видно из таблицы 7, при изучении сохранности ПФ методом «ускоренного старения» в варианте хранения иммобилизованных хлеток в физиологическом растворе без консерванта, через 10 циклов концентрация клеток упала практически на порядок, далее падение продолжалось и к концу испытаний их концентрация упала практически на 4 порядка.

При хранении иммобилизованных клеток в 15 и 30% растворах глицерина и лактозы в физиологическом растворе концентрация клеток через 10 циклов практически не изменилась, а к концу 30-го цикла снизилась не более, чем на порядок.

Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препаратов в растворах консервирующих агентов, показали, что иммобилизованные клетки даже после 30-ти циклов сохраняли свою эффективность на том же уровне, что и свежеприготовленные.

Таблица 7.

Результаты сохранности препарата по методу «ускоренного старения».

Вариант хранения Концентрация клеток, КОЕ кл/мл

0-й цикл 10-й цикл 20-й цикл 30-й цикл

ТС ВП ТС вн ТС ВЧ ТС вч

ИК в физ. р-ре 3x10" 6x10* 5x10' 7х 10! ЗхЮ3 4x10" 8Х101 ЗхЮ3

ИКв 15% р-ре глицерина в физ. р-ре 8х 108 7х109 4x108 4хЮ9 ЗхЮ8 8 x10е 1х108 ЗхЮ8

ИК в 30% р-ре глицерина в физ. р-ре 4х108 ЗхЮ9 ЗхЮ8 1х109 1х108 8хЮ7 8хЮ7 7х107

ИК в 15% р-ре лактозы в физ. р-ре 5хЮ8 4х109 ЗхЮ8 ЗхЮ9 1хЮ8 2хЮ9 7х 107 7хЮ8

ИК в 30% р-ре лактозы в физ. р-ре 7хЮ8 8x10® 4х108 2x10' 2хЮ8 1 х Ю9 8х107 8х108

Результаты экспериментов по хранению образцов препаратов при комнатной температуре в течение года показали, что в отсутствие консервирующих агентов концентрация клеток через полгода снижается на порядок, а через год почти на пять порядков, что соответствует полученным по методу «ускоренного старения».

Таблица 8.

Концентрации клеток при хранении препарата при комнатной температуре.

Вариант хранения Концентрация клеток, КОЕ кл/мл

0-й месяц 6-й месяц 9-й месяц 12-й месяц

ТС ви ТС ви ТС Bti ТС ви

ИК в физ. р-ре 4x10* 5x10* 1x10' 4х108 2хЮ3 3x10" 4x10s 1хЮ5

ИКв 15% р-ре глицерина в физ. р-ре 7 x10s 6хЮ9 ЗхЮ8 2x10" 1x10s 7хЮ8 7хЮ? 2хЮ7

ИК в 30% р-ре глицерина в физ. р-ре ЗхЮ8 4x10' 2х108 ЗхЮ9 1хЮ8 6х108 7х 107 2хЮ8

ИКв 15% р-ре лактозы в физ. р-ре 6х108 7x10' 4х108 4x10" ЗхЮ8 2x10' 8хЮ7 7хЮ8

ИК в 30% р-ре лактозы в физ. р-ре 5хЮ8 5х109 ЗхЮ8 2х109 1хЮ8 1хЮ9 7х107 8хЮ8

При хранении иммобилизованных клеток в растворах глицерина или лактозы в течение года снижение концентрации клеток было незначительным и не превышало одного порядка. Различие между консервантами заключалось в том, что при хранении в растворах глицерина даже в 30% растворе наблюдался рост гриба из гранул, что приводило к слипанию гранул и потере товарного вида. При хранении в 15 и 30% растворах лактозы роста гриба из гранул отмечено не было и эффекта слипания не наблюдалось.

Исследования ларвицидной активности, проверенной для образцов препаративных форм в растворах консервирующих агентов, показали, что препарат даже после года хранения сохранял свою эффективность на том же уровне, что и свежеприготовленный.

Таким образом, из полученных результатов эксперимента можно сделать вывод, что оптимальным консервирующим агентом для хранения препарата в течение не менее года является лактоза в концентрации 15%.

10. Результаты производственных испытаний

Для проведения производственных испытаний препарата была наработана опытная партия. Испытания проводили в период с 15.05.2006 по 15.09.2006 г. путем обработки затопленных подвальных помещений в г.Москве общей площадью 500 м2.

Препарат вносили по следующей схеме. Непосредственно перед обработкой готовили рабочий раствор путем перемешивания необходимого количества препарата в водопроводной воде при температуре 22°С. Дозу препарата рассчитывали, исходя из площади обрабатываемой водной поверхности и нормы расхода препарата 0,1 мл/м2. Объем воды для приготовления рабочего раствора рассчитывали, исходя из нормы расхода рабочего раствора 10 мл/м2 обрабатываемой поверхности.

Обработки проводили путем нанесения рабочего раствора на водную поверхность с помощью ранцевого опрыскивателя с постоянным перемешиванием, диаметр форсунок был не менее 0,3 мм.

Перед обработкой проводили подсчет численности личинок и окрыленных комаров сачком диаметром 20 см по методике, описанной в МУ 3.5.2.705-98 «Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях». Первоначальная численность личинок в подвале составляла 50±5 экз./м2, имаго - 33±5 экз./м2.

Учет эффективности обработок проводили через каждые 7 дней после обработки в течение 4 месяцев. Снижение численности комаров после обработки определяли в процентах по количеству комаров (личинок, имаго) в сравнении с их числом до проведения обработки.

Испытания показали, что после обработки затопленных подвалов препаратом через неделю не было зарегистрировано ни одной личинки или куколки. Количество окрыленных комаров на стенах подвалов и лестничных клетках в среднем было менее 1 экз./м2. Количество личинок и имаго остались на том же уровне в течение 4 месяцев после обработки.

Таким образом, из проведенных испытаний можно сделать вывод, что разработанный препарат на основе смеси иммобилизованных клеток гриба Т.cylindrosporum и бактерий Bti является высокоэффективным препаратом длительного действия для уничтожения личинок комаров.

Основные результаты и выводы.

1. Отобран гриб Т. cylindrosporum, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров. При изучении кинетики роста Т. cylindrosporum, иммобилизованных в Са-альгинатных гранулах с субстратами различной природы (крахмал, растительные масла), показано, что рост мицелия гриба на поверхности гранул не отличается по морфо-физиологическим характеристикам от роста при их поверхностном культивировании. Установлено, что на рост мицелия из гранул оказывает влияние природа и концентрация субстрата, иммобилизованного в грануле, а также концентрация альгината. Оптимальными для Т. cylindrosporum являются концентрация альгината 1% и концентрация подсолнечного масла внутри гранулы 10%.

2. Показано, что клетки Т. cylindrosporum, иммобилизованные в Са-альгинатные гранулы, а также в гранулы с одновременно иммобилизованными субстратами различной природы, сохраняют свою ларвицидную активность, стабильность при хранении в течение не менее 1 года.

3. При изучении кинетики гибели личинок комаров А. aegypty под действием гриба Т. cylindrosporum, показано, что введение в гранулу таких веществ как н-алканы и растительные масла обеспечивает положительную плавучесть гранул, что повышает эффективность их использования за счет пролонгированного действия и локализации на поверхности воды. Показано, что клетки Т. cylindrosporum, иммобилизованные в гранулы с субстратом, вызывают возникновение эпизоотии личинок комаров А. Aegypty.

4. При изучении кинетики гибели личинок А. aegypty под воздействием клеток бактерий В. thuringiensis vor. israelensisis свободных и иммобилизованных в Са-

альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, показано, что при иммобилизации бактерии сохраняют свою ларвицидную активность.

5. При изучении взаимного влияния клеток T.cylindrosporum и В. thuringtensis var. israelensis было показано, что бактерии угнетают рост гриба как в свободном так и в иммобилизованном состоянии. Однако, при одновременном применении иммобилизованных клеток T.cylindrosporum и В. thuringiensis var. israelensis повышается эффективность и длительность ларвицидной активности препаративной формы. Это легло в основу создания комбинированного препарата на основе смеси гранул иммобилизованных клеток бактерий и грибов.

6. Разработано, испытано и внедрено в производство инсектицидное средство Ба-толим на основе смеси Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками Т. cylindrosporum с субстратом и В. thuringiensis var. israelensis в процентном соотношении 75:25. Показана высокая эффективность средства при его применении в коммунальном хозяйстве для борьбы с личинками комаров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеева (Горюнова) О.Б., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Инсектицидные свойства глубинных культур микромицета Tolypocladium cylindrosporum в отношении личинок комара Aedes aegypty // Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 2006. - С. 286-287

2. Алексеева (Горюнова) О.Б., Цой A.M., Андрианова Д.А., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Глубинное культивирование энтомопатогенного микромицета Tolypocladium cylindrosporum на различных источниках углерода // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. - С. 37-38.

3. Мельников Е.А., Алексеева (Горюнова) О.Б., Т:-решкина H.H., Марквичев Н.С., Борисов Б.А. Изучение хранения и прорастания спор нематофильного микромицета Paecilomyces lilacinus, иммобилизованного в кальций-альгинатном геле // Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. - С. 298-299.

4. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Биологический препарат для борьбы с дичинками кровососущих комаров на основе ассоциации энтомопатогенных микроорганизмов // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009. - С. 205-206.

5. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Рост гриба Tolypocladium cylindrosporum из гранул кальций-альгинатного геля // Биотехнология. - 2009. - №3. - С. 3439.

6. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Комары - вне закона// Экология и жизнь. -2009. - №6. - С. 89-90

/и /Vх .. ЦТ) У /У

» У/

t S

Подписано в печать:

16.09.2009

Заказ № 2504 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ni

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Горюнова, Ольга Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Комары как переносчики опасных заболеваний.

1.1.1. Среда обитания и физиология развития комаров.

1.2. Методы борьбы с комарами.

1.3. Бактериальные средства борьбы с личинками комаров.

1.4. Энтомопатогенные грибы как потенциальные агенты борьбы с личинками комаров

1.4.1. Энтомапатогенный гриб Tolypocladium cylindrosporum как агент биологического контроля личинок кровососущих комаров „

1.4.2. Механизм патогенеза личинок кровососущих комаров под действием гриба Tolypocladium cylindrosporum.

1.4.3. Особенности культивирования гриба Т.cylindrosporum. Жизнеспособность клеток.

1.5. Препаративные формы биологических препаратов.

1.6. Иммобилизация микроорганизмов как способ повышения стабильности клеток микроорганизмов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров"

Борьба с кровососущими комарами долгие годы является проблемой, которую человек пытается решить всеми доступными способами. Это связано не только с тем, что комары вносят неудобства в бытовую жизнь человека, но и с тем, что они являются переносчиками целого ряда опасных трансмиссивных заболеваний.

Для борьбы с комарами и их личинками применяются, в основном, химические препараты. Их использование экологически небезопасно и достаточно быстро вызывает резистентность у насекомых.

Биологические инсектициды, применяемые для борьбы с личинками комаров, представляют собой сухие споровые формы или живые вегетативные клетки бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis. Такие препараты обладают рядом общих существенных недостатков: большая норма расхода и отсутствие длительности действия. Большая норма расхода связана с тем, что она напрямую зависит от глубины водоема, так как клетки, после внесения в экосистему на водную поверхность достаточно быстро оседают на дно. Отсутствие длительности действия определяется механизмом ларвицидной активности бактерий В.thuringiensis var. israelensis и особенностями биологического развития клеток. Это, в свою очередь, приводит к необходимости частых повторных обработок. Разработка нового биологического препарата для борьбы с личинками комаров, лишенного данных недостатков, является актуальной задачей современной биотехнологии.

Основной целью работы явилась разработка новой формы инсектицидного биологического препарата для борьбы с личинками комаров. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:

• Провести выбор среди грибных культур микроорганизм, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров.

• Изучить свойства и динамику роста гриба, иммобилизованного в Са-альгинатном геле. Подобрать субстраты, которые метаболизируются грибом внутри гранулы и обеспечивают выход микроорганизма из гранулы в свободное состояние.

• Исследовать динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы клеток грибов.

• Оценить возможность иммобилизации бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis в Са-альгинатные гранулы с сохранением их свойств и ларвицидной активности. Исследовать и сравнить динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных клеток бактерий.

• Провести испытания полученного инсектицидного препарата для борьбы с личинками комаров в реальных условиях.

1.1.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Горюнова, Ольга Борисовна

выводы

3. При изучении кинетики гибели личинок комаров A. aegypty под действием гриба Т. cylindrosporum, показано, что введение в гранулу таких веществ как н-алканы и растительные масла обеспечивает положительную плавучесть гранул, что повышает эффективность их использования за счет пролонгированного действия и локализации на поверхности воды. Показано, что клетки Т. cylindrosporum, иммобилизованные в гранулы с субстратом, вызывают возникновение эпизоотии личинок комаров A. Aegypty.

4. При изучении кинетики гибели личинок A. aegypty под воздействием клеток бактерий В. thuringiensis var. israelensisis свободных и иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью, показано, что при иммобилизации бактерии сохраняют свою ларвицидную активность.

5. При изучении взаимного влияния клеток Т. cylindrosporum и В. thuringiensis var. israelensis было показано, что бактерии угнетают рост гриба как в свободном так и в иммобилизованном состоянии. Однако, при одновременном применении иммобилизованных клеток Т.cylindrosporum и В. thuringiensis var. israelensis повышается эффективность и длительность ларвицидной активности препаративной формы. Это легло в основу создания комбинированного препарата на основе смеси гранул иммобилизованных клеток бактерий и грибов.

6. Разработано, испытано и внедрено в производство инсектицидное средство Батолим на основе смеси Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками Т. cylindrosporum с субстратом и В. thuringiensis var. israelensis в процентном соотношении 75:25. Показана высокая эффективность средства при его применении в коммунальном хозяйстве для борьбы с личинками комаров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биологические препараты для борьбы с личинками комаров являются высокоэффективными инсектицидами, потребность в которых постоянно растет. Используемые на сегодняшний день биологические препараты обладают рядом существенных недостатков, которые сильно ограничивают и усложняют работу с ними. К таким недостаткам, прежде всего, относятся большие нормы расхода, которые напрямую зависят от глубины обрабатываемой водной поверхности, и отсутствие длительного остаточного действия, что требует постоянных повторных обработок.

В результате настоящих лабораторных и производственных исследований был разработан новый биологический инсектицид, обладающий рядом существенных преимуществ: небольшая норма расхода, которая зависит только от площади обрабатываемой водной поверхности и не зависит от глубины, длительность действия в течение нескольких месяцев без дополнительных повторных обработок, длительность хранения, удобство транспортировки.

Действующим началом нового биопрепарата для борьбы с личинками комаров является смесь энтомопатогенных микроорганизмов - бактерий и грибов. Микроорганизмы заключены в альгинатные гранулы, обладающие положительной плавучестью. Внутри гранул находится субстрат, который метаболизируется клетками, что обеспечивает их рост внутри гранулы и выход в окружающую среду без потери активности.

В ходе лабораторных испытаний были подобраны оптимальные характеристики препаративной формы, определена норма расхода препарата для широкомасштабного применения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Горюнова, Ольга Борисовна, Москва

1. Dale P.E.R. Wetlands and mosquitoes: a review / Dale P.E.R., Knight J.M. // Wetlands Ecol Manage. 2008. - Vol. 16. - p. 255-276.

2. Виноградова Е.Б. Городские комары, или «дети подземелья» / Е.Б. Виноградова. — М.: ООО «Галерея-Принт», 2005. 96с.

3. Тарасов В.В. Медицинская энтомология / В.В. Тарасов. — М.: Изд-во МГУ, 1996.-352 с.

4. Роспотребнадзор: в 63% водоемов Москвы живут личинки малярийного комара Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.no vopol.m/article22885.html/ww^^t39525.html, свободный.

5. Бей-Биенко Г.Я. Общая энтомология / Г.Я. Бей-Биенко. М., 1971. - 480 с.

6. Цуриков М.Н. Беспозвоночные: следует ли их бояться? Электронный ресурс. / М.Н. Цуриков. Режим доступа: http://www.humane.evol.nw.ru/popbp6.html, свободный.

7. Ясюкевич В.В. Питание личинок кровососущих комаров. Электронный ресурс. / В.В. Ясюкевич. — Режим доступа: http://pestkiller.ru/pitanie licshinokl .shtml, свободный.

8. Ганушкина JI.A. Биологические основы совершенствования методов борьбы с кровососущими комарами: дис. . д-ра биол. наук / JI.A. Ганнушкина. — М., 2004.-216 с.

9. Amer A. Repellency effect of forty-one essential oils against Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes / Amer A., Heinz M. // Parasitol Res. 2006. - Vol. 99. - p. 478-490.

10. Corbet S.A. Surface films as mosquito larvicides: partitioning the mode of action / Corbet S.A., Tiley C., Moorhouse Т., Giaml G., Pursglove S., Raby J. & Rich M. // Entomologia Experimentalis et Applicata. 2000. - Vol. 94. - p. 295-307.

11. Martinez-Ibarra J.A. Indigenous fish species for the control of Aedes aegypti in water storage tanks in Southern Mexico / Martinez-Ibarra J.A., Guillen Y.G., Arredondo-Jimenez J.A., Rodrigues-Lopez M.H. // BioControl. 2002. - Vol. 47. -p. 481-486.

12. Marten G.G. Use of cyclopoid copepods for mosquito control / Marten G.G., Bordes E.S. & Nguyen M. // Hydrobiologia. 1994. - Vol. 292/293. - p. 491-496.

13. Ahmad R. Effect of four chlorophytes on larval survival, development and adult body size of the mosquito Aedes aegypti / R. Ahmad, W.-L. Chu, H.-L. Lee & S.-M. Phang // Journal of Applied Phycology. 2001. - Vol.13, -p. 369-374.

14. Akara A.A. The developing role of microbiological agents in vector control / A. A. Akara// Swiss Society of Microbiology. 1977. - Vol.15. - p. 125-130.

15. Lacey L.A. Insect pathogens as biological control agents: do they have a future? / L.A. Lasey, R. Frutos, H.K. Kaya, P. Vail // Biologycal Control. 2001. - Vol. 21. -p. 230-248.

16. Быков В.А. Биотехнология. Книга 6. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. и др. М.: Высш. шк., 1987. - 143 с.

17. Вейзер Я. Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми / Я. Вейзер. М.: Колос, 1972. - 640 с.

18. Burges H.D. Nomenclature of Bacillus thuringiensis with abbreviations / H.D. Burges // Mosquito News. 1984. - Vol. 77. - p. 473-475

19. Federici B.A. Insecticidal Protein Crystals of Bacillus thuringiensis / B. A. Federici, H.-W. РагкЗ, Y. Sakano // Microbiol Monogr. J.M. Shively: Inclusions in Prokaryotes. 2006. - p. 196-236.

20. Tyrell D.J. Toxicity of parasporal crystals of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis to mosquitoes / D.J. Tyrell, L.I. Davidson, L.A. Ramoska // Applied and Environmental Mycrobiology. — 1979. Vol. 38. — p. 656-658.

21. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / под. Ред. В.В. Глупова. — М.: Круглый год, 2001. 736 с.

22. Кандыбин Н.В. Проблемы и перспективы использования Bacillus thuringiensis Ни в борьбе с кровососущими комарами и мошками / Н.В. Кандыбин, О.В. Смирнов. Л.: Всесоюзный НИИ с.-х. микробиологии, СССР, 1998. — 31 с. (Информационный бюллетень ВПС МОББ).

23. Кандыбин Н.В. Токсичность вегетативных клеток В. thuringiensis var. israelensis для личинок Culex pipiens molestus. / Н.В. Кандыбин, В.П. Ермолова, Н.М. Барбашова. Л.: ВНИИСХН, 1982. — 36с. (Бюллетень ВНИИСХН).

24. Khodyrev V.P. Characterization of Crystal-Forming Bacteria Bacillus thuringiensis subsp. Tohokuensis Toxic to Mosquito Larvae / V. P. Khodyrev, G. V. Kalmykova, L. I. Burtseva, and V. V. Glupov // Biology Bulletin. 2006. - Vol. 33. - p. 513516.

25. Lizuka T. Serological properties of the mosquitocidal protein of Bacillus thuringiensis and the morphology of its parasporal crystal / T. Lizuka, T. Yamamoto // Рас. Agr. Hokkaido Univ. 1984. - Vol. 62. - p. 98-114.

26. Davis K.I. On the delta-endotoksin of Bacillus thuringiensis israelensis: Diss. . doct. Nature. Sci. /К.1. Davis. Swiss. Fed. Inst., - 1982.

27. H.E. Huber Davis K.I. Bacillus thuringiensis delta-endotoksin: composition and activation. In. E. Davidson (ed), pathogenesis of invertebrate microbial diseases, Alienheld, Osmun Fotowa, NJ. 1981.

28. Tyrell D J. Comparative biochemistry of entomocidal crystals of selected strains of Bacillus thuringiensis. / D.J. Tyrell, L.A. Billa, K.A. Kramer, L.I. Davidson // Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1980. - p. 101

29. Tyrell D.J. Characterization of spore coat-proteins of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus / D.J. Tyrell, L.A. Billa, L.I. Davidson // Сотр. Biochem. and Physiol. 1981. - Vol. 70. - p. 535-539.

30. Nickerson K.W. Structure and function of the Bacillus thuringiensis protein cristal / K.W-. Nickerson // Biotechnology and Bioinginiering. 1980. - Vol. 22. - p. 13051333.

31. Margalit J. The story of Bacillus thuringiensis var. israelensis / J. Margalit, D. Dean // J. Am. Mosq. Control Assoc. 1985. - Vol. 1. - p. 1-7.

32. Cowan S. T. Cowan and Steel's manual for the identification of medical bacteria / S.T. Covan (ed.), 2nd rev. ed., Cambridge University Press, Cambridge. 1974. -167 p.

33. Himeno M. Plasmids and insecticidal activity of delta-endotoxin crystals from Bacillus thuringiensis var. israelensis / M. Himeno, M. Ikeda, K. Sen, N. Koyama, Т. Komano, H. Yamamoto, I. Nakayama // Agric. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49. — p. 373-580.

34. Cantwell G.E. Effectiveness of Bacillus thuringiensis var. israelensis in controlling a sciarid fly, Lycoriella maly, in mushroom compost / G.E. Cantwell, W.W. Cantelo // J. Econ. Entomol. 1984. - Vol. 77. - p. 473-475.ij i

35. Каменек M.K. Влияние эндотоксина Bacillus thuringiensis на Mg АТФазную систему насекомых / M.K. Каменек. Новосибирск: Фауна и экол. членистоногих. Материалы 5-го совещания энтомологов Сибири. — 1979. — с. 52-55.

36. Бактицид ларвицидный препарат. Электронный ресурс. - Режим доступа: http://www.sibbio.ru/products/larvicid/, свободный.

37. Becker N. Biological control of mosquitoes: management of the upper rhine mosquito population as a model programmer / Ecological and societal approach to biological control. J. Eilenberg and H.M.T. Hokkanen (eds.). 2006. - p. 227-245.

38. Margalit J. Effect of encapsulation on the persistence of Bacillus thuringiensis var. israelensis, serotype Н-14/ J. Margalit, A. Marcus, Z. Pelah// Applied Microbiology and Biotechnology. 1984. - Vol. 19. - p. 382-383.

39. Мечников И.И. Болезни хлебного жука / И.И. Мечников. — Одесса. 1987.

40. Красильщик И.М. // Труды 6-го областного энтомологического съезда. Одесса. — 1886.

41. Евлахова А.А. Энтомопатогенные грибы. Систематика, биология, практическое значение / А.А. Евлахова. — JL: Наука, 1974. 260 с.

42. Scholte Е.J. Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review / E.-J. Scholte, B.G.J. Knols, R.A. Samson, W. Takken // Journal of Insect Science. — 2004. — Vol. 4. 24 pp.

43. Roberts R.V. Coelomomyces, Entomophora, Beauvaria, and Metarhizium as parasites of mosquitoes / D.W. Roberts // Misc Publ Entomo Soc Am. 1970. — Vol. 7.-p. 140-155.

44. Miranpuri G.S.Infection sites of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in the larvae of the mosquito Aedes aegypti / G.S. Miranpuri, G.G. Khachatourians // Entomol. exp. appl. 1991. - Vol. 59. - p. 19-27.

45. Mohanty S.S. Induction of chymoelastase (Prl) of Metarhizium anisopliae and its role in causing mortality to mosquito larvae /S.S. Mohanty, K. Raghavendra, A. P. Dash // World J Microbiol Biotechnol. 2008. - Vol. 24. - p. 2283-2288.

46. Goettel M.S. Pathogenesis of the Hyphomycete Tolypocladium cylindrosporum in the mosquito Aedes aegypti /M.S. Goettel // Journal of Invertebrate Pathology. -1988. Vol. - 51. - p. 259-274

47. Goettel M. S. Manual of Techniques in Insect Pathology / Fungi: Hyphomycetes. In: Lacey L.A .editor.- 1997. Vol. 5-3. - p. 213-248.

48. Soares G.G. Tolypocladium cylindrosporum, a new fungul pathogen of mosquito larvae with promise for use in microbial control / G.G. Soares, D.E. Pinnock, R.A. Samson// In «Proceedings 47th Ann. Conf. Calif. Mosquito and Vector Control Assoc.». 1979.

49. Weiser J. Mosquito killing activity of strains of Tolypocladium cylindrosporum and Tolypocladium niveum / J/ Weiser// Ceshka mycology. - 1987. - Vol. 41. - p. 219-225.

50. Soares G.G. Entomopathogenic species of the hiphomycete genus Tolypacladium/ G.G. Soares// Journal Invertebrate pathology. 1984. - Vol. 43. - p. 133-139

51. Gams W. Tolypocladium, a Hyphomecetengattuig mit geschwollen Phialiden/ W. Gams//Persoonia.- 1971.-Vol. 7.-p. 185-191.

52. Weiser J. Tolypocladium cylindrosporum Deuteromycetes, Moniliaceae. a new pathogen of mosquito larvae/ J. Weiser, J.S. Pillai// Entomophaga. 1981. - Vol. 26.-p. 357-361.

53. Ravallec M. Infection of Aedes albopictus by Tolypocladium cylindrosporum / M. Ravallec, A. Vay, G. Riba// Journal of invertebrate pathology. 1989. - Vol. 53. -p. 7-11.

54. Soares G.G Pathogenesis of infection by hyphomycetous fungus, Tolypocladium cylindrosporum in Aedes sierrensis and Culex tarsalis / G.G. Soares// Entomophaga. 1982. - Vol. - 27. - p. 283-300.

55. Krasnoff R.B. Efrapeptin prodaction by Tolypocladium fungi (Deuteromycotina: Hyphomycetes): intra- and interspecific variation / R.B. Krasnoff, S. Gupta// Journal of chemical ecology. 1992. - Vol. 18. - p. 1727-1741.

56. Bandani A.R. Effects of Tolypocladium cylindrosporum and its secondary metabolites, efrapeptins, on the immune system of Galleria mellonella larvae // A.R. Bandani. Biocontrol Science and Technology. - 2005. — Vol. 15. — p. 67-79.

57. Jegorov A. Production of cyclosporins by entomopathogenic fungi / AJ Jegorov, V. Matha, J. Weiser// Microbios letter. 1990. - Vol.45, -p.65-69

58. Weiser J. Acute toxicity of conidia of Tolypocladium fungi to larvae of Culex sitiens /J. Weiser// Entomology. 1991. - Vol. 88. - p.367-369.

59. McCauley V.J.E. Histopathology of green muscardine in larvae of four species of Elateridae / V.J.E. McCauley, R.Y. Zacharuk// Journal of invertebrate pathology. — 1968. Vol. 12. - p. 444-459.

60. Riba G. Comparative stadies of Metarhizium anisopliae and Tolypocladium cylindrosporum as pathogens of mosquito larvae / G. Riba, A. Keita, G.G. Soares, P. Ferron// Journal American Mosquito Control Association. — 1986. Vol.2 — p. 469-473/

61. Gardner J.M. Tolypocladium cylindrosporum (Deuteromyeotina: Moniliales), a fungal pathogen of the mosquito Aedes australis. II. Methods of spore propagation and storage / J. M. Gardner , J. S. Pillai // Mycopathologi. 1987. - Vol. 97. -p.77-82.

62. Gardner J.M. Tolypocladium cylindrosporum (Deuteromyeotina: Moniliales), a fungal pathogen of the mosquito Aedes australis. III. Field trials against twomosquito species / J. M. Gardner , J. S. Pillai // Mycopathologi. 1987. - Vol. 97. -p.83-88.

63. Вейзер Я. Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми. М.: Колос. 1972. - 640 с.

64. Штерншис М.В. Повышение эффективности микробиологической борьбы с вредными насекомыми. Новосибирск. 1995. - 195 с.

65. Штерншис М.В. Биологический контроль численности насекомых /под. Ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001. - с. 562-610.

66. Бодей С.П., Броделиус П., Кабрал И.М. «Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Москва, Мир, 1988, стр. 215.

67. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки. В кн.: Итоги науки и техники. Сер.микробиология.М. :ВИНИТИ, 1981, 11,с.55-157.

68. Вудвард Д. Иммобилизация клеток и ферментов // М., "МИР", 1988, 162 с.

69. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок: дис. . канд. техн. наук / Х.А. Аушева. -М., 2007.- 181 с.

70. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение. В кн.: Иммобилизованные клетки. Пущино, 1978, с.5-36.

71. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // М., Изд-ва МГУ, 1994, 228 с.

72. Cassidy М.В., Lee Н., Trevors J.T. Environmental application of immobilized microbial cells: a review. // J. Ind.Microbiol 1996 - Vol. 16 - p. 79-101

73. Практикум по микробиологии под ред.А.И.Нетрусова // M.: Академия, 2005, 606 с.

74. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности// Сб. М., -1998. ч. 1-3.

75. Борисов Б.А. Изучение энтомапатогенных микроорганизмов и разработка технологий производства и их применения/ Б.А. Борисов// Научн. работы симпозиума СЭВ по теме 12. V. Бухарестб Румыния. 1987. - с.8-22.

76. Бегляров Г.А. Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов / Г.А. Бегляров, В.А. Понамарева, В.А. Назарова// Сборник трудов, М.: ОРИСО Главмикробиопром. 1985. - с. 90-92.

77. Ferron P. Pest control by the fungi Beauveria and Metharhizium / P. Ferron// In: Burgess HD, editor. Microbial control of pests and diseases. 1970-1980. - Vol. 24. - p. 465-482. - London. Academic Press.

78. Zimmerman G. The entomopathogenic fungus Methathizium anisopliae and its potencial as a biocontrol agents / G. Zimmerman// Pestic Science. 1993. - Vol. 37. -p. 375-379.

79. Boucias DR. Entomopathogenic fungi; Fungy Imperfecty / DR. Boucias, JC. Pendland // In: DR. Boucias, JC. Pendland, editors. Principles of insect pathology. Dordecht, Kluwer academic publishers. 1998. — Vol. 10. - p. 321-359.

80. Goettel MS. A simple method for mass culturing entomophatogenic Hyphomycete fungi / MS. Goettel// Journal microbiologycal methods. 1984. - Vol. 3. - p. 15-20.92.: дис. . канд. техн. наук/Х.А. Аушева. -М., 2007.- 181 с.

81. Weiser J. Tolypin, a new insectidical metabolite of fungi of the genus Tolypocladium / J. Weiser, V. Matha// Journal of invertebrate pathology. 1988. -Vol. 51.-p. 94-96.

82. Becker N. Factors influencing the efficacy of the microbial control agent Bacillus thuringiensis israelensis. / N. Becker, M. Zgomba, M. Ludwig, D. Petric, F. Rettich // Journal American Mosquito Control Association. 1992. - Vol. 8. - p. 285-289.

83. Eskils K. Release of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in Swedish soil / K. Eskils, A. Lovgren // FEMS Microbiology Ecology. 1997. - Vol. 123. - p. 229237.

84. Rashed S.S. Factors influencing ingestion of particulate materials by mosquito larvae (Diptera: Culicidae) /S.S. Rashed, M.S. Mulla// Journal Med. Entomol. — 1989.-Vol. 26.-p. 210-216.

85. Margalit J. The effect of organic materials and solids in water on the persistence of Bacillus thuringiensis var. israelensis, Serotype H-14 / J. Margalit, H. Bobroglo// Zeitschrift angew. Entom. 1984. - Vol.97. - p. 516-520.

86. Blaustein L. Indirect effects of the fairy shrimp, Branchipus schaefferi and two ostracod species on Bacillus thuringiensis israelensis-induced mortality to mosquitoes / L. Blaustein, J. Margalit // Hydrobiologia. — 1991. — Vol. 212. — p. 6776.

87. Hoti SL. Formation of melanin pigment by a mutant of Bacillus thuringiensis H-14 / SL. Hoti, K. Balaraman// J Gen Microbiol. 1993; 139:2365- 9

88. Aly С. Sporulation and toxin production by Bacillus thuringiensis var. israelensis in cadavers of mosquito larvae (Diptera: Culicidae) / C. Aly, M.S. Mulla, В .A. Federici// Journal Invertebrate Pathology. 1985. - Vol. 46. - p. 251-258.

89. Barak Z. A mutant of Bacillus thuringiensis var. israelensis (BTI) resistant to antibiotics / Z. Barak, B. Ohana, Y. Allon, J. Margalit // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - Vol. 27. - p. 88-93.

90. Khawaled K. The fate of Bacillus thuringiensis var. israelensis in B. thuringiensis var. israelensis-kiMzd pupae / K. Khawaled, E. Ben-Dov, A. Zaritsky, Z. Barak// Journal Invertebrate Patholology. 1990. - Vol. 56. - p. 312316.

91. Cheung P.Y.K. Micro-lipid-droplet encapsulation of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis delta-endotoxin for control of mosquito larvae / P.Y.K. Cheung,

92. B.D. Hammock // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - Vol. 50. - p. 984-988.

93. Cassidy M.B. Environmental application of immobilized microbial cells: a review / M.B. Cassidy, H. Lee, J.T. Trevors // J. Ind.Microbiol. 1996. - Vol. 16. -p. 79-101.

94. Ross G.R. Microencapsulation of probiotic strains for swine feeding / G.R. Ross,

95. C. Gusils, S.N. Gonzalez//Bio. Pharm. Bull. -2008. Vol. 31. -p.2121-2125.

96. Shahbazi A. Lactic acid production from cheese whey by immobilized bacteria / A. Shahbazi, M.R. Mims,Y. Li, V. Shirley eds. // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2005. -Vol. 121. p. 529-540.

97. McLoughlin A.J. Immobilized cells in meat fermentation/ A.J. McLoughlin, C.P. Champagne // Crit Rev Biotechnol. 1994. - Vol. 14. - p. 179-192.

98. Jackson S.J., Leek R., Microencapsulation and the food industry // Lebensm Wiss. Technol. Vol. 25 - p. 289-297.

99. Чекалова К.В. Разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток микроорганизмов Trichoderma viride и Pseudomonas fluoriscens: дис. . канд. биол. наук / К.В. Чекалова. М., 2007.162 с.

100. Аушева Х.А. Изучение процессов биодеструкции нефти иммобилизованными дрожжами Yarrowia lipolytica / Х.А. Аушева, Н.С. Марквичев // Материалы III Международного конгресса «Биотехнология — состояние и перспективы развития». — Москва. — 2005. с. 33.

101. MarkR. R. Experimental and modeling studies of diffusion in immobilized cell systems / R.R. Mark R., J.M. Fernando, C.R. Sebastian // Applied Biochemistry and Biotechnology. -1999. Voil. - 80. - p. 151-188.

102. Duffy B.K. Pathogenic self defense: mechanisms to counteract microbial antagonism / B.K. Duffy B.K., A. Schoten, J.M. Raajmakers // Annu. Rev. Phytopathol. 2003. - Vol.641- p.501-538.

103. Rhodes D.J. Formulation of biological control agents. In: Exploitation of Microorganisms // Chapman and Hall London, UK - 1993 - p. 411-439.

104. Перт С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Перт. — М.: Мир, 1978.-331 с.

105. Georghiou G. P. Resistance potential to biopesticides and consideration of countermeasures / G.P. Georghiou // In J. E. Casida (ed.), Pesticides and alternatives. Elsevier Science Publishers, New York, N.Y., 1990. p. 409-420.

106. Li J. Crystal structure of insecticidal ^-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 angstrom resolution / J. Li, J. Carroll, D.J. Ellar// Nature. 1991. - Vol. 353. -p. 815-821.

107. Thomas W.E. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis var. israelensis insecticidal <5-endotoxin / W.E. Thomas, D.J. Ellar // FEBS Lett. 1983. - Vol. 154.-p. 362-368.

Информация о работе

Горюнова, Ольга Борисовна
кандидата технических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы