Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей

Марданов, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей"

005049591

На правах рукописи

Марданов Андрей Владимирович

Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 4 ФЕВ 2013

Москва-2013

005049591

Работа выполнена в Лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты:

Шестаков Сергей Васильевич, доктор биологических наук, профессор, академик РАН, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Биологический факультет, главный научный сотрудник. Дебабов Владимир Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, академик РАСХН, Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», научный руководитель.

Пименов Николай Викторович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, заместитель директора по научной работе.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита диссертации состоится апреля 2013 г. в 11 часов на заседании Совета

Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан » 2013г. —• —^Л.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

С момента описания Карлом Возе в качестве отдельного, наряду с бактериями и эукариотами, домена живых существ (Woese and Fox, 1977), археи стали одними из наиболее интересных объектов микробиологии, молекулярной биологии и биохимии. Несмотря на большой интерес к археям, успехи в их изучении до середины 1990-х годов были весьма ограничены, что во многом было связано с сложностью культивирования большинства этих микроорганизмов и практически полным отсутствием генетических «инструментов» (генетическая трансформация, векторы для экспрессии, методы нокаута генов и др.), подобных давно разработанным для таких модельных объектов как Escherichia coli.

Успехи в развитии геномики вносят особенно заметный вклад в исследование архей. Благодаря прогрессу в разработке геномных технологий растет число полных геномных последовательностей, расширяются знания о биологии архей, их разнообразии и эволюции. Получены новые данные о ключевых генетических процессах у архей, таких как клеточное деление и репликация ДНК, о роли горизонтального переноса генов в эволюции, выявлены взаимосвязи между археями и эукариотами. Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации более близок к эукариотическому. Вследствие этого археи являются удобными модельными объектами для изучения молекулярных механизмов многих генетических процессов у эукариот.

Среди архей выделяют два основных филума (Woese et al., 1990), - Crenarchaeota (кренархеи) и Euryarchaeota (эуриархеи). Кренархеи и эуриархеи не только образуют отдельные филогенетические ветви, но и существенно отличаются в организации аппарата репликации и экспрессии генома, клеточного деления и многих других важнейших генетических процессов.

На момент начала данной работы, к 2008г. было определено всего около 50 полных геномов архей, что более чем на порядок меньше, чем число расшифрованных бактериальных геномов. Большинство архей с известными полными геномами представляли всего несколько филогенетических групп, - метаногены, галофилы, термофильные археи порядка Thermococcales (эуриархеи) и кренархеи порядка Sulfolobales. Для большинства остальных групп, в первую очередь термофильных кренархей, геномные данные отсутствовали либо были доступны для одного-двух представителей, что существенно ограничивало знания о биологии этих организмов.

Таким образом, задача определения и анализа структур геномов архей, в первую очередь представляющих «новые» эволюционные ветви, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области молекулярной биологии и микробиологии. Не меньшее значение, в первую очередь для понимания молекулярных механизмов эволюции, имеет и сравнительный анализ геномов близкородственных организмов. Расшифровка геномов архей, обитающих в специфических экологических нишах, важна для выяснения соответствующих путей метаболизма и экологической роли этих микроорганизмов в природных сообществах. Функциональная геномика архей, обитающих в экстремальных условиях среды, имеет и очевидное практическое значение, обусловленное биотехнологическим потенциалом этих микроорганизмов в качестве источников новых ферментов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия термофильных архей на основе определения и анализа полных нуклеотидных последовательностей их геномов.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Определение полных нуклеотидных последовательностей геномов термофильных архей - объектов исследования.

2. Изучение особенностей структурной организации и функционирования геномов архей.

3. Анализ путей и механизмов эволюции архей на основе геномных данных.

4. Анализ особенностей метаболизма архей.

5. Идентификация и характеристика новых термостабильных ферментов, перспективных для использования в биотехнологии.

6. Определение структур микробных сообществ термальных источников с различными физико-химическими характеристиками, анализ экологической роли отдельных групп микроорганизмов.

Объектами исследования являлись новые виды термофильных архей из коллекции микроорганизмов, выделенных в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН. Две архей представляли новые филогенетические группы (АсгУо/о&ия ¡асскагогогат и РеЫсИсоссия /ол^), другие были выделены из ранее неисследованных экологических ниш и/или имели необычные возможности метаболизма (РетЦигососсш катсИшкепш,

Thermococcus sibiricus, Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis, Pyrobaculum sp. 1860, Thermofilum carboxydotrophus, Thermogladius cellulolyticus).

Научная новизна работы

Впервые определены полные структуры геномов 9 термофильных архей из различных филогенетических групп. Анализ геномов двух архей, Acidolobus saccharovorans и Fervidicoccus fontis, подтвердил, что эти микроорганизмы представляют два новых порядка кренархей (Acidilobales и Fervidicoccales), наряду с тремя ранее известными порядками (Desulfurococcales, Sulfolobales и Thermoproteales). В результате анализа геномных данных охарактеризованы основные пути метаболизма исследуемых архей, механизмы их приобретения и потери на молекулярном уровне.

Впервые проведена глубокая количественная характеристика состава сообществ микроорганизмов термальных источников Камчатки с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования фрагментов генов 16S рРНК. Полученные результаты значительно расширяют знания о разнообразии микроорганизмов термальных источников. Обнаружены ранее неизвестные группы архей. Определена зависимость состава и разнообразия микробных сообществ от температуры и рН, что дало новую информацию о распространении в природе и вероятной экологической роли отдельных групп архей.

Анализ геномов архей выявил ряд особенностей генетических процессов на молекулярном уровне. Обнаружено, что репликация хромосомы A. saccharovorans инициируется с двух orí - сайтов. Один из них расположен вблизи гена, кодирующего архейный инициаторный белок WhiP, гомолог эукариотического белка Cdtl. WhiP гены и ассоциированные с ними orí - сайты присутствуют в геномах Sulfolobales и некоторых представителей Desulfurococcales, но отсутствуют у наиболее эволюционно древней ветви кренархей Thermoproteales, а также у Fervidicoccales. Филогенетический анализ WhiP показал, что «второй» ori-сайт и whiP были приобретены на раннем этапе эволюции кренархей (и впоследствии утрачены в некоторых линиях), а не в результате интеграции вирусов и горизонтального переноса, как это предполагалось ранее.

Определение полных структур геномов стало основой работ по микробиологической и биохимической характеристике этих архей, изучению молекулярных механизмов генетических процессов, эволюции архей и структурно-функциональному исследованию белков, представляющих интерес как для исследований в области эволюционной энзимологии, так и для решения биотехнологических задач.

Практическая ценность работы

Практическая значимость работы обусловлена биотехнологическим потенциалом термостабильных ферментов и термофильных микроорганизмов. Термостабильные ферменты, продуцируемые гипертермофильными археями, широко используются в различных областях биотехнологии, что обусловлено их устойчивостью не только к высокой температуре, но и к другим экстремальным условиям (рН, высокие концентрации детергентов и растворителей и др.). Биотехнологически значимыми функциональными характеристиками обладают идентифицированные в этой работе термостабильные ферменты: алкогольдегидрогеназа из Т. зЛтсш, протеаза из О. катс11Мкеп$15, альдегиддегидрогеназа из РугоЬасиШт ер. 1860, супероксиддисмутаза из А. .$асс/гагоуогап.5, бета-галактозидаза из Т. зШНсш, многофункциональная бета-гликозидаза из А. хассИагт'Огап.ч, ДНК-лигазы из А. ьассИаго1'огап.1; и Т. ¡Шпсш. Выявленные термостабильные ферменты могут быть использованы для разработки новых биотехнологий для пищевой промышленности, переработки лигноцеллюлозного сырья, производства детергентов, органического синтеза.

В рамках выполнения данной работы были получены патенты на две термостабильные ДНК лигазы (Патенты РФ № 2405823 и № 2413767) и термостабильную алкогольдегидрогеназу из Т. хгЫпсш (Патент РФ № 2413766). Поданы две заявки на получение патентов на изобретения - термостабильные бета-галактозидаза из Т. ¡¡Ыпсш и бета-гликозидаза из Л. ^асс\шго\'огапк.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: II международная конференция «ВюМ1сго\УогШ007» (Севилья, Испания, 2007), симпозиум «Метаболомика и биотехнология» (Майорка, Испания, 2008), международный симпозиум «ВАСЕСО-Ю» (Упсала, Швеция, 2010), международный симпозиум «Биоразнообразие, молекулярная биология и биогеохимия термофилов» (Петропавловск-Камчатский, 2010), международная конференция «ЕхиеторЬПез 2010» (Азорские острова, Португалия, 2010), I и II международные научно-практические конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010; Новосибирск, 2011), международный симпозиум «ВАСЕСО-11» (Корфу, Греция, 2011), 2-ая международная конференция «ВИ^/БВ' 12» (Новосибирск, 2012), 3 Московская международная конференция «Молекулярная филогенетика Мо1РЬу-3» (Москва, 2012), 14 международный симпозиум 1ЯМЕ14 (Копенгаген, Дания, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 работ, в том числе 21 статья в научных журналах, 12 - в сборниках материалов научных конференций (тезисы сообщений и докладов). Получено 3 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 312 страницах машинописного текста и включают 77 рисунков и 36 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Цель и задачи исследования», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение» в 6 тематических главах, «Заключение», «Выводы», «Список публикаций по теме диссертации», и «Цитированная литература», список которой содержит 5 отечественных и 427 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования были новые виды термофильных архей из коллекции лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, для которых ранее не проводилось определение нуклеотидных последовательностей геномов. Ое.\ч1/игососси5 катсИмкеп515 и Thermogladius сеИиШуНсиз представляют порядок Ос5иН'игососса1ез; УикшшаеШ тоШпоуяИа, ТЪегторШеш тотетгя, РугоЬаси1ит ер. 1860 и Ткегто/Нит сагЬоху{1о1горкии - порядок ТЬегторго(еа1ея; Ас14о1оЬых зассИагоуогат и РепчсИсоссия /ол/;'.? - два новых порядка филума СгепагсЬаео1а. Еще одна архея, Т1гегтососсш 51Ыпсш, относится к филуму ЕигуагсЬаейа. Для определения полных структур геномов был использован метод высокопроизводительного пиросеквенирования.

1. Термоацидофильная архея АсиШоЬш $асс}гагоуогап$ - представитель новой филогенетической линии кренархей

Архея АсиИ/оЬих яассИагоуогат 345-15т была выделена из кислого горячего источника кальдеры вулкана Узон, Камчатка, Россия (РгокоГеуа е1. а1., 2009). Этот микроорганизм является облигатным анаэробом, термоацидофилом, растущим при рН 2,5-5,8 и температурах от 60 до 90°С. А. засскагоуогаю — органогетеротроф, способный утилизировать разнообразные углеводы и белковые субстраты (РгокоГеуа е!:. а!., 2009). Рост микроорганизма стимулируется добавлением 8° и тиосульфата, которые восстанавливаются до НгЭ. Геном А. ьасскагоуогапя является первым расшифрованным геномом облигатно анаэробной термоацидофильной археи.

Геном А. ¡асскагоуогат представляет собой кольцевую хромосому длиной 1.496.453 п.н. и не содержит внехромосомных элементов (Рис. 1). Геном содержит одну копию оперона 168-238 рРНК, одну удаленно расположенную копию гена 58 рРНК и

45 генов тРНК. С помощью стандартных протоколов поиска генов было найдено 1499 потенциальных белок-кодирующих генов со средней длиной 902 нт, покрывающих 90.4 % генома. Функции 972 белков (65%) могут быть предсказаны с различной степенью достоверности и детализации в результате сравнения с базами данных. Функции остальных 527 генов предсказать по аминокислотной последовательности соответствующих белков не представляется возможным, причем 246 генов являются уникальными для A. saccharovorans.

Из мобильных элементов в геноме была найдена одна копия транспозона семейства IS607, интегрированные архейные вирусы и плазмиды обнаружены не были. Геном A. saccharovorans содержит пять кластеров коротких тандемных повторов (CRISPR), включающих 24, 10, 26, 42 и 8 повторяющихся спейсеров. Предполагается, что CRSIPR-локус участвует в системе защиты клетки, действующей по механизму, аналогичному РНК-интерференции эукариот, а спейсерные последовательности являются производными внехромосомных элементов, например вирусов. В подтверждение этой гипотезы мы обнаружили, что последовательность одного из спейсеров совпадает с последовательностью плазмиды pHVE14 из Sulfolobus islandicus. Активностью CRISPR системы может объяснять отсутствие интегрированных вирусов и минимальное число мобильных элементов в геноме A. saccharovorans.

Рисунок 1. Карта генома А. 5ассЬаго\югаш. На двух внешних кругах отмечены гены, транскрибирующиеся по часовой стрелке и против часовой стрелки, соответственно. На двух внутренних кругах отмечены гены тРНК, рРНК и СКВРК-локусы.

561170

genes (CW) genes (СCW)

На Рис. 2 представлены данные о количестве белок-кодирующих генов А. saccharovorans, гомологи которых присутствуют в геномах других архей. Полученные результаты показывают, что ближайшим родственником А. яассЬагоуогапз является кренархея Аегоругит регтх, описанная как представитель порядка ВевиИигососсакв,

около половины (-740) белков у них гомологичны. Значительно меньшее число «общих» белков А. яасс]шго\югап$ имеет с другими представителями ОеяиНчдгососсакв (478-586 белков) и ТЬегторгМеаЬв (491-624 белков). Особо стоит отметить то, что А. яасскагоуогат имеет большее число «общих» белков с представителями БиНЫоЬакв (661-687 белков). Причина такого сходства между протеомами А. ¡ассИагочогапь и БиИЫоЬакв, вероятно, связана с адаптацией этих организмов, способных расти на сложных белковых и полисахаридных субстратах, к термоацидофильным условиям и обусловлена событиями горизонтального переноса генов. Эту гипотезу подтверждает совместное обитание этих микроорганизмов в кислых горячих источниках и наличие у них похожих мобильных элементов.

(А) (В)

59%

34%

^Н Aeropyrum pernix

I_J Other Desulfurococales

ES3 Suifolobales

ЕЙЭ Thermoproteales

□ Others

Crenarchaea

Euryarchaea

Рисунок 2. Сравнения протеомов A. sacchrarovorans и других архей.

(A) Число белок-кодирующих генов A. sacchrarovorans имеющих гомологов в геномах других архей. Два гена считались гомологичными, если соответствующие белковые последовательности перекрывались на длине > 70%, при этом Е<10"'°. Обозначение: Aper, -Aeropyrum pernix; Dkam, - Desulfurococcus kamchatkensis', Hbut, - Hyperthermie butylicus\ Ihos, -Ignicoccus hospitalism Smar, - Stapliylothermus marinus\ Ssol, - Sulfolobus solfataricus; Sacid, -Sulfolobus acidocaldarius; Stok, - Sulfolobus tokodaii\ Msed, - Metallosphaera sedula; Cmaq, -Caldivirga maquilingensis; Tpen, - Thermofilum pendens; Pisl, - Pyrobacuium islandicum; Tneut, -Thermoproteus neutrophilus; Ptor, - Picrophilus torridus; Tacid, - Thermoplasma acidophilum; Pfur, -Pyrococcus furiosus; Aful, - Archaeoglobus fulgidus.

(B) Распределение ближайших гомологов рибосомных белков, найденных с помощью BLASTP, между различными таксонами.

Для определения филогенетического положения Acidilobales мы провели

таксономический анализ состава протеомы A. saccharovorans, определяя для каждого белка таксономическое положение его ближайшего гомолога в базе данных NCBI. Если предположить, что А. saccharovorans относится к Desulfurococcales, то большая часть его белков должна иметь наилучшие совпадения именно с белками архей порядка Desulfurococcales. Однако, мы установили, что около 40% белков А. saccharovorans имеют ближайшие гомологи среди белков А. pernix, а остальные наилучшие совпадения

распределены между разными порядками кренархей, - ВевиНигососсакв (21%), ЭиИЫоЬакв (15%) и ТЬегторкЛеакв (13%). Также были построены филогенетические деревья, основанные на сравнении последовательностей 53 рибосомных белков А. яасскагоуотт и других кренархей с известными полными геномными последовательностями (Рис. 3). Полученные результаты показывают, что А. яасскагоуогапз кластеризуется с А. регтх и образует отдельную линию, ответвляющуюся от ОезиИшососсакэ вскоре после расхождения ОевиИигососсакв и 8и11Ъ1оЬа1е8. В целом полученные данные полногеномного анализа свидетельствуют о близком родстве А. засскагоуогапз с А. регтх и поддерживают классификацию Ас1сШоЬа1е5 в качестве нового порядка кренархей.

■ Fervidicoccus fotitis Кат940 Fervidicoccales

-Acidilobus saccharovorans 345-15 1

-Caldisphaer;

JAcidilobales

— Aeropyrum pernix K1

- Ignicoccus hospitalis KIN4/I

~ Pyrolobus fumarii 1A ■ Hyperthermus butylicus DSM 5456

-Staphylothermus marinus F1

-Thermogladius cellulolyticus. 1633

-Thermosphaera aggregans DSM 11486

-Desulfurococcus kamchatkensis 1221n

—Sulfolobales

Desulfurococcales

o|—Vi

-I-

-1

iool-

Thermofilum carboxydotrophus Thermofilum pendens Hrk 5 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28

— Caldivirga maquilingensis 1С-167

— Thermoproteus tenax Kra 1 ■ Thermoproteus uzoniensis 768-20 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Pyrobaculum aerophilum str. IM2 Pyrobaculum sp. 1860 —

Thermoproteales

" Thermococcus sibiricus MM 739

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании контактенированных последовательностей 53 рибосомных белков, построенное методом Neighbour-joining.

Анализ распределения состава нуклеотидов в геноме А. эассИагоуогат показал наличие двух основных локальных минимумов на графике, демонстрирующем диспаритет содержания в « С (йС-вкеш) (Рис. 4В). Это указывает на возможное

наличие в геноме двух сайтов инициации репликации (orí). В результате поиска консервативных последовательностей сайтов связывания инициаторных белков Orcl/Orb6 (ORB-мотивы), было найдено три копии вероятного ORB мотива в некодирующем участке между генами ASac_1056 и Asac_1057 (Рис. 4С).

(А)

oríCZ \

опС1 1

200 400 600 800 1000 1200 1400 kb I -1 -

oriC1

oríC2

(С)

ая ucm

ORB1 ORB2 mORB1 ORB3

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 kb

mORB2 mORB3

-ф— 296/ whiP~

292435

ORB1 TCCAGAGGAAACGGAGGGGT ÜRB2 TT CAC AGGAAACAGAGGGGT ORB3 TCCAGAGGAAACAGAGGGGT

mORB1 CTATTGCAGCGCGTAGGGGT mORB2 GAAGATTATGAGTGCGGGGT mORB3 ATATTATTGCCCTCAGGGGT

UCM CATTATACAAAC

Рисунок 4. Идентификация сайтов инициации репликации в геноме A. saccharovorans.

(A) Кратность прочтения нуклеотидных последовательностей генома А. saccharovorans.

(B) GC-skew анализ генома (показана кривая «кумулятивного» GC skew).

(C) Структура предсказанных oriCl и oriC2 сайтов. Белые стрелки показывают положение ORB элементов, серые стрелки — укороченные ORB (mini-ORB), черная стрелка указывает положение мотивов UCM. А/Т - А/Т богатый регион в oriCl.

Экспериментальное подтверждение наличия и функционирования двух orí сайтов было получено при анализе распределения кратности прочтения нуклеотидной последовательности по длине генома. Препарат геномной ДНК A. saccharovorans для геномного секвенирования был выделен из растущей культуры, в которой происходит репликация ДНК. Поэтому участки, прилегающие к оп-сайтам, должны быть представлены в большем числе копий, чем прилегающие к сайтам терминации. Поскольку при секвенировании генома фрагменты «выбираются» из геномной ДНК случайным образом, прилегающие к оп-сайтам районы должны быть прочтены большее число раз. График, иллюстрирующий распределение кратности прочтения по

длине генома (Рис. 4А) действительно имеет два основных максимума, положения которых точно совпадают с минимумами кривой GC skew и положением консервативных мотивов архейных оп-сайтов. Таким образом, можно сделать вывод о том, что репликация хромосомы A. saccharovorans инициируется с двух ori-сайтов и является двунаправленной.

В результате анализа генома были выявлены гены, кодирующие ферменты, обеспечивающие возможность роста Л. saccharovorans на различных субстратах. Рост Л. saccharovorans на белках и пептидах обеспечивается несколькими внеклеточными ферментами, среди которых обнаружены сериновые и термопсин-подобные протеазы, а также различные пептидазы. Дальнейшее расщепление импортированных в клетку пептидов обеспечивается внутриклеточными протеолитическими ферментами. Образуемые аминокислоты в дальнейшем могут быть деаминированы набором аминотрансфераз, действующих совместно с глутамат-дегидрогеназой, и в дальнейшем могут быть окислены с образованием соответствующих производных СоА. Образуемые ацил-СоА производные в дальнейшем могут служить субстратом для ацетил-СоА синтазы (ACS) или сукцинил-СоА синтазы (SCS), в результате чего образуется соответствующая кислота и синтезируется АТФ.

Геномные данные также указывают на возможность роста A. saccharovorans на триглицеридах и жирных кислотах, поскольку в геноме имеется 14 генов внеклеточных эстераз, а также полный набор ферментов пути ß-окисления жирных кислот.

Наличие генов кодирующих различные ферменты гидролиза поли- и олигосахаридов, в том числе секретируемых из клетки, коррелирует со способностью A. saccharovorans расти на крахмале, мальтозе, целлобиозе, ксилане и сахарозе. Некоторые гены, кодирующие гликолитические ферменты, были клонированы, экспрессированы в Е. coli, а их продукты функционально охарактеризованы. Одним из наиболее интересных ферментов является ASAC_1390, относящийся к семейству GH1 гликозил-гидролаз. Рекомбинантный фермент активен в диапазоне значений pH от 4.0 до 7.0 при температурах 80-100°С (оптимум при 93°С) и обладает высокой термостабильностью, - при прогревании фермента при 90°С в течении 4 часов, активность снижается всего на 30%. ASAC_1390 является многофункциональным ферментом и обладает активностями бета-гликозидазы, бета-галактозидазы, бета-ксилозидазы и бета-маннозидазы. Активность фермента в оптимальных условиях составляла 550 ед/мг, - одна из самых высоких для известных термостабильных бета-гликозидаз. Вероятно, именно ASAC_1390 может обеспечивать способность А. saccharovorans расти на целлобиозе, лактозе и некоторых других сахарах.

Мономерные сахара и низкомолекулярные олигосахарды импортируются в клетку двумя первичными системами транспортеров АВС-типа, а также более чем двадцатью вторичными транспортными системами. Большая доля вторичных транспортеров по сравнению с первичными может указывать на то, что высокая концентрация протонов в окружающей среде в значительной степени используется А. íacc/гarovoraíгí для процессов транспорта. В отличие от большинства известных архей А. хасскагоуогапя обладает ферментами сразу двух путей метаболизма глюкозы - Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова. Образуемый пируват может окисляться пируват:ферредоксин оксидоредуктазой до ацетил-СоА, а затем ацетил-СоА синтаза обеспечивает образование ацетата и синтез АТФ.

А. 5асс1гагогогап5 может запасать энергию в процессах субстратного фосфорилирования, в которых при окислении одной молекулы глюкозы до ацетата образуется две молекулы АТФ, а при окислении одной молекулы аминокислоты - одна молекула АТФ. Кроме того, А. яассЬагоуогат может запасать энергию в процессах анаэробного дыхания (окислительного фосфорилирования), при котором происходит восстановление Б0 и перенос протонов мембран-связанными комплексами. В результате переноса протонов через мембрану формируется протонный градиент, которые используется АТФазой для синтеза АТФ. В геноме А. яасскагоуогат кодируется одна А| А0 АТФ синтаза, состоящая из 9 субъединиц.

У А. зассИагоуогапз при росте в присутствии серы в качестве акцептора электронов может функционировать разветвленная дыхательная цепь. В геноме А. зассИагогогапх содержатся гены, кодирующие полный набор ферментов окислительного цикла трикарбоновых кислот (ТСА), в котором ацетил-СоА окисляется в присутствии Б0 или тиосульфата. В присутствии Б0 восстановленный ферредоксин и ЫАП(Р)Н могут быть окислены совместным действием мембран-связанных белковых комплексов и цитоплазматических белков, в результате чего формируется трансмембранный протонный градиент. Геномный анализ выявил мембран-связанный белковый комплекс (АЙАС_0373 - АБАСМШЗ), который имеет сходство с бактериальной МАБН:хинон оксидоредуктазой (дыхательный комплекс I) и может осуществлять перенос протонов. У А. .чассИагомгапя этот комплекс является протон-переносящей ферредокош^АВР оксидоредуктазой (РКСЖ), получающей электроны от восстановленного ферредоксина и переносящий их на ИАОР+; при этом формируется трансмембранный протонный градиент. Образовавшийся МАО(Р)Н окисляется КАО(Р)Н:8° оксидоредуктазой (N5Я) с образованием НзЗ или участвует в других процессах, связанных с повторным окислением МАО(Р)Н. РЬ1(Ж может также

переносить электроны на хиноны дыхательной цепи и далее на мембран-связанные редуктазы. Помимо КТОИ. комплекса, дыхательная цепь А. хассИаготгап.ч включает сукцинат:хинон оксидоредуктазу (БООЯ; А5ЛС_1440 - А8АС_1443, дыхательный комплекс П), который представляет собой мембран-связанный компонент окислительного ТСА. Вторым возможным сайтом восстановления Б0 в А. 5асскагоуогат является мембран-связанный серо-редуктазный комплекс (БЯ, А5АС_1394-А5АС_1397), который может функционировать как конечная оксидаза при 5°-зависимом дыхании.

Таким образом, при росте в присутствии серы в качестве акцептора электронов, во-первых, электроны от восстановленного ферредоксина могут быть использованы комплексами П^ОЯ и ШЯ. В результате их функционирования восстанавливается сера и образуется трансмембранный протонный градиент. Во-вторых, часть электронов от РЖЖ и Б(2(Ж может быть перенесена на хиноны. Их окисление с помощью БЯ, связанное с формированием трансмембранного протонного градиента, является вторым сайтом восстановления серы.

При росте микроорганизма в среде, не содержащей серы, цикл трикарбоновых кислот не функционирует и дыхательная цепь, включающая 5(2(Ж комплекс, хиноны и 8Я, не работает. Однако трансмембранный градиент протонов все же может быть образован при окислении восстановленного ферредоксина ИМОЯ комплексом, функционирование которого требует повторного окисления КАО(Р)Н. У многих архей эта задача решается с помощью гидрогеназы (протоны используются как акцепторы электронов), однако в геноме А. зассИагоуогапя гены гидрогеназы отсутствуют, и водород во время роста не образуется (РгокоГеуа е1 а1. 2009). Однако, регенерация КАЭР+ может осуществляться в реакциях, приводящих к образованию других восстановленных продуктов брожения (например аланина, этанола, лактата и формиата). Дополнительно протонный градиент в отсутствии серы может создавать Н+-транспортирующая мембранная пирофосфатаза. Реконструкция метаболизма А. хасскагоуогапх на основе геномных данных представлена на Рис. 5.

А. хассЬаготгап! является строгим анаэробом, однако, в естественных условиях наземных горячих источников он может периодически подвергаться воздействию кислорода при попадании в аэробную зону. Геном А. зассИатуогапх кодирует различные системы защиты клетки от повреждения кислородом. Ключевым ферментом, обеспечивающим защиту от окислительного стресса является супероксиддисмутаза (СОД), которая превращает свободные радикалы кислорода в

fHinked polysaccharides Starch

«- овп

„ . * Malto-

I Celo-oligorier» oligomers

Proteins

I Proteases Di-/oligopeptides

Formale FOR Formaldehyde

f^Fít») maldehyde

3-Hexulos I HPS I

HKjc

Di-/o ligopeptides

I Peptidases Glutamate

Amino acids

Aminotransferases -----------2-Ket

Ghjcose-6-P i PGI

3-Hexuk>se-6-P ¿^-Fructose-в-Р

Fructose-1,6-bisP FBA

Ríbulose-5-Р RPI [ Ribose-5-P

PPS Jd^ Phosphoribosyl pyrophosphate

Regeneration of reductants In the absence of S°

Biosynthesis

Alanine

Ethanol

Lactate

Formale

НДЦРГ NAO(P)H

2-Keto-3-deoxy-6- Glyceraldehyde P-ehKonate A0R, fdl„ KO(P)GA [4» __ fc^

I Pyruvate Fdl4

Glyceraldehyde-3-P

GAPN I IGAPOR

3-P-Glyceraie —» 2-P-Gfycerate PGM i Enolase PEP

Acyl-CoAs ♦ CO, ACS L- А» SCS f""» АТР«С«ДЗН

H,S

fÑSñl/La»

Respiratory chain / Acyl-CoA

S* HjS Fumarate Succinate

7Г

Erf EtfHj

F Oxidation

Long-chain fatty acids CoASH I FadDK^^

Acyl-CoA * FadE

FADK,

ЕооуЮаА Fad fW 3-Hydroxyacyl-CoA

3-Ketoacyt-CoA Fad/V L—CoASH

AcaB £-» Acvt-C

Acetvt-CoA ''2>

Enoyl-CoA A, A. ATP synthase И»

AOP P.

I" $

Рисунок 5. Основные пути метаболизма у Л. saccharovorans.

Жирным шрифтом отмечены используемые субстраты, ферменты и белки отмечены синим, высокоэнергетические интермедиаты (АТФ и др.) отмечены красным.

(А) - утилизация углеводов, (В) - утилизация белков, (С) - гликолиз (Э-М и Э-Д пути), (D) -метаболизм пирувата, (Е) синтез пентозо-фосфатов, (F) — цикл ß-окисления жирных кислот, (G) формирование протонного градиента с образованием АТФ, ТСА - цикл трикарбоновых кислот. Обозначения: POR, пируват:ферредоксин оксидоредуктаза; VOR, 2-кетоизовалерат: ферредоксин оксидоредуктаза; IOR, индол-пируват: ферредоксин оксидоредуктаза; KGOR, 2-кетоглутарат: ферредоксин оксидоредуктаза; ACS, ацетил коэнзим А синтетаза; SCS, сукцинил коэнзим А синтетаза; AOR, альдегид: ферредоксин оксидоредуктаза; НК, гексокиназа; PGI, фосфоглюко-изомераза; PFK, фосфофруктокиназа; FBA, фруктозо-1,6-бифосфат альдолаза; GAPOR, глицеральдегид-3-фосфат ферредоксин оксидоредуктаза; GAPN, нефосфорилирующая глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа; PGM, фосфоглицерат мутаза; PYK, пируват киназа; PPDK, пируват фосфат дикиназа; GDH, глюкоз-дегидрогеназа; GAD, глюконат дегидратаза; KDGK, 2-кето-З-дезокси-глюконат киназа; KD(P)GA, 2-кето-3-дезокси-(6-фосфо)глюконат альдолаза; GK, глицерат киназа; PHI, 6-фосфо-З-гексулоизомераза; HPS, З-гексулоз-6-фосфат синтаза; RPI, рибозо-5-фосфат изомераза; PPS, фосфорибозил пирофосфат синтаза; FOR, формальдегид: ферредоксин оксидоредуктаза; PEP, фосфоэноилпируват; Fd(ox), окисленный ферредоксин; Fd(red), восстановленный ферредоксин; FNOR, ферредоксин:NAD(P)+ оксидо-редуктазный комплекс; NSR, NAD(P)H:S° оксидоредуктаза; РР, Н+-пирофосфатаза; SQOR, сукцинат: хинон оксидоредуктазный комплекс; SR, сероредуктаза; Etf, электрон переносящий флавопротеин, Etf-QOR, электрон переносящий флавопротеин:хинон оксидоредуктаза; CoASH, коэнзим A; FadD, ацил-КоА лигаза; FadE, ацил-КоА дегидрогеназа; Fad, эноил-СоА гидратаза; Hbd, 3-гидроксил-КоА дегидрогеназа; FadA/AcaB, 3-кетоацил-КоА тиолаза.

перекись водорода и кислород. СОД кодируется геном Asac_0498, который был нами клонирован и экспрессирован в Е. coli. Биохимическая характеристика рекомбинантной СОД (Слуцкая и др., 2012), показала, что фермент относится к классу Fe-зависимых супероксиддисмутаз. Температурная денатурации фермента наблюдается при 107°С. СОД широко распространены у аэробных архей (Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus и др.) но крайне редко встречаются у анаэробов.

2. Органотрофные кренархеи порядков Desulfurococcales и Fervidicoccales

В лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН из термальных источников Камчатки были выделены три анаэробные органотрофные кренархеи - Desulfurococcus kamchatkensis 122In (Kublanov et. al. 2008), Thermogladius cellulolyticus 1633 и Fervidicoccus fontis (Perevalova et al., 2010). Первые две археи относятся к порядку Desulfurococcales, a F. fontis при его описании было предложено выделить в новый порядок, Fervidicoccales (Perevalova et al., 2010).

По своим физиологическим характеристикам эти три организма являются анаэробными органотрофами, растущими при нейтральных или умеренно-кислых рН (6-7). D. kamchatkensis и Т. cellulolyticus являются гипертермофилами (оптимальная температура 84°С) и способны расти на белках и некоторых сахарах. F. fontis растет только на белковых субстратах при более низких температурах (оптимально от 70°С до 75°С). Морфологически все три организма представляют собой неподвижные кокки диаметром около 1 цш.

В таблице 1 представлены основные характеристики геномов D. kamchatkensis, Т. cellulolyticus и F. fontis. Микроорганизмы имеют одну кольцевую хромосому размером 1.3-1.4 млн. нуклеотидов, внехромосомные элементы не обнаружены.

Таблица 1. Основные характеристики геномов

Характеристика D. kamchatkensis Т. cellulolyticus F.fontis

Размер генома, нт. 1 365 223 1 356 318 1 319216

С+С, % 45.3 56 37.5

Число идентифицированных ОРС 1474 1431 1405

Средняя длина ОРС, нт 818 866 821

Доля кодирующей последовательности (% генома) 88.4 91.4 87.4

ОРС с предсказанными функциями 1111 (75%) 1040 (72.7%) 960 (68.3%)

Уникальные ОРС 205 170 336

Гены тРНК (с интронами) 47(16) 46(15) 48(12)

Гены рРНК (* содержит интрон) 16S-23S, 5S 16S-23S*, 5S 16S-23S, 5S

СМБРК локусы 2 2 5

В результате сравнения трех геномов было определено количество общих генов (Рис. 6). Около 65% генов £). катс1га1кепх1.ч Т. се11и1о1уисия сходны, но только 40% генов /•". /ом1$ имеют гомологов в геномах двух других организмов. Эти результаты показывают, что по набору кодируемых белков К /ол?« существенно отличаются от представителей порядка Ое5иН'игососса1ех, что свидетельствует в пользу правомерности его выделения в отдельный порядок РетШсоссаЬв. Проведенный нами филогенетический анализ последовательностей 53 рибосомных белков также показал, что £). катскшкеп515 и Т. сеИиШуйсих являются близкородственными микроорганизмами в порядке Ое5и1Гигососса1ех, а К ¡опии формирует отдельную филогенетическую ветвь на дереве кренархей, расположенную вблизи «корня» порядка ОехиМигососса^ и АЫсШоЬа1ея (Рис. 3).

Desulfurococcus kamchatkensis (1471 genes)

Thermogladius cellulolyticus (1413 genes)

Рисунок 6. Сравнение наборов белок-кодирующих генов О. катс1га1кеп.^1.'1, Т. сеИиШуЫсм и /оШи. Общими считались белки, перекрывающиеся на более чем 80% аминокислотной последовательности, при е-Уа1ие меньше 1*10"'°.

В результате поиска мобильных элементов в геноме D. kamchatkensis были выявлены полноразмерные транспозоны, принадлежащих к двум семействам - ISC1913 (6 копий) и IS607 (1 копия). Три копии транспозонов семейства ISC1913 были обнаружено в геноме T. cellulolyticus. В геноме F. fontis полноразмерные транспозоны отсутствуют. Обнаружены MITE- элементы (miniature inverted repeat transposable element), которые являются производными как обнаруженных в геноме, так и неизвестных транспозонов, вероятно, уже элиминированных из генома. MITE элементы содержат концевые области «родительского» транспозона, но не центральные кодирующие участки. Транспозиция этих элементов зависит от активности ферментов «родительского» транспозона.

В геномах D. kamchtkensis, T. cellulolyticus и F. fontis обнаружены различные системы защиты генома от инвазии чужеродной ДНК, среди которых были обнаружены системы рестрикции-модификации, а также CRSIPR-локусы (Рис. 7). В геномах D. kamchatkensis и T. cellulolyticus было обнаружено по два CRSIPR локуса, содержащих 9 и 86, и 24 и 48 повторов, соответственно. В геноме F. fontis имеется

четыре локуса, содержащие 14, 18, 18 и 18 повторов. Последовательности спейсеров не совпадали ни с одним известным внехромосомным элементом архей, но одна последовательность спейсера СЫЗРЯ локуса Э. катс11Шкеп515 совпадала с З'-концевым участком гена 0кат_1260. Функция 0кат_1260 неизвестна, хотя гомологичные гены присутствуют в геномах некоторых других представителей Ое5иНишсосса1ез. Сходство спейсерной последовательности СЯКРЫ-локуса и последовательности собственного гена ставит вопрос о возможном механизме контроля экспрессии генов самого микроорганизма за счет активности СМвРЯ-локуса, подобно РНК интерференции в эукариотах.

А. Desulfurococcus kamchatkensis

ГИ I I I I I I l—^TTTTI I I I I I I I I 1

CRISP1 CRISP2

Б. Thermogladius cellulolyticus

CRISP2 (24)

GAAGCAATCAAGAAGAATTGAAAG

В. Fervidicoccus fontis

CRISP2 (18 repeats)

CRISP1 (14 repeats)

ctttcaattctotctgagagattc щ

INI II I — I I II

CRISP3

I I I I I I I I I

GAATCTCTCAGATAGAATTGAAAG

CRISP4 (18)

GAATCTGTTAGATAGAATTGAAAG

Рисунок 7. Схема CRISPR-локусов. Черными прямоугольниками отмечены CRISPR-локусы, в скобках указано число повторов, снизу приведена последовательность повтора. Стрелками указаны инвертированные повторы длиной 395 нт.

D. kamchatkensis, Т. cellulolyticus и F. fontis растут на различных белковых субстратах, что предполагает наличие у них термостабильных внеклеточных протеаз В геномах каждого из этих микроорганизмов было идентифицировано более двух десятков пептидаз/протеаз различных типов. Некоторые протеолитические ферменты, экспрессированные в Е. coli были функционально охарактеризованы. Так, субтилизин-подобная сериновая протеаза Dkam_l 144 из D. kamchatkensis, активная форма которой образовывалась в результате автопроцессинга пропептида, проявляла максимальную

активность при 90°С в присутствии ионов кальция и активировалась в присутствии 0.01% SDS. Протеаза Dkam_1144 обладает высокой термостабильностью, сохраняя свою активность в течение 4 часов инкубации при 80°С. Такие характеристики Dkam_1144 делают этот фермент перспективным для применения в различных областях биотехнологии.

В геномах D. kamchatkensis и Т. cellulolyticus найдены гены различных гликозил-гидролаз, что соответствует способности этих архей расти на некоторых полисахаридах. Так у них имеется набор ферментов, обеспечивающих гидролиз крахмала и родственных полимеров. Т. cellulolyticus, в отличии от D. kamchatkensis, может использовать в качестве субстратов различные виды целлюлозы, однако, гены известных целлюлозолитических ферментов в геноме Т. cellulolyticus не найдены. Поэтому, можно предположить, что у Т. cellulolyticus функционирует неизвестный механизм гидролиза целлюлозы. Более узкоспециализированным органотрофным метаболизмом, ориентированным на гидролиз белковых субстратов, характеризуется F. fontis, - его геном кодирует широкий спектр протеолитических ферментов при отсутствии ферментов, обеспечивающих гидролиз полисахаридов.

Анализ геномов выявил наличие генов, кодирующих все ферменты метаболизма глюкозы по модифицированному пути Эмбдена-Мейергофа. В отличие от А. saccharovorans, в геномах D. kamchatkensis и Т. cellulolyticus и F. fontis отсутствуют гены ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, что ограничивает возможности метаболизма этих архей по пути брожения и не позволяет им полностью окислять органические субстраты даже в присутствии внешнего акцептора электронов (напр. S0). Отсутствие ферментов известных циклов автотрофной фиксации углерода согласуется с неспособностью этих микроорганизмов к автотрофному росту.

Согласно результатам геномного анализа D. kamchatkensis, Т. cellulolyticus и F. fontis могут синтезировать АТФ как за счет субстратного фосфорилирования, так и в процессе окислительного фософорилирования с помощью АТФ синтаз, использующих для синтеза АТФ трансмембранный ионный градиент. У всех трех микроорганизмов протонный градиент может создаваться за счет окисления восстановленного ферредоксина мультисубъединичными мембран-связанными комплексами двух типов. Комплекс первого типа, энерго-преобразующая гидрогеназа (MBH), использует восстановленный ферредоксин в качестве донора электронов и переносит их на протоны как акцептор электронов, образуя водород. При этом происходит перенос протонов через мембрану и образуется протонный градиент. Помимо MBH трансмембранный протонный градиент может быть создан мембран-связанной

4>eppeflOKCHH:NADPH оксидоредуктазой (MBX), которая окисляет ферредоксин и восстанавливает NADP+ с генерацией протон-движущей силы. Перенос электронов на серу с образованием водорода может осуществлять растворимая NAD(P)H: полисульфид оксидоредуктаза или аналогичный фермент, окисляющий NAD(P)H с образованием H2S. Сера не стимулирует рост F. fontis, что согласуется с отсутствием в его геноме явных гомологов генов ферментов, окисляющих NAD(P)H и восстанавливающих серу. Другие потенциальные акцепторы электронов (сульфат, нитрат, тиосульфат) D. kamchatkensis, Т. cellulolyticus и F. fontis не используются, что согласуется с отсутствием генов, кодирующие соответствующие редуктазы.

Наряду с мембран-связанными гидрогеназами, у Т. celluloyticus и F. fontis имеется цитоплазматическая гидрогеназа, относящаяся к группе ЗЬ [№Рс]-гидрог еназ. Донором электронов для этих бинаправленных гидрогеназ является NADPH. Гидрогеназы этого типа ранее не были описаны в археях.

Образованный в результате активности мембранных комплексов MBH и МВХ протонный градиент используется AiA0 АТФ-синтазой для синтеза АТФ. Анализ аминокислотных последовательностей «роторных» субъединиц АТФ-синтазы D. kamchatkensis и Т. cellulolyticus выявил наличие консервативных остатков, участвующих в связывании Na+ в Na+-ATO синтазах. Это означает, что транспортируемым ионом в АТФ-синтазах этих двух микроорганизмов является Na+. Это может объяснять наличие натрий-протонных антипортеров. Ранее была выдвинута гипотеза о том, что ионы натрия имеют ряд преимуществ над протонами в качестве сопряженных ионов при росте в анаэробных высокотемпературных местообитаниях (Pisa et al., 2007). Возможно, натрий-зависимые биоэнергетические процессы в гипертермофильных археях определяют их адаптацию к внешним условиям. Растущий при более низких температурах F. fontis имеет Независимую АТФ-синтазу.

3. Геномы трех кренархей порядка Thermoproteales

Представители родов Vulcanisaeta, Pyrobaculum и Thermoproteus вместе с Thermocladium, Caldivirga и Thermofilum образуют порядок Thermoproteales филума Crenarchaeota, объединяющий термофильных кренархей, имеющих клетки палочковидной формы. Этот порядок является эволюционно наиболее древним среди гипертермофильных кренархей. Три новых вида архей порядка Thermoproteales были выделены сотрудниками ИНМИ РАН: Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 и Thermoproteus uzoniensis 768-20 из сульфатары, расположенной в вулкане Мутновский на Камчатке

(Ргоко1'е\'а е1 а1., 2005), а новый штамм РугоЬасиШт ер. 1860 - из озера Фумарольное кальдеры вулкана Узон.

Основные характеристики геномов этих трех микроорганизмов представлены в таблице 2. Размеры геномов значительно больше, чем у архей порядка ОевиИцгососса^ и составляют от 1.9 млн нуклеотидов у Т. uzoniens¡s до 2,5 млн. нуклеотидов у РугоЬасиШп ер. 1860. Соответственно, больше и общее число предсказанных белок-кодирующих генов. Все геномы содержат по одному рибосомному оперону, включающему гены 168 и 23Б рРНК, а также отдельно расположенный ген 58 рРНК.

Таблица 2. Основные характеристики геномов

Характеристики V. тоШпоупИа 768-28 Т. иготетхз 768-20 РугоЬасиШт ер. 1860

Размер генома, нт. 2 298 983 1 936 063 2 467 972

а+с, % 42,4 59,7 57

Число идентифицированных ОРС 2320 2188 2828

Доля кодирующей последовательности (% генома) 88.0 91.3 89.7

ОРС с предсказанными функциями 1496 1441 1460

Гены рРНК (* содержит интроны) 168-238 и 5Б 168-238 и 5Э 168*-238 и

СИКРИ локусы 4 0 8

В гене 165 рРНК РугоЬасиШт ер. 1860 найдено три интрона длиной 717, 785 и 602 нт. У других представителей РугоЬасиЫш в генах 16Б рРНК может содержаться 1-2 интрона. В интронах гена 165 рРНК РугоЬасиШт ¡р. 1860 найдены три гена, кодирующие интронные хоминг-эндонуклеазы. Предполагается, что присутствие этих генов в последовательностях интронов архей указывает на инфекционную природу интронов (ПоЬ е1 а12003).

В результате поиска ОЖРЯ-систем в геномах V. тоШптИа и РугоЬасиШт ер. 1860 были идентифицированы 4 и 8 СЯКРЯ кластеров, соответственно. В геноме Т. иготеп51$ СЯКРЯ локусов не содержится, что необычно для гипертермофильных архей. Отсутствие СЯКРЯ системы коррелирует с практически полным отсутствием в геноме Т. иготетгз генов транспозаз и интеграз, которые указывали бы на наличие мобильных элементов или их остатков. Возможно, отсутствие СМ5РЯ системы и мобильных элементов у Т. 1Котеп515 обусловлены особенностями экологической ниши, занимаемой этой археей, в которой возможно отсутствуют вирусы и другие мобильные элементы. Альтернативным объяснением может являться наличие другой эффективной системы защиты генома от чужеродной ДНК, что делает СМБРЯ систему ненужной.

Мы провели попарные сравнения геномов V. moutnivskia и Т. uzoniensis с геномами близкородственных им микроорганизмов (Рис. 8). Ближайшим родственником V. moutnovskia является V. distributa DSM 14429, геном которого был секвенирован в Joint Genome Institute (Mavromatis et al., 2010). Около 11% предсказанных белков V. moutnovskia имеют сходство с белками, кодируемыми геномом V. distributa, а 72% предсказанных белков Т. uzoniensis 768-20 имеют сходство с белками его ближайшего родственника Т. tenax, геном которого был опубликован в 2011 году.

Сравнение полных геномных последовательностей V. moutnovskia и V. distributa, а также Т. uzoniensis и Т. tenax выявило не только сходство последовательностей отдельных генов, но и сохранение порядка генов на протяжении крупных участков хромосомы (синтению), что характерно для близкородственных микроорганизмов (Рис. 8). Наибольшее сходство, как по набору генов, так и по порядку их расположения было обнаружено при сравнении геномов V. moutnovskia и V. distributa. Эти геномы отличаются четырьмя крупными инверсиями (Рис. 9). Число перестроек между геномами Т. uzoniensis и Т. tenax значительно больше, но синтения на протяжении крупных фрагментов геномов также прослеживается.

Vutcanisa&ta moutnovskia 768-28 2298983 нт Т. UZOPienSiS 768-20 1936063 нт

Vulcanisaata distributa DSM 14429 2374137 нт Т. tenax 1841542 нт

Рисунок 8. Локализация гомологичных участков в геномах.

Сравнение выполнено по протоколу BLASTN (e-value < 1е-10) и визуализировано с помощью WebACT tool (http://www.webact.org/WebACT/home). Для удобства визуализации начальная точка смещена в положение 1.413.820 нт. в последовательности генома V. moutnovskia (GenBank СР002529) и в положение 588.199 нт в геноме V. distributa (GenBank NC014537), в положение 400 000 нт. в последовательности генома Т. uzoniensis 768-20 (GenBank NC_015315), координаты в последовательности генома T.tenax (GenBank FN869859) не изменяли.

Сравнение геномов V. moutnovskia и V. distributa выявило уникальные участки, имеющиеся лишь в одном из геномов. Большая часть генов, расположенных в этих районах, кодирует белки с неизвестными функциями, отсутствующие в геномах других архей; их появление может быть результатом интеграции неизвестных вирусов или мобильных элементов (хотя не исключены и связанные с использованием разных программ артефакты аннотации, особенно для коротких генов). Так, из 540 генов

У.тоШпоуяМа, отсутствующих в геноме V. сИ&пЬша, 365 составляли гены гипотетических белков, не имеющих гомологов в базах данных, а 15 - гены транспозаз. На вирусную природу генов гипотетических белков во многих случаях указывает их кластерное расположение в геноме. Это согласуется с тем, что большинство белков вирусов архей не имеют гомологов в базах данных. Однако, в некоторых случаях появление «уникального» района в одном геноме отражает делецию соответствующего участка генома у другого анализируемого организма, что проявляется в потере определенных свойств.

Анализ путей метаболизма у V. тои№ога£;а, Т. игатепх1х и РугоЬасиШт ер. 1860 выявил наличие различных гидролитических ферментов, которые могут обеспечивать утилизацию белковых субстратов и некоторых Сахаров, что соответствует спектру используемых для роста субстратов. У этих трех архей метаболизм глюкозы может осуществляться через модифицированные пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова. Образовавшийся пируват может окисляться пируват:ферредоксин оксидоредуктазой до ацетил-СоА и далее до ацетата ацетил-СоА синтетазой с образованием АТФ. Конверсия пирувата в ацетил-СоА у Т. игошеп.ш и РугоЬасиШт вр. 1860 может также осуществляться пируват-дегидрогеназным комплексом, который используется для этой цели у эукариот и большинства аэробных бактерий. У V. тоМпоузИа этот комплекс отсутствует. Возможно, его приобретение в процессе эволюции ТЪегторгмеа^ произошло после разделения рода Уикашйа^а и общего предшественника ТЬегторгШеия и РугоЬаси1ит.

В каждом из трех геномов были обнаружены гены внеклеточных эстераз и набора ферментов пути бета-окисления жирных кислот, что предполагает возможность использования этими археями липидов. В геноме V. тоШпоуяЫа также кодируется глицерол-киназа, что позволяет этой архее использовать не только жирные кислоты, но и глицерин, образующийся при гидролизе триглицеридов.

Энергия может запасаться как в процессах субстратного фосфорилирования, так и анаэробного дыхания в присутствии внешнего акцептора электронов. Образующийся в результате метаболизма Сахаров, белков и жирных кислот ацетил-СоА может не только сбраживаться до ацетата, но и окисляться до СО2 в ходе анаэробного дыхания. Для этого в геномах V. тоШпо\<$Иа, Т. игошеш13 и РугоЬасиШт ер. 1860 кодируется полный набор ферментов окислительного цикла трикарбоновых кислот. Анализ геномов Т. игоп1еп515 и РугоЬасиШт ер. 1860 позволяет предсказать способность этих архей осуществлять автотрофную фиксацию СО2 благодаря наличию восстановительного

цикла трикарбоновых кислот и дикарбоксилат/4-гидроксибутиратного цикла. В геноме V. moutnovskia ключевые ферменты циклов автотрофной фиксации ССЬ отсутствуют.

Особенностью Т. uzoniensis, предсказанной в результате анализа генома, является способность к автотрофному росту за счет анаэробного окисления водорода, связанного с восстановлением серы (hydrogen-sulfur autotrophy). Окисление водорода (Н2 > 2Н+ + 2е ) и восстановление серы (2Н+ + 2е" + S° > H2S) осуществляются мембран-связанными гидрогеназой и сероредуктазой; их совместное функционирование в короткой электрон-транспортной цепи приводит к переносу протонов из клетки и к образованию трансмембранного градиента протонов, используемого для синтеза АТФ. Аналогичные кластеры генов, кодирующих сероредуктазу и гидрогеназу, имеются и в геноме V. distributeг, однако, в геноме V. moutnovskia делетированы два из трех генов, кодирующих субъединицы сероредуктазы, гидрогеназа также отсутствует (Рис. 9).

2164 2165 2166 2167 2168 2169 2170 2171

Рисунок 9. Локус, кодирующий мембран-связанную сероредуктазу у V. distributa (вверху) и соответствующий участок генома V. тоМпоуяИа (внизу). Гены, кодирующие субъединицы сероредуктазы, указаны серыми стрелками, гены с неизвестными функциями, - незакрашенными стрелками.

В процессах анаэробного дыхания в присутствии акцептора электронов восстановленный ферредоксин, NAD(P)H и водород, могут быть окислены в результате согласованной работы набора мембран-связанных оксидоредуктазных комплексов и цитоплазматических редуктаз, приводящей к образованию трансмембранного протонного градиента. Все три генома кодируют протон-транспортирующие ферредоксин: НАО(Р)+ оксидоредуктазные комплексы, получающие электроны от восстановленного ферредоксина и передающие их на КАО(Р)+ и/или на хиноны дыхательной цепи и далее на мембран-связанные редуктазы. В геномах V. тоШпоУ5Ша и Т. игош'елл'.? кодируется ЫАО(Р)Н:8 оксидоредуктаза ШИ, которая может окислять восстановленный НАО(Р)Н с образованием сероводорода. В геноме РугоЬасиЫт ер. 1860 отсутствует гены цитоплозматической ШИ и мембран-связанной сероредуктазы, что согласуется с тем, что этот микроорганизм не восстанавливает серу.

sreB doxD doxA

У V. moutnovskia, Т. uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860 имеются различные терминальные оксидоредуктазы. Так, Т. uzoniensis кодирует мембран-связанную сероредуктазу, а также цитохром bd и цитохром с оксидазы. Особенностью V. moutnovskia является наличие полного набора генов, кодирующих ферменты пути восстановления сульфатов, редко встречающегося у архей и на сегодняшний день описанного только у эуриархеи Archaeglobus fulgidus и кренархеи Caldivirga maquilingensis. Наиболее широкий спектр мембран-связанных оксидоредуктаз, которые могут служить конечными акцепторами электронов при анаэробном дыхании, обнаружен у Pyrobaculum sp. 1860. Это цитохром-оксидазы различных типов, нитрат редуктаза NarG-типа, цитохром с нитрит редуктаза, NO-редуктаза, цитохром с редуктаза закиси азота, редуктаза оксида железа Fe(III) цитохром с типа, и молибдоптериновые оксидоредуктазы Psr/Phs семейства, которые могут восстанавливать арсенат, тиосульфат или полисульфид. Нитрит редуктаза кодируется двумя расположенными рядом генами (Р18б_0727 и Р186_0728); анализ их нуклеотидных последовательностей показал, что удаление одного нуклеотида может приводить к восстановлению рамки считывания. Это может указывать на наличие в этом гене потенциального сайта программируемого сдвига рамки считывания. Реальная физиологическая роль терминальных оксидоредуктаз у Pyrobaculum sp. 1860 является предметом изучения, поскольку экспериментально была показана только способность Pyrobaculum sp. 1860 восстанавливать нитрат, оксид железа (III) и арсенат.

Таким образом, у V. moutnovskia, Т. uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860 функционируют разветвленные дыхательные цепи. По-видимому, в зависимости от условий окружающей среды эти микроорганизмы используют оптимальные акцепторы электронов. Во всех трех микроорганизмах протонный градиент, являющийся результатом действия протонных насосов и пирофосфатазы, может использоваться АТФ-синтазой А|А0 типа для синтеза АТФ, сопряженного с переносом протонов в клетку. Этот фермент может действовать в обоих направлениях. При росте в отсутствие внешних акцепторов электронов активности протонных насосов может оказаться недостаточно для создания протонного градиента, необходимого для поддержания нормального внутриклеточного pH в условиях кислой среды. В этом случае дополнительный протонный градиент может генерироваться обратной активностью АТФазы, действующей как протонный насос за счет гидролиза АТФ, синтезированного в реакциях субстратного фосфорилирования.

4. Thermofilum carboxydotrophus, карбоксидотрофная кренархея порядка Thermoproteales.

Анаэробная кренархея Thermofilum carboxydotrophus 1505 была выделена из горячего источника, расположенного вблизи вулкана Мутновский, Камчатка. Культура растет в анаэробной среде, содержащей 100 мг/ji дрожжевого экстракта, в присутствии 45% СО в газовой фазе (Sokolova et al., 2009). В процессе роста СО полностью потреблялся с образованием молекулярного водорода и СОг. T. carboxydotrophus является первым представителем Crenarchaeota, способным к гидрогеногенной карбоксидотрофии (реакция СО + Н20 > С02 + Н2). Это свойство широко распространенно среди бактерий типа Firmicutes, но крайне редко встречается у архей.

Геном Т. carboxydotrophus является кольцевой хромосомой длиной 1.754.192 нт и не содержит внехромосомных элементов. Содержание G+C составляет 46.4 %. Было идентифицировано 2013 потенциальных генов, покрывающих 89.7% хромосомы, из них 1969 - кодирующих белки. В результате сравнения с базами данных аминокислотных последовательностей с различной степенью детализации и достоверности были предсказаны функции 66% предполагаемых белков. 320 предсказанных белков являются специфичными для Т. carboxydotrophus и не имеют сходства с последовательностями, представленными в GeneBank.

Геном содержит одну копию рибосомного оперона, включающего гены 16S и 23S РНК, а также отдельно расположенный ген 5S рРНК. Гены рибосомных РНК не содержат интронов, однако, интроны были найдены в половине идентифицированных генов тРНК. В геноме Т. carboxydotrophus найдено 9 CRISPR локусов, 8 из них расположены в одном участке генома размером около 300 т.п.н. У Т. carboxydotrophus найдено только 4 гена, кодирующих необходимые для функционирования CRISPR-системы Cas белки, т.е. минимальный набор cas-генов, найденных в других организмах, по-видимому, отсутствует. Поэтому можно предположить, что CRISPR-система у Т. carboxydotrophus не функционирует.

В результате сравнения наборов белок-кодирующих генов установлено, что ближайшим родственным T. carboxydotrophus микроорганизмом с известной полной геномной последовательностью является Т. pendens. Около 65% предсказанных белков Т. carboxydotrophus (-1300 белков) имеют сходство с белками Т. pendens. Сравнение полных геномных последовательностей Т. carboxydotrophus и Т. pendens (Рис. 10) выявило сохранение порядка генов на протяжении крупных участков хромосомы. Однако, распределение такой синтении в геномах не равномерно - на протяжении примерно 3/4 длины геномы в основном колинеарны, а оставшиеся фрагменты сильно

различаются (Рис. 10). У Т. carboxydotrophus этот «видоспецифический» участок включает 577 белок-кодирующих генов. Среди этих белков только 35 % (-200 белков) имеют гомологию с белками Т. pendens, это в два раза ниже, чем в среднем по геному. Большая часть генов этого района кодирует белки с неизвестными функциями, отсутствующие в геномах других архей. Появление таких генов может быть результатом интеграции крупных фрагментов чужеродной горизонтально перенесенной ДНК и геномных перестроек.

Т. carboxydotrophus

t— L«™ ь— t— и- к— t— Рисунок 10. Локализация

гомологичных участков в геномах Т.

Icarboxydotrophus и Т. pendens.

Сравнение выполнено по протоколу BLASTN (е-value < 1е-10) и визуализировано с помощью WebACT tool. Для удобства визуализации начальная точка смещена в положение 1.123.000 нт. в последовательности генома Т. carboxydotrophus, а для генома Т. pendens показана комплементарная i™, ,,«„ ь«.. i™ i™.. [™ i™ i„„.„ последовательность.

Т. carboxydotrophus растет на пептоне и глюкозе в присутствии дрожжевого экстракта и серы. Анализ генома выявил гликолитические и протеолитические ферменты, а также транспортеры Сахаров и пептидов. Особенностью Т. carboxydotrophus является то, что абсолютное большинство гидролитических ферментов являются внутриклеточными. Например, из 14 гликозил-гидролаз лишь один фермент семейства ОН57 имеет сигнальную последовательность, что может предполагать его внеклеточное функционирование. В геноме кодируется большое количество различных транспортеров Сахаров и пептидов, в том числе ферменты фосфотрансферазной системы транспорта углеводов, редко встречающейся у архей. Все это указывает на то, что рост Т. carboxydotrophus обеспечивается не за счет гидролиза внеклеточных полисахаридов и сложных белковых субстратов, а, в первую очередь, за счет эффективного транспорта и использования низкомолекулярных соединений, присутствующих в среде.

Основные пути центрального метаболизма у Т. carboxydotrophus сходны с таковыми у проанализированных представителей Оеви^игососсаЬз (Рис. 12). Метаболизм глюкозы может осуществляться посредством модифицированного пути

Т. carboxydotrophus

[17ЛПГ [лздооо £ОППП - -П li"'w [l4n(1",nf [lsrinn [l?

i-»' „fa,,.1,ЕтI is 4т ь""™ &

Т. pendens

Эмбдена-Мейергофа. В отличие от других Thermoproteales, у Т. carboxydotrophus отсутствуют путь Энтнера-Дудорова и цикл трикарбоновых кислот.

Анализ генома выявил два мембран-связанных оксидоредуктазных комплекса. Первый комплекс подобен MBH гидрогеназе, окисляющей восстановленный ферредоксин с образованием водорода и переносом протонов через мембрану. Второй МВХ-подобный комплекс формирует протонный градиент за счет окисления ферредоксина и восстановления NADP+. Образуемый NADPH может в дальнейшем окисляться NAD(P)H:S оксидоредуктазой с образованием H2S. Восстановление серы также может осуществляться посредством мембран-связанной сероредуктазы, которая может получать электроны от хинонов дыхательной цепи или мембран-связанной гидрогеназы.

Еще одной особенностью Т. carboxydotrophus, указывающей на его способность использовать продукты деятельности других микроорганизмов, является наличие пути ассимиляции глицерина, который может образовываться, в частности, в результате гидролиза присутствующих в среде триглицеридов липолитическими ферментами. Глицерин может фосфорилироваться, а затем окисляться мембран-связанной глицерол-3-фосфат дегидрогеназой, которая может переносить электроны на хиноны дыхательной цепи. Образованный гидроксиацетон-фосфат может утилизироваться по пути Эмбдена-Мейергофа.

Т. carboxydotrophus является единственной известной кренархеей, способной к росту на СО с образованием Нг и С02. Ранее анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофы были описаны в основном среди бактерий типа Firmicutes. Среди архей это тип метаболизма был обнаружен у некоторых представителей эуриархей рода Thermococcus. В результате анализа генома Т. carboxydotrophus был выявлен кластер генов (Ther_0860 - Ther_0871), кодирующих СО-дегидрогеназу (CODH). Этот кластер включает транскрипционный регулятор и гены, кодирующие субъединицы CODH: электрон-транспортную CooF, каталитическую CooS, вспомогательную субъединицу СооС, субъединицы гидрогеназы С00М, C00U, С00Н, C00L, С00К и СооХ. Организация кластера генов CODH у Т. carboxydotrophus сходна с таковой у эуриархей рода Thermococcus (Рис. 11), что указывает на горизонтальный перенос этого кластера между Т. carboxydotrophus и Thermococcus. Первоначальным источником этих генов, вероятно, были термофильные карбоксидотрофные бактерии филума Firmicutes.

Каталитическая субъединица СО-дегидрогеназы Т. carboxydotrophus, CooS, имеет высокую гомологию с CooS (THERMP_01153) из Thermococcus barophilus МР (74% идентичности), а также функционально охарактеризованным CooS из Carboxydothermus

hydrogenoformans (Chy_0085) и Rhodospirilum rubrum. CODH комплекс Rhodospirilum rubrum принимает участие в CO-зависимой цепи переноса протонов. СО-дегидрогеназа окисляет СО до СО2, используя Н20, и переносит электроны на протоны с образованием водорода, энергия генерируется в виде трансмембранного протонного градиента (Рис. 12).

М . К , L, X , U. Н

Rhodospirillum rubrum

с, М к К. L. X .и. Н . . F. S .

-гА| УТИП-ЮИ-V Carboxydothermus

—Г-/—ГТ^Т~Т f~ll-/ hydrogenoformans

Thermococcus AM4 '. barophilus onnurineus

Thermofilum carboxydotrophus

Рисунок 11. Организация кластера CODH генов у карбоксидотрофных архей и бактерий филума Firmeutes.

На основании геномных данных можно предположить, что Т. carboxydotrophus использует СО не только как источник энергии, но и как источник углерода. Геном содержит ген рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы, ключевого фермента автотрофной фиксации углекислого газа в цикле Кальвина. Также в геноме кодируются ферменты, участвующие в преобразовании рибозофосфатной группы аденозинмонофосфата (АМФ) в рибулозо-1,5-бисфосфат: АМФ фосфорилаза и рибозо-1,5-бисфосфат изомераза. В условиях недостатка гетеротрофных субстратов и ограниченного образования COi в процессах катаболизма, СОг, образуемый в результате действия CODH, может быть субстратом для рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы (Рис. 12).

Культивирование Т. carboxydotrophus требует присутствия в среде дрожжевого экстракта, что указывает на потребность микроорганизма в сложных соединениях. Более того, другой представитель этого рода, Т. pendens, требует для роста клеточных экстрактов археи Т. tenax, что указывает на потерю многих биосинтетических процессов. Как и в случае Т. pendens (Anderson et al., 2008), анализ генома Т. carboxydotrophus указывает на потерю способности синтезировать многие метаболиты, в том числе пурины, большинство кофакторов и аминокислот. Из 125 COG (Clusters of

Ortologous Groups), кодирующих биосинтетические ферменты у архей (Anderson et al., 2008), в геномах Т. pendens и Т. carboxydotrophus имеются гены лишь 11 ферментов. Такая потеря биосинтетических путей характерна для некоторых облигатных паразитов (например Rickettsia). Вероятно, Т. carboxydotrophus оптимальным образом приспособлен для получения необходимых им метаболитов из содержащей разнообразную органику среды термального источника.

Рисунок 12. Основные пути метаболизма Т. carboxydotrophus.

(А) - утилизация Сахаров, (В) — утилизация белков, (С) - гликолиз (Э-М) и глюконеогенез, (О) -метаболизм пирувата, (Е) - синтез пентоз-фосфатов, (Р) формирование протонного градиента с образованием АТФ.

5. Эуриархея Ткегтососсия siЫricus, выделенная из пластовых вод нефтяного резервуара

Представители рода Пег/пососсм широко распространены в наземных и морских гидротермах, а также в пластовых водах подземных нефтяных месторождений. Гипертермофильная анаэробная эуриархея Пегтососсия 51Ыпси5 ММ 739 была выделена из пластовых вод высокотемпературного нефтяного месторождения Самотлор в Западной Сибири (МповЬшсЬепко е1. а!., 2001). Температура вод в месте

выделения (глубина 2350 метров) составляла около 84°С. Вместе с родами Pyrococcus и Palaeococcus, Thermococcus относится к эуриархейному порядку Thermococcales. Большинство Thermococcales являются органогетеротрофами, растущими на белках и некоторых углеводах, используя серу или протоны в качестве акцепторов электронов.

Ранее были определены геномные последовательности нескольких представителей Thermococcales, выделенных из морских гидротерм. В отличие от них T. sibiricus был выделен из пластовых вод высокотемпературного нефтяного резервуара. Такие места обитания характеризуются низким уровнем растворенного органического углерода и следовыми количествами свободных аминокислот. Тем не менее, первоначально T. sibiricus был описан как анаэроб, сбраживающий белковые субстраты (Miroshnichenko et al. 2001). Этот организм был найден в изолированном нефтесодержащем горизонте Юрского периода, причем в это месторождение вода искусственно не закачивалась. Оптимальные условия роста T. sibiricus (температура, рН и соленость) соответствуют условиям месторождения. Поэтому можно предположить, что T. sibiricus является аборигенным микроорганизмом для нефтесодержащего горизонта, что предполагает его выживание с момента образования месторождения и адаптацию его метаболизма к условиям подземного резервуара. Результаты анализа генома T. sibiricus позволяют объяснить способность этой археи расти в такой экологической нише.

Геном T. sibiricus имеет длину 1.845.800 нт., содержит одну копию оперона 16S-23S рРНК и две копии гена 5S рРНК, расположенных удалено от 16S-23S оперона. Было найдено 46 генов тРНК для 20 аминокислот, распределенных по всей длине генома. В геноме идентифицировано 2061 потенциальных белок-кодирующих генов со средней длиной 815 нт, покрывающие 91% генома. Функции 1413 (69%) белков могут быть предсказаны с различной степенью достоверности и детализации в результате сравнения с базами данных. Функции остальных 648 (31%) предсказать по аминокислотной последовательности не представляется возможным, причем 181 ген является уникальным для T. sibiricus.

На рисунке 14 представлены диаграммы, иллюстрирующие количества белок-кодирующих генов T. sibiricus, гомологи которых присутствуют в геномах других представителей порядка Thermococcales. Полученные данные показывают, что около 70% (1480) белков имеют гомологов кодируемых в геномах T. kodakaraensis и Т. onnurineus (Рис. 13). Из них 1024 белка имеются у всех трех известных представителей рода Pyrococcus. Можно предположить, что этот общий набор генов имелся у общего предка архей порядка Thermococcales. Около 387 белков T. sibiricus отсутствуют у

других представителей порядка ТЬегтососсакв, и хотя функции большинства из этих белков неизвестны, среди них есть ферменты, которые могут обеспечивать специфические особенности метаболизма Т. .^¡Ыгких (см. ниже).

Первоначально, согласно микробиологическим данным, Т. зШтсш был описан как анаэроб, сбраживающий белковые субстраты. В результате анализа генома Т. я"ЬМсих было найдены гены для 281 белков с сигнальными последовательностями на М-конце. Большинство из них были аннотированы как транспортные белки, протеазы, гликозил гидролазы, липазы/эстеразы. В результате геномного анализа были выявлены секретируемые ферменты, которые могут обеспечивать рост Т. ¡¡Ыпсих на других субстратах, помимо белков. В ИНМИ РАН была экспериментально проверена предсказанная в результате анализа геномных данных способность Т. ¡Шпсиз расти на других субстратах. В результате была подтверждена возможность роста на мальтозе, декстране, целлюлозе, целлобиозе, агарозе, гексадекане, ацетоне, оливковом масле и глицерине.

Т.зЬМыв Т.кос/акагает/з ТяЪМсиз Т.коеЗакагаепЁ/э

Рисунок 13. Сравнение наборов белок-кодирующих генов Т. зШпсш и других представителей порядка ТЬегтососсаЬв.

Анализ геномных данных показал, что определенный участок генома Т. ¡¡Ыпсих (нт 308742 - 328657, соответствует генам Т51Ь_0320-Т51Ь_0334), содержит набор генов, кодирующих ферменты, существенные для использования целлюлозы, ламинарина, агара и других Р-связанных полисахаридов (Рис. 14). Этот «сахаролитический остров» кодирует ферменты для внеклеточного гидролиза этих субстратов, транспорта олигосахаридов в клетку и их последующего расщепления до мономеров: две внеклеточные и одну внутриклеточную эндо-р1,4-глюканазы, целлобиоз-фосфорилазу, внеклеточную ламинариназу (эндо-р 1,3-глюканазу), р-галактозидазу, внеклеточную

ß-агаразу, ß-гликозидазу и транспортную систему АВС-типа для ß-гликозидов. Ближайшие гомологи этих ферментов (за исключением ß-агаразы) были найдены у бактерий рода Thermotoga, однако этот регион отсутствует у близких родственников Т. sibiricus - Т. kodakaraensis и Т. onnurineus (Рис. 14). В Т. sibiricus этот «сахаролитический остров» расположен в кластере генов рибосомных белков, который имеется и у Т. kodakaraensis и Т. onnurineus. Все эти данные свидетельствует о том, что "сахаролитический остров" был горизонтально перенесен в геном Т. sibiricus из неизвестной термофильной бактерии, возможно, близкой к Thermotoga. Также нельзя исключить архейного происхождения этого «острова», поскольку предполагается, что значительная фракция генов Т. maritima (более 20%) является результатом горизонтального переноса из геномов термофильных архей.

7573 7509

Цс^^ХуО*^ Т. kodakaraensis

УО

А V—I ^ Т. onnurineus 317 ,, 337

337

Т. sibiricus

308 310 312 314 316 318 320 322 324 326 328 kb Рисунок 14. «Сахаролитический остров» в геноме Т. sibiricus.

Гены, показанные синим цветом, встречаются во всех геномах Thermococcus. Гены не участвующие в деградации полисахаридов или с неизвестной функцией обозначены желтым. Гены, кодирующие сахаролитические ферменты, представлены светло зеленым; гены транспортной системы АВС-типа отмечены темно зеленым цветом.

Еще одним вероятным результатом горизонтального переноса генов у Thermococcales является имеющий размер около 16 тпн кластер генов деградации мальтозы и трегалозы, найденный в геномах Р. furiosus и Thermococcus litoralis. Аналогичный локус имеется в геноме Т. sibiricus (нт 340628 - 356664, соответствует генам Tsib_0356-Tsib_0369), причем порядок генов совпадает с порядком генов в геноме Р. furiosus. Этот кластер генов кодирует предполагаемую трегалоз-синтазу, гликоген-расщепляющий фермент и гликозидазу. Он также содержит гены двух высоко аффинных транспортных систем АВС-типа для а-гликозидов.

В геноме Т. sibiricus обнаружено 15 генов, кодирующих липазы/эстеразы, четыре из которых содержат сигнальные пептиды, что предполагает их внеклеточную активность. Один из этих генов, кодирующий липазу, Tsib_1424, был нами клонирован, экспрессирован в Е. coli и полученный рекомбинантный белок был функционально

охарактеризован. Было установлено, что Tsib_1424 может гидролизовать производные п-нитрофенила с различной длиной цепи при температурах 50-70°С, т.е. проявляет липолитическую активность. В соответствии с этими данными было обнаружено, что Т. sibiricus растет на оливковом масле, основным компонентом которого является триолеин. Это свойство крайне редко встречается у архей. Гидролиз триглицеридов липазами приводит к образованию глицерина и жирных кислот. Т. sibiricus растет на глицерине, но не на длинноцепочечных жирных кислотах, что согласуется с отсутствием пути ß-окисления жирных кислот. Следовательно, рост на оливковом масле является результатом утилизации глицерина, образующегося в результате гидролиза липидов.

Центральный метаболизм глюкозы в Т. sibiricus может осуществляться с помощью ферментов пути Эмбдена-Мейергофа. Образовавшийся пируват может быть в дальнейшем окислен до СОг в результате совместного действия пируват.формиат лиазы и формиат:гидроген-лиазного комплекса, а также может окисляться пируват:ферредоксин оксидоредуктазой.

Т. sibiricus способен запасать энергию с помощью субстратного фосфорилирования и анаэробного дыхания. Основным механизмом сохранения энергии Т. sibiricus является образование протонного градиента тремя мембранными комплексами, сходными с NADH:xhhoh оксидоредуктазой. Это два мембран-связанных гидрогеназных комплекса МВН1 и МВН2, а также мембран-связанный NADP+ -восстанавливающий комплекс МВХ, связанный с восстановлением серы. Повторное окисление образованного NADPH может осуществляться NADPH:S° оксидоредуктазой, которая переносит электроны на серу и образует H2S. Донором электронов для MBH и МВХ комплексов, вероятно, является восстановленный ферредоксин, который образуется в ферредоксин-зависимых реакциях в процессе окислении углеводов и белков. Функционирование Нг-образующих гидрогеназ MBH типа подтверждается образованием Нг во время роста Т. sibiricus в отсутствии So как акцептора электронов. В отсутствии серы Т. sibiricus, вероятно, запасает энергию с помощью МВН1 и МВН2, а в присутствии серы - с помощью МВХ-комплекса.

Сформированный за счет работы МВН1, МВН2, и МВХ трансмембранный протонный градиент может быть использован АТФ синтазой для синтеза АТФ. В геноме Т. sibiricus кодируется одна АТФ синтаза, транспортирующая ионы натрия. Отметим, что для роста Т. sibiricus требуется довольно высокая соленость (оптимум при 20 г/л NaCl).

Рисунок 15. Основные пути метаболизма Т. зШпсив.

(А) - утилизация Сахаров, (В) - утилизация белков, (С) - гидролиз триглицеридов и утилизация глицерина (О) - гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа), (Е) - метаболизм пирувата, (Р) формирование протонного градиента и синтез АТФ.

Различные пути метаболизма, идентифицированные на основании геномных данных, представлены на Рис. 15. Расшифровка генома создала основу для открытия новых физиологических особенностей данного микроорганизма, который изначально был описан как архея, способная расти только на белковых субстратах. В результате геномного анализа были выявлены ферменты, необходимые для деградации полисахаридов, а также системы транспорта Сахаров в клетку. Способность Т. з^Ыпсия расти на олигомерных и полимерных углеводах с а-связями (мальтоза, декстран) и (3-связями (целлобиоза, целлюлоза, ламинарин и агароза) была подтверждена экспериментально в ИНМИ РАН. Способность к росту на агарозе ранее не была описана для термофильных эуриархей. Гены ферментов гидролиза полисахаридов и транспорта Сахаров в клетку локализованы в геноме в виде «островков», вероятно приобретенных в результате горизонтального переноса генов. Более того, Т. пЫпст, по-видимому, использует неизвестный механизм деградации п-алканов, поскольку его

рост стимулируется гексадеканом, а известные пути анаэробного метаболизма алканов в геноме отсутствуют. Редким для термофильных архей является способность Т. sibiricus к росту на липидах, что обеспечивается наличием у него липаз, а не только часто встречающихся у архей эстераз, расщепляющих лишь короткоцепочечные триглицериды.

Особенности метаболизма Т. sibiricus, установленные в результате анализа его генома, подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой архей из пластовых вод нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования. Помимо пептидов и аминокислот, присутствующих в нефтяных резервуарах в следовых количествах, Т. sibiricus может расти на полисахаридах и липидах, источником которых могут являться океанические осадки, из которых образовалась нефть Западной Сибири, а также на алканах сырой нефти.

б. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников Камчатки

За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых видов термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих новые филогенетические линии высокого уровня и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007). Некоторые из них были объектами исследования в рамках данной работы. По сравнению с такими экологическими нишами, как гейзеры Исландии и Иеллоустонского парка США, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки исследовано хуже.

В кальдере Узон располагается большое количество разнообразных термальных источников, характеризующихся различными значениями температуры и pH, а также химическим составом. До начала нашей работы «глубокий» молекулярный анализ биразнообразия, основанный на пиросеквенировании фрагментов генов 16S рРНК, дня термальных источников кальдеры Узон не проводился.

Целью этой части работы являлся анализ микробных сообществ нескольких термальных источников кальдеры вулкана Узон, отличающихся физико-химическими параметрами. В качестве объектов исследования были выбраны пять «кислых» (pH 3.75.6) источников «1805», «1810», «1807», «1818» и «1884», различающихся по температуре, а также два «нейтральных» (pH 6.3) источника «Заварзин» и «Бурлящий», имеющие температуры 55-58°С и 90-94°С, соответственно (Табл. 3). Пробы

биоматериала (воды и/или взвеси грунта) были отобраны в ходе экспедиций в кальдеру Узон в 2007, 2008 и 2009 гг.

Важнейшими факторами, влияющими на состав и разнообразие сообществ термофильных микроорганизмов, по крайней мере, для наземных гидротермальных экологических ниш, являются температура и рН. Исследования микробных сообществ нейтральных и умеренно-щелочных источников Иеллоустонского парка США, показали, что бактерии во всех случаях составляют большую часть сообществ, а на долю архей обычно приходится не более нескольких процентов микроорганизмов. Большую часть гипертермофильных сообществ (обычно более 75%) составляли бактерии Aquificales, также встречались представители Thermotogales, Thermus-Deinococcus, и Thermodesulfobacteria. Суммарно, на эти группы приходилось более 90% всех микроорганизмов. В источниках, температура которых была ниже границы, при которой возможен фотосинтез (около 70°С) были широко распространены фототрофные бактерии, - Cyanobacteria и Chloroflexi. С ростом температуры биоразнообразие сообществ уменьшалось (Miller et al., 2009), и в наиболее высокотемпературных источниках ограничивалось всего несколькими группами бактерий. Например, в источнике West Thumb Pool (температура 89°С, рН 7.3) на долю бактерий рода Hydrogenobacter (филум Aquificales) приходилось 92% сообщества, а остальные 8% составляли Thermotogales (Spear et al. 2005).

Эти закономерности подтверждаются результатами сравнительного анализа микробных сообществ воды из двух «нейтральных» источников, - Бурлящего и Заварзина (Табл. 3). В высокотемпературном «Бурлящем» доминируют всего две группы хемолитоавтотрофных микроорганизмов, - Aquificales среди бактерий (69%) и Thermoproteales среди архей (91%), причем последняя группа представлена почти исключительно родом Pyrobaculum, который отсутствовал в менее горячих гидротермах. Эти кренархеи обладают разнообразными системами автотрофного и гетеротрофного метаболизма (раздел 3).

Имеющий более низкую температуру источник Заварзина содержит разнообразное по составу сообщество, в котором абсолютное большинство составляют термофильные бактерии (Табл. 3). Поскольку температура источника ниже верхней границы, при которой возможен фотосинтез (около 70°С), первичная продукция органического вещества может осуществляться как фотосинтетически, так и хемолитоавтотрофно, в результате окисления восстановленных субстратов вулканического происхождения, поставляемых геотермальным потоком.

Таблица 3. Состав микробных сообществ термальных источников.

Заварзин Бурлящий 1884 1805 1807 1810 1818

Температура 55-58°С 90-94°С 50°С 60°С 86 °С 89-91°С 80 °С

рн 6.3 6.2 4.0 3.7 5.6 4.1 3.5

Бактерии

АдшПса1е$ 33.8 68.7 - 36.0 35.0 0.1 4.0

Оетососсш-Т11егтш 4.6 12.2 - - - - -

ОсИегпЬа^егех 12.7 - - - - - -

ГЬегто1одае 6.6 - - - - - 1.0

ГЬепш^еБиИоЬа^па 7.6 0.9 - - - - -

Dictyoglomi 1.7 - - - - - -

ВЯС1 2.0 - - - - - -

СаШ15епса 1.8 - - - - - -

УегтсописгоЫа 1.0 - 41.0 - - - -

А1рЬа-рго1еоЬас1епа - 3.3 4.0 18.0 4.0 31.0 2.0

Ве1а-рго1еоЬа«епа 6.9 - 1.0 1.0 2.0 2.0 7.0

Сатта-ргоиюЬааспа 11.5 0.1 24.0 14.0 33.0 14.0 1.0

Оеиа-рго1еоЬас1епа 3.1 - 1.0 - - - -

Ас(тоЬа«епа - 5.3 - 1.0 10.0 1.0 7.0

Bacteroidetes _ 0.4 - - - - -

Р1птис1Де$ - 12.0 29.0 16.0 43.0 73.0

РНитарна - - 1.0 - - - -

другие 6.6 9.1 16.0 1.0 0.0 9.0 5.0

Археи

ТЬегтор1а5та1а1е5 42.0 - 39.0 2.0 0.6 2.0 -

На1оЬас1епа1е8 - - - 1.0 0.3 5.0 7.8

Ретё1сосса1е5 - - 9.0 - - - -

Acidilobales - - 1.0 13.0 25.7 3.0 64.0

5и1ЫоЬа1е8 - - 1.0 55.0 33.4 46.0 18.8

РугоЬасиШт 25.2 85.0 - - - - -

ГИегторго^ия - - 1.0 1.0 0.5 12.0 -

УЫсагшаеСа - - - 5.0 3.5 3.0 -

ОШег сгепагсЬаеМа 24.8 12.0 47.0 17.0 4.9 1.0 0.3

Когагс1|ае(Ла 7.5 - - - - - -

ЫапоагсЬасога 0.5 2.4 - 5.0 1.8 24.0 4.9

ГЬаитагсЬаео1а - - - - 27.0 - 2.0

другие - 0.6 2.0 1.0 2.3 4.0 2.2

Соотношение археи/бактерии 0.05 0.8 1.9 1.3 1.1 0.9 6.6

Показаны доли (%), которые соответствующие группы составляют среди бактерий или архей (доли менее 0.1 % не показаны)

Фотосинтетическая продукция в источнике Заварзина осуществляется цианобактериальным матом, покрывающим дно, тогда как в воде концентрация фототрофов (цианобактерий и Chloroflexi) была низкой. Хемолитоавторофная продукция может осуществляться в аэробных или микроаэрофильных условиях за счет окисления серы и ее восстановленных соединений (Sulfurihydrogenibium, Thiofaba), а в анаэробной зоне путем окисления водорода с использованием в качестве акцептора электронов серы (при участии Thermosulfidibacter, Caldimicrobium, Thiomonas).

Образуемая фотосинтетиками и хемолитоавтотрофами, а также поступающая с поверхностными водами из окружающих низкотемпературных зон органика может использоваться разнообразными гетеротрофными микроорганизмами, представленными в основном анаэробами. В их число входят как бактерии, сбраживающие органические субстраты (Fervidobacterium, Dictyoglomus и др), так и осуществляющие ее полное окисление за счет использования в качестве акцептора электронов кислорода, серы или нитрата (Thermus, Desulfurella, Calditerrivibrio). В целом, источник Заварзина характеризуется высоким разнообразием обитающих в нем термофильных прокариот, при этом в отличие от Бурлящего не наблюдается абсолютного доминирования какой-либо одной группы микроорганизмов, например, Aquificales. Вероятно, это обусловлено как сравнительно умеренными значениями температуры и pH, так и разнообразием процессов первичной продукции органических веществ. Большое количество филогенетически разнообразных групп говорит о том, что это - хорошо сбалансированное сложное сообщество, где каждая группа занимает свою экологическую нишу.

Объектами большинства ранее опубликованных исследований были термальные источники с высокой температурой и нейтральным pH, в то время как «кислые» термальные источники встречаются реже и охарактеризованы хуже. Именно термоацидофильные экологические ниши могут быть источником совершенно неизвестных линий бактерий и архей. Мы охарактеризовали микробные сообщества четырех «кислых» источников с близким pH (от 3.5 до 4.1, - «1884», «1805», «1818» и «1810»), но различной температурой, а также микробное сообщество источника «1807», являющегося промежуточным между «кислыми» и «нейтральными» источниками (86°С, pH 5.6). Прежде всего, отметим, что во всех «кислых» источниках археи составляли значительную, а в некоторых - большую часть микробных сообществ (Табл. 3). С учетом того, что большинство бактерий в источниках «1805», «1818», «1807» и «1810», по-видимому, не являются эндогенными (см. ниже), можно сделать вывод о том, что именно археи доминируют в сообществах кислых гидротерм.

Микробное сообщество источника «1884», представлявшего собой искусственно вырытую заполненную грунтовой водой яму в месте выноса на поверхность углеводородов термальными водами, имело необычный состав. В нем доминировали не бактерии, а археи, составлявшие более 70% всех микроорганизмов. Почти 90% архей относились к различным линиям, не имеющих культивируемых представителей. В отсутствии фотосинтеза первичная продукция органических веществ может обеспечиваться за счет использования неорганических субстратов вулканического происхождения, к которым относятся метан, водород и восстановленные соединения серы, присутствующие в источнике «1884». Первичную продукцию органических веществ могут обеспечивать две группы аэробных автотрофных бактерий: представители рода Acidithiobacillus, окисляющие неорганические соединения серы и/или металлы, а также термоацидофильные метанотрофы филума Verrucomicrobia. Эти группы бактерий используют в качестве источника углерода, соответственно, СОг и метан. Другие микроорганизмы сообщества являются органотрофами (Fervidicoccales, Geobacillus, Actinobacteria), или их функциональная роль не может быть предсказана исходя из таксономической принадлежности (некультивируемые линии бактерий и архей). Поэтому можно предположить, что в сообществе присутствуют неизвестные группы термофильных литоавтотрофов, либо это сообщество зависит от притока органических веществ извне, с дождевыми водами, поступающими из окружающих более холодных районов и/или от поступления углеводородов из глубинных слоев с геотермальным потоком. Отметим, что «1884» - единственный из проанализированных источников, в котором значительную долю сообщества составляли кренархеи порядка Fervidicoccales. Вероятно, умеренно горячие кислые гидротермы являются оптимальными для роста этих органотрофных микроорганизмов, сбраживающих белковые субстраты (глава 2).

Особенностью кислых источников естественного происхождения («1805», «1818», «1807» и «1810») является значительная доля архей в сообществе. Более того, в обнаруженном составе бактериального компонента сообществ большинство бактерий относится к мезофильным, а не термофильным линиям. По-видимому, эти бактерии не являются эндогенными компонентами сообществ, а попали в источники извне, с дождевыми водами из окружающих низкотемпературных зон. К термофилам относятся Aquificales, которые составляли 36% бактерий в «1805», 35% - в «1807», 6% - в «1818», но отсутствовали в «1810». Термоацидофилы Acidithiobacillus были обнаружены в источниках «1805» (12% бактерий), «1807» (0.7%) и «1810» (18%). Еще одна группа термофилов, - Thermotogae, составляла около 1% бактерий в источнике «1818». В

пользу гипотезы об экзогенном происхождении «нетермофильных» бактерий в этих источниках свидетельствуют результаты сравнительного анализа бактерий из источников «1805» и «1810». Если исключить из рассмотрения Aquificales, относительные доли основных групп бактерий в источниках «1805» и «1810» окажутся практически одинаковыми, несмотря на большие различия в их температурах. Оба источника расположены вблизи друг от друга, что объясняет сходство состава «экзогенных» бактерий. Кроме того, в отличие от источника Заварзина, источники «1805» и «1810» (а также «1818» и «1807») представляют собой замкнутые бассейны, в которых отсутствует постоянный приток воды из подземных гидротермальных выходов, который мог бы постоянно обновлять воду источника, удаляя попавшие извне микроорганизмы. Таким образом, если сделанное нами предположение верно, археи должны составлять абсолютное большинство в «эндогенных» микробных сообществах кислых термальных источников.

В отличие от бактерий, археи микробных сообществ источников «1805», «1818», «1807» и «1810» относятся к известным линиям термофилов. Две группы термоацидофильных кренархей, Sulfolobales и Acidilobales, доминировали в этих сообществах, представляя более половины архей. Sulfolobales, - типичные обитатели кислых горячих источников, например, сульфатар. Именно эти в основном аэробные археи, окисляющие водород и серу, являются первичными продуцентами в термоацидофильных сообществах, но многие из них способны окислять и органические вещества в процессах аэробного и анаэробного дыхания. Напротив, культивируемые представители Acidilobales являются анаэробными гетеротрофами, способными осуществлять полное окисление органических веществ в процессах анаэробного дыхания в присутствие серы. Сосуществование этих двух групп в кислых термальных источниках может объяснять и интенсивный горизонтальный перенос генов между Sulfolobales и Acidilobales, выявленный в результате анализа генома A. saccharovorans.

Некоторые группы архей в значительных количествах были обнаружены только в отдельных источниках. Прежде всего, это представители филума Taumarchaeota, обнаруженные в источниках «1807» и «1818», в которых они составляют 27% и 2% архейного сообщества, соответственно. Это аэробные, окисляющие аммоний археи первоначально были найдены в морях и почвах, но впоследствии были обнаружены и в гидротермальных местообитаниях Иеллоустонского парка США. Оптимальными для них, видимо, являются высокотемпературные умеренно-кислые гидротермы, о чем свидетельствует сравнение долей Taumarchaeota в источниках «1807» (86°С, pH 5.6) и «1818» (80°С, pH 3.5). Еще одной группой архей, доля которых увеличивалась при

снижении pH и росте температуры, являются эуриархеи Halobacteriales, на долю которых приходилось 0.6% архейных последовательностей в «1805», 0.3% - в «1807», 5% в «1810» и 7% - в «1818». Вероятно, обнаруженные нами микроорганизмы образуют группу термоацидофильных галоархей.

7. Основные характеристики отдельных групп архей

Расшифровка и анализ геномов позволили не только охарактеризовать конкретные организмы, но и выявить ряд закономерностей и общих характеристик отдельных линий архей. Анализ геномов трех представителей (У. moutnovskia, Т. uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860) наиболее древнего порядка гипертермофильных кренархей, Thermoproteales, показал, что они имеют сравнительно крупные геномы (1.8-2.4 млн. нт.) и обладают разнообразными системами автотрофного и гетеротрофного метаболизма. Эти микроорганизмы способны гидролизовать сложные белковые субстраты и полисахариды, и не только сбраживать органические вещества, но и осуществлять их полное окисление в процессах анаэробного дыхания. В их геномах кодируются ферменты окислительного цикла трикарбоновых кислот и разнообразные цитоплазматические и мембран-связанные оксидоредуктазы, позволяющих этим археям использовать различные акцепторы электронов. Набор этих окидоредуктаз отличается у разных представителей Thermoproteales. По-видимому, в процессе эволюции Thermoproteales происходили потери отдельных оксидоредуктаз и их приобретение в процессах горизонтального переноса и дупликации генов с последующей специализацией ферментов. Широкий спектр путей метаболизма у Thermoproteales обуславливает их распространение в термальных источниках с различными физико-химическими характеристиками. Наиболее многочисленными они являются в нейтральном источнике с наиболее высокой температурой, «Бурлящем». По-видимому, Thermoproteales являются не только первичными продуцентами органических веществ благодаря своей способности к литоавтотрофному росту, но и осуществляют их полное окисление в процессах анаэробного дыхания.

Другой тип метаболизма характерен для Т. carboxydotrophus, - представителя рода Thermofilum, образующего базовую ветвь порядка Thermoproteales. Анализ генома Т. carboxydotrophus показывает, что эта архея специфически адаптирована к использованию низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов, присутствующих в среде. У Т. carboxydotrophus потеряны многие биосинтетические пути, что характерно для облигатных паразитов. Вероятно, более простой набор путей метаболизма у представителей рода Thermofilum по сравнению с

другими Thermoproteales обусловлен не эволюционной древностью Thermofilum, а утратой этих путей в результате вторичной адаптации к получению необходимых метаболитов в «готовом» виде из содержащей разнообразную органику среды термального источника.

Гораздо более простыми по сравнению с Thermoproteales путями метаболизма обладают проанализированные нами представители порядка Desulfurococcales, - D. kamchatkensis и T. cellulolyticus. Они имеют одни из наименьших геномов (1.3-1.4 млн. нт), среди свободноживущих микроорганизмов и обладают специализированным метаболизмом, осуществляя гидролиз высокополимерных белковых субстратов и полисахаридов. Анализ генома F. fontis, представителя нового порядка Fervidicoccales, показал, что он характеризуется узкоспециализированным метаболизмом, связанным с гидролизом и сбраживанием только белковых субстратов. Видимо, Fervidicoccales представляют собой имеющую общее происхождение с Desulfurococcales линию, которая эволюционировала по пути специализации к росту на сложных белковых субстратах с потерей «ненужных» генов.

В отличие от F. fontis, термоацидофильная кренархея A. saccharovorans не только филогенетически относится к новому порядку Acidilobales, но и обладает специфическими особенностями метаболизма. Как и Thermoproteales, A. saccharovorans обладает сразу двумя путями метаболизма глюкозы - Энтнера-Дудорова и Эмбдена-Мейергофа. Другой общей чертой A. saccharovorans и Thermoproteales является наличие цикла трикарбоновых кислот, который обеспечивает полное окисление органических веществ в анаэробных условиях в присутствии внешних акцепторов электронов. Редким свойством, не описанным у Desulfurococcales, но также характерным для Thermoproteales, является наличие цикла бета-окисления жирных кислот. Однако, у A. saccharovorans отсутствует характерный для Thermoproteales широкий спектр терминальных оксидаз, а в качестве акцептора электронов могут использоваться только сера или тиосульфат. Представители Acidilobales могут завершать анаэробный цикл углерода, не только расщепляя сложные полимерные субстраты, но и осуществляя минерализацию органических веществ в процессах анаэробного дыхания. В отличие от мезофильных микробных сообществ, в которых процесс анаэробного разложения органических субстратов состоит из нескольких стадий, осуществляемых разными группами микроорганизмов (гидролиз, ферментация, синтрофные реакции и конечное окисление), в высокотемпературных условиях этот процесс может быть осуществлен всего одной группой микроорганизмов, Thermoproteales - в нейтральных горячих источниках и Acidilobales - в кислых.

Особенности метаболизма Т. sibiricus, установленные в результате анализа его генома, подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой археи из нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования. В результате анализа генома были выявлены ферменты, необходимые для деградации полисахаридов и липидов, источником которых могут являться океанические осадки (водоросли как источник агара, ламинарина и целлюлозы), из которых образовалась нефть, а также системы транспорта Сахаров в клетку. Эти гены локализованы в виде «островков», вероятно приобретенных в результате горизонтального переноса.

ВЫВОДЫ

1. Определены полные структуры геномов термофильных архей Acidolobus saccharovorans, Fervidicoccus fontis, Desulfurococcus kamchatkensis, Thermogladius cellulolyticus, Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis, Pyrobaculum sp. 1860, Thermofilum carboxydotrophus, и Thermococcus sibiricus.

2. Анализ геномов кренархей Desulfurococcus kamchatkensis и Thermogladius cellulolyticus, представляющих порядок Desulfurococcales, показал, что эти микроорганизмы обладают комплексом ферментов, которые могут обеспечивать гидролиз белковых субстратов и некоторых полисахаридов. В геномах D. kamchatkensis и Т. cellulolyticus отсутствуют гены ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, что ограничивает возможности метаболизма этих архей брожением и не позволяет им полностью окислять органические субстраты.

3. Анализ генома кренархей Fervidicoccus fontis, представителя порядка Fervidicoccales, показал, что эта архея обладает специализированным типом метаболизма, осуществляя гидролиз высокополимерных белковых субстратов и их сбраживание с образованием ацетата и водорода.

4. Анализ генома кренархей Acidolobus saccharovorans подтвердил правомерность выделения этого микроорганизма в новый порядок Acidilobales филума Crenarchaeota. В геноме были выявлены пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова метаболизма глюкозы и путь бета-окисления жирных кислот. Наличие окислительного цикла трикарбоновых кислот и ферментативных комплексов, осуществляющих восстановление серы, позволяет Acidolobus saccharovorans помимо сбраживания органических субстратов осуществлять их полное окисление в процессах анаэробного дыхания в присутствии внешних акцепторов электронов. Репликация хромосомы А.

ягсс/югоуогаля инициируется с двух сайтов инициации репликации и является двунаправленной.

5. Бета-гликозидаза А5АС1390 из кренархеи Ас1с1о1оЬи.ч ¡ассИагоуогапз является многофункциональным ферментом, обладающим бета-гликозидазной, бета-галактозидазной, бета-ксилозидазной и бета-маннозидазной активностями.

6. Анализ геномов кренархей Уи1сат5аеШ тоШпотИа, Т1гегторго1еих и?,оте№15 и РугоЬаси1ит 5р. 1860 порядка ТкеппорШеакя показал, что эти микроорганизмы могут осуществлять окисление органических субстратов в присутствии внешних акцепторов электронов и автотрофно фиксировать СОг. Геномы этих архей кодируют пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова метаболизма глюкозы. Геномные данные указывают на способность РугоЬасиЫт ер. 1860 использовать широкий спектр акцепторов электронов, в том числе оксид железа и нитрат.

7. Анализ генома кренархеи ТИегтоАШт сагЬохус1мгор1ш5 порядка ТЬегторгйеаЬв показал, что эта архея адаптирована к использованию низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов. В её геноме отсутствуют гены ферментов путей биосинтеза многих метаболитов. Способность ТИегто/Иит сагЬохуЛтгоркиа к росту на СО с образованием Нг и СОг обеспечивается мембран-связанной СО-дегидрогеназой, кластер генов которой получен путем горизонтального переноса.

8. В результате анализа генома термофильной эуриархеи ТИегтоспссих яШНым, выделенной из пластовых вод нефтяного резурвуара в Западной Сибири, были выявлены пути метаболизма, с помощью которых эта архея может использовать различные органические субстраты, включая белки, липиды и полисахариды. Гены ферментов гидролиза полисахаридов и транспорта Сахаров в клетку локализованы в геноме в виде кластеров, приобретенных в результате горизонтального переноса. Особенности метаболизма Т. яШпсщ подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой археи из пластовых вод нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования.

9. Методом пиросеквенирования фрагментов гена 168 рРНК определены составы микробных сообществ семи термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся температурой и рН воды. Наибольшее разнообразие автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов при отсутствии доминирования какой-либо одной группы обнаружено в воде источника Заварзина, имеющего нейтральный рН и умеренно-высокую температуру воды (55-58°С). В высокотемпературном нейтральном источнике «Бурлящий» (90-94°С, рН 6.2) доминируют две группы

хемолитоавтотрофных микроорганизмов, - бактерии Aquificales и археи Pyrobaculum. В источниках с низким рН археи составляют большинство микроорганизмов. В источнике с температурой около 50°С преобладают различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, в кислых источниках с температурой 60-90°С - ацидофильные кренархеи порядков Sulfolobales и Acidilobales.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скрябин К.Г., Марданов А.В. , Кубланов И.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Определение полной нуклеотидной последовательности генома гипертермофильного микроорганизма. // Доклады Академии наук. 2008 Т. 421. С. 204206.

2. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Выделение и характеристика новой термостабильной ДНК-лигазы из архей рода Themococcus. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 45. С. 523-528.

3. Ravin N.V., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Kublanov I.V., Kolganova T.V., Lebedinsky A.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the anaerobic, protein-degrading hyperthermophilic crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis. //J. Bacterid. 2009. V. 191. P. 2371-2379.

4. Kublanov I.V., Bidjieva S.Kh., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Desulfurococcus kamchatkensis sp. nov., a novel hyperthermophilic protein-degrading archaeon isolated from a Kamchatka hot spring. // Int. J. Syst. Evol. Micr.. 2009. V. 59. P.1743-1747.

5. Mardanov A.V., Ravin N.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Metabolic versatility and indigenous origin of the archaeon Thermococcus sibiricus, isolated from a Siberian oil reservoir, as revealed by genome analysis. // Appl. Environ. Microbiol.. 2009. V. 75. P. 4580-4588.

6. Stekhanova T.N., Mardanov A.V., Bezsudnova E.Y., Gumerov V.M., Ravin N.V., Skryabin K.G., Popov V.O. Characterization of a thermostable short-chain alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sibiricus. // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 4096-4098.

7. Lyashenko A.V., Bezsudnova E.Y., Gumerov V.M., Lashkov A.A., Mardanov A.V., Mikhailov A.M., Popov V.O., Ravin N.V., Skryabin K.G., Stekhanova T.N, Kovalchuk M.V. Expression, purification and crystallization of a thermostable short-chain alcohol dehydrogenase from archaeon Thermococcus sibiricus. // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2010. V. 66. P. 655-657.

8. Марданов А.В., Гумеров В.М., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пиросеквенирования. // Доклады Академии наук. 2010. Т. 432. С. 544-548.

9. Mardanov A.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. The genome sequence of the crenarchaeon Acidilobus saccharovorans supports a new order, Acidilobales, and suggests an important ecological role in terrestrial acidic hot springs. // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 5652-5657.

10. Perevalova A.A., Bidzhieva S.K., Kublanov I.V., Hinrichs K.U., Liu X.L., Mardanov A.V., Lebedinsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Fervidicoccus fontis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermophilic crenarchaeote from hot springs in Kamchatka, and proposal of Fervidicoccaceae fam. nov. and Fervidicoccales ord. nov. // Int J Syst Evol Microbiol. 2010. V. 60. P. 2082-2088.

11. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of "Vulcanisaeta moutnovskia" strain 768-28, a novel member of the hyperthermophilic crenarchaeal genus Vulcanisaeta. // J. Bacterid. 2011. V. 193. P. 2355-2356.

12. Гумеров B.M., Марданов A.B., Белецкий A.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, кальдера Узон, Камчатка // Микробиология. 2011. Т. 80. С. 258-265.

13. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Perevalova A.A., Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Uncultured archaea dominate in the thermal groundwater of Uzon Caldera, Kamchatka. // Extremophiles. 2011. V. 15(3). P. 365-372.

14. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the thermoacidophilic crenarchaeon Thermoproteus uzoniensis 768-20. // J. Bacterid. 2011. V. 193. P. 3156-3157.

15. Голубев C.C., Кононогов C.A., Кудеяров Ю.А., Марданов А.В., Николаева П.Ю., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Метрологическое обеспечение секвенирования молекул ДНК. // Измерительная техника. 2012. Т. 3. С. 64-68.

16. Слуцкая Э.С., Безсуднова Е.Ю., Марданов А.В., Гумеров В.М., Ракитина Т.В., Попов В.О., Липкин В.М. Характеристика новой М42 аминопептидазы из кренархеи Desulfurococcus kamchatkensis. // Доклады Академии наук. 2012. Т. 442. С. 551-554.

17. Гумеров В.М., Марданов A.B., Колосов П.М., Равин Н.В. Выделение и характеристика липазы из термоалкалофильной бактерии Thermosyntropha lipolytica. // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. С. 376-382.

18. Слуцкая Э.С., Безсуднова Е.Ю., Марданов A.B., Сафенкова И.В., Клейменов С.Ю., Чеботарева H.A., Гумеров В.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Попов В.О. Независимая супероксиддисмутаза из новой термоацидофильной кренархеи Acidilobus saccharovorans: от гена до активного фермента. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 1681-1692.

19. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Slobodkina G.B., Beletsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of strain 1860, a crenarchaeon of the genus Pyrobaculum able to grow with various electron acceptors. // J. Bacterid. 2012. V. 194. P. 727-728.

20. Mardanov A.V., Kochetkova T.V., Beletsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the hyperthermophilic cellulolytic crenarchaeon "Thermogladius cellulolyticus" 1633 // J. Bacteriol. 2012. V. 194. P. 44464447.

21. Марданов A.B., Равин H.B. Роль геномики в исследовании разнообразия и эволюции архей. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 965-980.

Патенты

22. Смагин В.А., Марданов A.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2010) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая эту ДНК-лигазу. Патент РФ № 2405823 от 10.12.2010г.

23. Смагин В.А., Марданов A.B., Прокофьева М.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2011) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Acidilobus. Патент РФ № 2413767 от 10.03.2011г.

24. Безсуднова Е.Ю., Бонч-Осмоловская Е.А., Гумеров В.М., Марданов A.B., Попов В.О., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Стеханова Т.Н. (2011) Термостабильная алкогольдегидрогеназа из археи Thermococcus sibiricus. Патент РФ № 2413766 от 10.03.2011г.

Избранные материалы конференций

25. Mardanov A.V., Smagin V.A., Е.А. Bonch-Osmolovskaya, Ravin N.V. Isolation of new thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2007), Seville, Spain. 2007. P. 21.

26. Mardanov, A., Bonch-Osmolovskaya, E., Ravin, N. Molecular analysis of microbial communities from hydrothermal environments of Kamchatka volcanic area in Russia. Abstracts of the workshop on metabolomics and environmental biotechnology, Palma de Mallorca, Spain. 2008. P13.

27. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. (2009) Microbial community of high-temperature spring "Burluashy" of Uzon Caldera, Kamchatka peninsula. Abstracts of the 10th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology BAGECO-IO, Uppsala, Sweden. 2010. P.210.

28. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. (2010) Molecular analysis of microbial communities of hydrothermal environments of Uzon Caldera. Abstracts of the International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. 2010. P. 18.

29. Ravin N.V., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Complete genome sequences of ten hyperthermophilic archaea reveal their metabolic capabilities and possible ecological roles. Abstracts of the international conference "Extremophiles 2010", Azores, Portugal. 2010. P. 185.

30. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Microbial diversity of thermal springs of Uzon Caldera, Kamchatka, as revealed by 454 pyrosequencing. Abstracts of the international conference "Extremophiles 2010", Azores, Portugal. 2010. P. 250.

31. Марданов A.B., Равин H.B. Расшифровка геномов термофильных архей: фундаментальные и прикладные аспекты. Тезисы I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, Россия. 2010. С. 86.

32. Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya Е.А., Ravin N.V. (2011) Complete genome sequences of new crenarchaeones isolated from hot springs of Kamchatka revealed their metabolic potentials and possible ecological roles. Abstracts of the 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology BAGECO-11, Corfu, Greece. 2011. P. 58.

33. Марданов A.B., Кадников B.B., Равин H.B. Геномика и метагеномика экстремофильных микроорганизмов. Тезисы II международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика", Новосибирск, Россия. 2011. С. 64.

34. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Gumerov V.M., Ravin N.V. Advances in genomic and metagenomic studies of extremophilic microoganisms. Abstracts of the Eight

international conference on bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology (BGRS/SB'12), Новосибирск, Россия. 2012. P. 198.

35. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Ravin N.V. The impact of genomics on research in diversity and evolution of thermophilic microorganisms. Тезисы 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-З», Москва, Россия. 2012. Р. 21.

36. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Ravin N.V. Metagenomic analysis of microbial community inhabiting the deep subsurface thermal waters in Western Siberia. Abstracts of the 14th International Symposium on Microbial Ecology - ISME14, Copenhagen, Denmark. 2012. P. 905.

Заказ № 69-А/01/2013 Подписано в печать 16.01.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г.т

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Марданов, Андрей Владимирович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреджение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

На правах рукописи

0520І350668

МАРДАНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

(03.01.03 - молекулярная биология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук

Н.В. Равин

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 2

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 65

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Термоацидофильная кренархея АыйНоЪт $асс11агоуогат представитель новой филогенетической линии кренархей 86

Глава 2. Органотрофные кренархей порядков ОехиЦ'игососсаЬеь и РетсИсосса1е$ 123

Глава 3. Геномы трех кренархей порядка ТЬегшорго1еа1е8 158

Глава 4 Ткегто/йит сагЬохус1о1горИ,их, карбоксидотрофная кренархея порядка ТЬегторгс^еакв 188

Глава 5. Эуриархея ТИ.егтососсш зШпсш, выделенная из пластоых вод нефтяного резервуара 205

Глава 6. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников Камчатки 231

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 257

ВЫВОДЫ 268

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 270

СПИСОК ЦИТИРОВАННОИ ЛИТЕРАТУРЫ 275

ВВЕДЕНИЕ

С момента описания Карлом Возе в качестве отдельного, наряду с бактериями и эукариотами, домена живых существ (Woese and Fox, 1977), археи стали одними из наиболее интересных объектов микробиологии, молекулярной биологии и биохимии. Длительное время наиболее известной группой архей были метаногены, широко распространенные в различных анаэробных местах обитания. Другие археи рассматривались как «экстремофилы», обитающие в специфических экологических нишах, в которых не могут развиваться другие организмы - при высоких температурах (термофилы), в кислых или щелочных условиях (ацидофилы и алкалофилы), при высокой солености (галофилы). Термофильные археи были обнаружены в горячих источниках Йеллоустонского парка США, Исландии, Камчатки, Новой Зеландии и т.д. Среди архей были выделены микроорганизмы, живущие при экстремальных значениях одновременно и температуры и рН - термоацидофилы и термоалкалифилы (Schleper et al., 1995; Li et al., 1993). Археи были найдены в глубоководных гидротермальных источниках на глубинах более 1000 м, где вода остается жидкой даже при температуре, значительно превышающей 100°С. В результате этих исследований были выделены микроорганизмы, способные расти при температуре 115°С (Blochl et al., 1997) и даже 121°С (Kashefi and Lovely 2003). Работы последних двух десятилетий, в первую очередь связанные с анализом последовательностей генов рибосомных 16S РНК, выделенных непосредственно из природных источников, показали, что археи распространены глобально и встречаются в почвах (Bintrimet al., 1997; Ochsenreiter et al., 2003; Galand et al., 2005), морской воде (DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992) и донных осадках (Boetius et al., 2000; Orphan et al., 2001; Mills et al., 2005), пресных водоемах (MacGregor et al., 1997; Keough et al., 2003), глубинных подземных местообитаниях (Takai et al., 2001), кишечнике человека (Lepp et al., 2004). Во многих местообитаниях археи являются важными компонентами сообществ, например, в мировом океане их доля оценивается в 10-40% всех микроорганизмов (Karner et al., 2001). Широкое распространение и многочисленность архей в различных морских и наземных экологических нишах свидетельствует о том, что не только метаногены, но и другие группы архей могут играть ключевую роль в глобальных биогеохимических процессах (Konneke et al., 2005; Leininger et al., 2006).

Несмотря на большой интерес к археям, успехи в изучении их молекулярной биологии, эволюции и метаболизма до середины 1990-х годов были весьма ограничены. Это во многом связано со сложностью культивирования большинства этих микроорганизмов и практически полным отсутствием генетических «инструментов»

(генетическая трансформация, векторы для экспрессии, методы нокаута генов и др.), подобных давно разработанным для таких модельных объектов как бактерии Escherichia coli. Многие эволюционно древние линии архей, известные по последовательностям 16S рРНК из природных источников, до настоящего времени не имеют представителей, культивируемых в лабораторных условиях, и остаются практически не изученными.

Поэтому успехи в развитии геномики, вызвавшие в середине 1990-х годов «геномную революцию» в микробиологии, вносят особенно заметный вклад в исследование архей. Хотя ключевое место в геномике микроорганизмов первоначально занимали «медицинские» объекты - возбудители наиболее значимых заболеваний человека, организмы, представляющие интерес для биотехнологии, экологии и эволюционных исследований также быстро стали объектами геномных проектов. Так, архея Methanococcus jannaschii стала третьим по счету организмом, для которого была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Bult et al., 1996). Роль расшифровки генома в изучении М. jannaschii хорошо иллюстрируется числом соответствующих публикаций, - 13 представленных в Pubmed работ за период от открытия этой архей в 1983г. до расшифровки ее генома в 1996г. и более пятисот работ, опубликованных за последующие 15 лет.

Благодаря быстрому развитию геномных технологий растет число полных геномных последовательностей, расширяются наши знания о биологии архей, их разнообразии и эволюции (Gribaldo and Broichier-Armanet, 2006). Получены новые данные об эволюции ключевых генетических процессов у архей, таких как клеточное деление и репликация ДНК, роли горизонтального переноса генов в эволюции архей, выявлены новые взаимосвязи между археями и эукариотами.

Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации более близок к эукариотическому. Вследствие этого архей являются удобными модельными объектами для изучения молекулярных механизмов и эволюции многих генетических процессов у эукариот.

На момент начала данной работы, 2008г., было просеквенировано всего около 50 полных геномов архей (в настоящее время известно около 100 геномов), что более чем на порядок меньше, чем число расшифрованных бактериальных геномов. Как отмечалось выше, даже культивирование большинства архей является непростой задачей, поэтому большинство из 50 архей с известными полными геномными последовательностями представляли всего несколько филогенетических групп, -

метаногены, галофилы, термофильные археи порядков ТЬегшососса1ез и БиИЫоЬакз. Для большинства остальных групп, в первую очередь термофильных кренархей, геномные данные отсутствовали либо были доступны для одного-двух представителей, что ограничивало наши знания о биологии этих организмов.

Таким образом, задача определения и анализа структур геномов архей, представляющих «новые» эволюционные ветви, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области молекулярной биологии и микробиологии. Не меньший интерес, в первую очередь для анализа молекулярных механизмов эволюции геномов, имеет и сравнение геномов близкородственных организмов. Наконец, расшифровка геномов архей, обитающих в специфических экологических нишах, важна для анализа соответствующих путей метаболизма и экологической роли этих микроорганизмов в природных сообществах. Расшифровка геномов архей, обитающих в экстремальных условиях среды, имеет и очевидное практическое значение, обусловленное биотехнологическим потенциалом этих микроорганизмов в качестве источников новых ферментов.

В Российской Федерации исследования термофильных бактерий и архей были начаты в конце 1970-х годов в Институте микробиологии им С.Н. Виноградского РАН. В значительной степени их успеху и международному признанию способствовало наличие уникального природного объекта, - многочисленных и разнообразных по своим физико-химическим характеристикам термальных источников Камчатки. За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых термофильных архей, в том числе представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся различными типами метаболизма.

Предметом настоящей работы является расшифровка полных структур геномов термофильных архей и молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников с различными физико-химическими характеристиками. Объектами исследования являются новые ранее не изученные виды термофильных архей из коллекции микроорганизмов, выделенных коллективом лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Две археи представляли новые филогенетические группы {Ас1с1о1оЪт .часс1гаго\'огап.^ и РетсИсоссш /опия), другие были выделены из неисследованных экологических ниш и/или имели необычные возможности метаболизма (Ое,$и1/игососси.ч катска1кепз18, Ткегтососсш бШпсш, Уи1сат.%сша тоШпоуяЫа, Т1гегторго1ет и1отепя1х, РугоЬасиШт зр. 1860, ТкегтоЩит сагЬохус1о1гор1шх, Thermogladius сеИиШуНст).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы является изучение особенностей метаболизма, путей

эволюции и биоразнообразия термофильных архей на основе определения и анализа

полных нуклеотидных последовательностей их геномов.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Определение полных нуклеотидных последовательностей геномов термофильных архей - объектов исследования.

2. Изучение особенностей структурной организации и функционирования геномов архей.

3. Анализ путей и механизмов эволюции архей на основе геномных данных.

4. Анализ особенностей метаболизма архей.

Обзор литературы

1. Основные характеристики геномов архей

Начиная с 1996г до настоящего времени определено более 100 полных геномов архей, из которых более половины было опубликовано в течение последних 3 лет. Тем не менее, число известных геномов архей более чем на порядок меньше, чем бактериальных (в настоящее время около 1,5 тыс.), а число ежегодно расшифровываемых во всем мире геномов архей, до недавнего времени, не превышало 20 (Рис. 1). Вероятно, прогресс в области геномики архей сдерживается сложностью выделения и культивирования этих микроорганизмов, в особенности представителей «новых» филогенетических линий.

Cumulative number of available complete genomes

Number ot complete archaeal genomes sequenced each year

z &

Years

Current Opinion in Microbiology

Рисунок. 1. Рост числа опубликованных полных геномов архей (из работы ВгосЫег-Агтапе! й а1., 2011).

Тем не менее, накопленный объем данных о полных геномных последовательностей позволил охарактеризовать геномы архей с помощью основных параметров, таких как размер и форма генома, число репликонов, Є+С состав, наличие оперонов, сайты инициации и терминации репликации, повторяющиеся последовательности. Однако ни один из этих параметров не является специфичным для архейных геномов. Диапазон изменения этих параметров в различных геномах архей сравним с соответствующими характеристиками для бактериальных геномов (табл. 1).

Таблица 1. Основные характеристики опубликованных геномов архей (данные на сентябрь 2012, культивируемые изоляты).

Вид Порядок Размер (млн. нт) ЄС % СепеВапк Кол-во генов

СгепагсЬаеоІа

Аеюругит регпіх К1 ОеяиП'игососсаІез 1.6697 56.3 N0.000854.2 1752

Оезиі/игососсия катсігмкетіз 122ІП ВезиІґигососсаІеБ 1.3652 45.3 N0.011766.1 1524

Ое.чиї/игососси.ч тисозиз ОБМ 2162 Ое5и1ґигососса1е8 1.3146 53.1 N0.014961.1 1421

Оеїиі/игососсиь /егтеШапз В5М 16532 ОевиИчдгососсаІев 1.3841 44.8 N0.018001.1 1522

Ignicoccus Ію.чрігаїі.ч КШ4Л ОеБиІґигососсаІеБ 1.2975 56.5 N0.009776.1 1495

тяр/гаега aggregans ОБМ 17230 ВеБиІґигососсаІеБ 1.876 35.7 N0.014471.1 2042

БіарІїуШІїегтт таппия Р1 ОезиІґигососсаІеБ 1.5705 35.7 N0.009033.1 1655

рігуїоікеппи .V кеііепісиз ББМ 12710 Ое8и1ґигососсаІЄ8 1.5804 36.8 N0 014205.1 1718

ТІгегто$р/іаега aggregans ОБМ 11486 Ое5и1ґигососса1е8 1.3166 46.7 N0.014160.1 1458

Нурепкегтин ЬшуПси.ч ОБМ 5456 Ое8и1ґигососса1ей 1.6672 53.7 N0.008818.1 1673

Thermogladшs сеііиіоіупсиь 1633 ОешІГигососсаІеї 1.3563 55.6 N0.017954.1 1465

РугоІоЬиз /итагіі 1А ОеБиІґигососсаІеБ 1.8433 54.9 МС_015931.1 2038

Асісііапив Ьовркаїїв Wl БиІґоІоЬаІеБ 2.1377 34.1 1ЧС_015518.1 2424

ЗиІ/оІоЬия юкосіаіі зіг. 7 БиІґоІоЬаІеБ 2.6948 32.8 N0.003106.2 2875

ЗиІ/оІоЬи.ч і.чіапсііси.ч Ь.О,8.5 БиІґоІоЬаІеБ 2.7487 35.3 N0 013769.1 3162

БиІ/оІоЬиз ізіапсіісш ¥.N.15.51 БиНоІоЬаІез 2.8544 35.3 N0.012623.1 3324

ЗиІ/оІоЬи.ч І.ч1апс1іси.ч М. 16.4 БиІґоІоЬаІеБ 2.5867 35 N0.012726.1 2871

8иІ/оІоЬи$ і.чІапіЛси.ч М. 14.25 БиІґоІоЬаІеБ 2.6088 35.1 N0,012588.1 2902

БиІ/оІоЬиї і.чіапсіісих М.16.27 Би^оІоЬаІеБ 2.6924 35 N0.012632.1 2958

БиІ/оІоЬи.ч ічкіпсПсих Ь.8.2.15 БиІґоІоЬаІеБ 2.7363 35.1 N0 012589.1 3071

Sulfolobus іх1апс!іси.ч ¥.0.57.14 БиІґоІоЬаІей 2.7021 35.4 N0.012622.1 3083

ЗиІ/оІоЬи.ч і.чіапсііси.ч НУЕ10/4 БиІґоІоЬаІеБ 2.6552 35.1 N0 017275.1 2861

БиІ/оІоЬиз isla.ndic.us ИЕ¥15А БиІґоІоЬаІеБ 2.523 35.3 N0.017276.1 2806

Sulfolobus solfataricus P2 Sulfolobales 2.9923 35.8 NC 002754.1 3034

Sulfolobus solfataricus 98/2 Sulfolobales 2.669 35.8 NC 017274.1 2956

Sulfolobus acidocaldarius DSM 639 Sulfolobales 2.226 36.7 NC 007181.1 2330

Metallosphaera sedula DSM 5348 Sulfolobales 2.1915 46.2 NC 009440.1 2345

Metallosphaera cuprina Ar-4 Sulfolobales 1.8404 42 NC 015435.1 2077

Acidilobus saccharovorans 345-15 Acidilobales 1.4965 57.2 NC_014374.1 1551

Fervidicoccus fontis Kam940 Fervidicoccales 1.3192 37.5 NC 017461.1 1439

Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Thermoproteales 2.1211 55.1 NC_009376.1 2408

Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Thermoproteales 1.7698 59.9 NC_010525.1 2059

Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Thermoproteales 1.8264 49.6 NC 008701.1 2063

Pyrobaculum aerophilum str. IM2 Thermoproteales 2.2224 51.4 NC_003364.1 2705

Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Thermoproteales 2.0093 57.2 NC_009073.1 2226

Pyrobaculum oguniense TE7 Thermoproteales 2.4529 55.1 NC_016885.1 3014

Pyrobaculum sp. 1860 Thermoproteales 2.468 57 NC_016645.1 2888

Thermofilum pendens Hrk 5 Thermoproteales 1.8134 57.7 NC_008698.1 1947

Caldivirga maquilingensis IC-167 Thermoproteales 2.0776 43.1 NC 009954.1 2048

Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Thermoproteales 2.299 42.4 NC 015151.1 2393

Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Thermoproteales 2.3741 45.4 NC 014537.1 2592

Thermoproteus uzoniens'is 768-20 Thermoproteales 1.9361 59.7 NC_015315.1 2229

Thermoproteus tenax Kra 1 Thermoproteales 1.8415 55.1 FN869859.1 2101

Euryarchaeota

Archaeo globus fulgidus DSM 4304 Archaeoglobales 2.1784 48.6 NC_000917.1 2486

Archaeo globus profundus DSM 5631 Archaeoglobales 1.5634 42 NCO13741.1 1910

Archaeo globus veneficus SNP6 Archaeoglobales 1.9019 47 NC_015320.1 2194

Ferroglobus placidus DSM 10642 Archaeoglobales 2.1963 44.1 NC_013849.1 2621

Halobacterium sp. NRC-1 Halobacteriales 2.571 65.9 NC_002607.1 2674

Halobacterium salinarum R1 Halobacteriales 2.6688 65.7 NC_010364.1 2934

Haloarcula marismortui ATCC 43049 Halobacteriales 4.2746 61.1 NC_006396.1,NC_00 6397.1 4304

Haloferax volcanii DS2 Halobacteriales 4.0129 65.5 NC 013967.1 4130

Natronomonas pharaonis DSM 2160 Halobacteriales 2.7497 63.1 NC_007426.1 2892

Haloquadratum walsbyi DSM 16790 Halobacteriales 3.1794 47.9 NC_008212.1 2914

Haloquadratum walsbyi C23 Halobacteriales 3.2605 47.7 NC_017459.1 3562

Halorubrum lacusprofundi ATCC 49239 Halobacteriales 3.6926 64 NC_012028.1,NC 01 2029.1 3726

Natrialba magadii ATCC 43099 Halobacteriales 4.4437 61 NC 013922.1 4364

Haloarcula hispanica ATCC 33960 Halobacteriales 3.89 62.5 NC_015943.1 ,NC_01 5948.1 3924

Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Halobacteriales 5.4408 64.2 NC 013743.1 5351

Halalkalicoccus jeotgali B3 Halobacteriales 3.6987 62.6 NC 014297.1 3925

Halopiger xanaduensis SH-6 Halobacteriales 4.3553 65.2 NC 015666.1 4370

Halogeometricum borinquense DSM 11551 Halobacteriales 3.9445 60 NC 014729.1 3993

Halomicrobium mukohataei DSM 12286 Halobacteriales 3.3324 65.5 NC_013202.1 3475

Halorhabdus utahensis DSM 12940 Halobacteriales 3.1168 62.9 NC_013158.1 3078

Haloferax medilerranei ATCC 33500 Halobacteriales 3.9047 60.3 NC 017941.1 3928

Natrinema sp. J7-2 Halobacteriales 3.7936 64.1 NC 018224.1 4360

Methanobrevibacter smithii ATCC 35061 Methanobacteriales 1.8532 31 NC 009515.1 1837

Methanothermobacter thermautotrophicus str. Delta H Methanobacteriales 1.7514 49.5 NC 000916.1 1921

Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 Methanobacteriales 1.7674 27.6 NC_007681.1 1591

Methanobrevibacter ruminantium M1 Methanobacteriales 2.9372 32.6 NC_013790.1 2283

Methanothermus fervidus DSM 2088 Methanobacteriales 1.2433 31.6 NC_014658.1 1352

Methanothermobacter marburgensis str. Marburg Methanobacteriales 1.6391 48.6 NC_014408.1 1806

Methanobacterium sp. AL-21 Methanobacteriales 2.5838 35.8 NC_015216.1 2584

Methanobacterium sp. SWAN-1 Methanobacteriales 2.5465 35.7 NC_015574.1 2500

Methanococcus maripaludis S2 Methanococcales 1.6611 33.1 NC_005791.1 1772

Methanococcus maripaludis C5 Methanococcales 1.789 33 NC 009135.1 1889

Methanococcus maripaludis C7 Methanococcales 1.7727 33.3 NC 009637.1 1855

Methanococcus maripaludis C6 Methanococcales 1.7442 33.4 NC 009975.1 1888

Methanococcus maripaludis XI Methanococcales 1.7467 32.9 NC 015847.1 1890

Methanococcus voltae A3 Methanococcales 1.9364 28.6 NC 014222.1 1768

Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 Methanococcales 1.7399 31.3 NC 000909.1 1823

Methanococcus vannielii SB Methanococcales 1.7201 31.3 NC 009634.1 1752

Methanococcus aeolicus Nankai-3 Methanococcales 1.5695 30 NC_009635.1 1552

Methanocaldococcus infernus ME Methanococcales 1.3282 33.6 NC 014122.1 1513

Methanocaldococcus fervens AG86 Methanococcales 1.5073 32.2 NC_013156.1 1665

Methanocaldococcus vulcanius M7 Methanococcales 1.7617 31.6 NC_013407.1 1808

Methanothermococcus okinawensis IH1 Methanococcales 1.6775 29.3 NC_015636.1 1672

Methanotorris igneus Kol 5 Methanococcales 1.8542 32.3 NC_015562.1 1843

Methanocaldococcus sp. FS406-22 Methanococcales 1.7731 32 NC_013887.1 1893

Methanocella paludicola SANAE Methanocellales 2.9576 54.9 NC_013665.1 3064

Methanocella arvoryzae MRE50 Methanocellales 3.1799 54.6 NC_009464.1 3170

Methanocella conradii HZ254 Methanomicrobia 2.3784 52.7 NC_017034.1 2574

Methanospirillum hungatei JF-1 Methanomicrobiales 3.5447 45.1 NC_007796.1 3294

Methanocorpusculum labreanum Z Methanomicrobiales 1.805 50 NC_008942.1 1822

Methanoregula boonei 6A8 Methanomicrobiales 2.5429 54.5 NC_009712.1 2517

Methanoculleus marisnigri JR1 Methanomicrobiales 2.4781 62.1 NC_009051.1 2557

Methanosphaerula palustris El-9c Methanomicrobiales 2.9229 55.4 NC_011832.1 2866

Methanoplanus petrolearius DSM 11571 Methanomicrobiales 2.8433 47.4 NC_014507.1 2881

Methanoplanus limicola DSM 2279 Methanomicrobiales 3.201 NZ_CM001436.1 3129

Methanofollis liminatans DSM 4140 Methanomicrobiales 2.4751 NZ_CM001555.1 2522

Methanosarcina barkeri str. Fusaro Methanosarcinales 4.8738 39.3 NC_007355.1 3830

Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcinales 5.7515 42.7 NC 003552.1 4721

Methanosarcina mazei Gol Methanosarcinales 4.0964 41.5 NC 003901.1 3434

Methanosaeta harundinacea 6Ac Methanosarcinales 2.571 60.6 NC_017527.1 2414

Methanosaeta thermophila PT Methanosarcinales 1.8795 53.5 NC_008553.1 1784

Methanosaeta concilii GP6 Methanosarcinales 3.0267 51 NC_015416.1 2927

Methanohalophilus inahii DSM 5219 Methanosarcinales 2.0124 42.6 NC_014002.1 2096

Methanohalobium evestigatum Z-7303 Methanosarcinales 2.4062 36.4 NC_014253.1 2437

Methanolobus psychrophilus R15 Methanosarcinales 3.0728 44.6 NC_018876.1 3229

Methanococcoides burtonii DSM 6242 Methanosarcinales 2.575 40.8 NC 007955.1 2497

Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcinales 2.1384 39.2 NC_015676.1 2086

Methanopyrus kandleri AVI 9 Methanopyrales 1.695 61.2 NC 003551.1 1729

Pyrococcus abyssi GE5 Thermococcales 1.7686 44.7 NC_000868.1 1878

Pyrococcus horikoshii OT3 Thermococcales 1.7385 41.9 NC 000961.1 2000

Pyrococcus furiosus DSM 3638 Thermococcales 1.9083 40.8 NC_003413.1 2225

Pyrococcus furiosus COMI Thermococcales 1.9098 40.8 NC_018092.1 2113

Thermococcus kodakarensis KOD1

Информация о работе

Марданов, Андрей Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Расшифровка структур геномов как основа изучения особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы