Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Распределение Р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB и изоформ α-актинина в связи с реорганизацией актинового цитоскелета в клетках А431
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Распределение Р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB и изоформ α-актинина в связи с реорганизацией актинового цитоскелета в клетках А431"

На правах рукописи

003468977

БОЛЬШАКОВА Анастасия Викторовна

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА ОТ-кВ И ИЗОФОРМ а-АКТИНИНА В СВЯЗИ С РЕОРГАНИЗАЦИЕЙ АКТИНОВОГО ЦИТО СКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 /»'н 'ГО

Санкт-Петербург 2009

003468977

Работа выполнена в Учреждении Институт цитологии РАН

Научный руководитель:

|й академии наук.

кандидат биологических наук Ольга Александровна Петухова Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Елена Сергеевна Корнилова Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Надежда Владимировна Кулёва Санкт-Петербургский государственный университет,

Биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: Институт канцерогенеза РОНЦ

им. Блохина

Защита состоится 22 мая 2009 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета

Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург,

Тихорецкий пр., д.4.

e-mail: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru

сайт: http://www.cvtspb.rssi.ru

факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан 22 апреля 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Одной из активно развивающихся областей современной клеточной биологии является изучение роли актинового цитоскелета в передаче сигнала и регуляции экспрессии генов.

Актиновые филаменты вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами образуют динамическую сеть в цитоплазме клеток, называемую цитоскелет, которая определяет форму клетки и лежит в основе клеточной миграции, участвует в межклеточной адгезии и адгезии клеток с матриксом (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999; Clark et al., 2002). Имеются данные, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточного сигнала. В частности, некоторые сигнальные молекулы способны непосредственно взаимодействовать с белками актинового цитоскелета на определенных этапах передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру (Yaraada, Geiger, 1997; Otey, Carpen, 2004; Legrand-Poels et al., 2007). Однако, по-прежнему, остаются невыясненными точные механизмы, с помощью которых актиновый цитоскелет принимает участие в сигнальных каскадах и регуляции экспрессии генов.

Ряд данных говорит о том, что реорганизация актинового цитоскелета может приводить к изменению активности транскрипционных факторов' (Sotiropoulos et ai., 1999; Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008). Реорганизация актинового цитоскелета происходит под влиянием ростовых факторов, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами. В то же самое время, факторы, вызывающие реорганизацию актинового цитоскелета, регулируют также активность транскрипционных факторов (Schoenwaelder, Burridge, 1999). Вероятно, реорганизация актинового цитоскелета сопровождается перегруппировкой белков актинового цитоскелета, входящих в состав сигнальных комплексов и взаимодействующих с транскрипционными факторами. Одним из таких транскрипционных факторов, регуляция которого может осуществляться в связи с реорганизацией актинового цитоскелета, является NF-кВ (Fazal et al., 2007, Nemeth et al., 2004).

Дополнительными фактами, указывающими на участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов, является открытие внутриядерных функций актина и актин-связывающих белков. Однако эти вопросы остаются, по-прежнему мало изученными. Одним из таких белков, способных взаимодействовать с транскрипционными факторами, является а-актинин (Poch et al., 2004; Goffart et al., 2006).

Настоящая работа является частью исследования, проводимого в Лаборатории биологии клетки в культуре в течение многих лет. Ранее в лаборатории было показано, что р65 субъединица NF-кВ солокализуется со стресс-фибриллами в цитоплазме

1

фибробласгов и при разрушении актинового цитоскелета р65 субъединица NF-kB остается связанной с агрегатами актина. Кроме того, рб5 субъединица NF-kB обнаруживалась в числе белков клеточных экстрактов, взаимодействующих с иммобилизованным F-актином (Are et al., 2000). Поиск белков, которые могут взаимодействовать как с актином, так и с р65 субъединицей NF-kB, указал на а-актинин, поскольку имеются данные о том, что киназа МЕКК1, которая является одним из активаторов NF-kB, способна напрямую взаимодействовать с а-актинином in vitro (Christerson et al., 1999). В немышечных клетках встречаются две изоформы а-актинина: а-актинин-1 и а-актинин-4. Особенностью а-актинина-4 является его способность транслоцироваться в ядро, где он может взаимодействовать с промоторами генов (Goffart et al., 2006) и выступать как кофактор транскрипции (Chakraborty et al., 2006). Исследования Лаборатории биологии клетки в культуре показали солокапизацию р65 субьединицы NF-kB и а-актининов в цитоплазме клеток А431, в особенности в области дорзальных раффлов. Более того, а-актинин-4 был обнаружен в ядре (Бабаков и др., 2004). Несмотря на солокапизацию обоих а-актининов и р65, в мультибелковых комплексах ядерных и цитоплазматических экстрактов после реакции иммунопреципигации с антителами к р65 субъединице NF-kB выявлялся только а-актинин-4 (Бабаков, 2004). Поэтому возникла необходимость детального исследования областей солокализации, а также сравнения распределения в субклеточных фракциях а-актинина-1, а-актинина-4 и р65. Кроме того, обнаружение а-актининов и р65 в одних и тех же белковых комплексах не является доказательством их прямого взаимодействия.

Работа была проведена на клетках А431, распластанных на фибронектине, для которых хорошо охарактеризованы структуры актинового цитоскелета и его реорганизация под влиянием эпидермального фактора роста (ЭФР) (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). Однако до сих пор не было исследовано, каким образом происходит перераспределение р65 в связи с реорганизацией актинового цитоскелета и важны ли актиновые структуры дня транслокации р65 в ядро.

Цели и задачи работы

Цель настоящей работы заключалась в выяснении участия актинового цитоскелета в перераспределении р65 субъединицы NF-kB, а также в сравнительной оценке участия а-актинина-1 и а-актинина-4 в событиях, связанных с активацией NF-kB.

В работе были сформулированы следующие задачи: '

1. Исследовать возможность транслокации р65 в ядро в условиях разрушения актинового цитоскелета после обработки клеток цитохалазином Д (ЦХ Д).

2. Исследовать влияние ЭФР, вызывающего реорганизацию актинового цитоскелета, на распределение р65, F-актина, а-актинина-1 и а-актинина-4 в цитоплазме и охарактеризовать области их солокализации.

3. Определить совместное присутствие р65, а-актинина-1 и а-акгинина-4 в различных субклеточных фракциях, соответствующих разным компартментам.

2

4. Исследовать возможность прямого взаимодействия а-актининов и NF-кВ in vitro с использованием метода аффинной хроматографии (GST-pull-down).

5. Исследовать возможность участия а-актишша-4 в реакции связывания NF-кВ с консенсусными последовательностями кВ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ЭФР стимулирует в клетках А431 два процесса: накопление р65 субъединицы NF-кВ в ядре и перераспределение р65 в цитоплазме. Наблюдается как зависимое от актиновых структур перераспределение, так и независимое.

2. В областях дискретной локализации р65 в цитоплазме, названных пэтчами, обнаруживаются белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией.

3. а-Актинин-1 и а-актинин-4 демонстрируют как общие, так и специфичные черты в характере распределения.

4. а-Актинин способен напрямую взаимодействовать с N-концевой последовательностью р65 субъединицы NF-кВ in vitro.

5. При добавлении а-актинина комплекс р65 субъединицы NF-кВ с кВ-специфичной последовательностью ДНК сохраняется.

Научная новизна полученных результатов

В работе впервые показано, что в клетках А431 ядерная транслокация р65 под влиянием ЭФР может происходить в клетках с разрушенным актиновым цитоскелетом при отсутствии стресс-фибрилл и раффлов. Описаны дискретные актинсодержащие области локализации р65 субъединииы NF-кВ в цитоплазме, включающие также белки, характерные для комплексов фокальной адгезии. Продемонстрированы особенности распределения а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431, показана способность непосредственного взаимодействия а-актинина с N-концевой последовательностью р65 субъединицы NF-kB.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты имеют фундаментальное значение для понимания роли актинового цитоскелета и актинсвязывающих белков в качестве участников регуляции активности транскрипционных факторов и экспрессии генов. Компоненты актинового цитоскелета, такие как актинсвязывающие белки, могут являться посредниками между транскрипционными факторами и актиновыми структурами. Более того, они могут сопровождать факторы транскрипции в процессе их активации в цитоплазме и участвовать в реализации их функций в ядре. Полученные данные могут быть использованы при проведении лекционно-практических занятий в СПбГУ и СПбГПУ.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах и 11 тезисов.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2006, 2007), на 11-й и 12-й Пущинской

3

международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007 , 200В), на международных конференциях American Society for Cell Biology (Сан Диего, 2006; Вашингтон, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН. Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 10 декабря 2008 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 174 ссылки. Диссертация изложена на 130 страницах. Иллюстративный материал содержит 7 схем, 25 рисунок и 1 таблицу.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов СПб НЦ РАН (2007 г.), РФФИ (#7852.2006.4), Ведущих научных школ (#07-04-011-90-а), гранта Visby Шведского института (#1361/2006).

Материалы и методы

Культивирование клеток А431. Клетки эпидермоидной карциномы линии А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота при 37 "С в атмосфере 5 % СОг.

Адгезия клеток на фибронектине. Фибронектин в концентрации 10 мкг/мл наносили на гидрофобные чашки Петри или силиконизированные покровные стекла (ночь, +4 °С), затем обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Клетки снимали смесью трипсина и версена в соотношении 3:7. Суспензию клеток в среде ДМЕМ (1.25х10б клеток/мл) наносили на гидрофобные чашки Петри (90 мм) или покровные стекла (1.5x105 кпеток/мл), покрытые фибронектином, и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч в атмосфере 5 % СОг. Клетки на чашках использовали для биохимических исследований, а клетки на стеклах анализировали с помощью иммунофлуоресценции. ЭФР человека добавляли в концентрации 100 нг/мл, ЦХ Д- в концентрации 2 мкг/мл.

Иммунофлуоресценция. Клетки фиксировали в течение 10 мин 3.7 %-иым раствором параформальдегида, а затем пермеабилизировали 0.1 %-ным раствором Тритона Х-100. Препараты инкубировали с первыми антителами против р65 субъединицы NF-кВ, а-актинина-1, а-актинина-4, винкулина или паксиллина и соответствующими вторыми антителами (каждая инкубация по 40 мин) с трехкратной промывкой 0.1 % Tween/PBS после каждой инкубации. Для выявления актинового цитоскелета клетки окрашивали Родамин-фаллоидином в течение 10 мин. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 им для вторых антител Alexa 488; НеЫе-лазер с длиной волны 543 нм для Alexa 568 и родамин-

4

фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала Alexa 488 и Alexa 568 (или Родамин-фаллоидина). Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software. Для анализа присутствия р65 на стресс-фибриллах свободные белки цитоплазмы экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, 5мМ ЭДТА рН 6.8, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.01 % дигитонина. Мембранные белки экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, ЗмМ ЭДТА рН 7.4, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.5 % Тритона Х-100 (Chiang etal., 2000).

Субклеточное фракционирование

Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков. В процессе подбора условий для субклеточного фракционирования использовали следующие буферные растворы: буфер 1: 0.32 М сахарозы, 2 мМ MgCI2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 % Тритона Х-100, 10 мМ трис-HCl рН 8.0, 1 мМ ДТТ, 0.1 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз; буфер 2: буфер 1, без Тритона Х-100; буфер 3: буфер 1, содержащий 0.05 % Тритона X-100. Клетки лизировали в одном из буферных растворов и осаждали ядра при 2000g, 10 мин. Супернатант содержал цитоплазматическую фракцию. Осадок ядер дополнительно очищали центрифугированием в 0.5 М сахарозе (Марзлав, Хуан, 1987). Ядерные фракции, содержащие транскрипционные факторы (0.4 М NaCl фракция), экстрагировали буфером, содержащим 400 мМ NaCl, 20 мМ HEPES рН 7.9, 25 % глицерина, 1.5 мМ MgCl2, 0.4 мМ ЭДТА, 0.4 мМ PMSF, 1 мМ ДТТ, 2 мМ Na3V04, и центрифугировали при 12000g, 30 мин. Осадок содержал белки, условно названные "прочно связанные с хроматином". Концентрацию белков в ядерных и цитоплазматических экстрактах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Получение ядерных подфракций по методу Двайера и Блоубела с модификациями (Dwyer, Blobel, 1976). Для лизиса клеток использовали буфер: 250 мМ сахарозы, 1 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 25 мМ трис НС1 рН 7.2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 1 мМ Na,V04, коктейль ингибиторов протеаз (Blobel, Potter, 1966; Бабаков и др., 2004). Ядра осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0.1 мМ MgCl2 с последующим добавлением ДНКазы I (100 мкг/мл), 10 % сахарозы, 10 мМ триэтаноламина (ТЭА) рН 8.5 и 0.1 мМ MgCl2 (20 мин, 22 °С). Смесь центрифугировали через 30 %-кую сахарозу (18000 g, 10 мин при +4 °С). Надосадочная жидкость содержала белки нуклеоплазмы (D^). Эту процедуру повторяли дважды. Тритон-растворимую фракцию белков ядерной оболочки (D2TS) экстрагировали в буфере: 10 % сахарозы 10 мМ ТЭА рН 7.5, 0.1 мМ MgCl2H 2 % Тритона Х-100 (10 мин при +4 °С) и центрифугировали 10 мин при 18000 g и +4 °С. Осадок ресуспендировали буфером, содержащим 10 % сахарозы, 10 мМ ТЭА рН 7.5,0.1 мМ MgCl2 и 2 % Тритона Х-100, далее добавляли 2 М NaCl, 100 мМ ТЭА рН 7.5 для получения белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей (D2TSs), после центрифугирования осадок содержал белки комплекса ядерной ламины (D2TSp).

Фракционирование с помощью коммерческого набора (Qiagen, Германия) с получением фракций несвязанных цитоплазматических белков, мембранных белков, белков, связанных с цитоскелетом, и белков ядерной ламины проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Иммуноблотинг белковых экстрактов клеток проводили по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Антитела к р65 субъединице NF-кВ, а-актинину-1 и а-актинину-4 использовали в разведении 1:1000, вторые антитела - в разведении 1:2000 (Dako).

Получение меченых двуцепочечных ДНК зондов (Fermentas). Реакцию мечения специфического олигонуклеотида (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') проводили в соответствии с рекомендациями фирмы Fermentas. Использовали у-32 Р-АТФ фирмы Amersham (Швеция) и Т4 полинуклеотидкиназу фирмы Fermentas (Литва). Радиоактивность определяли на счетчике фирмы Beckman. Для получения двуцепочечного фрагмента ДНК проводили отжиг меченых олигонуклеотидов с комплементарными немечеными олигонуклеотидами в 0.1 М NaCl: смесь нагревали до 78 °С и давали остыть до tK0Mn.

Анализ ДНК-связывающей активности ядерных экстрактов методом торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (Dent et al., 1999). Реакцию связывания специфического меченого олигонуклеотида с белками ядерных экстрактов проводили в буферном растворе 50 мМ КС1, 20 мМ HEPES, 10 мМ MgCb, 10% глицерина, 0.5 мМ ДТТ в присутствии 1000-кратного избытка неспецифического конкурента (poly[dI-dC]) в течение 20 мин, tK0MH. В реакцию брали не менее 30000 имп/мин меченого олигонуклеотида и 7 мкг ядерного экстракта. При конкурентном анализе в реакцию добавляли антитела к р65 и р50 субъединицам NF-кВ или а-актинину-4 (20 мин, tK0MH). ДНК-белковые комплексы разделяли в нативном 4 %-ном ПААГ в трис-ацетатном буфере при 100 В. Высушенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой фирмы Kodak в течение необходимого времени.

Сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блот-анализа (Demczuk et al., 1993). Реакция связывания и разделения ДНК-белковых комплексов проводили так же, как описано выше. После переноса в трис-глициновом буфере, содержащем 20 % метанола и 0.1 % SDS с помощью установки для переноса (BioRad, США), белковый компонент связывался с нитроцеллюлозой, а ДНК - с мембраной ДЕ81. После переноса нитроцеллюлозу блокировали 5 %-ным обезжиренным сухим молоком и инкубировали с первыми и вторыми антителами. Для усиления сигнала использовали систему хемилюминесценции ECL. Хемилюминесцентное излучение регистрировали с помощью рентгеновской пленки. Мембрану ДЕ81 экспонировали с рентгеновской пленкой.

Метод GST-pulldown. Для анализа прямого взаимодействия N-или С- концевых доменов р65 субъединицы с очищенными белками, а-актинином-1 и а-актинином-4 использовали рекомендации фирмы Amersham.

Для экспрессии в Е. coli, штамм BL21 использовали плазмиды pGEX 4Т-1, содержащие N-концевую последовательность р65 (аминокислоты 1-357) и С-концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550), сшитые с глютатион S -трансферазой (GST). После индукции IPTG белки, иммобилизованные на глютатион-сефарозе (Amersham), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии.

Реакцию связывания иммобилизованных N- и С- концевых последовательностей р65 с выделенными белками, а-актинином-1 и а-актинином-4, проводили в буферном растворе PBS. а-Актинин, выделенный из желудков цыпленка, обогащенный а-актинином-1, и а-актинин, выделенный из подоцитов почек свиньи, обогащенный а-актинином-4, любезно предоставлены В.Н. Бабаковым. К различным аликвотам сефарозы с пришитыми последовательностями р65 добавляли по 20 мкг очищенных белков, а-актинина-1 или а-актинина-4, и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч при +4°С. Сефарозу многократно отмывали от несвязавшихся белков растворами 1 %-ного Тритона X-100/PBS и PBS и анализировали связавшиеся белки с помощью электрофореза (Laemmli, 1970) и вестерн-блота с окраской антителами кр65 субъединице, а-актинину-1 или а-актинину-4.

Анализ ДНК-связыеающей активности выделенных белков методом торможения подвижности ДНК в геле (in vitro band-shift). Для получения свободных N- или С- концевых последовательностей р65 субъединицы в растворе GST-сефарозу, содержащую N- и С-концевые домены р65, инкубировали с тромбином (0.125 ед/мкл) в течение ночи. Реакцию связывания N- и С- доменов р65 со специфическим меченым олигонуклеотидом проводили как описано выше. Очищенный а-актинин добавляли непосредственно в реакцию связывания N-концевого р65 с кВ-специфической последовательностью ДНК.

Статистическая обработка данных. Электрофореграммы после иммуноблотинга и in vitro band-shift анализировали с помощью программы Scion image. В подсчетах средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов использовали программу Microsoft Excel. Солокализацию белков после иммунофлуоресцентного анализа проводили с использованием программы Image J. Области перекрывания белков и ДНК-белковых комплексов после анализа методом shift-western получены с использованием программы Adobe Photoshop.

Результаты и обсуждение

Распределение RelA/p65 в клетках А431 при адгезии к фибронектину и воздействии ЭФР [1, 2, 3, 7, 10]. Распластывание на фибронектине приводило к формированию стресс-фибрилл у большинства клеток в популяции, создавая

7

единообразную структуру актинового цитоскелета (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). Под влиянием ЭФР наблюдалась согласованная реорганизация актинового цитоскелета, заключающаяся в расхождении существующих стресс-фибрилл к краям клеток и частично к их разборке и в последующем восстановлении стресс-фибрилл по всему телу клеток.

На рис.1 представлено распределение р65 и F-актина в клетках А431, распластанных на фибронектине. Приведены вертикальные и горизонтальные срезы. Можно видеть, что р65 обнаруживается солокализованно со стресс-фибриллами и диффузно (независимо от актиновых филаментов) в цитоплазме, причем более плотно в перинуклеарной области, а также в ядре (рис.1, А, А'). Воздействие ЭФР в течение 5 мин, когда происходит реорганизация актинового цитоскелета и образуются дорзальные раффлы, р65 обнаруживается в дорзальных раффлах (рис.1, Б - апикальный срез). Р65, окрашиваемый независимо от F-актина (диффузно), перераспределяется по направлению к краю клеток, как это можно видеть на срезе, сделанном в вентральной области клеток (рис.1, Б, б). Через 30 мин воздействия ЭФР RelA/p65 наблюдается солокализованно со стресс-фибриллами и накапливается в ядре, а также распределяется диффузно по всей цитоплазме (рис.1, В). Солокализацию на стресс-фибриллах, полученную с помощью программы Image J, можно видеть на рис.1, А', Б', В', где представлены срезы в вентральной области клеток (красные). Солокализация р65 со стресс-фибриллами в клетках после 30-мин воздействия ЭФР представлена на рис.1, Д после экстракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков.

Р65 также обнаруживался в дискретных областях в цитоплазме, солокализованно с F-актином. Эти области, обозначенные рамкой на рис.1, В, представлены более детально на рис.1, Г, на срезе, проведенном ближе к апикальной поверхности клетки по сравнению с рис.1, В, где видно, что актин в этих зонах расположен в виде «клубка» и, по-видимому, р65 расположен внутри этого «клубка».

Таким образом, на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, вызванных адгезией к фибронектину и воздействием ЭФР, RelA/p65, помимо диффузного распределения, выявлялся солокализованно с актин-содержащими структурами разных типов.

Возник вопрос, не может ли происходить транслокация RelA/p65 в ядро под влиянием ЭФР с помощью этих лабильных структур F-актина. Одним из фактов в пользу участия раффлов в активации и транспорте RelA/p65 служат данные других авторов (Boyer et al., 2004). Образование дорзальных раффлов в нашем случае характерно для клеток после 5 мин воздействия ЭФР. Их формирование в клетках А431 было показано другими авторами после 1-5 мин стимуляции ЭФР (Araki et al., 2007). Накопление р65 в ядре под влиянием ЭФР мы выявляли методом иммуноблота.

Н актина в клетках А431 под влиянием

'i^lpBl фибронектина и ЭФР.

Иммунофлуоресцентный анализ,

jffi^^'ffe ^/''-.^Я Окраска антителами к р65 (зеленый) и

' Родамин-фаллоидином (красный). А

шкъ- Jki^^'* - ^^ИЙ^^И клетки< распластанные на фибронектине I ч.

-. Б - 5 мин ЭФР. срез в апикальной области, б-

| ч^И срез в вентральной области. В - 30 мин ЭФР.

Г - области дискретной локализации р65 (увеличено), п - срез в области ядра Стрелками указаны области солокализации (желтый). А', Б', В' -солокализация выявлена с помощью программы Image J (красный), срезы в вентральных областях клеток. Д — локализация р65 на стресс-фибриллах после экстракции белков цитоплазмы и мембранных белков. Объектив 63х.

В цитоплазматической фракции не выявлены изменения доли р65 ни в клетках, культивируемых на пластике, ни в клетках, распластанных на фибронектине. Доля р65 во фракции белков, экстрагируемых 0.4 М ЫаС1, в клетках, культивируемых на пластике, увеличивалась в 5 раз под влиянием ЭФР (рис.2, А), тогда как в клетках, распластанных на фибронектине, наблюдалось увеличение в 2.5 раза (рис.2. Б),

поскольку само по себе распластывание на фибронектине сопровождалось увеличением доли р65.

Воздействие ЦХ Д на клетки приводило к разрушению актинового цитоскелета и образованию агрегатов актина. Удаление ЦХ Д и добавление ДМЕМ сопровождалось восстановлением стресс-фибрилл, тогда как добавление ЭФР препятствовало их восстановлению; И-актин в этом случае был представлен крупными агрегатами. Если ЭФР добавляли непосредственно в среду, содержащую ЦХ Д, то не наблюдалось даже образования крупных агрегатов, весь Б-актин был представлен мелкими агрегатами по

Рис.2. Накопление RelA/p65 в ядре под воздействием ЭФР.

Вестерн-блот-анализ. А- клетки,

культивируемые на пластике. Б- клетки, распластанные на фибронектине. В - клетки, распластанные на фибронектине (К, 1), обрабатывали ЦХ Д (2) для разрушения актинового цитоскелета, после чего заменяли среду, содержащую ЦХ Д, на чистую ДМЕМ (3, 6) или ДМЕМ, содержащую ЭФР (4, 7) или ЭФР в присутствии ЦХ Д (5, 8). На диаграммах приведены численные значения интенсивности полосы белка с подвижностью 65 кДа. Количественный анализ проводили с использованием программы Scion Image. На диаграммах оси ординат - интенсивность полосы, усл.ед. р<0.05, п=3.

Раффлы в этом случае не были обнаружены. Вестерн-блот-анализ

показал, что накопление р65 в ядре №, как в присутствии ЦХ Д, так и без него (рис.2, В). Следует отметить, что самого по себе восстановления актиновых филаментов в отсутствие стимуляции клеток ЭФР оказалось не достаточно для транспорта Яе1А/р65 в ядро.

Таким образом, опыты с ЦХ Д доказали, что транслокация р65 в ядро не зависит от наличия стресс-фибрилл и раффлов.

Особого внимания заслуживают области дискретной локализации Ке1А/рб5 (пэтчи). Как показано на рис. I, Р-актин в пэтчах расположен в виде «клубка», а р65 обнаруживается внутри этого «клубка» по всей толщине клетки, поскольку р65 можно видеть как на вентральных, так и на апикальных срезах. Таким образом, конфокальные срезы показали возможность контакта р65 в этих областях с основанием клетки, что предполагает связь этих структур с клеточной адгезией.

всему телу клеток.

A js>\rf

,AJ .A*

кДуК ^ 7256-

S Л? h <f

кЛя К

72-

Ьб-]

= ¡± й U ::: й й

к 5'эфрзо'эфр к 5'эфр зо'эфр

в

//////у

кДа к -ft* У # <У~ -У

происходило только в случае добавления Э<£

Рис. 3. Акгин-содержащие зоны дискрешой локализации RelA/p65 в цитоплазме (пэтчи) клеток, распластанных на фибронектине после

воздействия ЭФР.

Иммунофлуоресцентньгй анализ. Окраска антителами к а-акгинину-1, а-акгинину-4,

пакснллину. винкулину

(красный) и RelA/p65 {зеленый). Стрелками указаны зоны дискретной локализации р65. Масштабный отрезок - 8 мкм. Объектив 63х.

Чтобы проверить это предположение, был

проведен иммунофлуоресцентный анализ с антителами к белкам, характерными для комплексов фокальной адгезии. Данные,

приведенные на рис.3, демонстрируют присутствие а-актинина-1, а-актинина-4, винкулина и паксиллина в этих областях. Такие белки характерны для еще одного типа динамичных F-актин-содержащих структур, подосом, которые впервые были описаны в трансформированных фибробластах (Linder, Aepfelbacher, 2003, Varón et а), 2006). Как было показано, подосомы постоянно разбираются и собираются в клетке около концов стресс-фибрилл, в области, граничащей с комплексами адгезии (Kaverina et а!., 2003; Burgstaller, Giraona, 2004). Подосомы отличаются от фокальной адгезии присутствием металлопротеаз, однако методом иммунофлуоресценции мы не обнаружили присутствия этих ферментов. Данных, свидетельствующих о присутствии RelA/p65 в подосома-подобных структурах, в литературе найти не удалось. Следовательно, вопрос о природе пэтчей пока остается открытым; вероятнее всего, они связаны с фокальной адгезией (Sastry, Burridge, 2000; Lock et al., 2008).

Очень важно, что размеры дискретных зон. в которых обнаружена солокализация р65 с белками адгезии, увеличивались, если ЭФР добавляли к клеткам, актиновый цитоскелет которых был разрушен ЦХ Д. Подобные зоны мы стабильно обнаруживали

а-Актинин 1 RelA/p65 Совмещение

W

а-Актинин 4 RelA/p65 Совмещение

» i

Паксиллин RelA/p65 Совмещение

vj

ВНИКУЛИН 1 L. 'ш Совмещение ■ьЛ.Я

в клетках, распластанных на фибронектине, после добавления ЭФР. Полученные данные позволяют предположить, что р65 накапливается в этих областях под влиянием ЭФР. Следовательно, присутствие р65 в дискретных актин-содержащих областях цитоплазмы, включающих белки, характерные для фокальной адгезии, является одним из этапов активации NF-кВ в клетках А431.

Сравнительный анализ распределения изоформ а-актинина в клетках и выделенных субклеточных фракциях [4, 5, 6, 8, 14]. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что обе изоформы а-актинина в клетках, распластанных на фибронектине, солокализуются со стресс-фибриллами и диффузно распределяются по цитоплазме клеток. Особенностью а-актинина-1 является его локализация в околоядерной области. а-Актинин-4 обнаруживался в ядре и, более плотно, на концах стресс-фибрилл (рис.4). После воздействия на клетки ЭФР солокализация а-актининов со стресс-фибриллами сохранялась, обе изоформы обнаружены также в раффлах, что подтверждает полученные ранее данные (Бабаков и др., 2004). Локализация а-актининов на стресс-фибриллах была показана также другими авторами (Honda et al., 1998). Особенностью настоящей работы является обнаружение а-актинина-4, в отличие от а-актинина-1, на концах стресс-фибрилл. Эти данные отличаются от результатов работы Хонды и соавторов, проведенной на фибробластах эндометрия матки, где а-актинин-1 обнаруживачся на концах стресс-фибрилл (Honda et al., 1998). Такое несоответствие может быть связано с особым характером распределения а-актининов в клетках эпителиального ряда. Другой причиной может служить влияние адгезии к фибронектину, приводящее к перераспределению а-актинина-4 в области фокальных контактов, как это было сделано в настоящей работе.

•тт п

4¡T , k Г" /

Рис.4. Распределение а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431,

распластанных на

фибронектине.

Окраска антителами к а-актинину-1 и а-актинину-4 (зеленый). Р-актин окрашивали родамин-фаллоидином (красный). Стрелкой указана локализация а-актинина-1 в перинуклеарной области, а-актинина-4 в ядре и на концах стресс-фибрилл. Объектив 63 х

Отличия в распределении а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431 были выявлены путем субклеточного фракционирования. Для этого клетки фракционировали с получением суммарной цитоплазматической фракции, ядерной фракции белков.

экстрагируемых 0.4 M NaCl, обогащенной транскрипционными факторами, и фракции белков, «прочно связанных с хроматином».

Было также проведено фракционирование ядер другим способом с получением фракции белков нуклеоплазмы, тритон-растворимых белков ядерной оболочки, белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей и белков комплекса ядерной ламины. В цитоплазме клеток, культивируемых на пластике, выявлялся только полноразмерный а-актинин-1 в отличие от а-актинина-4, для которого было характерно присутствие укороченной формы -75 кДа. Перевод клеток в суспензионное состояние и адгезия к фибронектину приводили к появлению укороченной формы а-актинина-1 в этой фракции (рис.5, А).

Рис. 5. Особенности распределения а-актинина-1 и а-актинина-4 в субклеточных фракциях клеток А431.

Вестерн-блот-анализ. А - цитоплазма. Влияние адгезии к фибронектину. Б-. -ядерная фракция 0.4 M NaC.1. В - фракция белков, «прочно связанных с хроматином». Г - ядерные подфракции. ПЛ - клетки, культивируемые на пластике. С - клетки в суспензионном состоянии, ФН - клетки, распластанные на фибронекгине. DIS (нуклеоплазма). D2TS (тритон-растворимая фракция белков ядерной оболочки), D2TSs (фракция белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей) и D2TSp (фракции белков комплекса ядерной ламины).

а-Актинин-4 стабильно выявлялся в ядре. В ядерной фракции белков, экстрагируемых 0.4 М МаС1, обогащенной транскрипционными факторами, и фракции белков, «прочно связанных с хроматином», обнаруживался полноразмерный а-актинин-4, фрагмент с мол. массой -65 кДа, а также высокомолекулярный белок с мол. массой -150 кДа (рис.5, Б, В). Фракционирование ядер другим способом показало присутствие а-актинина-4 во всех ядерных подфракциях. Ситуация с выявлением а-актинина-1 в ядре оказалась более сложной, в отдельных экспериментах можно было обнаружить полноразмерный а-актинин-1 либо его фрагмент (рис.5, Б). В случае фракционирования ядер другим способом а-актинин-1 обнаруживался в тритон-растворимой фракции ядерной оболочки и фракции комплекса ядерной ламины и отсутствовал во фракции нуклеоплазмы и фракции ядерных белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей. Эти особенности распределения могут быть связаны с тем, что а-актинины принадлежат к белкам цитоскелета, и при использовании различных буферных растворов для лизиса клеток цитоскелетная фракция может загрязнять ядерную фракцию. В нашем случае буферные растворы различаются присутствием Тритона Х-100. Так. при фракционировании ядер другим способом по методу Двайера и Блоубела (0\ууег, В1оЬе1, 1976) Тритон Х-100

отсутствовал; вероятно, в этом случае сохранялась связь а-актинина-1 с ядерной мембраной (рис.5, Г).

Вероятно, тесное взаимодействие а-актинина-1 с ядерной оболочкой является общим свойством для спектринсодержащих белков. Исследования последних лет показали, что в наружной мембране ядерной оболочки присутствуют белки несприны, имеющие а-актинин-подобный актинсвязывающий домен (Zhang et al., 2001. Young, Kothary, 2005). Присутствие а-актинина-4 в ядре показано всеми применяемыми способами, подтверждает данные, ранее полученные в лаборатории, и данные других авторов и не вызывает сомнений (Бабаков и др., 2004; Poch et al., 2004, Chakraborty et al., 2006).

Совокупные результаты, полученные при сравнении нескольких биохимических методов и иммунофлуоресцентного анализа, свидетельствуют о том, что помимо того, что а-актинины являются типичными белками цитоплазмы, а-актинин-1 прочно связан с мембраной ядерной оболочки, а а-актинин-4 является лабильным белком и может присутствовать в разных ядерных подфракциях.

Совместное распределение а-актинина-1 и а-актинина-4 в и рб5 субъединицы NF-кВ в клетках А431 [9, 11, 12].

Рис.6. Совместное

распределение р65, а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431, распластанных на фибронектине и после добавления ЭФР. Иммунофлуоресценгныи анализ.

Окраска антителами к а-актинину-1 и а-актинину-4 {красный), и к р65 {зеленый). Области солокализации {красные) выявлены с помощью программы Image J. Объектив 63х.

Результаты иммунофлуоресцентного анализа приведены на рис.6. Области солокализации р65 субъединицы NF-кВ с а-актинином-1 или 4, выявленные с помощью программы Image J, представлены на рис.6 как области, окрашенные красным цветом. Солокализация этих белков выявляется в области стресс-фибрилл, а после

воздействия ЭФР- в раффлах. Присутствие а-актинина-1 и а-актинина-4 в дискретных областях, содержащих р65, в цитоплазме (пэтчах), возникающих после воздействия ЭФР, было представлено ранее на рис.3.

Для того, чтобы проверить совместное присутствие этих белков в разных субклеточных фракциях, было проведено субклеточное фракционирование с использованием коммерческого набора (Qiagen) с получением фракций свободных белков цитоплазмы, мембранных белков, ядерных и цитоскелетных белков (рис.7). Мы обнаружили присутствие р65, а-актинина-1 и а-актинина-4 во всех анализируемых фракциях. Особенность заключалась в разном наборе белков, узнаваемых антителами к исследуемым белкам.

Полноразмерный р65 был обнаружен во всех субклеточных фракциях. Во фракции свободных белков цитоплазмы антитела к р65 узнавали, кроме того, высокомолекулярный белок с мол. массой около 150 кДа. Укороченные формы р65 обнаруживались во всех фракциях кроме цитоскелетной. Цитоскелетная фракция также характеризовалась присутствием белка с мол. массой -100 кДа (рис.7). Полноразмерный а-актинин-1 был обнаружен во всех субклеточных фракциях, в том числе в ядерной. Мы полагаем, что это связано с тем, что ядерная фракция может содержать белки ядерной оболочки. Укороченная форма а-актинина-1 с мол. массой -75 кДа выявлялась в двух фракциях: цитоплазматических и мембранных белков. В отличие от а-актинина-1, как полноразмерный а-актинин-4 , так и укороченная форма -75 кДа были обнаружены во всех фракциях.

Фракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков были обогащены этим фрагментом. Кроме того, во фракциях цитоплазматических, мембранных и ядерных белков выявлялся фрагмент -65 кДа. В ядерной фракции обнаружили также фрагмент ~55кДа.

кДа 170- А р65 акт1 акт4 кДа 170п Б р65 акт1 акт4 кДа 170п В р65 агсг 1 акт4 кДа 170- г р65 акт! акт4

130- 130- 130- 130-

95J — «в» 95- «■» тш 95- — mm 95-

72- т "" 72- т 72- т ~~ 72- т

55- 55- 55- ЯШ 55-

43- 43н 43 н 43-

34- 34- 34- 34-

Рис.7. Ко1А/р65, а-актинин-1 и а-актинин-4 в субклеточных фракциях, полученных с помощью коммерческого набора фирмы QiageIl.

Вестерн-блот-анализ фракции свободных белков цитоплазмы (А), мембранных белков (Б), ядерных белков (В) и белков цитоскелета (Г) клеток, распластанных на фибронектине.

Таким образом, субклеточное фракционирование позволило выявить дополнительные различия в распределении изоформ а-актинина, показывая особый

характер состава цитоскелетной фракции и демонстрируя особенности распределения укороченных форм всех исследуемых белков.

Роль укороченных форм а-актинина и р65 в клетках А431 остается пока не выясненной, хотя данные о появлении фрагмента ~75 кДа а-актинина-1 в суммарной цитоплазматической фракции после распластывания клеток А431 на фибронектине (см. рис.5) могут свидетельствовать о взаимосвязи процессов адгезии и образования фрагментов.

Существование фрагментов RelA/p65 было показано для различных типов клеток. В литературе описаны фрагменты р65 с мол. массами 53-55 кДа, 42-45 кДа и 37 кДа (Chapman et al., 2002). Подобные укороченные формы р65 были найдены в эндотелиальных клетках, миеломоноцитах, Т-клетках, клетках костной ткани, HeLa и других клетках (Narayanan et al.,1992; Ruben et al., 1992).

Образование укороченных форм а-актинина было показано другими авторами in vivo и доказано их важное физиологическое значение (Selliah et al., 1996; Pavalko et al., 1998; Communal et al., 2002; Luikart et al., 2002). Фрагменты могут быть получены in vitro при протеазном расщеплении а-актинина трипсином, термолизином и химотрипсином (Immure et al., 1988; Communal et al., 2002).

Прямое взаимодействие RelA/p65 и а-актинина [13].

На вопрос о прямом взаимодействии белков можно ответить с использованием метода GST pull-down. Данный метод заключается в изучении взаимодействия белков, иммобилизованных на GST-сефарозе, с очищенными белками. Е. coli трансформировали плазмидами pGEX 4Т-1, содержащими N-концевую последовательность р65 (аминокислоты 1-357) и С- концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550). После индукции IPTG белки, сшитые с глютатион S -трансферазой (GST), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии на глютатион-сефарозе. Для взаимодействия N- и С- концевой последовательности р65 были использованы очищенные белки, обогащенные а-актинином-1, или а-актинином-4.

Результаты вестерн-блот-анализа после разделения реакционной смеси в системе SDS-электрофореза, приведенные на рис.8, демонстрируют, что только N-концевая последовательность взаимодействует с а-актинином. Причем, установлено взаимодействие как с а-актинином, выделенным их почек свиньи (а-актинин-4), так и с а-актинином, выделенным из желудков цыплят (а-акгинин-1). Таким образом, специфичность по отношению к одному из а-актининов выявить не удалось. Это подтверждает полученные ранее данные о том, что р65 обнаруживается среди белков, взаимодействующих с иммобилизованным а-актинином, выделенным из желудков цыплят (а-актинином-1) (Бабаков, 2004).

А

кДа

+ «jfV

g-Акт! а-Акт4

pGex N-домен С-домен ,1 2 3 12 3 1 2 3

а-Актинин

В

^ pGex N-домен С-домен кДа, § 1 2 3 1 2 3 1 2 3

а-Актинин 4

Рис. 8. Анализ взаимодействия N- и С-концевых доменов р65, иммобилизованных на глютатион-сефарозе, с а-актинином (метод GST pulldown).

Вестерн-блот-анализ с антителами к а-актинину-1 и а-актинину-4.

А - Контроль без добавления а-актининов к GST-сефарозе. Б - взшшодействие с а-актинином-1. В -взаимодействие с а-актинином-4. На дорожки наносили уменьшающиеся количества глютатион-сефарозы (1,2, 3). pGex - контроль, не содержащий последовательности р65.

Возможность участия а-актинина-4 в реакции ДНК-связывания NF-кВ с консенсусньши последовательностями к В [13].

Данные в пользу того, что а-актинин может являться кофактором NF-кВ, впервые были исследованы в Лаборатории биологии клетки в культуре (Бабаков и др., 2004). В литературе описаны белки, кофакторы транскрипционного фактора NF-кВ, участвующие в регуляции NF-кВ-зависимых генов. Более подробно роль белков-коактиваторов описана для HMG 1(Y), c-jun, ATF-2, IRF (IFN regulated factor) (Thanos, Maniatis, 1995), CREB-связывающего белка (СВР/300). Некоторые из кофакторов выполняют репрессирующую функцию, например, гистоновая деацетилаза - 1, 2 (HDAC-1, 2) (Zhong et al„ 1998, 2002), белки HSCO, SINC (Owen et al„ 2005). Взаимодействие с RelA/p65 показано для СВР, рЗОО, ТВР, TAF, TFIIB.

Для а-актинина-4 показано взаимодействие с фактором транскрипции NF-Y (Poch et al., 2004), участие в активации транскрипционного фактора MEF-2 путем негативной регуляции активности HDAC7 (Chakraborty et al., 2006) и способность образовывать ДНК-белковые комплексы на промоторе цитохрома С (Goffart et al., 2006).

Для проверки предположения о том, что а-актинин является кофактором NF-кВ на уровне ДНК-связывающей активности и может входить в состав кВ-специфичных ДНК-белковых комплексов, в настоящей работе использовали метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле и конкурентный анализ, а также сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блота (shift-western). ДНК-связывающая активность характеризует первый этап регуляции экспрессии генов и является важным функциональным свойством транскрипционного фактора.

В предыдущих работах Лаборатории биологии клетки в культуре в ядерных экстрактах было выявлено формирование трех кВ-специфичных ДНК-белковых комплексов, различающихся по подвижности в ПААГ (Петухова и др., 2005). Комплексы II и III стабильно выявлялись в активированных клетках. Комплекс I с

наименьшей электрофоретической подвижностью выявлялся нестабильно, и закономерности его появления не удалось выяснить.

Результаты конкурентного анализа показали, что комплекс II содержит р65, поскольку добавление антител к р65 приводило к торможению подвижности кВ-специфичного комплекса II (супершифту) (рис.9, А). Комплекс III, по-видимому, не содержит р65, поскольку при добавлении антител к р65 интенсивность этого комплекса не менялась. Если в экстрактах присутствует комплекс III, то добавление антител к а-актинину-4 приводило к исчезновению этого комплекса, что указывает на присутствие в нем а-актинина-4, снижалась также интенсивность комплекса II (рис.9, А). Анализ с антителами к р50 субъединице показал, что комплекс II содержит также и р50, поскольку наблюдался супершифт и снижение его интенсивности. Тот факт, что при добавлении равного количества антител к р65 и р50 в реакцию антитела к р50 не приводили к исчезновению комплекса II, может свидетельствовать о том, что кроме комплекса р65/р50 (классический NF-кВ) в состав этого комплекса входят и другие

белки.

Рис. 9. Анализ состава кВ-специфичных ДНК-белковых

комплексов.

А - конкурентный анализ с антителами к р65, р50 субъединицам и а-актинину-4. Б -анализ при сочетании методов торможения ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блотинга. Цветовая маркировка: красный -кВ-специфичные ДНК-белковые

комплексы, зеленый - окраска антителами к р65, синий - окраска антителами к р50, черный - окраска антителами к а-актинину-4. В - схематическое представление областей перекрывания. 1 - экстракты клеток без воздействия. 2 - экстракты клеток после воздействия ЭФР. Область перекрывания р65. а-актинина-4 и ДНК заштрихована и указана стрелкой. Цифры слева — ДНК-белковые комплексы I, II, III.

Для уточнения результатов конкурентного анализа мы провели исследование методом shift-western, который подтвердил, что в экстрактах активированных клеток комплекс II содержит р65. В этом случае р65 выявлялся в виде широкой полосы, в которой можно выделить две области, которые мы обозначили как а и б (рис.9, Б). Полоса а соответствует подвижности р65 в экстракте неактивированных клеток, когда не образуется специфический ДНК-белковый комплекс. Полоса б выявляется в экстракте активированных клеток на уровне комплекса II. Анализ с антителами к а-актинину-4 показал, что он обнаруживается как в активированных, так и в неактивированных экстрактах. Зона перекрывания положения а-актинина-4 с

А днк- Б

о3^ ч^" белковые гп , ,

комплексы Р65 Р50 а"Акт4

К xi~xt- К Х^

7 12 12

ДНК/р65 ДНК/р65/а-актинин 4

Г 2 12

положением р65 и комплексом II представлена на рис.9, В как заштрихованная область, указанная стрелкой. Присутствие р50 субъединицы NF-кВ в составе комплекса II подтвердилось также и shift-western анализом. Данные, полученные методом shift-western, позволяют предположить, что а-актинин-4 может входить в состав кВ-специфического ДНК-белкового комплекса.

Однако оказалось, что подвижность а-актинина-4 в нативном геле в составе чистых белковых экстрактов практически совпадает с подвижностью а-актинина. после взаимодействия экстрактов с ДНК. Следовательно, однозначно ответить на вопрос о присутствии а-актинина-4 в составе комплекса, взаимодействующего с кВ-последовательностью ДНК, с помощью этого метода не удалось. Эту сложность мы пытались обойти, анализируя взаимодействие очищенных N- и С-концевых фрагментов р65 с консенсусной последовательностью ДНК в присутствии очищенного белка а-актинина.

В химерном белке GST-p65 содержится сайт узнавания протеазы тромбина. Переваривание тромбином позволяет получить N- и С- концевой р65 в растворе в свободном виде. Выход р65 в супернатант после переваривания тромбином контролировали с помощью вестерн-блот-анализа. Анализ методом торможения в геле показал, что только N-концевой домен р65 способен образовывать кВ-специфичный ДНК-белковый комплекс, причем, в ПААГ он движется быстрее, чем комплекс II ядерных экстрактов (рис.10).

Поскольку взаимодействие р65 с ДНК осуществляется за счет N-концевой

последовательности, содержащей ДНК-связывающий домен, важно было понять,

сохраняется ли комплекс р65 субъединицы с кВ-специфичной последовательностью

ДНК в присутствии а-актинина. Добавление а-актинина в реакцию связывания

приводило к сдвигу максимума распределения плотности, соответствующей ДНК-

белковому комплексу, в сторону более низкой электрофоретической подвижности по

сравнению с положением максимума комплекса, образованного N-концевым р65 с кВ-

последовательностью без добавления а-актинина (рис.10). Следовательно,

взаимодействие с а-актинином-4 не препятствует образованию кВ-специфического

ДНК-белкового комплекса, а только изменяет его подвижность.

Рис.10. Взаимодействие N-концевого домена р 65 с кВ-последовательностью в

присутствии а-актинина.

Анализ методом торможения ДНК-белковых комплексов в геле. Электрофореграмма и графическое представление данных, полученных с помощью программы Scion Image

I- ядерный экстракт (на графике -зеленый). 2- N- концевой домен р65 (на графике - красный). 3- добавление а-актинина в реакцию связывания N- концевого домена р65 с кВ-последовательностью (на графике -синий). 4 - плазмида pGex, не содержащая последовательность р65. 5 - С- концевой домен р65.

Заключение

Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии и биохимического анализа субклеточных фракций демонстрируют существование в цитоплазме как связанного с акгиновыми структурами пула р65, так и несвязанного (диффузного). На всех этапах реорганизации акгинового цитоскелета, вызванных как адгезией к фибронектину, так и воздействием ЭФР, р65 в цитоплазме обнаруживался в связи с F-актином, в области стресс-фибрилл и раффлов. Помимо этого, р65 выявлялся в дискретных актин-содержагцих областях, названных пэтчами, в которых присутствовали также белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией. Накопление р65 под влиянием ЭФР в областях, связанных с фокальной адгезией, свидетельствует в пользу того, что присутствие р65 в этих областях является одним из этапов активации NF-кВ в клетках А431. Накопление р65 в ядре через 30 мин воздействия ЭФР, по-видимому, не связано с присутствием в клетках А431 стресс-фибрилл и раффлов. В чем заключаются различия между пулом р65, направляемым в ядро, и пулом р65, ассоциированным с актин-содержащими структурами в цитоплазме, остается пока не выясненным.

Данные о том, что а-актинин-4 может взаимодействовать в реакции in vitro с N-концевой последовательностью ReIA/p65, солокализуется с RelA/p65 в области стресс-фибрилл, раффлов и пэтчей на всех стадиях реорганизации акгинового цитоскелета, а также выявление этих белки в одних и тех же субклеточных фракциях, присутствие а-актинина-4 в ядре, где он может принимать участие в формировании кВ-специфичного ДНК-белкового комплекса, позволяет утверждать, что а-актипин-4 является функциональным партнером р65 субъединицы NF-кВ и сопровождает RelA/p65 в процессе активации в цитоплазме и в ядре. Выявленные особенности локализации и распределения а-актинина-1, его солокализация с р65 в цитоплазме, а также возможность прямого взаимодействия этих белков позволяют предположить, что а-актинин-1 может участвовать в процессах, связанных с активацией NF-kB. Однако вопрос о том, почему в мультибелковых комплексах после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 выявлялся только а-актинин-4, как это было продемонстрировано ранее в Лаборатории биологии клетки в культуре, остается невыясненным и требует дальнейших исследований.

Выводы

1. В клетках А431 воздействие ЭФР, приводящее к реорганизации актинового цитоскелета, стимулирует накопление р65 в ядре, причем, ядерная транслокация р65 наблюдается в условиях разборки актинового цитоскелета и не требует присутствия стресс-фибрилл и раффлов.

2. В цитоплазме под воздействием ЭФР наблюдается как связанное с F-актином перераспределение р65 (раффлы, стресс-фибриллы, пэтчи), так и независимое. Актин-содержащие зоны дискретной локализации р65 в цитоплазме (пэтчи), включающие а-актинин-1, а-актинин-4, винкулин и паксиллин, описаны впервые.

20

3. Изоформы а-актинина различаются между собой по локализации в разных компартментах клетки. Особенностью а-актинина-1 является его локализация в перинуклеарной области, а а-актинина-4 - на концах стресс-фибрилл и в ядре. На биохимическом уровне различия заключаются в выявлении разного набора укороченных форм а-актининов, узнаваемых антителами к этим белкам, в цитоплазматических и ядерных подфракциях. В ядре а-актинин-4 выявляется во всех ядерных подфракциях, тогда как а-актинин-1 обнаруживается во фракции белков ядерной оболочки.

4. а-Актинин является функциональным партнером р65 субъединицы ОТ-кВ в клетках А431, поскольку эти белки способны непосредственно взаимодействовать друг с другом, солокализуются в цитоплазме, могут обнаруживаться в одних и тех же подфракциях, и а-актинин-4 может принимать участие в регуляции ДНК-связывающей активности ОТ-кВ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Емельянов А.Н., А.В. Большакова, О.Л. Петухова, JI.B. Туроверова, И.В. Кропачева, Г.П. Пинаев.

2005. Особенности распределения рб5 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47 (9): 808.

2. Petukhova О., A. Emelyanov, Л. Bolshakova, L. Turoverova, V.Babakov, l.Kropacheva, K-E. Magnusson, G.Pinaev. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-icB/Rel A in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45 th Annual Meeting. 2005. p. 100a.

3. Большакова A., E. Емельянов, О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48 (9): 746

4. Большакова А., О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Распределение изоформ альфа-актинина-1 и 4 в клетках А431. Цитология. 48 (9): 747.

5. Bolshakova А., О. Petukliova, L Turoverova, V. Babakov, D. Tender K-E. Magnusson, G. Pinaev.

2006. Adhesion induced actinin 1 and actinin 4 re-distribution in A431 spread on fibronectin and laminin 2/4. Abstracts the American Society for Cell Biology, 46-th Annual Meeting.

6. Большакова А., О. Петухова, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П Пинаев. 2007. Структурно не связанный и связанный альфа-акшнии в клетках А431. Ц1ш>логия. Т49. С. 719-720.

7. Большакова А., О. Петухова. 2007. Анализ субклеточного распределения р65 субъединицы NF-кВ при воздействии ЭФР и адгезии клеток А431 к фибронекгину. Материалы 11-й путинской международной школы-конференции молодых ученых, 29 окгября-2 ноября, Пупцто. С. 71-72.

8. Bolshakova А., О. Petukhova, L Turoverova, V. Babakov, D. Tender, K-E. Magnusson, G. Pinaev.

2007. Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-actinin-l and alpha-actiuin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 31. P. 360-365.

9. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007. EGF influences the sub cellular distribution of alpha actinins and NFkB in A431 cells spread on fibronectin. The American Society for Cell Biology Meeting Abstracts. Mol. Biol. Cell 18 (suppll): 484.

10. Petukhova O., Bolshakova A„ Turoverova L„ Tentler D„ Magnusson K.-E., Pinaev G. 2008. The distribution of RelA/p65 in the cytoplasm is actin cytoskeleton-dependant but not its nuclear translocation in A431 cells stimulated with EGF. Abstracts of 33rd FEBS Congress and И" IUBMB Conference. Athens, Greece, June, 29th -3rd July, PP4D-14, p.254.

11. Babakov, O. Petukhova, L Turoverova, I. Kropacheva, D. Tentler, A. Bolshakova, E. Podolskaya, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2008. RelA/NF-кВ transcription factor associates with a-actinin-4. Exp. Cell Res. 314. P. 1030-1038.

12. Большакова А. В., Петухова О. А., Магнуссон К.-Е., Пинаев Г. П. 2008. Альфа акгинины и NF-кВ совместно перераспределяются в клетках А431 в разных субклеточных компартментах. Материалы 4-го съезда биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, И-15 мая. С. 16 (№269).

13. Большакова А., Петухова О. 2008. Альфа актинии 4 взаимодействует с N-концевой последовательностью ReIA/p65 in vitro и может принимать участие в формировании специфических ДНК-белковых комплексов. Сборник тезисов 12-й Путинской международной школы-конференции Молодых ученых, 10-14 ноября, Пущино. С. 8-9.

14. Большакова А, В., О. А. Петухова, Г. П. Пинаев, К.-Е. Магнуссон. 2009. Сравнительный анализ способов субклеточного фракционирования для выявления а-актишша 1 и а-актишша 4 в клетках М31. Цитология. 51 (2): 122-129.

Список цитируемой литературы

Бабаков В.Н. 2004. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург. Бабаков В., Кропачева И., Петухова О., Туроверова Л., Пинаев Г.П. 2004. Цитология. 46(12): 1055-1063. Бабаков В.Н.. Бобков J I.E., Петухова OA., Туроверова J1.В., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Г.П. 2004. Цитология. 46(12): 1064-1072.

Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. 2004. Цитология. 46(1): 5-15. Петухова О., Туроверова Л„ Емельянов А., Кропачева И., Пинаев Г. 2005. Цитология. 47(2): 175-183. Марзпав У. иХуанР. 1987. М: Мир. с. 111-115.

Araki N.. Egamia Y„ Watanabe Y„ Hataea T. 2007. Exp. Cell Res. 313: 1496-1507. AreA.F, Calkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. Exp. Cell Res. 256: 533-544. AreA.FPinaev G.P., Buroya E„ Lindberg U. 2001. Cell Motil. and Cytoskeleton. 48: 24-36. Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. New York. Plenum Press: 298. BlobelG., Potter V.R. 1966. Science. 154:1662-1665.

Boxer L, Travaglione S., Falzano L, Gauthier N.C., Popoff M.R., Lemichez E., Fiorentini C., Fabbri A. 2004.

Mol. Biol. Cell. 15:1124-1133.

Bradford M. M. 1976. Anal. Biochem. 72: 525-529.

Burgstaller G„ Gimona M. 2004. J. Cell Sci. 117: 223-231.

Chapman N.R., Webster G.A., Gillespie P., Wilson B.J., Crouch D.H., Perkins N.D. 2002. Biochem. J. 366: 45969. ч '

Chakraborty S, Reineke -E.L; Lam U„ UX„ Liu Y., Gao C„ Khurana S„ Kao H.Y. 2006. JBC. 281: 3507035080.

Chiang E.T., Lim M.J., Patton W.F., SbeproD. 2000. J. Biochem. Biophys. Methods. 46: 53—68. Christerson L.B., Vanderbilt C.A., CobbM.H. 1999. Cell Motil Cytoskeleton. 43:186-198. Clark K.A., McElhinny AS., Beckerle M. C„ Gregorio С. C. 2002. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18:637-706. Communal C., Sumandea M„ de Tombe P., Narula J., Soiaro R.J., Hajjar. 2002. PNAS. 99: 6252-6256. Demczuk S„ Harbers M„ Vennstrom B. 1993. Proc.Natl.Acad.Sci. 90:2574-2578.

Dent C.L., Smith M.D., Latchman D.S. 1999. Pract. Approach 2-nd Ed Latchman D.S. Oxford. University Press. Drn-erN.. Blobel G-1976. The J. Cell Biol. 70:581-591.

Faial F„ Minhajuddin M„ Bijli KM., McGrath J.L.. Rahman A. 2007. JBC. 282(6): 3940-3950.

GoffartS., FrankoA., Clemen C.S., WiesnerRJ. 2006. Current Genetics. 49:125-135.

Honda K., Yamada Т., Endo R„ lno Y„ Gotoh M„ Tsuda H„ Yamada Y„ Chiba H, Hirohashi S. 1998. The

Journal ofCell Biology. 140(6): 1383-1393.

Hynes R.0.1999. Trends Cell Biol. 9(12): 33-37.

Immure M„ Endo Т., Kuroda M., Tanaka Т., Masaki T. 1988. JBC. 263:7800-7805. KaverinaI., Stradal Т.Е., GimonaM.. 2003.1. Cell Sci. 116:4915-4924. Kustermans G., Piette J., Legrand-Poels S. 2008. Biochem. Pharmacol. 76( 11): 1310-22. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227:680-685.

Legrand-Poels S., Kustermans G., Bex F., Kremmer E., Kufer T. A., Piette J. 2007. J. of Cell Sc. 120: 12991310.

Under S„ AepfelbacherM. 2003. Trends in Cell Biol. 13: 376-385.

Lock J.G., Wehrle-Haller В., Stromblad S. 2008. Semin Cancer Biol. 18(1): 65-76.

Luikart S„ Masri M„ Wahl D„ Hinkel Т., Beck J.M., Gyetko M.R., Gupta P., Oegema T. 2002. Biochim Biophys Acta. 1591:99-107.

Narayanan R , Klement J.F., Ruben S.M., Higgins K.A., Rosen C.A. 1992. Science.256: 367-370. Nemeth Z.H., Deitch E.A., Davidson M.T., Szabo C„ Vizi E.S., Hasko G. 2004. J Cell Physiol. 200(1): 71-81. Otey C.A., Carpen O. 2004. Cell Motil. Cytoskeleton. 58:104-111.

OwenH.R., QuadroniM., Bienvenut W„ Buerki C„ Hottiger M.O. 2005. J.of Proteome Research. 4:1381-1390. Pavalko F.M., Chen NX., Turner C.H., Burr D.B.. Atkinson S„ Hsieh Y.-F., Qui J., Duncan R.L 1998. Am. J. Physiol. 275:1291-1601.

Poch M. T„ Al-Kassim L, Snwlinski S.M., ¡lines R.N. 2004. Toxicol. Appl. Pharm. 199: 239-250.

Ruben S.M., Narayanan R„ Klement J.F., Chen C-H., Rosen C.A. 1992. Mol.CeIl.Biol. 12: 444-454.

Sastry S.K., Burridge K. 2002. Exp Cell Res. 261(1): 25-36.

Selliah N.. Brooks W.H., Roszman T.L. 1996. J. Immunol. 156: 3215-3221.

SchoenwaelderS.M., Burridge K. 1999. Current Opinion in Cell Biology. 11:274-286.

Sotiropoulos A., Gineitis D., Copeland J., Treisman R. 1999. Cell. 98: 159-169.

Thanos D„ Maniatis T. 1995. Cell. 80:529-532.

Towbin H„ Staehelin T.. Gordon J. ¡979. Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350-4354.

Varon C., Tatin F„ Moreau V., Obberghen-Schilling E.V., Fernandez-Sauze S„ Reuzeau E„ Kramer I., Genot E.

2006. Mol. Cell. Biol. 26: 3582-3594.

Yamada KM.. GeigerB. 1997. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

Young K.G., Kothary R. 2005. BioEssays. 27: 144-152.

Zhang Q„ Skepper J.N., YangF., Davies J.D., HegyiL., RobertsR.G., Weissberg P.L, Ellis],A., Shanahan C.M.

2001. J. Cell Sci. 114: 4485-4498.

Zhong H„ Voll R.E., Ghosh, S. 1998. Mol. Cell. 1:661-671.

Zhong H., May M. J., Jimi E„ Ghosh S. 2002. Mol. Cell. 9:625-636.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Отдела клеточных культур Института цитологии за помощь в работе. Особенно благодарен автор своему научному руководителю O.A. Петуховой, проф. Г.П. Пинаеву, JI.B. Туроверовой, проф. К.-Э. Магнуссону, В.Н. Бабакову, М.Г. Хотину, Д.Е. Бобкову и Н. Шарлаимовой.

Подписано в печать 15.04.2009. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/0415. П. л. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Большакова, Анастасия Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУР АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА.

2.2. РОЛЬ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ПРОВЕДЕНИИ СИГНАЛА И РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.

2.3. БЕЛКИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В ЯДРЕ.

2.4. БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ СПЕКТРИНОВЫЕ ПОВТОРЫ, В ЯДРЕ.

2.5. АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК - а-АКТИНИН.

2.5.1. Фрагменты а-актинина.

2.6. АДГЕЗИЯ КЛЕТОК К ВНЕКЛЕТОЧНОМУ МАТРИКСУ.

2.6.1. Комплексы адгезии.

2.6.2. Сигналы, активируемые клеточной адгезией.

2.6.3. Изменение экспрессии генов в результате адгезии.

2.7. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР №кВ.

2.7.1. Характеристика кВ-специфических ДНК-белковых комплексов.

2.8. ЭПИДЕРМАЛЬНЫЙ ФАКТОР РОСТА (ЭФР) И ЕГО РЕЦЕПТОР.

2.8.1. Сигнальные пути в клетке, активируемые ЭФР.

2.9. ДАННЫЕ, ПОЛУЧЕННЫЕ В ПРЕДЫДУЩИХ РАБОТАХ ЛАБОРАТОРИИ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК А431.

3.2. АДГЕЗИЯ КЛЕТОК НА ФИБРОНЕКТИНЕ.

3.2.1. Обработка клеток ЭФР и цитохалазином Д.

3.3. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ.

3.4. АНТИТЕЛА, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ ДЛЯ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ИММУНОБЛОТИНГА.

3.5. СУБКЛЕТОЧНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ.

3.5.1. Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков.

3.5.2. Получение ядерных подфракций по методу Двайера и Блоубела с модификациями.

3.5.3. Фракционирование с помощью коммерческого набора.

3.6. ИММУНОБЛОТИНГ БЕЛКОВЫХ ЭКСТРАКТОВ КЛЕТОК.

3.7. ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕНЫХ ДВУЦЕПОЧЕЧНЫХ ДНК ЗОНДОВ.

3.8. АНАЛИЗ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЯДЕРНЫХ ЭКСТРАКТОВ МЕТОДОМ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В ГЕЛЕ.

3.9. СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ В ГЕЛЕ И ВЕСТЕРН-БЛОТ-АНАЛИЗА.

3.10. МЕТОД GST-PULLDOWN.

3.11. ПОЛУЧЕНИЕ СВОБОДНЫХ N-ИЛИ С- КОНЦЕВЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Р65 В РАСТВОРЕ ПОСЛЕ ПЕРЕВАРА ТРОМБИНОМ СЕФАРОЗЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ N-ИЛИ С- КОНЦЕВЫМИ ДОМЕНАМИ Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ.

3.12. АНАЛИЗ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ТОРМОЖЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ ДНК В ГЕЛЕ (IN VITRO BAND-SHIFT).

3.13. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431 ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭФР.

4.2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЕЬА/Р65 В КЛЕТКАХ А431.

4.2.1. Иммунофлуоресцентный анализ совместной локализации 11е1А/р65 и Б-актина в клетках, распластанных на фибронектине, и после воздействии ЭФР.

4.2.2. Влияние адгезии на распределение 11е1А/р65 в субклеточных фракциях.

4.2.3. Влияние ЭФР на распределение 11е1А/р65 в клетках, культивируемых на пластике и клетках, распластанных на фибронектине.

4.3. ВЛИЯНИЕ ЦХ Д НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЕЬА/Р65 В КЛЕТКАХ А431.

4.3.1. Реорганизация актинового цитоскелета после воздействия цитохалазина Д и последующего добавления ЭФР.

4.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ распределения Ые1А/р65 в клетках А431 под влиянием ЦХ Д.

4.3.3. Вестерн-блот-анализ распределения 11е1А/р65 в субклеточных фракциях под влиянием ЭФР в клетках, актиновый цитоскелет которых разрушен ЦХ Д.

4.4. АНАЛИЗ АКТИН-СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЕЙ ДИСКРЕТНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЯЕЬА/Р65 В ЦИТОПЛАЗМЕ.

4.5. а-АКТИНИНЫ В КЛЕТКАХ А431.

4.5.1. Иммунофлуоресцентный анализ распределения а-актининов в клетках А431.

4.5.2. Особенности распределения изоформ а-актинина в субклеточных фракциях.

4.5.3. Сравнение методов субклеточного фракционирования для выявления а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431.

4.5.3.1. Оценка целостности ядер после клеточного лизиса.

4.5.3.2. Выявление а-актинина-1 и а-актинина-4 в субклеточных фракциях, выделенных из предварительно замороженных клеток и клеток без предварительного замораживания.

4.5.3.3. Распределение а-актининов в ядерных подфракциях.

4.6. СОВМЕСТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ а-АКТИНИНА-1, а-АКТИНИНА-4 И Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ NF-кВ В КЛЕТКАХ А431.

4.6.1. Иммунофлуоресцентный анализ областей солокализации RelA/p65 с а-актинином-1 или а-актинином-4 в клетках А431, распластанных на фибронектине.

4.6.2. RelA/p65, а-актинин-1 и а-актинин-4 в субклеточных фракциях.

4.7. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРЯМОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ RELA/P65 И а-АКТИНИНОВ МЕТОДОМ GST PULL-DOWN.

4.7.1. Характеристика а-актинина, очищенного из желудков цыпленка, и а-актинина, очищенного из почек свиньи при окрашивании антителами к а-актинину-1 и а-актинину-4.

4.7.2. Исследование возможности прямого взаимодействия р65 и а-актининов.

4.8. ВОЗМОЖНОСТЬ УЧАСТИЯ а-АКТИНИНА-4 В РЕАКЦИИ ДНК-СВЯЗЫВАНИЯ NF-кВ С КОНСЕНСУСНЫМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ кВ.

4.8.1. Конкурентный анализ с антителами к RelA/p65, р50 или а-актинину-4.

4.8.2. Анализ состава комплексов при использовании сочетания вестерн-блот-анализа и торможения ДНК-белковых комплексов в геле (shift-western).

4.8.2.1. Подвижность белков в нативном геле.

4.8.2.2. Анализ состава кВ-специфичных комплексов при сочетании методов торможения ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блотинга.

4.8.3. Возможность участия а-актинина-4 в реакции ДНК-связывания NF-кВ с консенсусными последовательностями кВ.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Реорганизация актинового цитоскелета сопровождает ядерную транслокацию и перераспределение в цитоплазме р65 субъединицы NF-кВ и активацию NF-кВ.

5.2. Особенности распределения RelA/p65, а-актинина-1 и а-актинина-4 в клетках А431 при распластывании на фибронектине и под влиянием ЭФР.

5.3. Сравнение субклеточного распределения изоформ а-актинина.

5.4. Взаимодействие изоформ а-актинина и р65 и участие а-актинина-4 в образовании кВ-специфичных ДНК-белковых комплексов.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распределение Р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB и изоформ α-актинина в связи с реорганизацией актинового цитоскелета в клетках А431"

Актиновые филаменты вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами образуют динамическую сеть в цитоплазме клеток, называемую цитоскелет, которая определяет форму клетки и лежит в основе клеточной миграции, участвует в межклеточной адгезии и адгезии клеток с матриксом (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999; Clark et al., 2002). Последнее время появились работы, подтверждающие возможность участия актинового цитоскелета в регуляции активности генов (Sotiropoulos et al., 1999, Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008). Сигнальные процессы в клетке запускаются под влиянием внеклеточных сигналов, таких как адгезия к белкам внеклеточного матрикса, межклеточная адгезия и воздействие ростовых факторов. Влияние этих факторов сопровождаются пространственной реорганизацией актиновых филаментов (Karin et al., 1997; May, Gosh, 1998; Schoenwaelder, Burridge, 1999).

Имеются данные, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточного сигнала. В частности, некоторые сигнальные молекулы способны непосредственно взаимодействовать с белками актинового цитоскелета на определенных этапах передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру (Yamada, Geiger, 1997; Otey, Carpen, 2004; Legrand-Poels et al., 2007). Однако, по-прежнему, остаются невыясненными точные механизмы, с помощью которых актиновый цитоскелет принимает участие в сигнальных каскадах и регуляции экспрессии генов.

Ряд данных говорит о том, что реорганизация актинового цитоскелета может приводить к изменению активности транскрипционных факторов (Sotiropoulos et al., 1999, Posern et al., 2002; Hofrnann et al., 2004; Kustermans et al., 2008). Реорганизация актинового цитоскелета происходит под влиянием ростовых факторов, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами. В то же самое время, факторы, вызывающие реорганизацию актинового цитоскелета, регулируют также активность транскрипционных факторов (Karin et al.,

1997; May, Gosh, 1998). Вероятно, реорганизация актинового цитоскелета сопровождается перегруппировкой белков актинового цитоскелета, входящих в состав сигнальных комплексов и взаимодействующих с транскрипционными факторами. Таким транскрипционным фактором, регуляция которого может осуществляться в связи с реорганизацией актинового цитоскелета, является NF-кВ (Fazal et al., 2007, Nemeth et al., 2004). Показано также, что актиновый цитоскелет важен на посттранскрипционном уровне регуляции, обеспечивая позиционирование РНК в цитоплазме (Ornelles et al., 1986; Hesketh, 1996).

Дополнительными фактами, указывающими на участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов, является открытие внутриядерных функций актина и актинсвязывающих белков. Однако эти вопросы остаются, по-прежнему мало изученными. Одним из таких белков, способных взаимодействовать с транскрипционными факторами, является а-актинин (Poch et al., 2004; Chakraborty et al., 2006; Goffart et al., 2006).

К семейству а-актипинов принадлежат четыре генных продукта, описанные впервые как актинсвязывающие белки. а-Актинин-1 и 4 характерны для немышечных клеток, а а-актинип-2 и 3 - для мышечных. Функция немышечного а-актинина заключается в сшивании актиновых филаментов. Позднее было показано, что а-актинин взаимодействует не только с актином, но и с большим числом молекулярных партнеров (Otey, Carpen, 2004). а-Актинин работает как скаффолд, связывая цитоскелет с различными трансмембранными белками в контактах разного типа, и соединяет цитоскелет с разнообразными сигнальными молекулами (Otey, Carpen, 2004). Поскольку а-актинин локализуется вблизи трансмембранных белков и актиновых филаментов, он является одной из основных мишеней регуляции сигнальных путей, особенно тех, что связаны с интегринами.

Аминокислотная последовательность а-актинина-1 и а-актинина-4 гомологична на 86 %, однако функции их в клетках различаются. В отличие от а-актинина-1, а-актинин-4 способен транслоцироваться в ядро и взаимодействовать с факторами транскрипции (Poch et al., 2004; Chakraborty et al., 2006; Goffart et al., 2006). Партнерами а-актинина-4 в ядре являются р-катенин и NF-Y факторы транскрипции, DEAD box содержащий белок Bat 1 и гистондеацетилазы (HDAC). а-Актинин является одним из кандидатов на роль партнера транскрипционного фактора NF-tcB.

Семейство транскрипционных факторов NF-icB/Rel принимает участие в регуляции экспрессии большого числа генов, среди которых гены, ответственные за иммунный ответ, противовоспалительные реакции, организацию цитоскелета и другие гены (Tian et al., 2005). Транскрипционные факторы семейства NF-кВ регулируются большим числом внеклеточных сигналов, среди которых ультрафиолет, факторы роста, фактор некроза опухолей, вирусы, при действии которых NF-кВ активируется в цитоплазме, после чего транспортируется в ядро (May, Ghosh, 1998). Эпидермальный фактор роста (ЭФР) также является одним из регуляторов NF-кВ (Sun, Carpenter, 1998). Одним из малоизученных вопросов остаются механизмы его перераспределения в цитоплазме и пути транспорта в ядро.

Данные об участии актинового цитоскелета в регуляции NF-кВ, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что NF-кВ солокализуется в цитоплазме нормальных фибробластов вдоль стресс-фибрилл и в фокальных контактах. Методом аффинной хроматографии на колонках было подтверждено, что NF-klB может связываться с иммобилизованным F-актином и высказано предположение, что распределение NF-кВ в цитоплазме происходит в зависимости от состояния актина (Are et al., 2000). Поиск белков, которые могут взаимодействовать как с актином, так и с р65 субъединицей NF-кВ указал на а-актинин, поскольку имеются данные о том, что киназа МЕКК1, которая является одним из активаторов NF-кВ, способна напрямую взаимодействовать с а-актинином in vitro (Christerson et al., 1999). Исследования нашей лаборатории показали солокализацию р65 субъединицы NF-кВ и а-актининов в цитоплазме клеток А431, в особенности в области дорзальных раффлов, кроме того, а-актинин-4 был обнаружен в ядре. Несмотря на солокализацию обоих а-актининов и р65 в цитоплазме, в мультибелковых комплексах ядерных и цитоплазматических экстрактов после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 субъединице NF-кВ выявлялся только а-актинин-4 (Бабаков, 2004). Поэтому возникла необходимость детального сравнения областей солокализации, а также сравнения распределения в субклеточных фракциях а-актинина-1, а-актинина-4 и р65. Кроме того, обнаружение а-актининов и р65 в одних и тех же белковых комплексах не является доказательством того, что это взаимодействие прямое.

Работа была проведена на клетках А431, распластанных на фибронектине, для которых хорошо охарактеризованы структуры актинового цитоскелета и реорганизация под влиянием ЭФР (Are et al., 2001; Петухова и др., 2005). Эти морфологические особенности создают удобную модель для исследования перераспределения факторов, связанных с F-актипом, при различных способах стимуляции клеток. Одним из стимулов, воздействие которого связано с реорганизацией актинового цитоскелета, является ЭФР.

Каким образом происходит перераспределение р65 в связи с реорганизацией актинового цитоскелета и важны ли актиновые структуры для транслокации р65 в ядро, до сих пор исследовано не было.

Цель настоящей работы заключалась в выяснении участия актинового цитоскелета в перераспределении р65 субъединицы NF-кВ, а также в сравнительной оценке участия а-актинина-1 и а-актинина-4 в событиях, связанных с активацией NF-kB.

В работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать возможность транслокации р65 в ядро в условиях разрушения актинового цитоскелета после обработки клеток цитохалазином Д (ЦХ Д).

2. Исследовать влияние ЭФР, вызывающее реорганизацию актинового цитоскелета, на распределение р65, F-актина, а-актинина-1 и а-актинина-4 в цитоплазме и охарактеризовать области солокализации.

3. Определить совместное присутствие р65, а-актинина-1 и а-актинина-4 в различных субклеточных фракциях, соответствующих разным компартментам.

4. Исследовать возможность прямого взаимодействия а-актининов и NF-кВ in vitro с использованием метода аффинной хроматографии (GST-pull-down).

5. Исследовать возможность участия а-актинина-4 в реакции связывания NF-кВ с консенсусными последовательностями кВ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Большакова, Анастасия Викторовна

6. выводы

1. В клетках А431 воздействие ЭФР, приводящее к реорганизации актинового цитоскелета, стимулирует накопление р65 в ядре, причем, ядерная транслокация р65 наблюдается в условиях разборки актинового цитоскелета и не требует присутствия стресс-фибрилл и раффлов.

2. В цитоплазме под воздействием ЭФР наблюдается как связанное с Р-актином перераспределение р65 (раффлы, стресс-фибриллы, пэтчи), так и независимое. Актин-содержащие зоны дискретной локализации р65 в цитоплазме (пэтчи), включающие а-актинин-1, а-актинин-4, винкулин и паксиллин, описаны впервые.

3. Изоформы а-актинина различаются между собой по локализации в разных компартментах клетки. Особенностью а-актинина-1 является его локализация в перинуклеарной области, а а-актинина-4 — на концах стресс-фибрилл и в ядре. На биохимическом уровне различия заключаются в выявлении разного набора укороченных форм а-актининов, узнаваемых антителами к этим белкам, в цитоплазматических и ядерных подфракциях. В ядре а-актинин-4 выявляется во всех ядерных подфракциях, тогда как а-актинин-1 обнаруживается во фракции белков ядерной оболочки.

4. а-Актинин является функциональным партнером р65 субъединицы №-кВ в клетках А431, поскольку эти белки способны непосредственно взаимодействовать друг с другом, солокализуются в цитоплазме, могут обнаруживаться в одних и тех же подфракциях, и а-актинин-4 может принимать участие в регуляции ДНК-связывающей активности №-кВ.

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Емельянов А.Н., А.В. Большакова, О.А. Петухова, JI.B. Туроверова, И.В. Кропачева, Г.П. Пинаев. 2005. Особенности распределения р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламипине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47 (9): 808.

2. Petukhova О., A. Emelyanov, A. Bolshakova, L. Turoverova, V.Babakov, I.Kropacheva, K-E. Magnusson, G.Pinaev. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-KB/RelA in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45 th Annual Meeting. 2005. p. 100a.

3. Большакова A., E. Емельянов, О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48 (9): 746

4. Большакова А., О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Распределение изоформ альфа-актинина 1 и 4 в клетках А431. Цитология. 48 (9): 747.

5. Bolshakova А., О. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2006. Adhesion induced actinin 1 and actinin 4 re-distribution in A431 spread on fibronectin and laminin 2/4. Abstracts the American Society for Cell Biology, 46-th Annual Meeting.

6. Большакова А., О. Петухова, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П Пинаев. 2007. Структурно не связанный и связанный альфа-актинин в клетках А431. Цитология. Т49. С. 719-720.

7. Большакова А., О. Петухова. 2007. Анализ субклеточного распределения р65 субъединицы NF-кВ при воздействии ЭФР и адгезии клеток А431 к фибронектину.

Материалы 11-й пущинской международной школы-конференции молодых ученых, 29 октября-2 ноября, Пущино. С. 71-72.

8. Bolshakova А., О. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007. Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 31. P. 360-365.

9. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev.

2007. EGF influences the sub cellular distribution of alpha actinins and NFkB in A431 cells spread on fibronectin. The American Society for Cell Biology Meeting Abstracts. Mol. Biol. Cell 18 (suppll): 484.

10.Petukhova O., Bolshakova A., Turoverova L., Tentler D., Magnusson K.-E., Pinaev G.

2008. The distribution of RelA/p65 in the cytoplasm is actin cytoskeleton-dependant but not its nuclear translocation in A431 cells stimulated with EGF. Abstracts of 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference. Athens, Greece, June, 29th -3rd July, PP4D-14, p.254.

11 .Babakov, O. Petukhova, L. Turoverova, I. Kropacheva, D. Tentler, A. Bolshakova, E. Podolskaya, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2008. RelA/NF-кВ transcription factor associates with a-actinin-4. Exp. Cell Res. 314. P. 1030-1038.

12. Большакова А. В., Петухова О. А., Магнуссон K.-E., Пинаев Г. П. 2008. Альфа актинины и NF-кВ совместно перераспределяются в клетках А431 в разных субклеточных компартментах. Материалы 4-го съезда биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая. С. 16 (№269).

13. Большакова А., Петухова О. 2008. Альфа актинин 4 взаимодействует с N-концевой последовательностью RelA/p65 in vitro и может принимать участие в формировании специфических ДНК-белковых комплексов. Сборник тезисов 12-й Пущинской международной школы-конференции Молодых ученых, 10-14 ноября, Пущино. С. 8-9.

14. Большакова А. В., О. А. Петухова, Г. П. Пинаев, К.-Е. Магнуссон. 2009. Сравнительный анализ способов субклеточного фракционирования для выявления а-актинина 1 и а-актинина 4 в клетках А431. Цитология. 51 (2): 122-129.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии и биохимического анализа субклеточных фракций демонстрируют существование в цитоплазме как связанного с актиновыми структурами пула р65, так и несвязанного (диффузного). На всех этапах реорганизации актинового цитоскелета, вызванных как адгезией к фибронектину, так и воздействием ЭФР, рб5 в цитоплазме обнаруживался в связи с F-актином, в области стресс-фибрилл и раффлов. Помимо этого, р65 выявлялся в дискретных актин-содержащих областях, названных пэтчами, в которых присутствовали также белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией. Накопление р65 под влиянием ЭФР в областях, связанных с фокальной адгезией, свидетельствует в пользу того, что присутствие р65 в этих областях является одним из этапов активации NF-кВ в клетках А431. Накопление р65 в ядре через 30 мин воздействия ЭФР, по-видимому, не связано с присутствием в клетках А431 стресс-фибрилл и раффлов. В чем заключаются различия между пулом р65, направляемым в ядро, и пулом р65, ассоциированным с актин-содержащими структурами в цитоплазме, остается пока не выясненным.

Данные о том, что а-актинин-4 может взаимодействовать в реакции in vitro с N-концевой последовательностью RelA/p65, солокализуется с RelA/p65 в области стресс-фибрилл, раффлов и пэтчей на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, а также выявление этих белки в одних и тех же субклеточных фракциях, присутствие а-актинина-4 в ядре, где он может принимать участие в формировании кВ-специфичного ДНК-белкового комплекса, позволяет утверждать, что а-актинин-4 является функциональным партнером р65 субъедипицы NF-кВ и сопровождает RelA/p65 в процессе активации в цитоплазме и в ядре. Выявленные особенности локализации и распределения а-актинина-1, его солокализация с р65 в цитоплазме, а также возможность прямого взаимодействия этих белков позволяется предположить, что а-актинин-1 может участвовать в процессах, связанных с активацией NF-kB. Однако вопрос о том, почему в мультибелковых комплексах после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 выявлялся только а-актинин-4, как это было продемонстрировано ранее в нашей лаборатории, остается невыясненным и требует дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Большакова, Анастасия Викторовна, Санкт-Петербург

1. Арэ А.Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.Петербург.

2. Бабаков В.Н. 2004. Взаимодействие изоформ а-актинина с транскрипционным фактором RelA/NF-кВ. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.Петербург.

3. Бабаков В.Н., Кропачева КВ., Петухова O.A., Туроверова Л.В., Пинаев Г.П. 2004. Внутриклеточное распределение актинсвязывающих белков, фосфорилированных по тирозину, при распластывании клеток А431 на разных лигандах. Цитология. 46(12): 1055-1063.

4. Губанова Н. В., Киселева Е.В. 2007. Структурная организация и функции ядерной оболочки. Цитология. 49 (4): 257-269.

5. Емельянов А. Н., Петухова О. А., Туроверова JI. В., Кропачева И. В., Пинаев Г. П. 2006. Динамика ДНК-связывающей активности факторов транскрипции в процессе распластывания клеток А431 на иммобилизованных лигандах. Цитология. 48(11): 935947.

6. Емельянов А.Н. 2006. Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

7. Маниатис Т., ФричЭ., СэмбрукДж. 1984. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, перевод с англ. под ред. Баева A.A. и Скрябина К.Г. М: Мир,, 480 с.

8. Марзлав У. и Хуан Р. 1987. Транскрипция и трансляция. Методы. Под ред. Б.Хейлеса и С.Хигинса. гл.4. Транскрипция РНК в изолированных ядрах. М: Мир. С. 111-115.

9. Никольский Н.Н., Сорокин А.Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л: Изд-во Наука. С.200.

10. Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. 2004. Анализ морфологических особенностей популяции клеток эпидермоидной карциномы А431, распластанных на иммобилизованных лигандах. Цитология. 46(1): 5-15.

11. Aplin А.Е., Hogan В.P., Тотеи J., Juliano R.L. 2002. Cell adhesion differentially regulates the nucleocytoplasmic distribution of active MAP kinases. J Cell Sci. 115: 27812790.

12. Araki N., Egamia Y., Watanabe Y., Hataea T. 2007. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Exp. Cell Res. 313: 1496-1507.

13. Araki N., Hatae Т., Yamada Т., Hirohashi. 2000. Actinin-4 is preferentially involved in circular ruffling and macropinocytosis in mouse macrophages: analysis by fluorescence ratio imaging. Journal of Cell Science. 113: 3329-3340.

14. Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. The RelA/p65 subunit of NF-kB interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. 256: 533-544.

15. Are A.F., Pinaev G.P., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A-431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 48: 24-36.

16. BaekM.K., Kim M.H., Jang H.J., Park J.S., Chung I. J., Shin B.A., Ahn B. W., Jung Y.D. 2008. EGF stimulates uPAR expression and cell invasiveness through ERK, AP-1, and NF-kappaB signaling in human gastric carcinoma cells. Oncol Rep. 20(6): 1569-1575.

17. Banno Т., Gazel A., Blumenberg M. 2005. Pathway-specific profiling identifies the NF-kB-dependent TNFa-regulated genes in epidermal keratinocytes. J. Biol. Chem. 280: 1897318980.

18. Bassell G., Singer R.H. 1997. mRNA and cytoskeletal filaments. Current opinion in Cell Biology. 9: 109-115.

19. Bassell G.J., Oleynikov Y, Singer R.H. 1999. The travels of mRNAs through all cells large and small. FASEB J. 13(3): 447-454.

20. Batchelor C.L., Woodward A.M., Crouch D.H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Experimental Cell Research. 296: 208-222.

21. Benecke B.-J., Ben-Zeev A., Penman S. 1978. The control of mRNA production, translation and turnover insuspended and reattached anchorage-dependent fibroblasts. Cell. 14:931-939

22. Benmerah A., Scott M., Poupon V., Marullo S. 2003. Nuclear functions for plasma membrane-associated proteins? Blackwell Munksgaard. 4: 503-511.

23. Berridge M. J. 1993. Cell signalling. A tale of two messengers. Nature. 365: 388-9.

24. Berrier A.L., Yamada K.M. 2007. Cell-matrix adhesion. J Cell Physiol. 213(3): 565-573.

25. Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. Cytoskeleton. New York. Plenum Press: 298.

26. Birbach A., Gold P., Binder B.R., Hofer E., de Martin R., Schmid J.A. 2002. Signaling molecules of the NF-kappa B pathway shuttle constitutively between cytoplasm and nucleus. J Biol Chem. 277 (13): 10842-10851.

27. Blessing C.A., Ugrinova G.T., Goodson H. V. 2004. Actin and ARPs: action in the nucleus. Trends in Cell Biology. 14(8): 435-442.

28. Blobel G., Potter V.R. 1966. Nuclei from rat liver: isolation method that combines purity with high yield. Science. 154: 1662-1665.

29. Botteri F.M., Ballmer-Hofer K., Rajput B., Nagamine Y. 1990. Disruption of cytoskeletal structures results in the induction of the urokinase-type plasminogen activator gene expression. J Biol Chem. 265(22): 13327-34.

30. Burgstaller G., Gimona M. 2004. Actin cytoskeleton remodelling via local inhibition of contractility at discrete microdomains. J. Cell Sci. 117: 223-231.

31. Carlotti F., Dower S.K., Qwarnstrom E.E. 2000. Dinamic shuttling of nuclear factor kB between the nucleus and cytoplasm as a consequence of inhibitor dissociation. The journal of biological chemistry. 275 (52): 41028-41034.

32. Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB J. 6: 3283-9.

33. Chakraborty S, Reineke E.L., Lam M„ LiX., Liu Y., Gao C„ Khurana S„ Kao H.Y. 2006. Alpha-actinin 4 potentiates myocyte enhancer factor-2 transcription activity by antagonizing histone deacetylase 7. J. Biol. Chem. 281: 35070-35080.

34. Chapman N.R., Webster G.A., Gillespie P.J., Wilson B.J., Crouch D.H., Perkins N.D. 2002. A novel form of the RelA nuclear factor kappab subunits is induced by and forms a complex with the proto-oncogene c-Myc. Biochem. J. 366: 459-69.

35. Chiang E.T., Lim M.J., Patton W.F., Shepro D. 2000. NFkappaB translocation in human microvessel endothelial cells using a four-compartment subcellular protein redistribution assay. J Biochem Biophys Methods. 2000. 46: 53-68.

36. Christerson L.B., Vanderbilt C.A., Cobb M.H. 1999. MEKK1 interacts with alpha-actinin and localizes to stress fibers and focal adhesions. Cell Motil Cytoskeleton. 43:186-198.

37. Clark K.A., McElhinny A.S., Beckerle M.C., Gregorio C.C. 2002. Striated muscle cytoarchitecture: an intricate web of form and function. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 637706.

38. Clark T.G., Merriam R.W. 1977. Diffusible and bound actin nuclei of Xenopus laevis oocytes. Cell. 12: 883-991.

39. Cohen S. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the newborn animal. J. Biol. Chem. 237: 1555-1562.

40. Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solaro R.J., Hajjar. 2002. Functional consequences of caspase activation in cardiac myocytes. PNAS. 99: 6252-6256.

41. Cooper J.A. 1987. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J Cell Biol. 105(4): 1473-1478.

42. Daniline S., Bitterman H., Rahat M.A., Kinarty A., Rosenzweig D., Nitza L. 2003. Hipoxia activates inducible nitric oxide synthase in mouse macrophages by disrupting its interaction with alpha-actinin 4. Journal immunology. 171: 3225-3232.

43. Demczuk S., Harbers M., Vennstrom B. 1993. Identification and analysis of all components of gel retardation assay by combination with immunoblotting. Proc.Natl.Acad.Sci. 90: 2574-2578.

44. Dent C.L., Smith M.D., Latchman D.S. 1999. The DNA-mobility shift assay. Transcription factors, a Practical Approach Second Edition. Ed. Latchman D.S. Oxford. University Press.

45. Dhanasekaran N., Reddy E. P. 1998. Signaling by dual specificity kinases. Oncogene. 17: 1447-1455.

46. Dhawan J., Farmer S.R. 1990. Regulation of al(I)-collagen gene expression in response to cell adhesion in swiss 3T3 fibroblasts. The Journal of Biological Chemystry. 265 (16): 9015-9015.

47. Dike L.E., Farmer S.R. 1998. Cell adhesion induces expression of growth-associated genes in suspension-arrested fibroblasts. Cell Biology. 85: 6792-6796.

48. Dwyer N., Blobel G. 1976. A modified procedure for the isolation of pore comlex-lamina fraction from rat liver nuclei. The J. Cell Biol. 70: 581-591.

49. Fazal F., Minhajuddin M., Bijli K.M., McGrath J.L., Rahman A. 2007. Evidence for actin cytoskeleton-dependent and independent pathways for RelA/p65 nuclear translocation in endothelial cells. J Biol Chem. 282(6): 3940-3950.

50. Feramisco J.R., Burridge K. 1980. A rapid purification of alpha-actinin, filamin, and a 130,000-dalton protein from smooth muscle. J Biol Chem. 255: 1194-1199.

51. Fermentas: catalogue and product application guide. 1998. Ed. A. Urbelis. Vilnius: Baricada.

52. Fey E.G., Wan KM., Penman S. 1984. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold: three-dimensional organization and protein composition. J. Cell Biol. 98:1973-1984.

53. Fraley T.S., Pereira C.B., Tran T.C., Singleton C., Greenwood J. A. 2005. Phosphoinositide binding regulates alpha-actinin dynamics: mechanism for modulating cytoskeletal remodeling. J Biol Chem. 280(15): 15479-82.

54. Fricker M., Hollinshead M,, White N., Vaux D. 1997. Interphase nuclei of many mammalian cell typer contain deep, dynamic, tubular membrane-bound invaginations of the nuclear envelope. J. Cel Biol. 136: 531-544.

55. Frisch S.M., Screaton RA. 2001. Anoikis mechanisms. Current Opinion in Cell Biology. 13: 555-562.

56. Geiger B., Bershadsky A., Pankov R., Yamada K.M. 2001. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nat Rev Mol Cell Biol. 2(11): 793805.

57. Genersch E., Schuppan D., Lichtner R.B. 1996. Signaling by epidermal growth factor differentially affects integrin-mediated adhesion of tumor cells to extracellular matrix prpteins. J. Mol. Med. 74: 609-616.

58. Gettemans J., Van Impe K., Delanote V., Hubert T., Vandekerckhove J., De Corte V. 2005. Nuclear actin-binding proteins as modulators of gene transcription. Traffic. 6(10): 84757.

59. Ghosh S., Karin M. 2002. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109 Suppl: S81-96.

60. Gluck U., Ben-Ze'ev A. 1994. Modulation of alpha-actinin levels affects cell motility and confers tumorigenicity on 3T3 cells. J cell Sci. 107: 1773-1782.

61. Goffart S., Franko A., Clemen C.S., Wiesner R.J. 2006. Alpha-actinin and BAT 1 interaction with Cytochrome c promoter upon skeletal muscle differentiation. Current Genetics. 49: 125-135.

62. GuayJ., Lambert H, Gingras-Breton G., Lavoie J.N., HuotJ., Landry J. 1997. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci. 110: 357-368.

63. Habib A.A., Chatterjee S., ParkS-K., Ratan R.R., Lefebvre S., Vartanian T. 2001. The epidermal growth factor receptor interacting protein and nuclear factor -kB (NF-kB)-inducing kinase to activate NF-kB. J Biol Chem. 276: 8865-8874.

64. Hamasaki M, Araki N., Hatae T. 2004. Association of early endosomal autoantigen 1 with macropinocytosis in EGF-stimulated A431 cells. Anat. Rec. 277: 298-306.

65. Hara T., Honda K., Shitashige M., Ono M., Matsuyama H, Naito K., Hirohashi S., Yamada T. 2007. Mass Spectrometry Analysis of the Native Protein Complex Containing Actinin-4 in Prostate Cancer Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 6: 479-491.

66. Harrington E.O., Smeglin A., Newton J., Ballard G., Rounds S. 2001. Protein tyrosine phosphatase-dependent proteolysis of focal adhesion complexes in endothelial cell apoptosis. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol.Physiol. 280: 342-353.

67. Hartigh J.C., Henegouwen P.M., Verkleij A.J., Boonstra J. 1992. The EGF receptor is an actin-binding protein. The Journal of Cell Biology. 119(2): 349-355.

68. Heo W.D., Meyer T. 2003. Switch-of-function mutants based on morphology classification of Ras superfamily small GTPases. Cell. 113: 315-28.

69. Hesketh J.E. 1996. Sorting of messenger RNAs in the cytoplasm: mRNA localization and the cytoskeleton. Experimental cell research. 225: 219-236.

70. Honda K, Yamada T., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsiida H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. The Journal of Cell Biology. 140(6): 1383-1393.

71. Howe A., AplinA.E., Alahari S.K., Juliano R.L. 1998. Integrin sugnalling and cell growth control. Current Opinion in Cell Biology. 10: 220-231.

72. Huang T.T., Kudo N., Yoshida M„ Myamoto S. 2000. A nuclear export signal in the Nterminal regulatory domain of Ikappa B a controls cytoplasmic localization of inactive NF kappa B/ Ikappa B a complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 1014-1019.

73. Hui H., Fernando M.A., Heaney A.P. 2008. The alphal-adrenergic receptor antagonist doxazosin inhibits EGFR and NF-kappaB signalling to induce breast cancer cell apoptosis. Eur J Cancer. 44(1): 160-6.

74. Hynes R.0.1999. Cell adhesion: old and new questions. Trends Cell Biol. 9(12): 33-37.

75. Hynes R.O. 2002. Integrins: bidirectoral, allosteric signaling machines. Cell. 110: 673687.

76. Immure M., Endo T., Kuroda M., Tanaka 71, Masaki T. 1988. Substructure and higher structure of chicken smooth muscle a-actinin molecule. J. Biol. Chem. 263: 7800-7805.

77. Ingber D.E. 2002. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology. Circ Res. 91(10): 877-887.

78. Johnson G.L., Lapadat R. 2002. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science. 298(5600): 1911-1912.

79. KangK-H., Lee K-H, Kim M-Y., Choi K-H. 2001. Caspase-3 mediated cleavage of the NF-kB subunit p65 at the NH2 terminus potentiates naphtoquinone analog-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276: 3629-3639.

80. Karin M., Liu Z.-G., Zandi E. 1997. AP-1 function and regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 240-246.

81. Kaverina I., Stradal T.E., Gimona M. 2003. Podosome formation in cultured A7r5 vascular smooth muscle cells requires Arp2/3-dependent de-novo actin polymerization at discrete microdomains. J. Cell Sci. 116: 4915-4924.

82. Kustermans G., El Benna J., Piette J, Legrand-Poels S. 2005. Perturbation of actin dynamics induces NF-kappa B activation in myelomonocytic cells through an NADH oxidase-dependent pathway. Biochem. J. 387: 531-540.

83. Kustermans G., El Mjiyad N., Horion J., Jacobs N., Piette J., Legrand-Poels S. 2008a. Actin cytoskeleton differentially modulates NF-kappaB-mediated IL-8 expression in myelomonocytic cells. Biochem Pharmacol. 76(10): 1214-1228.

84. Kustermans G., Piette J., Legrand-Poels S. 20086. Actin-targeting natural compounds as tools to study the role of actin cytoskeleton in signal transduction. Biochem. Pharmacol. 76(11): 1310-22.

85. LaCasse E.C., MahoneyD.J., CheumgH.H, Plenchette S., BairdS., KornelukR.G. 2008. IAP-targeted therapies for cancer. Oncogene. 27(48): 6252-6275.

86. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

87. Lafrenie R.M., Bernier S.M., Yamada KM. 1998. Adhesion to Fibronectin or collagen 1 gel induces rapid, extensive, biosynthetic alterations in epithelial cells. Journal of cellular physiology. 175: 163-173.

88. Lallena M.J., Diaz-Meco M.T., Bren G., Paya C. V., MoscatJ. 1999. Activation of IkappaB kinase beta by protein kinase C isoforms. Mol Cell Biol. 3: 2180-2188.

89. Legrand-Poels S., Kustermans G., Bex F., Kremmer E., Kufer T. A., Piette J. 2007. Modulation of Nod2-dependent NF-kB signaling by the actin eytoskeleton. Journal of Cell Science. 120: 1299-1310.

90. Levkait B., Scatena M., Giachelli C.M., Ross R., Raines E. W. 1999. Apoptosis overrides survival signals throught a caspase-mediated, dominant-negative NF-kB loop. Nature Cell Biol. 1:227-233.

91. Linder S„ Aepfelbacher M. 2003. Podosomes: adhesion hot-spots of invasive cells. Trends in Cell Biol. 13: 376-385.

92. Liu B.-L., McGrath J. 2005. Response of eytoskeleton of murine osteoblast cultures to two-step freezing. Acta biochim. biophys. 37: 814-818.

93. Lock J.G., Wehrle-Haller B., Stromblad S. 2008. Cell-matrix adhesion complexes: master control machinery of cell migration. Semin Cancer Biol. 18(1): 65-76.

94. LuikartS., Masri M., Wahl D., Hinkel T., Beck J.M., Gyetko M.R., Gupta P., Oegema T. 2002. Urokinase is required for the formation of mactinin, an alpha-actinin fragment that promotes monocyte/macrophage maturation. Biochim Biophys Acta. 1591: 99-107.

95. Lyle R., Valleley E.M., Sharpe P.T., Hewitt J. E. 1994. An alternatively spliced transcript, p65 delta 2, of the gene encoding the p65 subunit of the transcription factor NF-kappaB. Gene. 138(1-2): 265-266.

96. Maniak M. 2001. Cell adhesion: Ushering in a new understanding of myosin VII. Curr Biol. 11(8): 315-317.

97. Massague J, Pandiella A. 1993. Membrane-anchored growth factors. Ann. Rev. Biochem. 62: 515-41.

98. May M.J., Ghosh S. 1998. Signal transduction through NF-kB. Immunology today. 19(2): 80-88.

99. McMahon L.W., Sangerman J., Goodman S.R., Kumaresan K., Lambert M.W. 2001. Human alpha spectrin II and the FANCA, FANCC, and FANCG proteins bind to DNA containing psoralen interstrand cross-links. Biochemistry. 40: 7025-7034.

100. McMahon L.W., Walsh C.E., Lambert M.W. 1999. Human alpha spectrin II and the Fanconi anemia proteins FANCA and FANCC interact to form a nuclear complex. Biol. Chem. 274: 32904-32908.

101. Mercurio F., Manning A.M. 1999. Multiple signals converging on NF-kB. Current Opinion in Cell Biology. 11: 226-232.

102. Meredith JJr, Mu Z, Saido T, DuX. 1998. Cleavage of the cytoplasmic domain of the integrin beta3 subunit during endothelial cell apoptosis. J. Biol. Chem. 273: 19525-19531.

103. Michaud J.L., Hosseini-Abardeh M., FarahK., Kennedy C.R. 2009. Modulating alpha-actinin-4 dynamics in podocytes. Cell Motil Cytoskeleton. 66(3): 166-178.

104. Narayanan R., Klement J.F., Ruben S.M., Higgins K.A., Rosen C.A. 1992. Identification of naturally occuring transformibg variant of the p65 subunit of NF-kB. Science.256: 367370.

105. Ohisubo M., Ta/cayanagi A., GamouS., Shimizu N. 2000. Interruption ofNFkB-Statl signaling mediates EGF-induced cell-cycle arrest. Journal of cellular physiology. 184: 131137.

106. Olave I.A., Reek-Peterson S.L., Crabtree G.R 2002. Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling. Annu Rev Biochem.71: 755-781

107. Ornelles D.A., Fey E.G., Penman S. 1986. Cytochalasin releases mRNA from the cytoskeletal framework and inhibits protein synthesis. Molecular and cellular biology. 5: 1650-1662.

108. Otey C.A., Carpen O. 2004. Alpha-actinin revisited: A fresh look at an old player. Cell Motil. Cytoskeleton. 58: 104-111.

109. Owen H.R., Quadroni M., Bienvenut W., Buerki C., Hottiger M.O. 2005. Identification of novel and cell type enriched cofactors of the transcription activation domain of RelA (p65 NF-kB). J.of Proteome Research. 4: 1381-1390.

110. Pavalko F.M., Chen N.X., Turner C.H., Burr D.B., Atkinson S., Hsieh Y.-F., Qui J., Duncan R.L. 1998. Fluid shear-induced mechanical signaling in MC3T3-E1 osteoblasts requires cytoskeleton-integrin interactions. Am. J. Physiol. 275: 1291-1601.

111. Pederson T., Aebi U. 2002. Actin in the nucleus: what form and what for? J. Struct. Biol. 140: 3-9.

112. Percipalle P., Visa N. 2006. Molecular functions of nuclear actin in transcription. J Cell Biol. 172(7): 967-971.

113. Percipalle P., Zhao J., Pope B., Weeds A., Lindberg U., Daneholt B. 2001 Actin bound to the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein hrp36 is associated with Balbiani ring mRNA from the gene to polysomes. J Cell Biol. 153: 229-236.

114. Poch M. T., Al-Kassim L., Smolinski S.M., Hines R.N. 2004. Two distinct classes of CCAAT box elements that bind nuclear factor-Y/a-actinin-4: potential role in human CYP1A1 regulation. Toxicol. Applied Pharmacol. 199: 239-250.

115. Pollard T.D., Cooper J. A. 1986. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev Biochem. 55: 987-1035.

116. Porjiri E., McCormick F. 1996. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by phosphorylation of the ras exchange factor hSOSl. J. Biol. Chem. 271: 58715877.

117. Posern G., Sotiropoulos A., Treisman R. 2002. Mutant Actins Demonstrate a Role for Unpolymerized Actin in Control of Transcription by Serum Response Factor. Molecular Biology of the Cell. 13: 4167-4178.

118. Qwarnstrom E.E., Ostberg C.O., TurkG.L., Richardson C.A., BomsztykK. 1994. Fibronectin attachment activates the NF-kappa B p50/p65 heterodimer in fibroblasts and smooth muscle cells. J Biol Chem. 269(49):30765-30768.

119. Ravi R., BediA., Fuchs E.J., BediA. 1998. CD95 (Fas)-induced caspase-mediated proteolysis of NF-kappaB. Cancer Res. 58(5): 882-886.

120. Reyes-Reyes M., MoraN., ZentellaA., Rosales C. 2001. Phosphatidylinositol 3-kinase mediates integrin-dependent NF-kappaB and MAPK activation through separate signaling pathways. J Cell Sci. 114: 1579-1589.

121. RheeS. G., Bae Y. S. 1997. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes. J. Biol. Chem. 272: 15045-1548.

122. Ridley A.J., Hall A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesion and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 1992. 70: 389-399.

123. Riese D. J„ Stern D. F. 1998. Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signaling network. Bioessays. 20(1): 41-48.

124. Robinson M.J., Cobb M.H. 1997. Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr Opin Cell Biol. 9(2): 180-186.

125. Ruben S.M., Narayanan R., Klement J.F., Chen C-H., Rosen C.A. 1992. Functional characterization of the NF-kB p65 transcriptional activator and an alternatively spliced derivative. Mol.Cell.Biol. 12: 444-454.

126. Sampath P., Pollard T.D. 1991. Effects of cytochalasin, phalloidin, and pH on the elongation of actin filaments. Biochemistry. 30(7): 1973-1980.

127. Sastry S.K., Burridge K. 2002. Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261(1): 25-36.

128. Savage C. R., Inagami T, Cohen S. 1972. The primary structure of epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 247(23): 7612-21.

129. Schlessinger J. 1990. Mutation analisis of epidermal growth factor-receptor kinase. Biochem. Soc. Symp. 61(2): 203-212.

130. Schmidt A., Hall M.N. 1998. Signaling to actin cytoskeleton. Annu.Rev.Cell Develop.Biol. 14: 305-338.

131. Schoenwaelder S.M., Burridge K. 1999. Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Current Opinion in Cell Biology. 11: 274-286.

132. Schütze S, Nottrott S, Pfizenmaier K, Kränke M. 1990. Tumor necrosis factor signal transduction. Cell-type-specific activation and translocation of protein kinase C. J. Immunol. 144: 2604-2608.

133. Sechler J.L., Corbett S.A., Wenk M.B., Schwarzbauer J.E. 1998. Modulation of cell-extracellular matrix interactions. Annals New-York Academy of Sciences. 857: 143-154.

134. Seiliah N., Brooks W.H., Roszman T.L. 1996. Proteolytic cleavage of a-actinin by calpain in T cells stimulated with anti-CD3 monoclonal antibody. J. Immunol. 156: 32153221.

135. Sen R., Baitimor D. 1986. Inducibility of k immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kB by a post-translational mechanism. Cell. 47: 921-928.

136. Shyu Y.J., Suarez C.D., Hu C.D. 2008. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sei USA. 105(1): 151-156.

137. Small J. V., Rottner K., Kaverina I., Anderson K.I. 1998. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. Biochim. Biophys. acta. 1404: 271-281.

138. Sotiropoulos A., Gineitis D., Copeland J., Treisman R. 1999. Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamic. Cell. 98: 159169.

139. Sridharan D., Brown M., Lambert W.C., McMahon L.W., Lambert M.W. 2003. Nonerythroid alphall spectrin is required for recruitment of FANCA and XPF to nuclear foci induced by DNA interstrand cross-links. J. Cell Sei. 116: 823-835.

140. Sun L., Carpenter G. 1998. Epidermal growth factor activation of NF-kB is mediated thought IkBcx degradation and intracellular free calcium. Oncogene. 16: 2095-2102.

141. Swanson J.A., Watts C. 1995. Macropinocytosis. Trends Cell Biol. 5(11): 424-428.

142. Tang Y., Katuri V., Dillner A., Mishra B., Deng C.X., Mishra L. 2003. Disruption of transforming growth factor-beta signaling in ELF beta-spectrin-deficient mice. Science. 299(5606): 574-577.

143. Thanos D., Maniatis T. 1995. NF-kB: a lesson in family values. Cell. 80: 529-532.

144. Tian B., Nowak D.E., Jamaluddin M., Wang S., Brasier A.R. 2005. Identification of Direct Genomic Targents Downstream of the Nuclear Factor-KB Transcription Factor

145. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Sei. 76: 4350-4354.

146. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell. 61:203-212.

147. Varón C., Tatin F., Moreau V, Obberghen-Schilling E.V., Fernandez-Sauze S., Reuzeau E., Kramer I., Genot E. 2006. Transforming growth factor alpha induces rosettes of podosomes in primary aortic endothelial cells. Mol. Cell. Biol. 26: 3582-3594.

148. Vendrell M., Aligué R., Bachs O., Seratosa J. 1991. Presence of calmodulin and calmodulin-binding proteins in the nuclei of brain cells. J Neurochem. 57(2): 622-628.

149. Verma I.M., Stevenson J.K., Schwartz E.M., Antwerp D. V, Miyamoto S. 1995. Rel/NF-kB/IkB family: initimate tales of association and dissociation. Genes & Development. 9: 2723-2735.

150. Vincent C., Pruliere G., Pajot-Augy E., Campion E., Gamier V, Renard J.P. 1990. Effects of cryoprotectants on actin filaments during the cryopreservation of one-cell rabbit embiyos. Cryobiology. 27: 9-23.

151. Wada A., Fukuda M., Mishima M., Nishida E. 1998. Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletal protein. EMBO J. 17: 1635-1641.

152. Wei L., WangL., Carson J.A., AganJ.E., Imanaka-Yoshida K., Schwartz R.J. 2001. Betal integrin and organized actin filaments facilitate cardiomyocyte-specific RhoA-dependent activation of the skeletal alpha-actin promoter. FASEB J. 15(3): 785-796.

153. Yamada K.M., Geiger B. 1997. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

154. Yarwood S. J., Woodgeft J.R. 2001. Extracellular matrix composition determines the transcriptional response to epidermal growth factor receptor activation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 98(8): 4472-4477.

155. Young KG., Kothary R. 2005. Specrtin repeat proteins in the nucleus. BioEssays. 27: 144-152.

156. Zhang S., Buder K., Burkhardt C, Schlott B., Gorlach M„ Grosse F. 2002. Nuclear DNA helicase II/RNA helicase A binds to filamentous actin. J Biol Chem. 277: 843-53

157. Zhong H., May M. J., Jimi E., Ghosh S. 2002. The phosphorylation status of nuclear NFkappaB determines its association with CBP/p300 or HDAC-1. Mol. Cell. 9: 625-636.

158. Zhong H., Voll R.E., Ghosh, S. 1998. Phosphorylation of NFkappa B p65 by PKA stimulates transcriptional activity by promoting Silencing mediator of a novel bivalent interaction with the coactivator CBP/p300. Mol. Cell. 1: 661-671.

159. Zhu P., Xiong W., Rodgers G., Qwarnstrom E.E. 1998. Regulation of interleukin 1 signalling through integrin binding and actin reorganization: disparate effects on NF-kappaB and stress kinase pathways. Biochem J. 330 (Pt 2): 975-981.