Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути биосинтеза кетокислот из глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пути биосинтеза кетокислот из глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica"

РГ5 ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 577.17-1

МОРГУНОВ ИГОРЬ ГРИГОРЬЕВИЧ

ПУТИ БИОСИНТЕЗА КЕТОКИСЛОТ ИЗ ГЛИЦЕРИНА У ДРОЖЖЕЙ ЧаггстШ (Сапй1<3а) 11ро1уХ1са.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1994 г.

Работа выполнена в Лаборатории окислительного обмена веществ Института биохимии и физиологии микроорганизмов

РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.В.Финогенова кандидат биологических наук А.А.Шарышев

доктор биологических наук

Ю.А.Троценко доктор биологических наук профессор Я Е Гоготов

Ведущая организация: Кафедра микробиологии

МГУ,Москва

Защита диссертации состоится ///•¿'¿/•Я' 1994 г. в ¡/^0 час, на заседании специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской обл., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.М.Вагабов

Актуальность проблеммы. Интерес к получению с помощью дрожжей веществ, химический синтез которых невозможен или нерентабелен, продолжает неуклонно расти.

Известно, что при ассимиляции ряда углеродных субстратов дрожжи могут экскретировать в среду органические кислоты (лимонную, изолимонную, пировиноградную, 2-оксоглутаровую, фумаровую и др.)(Финогенова с соавт., 1966, Лозинов, 1970, Глазунова, Финоге-нова, 1973, Финогенова, 1982, Ермакова с соавт., 1986).

Использование тех или иных источников углерода для целей микробиологического синтеза ставит задачи изучения механизмов ассимиляции этих соединений, путей их превращения в конечный продукт и возможностей регуляции процессов биосинтеза.

Перспективным субстратом для микробиологического получения ряда веществ является глицерин. Дрожжи Candida lipolytica при росте на глицерине способны накапливать в среде кетокислоты - пировиноградную и 2-оксоглутаровую. В ИБФМ разработан метод получения пировиноградной кислоты из глицерина с помощью дрожжей С.lipolyîica (A.c. N I32I064, N 1249069). Пировиноградная кислота является ценным биохимическим реактивом, а также может быть использована в качестве предшественника при производстве аминокислот - тирозина, аланина, триптофана, и лекарственного вещества диоксифе-нилаланин. Однако, метаболизм глицерина у дрожжей - продуцентов и механизм сверхсинтеза пирувата оставался неизученным.

Для изучения путей метаболизма глицерина нами были выбраны дрожжи с различным типом метаболизма: Candida lipolyttca - строго аэробный организм, продуцент пировиноградной кислоты и Candida valida - культура, обладающая способностью к брожению, известный продуцент цитохрома с.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение ключевых ферментов путей метаболизма глицерина и механизма биосинтеза кетокислот у тиаминауксотрофных дрожжей С. lipolytica.

В задачи экспериментального исследования входило:

1) сравнительное изучение путей метаболизма глицерина у двух различных видов дрожжей - С.lipolytica и С.valida.

2) выделение и характеристика ключевых ферментов ассимиляции глицерина, исследование механизмов их регуляции;

3) изучение механизмов биосинтеза пировиноградной и 2-оксоглу-таровой кислот дрожжами С.lipolytica из глицерина.

Научная новизна работы. Установлен путь метаболизма глицерина у дрожжей C.lípolytlca - продуцента кетокислот. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорили-рования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фос-фата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависи-мой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы. Ключевой фермент этой метаболической последовательности - глицеролкиназа - очищен и охарактеризован.

Показано, что дрожжи С.valida реализуют другую метаболическую последовательность, в которой глицерин сначала дегидрируется глицеролдегидрогеназой до диоксиацетона, который далее фосфорили-руется диоксиацетонкиназой. Глицеролдегидрогеназа из G.valida выделена и охарактеризована.

Изучен механизм биосинтеза пировиноградной и 2-оксоглутаровой кислоты из глицерина дрожжами С.lipolytica при росте на дефицитной по тиамину среде. Проведен сравнительный анализ изменения активности ферментов основных метаболических путей при росте дрожжей на полной и дефицитной средах.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований создано представление о биохимическом механизме "сверхсинтеза" пирувата и 2-оксоглутарата, которое может быть использовано при практическом осуществлении процесса получения кетокислот.

Разработаны простые оригинальные методы очистки глицеролкина-зы из C.lipolytica и глицеролдегидрогеназы из С.valida. Данные ферменты могут быть использованы для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицерол-киназы из дрожжей защищен авторским свидетельством.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов", Рига, I98S г.; на Всесоюзной конференции "Метода получения и анализа биохимических препаратов", Рига, 1987 г.; на Международной школе-конференции молодых ученых по микробиологии, Приморско, Болгария, 1987 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения в 7 главах,-выводов и списка литературы ( £iL ссылка-) . Работа изложена на Ч-Сг-страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 14 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследований. Основными объектами исследований служили дрожжи Candida lipolytica и Candida valida. В ряде экспериментов использовали дрожжи Torulopsis candida, Candida maltosa, Can -dlda utllls , Candida boldlnll.

Культивирование. Дрожшг культивировали в минеральной среде Ридер со смесью микроэлементов Буркгольдера (Мунтян,1971).

Культивирование проводили при 29°С в колбах на качалке или в ферментерах АНКУМ-2М емкостью 10 литров. В тех случаях, когда культивирование проводилось в ферментере, выдерживался следующий режим: обьем среды - 7 литров, кислород - 65% насыщения, обороты мешалки - 800 об/мин, рН=6.0. В качестве источника углерода использовались глюкоза или глицерин в концентрации 1.5%, и гексадекан в концентрации 0.8 % (по объему).

Тиаминауксотрофные дрожжи С.lipolytica выращивали при концентрации тиамина 500 мкг/л (полная среда) и при концентрациях 0,5-5 мкг/л (дефицитная среда).

Получение бесклеточных экстрактов. Для получения бесклеточных экстрактов клетки разрушали одним из двух методов:

I) с помощью пресса ИБФМ из замороженного состояния;

Z) на шаровой мельнице с помощью стеклянных бус "баллотини".

Измерение активности ферментов проводили при 30°С на спектрофотометре "Specord UV-VIS", активность выражали в микро- или нано-молях превращенного субстрата в минуту на миллиграмм бежа.

Все использованные процедуры очистки ферментов разработаны нами. Очистку проводили при 4°С, если не указаны другие условия.

Методы определения активностей ферментов и процедуры очистки подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Сравнительное изучение путей метаболизма глицерина, у дрожжей С.lipolytica и С.valida.

Тиаминауксотрофные дрожжи С. lipolytica являются строгими аэробами и при росте на глицерине в условиях дефицита тиамина могут экскретировать в среду пировиноградную и 2-оксоглутаровую кислоты (Финогенова, 1982).

С.valida являются дрожжами бродильного типа. Этот организм детально изучен как продуцент цитохрома с (Еремина,1978). Дрожжи С.valida рассматриваются также как один из перспективных видов дрожжей для получения кормового бежа.

В настоящее время известно два основных пути метаболизма глицерина у дрожжей:

1)фосфорклирование глицерина глицеролкиназой и последующее дегидрорование глицерол-3-фосфата до диоксиацетонфосфата (фосфори-лирующий путь);

2)окисление глицерина глицеролдегидрогеназой и фосфорилирова-ние образовавшегося диоксиацетона диоксиацетонкиназой.

Нами определены активности ферментов, катализирующих начальные этапы как фосфорилирующего, так и окислительного путей метаболизма глицерина, в экстрактах из клеток дрожжей C.lipolytica и С.valida (таблица I).

Таблица I.

Активности ферментов начальных этапов ассимиляции глицерина

у дрожжей C.lipolytica и С.valida ( нмоль/мин на мг белка).

Источник углерода для роста ФЕРМЕНТЫ C.lipolytica С.valida

глюкоза глицерин глицерин

Фэсфорилирующий путь

Глицеролкиназа 47 105 0

Глицерол-З-фосфат-дегидрогеназа(НАД) 5 52 0

Глицерол-З-фосфат-дегидрогеназа(ФАД) 3 41 0

Окислительный путь

Глицеролдегидрогеназа (НАД) н.о О 300

Диоксиаце тонкиназ а н.о. 0 81

Глицеролдегидрогеназа(НАДФ) н.о. 0 0

Глицеролоксидаза н.о. 0 0

и.о.- не определяли.

При выращивании С.Иро1уИса в среде с глицерином наблюдается увеличение уровней активности глицеролкиназы и двух глицерол - 3 -фосфатдегидрогеназ.

Ферменты, катализирующие реакции окислительного пути метаболизма глицерина, - ни НАД-зависимая глицеролдегидрогеназа, превращающая глицерин в диоксиацетон, ни диоксиацетоикиназа, - не были обнаружены в грубых экстрактах клеток исследуемых дрожжей. Отсутствовали в них также активности ферментов превращения глицерина в глицеральдегид - НАДФ - зависимой глицеролдегидрогеназы и глице-ролоксидазы, ранее обнаруженных у некоторых дрожжей и грибов.

Высокие активности глицеролкиназы и двух глицерол -3- фосфат-дегидрогеназ и индуцибельный характер этих ферментов, а также отсутствие других ферментов ассимиляции глицерина позволяет предпо-предположить, что у дрожжей C.lipolytica функционирует только фос-форилирующий путь метаболизма этого субстрата.

Долгое время фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Затем для ряда дрожжей был описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацетона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May, Sloan, 1981).

Функционирование глицеролдегидрогеназного пути метаболизма глицерина обнаружено нами у дрожжей С.valida. В экстрактах этих дрожжей обнаружены глицеролдегидрогеназа и диоксиацетоикиназа (табл.1). Глицеролкиназа и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы отсутствовали.

Дрожжи С.valida, как активные бродилыщжи, обладает высокой активностью алкогольдегидрогеназы. Поскольку алкогольдегидрогеназа характеризуется широкой субстратной специфичностью, можно было предположить, что этот фермент катализирует НАД-зависимое окисление глицерина. Однако это предположение не подтвердилось в результате поставленных нами экспериментов. С использованием гидрофобной хроматографии нам удалось четко разделить алкоголь- и глицеролде-гидрогеназу (рисЛ). При этом алкогольдегидрогеназа не катализировала НАД-зависимое окисление глицерина, а глицеролдегидрогеназа, в свою очередь, не обладала алкогольдегидрогеназной активностью.

Исходя из полученных результатов, можно утверждать, что у дрожжей С.valida тлеется фермент,специфичный для глицерина и катализирующий его окисление с НАД в качестве кофактора. НАДФ-зависи-мого окисления глицерина в экстракте изучаемых дрожжей не обнаружено, отсутствовала также и активность глицеролоксидазы.

Е гво 0,5 Ы CA.

0,25 U ÇA. и ip*o-«rt«p Ул

2

Уа ГДГ

г

I

Уа АДГ

1

Белов j

J

г.

11 1 У^т I

гл л /

номер фракции

Рис.1. Разделение глицеролдегидрогеназы и алкогольдвгидрогеназы на фенил-сефарозв.

Уа-удельная активность (мкмоль/мин на мг белка);

ГДГ-глицеролдегидрогеназа ; АДГ-апкогольдегидрогеназа;

СА-сульфат аммония.

Таким образом, изучаемые нами дрожжи C.ltpolytica и С.valida реализуют два различных пути метаболизма глицерина (рис.2). У C.ltpolytica первым этапом ассимиляции глицерина является его фос-форилирование глицеролкиназой. Далее глицерол-3-фосфат дегидрируется глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой до диоксиацетонфосфата. У С.valida образования глицерол-3-фосфата не происходит, поскольку глицерин окисляется глицеролдегидрогеназой до диоксиацетона, который фосфорилируется диоксиацетонкиназой .

Такие различия в путях метаболизма глицерина можно объяснить физиологическими особенностями исследуемых дрожжей. C.lipolytica -строго аэробный организм, в то время как С.valida являются дрожжами бродильного типа. Известно, что основным побочным продуктом при брожении является глицерин. Образование глицерина происходит из-за избытка НАДН,появляющегося при ассимиляции сахара в биомассу (Hof-

ФОСФОРШШРУЮЩИЙ ПУТЬ (C.lipolytica)

ГЛИЦЕРОЛ-З-ФОСФАТ..

ГЛИЦЕРИ

тт^ЧчГлицерол ДГ диок! 1Д i \ кш

НАДН \

ДИОКСИАЦЕТОН-Ф—»-

ГЛИКОЛИЗ

ДИОКСИАЦЕТОН

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ПУТЬ (С.valida)

Рис.2. Пути метаболизма глицерина у C.lipolytica и С.valida.

fmann,l983). Глицеролдегидрогеназа способна катализировать реакцию восстановления диоксиацетона в глицерин при физиологических условиях. Следовательно, можно предположить, что у бродилыциков в аэробных условиях глицеролдегидрогеназа может отвечать за первый этап ассимиляции глицерина, а при анаэробной ферментации Сахаров служить клапаном для сброса восстановительных эквивалентов, катализируя эндергоничное образование глицерина.

Известно также, что С.valida при росте на глюкозе в условиях дефицита фосфора способны накапливать в среде глицерин (Еремина, Финогенова, 1990). При этих же условиях C.lipolytica экскретирует в среду не глицерин, а лимонную кислоту (Лозинов, 1974). Способность накапливать в среде глицерин у разных видов дрожжей может быть связана с наличием или отсутствием глицеролдегидрогеназы.

Для более детального изучения путей метаболизма глицерина и выяснения механизмов его регуляции были очищены ферменты -глицеролкиназа и глицеролдегидрогеназа.

2. Очистка и свойства глицеролкиназы и глицеролдегидрогеназы.

Очистка глицеролкиназы из C.lipolytica. Метод очистки глицеролкиназы состоит из трех стадий. На первом этапе прогреванием экстракта удаляли менее термостабилыше белки. Полученный на этой

стадии супернатант подвергали хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. Гли-церожиназа элюировалась после выхода балластных бежов ступенчатым градиентом концентрации сульфата аммония (0-0.1 М). Фракции, содержащие активность глицерожиназы, объединяли, до водили концентрацию сульфата аммония до 0.25 Ми наносили на колонку с фенил-се-фарозой. Глицерожиназа сорбировалась на этом носителе при довольно низкой концентрации соли, в то время как большинство балластных бежов при этих условиях не задерживалось на колонке. Злюцию гл-церожиназы после удаления несвязавшихся бежов проводили 0,1 М сульфатом аммония. Фракции, содержащие активность фермента,объединяли, концентрироваж на диализной ячейке и полученный препарат использовали для дальнейших исследований. Процедура очистки гжце-рожиназы суммирована в таблице 2. Глицерожиназа очищена более чем в 300 раз с выходом 51% и имела удельную активность - 17.8 мкмоль/мин на мг бежа.

Таблица 2.

Очистка глицерожиназы из дрожжей C.lipolytica.

Стадия очистки Общий Общая Уд. Выход Степень

белок активность акг-ть %

(мг) (Е) (Е/мг б. ) очистки

Грубый экстракт 1320 77.9 0.059 100 I

Прогрев 510 77.5 0.152 99 2.6

ДЭАЭ-сефароза 32.4 48.6 1.5 62 25.4

Фенил-сефароза 2.3 40.9 17.8 51 301.3

Свойства глицерожиназы. Выделенная нами глицеролкиназа имеет молекулярный вес 200 кДа. Сходную молекулярную массу имеют ферменты из Cadiüa mycoßerma (251 ¡aa)(Bergmeuer,I96I) и E.coli (210 кДа)(Hayashi, bin, 1967).Молекулярная масса в 120 кДа установлена для глицеролкиназ из Neurospora crassa (Courtright, 1975) и Pseudomonas aeruginosa (McCowen, 1987J.

Интересно отметить, что фермент из E.coli ингибируется фрук-тозо-1.6-бисфосфатом, а фермент из N. crassa нечувствителен к данному соединению. Авторы, исследовавшие глицерожиназу из N. crassa, предполагают, что нечувствительность фермента к фруктозо-1,6-бис-

фосфату связана с отсутствием одной или нескольких регуляторных субъедениц (Courtright, 1975). Действительно, молекулярная масса фермента из ff. сrassa меньше, чем у глицеролкиназы из E.coli. Исследуемый нами фермент и глицеролкиназа из С.шусойегша, хотя по молекулярной массе схожи с ферментом из E.coli, но не ингибируются фруктозо-I,6-бисфосфатом.

Максимальную активность глицеролкиназа из C.lipolytica проявляет при pH = 10.0. Такой же оптимум pH характерен для ферментов из печени кролика и E.coli. Глицеролкиназы из N.crassa и метило-трофпых дрожжей Hansenula polymorpba максимально активны при pH = 8,0. Исследование термостабильных свойств глицеролкиназы показало, что фермент выдерживал инкубацию при 60° С в течение 10 минут,сохраняя 90 % активности. При этих условиях сохраняет активность и фермент из C.mycoderma.a глицеролкиназа из печени кролика выдерживала инкубацию при 60°С в течение 80 минут. Исследуемая наш глицеролкиназа ингибировалась 0.5 мМ АМФ на 50 %. Регуляция АМФ, по видимому, является универсальным свойством глицеролкиназ. Ингибиро-ванию АМФ в разной степени подвержены ферменты из печени человека, кролика, быка и из дрожжей C.mycoderma (Grunnet, Lundquist, 1967). Таким образом, выделенная нами из дрожжей C.lipolytica глицеролкиназа, по совокупности свойств (величина молекулярной массы,термостабильность, ингибирование АМФ) близка к глицеролкиназе дрожжей C.mycoderma.

Очистка глицеролдегидрогеназы из С.valida. На первой стадии бесклеточный экстракт фракционировали сульфатом аммония (30-70% от насыщения). Полученный после высаливания осадок растворяли в 50 мм калий-фосфатном буфере, содержащем 0,5 М сульфат аммония, и наносили на колонку с фенил-сефарозой. Элюцию глицеролдегидрогеназы проводили 0,5 М сульфатом аммония. При повторной хроматографии на той же колонке с фенил-сефарозой элюцию проводили в градиенте сульфата аммония (I - О М), что позволило достичь более полной очистки, чем на предыдущей стадии. На последнем этапе использовали гель-фильтрацию высокого разрешения (FPLC). 200 мкл препарата фермента, полученного после гидрофобной хроматографии наносили на колонку Superóse 12 HR. Элюцию проводили 0,1 М калий-фосфатным буфером. В результате удалось получить высокоочищенный препарат глицеролдегидрогеназы с удельной активностью 20 мкмоль/мин на мг бежа (табл 3).

Таблица 3.

Очистка глицеролдегидрогеназы из Candida valida.

Стадия очистки V Общий Общая УД. Выход Степень

(мл) белок акт-ть акт-ть % очистки

(мг) (Е) (Е/мг б. )

Грубый экстракт 120 460 138 0.3 100 I

Высаливание 24 216 108 0.5 78 1.66

Фенил-сефароза(I) 75 70 78 I.I 56 3.66

Фенил-сефароза(2) 10 8 40 8.0 28 26.6

0.2 0.16 1.28 8

Гель-фильтрация 2 0.064 1.28 20 66.6

Свойства глицеролдегидрогеназы. Глицеролдегидрогеназа из С. valida имеет молекулярную массу порядка 62 кДа. Молекулярная масса глицеролдегидрогеназы дрожжей Schizosaccharomyces pombe составляет 400 кДа (Marshall,1985); а для фермента из E.coli - 300 кДа (Tang, 1979).

Оптимум pH для реакции дегидрирования глицерина равен 10.5, для реакции восстановления диоксиацетона - 7.0. Общим свойством всех изученных на данный момент глицеролдегидрогеназ является то, что оптимальное значение pH для реакции дегидрирования глицерина заметно выше, чем для обратной реакции.

Глицеролдегидрогеназа из С.valida, как и фермент из Schis, pombe активируется ионами Zn2+ и Мп2+. Ионы Си2+и Mg2+ активируют фермент из С.valida, но не действуют на фермент из Schiz.pombe ("Marshall, 1985;.

3. Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина у C.lipolytica и физиологическая роль глицерол-3-фосфат-де-гидрогеназ.

Первый этап превращения глицерина - фосфорилирование,- локализован в цитоплазме. Доказательством этого служит тот факт, что 93% активности глицеролкиназы обнаруживается в растворимой фракции после дифференциального центрифугирования.

Следующий этап ассимиляции глицерина - дегидрирование образовавшегося в глицеролкиназной реакции глицерол-3-фосфата - может катализироваться двумя различными оксидоредуктазами - ФАД - зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой и НАД - зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (активности обеих обнаружены у C.ltpolytica (табл.1)). ФАД - зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа ассоциирована с фракцией мембранных органелл. Более 75 % активности этого фермента при дифференциальном центрифугировании обнаружено во фракции частиц. При этих же условиях примерно 79 % активности фу-маразы,маркерного фермента митохондрий,определялось в той же фракции. Одинаковый характер распределения этих двух ферментов позволяет предположить, что они ассоциированы с одной субклеточной органе ллой.

Более 55 % НАД - зависимой глицерол-Знфосфат-дегидрогеназы связано с фракцией частиц. Примерно также распределяются активности пероксисомальных ферментов (изоцитрат-лиазы и каталазы). Однако, для окончательного выяснения внутриклеточной локализации НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы необходимы дальнейшие исследования, в частности, получение фракции пероксисом.

Теоретически можно предположить три метаболических функции для НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы: восстановление диоксиацетонфосфата для биосинтеза триглицеридов, окисление глице-рол-3-фосфата, образовавшегося при ассимиляции глицерина, и поддержание редокс - потенциала. Литературные данные о метаболической роли глицерол-З^&осфат-дегидрогеназы из различных источников не-многочислены и противоречивы. Участие в поддержании редокс - состояния предполагается для фермента из мышцы курицы (Whait, Kaplan, 1972) и дрожжей, ассимилирующих н-ажаны (Kawamoto et al., 1979), катаболическая роль - для ферментов из E.coli (Kito, Pizer,I968), печени курицы (Harding, 1975), N.crassa (Courtright, 1975). Биосинтетическая роль обсуждалась для ферментов из S.cerevisiae (Hoi-mam, 1983) и E.coli (Kito, Pizer, 1968).

В наших исследованиях мы наблюдали десятикратное увеличение активности НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках, выращенных на глицерине,по-сравнению с "глюкозными" клетками. Казалось бы, что основная роль данного фермента в клетках C.lipo-lytica заключается в дегидрировании глицерол-3-фосфата, образующегося в глицерожиназной реакции. С другой стороны, японские исследователи предположили, что НАД-зависимая глицерол-3-фосфат -

дегидрогеназа вовлечена в глицерол-3-фосфат - диоксиацетонфосфат челночную систему, функционирующую в ажан - утилизирующих дрожках. Данная система служит для транспорта восстановительных эквивалентов, образующихся в пероксисомах во время р-окисления жирных кислот (Kawamoto, et al.,1979).

Нами предпринята попытка определения метаболической роли НАДи ФАД-зависимых глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ в метаболизме глицерина у дрожжей. Алкан-утилизирующие дрожжи С. lipolytica, Т.candida , С.maltosa были выращены на глицерине и гексадекане, и в бесклеточных экстрактах этих дрожжей определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина. Активности этих же ферментов были определены в дрожжах C.utilis, не способных ассимилировать н-алканы, и в метанольных дрожжах C.boídínii, выращенных на глицерине. Также были определены активности ферментов метаболизма н-алканов.

Из результатов, представленных в таблице 4, очевидно, что активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках, выращенных на гексадекане, значительно выше, чем в "глицериновых" клетках. У дрожжей, не окисляющих н-алканы, этот фермент вообще не обнаружен. Активности ферментов, участвующих в метаболизме н-алка-нов, (цитохрома Р-450, оксидазы высших спиртов, дегидрогеназы высших альдегидов, ацил-КоА оксидазы, изоцитрат-лиазы) у всех исследованных дрожжей были выше при росте на гексадекане. В то же время активность ключевого фермента ассимиляции глицерина - глицеролки-назы - выше у дрожжей, выращенных на глицерине. Активность ФАД-за-висимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы при выращивании дрожжей на глицерине и гексадекане изменялась незначительно. Эти результаты дают возможность предположить, что основная физиологическая роль НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связана не с ассимиляцией глицерина, а с метаболизмом н-алканов.

В окислении глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролки-назной реакции, основную роль, по-видимому, играет ФАД - зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа.

Таблица 4.

АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ГЛИЦЕРИНА II Н-АЖАПОВ У ДРОЫЕЙ.

Удельная активность, ныоль/мин на мг белка ФЕРМЕНТ С.Иро1уИса Т.сагхИс1а С.ппНоза С.иЫНз С.ШсИпИ

глицерин гексадекан глицерин гексадекан глицерин гексадекан глицерин глицерин

Глицеролкинааа 105 21 121 65 95 29 172 73

Глицерод-З-фос-

фат ДГ от 52 208 45 275 44 137 0 0

Глицерол-З-фос-

фат ДГ (ФАД) 41 40 49 63 32 52 48 27

Цитохром Р-450

(нмоль/мг сух. кд) 12 45 15 39 10 51 0 0

Оксидааа высших

жирных спиртов 15 80 44 120 35 153 0 0

Дегидрогеназа

высших альдегидов 34 96 75 180 64 179 н. 0. н. 0.

Ацил-КоА оксидаза 23 109 56 115 45 120 н. 0. н. 0.

Изоцитрат-лиаза 30 89 39 123 42 122 и.о. н. 0.

н. о. - не определяли

4. Биосинтез кетокислот дрожжами С.Иро1уИса при росте на глицерине.

Три исследованных нами штамма С.ИрогуИса (374, 579 и 695) хорошо росли на полной среде с глицерином (1,5 % по общему) в отсутствии лимитирования роста тиамином (500 мет/л) и накапливали биомассу 5-7 г/л.

Затем исследуемые штаммы были выращены на дефицитной по тиамину среде (концентрация тиамина 1.5 мкг/л). В этих условиях у всех трех штаммов наблюдалось снижение выхода биомассы и экскреция в среду кетокислот - пировиноградной и 2-оксоглутаровой. При этом как абсолютное количество накапливаемых в среде кетокислот, так и их соотношение было различным.

Для дальнейших исследований нами была выбрана культура С.11-роХуНса 695, так как данный штамм синтезировал наибольшие количества кислот (рис.3).

Рис.3. "Сверхсинтез" кетокислот дрожжами с.ираХуИса при росте на

глицерине е условиях дефицита тиамина.

Стрелками указано время отбора проб для определения активностей ферментов.

Для изучения путей биосинтеза кетокислот были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и цикла трикарбоновых кислот при росте дрожжей в условиях дефицита тиамина (содержание тиамина 1,5 мкг/л). Клетки отбирались в фазе замедленного роста к в стационарной фазе (точки I и 2 на рис.3).

В таблице 5 представлены данные, полученные при определении активности ферментов. Здесь же для сравнения приведены результаты определения активности этих ферментов в период экспоненциального роста в отсутствии синтеза кетокислот (тиамин - 500 мкг/л).

Таблица 5.

Активность ферментов основных и анаплеротических путей метаболизма глицерина у дрожжей С.Иро1уИса, (нмоль/мин на мг белка).

Фаза

ФЕРМЕНТЫ экспонен- замедления стаци-

циальная роста онарная

I. Начальные этапы ассимиляции

глицерина: 105 95 170

глицеролкиназа

глицерол-3-фосфат-дегидро- 52 16 13

геназа (НАД)

глицерол-3-фосфат-дегидро- 41 85 82

геназа (ФАД)

2. Гликолиз

Глицеральдегидфосфатдегидро- 120 98 130

геназа

Пируваткиназа 350 270 250

3. Пи^уватдегидрогеназа 115 82(103) 57(89)

Цитрат-синтаза 900 688 825

Изоцитратдегидрогеназа(НАД) 115 152 195

Изоцитратдегидрогеназа(НАДФ) 152 421 255

2-оксоглутаратдегидрогеназа 120 7(14) 3(15)

Малатдегидрогеназа 2000 1125 2550

4. Анаплеротические пути

Пируваткарбоксилаза 54 36 41

Изоцитрат-лиаза 9 22 12

В скобках даны активности при внесении в реакционную смесь

тиаминпирофосфата.

Как было .отмечено выше, фосфорилирование до глицерол-3-фосфа-та с участием глицеролкиназы является единственным путем вовлечения глицерина в метаболизм у изучаемой культуры. Как видно из приведенных в таблице результатов, активность глицеролкиназы не изменяется в фазе замедления роста, когда начинается синтез кетокис-

лот, и остается на высоком уровне в стационарной фазе.

Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы снижается в четыре раза в условиях дефицита тиамина и синтеза кето-кислот. В то же время активность ФАД-зависимого фермента возрастает вдвое при замедлении роста культуры, что подтверждает предположение о ключевой роли данного фермента в окислении глицерол-3-фосфата.

Активности ключевых ферментов, участвующих в превращении ди-оксиацетонфосфата в пируват - глицеральдегидфосфатдегвдрогеназы и пируваткиназы - при дефиците тиамина сохраняются на уровне, близком к таковому в период экспоненциального роста.

Активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается от 115 нмоль/мин на мг белка в экспоненциальной фазе до 82 нмоль/мин на мг белка в условиях дефицита тиамина в фазе замедления роста и 57 нмоль/мин на мг бежа в стационарной фазе. При этом необходимо отметить, что синтез апофермента в условиях дефицита тиамина в клетке идет с высокой скоростью - активность пируватдегидрогеназы, измеренная при внесении в реакционную смесь тиаминпирофосфата, хотя и несколько ниже активности, обнаруживаемой при экспоненциальном росте, но значительно более высока, чем в отсутствии тиаминового кофактора.

Активность ключевого фермента цикла трикарбоновых кислот цит-рат-синтазы незначительно снижается при переходе клеток в стадию синтеза кетокислот, а активность НАД - зависимой изоцитратдегидро-геназы даже несколько увеличивается. Наблюдается увеличение активности и НАДФ - зависимой изоцитратдегидрогеназы. Высокой на всем протяжении культивирования остается активность малатдегидрогеназы. Дефицит тиамина вызывает резкое снижение активности 2-оксоглута-ратдегидрогеназного комплекса(от120 нмоль/мин на мг белка в экспоненциальной фазе до 7 - 3 нмоль/мин на мг бежа при синтезе кетокислот). При добавлении в реакционную смесь тиаминпирофосфата активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса увеличивается незначительно (до 14 - 15 нмоль/мин на мг бежа). Причиной этого может быть нарушение биосинтеза фермента, вызванное тиаминовым дефицитом, или протеолитическое расщепление ферментного бежа в отсутствии кофактора.

Полученные результаты позволяют предположить следующий механизм биосинтеза кетокислот. Лимитирование роста дрожжей тиамином приводит к резкому снижению в клетках пула тиаминпирофосфата,что в

свою очередь делает реакцию окислительного декарбоксилирования пи-рувата узким звеном метаболизма. В результате этого часть пирови-ноградной кислоты, образовавшейся в реакциях окисления субстрата, экскретируется в среду. Однако,полного блокирования пируватдегид-рогеназного комплекса не происходит и реакция образования ацетил -КоА продолжает функционировать, хотя и с меньшей скоростью, обеспечивая синтез 2-оксоглутарата в цикле лимонной кислоты. Образовавшийся 2-оксоглутарат не окисляется в дальнейших реакциях цикла из-за повреждения 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, вызванного дефицитом тиамина. Результатом разомкнутости цикла на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы является экскреция в среду 2-оксоглутаровой кислоты. Ресинтез оксалоацетата в этих условиях, вероятно, осуществляется посредством функционирования пируваткар-боксилазной реакции, поскольку активность изоцитрат-лиазы практически отсутствует. При этом НТК функционирует в виде двух ветвей (рис.4).

ГЛИЦЕРИН

ГК-глицеролкиназз

Г-З-Ф ДГ-глицерол-З-фосфат-

Глицерол-З-фо сфа т

| Г-З-Ф ДГ(ФАД) Диоксиаце тонфо сфа т

ПВК ДГ - пируватдегидрогеназа ЦС - цитрат-синтаза ПВКК - пируваткарбоксилаза МДГ - малатдегидрогеназа ИДГ - изоцитратдегидрогеназа ОГК ДГ- 2-оксоглутаратдегид-

дегидрогеназа

--иг.1

{ МДГ Малат

рогеназа ТПФ-тиаминпирофо сфа т

Изоцитрат ИДГОВДЗ ИДГ(НАД)

Сукцинат

ОГК ДГ * ---|2-0КС0ГЛУТМ>АТ

Рис.4.Механизм биосштеза кетокислот дрожжами C.lipolytíca из глицерина в условиях дефицита тиамина

ВЫВОДЫ.

1. Проведено сравнительное изучение метаболизма глицерина у строго аэробных дрожжей C.lipolytica и у дрожжей, способных к брожению, С.valida. Показано, что первой стадией ассимиляции глицерина у дрожжей C.lipolytica является его фосфорилирование с участием глицеролкиназы.

2. У C.lipolytica обнаружены две глицерол-Знфосфат-дегидро-геназы (НАД- и ФАД-зависимые). Установлено, что основная роль в метаболизме глицерина принадлежит ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназе.

3. Показано, что глицеролкиназа является -цитоплазматическим ферментом, а обе глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы ассоциированы с фракцией частиц.

4. Глицеролкиназа из C.lipolytica очищена и частично охарактеризована. Получен препарат фермента со степенью очистки в 301 раз, удельной активностью 17.8 мкмоль/ мин на мг белка и выходом 51%. Фермент имеет молекулярную массу 200 кДа. В отличие от бактериальных глицеролкиназ,фермент из C.lipolytica не ингибируется фруктозо -1.6-бисфосфатом.

5. У дрожжей С.valida первой стадией включения глицерина в метаболизм является его дегидрирование НАД - зависимой глицеролде-гидрогеназой. Диоксиацетон, образовавшийся в глицеролдегидрогеназ-ной реакции, фосфорилируется диоксиацетонкиназой.

6. Глицеролдегидрогеназа из С.valida очищена и частично охарактеризована. Получен препарат фермента со степенью очистки в 66 раз и удельной активностью 20 мкмоль/мин на мг бежа. Глицеролдегидрогеназа имеет молекулярную массу 62 кДа и активируется ионами Zn2î Cu2î Mg2t

7. Показано, что дефицит тиамина вызывает снижение активности пируватдегидрогеназного комплекса, что приводит к "сверхсинтезу" пирувата. Однако, пируватдегидрогеназа инактивируется не полностью, что делает возможным функционирование цикла трикарбоновых кислот. Разомкнутость цикла Кребса на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы, вследствие дефицита тиамина приводит к накоплению 2-оксоглутаровой кислоты в культуральной жидкости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Моргунов И. Г. (1987) Метаболизм глицерина у дрожжей Candida lipolytica. Сб."Современные проблеммы биотехнологии микроорганизмов" Рига, с.146.

2. Ермакова И.Т., Моргунов И.Г.(1988) Ассимиляция глицерина дрожжами Yarrcwia lipolytica. Сб. "Методы получения и анализа биохимических реактивов" Рига, с.155.

3. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Ермакова И.Т. (1988)"Способ получения глицеролкиназы" Авт.свид.И 1433980.

4. Ермакова И.Т., Моргунов И.Г. (1988) Пути метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica. Микробиология, т.57,N4,с.533-537.

5. Моргунов И.Г., Ермакова И.Т. (1989) Механизм биосинтеза пировиноградной кислоты из глицерина дрожжами Yarrowia lipolytica. Микробиология,т.58,N1,с.26-30.

6. Моргунов И.Г., Ильченко А.П. (1991) Выделение.очистка и некоторые свойства глицеролкиназы из Candida lipolytica. Прикл. биохим.и микробиол.,т.27,N3,с.370-374.

7. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев A.A. (1991) Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) llpolytica.Em-химия,т.56,N2,с.258-266.

26.04.94 г. Зак.6072Р. Тир.130 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ШЦ РАН