Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР"



На правах рукописи

Уе1дина Анастасии Викторовна

ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории протозоологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский инсттут экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук и лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики Российской академик наук

Научный руководитель:

- доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР, Заблоцкий Вячеслав Титович

Официальные оппоненты:

- лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент Академии естествознания, доктор биологических наук, профессор Дьяконов Л.П. (ВИЭВ)

- доктор биологических наук, профессор Бенедиктов И.И.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится « & » 2008 г.

в ас. на заседании диссертационного совета Д 006.011.01 по защите

диссертаций на соискание ученой степеки кандидата биологических наук при ГНУ Всероссийском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (117218, Москва, Б. Черемушкинская, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан« 6 » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.К. Бережко

). Обшяя характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. Птицеводство занимает важное место в сельскохозяйственном производстве. В условиях интенсивных технологий ведения птицеводства цыплята с первых дней жизни подвергаются воздействию факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы, что приводит к снижению общей неспецифической резистентности организма и вызывает резкие морфо-функцнонзльные изменения в желудочно-кишечном тракте, которые влияют на работу пищеварительного тракта, рост и продуктивность птиц. Серьезную проблему в промышленном птицеводстве представляет кри птоспоридиоз.

Крилтоспоридии известны как паразиты преимущественно кишечного тракта, хотя они были установлены и в других органах и тканях животных (Payer R., Ungar B.L., 1986).

В соответствии с определением ВОЗ крнгггоспоридиоз отнесен к числу типичных зоонозов, возбудители которых трансм иссиру ются с позвоночными животными, птицами и человеком.

Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза во многих странах мира, в том числе и в нашей стране, он продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарии и медицины. При этом следует отметить, что наиболее сложной стороной в решении данной проблемы является диагностика криптоспоридиоза.

В настоящее время криптоспоридноз широко распространен на животноводческих и птицеводческих фермах, особенно в странах европейского континента, где заболеваемость телят этой инвазией колеблется от 22 до 40% от числа заболевших с признаками диареи. Наряду с телятами высокую чувствительность к возбудителю проявляют ягнята и козлята. Мыши, крысы и морские свинки также заражаются ооцистами криптоспородий, но без проявления клиники болезни, будучи при этом "резервуаром" для инфицирования домашних животных. V птиц

кри птоспориди оз чаще имеет

Г имени К.А. Тимирязева I ЦНБ имени Н И. Ж- дезнов1а

Частота поражения респираторного тракта у млекопитающих окончательно не изучена. Оо цисты криптоспоридий обладают чрезвычайной устойчивостью к разным лечебным антимикробным и антипаразитарным веществам, а также дезинфицирующим средствам. Заражение животных и птиц происходит алиментарно и аэрогенно (Muirhead S., 1986; Pavlasek I., 2001).

В своих исследованиях мы исходили на интереса к изучению опасного антропозооноза - кри птоспоридиоза птиц.

Актуальность проблемы криптоспорндиоза птиц обусловлена отсутствием надежных экспресс-методов диагностики, что и определило цель и задачи наших исследований.

1.2. Цель н задачи работы. Изучить распространенность криптоспорндиоза кур в Саратовской и Московской областях; разработать диагностическую тест-систему на основе ПЦР для выявления возбудителя кри птоспоридиоза кур.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Подобрать специфические олиго ну к леотидные праймеры для выявления ДНК Cryptosporidium baylei;

- Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции с использованием полевого штамма идентифицируемого возбудителя, включая подбор методики выделения ДНК;

- Определить оптимальную концентрацию компонентов реакционной смеси, температурный режим, условия регистрации результатов анализа;

- Апробировать разработанную ПЦР тест-систему в экспериментальных условиях на таксономическую специфичность, включая использование клинического и патологического материала от естественно зараженной птицы и лабораторных животных.

- Провести эпизоотопогическое обследование птицеводческих хозяйств и исследовать клинический материал от больной птицы на наличие Cryptosporidium bay lei;

U. Научная новизна.

Подобрана методика выделения ДНК из культур клеток простейших организмов, клинического и патологического материала;

Разработана экспериментальная диагностическая тест-система на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур: подобраны специфические слигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК, определены оптимальные условия проведения ПЦР.

Проведено эпизоотологнческое обследование специализированных хозяйств Московской и Саратовской областей;

1.4. Практическая значимость. Разработаны методические указания по применению экспериментальной тест-системы ПЦР для выявления ДНК Cryptosporidium bay lei, которые рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ 2006 года.

Представленные результаты наших исследований могут быть использованы в практической ветеринарии для прижизненной и посмертной диагностики криптоспоридиоза птиц.

li. Основные положения, выносимые на защиту:

оптимизация условий и конструирование праймеров для выявления и идентификации криптоспоридий;

разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур,

эпизоотопогическое обследование специализированных хозяйств -субьекгов РФ.

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-производственных конференциях, Ученом совете ВИЭВ (2007), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2007).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

1.8. Объем н структура диссертации.

Диссертация изложена на _ страницах компьютерного текста и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических предложений, списка

цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы _

таблицами, _ рисунками. Список литературы включает _

источников, из них _зарубежных.

2. Собственные исследования. 2.1. Материалы и методы.

Рабата выполнена в период с 2002 по 2005 г. г. в лаборатории протозоологии ГНУ Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко и в лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики Российской академии медицинских наук.

С целью выявления возбудителя криптоспоридиоза пшц и определения степени инвазированности цыплят нами было проведено обследование на четырех птицефабриках и одном нлемрепродукторе Iи порядка:

- Московская область, Нарофоминский район, ЗАО птицефабрика «Элинар Бройлер »;

- Московская область, г. Люберцы, ЗАО птицефабрика «Мирная»;

- Московская область, Конобеевский р-н, п/ф «Барановское»; -Саратовская область, Татищеве кий р-н, ФГУП «Ппемрепродуктор

Зори некий».

Специализированные предприятия имели аналогичный тип технологии содержания, кормления, породы, возраста.

Для разработки экспериментальной тест-системы ПЦР для обнаружения и идентификации возбудителя криптоспоридиоза кур мы использовали полевой штамм Cryptosporidium baylei. Данный штамм был получен от птиц из хозяйств Московской и Саратовской областей.

Ооцисты возбудителя имеют овальную форму и тонкую стенку, размер в среднем составляет 5,0 - 4,6 мкм. В препаратах, приготовленных из свежего материала н окрашенных методом Циля-Нильсена, ооцисты имеют вид овальных образований ярко-красного цвета.

.Для проверки таксономической специфичности разрабатываемой экспериментальной тест-системы нами была использована ДНК различных близкородственных видов организмов (токсоплазмы, эймерии). Культура клеток эймерий (Eimeria tenella) в концентрации 1млн. клеток в 1мл, представленная лабораторией протозоологии ВНИВИП г, Санкт-Петербург; Toxoplasma gondii предоставлен заведующим лабораторией протозойных инфекций НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи к.м.н. Д.Б. Гончаровым; полевой штамм Cryptosporidium baylei и Cr. parvum в концентрации 10 ООО м. клУмл.

Лабораторные животные;

В качестве лабораторной модели для поддержания выделенного нами экспериментального штамма криптоспоридий использовали беспородных белых мышей и крыс в возрасте 1-20 дней.

Клинический и патологический материал;

Материалом для исследования служили: фекалия, смывы с носоглотки, прямой кишки, слюна, ткани кишечника.

Всего исследовано 2021 проба клинического материала от кур и 30 проб патологического материала от цыплят-бройлеров,

В работе использовано следующее лабораторное оборудование; лам и нар бокс Л-5В; центрифуга Mikro 120, Hettich Eppendorf centrifugo 5415; термостат Termo 24-15 Biokom; вортекс Fuge-vortex; LABOTER ПЦР бокс

ДНК-Технология; амплификатор Biokom; транс иллюминатор; микроскоп JIOMO - МББ-1 А.

Химические реактивы,

1. Транспортная среда (10 шМ Tris НС1; 1 шМ EDTA рН 8,0; 2% DDT);

2. Лидирующий раствор;

3. ОгмывочныЙ раствор;

4. ТЕ-буфер для элюции ДНК;

5. Раствор фермента протеиназы К;

6. 5хТВЕ (трис; борная кислота; 0,5 m EDTA);

7. Красители: 1% раствор бромистого этидия; бромфенол синий;

S. Хлорид магния (MgClj);

9. Фермент Taq-полимераза;

10. В одонасыщенн ы й хлороформ;

11. Реакционная смесь (Н20; dntp; BxlO; Mg2+),

Материал, используемый нами для экспериментальной работы, получали от спонтанно и экспериментально зараженных цыплят-бройлеров и лабораторных животных (мыши, крысы).

Материалом для исследований служили пробы фекалий и смывы с прямой кишки, носоглотки от птицы из специализированных хозяйств, лабораторных животных (мыши, крысы).

Выделяли и накапливали биомассу возбудителя (ооцисты Cryptosporidium baylei) при помощи нескольких методов обогащения, использовали флотационные растворы. В качестве флотационных растворов применяли насыщенные растворы различных веществ (соли (NaCI), сахарозу, растворы сульфата цинка, среду Бреза, сульфата магния, тисульфата натрия), а вспомогательным средством в достижении поставленной перед нами цели (накопление ооцист криптоспоридий) служило центрифугирование.

Для длительного хранения выделенную культуру ооцист хранили в растворе бихромата калия 2,5% концентрации при температуре 7°С.

Определение наличия ооцист в мазках проводили под имерсионной системой микроскопа при увеличении 10X90,

Интенсивность инвазии у птицы определяли методом подсчета (В.Ф. Никитин) в 20 полях зрения микроскопа при увеличении в 600 раз: слабая инвазия или + -от 1 до 3 ооцнет во всех полях зрения; средняя или ++ до 4 ооцист; сильная или +++ - от 5 и более ооцист.

Моделью для воспроизведения кри птоспоридиозной инвазии н поддержания штамма Cryptosporidium baylei, Cryptosporidium parvum в лабораторных условиях служили новорожденные белые мыши и крысы.

Для экспериментальных исследований использовали 4 труппы новорожденных лабораторных животных в возрасте 2 дней по 10 животных в каждой. Заражение нами проводилось с целью получения биомассы Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium baylei. Животным инокулировапи суспензию возбудетеля per os. Суспензия ооцист двух видов Cryptosporidium была получена методом флотации с центрифугированием из фекалий больных криптоспоридиозом птиц и телят. Инокулят, вводимый мышам и крысам, содержал 10 тыс. ооцист. Ооцнсты вводили при помощи автоматического микродозатора, используя индивидуальные наконечники для каждого животного.

За экспериментальными животными вели ежедневное наблюдение, а исследование фекалий начинали с 2-х суток и продолжали по 20-ые сутки после заражения. Материал, получаемый от экспериментально зараженных животных, исследовали методом световой микроскопии и ПЦР. Для подтверждения диагноза использовали патологоанатомическое вскрытие с последующим приготовлением гистологических препаратов.

Лабораторных животных заражали с целью получения экспериментального материала, для чего использовали материал, полученный от больных криптоспоридиозом птиц и телят путем смыва с носоглотки и прямой кишки.

Образцы клинического материала, используемые нами для выделения ДНК Cryptosporidium bay ¡lei, С. parvum хранили в морозильной камере при минус 20°С до начала исследований. Не допускали повторного замораживания/оттаивания. Клинический материал помешали в пробирку, содержащую 0,5 мл транспортной среды (10 mM Tris HCL, 1 тМ EDTA рН 8,0,2% DDT) при помощи одноразового стерильного шпателя.

При первичной подготовке клинического материала с целью увеличения концентрации ооцист в исследуемом материале использовали несколько модификаций обогащения проб (флотацию, седиментацию, центрифугирование), В качестве флотационной жидкости использовали среду Бреза, которая представляет собой смесь гипертонических растворов тиосульфата натрия, сульфата магния, дистиллированной воды в соотношении, равном 3:3:1,60% раствор сахарозы.

Выделение ДНК осуществляли несколькими методами: сорбентным, лизирующим с протеиназой К.

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили, как правило, в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов. Потерю или появление рестрикционного сайта определяли соответственно по наличию или отсутствию рестрицированного ПЦР-продукта.

Амплифицированную ДНК осаждали с применением колонок для гель-фильтрации NAP 10.

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле.

Результаты реакции учитывали с использованием трансэллюминатора. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде красно-фиолетовых полос при облучении УФ излучением с длиной волны 310 нм.

Положительный контроль для Cryptosporidium baylei: выявлялась полоса размером 612 н.л.

Отрицательный контроль: полоса на уровне положительного контроля должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора для реакции.

Если в анализируемых пробах отмечалось отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля, это свидетельствовало об отсутствии данного возбудителя в пробе. Наличие полосы на уровне положительного контроля сообщало о наличии данного возбудителя в клинической пробе.

2.2. Результаты исследований.

Изучая распространенность паразитоценозов птиц в специализированных птицефабриках двух регионов {Московской и Саратовской областей), мы провели широкое обследование на наличие в них возбудителя криптос порндиоза.

Применение диагностически точных и ускоренных методов детекции кокцндий рода Ciyptosporidium во многом определяет эффективность противоэпизоотических мероприятий и сокращает экономические потери. Однако сложность индикации крнптоспоридий в объектах, обильно контаминированных посторонней микрофлорой, может существенно затруднять выделение и идентификацию этого паразита. Поэтому остается актуальной разработка и внедрение новых эффективных методов обнаружения и идентификации крнптоспоридий. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция. Анализ проб с использованием ПЦР проводится в течение 2-2,5 часов и позволяет обнаружить от 10 ооцист в 1 мл исследуемого клинического материала.

Успех разработки ПЦР-тсста во многом зависит от правильного подбора праймеров на основе сравнения нуклеотидных последовательностей геномов Cryptosporidium.

При сравнении нуклеотидных последовательностей использовали программу «OLIGO».

П рай меры подбирали таким образом, чтобы они имели равные или близкие температуры отжига с соответствующими матрицами. В процессе работы соблюдали данные условия как для пар наружных, так и внутренних праймеров.

Также нами были подобраны прайм еры и отработана новая диагностическая тест-система, основанная на амплификации участка гена 18S rRNA, HSP70.

На следующем этапе работы мы подбирали оптимальный метод выделения ДНК из клинических образцов. За основу был взят выше описанный метод, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН,

Этот метод отличается простотой, дает высокий выход ДНК и удобен для массовых исследований.

I 2 3 4 5 б

!

Рис. 1: Определение чувствительности метода ПЦР. А м пли коны, полученные при nested ПЦР: 1 трек - рестрицированная проба, полученная путем рестрикции с ферментом Taq-полимераза; 2 трек - рестрицированиая ДНК, прошедшая очистку через колонку NAP 10; 3,4,5,6 - клинические пробы.

Реакцию проводили в присутствии наружных и внутренних праймеров. Результаты оценивали по наличию в геле и, соответственно, на фотографии специфических фрагментов ДНК, рассчитанный размер которых соответствует размеру синтезируемого ам ил и ко на Cryptosporidium baylei.

По данным тестирования faeces, смывов обследуемой птицы на содержание возбудителя, наблюдалось заметное совпадение данных как по положительным, так и по отрицательным результатам.

Таблица 1

Сравнительные результаты определения Cryptosporidium bailey н С. parvum в faeces больной птнцы ii экспериментально зараженных животных (белые мыши).

Вид животного и возраст (дни) Количество обследованных животных (голов) Совпадение результатов при обследовании разными методами

Микроскопия мазка окрашенного по Цнль-Нильсену пол имеразн о-цеп ная реакция

+ - + -

Мыши 7-10 дн. 18 15 3 17 1

Цыплята-бройлеры 3140 дн.(ЗАО «Барановское») 235 190 45 206 29

Цыплята-бройлеры 3140 дн.(ЗАО «Мирная») 220 173 47 202 18

Подтверждение эффективности разработанной нами тест-системы проводили на экспериментально зараженных белых мышах и больных цыплятах. От цыплят 31 -40-дневного возраста брали клинический метериал (фекалии). Мышей 1-2-дневного возраста заражали суспензией ооцист Cryprosporidium parvum, предоставленной лабораторией протозойных инфекций Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. На 7-10 день после заражения от мышей брали образцы фекалий. Параллельно с ПЦР полученные образцы исследовали методом микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль-Нильсена,

При микроскопическом исследовании положительные результаты были зарегистрированы у лабораторных животных в 80% случаев; у цыплят бройлеров при аналогичном исследовании - в 79%. В тест-системе ПЦР у мышей положительный результат - в 94 у цыплят - в 89% случаев.

Специфичность амплификации фрагмента нуклеопгидной последовательности в присутствии подобранных праймеров определяли с помощью рестрикционного анализа соответствующих ампликонов. Амплификацию проводили на ДНК, Cryptosporidium baylei и parvum, выделенных из клинических образцов и полученных от лабораторных экспериментально зараженных животных.

Рестрикты фрагмента области генома Cr. baylei были позднее применены для конструирования образца внутреннего контроля (ОВК), Результаты рестрикционного анализа продуктов амплификации представлены на рисунке;

Рис. 2.1 трек - рестрициро ванная ДНК Cryptosporidium bay lei, выделенная из клинической пробы; 2 трек - рестрицированная ДНК Cryptosporidium bay lei, выделенная из клинической пробы и очищенная переосаждением спиртом.

Условия и режимы проведения реакции были отработаны в предварительных экспериментах. Для оценки чувствительности и

специфичности ПЦР использовали полевые штаммы: Cryptosporidium baylei и parvum, эмернй; эталонные штаммы: Toxoplasma gondii.

Одним из наиболее важных параметров, определяющих специфичность и чувствительность реакции, является отжиг праймеров, Температура проведения отжига праймеров зависит от его длины и содержания в нем пар нуклеотидных оснований.

Температуру плавления и отжига для каждого праймера в отдельности рассчитывали по формуле:

То™ = 2 х (Т+А) + 3 х (C+G) - 5 [°С], где

А, Т, С, G - число соответствующих нуклеотидов в составе праймера. Рассчитанная по приведенной выше формуле температура была для нас лишь ориентиром при выборе температурного показателя. Эту величину наиболее точно мы определили в серии экспериментов.

Отклонение от оптимальной температуры отжига в сторону понижения приводило к образованию неспецифических продуктов реакции при исследовании полевых штаммов, выделенных от больной птицы, а при повышении более чем на 2°С - чувствительность реакции снижалась.

Параметры реакции зависели от типа термоциклера, объема реакционной смеси, количества циклов. Увеличение числа циклов более 45 приводило к образованию неспецифических амшшконов, а при снижении числа циклов отмечалось зачетное уменьшение выхода специфического реакционного продукта,

В ходе серии опытов установлено, что чувствительность данной реакции, с выбранными праймерами и определенными нами условиями проведения ПЦР, составляет от 10 до 10 тыс. м.к./мл. В процессе экспериментов по проверке специфичности реакции с данной парой праймеров тестировали 5 штаммов криптоспоридий, специфичных для птицы, и 2 штамма возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих, 1 штамм возбудителя эймериоза (Е. tenella).

Со всеми представителями вида Cryptosporidium были получены положительные результаты, но с другими видами кокцидий положительного ответа не было ни в одном случае.

Нами были обследованы 5 птицефабрик в Московской и Саратовской областях. Обследование проводилось в птичниках 2 раза в год: в зимне-весенний и осенне-зимний периоды. Данные периоды года выбраны не случайно, т.к. именно в эти сезоны года, по нашим наблюдениям, преобладает иммунодефицитное состояние птицы, повышенная влажность

14

воздуха, что способствует сохранению инвазионных свойств ооцист возбудителя во внешней среде.

Всего было подвергнуто исследованию 2021 проба.

В период проведения работы нами был выявлен криптоспоридиоз в 4-х из 5 обследованных хозяйств.

Возраст обследованной птицы составлял 10-60 дней. Материал получали с птицефабрик как с напольным так и с клеточным типом содержания. Выделение ооцист отмечалось у птицы в возрастной категории от 30 до 45 дней. Экстенсивность инвазии достигала наиболее высоких показателей на 39-41 день. ЭИ в возрасте 10 дней и 30-40 дней.

Интенсивность выделения ооцист с фекалиями в инфицированных хозяйствах изменялась в зависимости от сезона года и возраста, но преобладала средняя или сильная. Преобладание средней и сильной степени инвазии зависело от того, что забор фекалий проводили от птицы, находящейся на разных стадиях заболевания.

В осенне-зимний период экстенсивность инвазии на разных птицефабриках находилась в пределах от 89 до 92%, ко в целом по Московской области она составляла 90%.

Зимне-весенний период:

Очень высокая степень зараженности кур в зим не-весенний период связана с ослабленным иммунитетом у птицы в это время года.

2.2.1. Спонтанная крнптоспорндиозная инвазия у кур.

Основным клиническим признаком криптоспоридиоза цыплят является диарея.

Заболевшая птица находится в угнетенном состоянии. Температура тела в период заболевания часто бывает снижена. При исследовании фекалий от больной птицы единичные ооцисты обнаруживаются в фекалиях на 7-12 дни после заражения. В нативных мазках, приготовленных из фекалий больных цыплят, регистрировали от 7 до 20 и более ооцист в поле зрения микроскопа.

Для изучения криптоспоридиоза в лабораторных условиях использовали новорожденных белых мышей и крысят в возрасте 1-20 дней. Лабораторные животные такого возраста наиболее восприимчивы к заражению. Лабораторных животных заражали полевыми штаммами, полученными от больной ппшы и телят из хозяйств Московской и Саратовской областей.

Взвесь ооцист кригггоспориднй получали вышеописанным флотационным методом. Доза заражения - 10 -15 тыс. ооцист в 1 мл. Животных обследовали, начиная со 2 дня после заражения. В течение периода наблюдений у мышей и крыс, зараженных Cryptosporidium baylei, выделение ооцист и клинических признаков не наблюдалось, из чего можно сделать вывод, что данный вид ооцист принадлежит птице. А в опытах с исследованием материала, полученного от больных телят, в фекалиях обнаруживались ооцисты криптоспоридий и характерные изменения в тканях тонкого отдела кишечника.

Таблица 2

Сравнительные результаты определения количества ооцист в носоглоточной слизи и фекалиях птицы, больной криптоспорпднозом -методом ПЦР

Количество обследован н ых Результаты обнаружения ооцист криптоспоридий в фекалиях и носоглоточной слизи.

Положительные Отрицательные

фекалии носоглоточная слизь фекалии носоглоточная слизь

856 759 672 97 184

1203 1195 907 8 296

Из таблицы видно, что ооцисты криптоспоридий обнаруживаются в фекалиях в 95% случаев, а в носоглоточной слизи — в 76%.

Проведенные исследования показали высокую информативность ПНР при исследовании носоглоточной слизи и фекалий как биосубстрата для обнаружения ооцист.

Результаты выявления возбудителя в носоглоточной слизи позволяют рассматривать ее как удобный биосубстрат при обследовании больной птицы на инфицирован ность криптоепорн диозом.

Данные, полученные в наших исследованиях, н мнения других авторов указывают на эпизоотологиичес кую значимость хронически больных животных как возможный источник заражения контактирующих с ними других животных и обслуживающий персонал.

2.2.2. П атоло гоа нато мическ ие изменения.

Проводя патологоанатомическое исследование трупов, экспериментально зараженных лабораторных животных, было отмечено, что у мышат и крысят, зараженных суспензией ооцист СгурювролФит Ьау1е1, гистоморфологические изменения отсутствовали, тем самым подтверждая принадлежность возбудителя к данному виду и его видоспецифичность. Патологоанатомические изменения присутствовали в желудочно-кишечном тракте мышеи и крыс, зараженных возбудителем кришоспоридиоза телят -СгургозрапШиш рапшт. Наблюдали гиперемию слизистой оболочки и катаральное воспаление тонкого отдела кишечника, набухание и увеличение ворсинок.

При внешнем осмотре трупы цыплят истошены, перьевой покров вокруг клоаки загрязнен испражениями с примесью крови и слизи, конъюнктива глаз и слизистая оболочка ротовой полости анемичны.

Макроскопические изменения сопровождались присутствием большого количества серозного экссудата в конъюнюшвальных мешках, носовых ходах, просвете трахеи. Наблюдалась гиперемия и набухание синусов, серокрасная пятнистость легких и печени.

При патологоан атомическом вскрытии трупов павших цыплят, у которых болезнь проявлялась ярко выраженной клинической картиной, основные

изменения обнаруживались в желудочно-кишечном тракте; слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки набухшая, покрыта слоем слизи. Стенки двенадцатиперстной кишки утолщены, ворсинки сглажены, отмечаются точечные кровоизлияния.

При криптоспоридиозной инвазии бронхолегочной системы отмечали очаги пневмонии, скопление казеозного экссудата, В последующих исследованиях биоптата методом ПЦР удалось идентифицировать ДНК Cryptosporidium bay lei.

При микроскопии гистопрепаратов было отмечено, что эндогенные стадии возбудителя локализовались главным образом в подвздошной и 12-перстноЙ кишке.

Рис.3 Эндогенные стадии Cryptosporidium bay lei в ткани подвздошной кишки больной птицы.

выводы.

1. Отработаны и модифицированы методы получения биомассы возбудителя.

2. Отработан метод выделения специфической ДНК из биологического материала (faeces, носоглоточной слизи).

3. Подобраны и сконструированы праймеры (CPB-DIAGF, СРВ-DIAGR, Сут 558U21, N-DiagRml) на основе консервативной нуклеотидной последовательности гена для разработки ПЦР по выявлению н идентификации криптоспоридий,

4. Разработаны оптимальные параметры экспериментальной полимеразной цепной реакции с данными праймерами, которые позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью (95%) детектировать Cryptosporidium baylei рода Cryptosporidium.

5. В сравнительных исследованиях установлено, что тест-система на основе ПЦР является более эфективной для диагностики спонтанного криптоспоридиоза у кур в сравнении с флотационными методами н микроскопией.

6. Показано, что экспериментальная тест-система на основе ПЦР позволяет выявлять возбудителя криптоспоридиоза кур в смывах с носоглотки и фекалиях больной птицы.

7. Получены новые статистические данные по эпизоотологии криптоспоридиоза птиц в 2-х областях.

Практические предложения.

Методические рекомендации по ПЦР-диагностике крилтоспоридиоза кур. Авторы: A.B. Уездина, ВЗ. Демкин, В.Т. Заблоцкий,

Методические рекомендации рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ 2006 года н на секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 25 мая 2007 г. протокол №2.

7. Список опубликованных работ по теме диссертации: Уездина A.B. Эпизоотология и лабораторная диагностика крилтоспоридиоза кур / Уездина A.B., Демкин В.В. // Объединенный научный журнал. - 2006. - №27. - С. 72-74.

Уездина A.B. Применение молекулярно-биологическнх методов в диагностике крилтоспоридиоза кур / Уездина A.B. // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. — 2007. - Вып. 2. -С. 70-71.

Уездина A.B. ПЦР-диагностика крилтоспоридиоза кур / Уездина A.B., Заблоцкий В.Т. // VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007»: Сб. материалов: В 3 т. - Москва, 2007. - Т.2. - С. 63 - 65.

Подписано в печать 04.03.2008 г. Печать трафаретная

Заказ № 140 Тираж: 100 экз.

Типография «И -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56, (499) 783-78-56

www.autoreferat.ru