Психроактивные анаэробные консорциумы и новые метаногены из антропогенных мест обитания

Ермакова, Анна Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Психроактивные анаэробные консорциумы и новые метаногены из антропогенных мест обитания
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Психроактивные анаэробные консорциумы и новые метаногены из антропогенных мест обитания"

На правах рукописи

ЕРМАКОВА АННА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ПСИХРОАКТИВНЫЕ АНАЭРОБНЫЕ КОНСОРЦИУМЫ И НОВЫЕ МЕТАНОГЕНЫ ИЗ АНТРОПОГЕННЫХ МЕСТ ОБИТАНИЯ

Специальность 03.02.03 - микробиология

5 Ш 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005541878

Москва-2013

005541878

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: Паршина София Николаевна

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Слободкин Александр Игоревич

доктор биологических наук, ИНМИ РАН, ведущий научный сотрудник, лаборатория гипертермофильных микробных сообществ

Щербакова Виктория Артуровна

кандидат биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт

биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН),

зав. лабораторией анаэробных микроорганизмов

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «23» декабря 2013 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН. Автореферат диссертации разослан «¿^ » ноября 2013 г.

Ученый секретарь * Хижияк Т.В.

диссертационного совета,

доктор биологических наук (Ж • ^ /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Согласно современным представлениям, анаэробное превращение практически любого сложного органического вещества в биогаз проходит несколько последовательных стадий: гидролиз, ферментация, ацетогенез и метаногенез. Весь этот сложный комплекс превращений осуществляет микробное сообщество, включающее, по некоторым оценкам, - до нескольких сотен видов (вщ'ег & ге1тс1ег, 1983; Заварзин, 1986). Летучие жирные кислоты (ЛЖК) являются важными интермедиатами анаэробной деградации органических веществ. В пресноводных экосистемах (природных и антропогенных) деградация ЛЖК невозможна без участия синтрофных бактерий, так как изменение свободной энергии Гиббса при окислении ЛЖК является положительной величиной ^агш, 1994). Такие реакции термодинамически невозможны. Для осуществления реакции окисления ЛЖК необходимо снижение концентрации водорода, образующегося в процессе окисления ЛЖК до 1-10 Па (1СГ4 атм). Низкую остаточную концентрацию водорода в пресноводных экосистемах обеспечивают водородиспользующие метаногены (Мс1пегпеу е1 а1., 2008). Научный интерес к метаногенным сообществам, функционирующим при пониженных температурах, обусловлен большой экологической значимостью низкотемпературных микробных экосистем в биосфере Земли.

Традиционно в России сточные воды очищают в аэротенках и реже - в анаэробных биореакторах. Эти методы имеют достоинства и недостатки. При анаэробной обработке сточных вод образуется на порядок меньше биомассы, однако, анаэробная очистка в реакторах с восходящим потоком среды проводится в основном в мезофильных (30-35°С) и термофильных (50-55°С) условиях и поэтому связана с большими энергозатратами на поддержание определенной температуры в реакторах, что делает этот процесс дорогим. Для снижения энергозатрат перспективной является разработка эффективной технологии анаэробной предобработки концентрированных стоков при температуре окружающей среды без обогрева реактора или с подогревом до 20—25°С. Эффективная очистка в таких условиях может быть достигнута при развитии сбалансированного психроактивного микробного сообщества. В анаэробных биореакторах с подачей очищаемой воды снизу (иАЗВ, ЕОЗВ), благодаря гидродинамическим условиям, микроорганизмы образуют агрегаты (гранулы), в которых происходит межвидовой перенос водорода между синтрофными бактериями, окисляющими ЛЖК, и водородиспользующими метаногенами. В метаногенном сообществе между группами микроорганизмов существуют тесные и сложные

взаимосвязи, в том числе, и обратные. Ввиду субстратной специфичности метаногенов, их рост невозможен без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь, метаногены, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Выявление особенностей регуляции низкотемпературного метаногенного сообщества, выделение и изучение физиологии микроорганизмов, входящих в его состав, необходимо для прогнозирования поведения микробных сообществ в холодных природных экосистемах, особенно находящихся под сильным антропогенным воздействием.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование психроактивных синтрофных метаногенных сообществ, окисляющих летучие жирные кислоты (пропионат и бутират), выделение и описание метаногенов из низкотемпературных антропогенных мест обитания. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) исследование метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества анаэробного биореактора к временному повышению или понижению температуры при периодическом культивировании;

2) получение пропионат- и бутират-окисляющих психроактивных микробны консорциумов, изучение их температурных характеристик и микробного состава;

3) выделение и описание психроактивного метаногена из упомянутых синтрофны консорциумов;

4) выделение и описание психроактивных метаногенов из придонных проб заглубленного навозохранилища свинофермы, с температурой in situ ниже 10°С.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые исследованы адаптационные возможности биомассы низкотемпературного анаэробного биореактора к временным изменениям температуры. Выявлено, что инкубирование психроактивной биомассы в течение 45-60 суток при температуре 30°С улучшает ее активность при переносе на 10°С.

Впервые из биомассы низкотемпературного анаэробного биореактора получены устойчивые синтрофные пропионат- и бутират-окисляющие психроактивные метаногенные консорциумы, растущие при пониженной температуре, и исследован их микробный состав.

Показана различная таксономическая принадлежность бактерий, составляющих низкотемпературный и мезофильный консорциумы. Обнаружено, что большинство бактерий низкотемпературных консорциумов принадлежат к новым таксонам.

Впервые из антропогенных местообитаний - анаэробного реактора и заглубленного навозохранилища, выделены новые психроактивные метаногены. Выделен и описан первый психроактивный гидрогенотрофный метаноген рода Methanospirillum - Methanospirillum stamsii PtlT из пропионат-окисляющего консорциума. Выделен и описан новый психроактивный вид рода Methanosarcina -«Methanosarcina porcellina Рг2т» и его референтный штамм «Methanosarcina porcellina Prl» из накопительной культуры, полученной из свиного навоза. Выделена и частично охарактеризована бактерия-спутник нового вида метаносарцины, представляющая собой новый вид рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.

Данные, полученные при исследовании исходной биомассы из анаэробного биореактора, полученных пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов, выделенных и описанных новых видов метаногенов расширяют знания о составе, структурных и метаболических взаимоотношениях в низкотемпературных анаэробных антропогенных микробных сообществах. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых экономичных технологий очистки муниципальных и промышленных концентрированных стоков, получения биотоплива, выделения ферментов, активных при температуре окружающей среды (10-20°С).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях -«2-nd FEMS Congress of European Microbiologists» в Мадриде (Испания, 2006), на 12-м международном Симпозиуме по микробной экологии ISME-12 в Кернсе (Австралия, 2008), на IV Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008) и на IX Молодежной школе-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2013).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 экспериментальные статьи и 4 тезисов.

Место проведения работы

Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук. Молекулярно-биологические исследования проводили в центре коллективного пользования ИНМИ РАН, в Центре «Биоинженерия» РАН и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. С.Н. Паршиной за научное руководство и помощь в работе, благодарит сотрудников ИНМИ РАНд.б.н., зав. лабораторией А.Н. Ножевникову, к.б.н. А.Ю. Каллистову, к.б.н. E.H. Деткову, к.б.н. А.К. Кизилову, H.A. Кострикину, сотрудников кабинета газохроматографического анализа, сотрудников центра коллективного пользования, сотрудников Центра «Биоинженерия» РАН за практическую помощь и ценные советы.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, состоящий из 220 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили (1) адаптированная к низкой температуре гранулированная метаногенная микробная биомасса, полученная из лабораторного двустадийного EGSB реактора (Университет Вагенингена, Нидерланды), обрабатывавшего модельную сточную воду с летучими жирными кислотами - ацетатом, пропионатом и бутиратом в качестве источника углерода и энергии при температуре 4-12°С (Rebac et al., 1995; Lettinga et al., 1999); (2) накопительные культуры двух морфотипов метаносарцин, выделенных из жидких стоков свинофермы, расположенной в северной части Крымской области (поселок Нижнегорск, Украина). Пробы для выделения отбирали со дна навозохранилища, где температура была ниже 10°С.

Синтрофные консорциумы. накопительные и чистые культуры микроорганизмов культивировали с использованием минеральных сред, описанных в публикациях (1, 2), с добавлением дрожжевого экстракта (0.2-0.5 г/л) и (при работе с чистыми культурами метаногенов) казаминовых кислот (5-10 г/л). Для работы с синтрофными консорциумами в качестве субстратов использовали раздельно пропионат и бутират (10-20 ммоль/л). Для определения спектра субстратов, используемых чистыми культурами метаногенов, применяли триметиламин, диметиламин, монометиламин, метанол, формиат, ацетат, лактат, бутанол, этанол, ацетон, бетаин, кротонат, пируват в концентрации 10-20 ммоль/л и смесь водорода и углекислого газа (80:20). Культивирование проводили при температуре 1, 5, 10, 18, 21, 25, 30, 35, 40, 50°С, в присутствии 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 М NaCl и в интервале pH от 4.0 до 10.0.

Выделение накопительных и чистых культур метаногенов проводили методом серийных разведений, получением колоний по методу roll-tubes (в пробирках Хангейта или в пенициллиновых флаконах с тонким слоем 2% агаризованной среды), посевом на разные субстраты, культивированием при разных температурах. При выделении использовали антибиотики: ванкомицин (100-200 мг/л), пенициллин (2 мг/л), стрептомицин (200 мг/л), канамицин (100 мг/л), хлорамфеникол (100 мг/л), ампициллин (1 г/л), циклосерин (100 мг/л), эритромицин (100 мг/л), рифампицин (100 мг/л). О чистоте культуры судили по результатам микроскопирования, отсутствию роста на глюкозо-пептонной среде, а также с помощью молекулярно-биологических методов (ПЦР - амплификация с бактериальными и архейными праймерами и секвенирование). Для ДНК-ДНК гибридизации использовали типовые штаммы MethanospiriUum hungatei JF1T и Meihanosarcina lacustris ZST.

Микроскопические методы исследования

Микроскопирование проводили с помощью микроскопов МБИ-3 и AxioImager Dl (CarlZeiss, Германия). Электронные фотографии получали на микроскопе JEOL 100С XII (Япония).

Газожндкостнаи хроматография

Летучие жирные кислоты определяли методом газоадсорбционной хроматографии на хроматографе Chrom 5 (Прага, Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента использовали Хромосорб-101. Температура детектора и испарителя -170 и 230°С соответственно. Расходы водорода и воздуха составляли 30 и 300 мл/мин соответственно. Расход газа-носителя (аргона) - 40 мл/мин. Пробу культуральной

жидкости предварительно центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин). Супернатант подкисляли 10%-й Н3РО4 до pH 2.

Анализ газов проводили на хроматографе ГХ 3700 (сорбент Porapak Q) и Кристалл 5000.1 (сорбент Хромосорб 102) с пламенно-ионизационным детектором (Россия). Температура колонок - комнатная; газ-носитель - аргон, расход газа - 40 мл/мин. Ток накала нити 80 мА. Использовали стеклянные колонки длиной 1.2 м и внутренним диаметром — 3 мм.

Молекулярно-биологические методы

Выделение ДНК чистых культур, ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК и тсгА, гель-электрофорез, очистку продуктов ПЦР, секвенирование, определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК, ДНК-ДНК гибридизацию проводили, как описано в публикации (2). При выделении ДНК метаносарцин биомассу дополнительно растирали в ступке с жидким азотом 2-4 раза.

Выделение тотальной ДНК синтрофного консорциума проводили методом, основанным на использовании гексадецилтриметиламмоний бромида (Wilson et al., 1989). Амплификацию генов 16S рРНК чистых культур проводили с использованием универсальных бактериальных 8-27F/1492R и универсальных архейных 8fa/1492R праймеров. ДНК-фрагменты, полученные при амплификации образцов ДНК с бактериальными праймерами GC984F/1492R и архейными праймерами GCArch3F/519R, разделяли методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) в 6% акриламидном геле, с содержанием линейного градиента (от 30 до 60%) ДНК-денатурантов (смесь мочевины и формамида) по стандартной методике (Muyzer et al., 1993). Последующую амплификацию проводили с бактериальными праймерами 984F/1492R и архейными праймерами Arch3F/519R. Ген тсгА амплифицировали с использованием праймеров MLF/MLR, mlas/mcrA-rev. Продукты амплификации секвенировали по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA). Обработку полученных хроматограмм проводили с помощью программы Chromas, версия 1.45. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Построение филогенетических деревьев проводили с помощью программы Geneious Pro (v 6.1, Biomatters, New Zealand).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследование метаболической устойчивости биомассы к изменениям температуры культивирования

Ранее было показано, что продуктивность разложения ЛЖК гранулированной биомассой низкотемпературного анаэробного биореактора (4-12°С), использованной для наших исследований, была сравнима с продуктивностью мезофильного реактора (Lettinga et al., 1999). В природных условиях или при эксплуатации биогазовых установок, в том числе низкотемпературных, температура культивирования может меняться. Поэтому было важно исследовать степень метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества к временному повышению (30°С) или вторичному понижению (до 10°С) температуры при периодическом культивировании (Паршина с соавт., 2011).

Биомассу из ферментера в течение нескольких лет хранили в стеклянном флаконе объемом 140 мл при 10°С. Для данного эксперимента биомассу гомогенизировали в стеклянной ступке под током азота для более равномерного внесения во флаконы с питательной средой с пропионатом (10 ммоль/л) и отдельно с бутиратом (10 ммоль/л). Инкубацию проводили при 10°С и 30°С. При температуре 30°С флаконы находились разные промежутки времени: 48 суток, 84 суток и 150 суток с дальнейшим возвращением на температуру 10°С. В результате проведенного исследования было показано, что инкубирование биомассы в течение относительно короткого времени (48 суток) при температуре 30°С не ухудшало её активность при 10°С. Однако долговременное культивирование биомассы при 30°С приводило к её адаптации к мезофильным условиям и высокой продуктивности разложения органического вещества при этой температуре. Полученные результаты свидетельствует о присутствии в сообществе как мезофильных, так и психроактивных микроорганизмов. При культивировании более двух-трех месяцев при 30°С мезофильные микроорганизмы, вероятно, замещают психроактивные.

2. Получение синтрофных метаногенных консорциумов на пропнонате и бутирате

Биомассу из анаэробного биореактора в течение нескольких лет поддерживали методом последовательных пересевов при 10°С на средах с пропионатом и бутиратом раздельно, чётко соблюдая линию каждого субстрата. В результате на каждом из субстратов были получены метаногенные консорциумы. Микроскопирование

50 100 150 200 250 300 Время (сутки)

Рис. 2. Динамика окисления пропионата и образования метана консорциумом при разных температурах. При 10, 20, 30 и 40°С (а) и 10°С (б).

Бутират-окисляющий консорциум функционировал в диапазоне температур от 10 до 30°С с оптимумом при 20—30°С. При 40°С окисление бутирата не происходило (рис. 3 а). Инкубирование при 10°С сопровождалось временным накоплением ацетата (рис. 3 б).

2 2,

я а 3

Я в

50 100 150 200 250 300 Время (сутки)

Рис. 3. Динамика окисления бутирата и образования метана консорциумом при разных температурах. При 10, 20, 30 и 40°С (а). При температуре 10°С (б).

Исследование микробного разнообразия метаногенных синтрофных консорциумов методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза

4.1. Исследование бактериальной составляющей пропионат-окисляющих консорциумов

и бутират-

Анализ ПЦР-продуктов пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов, после амплификации с универсальными бактериальными праймерами для ДГГЭ, показал наличие 5-7 полос в каждом консорциуме. Обращало на себя внимание различное расположение полос в образцах из пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов, выращенных при 10 и 30°С (рис. 4 а, б; табл. 1, 2). Это свидетельствовало о различной

Таблица 1. Филогенетическое разнообразие представителей домена Bacteria пропионат-окисляющего синтрофного консорциума

Консорциум, температура инкубации Таксоны в генбанке % сходства генов 16S pPHK Источник выделения

Номер сиквенса в генбанке Ближайшие таксоны

Пропионат 10°С АВ447697 Тип Proteobacteria, семейство Syntrophaceae, Smithella propionica 97 Анаэробный биореактор

СР002541 Тип Spirochaetes, семейство Spirochaetaceae, Sphaerochaeta globosa str. Buddy, полный геном 90 Пресноводный осадок

EF034778 Домен Bacteria, клон 92 Лед Антарктического озера

НЕ654006 Тип Firmicutes; семейство Syntrophomonadaceae; Syntrophomonas bryantii 96 Анаэробный биореактор

HQ020488 Тип Bacteroidetes; семейство Porphyromonadaceae; Macellibacteroides fermentans 98 Психрофильный анаэробный биореактор

Пропионат 30°С EU517557 Тип Firmicutes', семейство Clostridiaceae, клон 96 Метаногенное сообщество нефтяного пласта

HQ 183984 Тип Synergistetes; семейство Synergistaceae; Aminobacterium sp., клон 94 Свалочный ил

GQ385405 Домен Bacteria, клон 98 Завод по опреснению воды

NR_042987 Тип Bacteroidetes; семейство Porphyromonadaceae', Petrimonas sulfuriphila штамм BN3 99 Низкотемпературное нефтяное хранилище

НЕ654006 Тип Firmicutes', семейство Syntrophomonadaceae', Syntrophomonas bryantii 96 Анаэробный биореакгор

HQ020488 Тип Bacteroidetes; семейство Porphyromonadaceae', Macellibacteroides fermentans 98 Психрофильный анаэробный биореактор

Таблица 2. Филогенетическое разнообразие представителей домена Bacteria бутират-окисляющего синтрофного консорциума

Консорциум, температура инкубации Таксоны в генбанке % сходства генов 16S pPHK Источник выделения

Номер еиквенса в генбанке Ближайшие таксоны

Бутират 10°С НЕ654006 Тип Firmicutes; семейство Syntrophomonadaceae; Syntrophomonas bryantii 96 Анаэробный биореакгор

HQ020488 Тип Bacteroidetes; семейство Porphyromonadaceae; Macellibacteroides fermentons 98 Психрофильный анаэробный биореактор

EF034778 Домен Bacteria, клон 99 Почва полярной Арктики

FJ645707 Тип Firmicutes; Proteocatella sphenisci штамм РРР2т(психротолерантная) 97 Помет пингвина

Бутират 30°С НЕ659254 Домен Bacteria, клон 95 Ливневые сточные воды

АВ447697 Домен Bacteria, клон 96 Низкотемпературный анаэробный биореактор

НЕ654006 Тип Firmicutes; семейство Syntrophomonadaceae', Syntrophomonas bryantii 96 Анаэробный биореактор

JF262039 Тип Firmicutes; семейство Clostridiaceae\ Youngiibacter fragile штамм 232 81 Анаэробный биореактор

FR749900 Тип Firmicutes; Семейство Ruminococcaceae; Acetivibrio multivorans 81 Анаэробный биореактор

HQ020488 Тип Bacteroidetes; семейство Porphyromonadaceae', Macellibacteroides fermentons 98 Психрофильный анаэробный биореактор

МеЛапозртПит. Штамм РПТ психроактивный - он имеет более низкий температурный предел и оптимум роста (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительные характеристики штамма PtlT, М. lacunae Ki8-1T и М. hungatei JF1T

Характеристика Ptl1 М. lacunae Ю8-11 М. 1шп^а/е1 ЛП1

Форма клеток искривленные палочки искривленные палочки искривленные палочки

Ширина клеток (мкм) 0.4-0.5 0.5-0.6 0.4-0.5

Длина клеток (мкм) 7-25 11-25 7.4-10

Диапазон температур (°С) 5-37 15-37 25-50

Оптимум температуры (°С) 20-30 30 30-37

Диапазон рН 6.0-10.0 6.0-9.5 6.5-10.0

Оптимум рН 7.0-7.5 7.5 6.6-7.4

Диапазон (М) 0-0.3 0-0.2 0-0.2

Оптимум N801 (М) 0 0 0

Субстраты:

Н2/С02 + + +

Формиат ± + +

Содержание Г+Ц (мол%) 40 (Тш) 45.3 (HPLC) 45 (Тт)

Источник выделения биомасса реактора почва муниципальные сточные воды

6. Выделение и описание «МеМапоэагЫпа рогсеШпа» ер. поу. штамм Рг1, Рг2т и их бактерии-спутника 5р1гаегосИае1а ер. Р8

Одной из задач нашего исследования было выделение психроактивных метаногенов из низкотемпературных мест обитания. Ранее Т.Н. Жилина и Г.А. Заварзин (1991) выделили из подмосковного болота штамм МеАгапоьагста Бр. 2-7289, способный расти при температуре 6°С. Метаносарцина росла на ацетате, но не использовала Н2/СО2. Позже Паршиной и соавторами (1993) были получены накопительные культуры двух морфотипов метаносарцин из жидких стоков свинофермы, хранившихся в навозохранилище при среднегодовой температуре ниже 10°С, а также накопительная культура метаносарцины из донных осадков пресноводного озера. Все метаносарцины были способны расти при 1—5°С. Психроактивная сардина, выделенная из донных осадков, названная МеЛаповагста 1аст1г1$ (Бкпапкоуа е1 а1., 2001), является единственной из десяти известных видов психроактивных метаногенов, выделенной из пресноводного источника и способной расти при температуре ниже 10°С на Н2/СО2. На данный момент ни один валидный психроактивный метаноген не был выделен из антропогенных мест обитания. Метаносарцины из свиного навоза представляют большой интерес, так как были обнаружены в низкотемпературном антропогенном месте обитания. Из накопительной культуры была выделена, но не описаны чистая

Штамм Рг1 образует метан в интервале рН от 5.5 до 7.5 с оптимумом рН 6.0-7.2 (рис. 10 а). Штамм Рг2т образует метан в диапазоне рН от 6.5 до 7.5 с оптимумом рН 6.8-7.2 (рис. 10 6).

Л 8 -

о. 5 я о " » 6 -

* 2 ь г Й & 5 "

я я м 4 -

3 "й -5 § и з -

? 5 о = г е 2 -

а | 1 -

г 0 -

10 15 20 25 Те мпература (°С)

10 15 20 25 30 Температура (°С)

Рис. 9. Максимальные скорости образования метана штаммами Рг1 (а) и Ргё1 (б) при разных температурах культивирования в средах с триметиламином.

Рис. 10. Максимальные скорости образования метана штаммами Рг1 (а) и Рг2т (б) при культивирования в средах с разным значением рН.

Штаммы Рг1и Рг21 образуют метан при солености среды менее 0.4М ЫаС1 и 0.2М ЫаС1 соответственно. Оптимальная скорость метанообразования обоих штаммов наблюдается при 0 ЫаС1 в среде. В сравнении со штаммом Рг1, штамм Рг21 обладает более узкими диапазонами рН, температуры и содержания №С1 для роста и метанообразования.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК исследуемых штаммов показал 100% сходства друг с другом и 100% сходства с геном МеЛапозагста 1аси$1г1$ ZS] (рис. 11). Анализ последовательностей гена тег А выделенных штаммов Рг 1 и Рг2т также показал 100% сходства этих генов у обоих штаммов между собой и 99.5% сходства с геном тег А типового штамма МеЛапояагста 1асив1п5 (подробнее в рукописи).

Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК штамма Рг1 составляет 45.6 мол%, а у штамма Рг2т - 43.8 мол%. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов Рг 1 и Рг2т с ближайшим родственным микроорганизмом МеЖапояагста 1асш1г1з составляет 53

и 42% сходства с, соответственно. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штамма Рг1 со штаммом Рг2т 79%.

908 987

ег* ¡9.

ШМтоявгапв («счло« /Ж МвгЬто&тШ «р. Рг2 (N653180£) Ме/Ьтотгста »р, Рг1 (НО 531808!

Швтюакта ар МО-М81 (АВ598272> , Г Ыетапомгож ер Т36 (А82М283) ■ ШШгтошгопа $0 нсг !АШ?дагб4) 94 8 Г- Мввтю&кста жФае (РЯТЗЖЗв)

I— тталонагопа Ьткая «и Ришо Ш 074253) - Ш№9Жсоссогйе$аШ$кеп5е АК-5 (АУ941|КИ)

Рис. 11. Филогенетическое положение штамма Рг1 и штамма Рг2 на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16Э рРНК методом ближайших соседей.

Штамм МеМапозагста ер. Рг1 был депонирован в международной коллекции (=УКМ В-2807). Штамм МеЛапохагста ер. Рг2' был депонирован в международных коллекциях (=ОЗМ 15218т, =УКМ В-2806т).

Таблица 4. Сравнительные характеристики штаммов Рг 1, Рг2т и М. 1асиз1пз 78т

Характеристика Штамм Рг1 Штамм Рг2' М. (асизМв 281

Морфология агрегаты кокков агрегаты кокков агрегаты кокков

Размер кокков (мкм) 1.5-3.5 0.5-1.5 1.5-3.5

Т опт. (°С) 21 25-30 25

Т мин. - Т макс. (°С) 1-30 5-35 1-35

№С1 опт. (М) 0 0 0

N801 мин. - №С1 макс. (М) 0-0.3 0-0.1 и.о.*

рН опт. 6.0-7.2 6.8-7.2 7.0

рН мин. - рН макс. 5.5-7.5 6.5-7.5 4.5-8.5

Субстраты:

Ацетат - - -

Метиламины + + +

Метанол + + +

н2/со2 + - +

% сходства гена 168 рРНК:

М. ЫсиэМэ (%) 100 100 100

Рг2т 100 100 -

% сходства по гену тсг\:

М. ¡асюМэ Х8Т (%) 99.5 99.5 100

Рг2т 100 100 -

ДНК-ДНК гибридизация с:

М. 1асиШпа (%) 53 42 100

с Рг2т 79 100 -

Содержание Г+Ц (мол%) 45.6 43.8 43.4

• н.о. - не определяли

имеет 96% сходства с геном 16S рРНК S. pleomorpha - ближайшим родственным микроорганизмом (рис. 13).

Род Sphaerochaeta включает в себя три вида: 5. globosa, S. pleomorpha и S. coccoides (перенесенную недавно из рода Spirochaeta, бывший вид Spirochaeta coccoides). Штамм Sphaerochaeta sp. PS был депонирован в международных коллекциях под номерами DSM 26296 и VKM В-2809.

49.9

71 i— Uncultured bacterium 04е05 (GQ132475) 94.sjl Uncultured bacterium 7 (JX898117)

95.8

ido

96 7C Й2.! 5! .3

L Uncultured bacterium 3 (JX898074)

Uncultured bacterium M35_D8_L_B_C07 (EF586003)

ЧГ

¡3.8 83

Й3.2

Uncultured bacterium M35_D20_H_B_A06 (EF586024) 7.1 r- Uncultured bacterium 5 (JX898095) 6 fl— Uncultured bacterium LVBR10cC03 (GQ167315) I— Uncultured bacterium LVBR10bB02 (GQ167322)

- Uncultured Spirochaeta sp. De387 (HQ183962)

— Uncultured Spirochaeta sp. NRB5 (HM041922) Sphaerochaeta sp. PS VKM B-2809 (HG 531807) Uncultured bacterium B10 (GU322892) L- Sphaerochaeta sp. TQ1 (DQ833400)

Uncultured Sphaerochaeta CFC72 (JF736652) Uncultured Sphaerochaeta sp. NSBac34 (JX462552) ■ Uncultured bacterium IIIB-9 (AJ488100) Sphaerochaeta pleomorpha str. Grapes (AF357917)

- Sphaerochaeta sp. RCcp2 (DQ833401)

99 5 p Bacterium enrichment culture clone DPF05 (GQ377125) 82.6J~1. Uncultured bacterium TANB18 (AY667253) '— Sphaerochaeta globus str. Buddy (AF357916) Bacterium DCE25 (AJ249227) Uncultured bacterium PL-16B9 (AY570600) Sphaerochaeta coccoides (CP002659)

77.

чг„

0.03

Рис. 13. Филогенетическое положение 5рЪаегосЬае1а ер. штамма РБ на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с постоянно ухудшающейся экологической обстановкой на планете и возрастающей необходимостью утилизации отходов, необходимо изучение функционирования микробных сообществ антропогенных мест обитания для уменьшения негативного влияния промышленных и бытовых загрязнений и регулирования работы очистных сооружений. Для изучения была использована

микробная биомасса из двух антропогенных мест обитания, функционировавших при пониженных температурах - анаэробного низкотемпературного ЕСБВ биореактора, разлагавшего ЛЖК (ацетат, пропионат, бутират) при температуре 3-12°С и навозохранилища свинофермы, на дне которого среднегодовая температура не превышала 10°С.

Способность микробного сообщества адаптироваться к изменениям окружающей среды зависит от физиологических свойств каждого члена сообщества в отдельности и от сбалансированности работы сообщества в целом. Исследование метаболической устойчивости биомассы анаэробного ЕСБВ биореактора показало, что в сообществе, несмотря на длительную адаптацию к низким температурам, присутствуют как психроактивные, так и мезофильные микроорганизмы. При длительном культивировании в мезофильных условиях психроактивные свойства биомассы утрачиваются, однако кратковременное культивирование (1.5-2 месяца) при температуре 30°С даже улучшает последующее функционирование психроактивной микробной биомассы при температуре 10°С.

Для определения микробного состава и физиологических свойств микроорганизмов, участвующих в окислении пропионата и бутирата при низкой температуре, из исходной биомассы ЕСБВ биореактора, содержавшей от нескольких десятков до нескольких сотен видов микроорганизмов, были получены консорциумы отдельно на пропионате и бутирате, содержавшие 5-7 микроорганизмов, непосредственно участвовавших в окислении конкретной ЛЖК. Следует отметить, что подавляющее число синтрофных бактерий способны окислять либо пропионат, либо бутират. В результате исследования температурных диапазонов роста консорциумов было выявлено, что пропионат-окисляющий консорциум обладал более низкой оптимальной температурой по сравнению с бутират-окисляющим. По-видимому, пропионат-окисляющая синтрофная бактерия имела более низкие пределы температуры роста, чем бутират-окисляющая.

Микроскопирование показало, что в пропионат-окисляющем консорциуме было больше клеток гидрогенотрофного метаногена МеМапозртЦит, а в бутират-окисляющем — ацетокластического метаногена Ме^оиогае/а. Такое соотношение соответствует стехиометрии реакций окисления пропионата и бутирата. В первом случае образуется больше водорода и меньше ацетата, а во втором — наоборот. Очевидно, что для функционирования при температуре 10°С члены консорциума должны быть психроактивными. Анализ архейной составляющей консорциумов методом ДГТЭ показал присутствие трех видов метаногенов с 98-100% сходства последовательностей генов 168 рРНК с Ме1капохае>а, МакапотеЖуЬуогапх и 97.5% сходства с геном МеЛапозртЫит. Выделенный нами штамм МегкапоэрЫИит ер.

оказался психроактивным (способен расти при температуре 5-10°С). Он был описан нами как новый вид Methanospirillum stamsii PtlT.

При анализе бактериальной составляющей консорциумов методом ДГГЭ, нами были обнаружены последовательности генов 16S рРНК представителей типов Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Spirochaetes, что характерно для биомассы анаэробных биореакторов, в том числе низкотемпературных (Grabowsky et al., 2005; McKeon et al., 2009). Полученные последовательности генов 16S рРНК, имели отдаленное родство с последовательностями генов пропионат-окислящей бактерии Smithella propionica (97%), бутират-окисляющей бактерии Syntrophomonas bryantii (96%), сахаролитическими бактериями Macellibacteroides fermentons (98%) и Acetivibrio multivorans (81%). Кроме того, секвенированием генов 16S рРНК было установлено, что консорциумы содержали бактерии, сходные с некультивируемыми до настоящего времени бактериями. Интересно, что многие из них были обнаружены в различных низкотемпературных природных (Арктика, Антарктика) и антропогенных (психрофильные анаэробные биореакторы, низкотемпературное нефтяное хранилище) местах обитания. Чрезвычайно важным является выделение в будущем обнаруженных бактерий (и синтрофов, и их спутников) в чистые культуры. Среди них могут оказаться совершенно новые психроактивные бактерии.

Из второго низкотемпературного антропогенного источника - свиного навоза, был выделен и описан новый психроактивный вид «Methanosarcina porcellina Рг2т» sp. nov. и штамм Prl являющийся референтным штаммом вида «Methanosarcina porcellina Prl». Штаммы Prl и Рг2т были отнесены к новому виду «Methanosarcina porcellina», несмотря на 100% сходства последовательностей их генов 16S рРНК с геном Methanosarcina lacustris ZST, так как ДНК-ДНК-гибридизация этих штаммов с Methanosarcina lacustris ZST показала 53 и 42%, соответственно, а друг с другом 79%. Известно, что несколько изолятов метаногенов при 99-100%-ном сходстве последовательностей генов 16S рРНК были отнесены к новым видам на основании данных ДНК-ДНК гибридизации (Singh et al., 2005; Krivushin et al., 2010; Wagner, 2013) и некоторых физиологических различий. Новый метаноген и его референтный штамм -первые психроактивные штаммы, выделенные из антропогенного источника, а не природного местообитания.

Выделенная бактерия — спутник «Methanosarcina porcellina Prl», также оказалась новым видом рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.

Таким образом, нами установлено, что в холодных условия идет длительный, но устойчивый процесс разложения органического вещества сложным сообществом микроорганизмов, многие из которых принадлежат к новым таксонам. Знания об этих

сообществах и микроорганизмах необходимы для понимания функционирования низкотемпературных природных и антропогенных микробных экосистем.

ВЫВОДЫ

1. Изучение метаболической устойчивости психроактивного синтрофного ЛЖК-окисляющего сообщества анаэробного биореактора к временному изменению температуры культивирования показало, что оно устойчиво к непродолжительному (1.5-2 месяца) культивированию при 30°С, которое способствует приросту психроактивных микроорганизмов и повышает их активность при последующем переносе на 10°С. При более длительном культивировании при 30°С мезофильные микроорганизмы, вероятно, замещают психроактивные. Для ускорения накопления психроактивного инокулята к запуску низкотемпературных биореакторов может быть использовано только непродолжительное повышение температуры.

2. Получены устойчивые психроактивные метаногенные консорциумы, разлагающие пропионат и бутират, и показаны различия в таксономической принадлежности составляющих их бактерий, большинство из которых принадлежит к новым таксонам.

3. В пропионат- и бутират-окисляющих консорциумах присутствуют одни и те же психроактивные метаногенные археи - представители родов Мехкапонае1а, МеЛапозртИит и Ме(капоте1ку1оуогап5. Различия в количестве гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в консорциумах соответствовали стехиометрии реакций окисления (количеству образующихся водорода и ацетата при окислении пропионата или бутирата).

4. Из психроактивных синтрофных консорциумов, полученных из гранулированного активного ила анаэробного реактора, работавшего при 4-12°С, выделен и описан первый психроактивный гидрогенотрофный метаноген рода МеЛапояртПит - Ме^апозрггШит ¿¡атяИ Бр. поу. с типовым штаммом РП7 (=ОЗМ 26304т, =УКМ В-2808т)

5. Впервые из антропогенного источника — придонной части открытого заглубленного навозохранилища свинофермы, выделены и описаны два штамма психроактивных метаногенов, представляющих новый вид «МеМапоэагста рогсеШпа» ер. поу. с типовым штаммом Рг2т (=Б8М 15218х, = УКМ В-280бт).

6. Выделен бактериальный спутник психроактивной метаносарцины Мегкапоьагста рогсеШпа Рг1 - ЗркаегосЪае1а ер. штамм Р8, который является представителем нового вида рода БркаегосЪаеШ (=ББМ 26296, =УКМ В-2809)

Список работ по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Паршина С.Н., Ермакова A.B., Шатилова К.А. Исследование метаболической устойчивости психротолерантного ЛЖК-окисляющего микробного сообщества анаэробного биореактора к изменениям температуры культивирования // Микробиология. 2011. Т. 80. № 1. С. 53-62.

2. Parshina S.N., Ermakova A.V.. Bomberg М., Detkova E.N. Methanospirilium stamsii sp. no v., a psychrotolerant hydrogenotrophic methanogenic archaeon isolated from an anaerobic EGSB bioreactor operated at low temperature // IJSEM, published online, doi: 10.1099/ijs.0.056218-0 September 2013.

Тезисы конференций

1. Parshina S.N., Ermakova A.V.. Stams A.J.M., Lettinga G., Rebac S., Nozhevnikova A.N. Psychroactive methanogenic archaea and syntrophic consortia // Abstract of 2-nd FEMS Congress of European microbiologists. Madrid, Spain, 2-6 July 2006, P. 174.

2. Ермакова A.B., Ножевникова A.H., Паршина C.H. Физиология психроактивных метаногенных архей // IV Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 20-22 октября 2008. С. 15-16.

3. Parshina S.N., Ermakova A.V.. Bomberg М., Nozhevnikova A.N. Syntrophic propionate and butyrate degradation at low temperature - they can do it // Abstract of The 12th International Symposium on Microbial Ecology - ISME 12. Cairns, Australia, 17-22 August 2008.

4. Ермакова A.B.. Паршина C.H. Первый психротолерантный гидрогенотрофный метаногенный архей рода Methanospirillum - Methanospirillum stamsii sp. nov. выделенный из низкотемпературного ферментера // IX Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 21-23 октября 2013. С. 3-5.

Подписано в печать: 19.11.13

Объем 1,0усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 151 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д. 2 (495)978-66-63 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермакова, Анна Вячеславовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

П/-ЭП1/С07СС I т J^-^JJJ

На правах рукописи

ЕРМАКОВА АННА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ПСИХРОАКТИВНЫЕ АНАЭРОБНЫЕ КОНСОРЦИУМЫ И НОВЫЕ МЕТАНОГЕНЫ ИЗ АНТРОПОГЕННЫХ МЕСТ ОБИТАНИЯ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. С.Н. Паршина

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

Цели и задачи исследования 7

Научная новизна и практическая значимость работы 8

Апробация работы 9

Публикации 9

Место проведения работы 10

Благодарности 10

Объем и структура диссертации 10

Список сокращений 11

Список работ по теме диссертации 12

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Метаногенное микробное сообщество 13

1.1. Стадия гидролиза 15

1.2. Стадия ферментации 16

1.3. Ацетогенная стадия 17

1.3.1. Синтрофное окисление ацетата 21

1.3.2. Синтрофное окисление пропионата 23

1.3.3. Синтрофное окисление бутирата и длинно-цепочечных 26 жирных кислот

1.4. Метаногенная стадия 28

1.4.1. Гидрогенотрофные метаногены 32

1.4.2. Ацетаиспользующие метаногены 34 1.4.2. Метилотрофные метаногены 37

2. Агрегирование микроорганизмов 38

3. Ингибиторы метаногенеза 42

4. Психрофильные и психроактивные метаногены 44

5. Структурные и функциональные изменения в клетке при 47 низких температурах

5.1. Адаптация клеточных мембран 47

5.2. Изменения в белках 48

6. Влияние пониженной температуры на анаэробное 52 разложение органического вещества

7. Синтрофные микробные сообщества анаэробных 53 низкотемпературных биореакторов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микробиологические методы 55

1.1. Обьекты исследования 55

1.2. Среды для культивирования 56

1.3. Субстраты для культивировании 58

1.4. Выделение чистых культур 58

1.4.1. Метод серийных разведений 58

1.4.2. Использование антибиотиков 59

1.4.3. Использование твердой агаризованной среды 59

1.4.4. Высев на разные субстраты 60

1.5. Проверка чистоты культур 60

1.5.1. Микроскопирование 60

1.6. Условия проведения экспериментов по исследованию 61 метаболической устойчивости биомассы к изменениям температуры культивирования

1.7. Получение синтрофных пропионат- и бутират-окисляющих 62 консорциумов

1.8. Условия проведения экспериментов по исследованию 63

температурных оптимумов 1.9. Условия проведения экспериментов по определению 63 диапазонов и оптимумов роста чистых культур на средах с

разной концентрацией ШС1

2.0. Условия проведения экспериментов по определению 64 диапазонов и оптимумов роста чистых культур на средах при разном значении рН

2. Аналитические методы 64

3. Геносистематические методы 65

3.1. Выделение ДНК 65

3.2. ПЦР-амплификация 67

3.2.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16Б рРНК 67

3.2.2. Амплификация фрагментов гена метил-коэнзим М редуктазы 69 {тегА)

3.2.3. Детекция продуктов ПНР 70

3.3. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез 71

3.4. Секвенирование ДНК-фрагментов 72

3.5. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей 73

3.6. Определение суммарного содержания гуанина и цитозина в 73 ДНК и уровня ДНК-ДНК гибридизации

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследование метаболической устойчивости биомассы к 74 изменениям температуры культивирования

2. Получение синтрофных метаногенных консорциумов на 85 пропионате и бутирате

3. Исследование влияния температуры на потребление 87 пропионата и бутирата метаногенными консорциумами

4. Исследование микробного разнообразия метаногенных 89 синтрофных консорциумов методом денатурирующего

градиентного гель-электрофореза

4.1. Исследование бактериальной составляющей пропионат- и 89 бутират-окисляющих консорциумов

4.2. Исследование архейной составляющей пропионат- и 94 бутират-окисляющих консорциумов

5. Выделение и описание нового гидрогенотрофного 95

метаногена МеЖапозртИит 81ат8и Бр. поу. штамм Ри

5.1. Выделение и морфология штамма Р1:1 95

5.2. Характеристики роста и метаболизма штамма РИТ 96

5.3. Генотаксономические характеристики штамма РЙТ 97

6. Выделение и описание «МеМапоБагста рогсеШпа» ер. поу. 99

штамм Рг1, Рг2 и их бактерии-спутника 8ркаегоскае1а ер. штамм РЭ

6.1. Выделение и морфология штаммов Рг1 и Рг2 100

6.2. Характеристики роста и метаболизма штаммов Рг1 и Рг2т 101

6.3. Генотаксономические характеристики штаммов Рг1 и Рг2т 103

6.4. Выделение и определение филогенетического положения 107 8рЪаегосЬае1а ер. штамм РБ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109

ВЫВОДЫ 113

Список литературы 114

ВВЕДЕНИЕ

Согласно современным представлениям, анаэробное превращение практически любого сложного органического вещества в биогаз проходит несколько последовательных стадий: гидролиз, ферментация, ацетогенез и метаногенез. Весь этот сложный комплекс превращений осуществляет микробное сообщество включающее, по некоторым оценкам, - до нескольких сотен видов (вгуег & 2е1шс1ег, 1983; Заварзин, 1986). Летучие жирные кислоты (ЛЖК) являются важными интермедиатами анаэробной деградации органических веществ. В пресноводных экосистемах (природных и антропогенных) деградация ЛЖК невозможна без участия синтрофных бактерий, так как изменение свободной энергии Гиббса при окислении ЛЖК является положительной величиной ^агш, 1994). Такие реакции термодинамически невозможны. Для осуществления реакции окисления ЛЖК необходимо снижение концентрации водорода, образующегося в процессе окисления ЛЖК до 1-10 Па (10-4 атм). Низкую остаточную концентрацию водорода в пресноводных экосистемах обеспечивают водородиспользующие метаногены (Мс1пегпеу е1 а1., 2008). Научный интерес к метаногенным сообществам, функционирующим при пониженных температурах, обусловлен большой экологической значимостью низкотемпературных микробных экосистем в биосфере Земли.

температуре окружающей среды без обогрева реактора или с подогревом до 20-25°С. Эффективная очистка в таких условиях может быть достигнута при развитии сбалансированного психроактивного микробного сообщества. В анаэробных биореакторах с подачей очищаемой воды снизу (иАЭВ, ЕОБВ), благодаря гидродинамическим условиям, микроорганизмы образуют агрегаты (гранулы), в которых происходит межвидовой перенос водорода между синтрофными бактериями, окисляющими ЛЖК, и водородиспользующими метаногенами. В метаногенном сообществе между группами микроорганизмов существуют тесные и сложные взаимосвязи, в том числе, и обратные. Ввиду субстратной специфичности метаногенов, их рост невозможен без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь, метаногены, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Выявление особенностей регуляции низкотемпературного метаногенного сообщества, выделение и изучение физиологии микроорганизмов, входящих в его состав, необходимо для прогнозирования поведения микробных сообществ в холодных природных экосистемах, особенно находящихся под сильным антропогенным воздействием.

Цели и задачи исследования

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) исследование метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества анаэробного биореактора к временному повышению или понижению температуры при периодическом культивировании;

2) получение пропионат- и бутират-окисляющих психроактивных микробных консорциумов, изучение их температурных характеристик и микробного состава;

3) выделение и описание психроактивного метаногена из упомянутых синтрофных консорциумов;

Научная новизна и практическая значимость работы

Т*

метаноген рода Methanospirillum - Methanospirillum stamsii Ptl из пропионат-

окисляющего консорциума. Выделен и описан новый психроактивный вид рода

Methanosarcina - «Methanosarcina porcellina Pr2 » и его референтный штамм

«Methanosarcina porcellina Prl» из накопительной культуры, полученной из свиного навоза. Выделена и частично охарактеризована бактерия-спутник нового вида метаносарцины, представляющая собой новый вид рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях - «2-nd FEMS Congress of European Microbiologists» в Мадриде (Испания, 2006), на 12-м международном Симпозиуме по микробной экологии ISME-12 в Кернсе (Австралия, 2008), на IV Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008) и на IX Молодежной школе-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2013).

Публикации

Место проведения работы

Работа выполнена в Лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук. Молекулярно-биологические исследования проводили в центре коллективного пользования ИНМИ РАН, в Центре «Биоинженерия» РАН и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, к.б.н. С.Н. Паршиной за научное руководство и помощь в работе, благодарит сотрудников ИНМИ РАН д.б.н., зав. лабораторией А.Н. Ножевникову, к.б.н. А.Ю. Каллистову, к.б.н. E.H. Деткову, к.б.н. А.К. Кизилову, H.A. Кострикину, сотрудников кабинета газохроматографического анализа, сотрудников центра коллективного пользования, сотрудников Центра «Биоинженерия» РАН за практическую помощь и ценные советы.

Объем и структура диссертации

Список сокращений

ДГГЭ - денатурирующий градиентный гель-электрофорез

ДМА - диметиламин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛЖК - летучие жирные кислоты

ММА - монометиламин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТМА - триметиламин

EGSB - expanded granular sludge bed (анаэробный биореактор с расширенным слоем биомассы)

UASB - upflow anaerobic sludge bed (анаэробный биореактор с восходящим потоком среды)

Список работ по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Паршина С.Н., Ермакова А.В., Шатилова К.А. Исследование метаболической устойчивости психротолерантного ЛЖК-окисляющего микробного сообщества анаэробного биореактора к изменениям температуры культивирования // Микробиология. 2011. Т. 80. № 1. С. 5362.

2. Parshina S.N., Ermakova A.V., Bomberg М., Detkova E.N. Methanospirillum stamsii sp. no v., a psychrotolerant hydrogenotrophic methanogenic archaeon isolated from an anaerobic EGSB bioreactor operated at low temperature // IJSEM, published online, doi: 10.1099/ijs.0.056218-0 September 2013.

Тезисы конференций

1. Parshina S.N., Ermakova A.V., Stams A.J.M., Lettinga G., Rebac S., Nozhevnikova A.N. Psychroactive methanogenic archaea and syntrophic consortia // Abstract of 2-nd FEMS Congress of European microbiologists. Madrid, Spain, 2-6 July 2006, P. 174.

2. Ермакова A.B., Кожевникова A.H., Паршина C.H. Физиология психроактивных метаногенных архей // IV Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 20-22 октября 2008. С. 15-16.

3. Parshina S.N., Ermakova A.V., Bomberg М., Nozhevnikova A.N. Syntrophic propionate and butyrate degradation at low temperature - they can do it // Abstract of The 12th International Symposium on Microbial Ecology - ISME 12. Cairns, Australia, 17-22 August 2008.

4. Ермакова A.B.. Паршина C.H. Первый психротолерантный гидрогенотрофный метаногенный архей рода Methanospirillum -Methanospirillum stamsii sp. nov. выделенный из низкотемпературного ферментера // IX Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 21-23 октября 2013. С. 3-5.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Метаногенное микробное сообщество

В естественных и антропогенных экосистемах наличие или отсутствие тех или иных доноров и акцепторов электронов влияет на распространение, состав и активность микроорганизмов. В анаэробных условиях, если неорганические акцепторы электронов, такие, как сульфат, нитрат, Мп (IV) и Бе (III), отсутствуют или находятся в ограниченном количестве, осуществляется метаногенная деградация органического вещества (81ашз, 1994).

Анаэробная деградация органического вещества в природных и антропогенных экосистемах с образованием метана представляет собой многоступенчатый процесс, осуществляемый различными группами микроорганизмов (вгуег & 2е1ик1ег, 1983; 8сЫпк & ТЬаиег, 1988; БсЫпк, 1997). Согласно общепринятым представлениям, анаэробное превращение сложных органических веществ в биогаз проходит несколько последовательных стадий.

Как видно из рисунка 1, первая стадия - гидролитическая, заключается в расщеплении сложных биополимерных молекул (белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и других) на более простые олиго- и мономеры: аминокислоты, углеводы, длинноцепочечные жирные кислоты и т.д. (БоШгщ, 1990). На второй - ацидогенной стадии происходит расщепление образовавшихся мономеров до еще более простых веществ - ЛЖК, кетонов, спиртов, углекислоты и водорода. На третьей - ацетогенной (синтрофной) стадии происходит образование непосредственных предшественников метана: ацетата, водорода и углекислоты. В результате последней, метаногенной стадии, образуется конечный продукт расщепления сложных органических веществ - метан.

ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО

бепкн

утл® еды

ШШЩБ1

ГИДРОЛИЗ

(ЛНИШШГ£ОЗС,1ф01еОЛНПГ£ОЭЕ,

целгпелшпогеоэе бактарнн)

щлинкшлота

сахадра. дпнннещашч еш! е Л М

ФЕРМЕНТАЦИЯ (бак11фнк-броднль1Ц11кн)

ишога(л стп шкссахафа \

МЕТАНОГЕНЕЗ

СН4

Рис. 1. Схема деградации сложных органических веществ до метана.

Центральным метаболитом, осуществляющим основную регуляторную функцию в метаногенном сообществе, является водород (БсЫпк, 1992). За счет

поддержания низкого парциального давления водорода в системе становится возможным межвидовой перенос водорода, меняющий метаболизм гидролитических и ферментативных организмов и позволяющий протекать реакциям разложения летучих жирных кислот и спиртов, осуществляемых синтрофными бактериями и метаногенами (Слободкин и Ножевникова, 1990; Калюжный и др., 1991; Stams, 1994; Ножевникова 1998).

1.1. Стадия гидролиза

Первый этап деструкции органического вещества осуществляется бактериями

Информация о работе

Ермакова, Анна Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Психроактивные анаэробные консорциумы и новые метаногены из антропогенных мест обитания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы