Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка

Степаненко, Олеся Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка"

На правах рукописи

СТЕПАНЕНКО Олеся Викторовна

ПРОЦЕССЫ СВОРАЧИВАНИЯ-РАЗВОРАЧИВАНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКОВ, ИМЕЮЩИХ СТРУКТУРУ ТИПА БЕТА-БОЧОНКА

03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003171241

Pdñoid выполнена в Инспиугс цишлопш РАН

Научные ру ководигели: дотор 6(10,101 ичсскнх наук

Ирина Михайчовиа КУЗШ ЦОВА.

Институт циточогии РАН

докчор ф1И11К()-ма1е\1а1 нчсских наук

Владимир Ниш иевич УВЬРСШЙ,

Институт биологическоги приборостроения РАН

Официальные оппоненты: доюор биожн ичсскпл наук, профессор

Владимир Иосифович ВОРОЬЫВ, Институт циточогыи РАН

доктор фишко-м.'пешшческих наук Андреи Леонидович ГИМКОВСКИЙ Петербургский юи титут яОерной фишки им Ь П Константинова РАН

Ведущая организация: Hiicuuyi бночмини им A1J БачаРАК

Защита сосгонгся "20" топя 20081 ода в 15 ч на заседании Диссерташюттю совета Д 002 23001 арн И»сшг)те шподопт РАН по адресу 194064, Саша-llaepGjpi, I ичорснкий rip, д 4 e-mail- сеПЬю^тай cjtspb rssi ru санr. г,уу,ш

t дисеерыциси можно ошакомшься в библиотеке Инсгнгу ta цшолоши РАН. Апгорсфера! раюе iati " f¡f" мая 2008 куы

Ученый секремрь Диссерыционною «шеи клндида! био юшчеекич ш\ к

[ В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследовании Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное натив-ное состояние является одним из основных фундаментальных вопросов молекулярной биологии Выяснение причин нарушений фолдинга белков представляет существенное практическое значение для медицины и биотехнологии Специфическая ассоциация макромолекул белка, связанная с нарушением их фолдинга и приводящая к образованию амилоидных фибрилл, часто сопровождает так называемые конформацнонные болезни, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера, злокачественная миелома, катаракта и др , а возникновение неправильно свернутых ассоциатов рекомбинантных белков и их накопление в телах включения является главной проблемой при получении нативных рекомбинантных белков Большинство исследований фолдинга белков выполнено на небольших глобулярных а-спиральных белках Процессы сворачивания белков, имеющих выраженную р-складчатую структуру, в частности, структуру типа Р-бочонка, изучались значительно меньше

В настоящей работе объектами исследования стали представители двух классов белков, имеющих структуру типа р-бочонка одорант-связывающий белок (ОВР) из обонятельного эпителия свиньи и флуоресцентные белки (РРв) Флуоресцентные белки представляют собой обширный класс белков, характерной особенностью которых является наличие уникального хромофора, поглощающего и, в большинстве случаев, способного флуоресцировать в видимой области спектра Одорант-связывающие белки представляют собой группу растворимых белков, секретируемых в обонятельном эпителии позвоночных и способных обратимо связывать молекулы одорантов с константой диссоциации микромолярного порядка Несмотря на то, что РР.ч и ОВР принадлежат к одному архитектурному типу, структура Р-бочонка этих белков имеет некоторые различия В случае РРб Р-бочонок образован 11 антипараллельными р-тяжами и в центре бочонка проходит а-спираль, содержащая хромофор, в то время как Р-бочонок ОВР полый и образован 9 антипараллельными Р-тяжами Флуоресцентные белки интересны в связи с их широким использованием в клеточной биологии в качестве биологических маркеров, которые позволяют изучать динамику генной экспрессии, локализацию и транспорт белков в живых клетках и тканях Одорант-связывающие белки представляют исключительный интерес в связи с исследованием механизмов распознавания запахов и в связи с возможностью их использования для создания биосенсоров, чувствительных к различным, в том числе, опасным (яды, взрывчатые вещества и т п ) соединениям

Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей процессов сворачивания-разворачивания белков, имеющих структуру типа р-бочонка одорант-связывающего белка из обонятельного эпителия свиньи (ОВР) и набора флуоресцентных белков, а также их мутантных рекомбинантных форм В задачи исследования входило ,

1 Изучение процессов сворачивания-разворачивания FPs и одорант-связывающего белка под действием гуашгдингидрохлорида (GdnHCl)

2 Определение устойчивости структуры ОВР к различным денатурирующим воздействиям

3 Установление влияния аминокислотных замен в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка (EGFP)

4 Выяснение на примере зеленых и красных флуоресцентных белков роли четвертичной структуры в стабилизации FPs

Научная новизна исследований Установлено, что белки, имеющие топологию типа р-бочонка, характеризуются более высокой стабильностью структуры по сравнению с глобулярными а-спиральными белками В то же время, особенностью фолдинга FPs, по сравнению с одорант-связывающими белками, является наличие существенно более высокого энергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями этих белков Показано, что предденатурационные концентрации GdnHCl вызывают локальные изменения микроокружения триптофанового остатка ОВР В случае зеленого флуоресцентного белка, при небольших концентрациях GdnHCl уменьшаются напряжения, существующие в каркасе этого белка, и в этих условиях хромофор, оставаясь недоступным тушащему действию растворителя, становится более пленарным, что проявляется в возрастании интенсивности флуоресценции хромофора

Показано, что агрегация ОВР при высоких температурах может быть вызвана разрушением старых и образованием новых неканонических межмолекулярных ионных пар или иных контактов петлевых участков молекулы белка

Впервые показано, что помимо существенной роли Arg96 в процессах созревания хромофора, аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке оказывают влияние на сворачивание и устойчивость к денатурирующему воздействию этого белка Основные положения, выносимые на защиту:

1 Белки с топологией нативной структуры типа [¡-бочонка более устойчивы к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками

2 Небольшие концентрации GdnHCl вызывают предденатурационные локальные изменения структуры белков

3 Четвертичная структура флуоресцентных белков EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), dtmer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) не является единственным фактором, определяющим различия в их стабильности

4 Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке влияют на возможность сворачивания, скорость сворачивания, структуру и устойчивость к денатурирующим воздействиям этого белка

Теоретическое и практическое значение работы Полученные результаты имеют важное теоретическое значение для понимания особенностей процессов фолдинга белков, имеющих различную нативную структуру Данные об особенностях действия химического денатуранта GdnHCl на структуру белковой молекулы, предшествующих ее денатурации, должны учитываться в дальнейшем при исследовании процессов сворачивания-разворачивания белков Данные о стабильности и процессах сворачивания-разворачивания одорант-связывающего белка могут иметь практическое значение при использовании белков данного класса в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем высокой социальной значимости Данные, полученные при изучении влияния остатка в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка и роли четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков, могут представлять интерес для создания новых флуоресцентных биомаркеров Новая информация о флуоресцентных характеристиках триптофанового остатка Тгр16 ОВР, полученная в данной работе, может представлять интерес для выявления взаимосвязи особенностей локализации триптофановых остатков в белке с параметрами их флуоресценции

Существенной методической разработкой является вывод поправочного коэффициента, введение которого в соотношение для определения константы равновесия, позволяет использовать для расчета данной величины такую интенсивную характеристику системы, как параметр Л

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса кафедры биофизики СПбГПУ

Апробация работы Основные положения работы были представлены на 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), на 3-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007), на 12-й Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобиньи, Франция, 2007), на международной конференции «Coherent and nonlinear optics / Lasers, applications, and technologies» (Минск, Беларусь, 2007), на 4-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2008)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, а также тезисы 8 докладов на всероссийских и международных конференциях и съездах

Финансовая поддержка работы Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях» при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 04-04-49290 и 06-04-48231), Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», Программы «Ведущие научные школы РФ» (НШ-9396 2006 4, НШ-1961 2008 4), INTAS (грант 01-2347), CNR-NATO (грант 215 36S), администрации Санкт-Петербурга (фант 02/2 6/15-03/38), Фонда содействия отечественной науке по программе «Лучшие аспиранты РАН»

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 173 наименования Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 11 таблиц и 31 рисунок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы Препараты одорант-связывающего белка предоставлены проф Д'Ауриа (Институт биохимии белка Национального совета по науке Италии, Неаполь) Выделение и биохимический анализ препаратов ОВР осуществляли в Институте биохимии белка Белок выделяли из слизистой оболочки носа свиньи Слизистую оболочку гомогенизировали в 50 мМ Tris НС1 буфере (рН 7 4), содержащем 1 мМ PMSF Полученную суспензию центрифугировали в течение 1 ч при 9000 х g при 5 °С Супернатант был загружен на колонку DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), уравновешенную 50 мМ Tris-HCl буфером при рН 7 4 Элюцию белка с колонки осуществляли линейным градиентом соли NaCl от 0 до 0 8 М Фракции, содержащие белок, были определены с помощью SDS-электрофореза, собраны вместе и подвергнуты диализу против 50 мМ Tns-HCl буфера в течение ночи при 4 °С После этого раствор белка был загружен на колонку Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) Элюцию белка проводили линейным градиентом NaCl (0 1-0 8 М) Фракции, содержащие белок, установлены с помощью SDS-электрофореза, собраны вместе и подвергнуты диализу против 50 мМ Tris-HCl буфера в течение ночи при 4 °С На последнем этапе раствор белка был очищен с помощью FPLC на гель-фильтрационной колонке Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) Степень чистоты белка определяли при помощи SDS-электрофореза Измерения проводили в растворах 20 мМ TnsHCl буфера, рН 7 5 Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0 1-05 мг/мл

Плазмиды, кодирующие флуоресцентные белки - EGFP, zFP506, mRFPl, dimer2, DsRedl и мутантные формы EGFP с заменами по остатку Arg96 на остатки Gly, Ala, Cys, Ser

- с концевыми полигистидиновыми метками, были сконструированы согласно описанной ранее методике [1] и предоставлены нам В В Верхушей Плазмиды использовали для транс-фекции клеток Eschenüva coli BL21 (DE3) (Invitrogen, США) Выделение и биохимический анализ препаратов белков осуществлял М М Шавловсний Экспрессию флуоресцентных белков в Escheuchia coli индуцировали 1 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония) Наращивание клеточной массы проводили в течение 24 ч при 37 "С Белки очищали с помощью Ni-агарозы (Qiagen, США) Чистота образцов по данным SDS-электрофореза составляла не менее 95% Молекулярную массу выделенных белков контролировали с помощью SDS-электрофореза, используя набор стандартных белков (Bio-Rcd, США) в качестве маркеров Измерения проводили в растворах 50 мМ TnsHCI буфера, pH 8 0 Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0 05 - 0 5 мг/мл

Гуанидингидрохлорид (GdnHCl) фирмы Nacalai Tesque (Япония) использовали без дополнительной очистки Концентрацию GdnHCl определяли по коэффициенту преломления с помощью рефрактометра Abbe (JIOMO, Россия)

Анализ пространственной структуры белка. Свойства микроокружения и особенности локализации триптофановых и тирозиновых остатков в ОВР (файл 1A3Y в PDB, [2]) анализировали с использованием данных о координатах атомов пространственной структуры этого белка Микроокружение триптофановых и тирозиновых остатков определяли как совокупность атомов, расположенных на расстоянии менее >ъ от геометрического центра индоль-ного или фенольного кольца, ; о было принято равным 7 А [3] Выявляли атомы микроокружения, ближайшие к каждому атому индольного или фенольного кольца, и расстояние между ними Плотность упаковки атомов в микроокружении определяли как число атомов, входящих в микроокружение, или как отношение объема, занимаемого атомами микроокружения, к общему объему сферы с радиусом 7 Ä Объем, занимаемый атомами, определяли на основании известных Ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов, причем учитывали лишь ту часть объема, которая входит в сферу радиуса 7 Ä Реальный объем, занимаемый атомами, несколько меньше, так как атомы участвуют в образовании химических связей Тем не менее для целей данного анализа это не имеет существенного значения Эффективность безызлуча-тельного переноса энергии рассчитывали согласно Ферстеру [3 - 7]

Флуоресцентные измерения проводили с помощью спектрофлуориметров собственного изготовления [8] Флуоресценцию ОВР в большинстве случаев регистрировали при возбуждении на длинноволновом краю спектра поглощения белка (297 нм), т е в условиях, когда флуоресценция белка обусловлена исключительно триптофановыми остатками Флуоресценцию хромофоров зеленого флуоресцентного белка EGFP и его мутантных форм, а также zFP506 возбуждали при длине волны 365 нм и регистрировали при 510 нм Флуорес-

ценцию хромофоров красных флуоресцентных белков возбуждали при длине волны 365 нм, а регистрировали при 612 нм для mRFPl, при 584 нм для dimer2 и 580 нм для DsRedl Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длинами волн 280 и 297 нм Для характеристики положения и формы спектров флуоресценции использовали параметр Ä=ln<Jhv> (/з2о и /зб5 - интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно, см [9]) Спектры флуоресценции и параметр А корректировали на спектральную чувствительность установки

Кинетические эксперименты были выполнены с использованием микрокювет (101 016-QS 5 х 5 мм, Hellma, Германия), перевод белка в растворы различной концентрации GdnHCl выполнялся путем ручного смешивания раствора белка высокой концентрации (160 мкл) с буфером, содержащим необходимую концентрацию GdnHCl (320 мкл) «Мертвое время» для подобного рода экспериментов не превышает 4 с [10]

Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик ОВР от концентрации GdnHCl измеряли после инкубации растворов белка в присутствии GdnHCl соответствующей концентрации при 4°С в течение 24 ч Отличительной чертой денатурации флуоресцентных белков является то, что процессы перехода в развернутое состояние осуществляются крайне медленно Поэтому вид денатурационных кривых существенно зависит от времени инкубации белка в растворах денатуранта Денатурационные кривые были охарактеризованы величиной CU2(t) - концентрацией денатуранта, отвечающей середине перехода денатурационной кривой, измеренной после инкубации белка в растворах денатуранта в течение времени t На основании полученных данных были построены зависимости С,,2 от времени инкубации Для расчета термодинамических характеристик использовали денатура-ционную зависимость, полученную после инкубации растворов в течение времени tt - времени инкубации, при котором C,,2(í) выходит на плато Расчет термодинамических характеристик проводили с использованием квазистационарных зависимостей, полученных после инкубации флуоресцентных белков в растворах денатуранта в течение 5 сут Термодинамические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [11]

Анализ затухания флуоресценции Кривые затухания флуоресценции анализировали в мультиэкспоненциапьном приближении Расчет проводили го методу наименьших квадратов с использованием алгоритма минимизации Маркуардта [12] В качестве эталона использовали растворы /;-терфенила в этиловом спирте или ТУ-ацетилтриптофанамида в воде [13]

Измерение спектров КД Измерение спектров КД проводили с использованием спек-трополяриметра J-710 (Jasco, Япония) Для измерения спектров КД в дальней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути I мм, в ближней УФ и видимой

областях - кюветы с длиной оптического пути 1 см Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 5 раз и полученные данные усредняли Спектры КД белков построены с учетом КД соответствующего буферного раствора

Тушение флуоресценции акриламидом Для того чтобы получить информацию о доступности триптофановых остатков и хромофора молекулам растворителя, проводили эксперименты по тушению их флуоресценции внешним тушителем акриламидом Полученные данные представляли в координатах Штерн-Фольмера и аппроксимировали линейной зависимостью При обработке данных делали поправку на вклад в регистрируемое свечение растворителя Бимолекулярная константа (kq) была рассчитана на основании константы Штерн-Фольмера (K$v) и времени жизни (г), как kq= KS\/t

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение процессов денатурации флуоресцентных белков

Отличительной чертой флуоресцентных белков, к которым относится зеленый флуоресцентный белок (EGFP), является наличие уникального хромофора, поглощающего и, в большинстве случаев, способного флуоресцировать в видимой области спектра За последние несколько лет, прошедших после открытия первого флуоресцентного белка - avGFP (GFP из медузы Aequorea victoria), активные генно-инженерные работы и поиск гомологичных FPs в других организмах привели к тому, что спектры флуоресценции известных в настоящее время FPs перекрывают практически всю видимую область спектра [14] Несмотря на довольно низкую степень гомологии аминокислотной последовательности между FPs из разных классов (около 25-30 %), все они представляют собой цилиндр из 11 р-тяжей (р-бочонок), в центре которого проходит a-спираль, содержащая хромофор, образующийся в результате трехстадийной автокаталитической циклизации трех аминокислотных остатков в положении 65-67 (рис 2, о) Белки данного класса стали широко используемым инструментом для изучения различных биологических процессов в клетках и тканях Более подробно основные группы известных к настоящему времени FPs, их структурные и спектральные свойства, механизмы образования хромофора, основные направления использования FPs в качестве маркеров и сенсоров в клеточной биологии описаны в работе Степаненко и др, 2007'

Денатурация EGFP под действием GdnHCl Изучение процессов разворачивания EGFP под действием GdnHCl позволило выявить ряд особенностей (Verkhusha et al, 2003, Stepanenko et al, 2004, Степаненко и др, 2005) Например, регистрация кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции хромофора показала, что даже при переводе белка в

' Здесь и далее в круглых скобках приводятся ссылки на работы, представленные в списке публикаций по теме диссертации

4 6 Время, мин

раствор с высоким содержанием денатурата (4 М и более) процесс разворачивания ЕОР'Р занимает несколько минут (рис 1, а) Это свидетельствует о существовании высокого сво-бодноэнергетического барьера, разделяющего нативное и денатурированное состояния белка Анализ квазистационарных зависимостей интенсивности флуоресценции ЕОРР от концентрации денатуранта (из-за низкой скорости разворачивания белка эти зависимости были измерены многократно через различные промежутки времени после перевода белка в раствор Ск1пНС1 заданной концентрации) позволил сделать заключение о высокой стабильности структуры ЕОРР (рис 1, 6)

Интересно отметить, что в начальный момент времени после перевода белка в раствор

денатурата интенсивность флуоресценции зеленого хромофора существенно превышает уровень интенсивности флуоресценции белка в буферном растворе (в отсутствие денатурата) (рис 1, а) Квазистационарные зависимости свидетельствуют о том, что в присутствии небольших концентраций Ос1пНС1 (0 1 - 0 2 М) происходит значительное возрастание интенсивности зеленой флуоресценции ЕОРР (рис 1, б) Оба эти эффекта, по-видимому, имеют одну и ту же природу Известно, что хромофор в нативном белке имеет конформацию, несколько отличную от планарной, в то время как в полностью развернутом белке он приобретает плоскую конформацию [15] Сделано заключение, что возрастание интенсивности флуоресценции при небольших концентрациях Ос1пНС1 обусловлено эффектом стабилизирующего действия денатурата структура каркаса зеленого флуоресцентного белка становится менее напряженной, и в этих условиях хромофор, оставаясь недоступным тушащему действию растворителя, становится более пленарным При этом возрастает сопряженность я-электронных связей хромофора, что приводит к увеличению квантового выхода его флуоресценции

3 4 [GdnHCl], М

Рис 1 (а) Кинетические зависимости интенсивности зеленой флуоресценции EGFP при денатурации белка GdnHCl Конечная концентрация денатуранта в растворе составила 2 0 М(1), 4 0 М (2), 5 6 М (3), 6 5 М (4) Длина волны возбуждения - 365 нм, длина волны регистрации - 510 нм (б) Квазиравновесные кривые денатурации EGFP под действием GdnHCl Измерения проводили через 1 (1), 4 (2), 5 (3) сут инкубации белка в присутствии желаемой концентрации денатуранта

Влияние замен в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка. Как уже было сказано выше, хромофор флуоресцентных белков образуется в результате автокаталитической циклизации трех аминокислотных остатков в положении 65-67 [16] В avGFP хромофор образован аминокислотами Ser 65, Туг 66 и Gly 67 Хотя такая аминокислотная последовательность встречается и в других белках, в них хромофор не образуется, что говорит о решающей роли пространственной структуры белка в образовании хромофора [17] Безусловно, крайне существенно то, что хромофор расположен внутри ß-бочонка Установлено, что скорость созревания хромофора, его спектральные свойства определяются рядом аминокислотных остатков, входящих в состав его микроокружения В настоящей работе нами предпринято исследование роли одного из остатков, входящих в состав микроокружения хромофора, - Arg 96 (Stepanenko et al, 20086) Этот остаток присутствует во всех FPs и находится в непосредственной близости от кислорода имидазолинона (рис 2, б) Считается, что основная роль Arg 96 состоит в ускорении созревания хромофора и что определяющую роль играет положительный заряд остатка [18] Хотя влияние Arg 96 на скорость формирования хромофора обсуждалось еще в работе Цьена [17], до настоящего времени не было проведено систематического изучения структуры и стабильности мутантных белков с аминокислотными заменами по этому остатку

Установлено, что замена Arg96 Gly препятствует образованию нативного белка - весь мутантный белок EGFP Arg96 Gly оказался локализованным в телах включения Уровни экспрессии EGFP Arg96 Cys и EGFP сравнимы, а белков EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala -значительно ниже Непосредственно после выделения белков зеленая флуоресценция наблюдалась лишь у мутанта EGFP Arg96 Cys, при этом интенсивность зеленой флуоресценции была в 5 раз меньше, чем у EGFP, в то время как мутантные белки EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala не имели полосы поглощения в видимой области и не обладали зеленым свечением (рис 2, в) Тем не менее, спектры КД в дальней УФ-области исследуемых белков свидетельствуют о том, что они уже имеют сформировавшуюся структуру (рис 2, г) В случае EGFP Arg96 Cys вторичная структура существенно отличается от EGFP, а спектры КД мутантных форм EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala практически полностью совпадают со спектром EGFP Тем не менее вид спектров КД всех исследуемых белков позволяет заключить, что все белки имеют структуру типа ß-бочонка Измерение спектров КД в ближней УФ-области и спектров триптофановой флуоресценции показало, что, несмотря на сходную вторичную укладку, наблюдаются локальные отличия третичной структуры EGFP и мутантов (рис 2, г, вставка, и 2, е) Интересно отметить, что через полгода хранения при -20 "С белки EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala приобретают заметное зеленое свечение При этом интенсивность флуоресценции хромофора этих мутантных белков примерно в 50 раз ниже

EGFP Arg96 X

Arg96

Hisl48

300 350 400 450 500 Длина волны, нм

(N £ 6

о 4

св '

£ 0

О -2

* -4

— 190 200 210 220 230 240 250 Длина волны, нм

Э1-0- Гл «ко

g0.8- /\\ ¡0.8

-: 06 - j V ^о.б

^0.4 - / / -&0.4

á°"2t/ J I0'2

0.0 fc--------- I-1-0.0

400 450 500 550 600 310 340 370 400 Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис.2

Рис 2 Спектральные свойства EGFP и ei о мутантных форм

(а) пространственная структура EGFP (1ЕМА, [19, 20]) в двух проекциях Хромофор показан зеленым цветом Центральная а-снираль, содержащая хромофор, показана красным цветом Остаток Arg% покачан синаи i/ee-точ Рисунок создан с использованием графических программ VMD [21] и Raster3D [22]

(б) взаимодействия хромофора с боковыми цепями остатков микроокружения

(в) спектры поглощения в УФ и видимой области для EGFP (кривая синего цвета), EGFP Arg96 Cys (кривая красного цвета), EGFP Arg96 Ser (кривая зеленого цвета) и EGFP Arg96 Ala (кривая светло-зеленого цвета)

(г) спектры КД в дальней УФ области для EGFP и его мутантных форм Вставка спектры КД в ближней УФ области для этих белков Обозначения см в пункте (в)

(д) спектры флуоресценции хромофора для EGFP и ею мутантных форм Спектры были приведены к единице в максимуме флуоресценции Обозначения см в нункте (в)

(с) спектры триптофановой флуоресценции исследуемых FPs Спектры были измерены для EGFP [кривая синего цвета) и EGFP Arg96 Cys (кривая красного цвета) Для EGFP Arg96 Ser (кривая зеленого цвета) и EGFP Arg96 Ala (кривая светю-зеленого цвета) спектры peí истрировали сразу после получения белков (пунктирная чиния) и через псин ода после их выделения (сшоишая линия)

интенсивности зеленой флуоресценции EGFP Обращает на себя внимание, что спектры флуоресценции хромофора EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala имеют более коротковолновое положение по сравнению с EGFP (рис 2, д) Другим важным наблюдением является то, что спектр триптофановой флуоресценции мутантного белка EGFP Arg96 Ala, измеренный через полгода после выделения, сдвинут в более коротковолновую область по сравнению со спектром, измеренным сразу после получения этого белка, что свидетельствует об изменении со временем микроокружения триптофанового остатка данного мутанта или, иными словами, о низкой скорости процесса сворачивания Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что замены в положении 96 могут приводить к нарушению или замедлению процессов сворачивания зеленого флуоресцентного белка и оказывать влияние на его структуру (Stepanenko et al, 2008b)

Измерение кинетических и квазиравновесных зависимостей интенсивности флуоресценции хромофора позволило охарактеризовать устойчивость EGFP и его мутантных форм к

-0 4

s S 2

Я 0

и -2

Q -4

О О -6

-8

. б

ГЗ

i i

2 3 [GdnHCl], М

2 3 4 [GdnHCl], М

Рис 3 (а) Квазистационарные зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации денатуранта для EGFP (l), EGFP Arg96 Cys (2), EGFP Arg96 Ala (3) и EGFP Arg96 Ser (-/) под действием GdnHCl Измерения были выполнены через 5 сут после перевода белков в раствор GdnHCl заданной концентрации (б) Зависимости изменения свободной энергии Гиббса от концентрации GdnHCl для EGFP (1), EGFP Arg96 Cys (2), EGFP Arg96 Ala (3) и EGFP Arg96 Ser (4)

денатурирующему действию GdnHCl (рис 3) Показано, что EGFP Arg96 Cys обладает большей стабильностью по сравнению с EGFP, в то время как замены Arg96 Ser и Arg96 Ala приводят к дестабилизации EGFP (Stepanenko et al, 20086)

Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. С целью выяснения роли четвертичной структуры в стабилизации FPs в настоящей работе проведен сравнительный анализ нескольких FPs с различной степенью олигомеризации, а именно EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), dimer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) (Verkhusha et al, 2003, Stepanenko et al, 2004, Степаненко и др, 2005) Измерены кинетические и квазиравновесные зависимости интенсивности красной и зеленой флуоресценции от концентрации GdnHCl (рис 4) Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что все исследуемые белки обладают высокой устойчивостью к действию GdnHCl и что денатурация FPs осуществляется чрезвычайно медленно Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что стабильность флуоресцентных белков различается значительно В группе зеленых FPs ассоциация макромолекул действительно может рассматриваться в качестве важнейшего стабилизирующего фактора, так как было показано, что zFP506 обладает гораздо большей стабильностью по сравнению с EGFP С другой стороны, данные, полученные для красных FPs, не подтверждают данный вывод Действительно, показано, что dimer2 обладает меньшей стабильностью по сравнению с DsRedl В то же время стабильность mRFPl даже превышает стабильность DsRedl На основании полученных данных был сделан вывод о том, что четвертичная структура является важным, но не единственным фактором, определяющим различия конформационной стабильности флуоресцентных белков Это говорит о том, что

2 3 4 [GdnHCl],

2 4 [GdnHCl], М

Рис 4 (о) Квазистационарные зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации денатуранта для ЕЙГР (1), 2РР506 (2), тШ>] (3), (Ьтегё (4) и ОэКесИ (5) под действием 0<1пНС1 Измерения были выполнены через 5 сут после перевода белков в раствор С<1пНС1 заданной концентрации (б) Зависимости изменения свободной энергии Гиббса от концентрации Ос1пНС1 для ЕвРР (1), гРР506 (2), тИТЧ (3), с1ппег2 (4) и ОзИссИ (5)

стабильность белка может быть значительно увеличена в результате введения соответствующим образом подобранных аминокислотных замен, при этом нет необходимости сохранять присущую многим РРэ тетрамерную организацию Этот результат может представлять интерес при создании новых флуоресцентных биомаркеров

Изучение процессов денатурации ОВР

Одорант-связывающие белки представляют собой группу растворимых белков, секре-тируемых в обонятельном эпителии позвоночных и способных обратимо связывать молекулы одорантов Белки этой группы, также как и флуоресцентные белки, принадлежат к архитектурному классу типа р-бочонка, который в этом случае образован 9 антипараллельными р-тяжами и в сечении имеет овальную форму Внутренняя полость р-бочонка одорант-связывающих белков формирует лиганд-связывающий сайт

Разворачивание ОВР под действием СФгНС1 Характер денатурационных зависимостей характеристик собственной флуоресценции и кругового дихроизма позволяет выделить три подобласти концентраций вскНО 0-1 4, 14-3 5, 35-50М (рис 5, 6) ($1а1апо й а1, 2007) Увеличение концентрации Ос1п11С1 от 0 до 1 4 М вызывает лишь незначительные изменения структуры ОВР, о чем свидетельствуют увеличение эллиптичности в ближней УФ-области (рис 7, вставка), небольшое увеличение интенсивности флуоресценции и уменьшение времени жизни возбужденного состояния (рис 5) до величины, характерной для белков в полностью развернутом состоянии [23] Все другие параметры, такие как положение спектра флуоресценции, анизотропия флуоресценции и спектры КД в дальней УФ-области, остаются неизменными в данном диапазоне концентраций Сс1пНС1 (рис 5) Доступность триптофано-вого остатка Тгр 16 молекулам растворителя (рис 7) и вклад тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка (рис 6, в) также не меняются

Разворачивание структуры белка, очевидно, происходит в области концентраций вс1пНС1 от 1 4 до 3 5 М Этот процесс сопровождается значительным изменением практически всех измеряемых параметров Величина параметра А уменьшается до 0 45, т е до величины, типичной для полностью развернутых белков, происходит уменьшение величины анизотропии флуоресценции, что указывает на увеличение внутримолекулярной подвижности триптофанового остатка, обусловленное разрушением пространственной структуры, а также уменьшением эллиптичности при 222 нм (рис 5), что говорит о разрушении вторичной структуры белка Растет также вклад тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию ОВР, что свидетельствует о нарушении условий для эффективного переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановому, т е о разрушении третичной структуры (рис 7) Параметрические зависимости между значениями интенсивности флуоресценции, измеренными при длинах волн 320 и 365 нм [24], подтверждают существование двух существенно

12 3 4 5

[сапна], м рис. 5

§ 2.0 К

5 1-5

Л- 1.0

5 0.5

3 2.0

В 1.5

6 1.0

н х

3 0.5

2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

Длина волны, нм рис. 6

Аи)-1.4М

N0-" 1 1 1 | |

0.7 0.8 0.9

1.0

1.1 1.2 1.3

1.2 -

1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 -0,0 к

300 320 340 360 380 400

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 [Акриламид], М

рис. 7

0 12 3 4 5 [оапнс!], м

260 280 300 Длина волны, нм

1.7 М

Н,(> ш

рис. 9

рис. 10

Рис 5 Конфоршционные переходы ОВР под действием GdnHCl Незакрашенные и закрашенные символы со-oiBeiciByrai процессам дена!урации и penaiypamni

Рис 6 Спектры испускания, заре» исфированные при длине волны возбуждения 297 нм (панель а) и 280 нм (панель б) Разность между сиекграми флуоресценции, возбужденными при 280 и 297 нм (панель а), нредстав-ляе! собой вклад шрозиновых ociaiKoe в суммарную флуоресценцию белка Данные, С001ве1С1вующие фем подобластям кон цен фаций GdnHCl, 0-1 4, 1 4-3 5 и 3 5-5 0 М, показаны красным, синим и юл\бым цвеюм

Рис 7 Тушение акриламидом собс1венной флуоресценции ОВР в npiicyiciemi разных конценфашш GdnHC! Цифры на кривых - конценфации GdnHCl Вставка спекфы КД в ближней УФ-обласш ОВР в нрису1С1Вии 0 (красная 'шпия), 1 2 (зе ¡еная линия), 1 7 (синяя чиния) и 4 0 M GdnHCl (го ¡убая линия)

Рис 8 Парамефическая зависимость между /з?о и A6s, харак1еризуюшая процессы сворачивания-разворачивания ОВР под действием GdnHCl Незакрашенные и закрашенные символы соошаствуЮ1 процессам дена1урации и ренагурации Цифры на кривых - конценфации GdnHCl ХВ0(6 = 297 нм

Рис 9 Микроокружение Тф 16 Рисунок создан на основании ренпеноструюурных данных ( 1 A3Y, [2, 20]) с использованием фафических нрофамм VMD [21] и Raster3D [22]

Рис 10 Определение 1ермодинамических парамефов денагурации ОВР под действием GdnHCl Зависимости доли белка в нашвном состоянии (tts) oi конценфации GdnHCl, определенные из данных элдиншчности при 222 нм (черные си.иво1ы), иарамефа А с учеюм коэффициент (/NW/uus) (зеленые сиивом) и без ею учеш (красные симво !ы) Вставка Соо1ве1ствуюшие зависимости конценфации GdnHCl

различных процессов, характеризующих изменение интенсивности флуоресценции ОВР под действием GdnHCl в диапазонах концентраций 00-14и14-35М (рис 8)

В растворах, содержащих более 3 5 M GdnHCl, ОВР находится в полностью развернутом состоянии и дальнейшее увеличение концентрации GdnHCl не вызывает заметных изменений регистрируемых параметров

Влияние остатка Lys 120 и молекул связаниой воды на флуоресцентные свойства ОВР. Для объяснения причин эффектов, наблюдаемых в диапазоне небольших концентраций GdnHCl (0 - 1 4), был проведен анализ микроокружения единственного триптофанового остатка ОВР, Тгр16, который позволил предположить, что флуоресцентные свойства Тгр16 в значительной степени определяются влиянием боковой цепи остатка Lys 120 и 3 молекулами связанной воды (рис 9) (Staiano et al, 2007) Боковая цепь Lys 120 расположена практически параллельно к индольному кольцу Тгр16, при этом ближайший атом этого остатка, NZ, находится на расстоянии всего 4 15 Â от центра индольного кольца Было показано, что лизин является слабым тушителем триптофановой флуоресценции [25] Следует заметить, что тушащее действие полярных групп определяется не только расстоянием между триптофановым остатком и тушащей группой, но в значительной степени зависит от пространственного расположения данной группы относительно индольного кольца [26, 27] Известно, что расположение положительно заряженной аминогруппы остатка Lys 120 над центром индольного кольца благоприятно для формирования комплекса между этой группой и индольным кольцом [28] Комплексообразсвание между Тгр16 и Lys 120 может объяснять низкую интенсивность флуоресценции ОВР в нативном состоянии Кроме того, в микроокружение Тгр16 входят 3 молекулы связанной воды, которые также могут образовывать комплекс с индольным

кольцом в основном и возбужденном состояниях Как уже было сказано, при увеличении концентрации GdnHCl интенсивность флуоресценции ОВР (квантовый выход) растет, в то время как время жизни возбужденного состояния падает Возможность такого не коррелированного изменения времени жизни флуоресценции (г) и квантового выхода (q) для трипто-фановых остатков в белках впервые была показана Шабо для нескольких белков с одним триптофановым остатком [29] и была объяснена образованием эксиплексов [3] Нельзя исключать того, что и в случае ОВР причина наблюдаемых эффектов обусловлена образованием триптофановым остатком Тгр16 эксиплексов с молекулами воды, входящими в состав его микроокружения

Таким образом, небольшие концентрации GdnHCl (вплоть до 1 4 М) не приводят к нарушению третичной структуры белка, однако микроокружение триптофанового остатка, по-видимому, претерпевает некоторые изменения Увеличение интенсивности флуоресценции, по-видимому, связано с нарушением комплекса между Тгр16 и Lys 120 Возможность значительного увеличения расстояния между атомом NZ остатка Lys 120 и индольным кольцом триптофанового остатка ОВР в водном растворе была продемонстрирована методом молекулярной динамики Подобные возмущения микроокружения триптофанового остатка не меняют его доступность молекулам растворителя, которая остается такой же низкой, как и для белка в воде (рис 7) В то же время асимметрия микроокружения триптофанового остатка даже несколько возрастает (рис 7, вставка), что может быть связано с образованием эксиплексов Тгр16 с молекулами связанной воды, тем самым объясняя уменьшение времени жизни флуоресценции

Дальнейшее увеличение концентрации GdnHCl (от 1 4 M до 3 5 M) полностью разрушает третичную структуру ОВР Накопление молекул белка в полностью развернутом состоянии приводит к последующему увеличению интенсивности флуоресценции из-за полного снятия тушащего действия Lys 120 и к длинноволновому сдвигу спектра флуоресценции из-за увеличения полярности микроокружения триптофанового остатка

Определение констант равновесия процессов разворачивания-сворачивания на основании измерения экстенсивных и интенсивных характеристик системы. Константа равновесия процессов разворачивания белков, используемая для определения термодинамических параметров процесса денатурации, определяется на основании хорошо известного соотношения [11]

где /н и /и - интенсивность флуоресценции белка в нативном и развернутом состояниях Это соотношение для определения константы равновесия справедливо только для экстенсивных

характеристик системы и не верно для интенсивных характеристик, таких иак параметр А и анизотропия флуоресценции Между тем это обстоятельство часто не принимается в расчет, и даже положение максимума спектра флуоресценции используется для определения ([о]) [30] В связи с этим предложено соотношение, которое демонстрирует, что такая интенсивная характеристика, каь параметр А, связана с константой равновесия следующим образом ^атпо « а1, 2007)

5 Лу - Л([Р])

4М)-Л/

(2)

где 365 и ¡и 365 - интенсивности флуоресценции белка в нативном и развернутом состояниях, зарегистрированная при длине волны 365 нм, Ам и А и - значения параметра А для натив-ного и развернутого состояния белка Таким образом, при использовании для определения константы равновесия параметра А следует учитывать коэффициент /Л, 1М / /,. 365, а, например, такая экстенсивная характеристика, как положение максимума спектра флуоресценции, вообще не может быть использована для определения величины константы равновесия Полученное выражение было использовано для определения величины разности свободных энергий ОВР в нативном и полностью развернутом состояниях (рис 10) Полученный результат подчеркивает, что использование соотношения (1) для определения константы равновесия допустимо только в том случае, если денатурационная зависимость получена при регистрации экстенсивной характеристики (рис 10, вставка) Следует заметить, что величина разности свободных энергий белка в нативном и полностью развернутом состоянии в отсутствие денатуранта составляет - 5 95 ккал моль что свидетельствует о высокой устойчивости структуры ОВР 1 2 Тепловая денатурация ОВР По- 1 1 казано, что пространственная структу- 1 0 ра ОВР чрезвычайно устойчива к на- 09

О»

2 ох

греванию ^ерапепко ег а1, 2008д) Се-

С 07

редина перехода зависимостей пара-

метра А от температуры наблюдается

при 70 "С (рис 11) При этом процесс ^ ^ тепловой денатурации ОВР осложняется агрегацией белка и поэтому является необратимым Как и ожидалось, присутствие ОдпНО приводит к уменьшению устойчивости ОВР к нагреванию

40 60

Температура, °С

Рис II Тепловая денаорация ОВР Зависимое|и 1, 2, 3,4, 5, 6 И 1 были измерены для рас торой белка, содержащих 0, 0 5, 0 75, 1 0, 1 25, 1 5 и 4 0 М С<1пНС1, соо1ве!С1венно Незакрашенные и закрашенные символы С001веювую1 денаиурации и ренатурации

(рис 11), в результате этого разворачивание ОВР начинается при меньших температурах, чем в отсутствие денатуранта Замечено, что для растворов белка, не содержащих GdnHCl, параметр А при температуре 90 °С достигает значения 0 64, которое несколько больше величин, измеренных при тепловой денатурации ОВР в присутствии GdnHCl, что указывает на неполное разворачивание белка под действием нагревания в отсутствие GdnHCl Молеку-лярно-динамические эксперименты также свидетельствуют о высокой устойчивости вторичной структуры белка к нагреванию Анализ усредненных структур белка, полученных в результате молекулярно-динамических экспериментов для температур 60, 75 и 80 "С, с помощью программы DSSP [31] показал, что содержание элементов вторичной структуры в белке меняется незначительно Высокая термостабильность ОВР (белка, выделенного из мезо-фильного организма), по-видимому, обусловлена особенностью топологии этого белка наличие большого числа гидрофобных остатков, образующих внутреннюю полость р-бочонка ОВР, создает сильную сеть гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру белка Молекулярно-динамические эксперименты показали, что наибольшие конформационные изменения при увеличении температуры происходят в петлевых участках белка, а именно 26 - 29 и 32 - 36 (петля L1), 45 - 47 (петля L2), 58 - 61 (ветвь рЗ - петля L3), 105 - 111 (петля L7) Кроме того, анализ ионных пар в усредненной структуре белка при разных температурах свидетельствует о том, что увеличение температуры ведет к разрушению ионного взаимодействия между Arg 152 и Glu 31, соединяющего самую длинную петлю L1 с С-концевым доменом По-видимому, потеря данного ионного контакта может приводить к тому, что, длинная петля L1 будет способна принимать различные конформации, благоприятствующие образованию неканонических межмолекулярных ионных пар или иных контактов с другими молекулами белка и, тем самым, способствовать агрегации ОВР Таким образом, локальные изменения конформации высокоподвижных петель, по-видимому, имеют существенное значение для межмолекулярных взаимодействий

ВЫВОДЫ

1 Исследованные в работе белки, одорант-связывающий белок и флуоресцентные белки, с топологией нативной структуры типа р-бочонка характеризуются более высокой устойчивостью к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками Высота свободноэнергетического барьера, разделяющего нативное и денатурированное состояния, для флуоресцентных белков существенно превышает эту величину для одорант-связывающего белка

2 Малые концентрации гуанидингидрохлорида вызывают локальные изменения структуры белков изменение микроокружения триптофанового остатка в случае одорант-связывающего белка и уменьшение непланарности хромофора в случае зеленого флуоресцентного белка

3 Четвертичная структура является существенным, но не единственным фактором, определяющим различия в стабильности зеленых и красных флуоресцентных белков возможно создание мономерных мутантных форм этих белков с высокой стабильностью

4 Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке ЕОРР приводят к нарушению или замедлению процессов сворачивания белка и могут оказывать влияние на структуру и устойчивость этого белка к денатурирующим воздействиям

5 Главной причиной агрегации молекул одорант-связывающего белка при высоких температурах является увеличение подвижности петлевых участков и, как следствие, образование неканонических ионных взаимодействий

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Verkhusha V V , Kuznetsova I М , Stepanenko Olesya V., Zaraisky A G , Shavlovsky M M , Turoverov К К , Uversky V N (2003) High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequoi ea EGFP Biochemistry 42(26) 7879-7884

2 Stepanenko Olesya V., Verkhusha V V , Kazakov V 1, Shavlovsky M M , Kuznetsova I M , Uversky V N, Turoverov К К (2004) Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zFP506, mRFPl, "dimer2" and DsRed Biochemistry 43(47) 14913-14923

3 Степаненко Олеся В , Верхуша В В , Шавловский М М , Алейникова Т Д, Уверений В Н , Кузнецова И М , Туроверов К К (2005) Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков Цитология 47(11) 1017-1027

4 Степаненко Олеся В., Верхуша В В , Кузнецова И М , Туроверов К К (2007) Флуоресцентные белки физико-химические свойства и использование в клеточной биологии Цитология 49(5) 395-420

5 Staiano М, D'Auna S , Varriale А , Rossi М, Marabotti А , Fini С, Stepanenko Olesya V., Kuznetsova I M , Turoverov К К (2007) Stability and dynamics of the porcine odorant-binding protein Biochemistry 46(39) 11120-11127

6 Stepanenko Olesya V, Marabotti A, Kuznetsova I M, Turoverov К К, Fini С, Varriale A , Staiano M , Rossi M , D'Auria S (2008a) Hydrophobic interactions and ionic networks play an important role m thermal stability and denaturation mechanism of the porcine odorant-binding protein Proteins 71(1) 35-44

7 Stepanenko Olesya V , Verkhusha V V , Shavlovsky M M , Kuznetsova 1 M , Uversky V N , Turoverov К К (2008b) Understanding the role of Arg96 m structure and stability of green fluorescent protein Proteins Published online 09 05 2008

8 Степаненко Олеся В , Верхуша В В , Туроверов К К (2004) Сравнительное изучение стабильности DsRed и EGFP 8-я Международная Путинская шкоча-конференция молодых ученых Тезисы докладов Пущино,34

9 Степаненко Олеся В., Верхуша В В , Шавловский М М , Уверский В Н , Туроверов К К (2004) Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков III Съезд биофизиков России Тезисы докладов Воронеж, 106-107

10 Степаненко Олеся В, Красноруцкая Р С , Верхуша В В , Кузнецова И М , Туроверов К К (2007) Роль остатка в положении 96 в созревании хромофора и стабильности EGFP XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» Тезисы докладов Москва, Т 1, 76

11 Степаненко Олеся В , Варриале А, Кузнецова И М , Туроверов К К , Д'Ауриа С (2007) Изучение процессов сворачивания-разворачивания одор-связывающего белка Третья Санкт-Петербургская конференция мочодых ученых с международным участием Тезисы докладов Санкт-Петербург, 201

12 Stepanenko Olesya V., Varriale А , Kuznetsova I M , Turoverov К К , Marabotti А , Fini С , Staiano М , Rossi М , D'Auria S (2007) Porcine odorant-bmding protein structural dynamics and stability 12th European conference on ihe spectioscopy of biological molecules Bobigny, France, 189

13 Varriale A , Staiano M , Rossi M , D'Auria S , Fini С , Stepanenko Olesya V. (2007) Structure and stability of the porcine odor-binding protein International conference on coherent and nonlinear optics / International conference on lasers, applications, and technologies Minsk, Belarus, 46

14 Степаненко Олеся В. (2007) Роль остатка в положении 96 в созревании хромофора и стабильности EGFP Двенадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов Тезисы докладов Санкт-Петербург, 42

15 Stepanenko Olesya V., Kuznetsova I M , Verkhusha V V , Uversky V N , Turoverov К К (2008) The effect of small guanidine hydrochloride concentrations on the structure of green fluorescent protein 4th Saint-Petersburg young scientists conference Abstract book Saint-Petersburg, 19

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Verkhusha V V et al, 2001 J Biol Chem 276 29621-29624 2 Spinelli S et al, 1998 Biochem 37 7913-7918 3. Turoverov К К et al, 1985 Biophys Chem 23 79-89 4. Forster Th 1960 Rad Res Suppl 2 326-339 5 Dale R E , Eismger J 1974 Btopolymers 13 15731605 6. Eismger J et al, 1969 Biochemistry 8 3908 - 3915 7. Steinberg I Z 1971 Ann Rev Biochem 40 83-114 8. Туроверов К К и др, 1998 Цитология 40 (8/9) 806-817 9 Turoverov КК, Kuznetsova IM 2003 J Fluorescence 13 41-57 10. Kuznetsova IM, Stepanenko Olga V, Stepanenko Olesia V et al, 2002 Biochemistiy 41 13127-13132 11. Nolting В 1999 Protein Folding Kinetics In Biophysical Methods Berlin-Heidelberg Spnnger-Verlag 191 p 12. Marquardt D W 1963 J Soc Indust Apl Math 11 431-441 13. ZukerM et al, 1985 Rev Sei Instrum 56 14-22 14 ShanerNC et al, 2005 Nat Methods 2 905-909 15. MaddaloSL, Zimmer M 2006 Photochem Photobiol 82 367-372 16. Reid В G, Flynn G С 1997 Biochemistry 36 6786-6791 17. TsienRY 1998 Annu Rev Biochem 67 509-544 18 Wood T I et al, 2005 Biochemistry 44 16211-16220 19. Ormo M et al, 1996 Science 273 1392-1395 20 Berman H M et al, 2000 Nucleic Acids Research 28 (1) 235-242 21 Humphrey W et al, 1996 J Molec Graphics 14 33-38 22. Merritt E A , Bacon D J 1977 Methods Enzymol 277 505-524 23 Gnnvald A , Steinberg I Z 1976 Biochim Biophys Acta 427 663-678 24 Kuznetsova IM et al, 2004 J Proteome Res 3 485-494 25. Chen Y , Barkley M D 1998 Biochemistry 37 9976-9982 26 Кузнецова И M , Туроверов К К 1998 Цитология 40 (8/9) 747-762 27. D'Auria S et al, 2005 Reviews in Fluorescence 25-61 28 Vivian J T , Callis P R 2001 Biophys J 80 2093-2109 29 Szabo A G , Faerman С 1992 Proc SPIE 1640 70-80 30. Pansi M et al, 2003 Biochim Biophys Acta 1652 115125 31 Kabsch W, Sander С 1983 Biopolymers 22 2577-2637

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 16 05 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2988Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степаненко, Олеся Викторовна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и фолдинг белков: современные представления.

1.2. Флуоресцентные белки.

1.2.1. Спектральные свойства флуоресцентных белков.

1.2.1.1. Флуоресцентные белки из класса Anthozoa.

1.2.1.2. Флуоресцентные белки из других классов организмов.

1.2.1.3. Aequorea GFP и его улучшенные варианты.

1.2.1.4. Фото активируемые флуоресцентные белки.

1.2.2. Структурные свойства флуоресцентных белков.

1.2.2.1. Пространственная структура, топология и олигомеризация.

1.2.2.2. Механизмы образования хромофора.

1.2.2.3. Микроокружение хромофора.

1.2.3. Конформационная стабильность флуоресцентных белков.

1.3. одорант-связывающие белки.

1.3.1. Лиганды OBPs.

1.3.2. Трехмерная структура OBPs.

1.3.3. Комплексы OBPs с молекулами одорантов.

1.3.4. Предположительная роль OBPs.

1.3.5. Конформационная стабильность рОВР.

ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Анализ пространственной структуры белка.

2.2.2. Флуоресцентные измерения.

2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции.

2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма.

2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.

2.2.6. Измерение кинетических кривых денатурации белков.

2.1.7. Тушение флуоресценции акриламидом.

2.2.8. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.

2.2.9. Расчет кинетических параметров.

2.2.10. Расчет термодинамических параметров.

ГЛАВА 3: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности процессов денатурации EGFP и его мутантных форм с заменами в положении 96.

3.1.1. Экспрессия EGFP и его мутантных форм в бактериальных клетках.

3.1.2. Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм.

3.1.3. Влияние точечных аминокислотных замен в положении 96 на структуру EGFP.

3.1.4. Особенности денатурации EGFP под действием GdnHCl. Влияние замен в положении 96 на стабильность EGFP.

3.2. роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков

3.2.1. Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs.

3.2.2. Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков.

3.2.3. Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя.

3.2.4. Особенности триптофановой флуоресценции.

3.2.5. Кинетика денатурации под действием гуанидингидрохлорида.

3.2.6. Квазистационарные зависимости.

3.3. Разворачивание-сворачивание ОВР под действием GdnHCl и нагревания.

3.3.1. Локальные предденагурационные изменения структуры ОВР под действием небольших концентраций GdnHCl.

3.3.2. Устойчивость структуры ОВР к денатурирующему действию GdnHCl.

3.3.3. Тепловая денатурация ОВР.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка"

Актуальность исследования

Вопрос о том как белки сворачиваются в уникальное нативное состояние является одним из основных фундаментальных вопросов молекулярной биологии. Выяснение причин нарушений фолдинга белков представляет существенное практическое значение для медицины и биотехнологии. Специфическая ассоциация макромолекул белка, связанная с нарушением их фолдинга и приводящая к образованию амилоидных фибрилл, часто сопровождает так называемые конформационные болезни, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера, злокачественная миелома, катаракта и др., а возникновение неправильно свернутых ассоциатов рекомбинантных белков и их накопление в телах включения является главной проблемой при получении нативных рекомбинантных белков. Большинство исследований фолдинга белков выполнено на небольших глобулярных а-спиральных белках. Процессы сворачивания белков, имеющих выраженную (3-складчатую структуру, в частности, структуру типа Р-бочонка, изучались значительно меньше.

В настоящей работе объектами исследования стали представители двух классов белков, имеющих структуру типа Р-бочонка: одорант-связывающий белок (ОВР) из обонятельного эпителия свиньи и флуоресцентные белки (FPs). Флуоресцентные белки представляют собой обширный класс белков, характерной особенностью которых является наличие уникального хромофора, поглощающего и, в большинстве случаев, способного флуоресцировать в видимой области спектра. Одорант-связывающие белки представляют собой группу растворимых белков, секретируемых в обонятельном эпителии позвоночных и способных обратимо связывать молекулы одорантов с константой диссоциации микромолярного порядка. Несмотря на то, что FPs и ОВР принадлежат к одному архитектурному типу, структура Р-бочонка этих белков имеет существенные различия. В случае FPs Р-бочонок образован одиннадцатью антипараллельными Р-тяжами и в центре бочонка проходит а-спираль, содержащая хромофор, в то время как р-бочонок ОВР полый и образован девятью аитипараллельными Р-тяжами. Флуоресцентные белки интересны в связи с их широким использованием в клеточной биологии в качестве биологических маркеров, которые позволяют изучать динамику генной экспрессии, локализацию и транспорт белков в живых клетках и тканях. Одорант-связывающие белки представляют исключительный интерес в связи с исследованием механизмов распознавания запахов и в связи с возможностью их использования для создания биосенсоров, чувствительных к различным, в том числе, опасным (яды, взрывчатые вещества и т.п.) соединениям.

Цели и задачи исследования

Цель работы состояла в изучении особенностей процессов сворачивания-разворачивания белков, имеющих структуру типа (3-бочонка: одорант-связывающего белка из обонятельного эпителия свиньи (ОВР) и набора флуоресцентных белков, а также их мутантных рекомбинантных форм. В задачи исследования входило:

1. Изучение процессов сворачивания—разворачивания FPs и одорант-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl).

2. Определение устойчивости структуры ОВР к различным денатурирующим воздействиям.

3. Установление влияния аминокислотных замен в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка (EGFP).

4. Выяснение на примере зеленых и красных флуоресцентных белков роли четвертичной структуры в стабилизации FPs.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Белки с топологией нативной структуры типа Р-бочонка более устойчивы к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками.

2. Небольшие концентрации GdnHCl вызывают предденатурационпые локальные изменения структуры белков.

3. Четвертичная структура флуоресцентных белков EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), raRFPl (красного мономера), dimer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) не является единственным фактором, определяющим различия в их стабильности.

4. Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке влияют на возможность сворачивания, скорость сворачивания, структуру и устойчивость к денатурирующим воздействиям этого белка.

Научная новизна исследований

Установлено, что белки, имеющие топологию типа Р-бочонка, характеризуются более высокой стабильностью структуры по сравнению с глобулярными а-спиральными белками. В то же время, особенностью фолдинга FPs, по сравнению с одорант-связывающими белками, является наличие существенно более высокого энергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями этих белков. Показано, что предденатурационные концентрации GdnHCl вызывают локальные изменения микроокружения триптофанового остатка ОВР. В случае зеленого флуоресцентного белка, при небольших концентрациях GdnHCl уменьшаются напряжения, существующие в каркасе этого белка, и в этих условиях хромофор, оставаясь недоступным тушащему действию растворителя, становится более планарным, что проявляется в возрастании интенсивности флуоресценции хромофора.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты имеют важное теоретическое значение для понимания особенностей процессов фолдинга белков, имеющих различную нативнуто структуру. Данные об особенностях действия химического денатуранта GdnHCl на структуру белковой молекулы, предшествующих ее денатурации, должны учитываться в дальнейшем при исследовании процессов сворачивания—разворачивания белков.

Данные о стабильности и процессах сворачивания-разворачивания одорант-связывающего белка могут иметь практическое значение при использовании белков данного класса в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем высокой социальной значимости. Данные, полученные при изучении влияния остатка в положении 96 на структуру и стабильность зеленого флуоресцентного белка и роли четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков, могут представлять интерес для создания новых флуоресцентных биомаркеров. Новая информация о флуоресцентных характеристиках триптофанового остатка Тгр16 ОВР, полученная в данной работе, может представлять интерес для выявления взаимосвязи особенностей локализации триптофановых остатков в белке с параметрами их флуоресценции.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса кафедры биофизики СПбГПУ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Степаненко, Олеся Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Исследованные в работе белки, одорант-связывающий белок и флуоресцентные белки, с топологией нативной структуры типа Р-бочонка характеризуются более высокой устойчивостью к действию химических денатурантов и нагреванию по сравнению с глобулярными а-спиральными белками. Высота свободноэнергетического барьера, разделяющего нативное и денатурированное состояния, для флуоресцентных белков существенно превышает эту величину для одорант-связывающего белка.

2. Малые концентрации гуанидингидрохлорида вызывают локальные изменения структуры белков: изменение микроокружения триптофанового остатка в случае одорант-связывающего белка и уменьшение непланарпости хромофора в случае зеленого флуоресцентного белка.

3. Четвертичная структура является существенным, но не единственным фактором, определяющим различия в стабильности зеленых и красных флуоресцентных белков: возможно создание мономерных мутантных форм этих белков с высокой стабильностью.

4. Аминокислотные замены в положении 96 в зеленом флуоресцентном белке EGFP приводят к нарушению или замедлению процессов сворачивания белка и могут оказывать влияние на структуру и устойчивость этого белка к денатурирующим воздействиям.

5. Главной причиной агрегации молекул одорант-связывающего белка при высоких температурах является увеличение подвижности петлевых участков и, как следствие, образование неканонических ионных взаимодействий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степаненко, Олеся Викторовна, Санкт-Петербург

1. Бурштейн Э. А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.

2. Кузнецова И. М., Степаненко Ольга В., Туроверов К. К, Хуанг Ч, Ванг Ч.-Ч. 2005. Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология 47 (11): 1007-1016.

3. Кузнецова И. М., Туроверов К. К. 1998. Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология 40 (8/9): 747762.

4. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136139.

5. Поварова О. И., Кузнецова И. М, Туроверов К. К. 2005. Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания-разворачивания. Цитология 47: 935-977.

6. ПолингЛ., Полинг П. 1978. Химия. М.: Мир. стр. 683.

7. Степаненко Ольга. В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К., Скогнамиглио В., Стаяно М., ДАуриа С. 2005. Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология 47(11): 9881006.

8. Степаненко Олеся В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2007. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология 49 (5): 395-420.

9. Степаненко Олеся В., Верхуша В. В., Шавловский М. М., Алейникова Т. Д., Уверский В. Н., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. 2005. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков. Цитология 47(11): 10171027.

10. Туроверов К. К, Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология 40 (8/9): 806-817.

11. Финкелъштейн А. В. 1976. Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. I. Разрешение конформации дипептидов. Мол. Биол. 10: 507-513.

12. Финкелъштейн А. В., Птицын О. Б. 2005. Физика белка. М.: КДУ. 456 с.

13. Эфтинк М. Р. 1998. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия 63 (3): 327-337.

14. Akerstrom В., Flower D. Я., Salier J.-P. 2000. Lipocalins: unity in diversity. BBA 1482: 1-8.

15. Altschuler G. M., Klug D. R., Willison K. R. 2005. Unfolding energetics of G-a-actine: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J. Mol. Biol. 353: 385-396.

16. Ando R., Hama II., Yamamoto-Hino M., Mizuno II, Miyawaki A. 2002. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12651-12656.

17. Ando R., Mizuno II, Miyawaki A. 2004. Regulated fast nucleocytoplasmic shutting observed by reversible protein highlighting. Science 306: 1370-1373.

18. Andrews В. Т., Schoenfish A. R., Roy M., Waldo G., Jennings P. A. 2007. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. J.Mol.Biol. 373: 476-490.

19. Anfinsen С. B. 1973. Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181:223-230.

20. Axelsen P. H., Prendergast F. G. 1989. Molecular dynamics of tryptophan in ribonuclease-Tl. II. Correlations with fluorescence. Biophys. J. 56: 43-66.

21. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. 2000. Biochemistry, mutagenesis and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 11984-11989.

22. Baldaccini N. E., Gagliardo A., Pelosi P., Topazzini A. 1986. Occurrence of apyrazine binding protein in the nasal mucosa of some vertebrates. Сотр. Biochem. Physiol. B. 84(3): 249-253.

23. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissing H., Shindyalov I. N., Bourne P. E. 2000. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235-242.

24. Bhuyan А. К. 2002. Protein stabilization by urea and guanidine hydrochloride. Biochemistry. 41 (45): 13386-13394.

25. Bianchet M. A., Bains G., Pelosi P., Pevsner J., Snyder S. H., Monaco H. L., Amzel L. M. 1996. The three-dimensional structure of bovine odorant binding protein and its mechanism of odor recognition. Nat. Struct. Biol. 3(11): 934-939.

26. Bignetti E., Cavaggioni A., Pelosi P., Persaud К. C., Sorbi R. Т., Tirindelli R. 1985. Purification and characterisation of an odorant-binding protein from cow nasal tissue. Eur. J. Biochem. 149(2): 227-231.

27. Bignetti E., Damiani G., De Negri P., Ramoni R., Avanzini F., Ferrari G., Rossi G. L. 1987. Specificity of an immunoaffinity column for odorant-binding protein from bovine nasal mucosa. Chem. Senses 12: 601-608.

28. Bokman S. H., Ward W. W. 1981. Renaturalion of Aequorea Green-Fluorescent Protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101: 1372-1380.

29. Brejc K., Sixma Т. K., Kitts P. A., Kain S. R., Tsien R. Y., Ormo M., Remington S. J. 1996. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 2306-2311.

30. Bulina M. E., Chudakov D. M, MudrikN. N., Lukyanov K. A. 2002. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem. 3: 1-8.

31. Burchell B. 1991. Turning on and turning off the sense of smell. Nature 350: 16-17.

32. Burova Т. V., Choiset Y., Jankowski С. K., Haertle T. 1999. Conformational stability and binding properties of porcine odorant binding protein. Biochemistry 38: 1504315051.

33. Carrell R. W., Gooptu B. 1998. Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799-809.

34. Cavaggioni A., Findlay J. В., Tirindelli R. 1990. Ligand binding characteristics of homologous rat and mouse urinary proteins and pyrazine-binding protein of calf. Сотр. Biochem. Physiol. B. 96: 513-520.

35. Cavaggioni A., Sorbi R. Т., Keen J. N., Pappin D. J., Findlay J. B. 1987. Homology between the pyrazine-binding protein from nasal mucosa and major urinary proteins. FEBS Lett. 212:225-228.

36. Ckalfle M., Tu Y., Euskirchen G„ Ward W. W, Prasher D. C. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263: 802-805.

37. Chen Y., Barkley M. D. 1998. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry 37: 9976-9982.

38. Chudakov D. M., Belousov V. V., Zaraisky A. G., Novoselov V. V., Staroverov D. В., Zorov D. В., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2003. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat. Biotechnol. 21: 191-194.

39. Chudakov D. M., Verkhusha V. V., Staroverov D. В., Souslova E. A, Lukyanov S., Lukyanov K. A. 2004. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat. Biotechnol. 22: 1435-1439.

40. Cody С. W., Prasher D. C., Westler W. M, Prendergast F. G., Ward W. W. J993. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry. 32: 1212-1218.

41. Cormack B. P., Valdivia R. H., Falkow S. 1996. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173: 33-38.

42. Cubitt А. В., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20: 448-455.

43. Dal Monte M., Andreini 1., Revoltella R., Pelosi P. 1991. Purification and characterization of two odorant-binding proteins from nasal tissue of rabbit and pig. Сотр. Biochem. Physiol. B. 99(2): 445-451.

44. Dal Monte M., Centini M., Anselmi C., Pelosi P. 1993. Binding of selected odorants to bovine and porcine odorant-binding proteins. Chem. Senses 18: 713-721.

45. Dale R. E., Eisinger J. 1974. Intramolecular distances determined by energy transfer. Dependence on orientational freedom of donor and acceptor. Biopolymers 13: 15731605.

46. Danson M. J., Hough D. W 1998. Structure, function and stability of enzymes from the Archaea. Trends Microbiol. 6: 307-314.

47. Das P., Wilson C. J., Fossati G., Wittung-Stafshede P., Matthews K. S., Clementi C. 2005. Characterization of the folding landscape of monomeric lactose repressor: quantitative comparison of theory and experiment. PNAS 102(41): 14569-14574.

48. D'Auria S., Staiano M., Kuznetsova I. M, Turoverov К. K. 2005. The combined use of fluorescence spectroscopy and X-ray crystallography greatly contributes to elucidating structure and dynamics of proteins. Reviews in Fluorescence: 25-61.

49. Dear T. N., Campbell K., Rabbitts Т. H. 1991. Molecular cloning of putative odorant-binding and odorant-metabolizing proteins. Biochemistry 30: 10376-10382.

50. Deheyn D. D., Kubokawa K., McCarthy J. K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G. W., Holland N. D. 2007. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213:95-100.

51. Dinner A. R., Sali A., Smith L. J., Dobson С. M., Karplus M. 2000. Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment. Trends. Biochem. Sci. 25: 331-339.

52. Dobson С. M. 2003. Protein folding and misfolding. Nature 426: 884-890.

53. Dumoulin M., Dobson С. M. 2004. Probing the origins, diagnosis and treatment of amyloid diseases using antibodies. Biochimie. 86: 589-600.

54. Eckl P. M., Ortner A., Esterbauer H. 1993. Genotoxic properties of 4-hydroxyalkenals and analogous aldehydes. Mutat. Res. 290: 183-192.

55. EftinkM. R. 1994. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J. 66: 482-501.

56. Eisinger J., Feaer В., Lamola A. A. 1969. Intramolecular singlet excitation transfer. Applications to polypeptides. Biochemistry 8: 3908-3915.

57. Enoki S., Saeki K., Maki K., Kuwajima K. 2004. Acid denaturation and refolding of green fluorescent protein. Biochemistry. 43 (44): 14238-14248.

58. Fink A. L. 1998. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold. Des. 3: 9-23.

59. Flower D. R. 1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem. J. 318: 1-14.

60. Flower D. R. 2000. Experimentally determined lipocalin structures. Biochim. Biophys. Acta. 1482: 46-56.

61. Flower D. R., North A. C., Sansom С. E. 2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim. Biophys. Acta. 1482: 9-24.

62. Forster Th. 1960. Transfer mechanisms of electronic excitation energy. Rad. Res. Suppl. 2: 326-339.

63. Fukuda H., Arai M., Kuwajima K. 2000. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry 39: 12025-12032.

64. Ganni M., Garibotti M., Scaloni A., Pucci P., Pelosi P. 1997. Microheterogcneity of odorant-binding proteins in the porcupine revealed by N-terminal sequencing and mass spectrometry. Сотр. Biochem. Physiol. B. 117: 287-291.

65. Garibotti M., Navarrini A., Pisanelli A. M., Pelosi P. 1997. Three odorant-binding proteins from rabbit nasal mucosa. Chem. Senses. 22: 383-390.

66. Goers J., Permyakov S. E., Permyakov E. A., Uversky V. N., Fink A. L. 2002. Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation. Biochem. 41: 1254612551.

67. Golebiowski J., Antonczak S., Fiorucci S., Cabrol-Bass D. 2007. Mechanistic Events Underlying Odorant Binding Protein Chemoreception. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 67: 448^158.

68. Grinvald A., Steinberg I. Z. 1976. The fluorescence decay of tryptophan residues in native and denatured proteins. Biochim. Biophys. Acta 427: 663-678.

69. GrolliS., Merli E., Conti V., Scaltriti E., Ramoni R. 2006. Odorant binding protein has the biochemical properties of a scavenger for 4-hydroxy-2-nonenal in mammalian nasal mucosa. FEBS J. 273: 5131-5142.

70. Gurskaya N. G., Savitsky A. P., Yanushevich Y. G., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2001. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem. 2: 6.

71. Hajjar E., Perahia D., Debat H„ Nespoulous C., Robert С. H. 2006. Odorant Binding and Conformational Dynamicsin the Odorant-binding Protein. J. Biol. Chem. 281 (40): 29929-29937.

72. Herent M. F., Collin S., Pelosi P. 1995. Affinities of nutty and green-smelling compounds to odorant-binding proteins. Chem. Senses 20: 601-610.

73. Hubbard S. J., Campbell S. F., Thornton J. M. 1991. Molecular recognition. Conformational analysis of limited proteolytic sites and serine proteinase protein inhibitors. J. Mol. Biol. 220: 507-530.

74. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. 1996. VMD: visual molecular dynamics. J. Molec. Graphics 14: 33-38.

75. Ikematsu M., Takaoka D., Yasuda M. 2005. Odorant binding initially occurring at the central pocket in bovine odorant-binding protein. BBRC 333: 1227-1233.

76. Jablonski A. 1957. Decay of fhotoluminescence of solutions. Acta Phys. Polon. 16: 471-479.

77. John T. R. and Radford S. E. 2005. The Yin and Yang of protein folding. FEBS J. 272: 5962-5970.

78. Johnson F. H., Shimomura O., Saiga Y., Gershman L. C., Reyholds G. Т., Waters J. R. 1962. Action of cyanide on Cypridina luciferin. J. Cell. Сотр. Physiol. 60: 85-104.

79. Kabsch W., Sander C. 1983. Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen bonded and geometrical features. Biopolymers 22: 25772637.

80. Kumar S., Nussinov R. 1999. Salt bridge stability in monomeric proteins. J. Mol. Biol. 293:1241-1255.

81. Kuznetsova I. M., Stepanenko Olga V., Turoverov К. K., Zhu L.,. Zhou J.-M., Fink A. L., Uversky V. N. 2002b. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase. Biochem. Biophys. Acta. 1596: 138-155.

82. Kuznetsova I. M., Turoverov К. K., Uversky V. N. 2004. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates. J. Proteome Res. 3: 485^194.

83. Labas Y A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., Matz M. V. 2002. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 4256-4261.

84. Levinthal C. 1968. Are there pathways for protein folding? J. Chim. Phys. 65: 44-45.

85. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. 2001. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Model. 7: 306-317.

86. Loebel D., Marchese S., Krieger J., Pelosi P., Breer H. 1998. Subtypes of odorant-binding proteins: heterologous expression and assessment of ligand binding. Eur. J. Biochem. 254:318-324.

87. Lobel D., Jacob M., Volkner M., Breer H. 2002. Odorants of Different Chemical Classes Interact with Distinct Odorant Binding Protein Subtypes. Chem. Senses 27: 39-44.

88. Maddalo S.L., Zimmer M. 2006. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochem. Photobiol. 82: 367-372.

89. Magert H. J., Hadrys Т., Cieslak A., Groger A., Feller S., Forssmann W. G. 1995. cDNA sequence and expression pattern of the putative pheromone carrier aphrodisin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 2091-2095.

90. Marchese S., Pes D., Scaloni A., Carbone V., Pelosi P. 1998. Lipocalins of boar salivary glands binding odours and pheromones. Eur. J. Biochem. 252: 563-568.

91. Marquardt D. W. 1963. An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters. J. Soc. Indust. Apl. Math. 11: 431-441.

92. Marinari U. M, Ferro M., Sciaba L., Finollo R., Bassi A. M., Brambilla G. 1984. DNA-damaging activity of biotic and xenobiotic aldehydes in Chinese hamster ovary cells. Cell Biochem. Funct. 2: 243-248.

93. Merritt E. A., Bacon D. J. 1977. Raster3D: Photorealistic molecular graphics: Methods Enzymol. 277: 505-524.

94. Mishin A. S., Subach F. V., Yampolsky I. V., King W., Lukyanov K. A., Verkhush V.V. 2008. The First Mutant of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein That Forms a Red Chromophore. Biochemistry. Published online 27.03.2008.

95. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., Miyawaki A. 2001. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry. 40: 2502-2510.

96. Nolting B. 1999. Protein Folding Kinetics. In Biophysical Methods, pill, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg.

97. Ormo M., Cubitt А. В., Kallio K., Gross L. A., Tsien R. Y, Remington S. J. 1996. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science. 273: 1392-1395.

98. Pace C. N. 1986. Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. Methods Enzymol. 131: 266-280.

99. Pan C. P., Barkley M. D. 2004. Conformational effects on tryptophan fluorescence in cyclic hexapeptides. Biophys. J. 86: 3828-3835.

100. Pan C. P., Callis P. R., Barkley M. D. 2006. Dependence of tryptophan emission wavelength on conformation in cyclic hexapeptides. J. Phys. Chem. B. 110: 70097016.

101. Pande V. S., Grosberg A. Yu., Tanaka Т., Rokhsar D. S. 1998. Pathways for protein folding: is a new view needed? Curr.Opin.Struct.Biol. 8: 68 79.

102. Paolini S., Tanfani F., Fini C., Bertoli E., Pelosi P. 1999. Porcine odorant-binding protein: structural stability and ligand affinities measured by Fourier-transform infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy. BBA 1431: 179-188.

103. Parisi M., Mazzini A., Sorbi R. Т., Ramoni R., Grolli S., Favilla R. 2003. Unfolding and refolding of porcine odorant binding protein in guanidinium hydrochloride: equilibrium studies at neutral pH. Biochim. Biophys. Acta. 1652: 115-125.

104. Patterson G. H., Lippincott-Schwartz J. 2002. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 13: 1873-1877.

105. Pelosi P., Baldaccini N. E., Pisanelli A. M. 1982. Identification of a specific olfactory receptor for 2-isobutyl-3-methoxypyrazine. Biochem. J. 201(1): 245-248.

106. Permyakov E. A., Yarmolenko V. V., Emelyanenko V. I., Burstein E. A., Closset J., Gerday C. 1980. Fluorescence study of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

107. Pes D., Dal Monte M., Ganni M., Pelosi P. 1992. Isolation of two odorant-binding proteins from mouse nasal tissue. Сотр. Biochem. Physiol. B. 103(4): 1011-1017.

108. Pes D., Mameli M., Andreini I., Krieger J., Weber M., Breer H., Pelosi P. 1998. Cloning and expression of odorant-binding proteins la and lb from mouse nasal tissue. Gene. 212(1): 49-55.

109. Pes D., Pelosi P. 1995. Odorant-binding proteins of the mouse. Сотр. Biochem. Physiol. В 112: 471-479.

110. Petersen J., Wilmann P. G., Beddoe Т., Oakley A. J., Devenish R. J., Prescott M., Rossjohn J. 2003. The 2.0-A crystal structure of eqFP611, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J. Biol. Chem. 278: 44626-44631.

111. Pevsner J., Нои V., Snowman A. M., Snyder S. H. 1990. Odorant-binding protein. Characterization of ligand binding. J. Biol. Chem. 265(11): 6118-6125.

112. Pevsner J., Hwang P. M„ Sklar P. В., Venable J. C., Snyder S. H. 1988. Odorant-binding protein and its mRNA are localized to lateral nasal gland implying a carrier function. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85(7): 2383-2387.

113. Pevsner J., Snyder S. H. 1990. Odorant-binding protein: odorant transport function in the vertebrate nasal epithelium Chem. Senses 15: 217-222.

114. Pevsner J., Trifiletti R. R., Strittmatter S. M., Snyder S. H. 1985. Isolation and characterization of an olfactory receptor protein for odorant pyrazines. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82(9): 3050-3054.

115. Plotkin S. S., Onuchic J. N. 2002. Understanding protein folding with energy landscape theory. Part I: Basic concepts. Quart. Rev. Biophys. 35: 111-167.

116. Prasher D. C., Eckenrode V K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. 1992. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. Ill: 229233.

117. Prendergast F. G., Mann K. G. 1978. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea. Biochemistry. 17: 3448-3453.

118. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A. J., Dove S, Hoegh-Guldberg O., Devenish R. J., Rossjohn J. 2003. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure. 11: 275-284.

119. RamoniR., Vincent F., Ashcroft A. E., Accornero P., Grolli S., Valencia C., Tegoni M., Cambillau C. 2002. Control of domain swapping in bovine odorant-binding protein. Biochem. J. 365: 739-748.

120. Reid B. G., Flynn G. C. 1997. Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry. 36: 6786-6791.

121. Remington S. J., Wachter R. M., Yarbrough D. K., Branchaud В., Anderson D. C., Kallio K., Lukyanov K. A. 2005. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry. 44: 202-212.

122. Schofield P. R. J988. Carrier-bound odorant delivery to olfactory receptors. Trends Neurosci. 11: 471-472.

123. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans В. N., Palmer A. E., Tsien R. Y. 2004. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22: 1567-1572.

124. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. 2005. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2: 905-909.

125. Shu X., Shaner N. C, Yarbrough C. A., Tsien R. Y, Remington S. J. 2006. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry 45: 96399647.

126. Singer A. G., Macrides F. 1993. Composotion of an aphrodisiac pheromone. Chem. Senses 18: 630.

127. Staiano M., D'Auria S., Varriale A., Rossi M., Marabotti A., Fini C., Stepanenko Olesya V., Kuznetsova I. M., Turoverov К. K. 2007. Stability and dynamics of the porcine odorant-binding protein. Biochemistry. 46(39): 11120-11127.

128. Steinberg I. Z. 1971. Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy in proteins and polypeptides. Ann. Rev. Biochem. 40: 83-114.

129. Stepanenko Olesya V., Verkhusha V. V., Shavlovsky M:M., Kuznetsova I. M., Uversky V. N., Turoverov К. K. 2008b. Understanding the role of Arg96 in structure and stability of green fluorescent protein. Proteins. Published online 09.05.2008.

130. Szabo A. G., Faerman C. 1992. Dilemma of correlating fluorescence quantum yields and intensity decay times in single-tryptophan mutant proteins. Proc. SPIE 1640: 7080.

131. Tcatchoff L., Nespoulous C., Pernollet J. C., Briand L. 2006. A single lysyl residue defines the binding specificity of a human odorant-binding protein for aldehydez. FEBS Lett. 580:2102-2108.

132. Tegoni M., Ramoni R., Bignetti E., Spinelli S., Cambillau C. 1996. Domain swapping creates a third putative combining site in bovine odorant binding protein dimer. Nat. Struct. Biol. 3(10): 863-867.

133. Tsien R. Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544.

134. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. 2005. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6: 233-238.

135. Turoverov К. K, Kuznetsova I. M., Zaitzev V. N. 1985. The environment of the tryptophan residue in Pseudomonas aeruginosa azurin and its fluorecsence properties. Biophys. Chem. 23: 79-89.

136. Turoverov К. K, Kuznetsova I. M. 2003. Intrinsic fluorescence of actin. J. Fluorescence 13: 41-57.

137. Utsumi M., Ohno K., Kawasaki Y, Tamura M., Kubo Т., Tohyama M. 1999. Expression of major urinary protein genes in the nasal glands associated with general olfaction. J. Neurobiol. 39: 227-236.

138. Verkhusha V. V., Chudakov D. M., Gurskaya N. G., Lukyanov S. A., Lukyanov K. A. 2004. Common pathway for the red ehromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chcm. Biol. 11: 845-854.

139. Verkhusha V. V, Kuznetsova I. M., Stepanenko Olesya. V., Zaraisky A. G., Shavlovsky M. M., Turoverov К. К, Uversky V. N. 2003. High Stability of Discosoma DsRed as Compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 42: 7879-7884.

140. Verkhusha V. V, Otsuna H., Awasaki Т., Oda H., Tsukita S., Ito K. 2001. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276: 29621-29624.

141. Verkhusha V V, Sorkin A. 2005. Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem. Biol. 12: 279-285.

142. Vieille C., Zeikus G. J. 2001. Plyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43.

143. Vincent F., Ramoni R., Spinelli S., Grolli S., Tegoni M., Cambillau C. 2004. Crystal structures of bovine odorant-binding protein in complex with odorant molecules. Eur. J. Biochem. 271(19): 3832-3842.

144. Vincent F., Spinelli S., Ramoni R., Grolli S., Pelosi P., Cambillau C., Tegoni M. 2000. Complexes of porcine odorant binding protein with odorant molecules belonging to different chemical classes. J. Mol. Biol. 300(1): 127-139.

145. VisserN. V, HinkM. A., Borst J. W„ van der Krogt G. N., Visser A. J. 2002. Circular dichroism spectroscopy of fluorescent proteins. FEBS Lett. 521: 31-35.

146. Vivian J. Т., Callis P. R. 2001. Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins. Biophys. J. 80: 2093-2109.

147. Ward W. W., Bokman S. H. 1982. Reversible denaturation of Aequorea Green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 21: 4535-4540.

148. Ward W. W., Cormier M. J. 1979. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. J. Biol. Chem. 254: 781-788.

149. Ward W. W, Prentice H. J., Roth A. F„ Cody C. W., Reeves S. C. 1982. Spectral Perturbations of the Aequorea Green-Fluorcscent Protein. Photochemistry and Photobiology 35: 803-808.

150. Weber W., Helms V., McCammon J. A., LanghoffP. W. 1999. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 6177-6182.

151. Wiedenmann J., Ivanchenko S., OswaldF., Schmitt F., Rocker C., SalihA., Spindler K. D., Nienhaus G. U. 2004. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 15905-15910.

152. Wood Т. I., Barondeau D. P., Hitomi C., Kassmann C. J., Tainer J. A., Getzoff E. D. 2005. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. Biochemistry 44: 16211-16220.

153. Yarbrough D., Wachter R. M., Kallio K., Matz M. V., Remington S. J. 2001. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 462-467.

154. Zimmer M. 2002. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chem. Rev. 102: 759-781.

155. Zuker M., Szabo A. G., Bramall L., Krajcarski D. Т., Selinger B. 1985. The delta function convolution method (DFCM) for fluorescence decay experiments. Rev. Sci. Instrum. 56: 14-22.136^

156. Хочу также выразить благодарность моей семье за постоянную поддержку, заботу и терпение.

Информация о работе

Степаненко, Олеся Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы