Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы индукции неспецифической цитотоксичночти и полиферации лимфоцитов крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Процессы индукции неспецифической цитотоксичночти и полиферации лимфоцитов крыс"

САНКТ-НЕТЕРЕУРГСКйИ ГОСУДАРСТЕЕЕНЫЯ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи АНЕСЕЮВ Андрей Григорьегкч

ПРОЦЕССЫ ИНДУКЦИИ ВЕСПЕЦИЗЙЧЕСКОЯ ДЙТОТОКГЕЧЮСТИ И ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИ1ЙОЩ1ГОВ КРЫС

Специальность 03.00.01 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степей: кандидата биологических наук

—-У

; ; Р-У!

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена на кафедре биологической и органической хи-учи и биотехнологии Петрозаводского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор. Болотников

академик 11АВЭБ, заслухенный деятель Игорь Алексеевич

науки Республики Карелия

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки России, доктор биологических наук, профессор Поляк Рут Яковлевна; Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Гончарова Валентина Павловна.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины.

Занята состоится " "_199 г. г 16 часов на

заседании Специализированного совета К.06&57.09. по присуждения ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Штербургском государственном университете ш адресу: 199034, Санкг-Пэтербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. АЛГорь-кого Санкг-ШтерОургского университета. _

Автореферат разослав -А99 4 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета АТ.Ыарков

-з-

лктулльохть ТЕШ. Изучение процессов аскзадаи лймфсидаьк клеток является в настоящее время одной из наиболее динамичных отраслей биохимии и иммунологии. После открытия в середине 70-х годов ключевого лимфсцитарного ростового фактора- интерлейкина-2 (ИЛ-2) стало очевидным, что ростовая активность Т-клеток и целого ряда других субпопуляций лимфоцитов непосредственно контролируется пэ прямыми межклеточными взаимодействиеми, а растворимыми медиаторами, в частности, ИЛ-2 (Smith К.А.,1933). Несколько позднее было найдено, что инкубация лейкоцитов периферической крови (ЛПК), а также лимфоцитов, изолированных из самых разных источников, в том числе костного мозга и тимуса с ИЛ-2, способна сущэст-Венно усилить их нэрестриктированнув по антигенам главного комплекса гистосовместимости цитолитическую активность (НЦТ) против опухолевых и вирус-инфицированнья клеток-мишеней (КМ) (Qwen-Schaub LB. et al., 1987; Bailas Z.K. et al., 1990), к числу которых относятся как клетки свежеизолированных опухолей, так и трансформированные иммсрталиэованныэ линии.

Указанная активность не возникает исключительно в ответ на ИЛ-2, поскольку НЦТ в норме обладают неактивированные экзогенными стимулами естественные киллернье клетка (ЕКК) человека и животных (Семененя И.Е, 1991). В работах целого ряда авторов (Rocsnek Е. et al., 1988; Procopio AD.G. et al., 198Э) показано, что лизис опухолевых КМ ЕТГ-эффекторами, равно как и процессы, происходящее в нативных и активированных ЕКК и Т-лимфоцитах при ЕКК (Т)/КМ-взаимодействии, тесно связаны с активзционными событиями, которые наблюдаются при стимуляции указанных клеток агентами (форбоямиристатацэтаг (СНА), некоторые листаны и могкжлонзльные антитела), стимулирующими протеинкиназу С (ПЕС). Известно несколько типов вторичных посредников, которые участвуют в передаче активацконного сигнала от плазматической мембраны в ядро клеток, в частности, ткрозиновые и серин/треоншшъе протеккккнагы, Г'ГФ-связывающие белки (б-белки), Са+и ряд других (Alexander D.R. et al., 1989; Meuer S. et al., 19S9). Езаимооткошения мзиду ними . представляют интерес с гота греши потенциальных возможностей регуляции теми внутриклеточными процессами, за активацию (подавление) которое и отвечают указанные посредники. Баяне» значение здесь имеет несколько теоретических и прикладных аспектов. В частности, относительно изло известно о существ? тех гапускаБшлх (триггеркнх) механизмов, которуэ вовлекается при икдукпк: НЦТ-ак-тивности в ответ на стимуляторы мптогз (ИЛ-2, ИЛ-4) и роркн клеток. Н послортги откосятся агенты, якпгдируицне ГИДРОЛИЗ

фосфзп1Д1Ш1Козэтолфосфатоз с поельдумцпй стимуляцией протеинкина-вы С.

С другой стороны, повышение цитолитической а.сгивности лимфоцитов (равно как и иэбирательности лизиса) против опухолевых клеток является актуальной задачей в онкологии. Работы в этом направлении связаны, прежде всего, с разработкой так называемого метода адоптивной иммунотерапии с ИЛ-2 (БГйггу ЯМ еЬ а1., 1991). Наконец, еще одна проблема, имеюцая отношение также и к клинической практике, состоит в изучении роли митотического деления клеток в ответ на КЛ-2 для процесса усиления НЦТ-активности в ответ на этот же ростовой фактор.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

ОСЮВНАЯ ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении активности 101-2 как ростового фактора и его способности усиливать лизис оцухолевых клеток зффекторнымн лимфоцитами, опосредованные, возможно, через разные механизма

В этой связи в задачи исследований входило:

1. Определить условия индукции

неспецифической цитотоксичности и пролиферации в ответ на ряд стимуляторов с известным механизмом активации клеток, в которых оба указанных эффекта проявляются неодновременно.

2. С помощью ингибиторов транскрипции и синтеза белка найти такие условия, концентрации ингибиторов, лри которых наблюдалось бы дифференциальное влияние только на одну из активностей (митоз или лизис опухолевых клеток мишеней).

3. Попытаться установить с использованием ряда стимуляторов ГТФ-евязывакщх белков участие этой группы внутриклеточных посредников в какой-либо одной или обоих активностях ИЛ-2 (рецептора к ИЛ-2): пролифератианой и индуцирующей ЩТ-активность.

4. Изучить возможность диссоциации двух указанных активностей ИЛ-2 в условиях подавления активности протеиккиназы С.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Еперзые экспериментально на лимфоцитах крыс показана возможность диссоциации пролиферативной и НПТ-индуцирую-вдэй активностей ИЛ-2. Предложен механизм указанной диссоциации, основанный на разобщении возможной связи рецептора к ИЛ-2 и про-теинкинэзы С (ПКС). Анализ эффектов константного активатора ГТФ-свягкзаюидх белков (А1Гу ) совместно с ИЛ-2 дает основания предположить АЩ -•■^•встаательного в спооредовзиии

такой сглэа. 06н5рр»кэ р<ггг:оэ в гфф-гигах ФМА а стаурсс-

п:;ина, ;евк!чсгачкмс для подазлешажагггэстп Ш53, кз проли&-риц'.'.и у,--.с;е!:-.'.1> НцТ и условиях ку>;ьг.:-;1г>0!'чния лимфоцитов о

- б -

ил-г.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ ¡заключается в углубленном изучении эффектов ИЛ-2 на лимфоциты в тех экспериментальных условиях, которые используются для лечения ряда онкологических заболеваний. Шлученные результата могут Сыть использованы в исследовании механизмов активируицэго действия ИЛ-2 на молекулярном уровне и при совершенствовании метода адоптивной иммунотерапии с ИЛ-2.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Материалы диссертации доложены и обсуждены:

1. На конференциях молодых ученых Карельского научного центра РАЯ, 1992- 1994 rjv,

2. На 5-ой Межгосударственной Межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (СПб., 1933 г.);

3. На 1-ом Всемирном конгрессе по иммунореабилитации (Дагомыс, 1994 г.).

ГОЖЖЕНИЯ, ЕЫНХИШЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Анализ временных и дозовых зависимостей стимуляции лимфоцитов крыс лектинами и ИЛ-2, наряду с использованием ингибиторов транскрипции и синтеза белка указывает на различие механизмов, индуцирующих пролиферацию и усиление НЦТ-активности.

2. Данные по модуляции активности ГТФ-связывающих белков предполагает наличие ассоциированного с рецептором к ИЛ-2 G-бел-ка, вовлеченного в регуляцию НЦТ-активности в ответ на ИЛ-2.

а Использование модуляторов активности ПКС (фсрболмиристат ацетата и стауроспорина) позволяет продемонстрирозать возможность диссоциации пролиферативной и НЦТ-индуцирувщей активности ИЛ-2.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Содержание работы изложено на страницах машнописного текста, включая 13 таблиц и /5" рисунков. Диссертация содержит введение, обзор литературы, включающий современные сведения по механизмам активации Тлимфоцитов и ЕКК, индукции пролиферации и неспецифической цитотсксичкости меток. Далее следуют раздэл, в котором изложены материалы и методы исследования и раздел'результатов и их обсуждения. ПЬследгий содержит 3 главы, разделенные ка подглавы, в которых последовав .:-лыта преда- . тзвлен фактический материал а анализ экспэржжзльных данных. Завершает работу гакиданиэ, еизодн и азкок литературы, вклачаи-иий 20 отечестггких и 152 гзрус*мых кстсчктка.

2. г:0ЕС!ЕЕКН1Е г;7СЛ?.ЛСВД1К.1 0.1. илГЕРИАОг и ¡членя и-елг-руиггд.

1. В работе использованы самцы крыс породы "Вистар" весом 200250 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе.

2. а) Получение суспензии спленоцитов крыс. Селегею® отбирали асептически и помещали в среду 199 при комнатной температуре. Суспензию одиночных клеток получали измельчением селезенка ножницами и продавливанием фрагментов через стальную'сеточку в той же среде. Клетки отмывали 2 раза средой 199, эритроциты лидировали дистиллированной водой (в течение 15 секунд), оставшиеся лейкоциты отмывали 2 раза средой 199 и держали на холоду (+2-4° С) до использования.

0) Получение суспензии тямоцитов крыс. Тимусы отбирали асептически, измельчали ножницами и продавливанием через стальную сеточку получали суспензию одиночных клеток. Тимоциты отмызали 2 раза средой 199 и держали на холоду (+2-4° С) до использования.

Я Определение численности жизнеспособных клеток проводили с использованием теста с трилансвым синим.

4. Определение уровня синтеза ДНК (показатель пролиферации клеток) проводили по методу (Lesourd В., 1986) с использованием3!! -тимидина. Данные представлены либо непосредственно в абсолютных величинах, либо в индексах стимуляции (ИС), рассчитанных по формуле: ИС= опыт/контроль; где опыт - имп/мин из культур лимфоцитов со стимулятором, контроль - ими/мин из культур лимфоцитов без стимулятора. Все культуры клеток ставились в 3-4 параллелях.

Определение уровней синтеза РНК и белка проводили аналогично с использованием ^-уридинз и3Н-лиз;ша, соответственно.

5. Определение неаицифичэской цитотоксичности. Клетки-мишени (КМ). В качестве КМ использовали клетки шейной опухолевой линии УАС-1. ЛИкия поддерживалась в полной питательной среде (ПС) следущэго состава: 80 Т. RPMI 1640, 10 7. ЭТО, 2 мМ L-глютаминн, 5

-У

х 10 И 2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл бенгилпенициллина, 100 мкт/мл стрептомицина сульфата (среда для НЦТ). Для проведения ЩТ-теста использовали суспензии YAC-1 с жизкесиоссбноетыо вше SO X. Учение YAC-1, подготовку клеток-эффекторов (КЗ) и постановку НЩ-теста проводили по Сорокину А.И. и соавт. (1991). Цитотокси-ческий индекс (Щ1, %) рассчитывается по формуле: ЦК=(1-огнг/кскгрозь) х 100 Z ; где опыт - »ап/ктн из культур КЗ +КЛ! (УАС-1); контроль - ют/км иг культи, еодггиздх только KM (YAC -1). ' '

t. j .с! íгг*.оu^j* < i gwú?i/í i* /ел*с®". a i.'с ü . л.0 ь iío методу CPrOwO/>íO Г-'Ш с исп(т*<па::л?м ^H-ií/.oh:ío -

аитола.

? Обработку клеток A1FV~ проводили по методу (Anderson N.Q. et al., 1991).

8. Обработка сапскиком/ГТФ. Есе операции проводятся на холоду (4°С) а среде кем (14D ияМ KCl, 0,01 мМ СаС12, 3 мМ 1^С12). Инкубацию с сапонином (30 мкг/мл) осуществляли в течение 20 мин. Затем после отмывания средой КСМ клетки инкубировали еще 20 мин с ГТФ (ATffl, УТФ, ЦТФ) 1-100 мкМ и отмываются 2 раза средой ЮЖ

22. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В первой серии экспериментов с использованием лектинов КонА, VGA, а также ИЛ-2 изучили временные и дозовые зависимости активации клеток указанными агентами. Пролиферация спленоцитов и тимо-цитов крыс в ответ на КонА (2,5-40 мкг/мл) демонстрировала кривую дозовой зависимости, имеющую колоколообрааный характер. Наоборот, внесение в культуру крысиных спленоцитов ША (5-80 мкг/мл) приводило к снижеюпо уровней синтеза ДНК, по сравнению с неегймулиро-ванным контролем.

Исходя из того, что КонА и МЗА индуцирует целый ряд сходных внутриклеточных активационных событий, вклвчащих гидролиз фэсфа-тидклинозитолфосфатов, активацию ШС, синтез и секрецию ИЛ-2, но ША блокирует рецепцию ИЛ-2 (Kawakarai К. et al„ 1983), предположили, что эффекты КонА и ША на модуляцию ВДГ на протяжении часов и дней культуры могут Сыть рассмотрены с точки зрения влияшия эн-догенно-пргдуцированного ИЛ-2. Различия в эффе.стах на НЦТ КпнА и W3A могли Сы указывать на наличие (отсутствие) активности ШГ-2, если последняя, как выше указано, блокируется в присутствии YEA.

Предварительно была изучена динамика синтеза ДНК лимфоцитами крыс в ответ на ИЛ-2. С испольрованием макрокультур (объемом 1 мл) нашли, во-первых, что тиыоциты достигают раньше пика пролиферации (3-5 сутки) по сравнению со сгшеноцитами (5-7 сутки). Во-вторых, присутствие ИЛ-2 в культуре крысиных спленоцитов необходимо а течение двух-трех суток, после чего ростовой фактор из культуры молет быть удален без существенной потери включения лН-тиикдана еие через 4 суток в культуре беь ИЛ-2 (рис. 1). Последнее, как мы полагаем, указывает на то, что для полного вовлечения (рекрутирования) в ответ на КЛ-2 клеток в культуре требуется по времени более 24 часов инкубации с ростоеым фактором.

Влияние лектиксв ка ксдулгцкю !ЩГ спленоцитов крыс харагсге-

t\'?!jnt!2 пгаитм^ти ппа^личллшгч r»i т)л„плпт11 гс *r»w гЛ

^лиоисали^и Cjic/^y лл^гпуш Du к&увал, j r^ocvinaui сч^л^ла

КонА имел очзгядггй ЕкфагнцЯ характер. Küj>опсоу время (< 4 часов)

инкубации клеток с лектином, либо внесение этого агента (5 мкг/ мл) в момант старта ИЦТ-теста усиливало логическую активность спленоцитов против YAC-1. Увеличение времени инкубации до 16-42 часов оказывало ингибирукхцее влияние. Обработка клеток (fc-D-метил-маннозидом (после 4-часовой инкубации с КонА), который связывает лектин, не отменила усиливающее действие КонА.

Во-вторых, W3A во всех вариантах обработки клеток (преинку-бация, внесение в момент старта ВДГ-теста) достоверно не модулировал НЦТ-активности. Отметим наличие тенденции к усилению НЦТ, особенно при низких соотношениях КЗ: ИХ Не исключено, что именно эта тенденция может указывать на сходный эффект двух лектинов, если оба они индуцируют активацию клеток (ЕКК); тогда как нарушение функционального КЛ-2/ИЛ-2р-взаимодействия в присутствии W3A может существекно снижать усиление НЦТ WBA-активированных клеток]. Известно, что экспрессия ИЛ-2р на ЕКК важна для поддержания нормальных величин НЦТ-активности даже в отсутствие регистрируемых уровней эндогенного ИЛ-2. С другой стороны, КонА и W3A опосредуют пассивную адгезию клеток за счет связывания гликопротеидов на мембранах противоположных клеток. Поэтому, различие в аффектах КонА и VGA (на НЦТ) может быть обусловлено либо способностью КонА индуцировать активациокные события, которые не затрагиваются в клетках в ответ на W3A, либо последний может блокировать рецептор -противорецепгорные взаимодействуй КЭ и KU, которые отвечают за индукцию лизиса YAC-1. Отметим, что в обоих случаях причина должна лежать в разной специфичности лектинов, свяаюаювдпсся с различными сахарами (D-манноза - для КонА, N-ацетклглюкозамин - для WGA (Луцик ИВ. и др., 1981)) и, по-видимому, гликопротеидами плазматических мембран.

Если за эффект усиления НЦТ в ответ на ряд стимулов отвечают сходные механизмы (например, гидролиз фосфатидилинозитолфосфатов и стимуляция ПКС), то не исключено, что временные зависимости указанного эффекта, полученные с использованием разных стимуляторов, могут быть сходны. Сорокадвухчасовая обработка слленоцитов крыс высокими концентрациями ИЛ-2 показала усиление литической активности против YAC-1. Более того, что 4-часовая предобработка тех же клеток ИЛ-2 показала тенденцию к усилению НЦТ. Различная временная кинетика модуляции литической активности в ответ ка КонА и Ш-2 указывает на то, что продукция эндогенного ИЛ-2 в 42-часовшс культурах не способна обратить эффект КонА.

Регистрируемые уровни синтева ДНК при стимуляции сплрноцитов ИЛ-2 (d rtyjimypax объемом 0,2 мл) наблюдаются на 3 сутк»; после

инициации культур. Наоборот, очинённые стимуляции CD3" ЕКК (БГЛ), нефракционироваяныэ ЛПК человека (Ramsdell et al., 1987), либо мышиные сгиеноциты (Garni-Wasmer et al., 1990) демонстрируют усиление НЦТ в ответ на 1-2-чаровую (и более) обработку клеток ЯЯ -2. Поэтому, не исключено, что эффект усиления НЦТ в культурах Ш -2-обработанньж спленоцитоз кз является результатом пролиферации клеток (синтеза ДНК) в ответ на тот же стимулятор и, по-видимому, не зависит от активации тех сигнальных механизмов, которые отвечают за индукцию синтеза ДНК.

Для йЯ-2-обработанных тимоцитов крыс наблюдается иная зависимость. Увеличение литической активности здесь обнаруживается не раньше, чем на 3-5 сутки после инициации культур (синтез ДНК - на 2-3 сутки), что, по суо/эству, указывает как на низкую долю среди общэй популяции тимоцитов НЦТ-активных клеток (ЕКК), так и на то, что наряду с созреванием эффекторов НЦТ требуется пролиферация клеток только для того, чтобы увеличилась их абсолютное (и относительное) количество. Отметим, что исходное уровни НЦТ тимоцитов очень низки (5-10 X).

Ингибиторный анализ пролиферации и индукции неспецифической цитотоксичности в спленоцитах. Использование ингибиторов транскрипции и синтеза белка дало следующие результаты. Возрастающие концентрации актиномициьа D (AktD; 0,1-10 мкг/мл) дозо-зависимо ангибировали синтез ДНК, РНК, белка; но та кшцентравдя (10 мкг/мл) кз изученных, которые вызывала максимальный ингибиторный эффект, (соответственно на 92,4 X, 91,3 X и ГО,7 X) существенно не влияла на HUT спленоцитов крыс в условиях 2-часовой предобработки клеток. Эффект варьировал, причем при разных соотношениях КЭ : КМ (6.1— 25:1? наблюдалось как подавление, так и активация НЦТ в опытных пробах относительно контроля. Принципиально сходные результаты получены и с использованием циклогексимида (ЦГ). Последний в концентрациях 1— 100 мкг/мл на 63-72 X подавлял синтез белка в спленоцитах крыс, однако дозовой зависимости не было обнаружено. Наоборот, 1— 100 мкг/мл ЦГ показали возрастаний эффект подавления !ШТ относительно контроля в условиях присутствия в культуре в течекке всего времени НЦТ-теста. Вместе с тем, снижение НЦТ здесь не вытекает (как следствие) из специфической ии-гибиторной активности ЦТ, поскольку 1— ICO мкг/мл ЦТ не показали дозовой зависимости на синтез белка. Наоборот, токсичность ингибитора на жизнеспособность YAC-1 нарастала параллельно с возрастанием концентраций ЦГ. ГЬ-зтсэд', ¡^ляс полагать, что подавление

синтеза белка в гжлтии 1 и 100 мкг/мл ЦТ суиественяо ш сни-

jjust НЦТ# тсгдз кок дооссоья 32в»1с«1х»с/с7й л1ггич£сксй активности от концентрации ЦТ может Сыть обусловлена токсичностью высоких концентраций ЦР для YAC-1. Еажый вывод, который следует из результатов инкйитсркого анализа, состоит в том, что глубокое подавление синтетических процессов в КЭ существенно не отражается на исходных величинах Цй, если указанная обработка не отстоит больше, чем на 2 часа от момента инициации НЦТ-теста и, следовательно, указывает на то, что механизмы в КЗ, вовлеченные в экспрессию НЦТ-активности, ассоциированы с плазматической мембраной и существенно не нуждаются в синтезе ДНК (РНК, белка). Наоборот, поддержание (обновление) ферментных систем, участвующие в реализации ВДГ, требует наличия указанных синтетических процессов.

Эффекты А1Рч~на пролиферация и индукцию неспецифической цито-токсичности в крысиных лимфоцитах. А1Гч"является константным активатором G-белков, поскольку он может встраиваться на место У-фос-фата в молекуле ГДФ, связанной с oi-субъединицей (3-белка. Предполагается, что Ш1-2р можй" индуцировать активацию ПКС за счет ассоциированного с ним Б-белка. Отметим, что известной каталитической функцией, которая активируется в ответ на Ш1-2/ИЛ-2р-взаи-модействие, является тирозин-киназкая активность. Последняя может отвечать либо за пролиферативное действие ИЛ-2, либо наряду с вероятным В-белком, служить промежуточным посредником между ИД-2р и ПКС. Если активация ПКС индуцирует (сопровождает) усиление, либо поддержание НЦТ-активности (Howcroft Т.К. et al., 1991), а ИЛ-2р опосредует усиление НЩ через активацию ПКС, то разобщение ИЛ-2р и ассоциированного с ним вероятного Б-СЧдка должно сопровождаться снижением ВДТ. Помимо этого, возможны вторичные эффекты, обусловленные активацией аденилат-циклаа и повышением внутриклеточных уровней цАКЕ» (за счет действия AlF^"). В нашх экспериментах получены следующие-результаты. Обработка свежеизолированных сплеюци-тов AlFf снидала НЦТ-активность. Если клетки (спленоциты) были преинкубированы в течение 19 часов , с Кона (5 мкг/мл) для индукции высокоаффинных ИЛ-2р, то обработка указанных клеток АП^Гзначимо снижала НЦГ при последующей 4-часовоЯ инкубации с 200 ед/мл ИЛ-2. Эффект не наблюдается для контрольных спленоцитов, преинкубиро-ванных в ПЗ 19 часов. Эти результаты могут указывать на эффект разобщения ШЬ2р и ассощшрованного (3-белка; однако, чтобы исключить побочные влияния сверхпродуцированшго цАМФ в ответ на A1FV~, мы попытались добиться активации Б-белков с помощью экзогенного •ГТФ, проникшего в клетки через сапонин-ичдуцировакные пера. 05ра-Сотку клеток сапонином в среде КСМ проводили, как указано вше, на

холоду (2-4° С) для уменьиэния токсических влияний этих агентов (среда КСМ, сапонин, ГТФ). Установлено, что эффект ГТФ, проникав-

гon i* ялшяг пцптипп глгчхт€r\trrjn "ii-лi-гл т1 <n<r.n«r f **

О tJlClLUI1 C-liJJl'V oa>Jl>rt^jraj., и^ПОЛАУ, '1 ij-*ÇA Ullbl^OÂ »-C>

rupex наблюдается'слабое усиление (ЩТ, в большинстве случаев недостоверное. Погмгка заместить ПО другими нуклеозидтрифосфата>Д1 (АТФ, УТЭ, ДТО) не дала отллчий от ГТФ в одной и той же схеме опыта.

Отметим, что эффект проникшего в клетку ГТФ возможен (например, наблюдается усиление продукции инозитолфосфатов (Ргосорю АЛЯ et al., 1991), однако, очевиден целый ряд побочных эффектов, маскирующих аффект ГТО (неспецифический гидролиз и под влиянл&м he-G-белковых ГТОаз, обратимый эффект нуклеотида на активацию 0-белков и др.). Наоборот, присутствие ГТФ (1-100 мкМ) в течение 1ЩГ-теста нативных спленоцитов существенно усиливает [ЩТ, Этот же эффект наблюдается и в случае КонА- индуцированной пролиферации. Возможный механизм указанного эффекта может состоять в индукции Са1+проницаемых пор, как это наблюдается п случае обработки тимоци-тов ATS*. Наили также, что обработка нативных спленоцитов ГТФ усиливала пролиферацию в ответ на КонА. В основе эффекта может лежать указанный выае механизм действия АТФ¥Г-

Возвращаясь к эффектам AIFf, укажем, что возможное разобщение ИЯ-2р и G-Селка и нарушение связи ИЛ-2р-ПКС может быть прослежено также и в случае гг^лиферации клеток в ответ на Ш-?.. Так, из результатов, представленных в табл. 1, следует, что во всех случаях (нативнь® тимоциты, а также спленоциты и тимоциты, преин-куСированные с КонА или без него в течение 19 часов) наблюдается синергизм обработки клеток А1%"и последующ 48-чзсоеой инкубации клеток с: 11Л--2. Еозможные причины эффекта - те же, что и в случае ВДГ. Если AlRjT нарушает связь ИЛ-2р— ПКС, то ответ AIE," -обработанных клеток на ИЛ-2 не должен вовлекать активацию ПКС, т.е. ми-тог проходит в условиях пониженной (подавленной) ПКС-активности.

Известно, что ингибирование ПКС влечет за собой усиление синтеза ДНК в ответ на ИЛ-2 (LeGrue S.J., 1988). С другой стороны, ПКС может оказывать негативное влияние на синтез ДНК за счет вовлечения в петлю отрицательной обратной связи (Nishizuka У., 1938).

Влияние форболмиристатацетата (ДНА) и стауроспорина на пролиферацию и индукцию кеспецифической цитотоксичности. Для Солее полного прояснения участия этой кинзгы в усилении НЦТ в ответ на ИЛ-2' мы попытались подавить активность ПКС длительной обработкой клеток высокий; дозами ffliA, a также ингибитором фермента - стау-

~1 г-

п р

о

я

и ф

«

р

а

Ц

■

<8>

75

50

2510

Рис.

р<оßS

I

11

У/,

v/>

%

2 4 2 4 2 4

Время инкубации в мякрокулмуре (сутки). I. Зависимость пролшфераци* сплвноцитов от времени культивирования с интерлейкииом-2. I - Инкубация в иакрокулыуре с ИЛ-2 24 чнеа. II - Инкубация г макрокультуре с ИЛ-2 46 часов, III - Инкубация в макрокулыуре с ЯЛ-2 72 часа.

ЦИ во* (%)

70 СО

50

40 30

20

10

КЭ : КМ 25 ! I

К о н

т

р

о л ь

i

Ш

КЭ : КМ 12 : I

К о н

т

р

о л

ь

«А

КЭ : ,КМ 6 : I

К о н

т р.

Ш

р <0,001 р<0,02 , р<0,01

Рис. 2. Щек ты 19-часовой предобработки сплеиоцитов ША t>a последующую генерацию ДА ¡¿-активности. КЭ : КМ - соотношение клеток-эффекторов и клеток-шанеХ.

Таблица 1.

Аддитивный эффект ИЛ-2 и AlFy на пролиферацию лимфоцитов (М ±я>; иип/мин).

Условия пр^чмк^Ji-

19 часов без КонА

19 часов с КонА

Клетки

Two-цмгк

Ил-Ь

1125 ±187 1899 ±485

2836 1222" 8693 ±609*

38635 ±2184 41559 ±1551

36031 ±1167 103193 +5352

Сплгмо цжн

494 ±20 319 ±36

1944 ±57 ' 619 ±28 *

8773 ±534 14832 +512

9023 ±443 35230 ±1419 *

* - JXQ.05

роспорином. Спленоциты крыс были преинкубированы 19 часов с 1 икМ BUA и после отмывания культивировали еще 42 часа с ИЛ-2 (200 ед/мл). Нашли, что указанная обработка значительно подавляет усиление литической активности в ответ на КЛ-2 (рис. 2). В качестве контролей были взяты необработанные ÍMA спленоциты, инкубированные в тех ж условиях, что и опытные. Гйоборот, пролиферация спленоцитов и тимоцитов в ответ на ИЛ-2 (но не на КонА) после указанной предобработки <DWA существенно возрастала (табл. 2),

Таблица 2.

Нлияние 19-часовой предобработки СМА лимфоцитов на пролиферацию клеток (М im¡ ими/мин).

Клетки к условия \^преинкуСации Тимоциты Спленоциты

Контроль ЛреинкуОаци С ФИА i Контроль Црчинкубация С SUA

КонА (5 мкг/мл) ИЛ-2 (200 ед/кл) 3321 +755 49172 +3CES 4.374 ±1745 308 ±45* 3263 +1241* 14106 ±1624* 2593 ±126 15353 ±967 898 ±126 2531 ±98 5785 Л£2* 8ГЕ7 ±221*

+

+

+

+

* - pi'0,05

С другой стороны, использование ингибитора ПКС (стауроспори-на) дало следующие результаты. Возрастанию концентрации этого агента (0,01- 0,3 мкЦ) полностью подавлял!! вшасчение'Н-ттадака, начиная уже с ОДЙ ikíí (sa гчат кястай токскчноел). Концентра-

ция 0,01 мкМ оказывала значительно меньший токсический аффект, но подавление такжэ било значительным (табл. 3).

Таблица а

Нлияниэ стауроспорина на пролиферацию лимфоцитов (М tm; имп/мин).

Клетки ^чСтауроспорин Стимулятор ^v. Тиме щиты 0,01 СШ1 еноциты 0,01

КонА (б мкг/мл) КЛ-2 (200 ед/ид) 742 ±э.ас 35282 ±748 6977 1Ш7 634 ±25 15494 ±308* 2883 ±500* 4827 ±104 16841 ±308 5347 +360 i 324 ±16* 2780 ±404* 1279 ±123 *

* - р<0,06

Здесь и далее стауроспорин вносился в указанной концентрации в момент старта культур и на все время культивирования для того, чтобы аффект стауроспорина сделать, по возможности, необратимы. Присутствие ингибитора (0,01. мкМ) в культурах лимфоцитов с КЛ-2 показало тенденцию к повышению НЦТ-активности, по сравнению с контролем (культуры без стауроспорина) (рис. 3 ).

Таким образом, обработка клеточ Ш и стауроспорином в указанных условиях показывает существенное различие пролиф&ративноП и ВДГ-кндуцирувдэй активностей- ИЛ-2. Одна из причин, которая могла бы лежать в основе различий эффектов ША и стауроспорина, состоит в относительно широком спектре действия ингибитора. Помимо ПКС стауроспорин может подавлять активность, тирозин-киназ. Очевидно, в условиях снижения тирозин-киназной активности пролиферация клеток в ответ на ИЛ-2 также должна быть подавлена, если Ш1-2р индуцирует синтез ДНК за счет ассоциированной с его внутриклеточным доменом тирозин-киназной активности (Sharon М. et al., 1990; Sugamura К. et al., 1990).

Из представленных данных следует, что пролиферация (синтез ДНК) лимфоцитов крыс в ответ на ИЛ-2 и усиление НЦТ-активности в в условиях инкубации клеток с этим же ростозым фактором опосредуется, по-видимому, через разные вторичные посредники. Наряду с тирозин-киназной активностью ИЛ-2р может взаимодействовать с предполагаемым Q-Оелком, посредством которого осуцествллэтсл взаимодействие ИЛ-Ер -ПКС. В свою очередь, активация ИЛ-2р-аесоции-

~15Г-

тимоциты

12 : I М (опыта) 52,1

М (контр.) 63,3

Рис. 3, Эффекты постоянного присутствия стауроспорина (0,01 мкМ) в течение 66-часового культивирования лимфоцитов крыс с ннтврлейкином-2 на генерация ЛАК-активности.

Подавлеиие пролиферации клеток.

Рис. 4. Вза:;1'0деКстг,ие 1<;Л-2о -

ПКС

рсвакной тирсзижиказы ist сопровождаться индукцией синтеза ДИК (О,— S-переход) через ряд промежуточных этапов. Отметим, vro рассматриваемые особенности сигналликга, осуществляемого ИЛ-2р, в частности, те, что имеет отношение к индукции пролиферации клеток, не несут, по-видимому, характера закономерностей, присущих всем лиыфоцитарным ростовым факторам. Например, стимуляция мито-тического деления лимфоцитов в ответ на Ш1-4 на вовлекает индукцию тирозинкикааной активности. Наоборот, активация тирсшнкинаэ в ответ на стимуляцию лимфоцитов анти-СКЗ-мАТ приводит, по-видимому, к гидролигу фосфатидилшюзитолфосфатов фосфолипазой С с последующей активацией ПКС.

Вовлечение указанного фермента (ПКС) в ответ на ИЯ-2 не является общей закономерностью, свойственной любым лимфоцитам. По данным разных исследователей, наблюдается значительная вариабельность эффекта в зависимости от источника и типа лимфоиднкх клеток. Более того, в мшииой лилфоидной линии CTLL-2,4 в ответ на ИЛ-2 активируется сер/тре-протеинкиназа, отличная от ПКС (Valentine М.А. et al., 1991). Не исключено, поэтому, что активация ПКС и других сер/тре-протеинкиназ в ответ на ИЛ-2 может Сьггь побочным событием. Более того, эффекты совместной обработки клеток A1Fv~h КЛ-2 могут быть обусловлены не прямым разобщением предполагаемой связи ИЛ-2р-0-белок-ПКС, а влиянием возросших уровней цШ> за счет стимуляции адекилатциклаз. Однако, данные по влиянию ffiliA и стауроспорина на пролиферацию и усиление НЦТ в ответ на ЮЬ 2 свидетельствует, по-видимому, о наличии такой свяаи. По крайней мере, в эксперименте обнаруживается эффект ПКС- и G-белок- стимулирующих агентов в усдоьиях обработки клеток ИЛ-2 (рис. 4.).

Механизм ассоциации ГГФ-связываЕшэго белка с цитсшазмати-ческим ■ доменом ИЛ-2р, равно как и сама идентификация указанного посредника представляются на сегодня практически неизученными. Дополнительную трудность вносит обнаружение нескольких гоеьк ЮЬ2р -ассоциированных белков, не обладакацпх, по-видимому, ГКагной активностью, но участвущпх либо в рецепиии ИЛ-2, либо в стабилизации ИЛ-2р на мембране клеток. Не исключено также взаимодействие ИЛ-2р с фосфатидилтаоштолгашаёой, за счет которой рецептор шжет Сыть интегрирован в цепь событий, пр;:еодл:цнх к активации ПКС.

При условии, что КЛ~Ер Егакмэдгйствует с G-Селком, ьезавдси-».¡о от псолгдхц;;х акг.:взц;;онньа ссСат.й, иитерес предстаамэт мэ-зхтивкост;; т;;рсгж-у,:-;зг ;; б-Сзжов, саувдствляз-М.-.Й одним и тгм рецептора (ИЛ-т.;-,. ■

щади.

1. С использованием лектинов (конканавалин А и wheat germ agglutinin) и пнтерлейкина-2 определили условия индукции двух процессов, происходящие а лимфоцитах крыс: пролиферации (синтеза ДНК) и иеспецифическсй цитотоксичности (против клеток-мишеней YAC-1). Индукция этих процессов разделена во времени.

2. Применял различные варианты обработки клеток актикомици-ном D и циклогекскмвдом в комбинации с кскканавалкнсм А, установили, что глубокое подавление соответствующих синтетических процессов, влекущее за ссбой резкое снижение уровней синтеза ДНК (пролиферации клеток) может не сопровождаться достоверным уменьшением величин неспецифической цитотоксичности (против клеток-мишеней YAC-1).

а Показали возможное участие G-белков в регуляции активности рецептора к интерлэйкину-2:

- с использованием константного активатора Q-белков (AIR,) обнаружили эффект аддитивного действия AlFv~n интерлейкина-2 на пролиферацию лимфоцитов крьс, нативных и преакгивированных конканавали-ном А;

- последовательная обработка AlFy- и интбрлейкином-2 крысиных спленоцитов, преактивкрованшх конкзнзвалином А, приводила к снижению неспецифической цитотоксичности по сравнению с обработкой клеток иктерлейкнном-2;

- комбинированная обработка клеток сапонином и ГТФ (1-100 мкМ) в трех опытах из четырех обнаружила тенденцию к усилению неспецяфи-ческой цитотоксичности, за счет ГТФ, прогожашэго в клетки (сплено-циты) через сапаюш-индуцированные пора Использование для совмести-ной (с сапонином) обработки клеток других нуклеозидтрифосфатов (АТФ, УТФ, ЦТО) не выявило достоверных отличий от эффекта ГТФ;

- присутствие ГТФ в культуре нативннх клеток дозо-зависимо стимулирует пролиферацию крысиных тимоцитов и спленоцитов в ответ на конканавалин А. Возможный механизм состоят в усилении проницаемости Са2*" каналов в плазматической мембране клеток.

4 Установили эффект модуляции неспецифической щггстоксичности и пролиферации в ответ на интерлейкик-2 з-условиях подавления активности протеинкиназы С:

- предобработка спленоцитов высокими дозам! фсрбслгжристатаце-тата снижала неспэцифишскув цитотск'лкность клеток при последлкцем культивировании с иктерлейкинои-2. Наоборот, прох'лфзрац;;я спленоцитов и тжоцнгоз в этих лэ услозилх гкачтаа усклпвзла-ь;

- присутствие стэурсспорлна (пккйптс/рз г.рстs:;i:k:k3eu С) в трехсуточных культу ■: ткмоцстсэ и сшвювдт:® крьк пскйзуг уроьни

««специфической цитотоксичностк, ко значительно подавляет пролифе-гацию клеток в тех же условиях.

5. Результата экспериментов по обработке лимфоцитов форболми-ристатацетатом и AIR," в разных условиях дают основания предположить, что рецептор к интерлейкину-2 вовлечен в регуляцию неспецифической цитотоксичности через стимуляцию протеинкиназы. С за счет промежуточного А1Е/"-чувствительного G-Селка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЯЭЖЕНИЯ: Разработан и использовался в работе полуавтоматический сборшрк клеток (Рац. предложение. Удостоверение И 1018 от 9.02.90.). Устройство позволяет упростить и облегчить процедуру сбора клеток из 96-луночной шкропштвты с одновременным отмыванием лунок. При необходимости может быть адаптировано для других типов планшет.

Результаты исследований могут быть использованы в учебных курсах го биохимии а иммунологии, для написания учебных и методических пособий, а также монографической литература

СПИСОК РАБОТ, ОПШВЖОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сравнение кинетических характеристик пролиферации и индукции неспецифической цитотоксичности у спленоцитов крье//В сб. Контроль состояния и регуляция функций биосистем на разных уровнях организэдш/Петрозаводск, 1993.-С.64-73 (Соавт.: Болотников НА.).

2. Сравнение спектров синтезированных белков в посгьядерной фракции спденоцитов крыс в разных условиях активации//Новые фармакологические средства в ветеринарии: ТеэдоклУБ-я Межгосударег-веняая Межвузовская научно-практическая конференция.- СШ., 1993.-С56 (Соавт.: Болотников JIA.).

3. Участие интерлейкина-2 в дифференцировке Т-клеток и развитии неспецифической цитотоксичности// Иммунология.- 1994.- К 2-С. 17-23 (Соавт.: Болотников ПЛ.).

4. Participation of interleukin-2 (IL-2) arri leotins in modulation of nort-speo;fic cytotoxio activity. tAbstrJ I Intern. Congr. iraurcrehab., Jure 5-9, lS94VInt. J. Inrororehab.- 1S94-

N 1, Suppl- P.70 (Co-auth.: Bolotnikov I.A.).