Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОЦЕСС ИНФИЦИРОВАНИЯ КЛЕВЕРА И ЛЮЦЕРНЫ КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРОЦЕСС ИНФИЦИРОВАНИЯ КЛЕВЕРА И ЛЮЦЕРНЫ КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ"

; ^ -: МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР..

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА > >

' . ! И ОРДЕНА' ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ \ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ"АКАДЕМИЯ имеии К. А- ТИМИРЯЗЕВА

• На правах рукописи ЩАТТА АБДЕЛЬ-ХАЛЙК МОХАЛ1ЕД АБДЕЛЬ-ГДНИ

ПРОЦЕСС ИНФИЦИРОВАНИЯ КЛЕВЕРА V ^ : р:,11Л ЮЦЕРНЫ КЛУБЕНЬКОВЫМИ

БАКТЕРИЯМИ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ; ■ /./.:. КРНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ

Л (Специальность 03.00.07 — микробиология) ■ . л ; . ■

■. V"'--' --",'" А Акторефера т •' --■»-■ "

диссертации на сонскаипеученой степени ■ V ; .кандидата биологических'наук ■

МОСКВА—1975

Работ а' вып о л н е н а / н а к а ф е д р'е м и кр об и ол о п I и Мое ков с к о и -ордена Ленина и ,ордена, Трудового'::красного"^Знамени::сель-: /ско хозяйствен ной академии" им. К. А.Д]1МИрязеБа. ; ,. ; _ ; :: ч ■■■■'. Научны й'*'-р у ко водитель — доктор - биологических':;'-наук

в.к/ шильни ко в а. ■ - ; •.' .":•/..;'....

, " Официальные оппоненты: "-доктор "биологических' наук Л:'И.: ВОРОБЬЕВА, кандидат биологических паук'О..Д. СИДОРЕНКО. - .•-/-' ••• - '. /'-"Л ■'■;"■:- *: * Т.'--■ Ведущее учреждение—ВНИИ/лшкробиологических средств защиты растений.и/бактериальных препаратов. . ■ ■ ■ Диссертация содержит Л34 страницы "машинописного тек-; ста, На 43 страницах размещены 77'рисунков,\нз'них ;45::элек-. трртшомикроскопнческих - фотографий, 32 , микрофотографии . : в световом" ь<икроскопе,17-таблмц, 18графиков." , ••

• - Автореферат разослан « Ж > фёвраля-1975 г.У-.'- .С*;: ■; : ■ ;Защита диссертации- состоится.1 «^^ .. » - марта 1975 г. на заседании: Ученого совета факультета агрохимии Тгпочвоведения ТСХА. . - _" ■--"'--'. •".' .;:д7 ■ 1. С. диссертацией .можно: ознакомиться - в' ЦНБ ТСХА( 10-й корпус); . -'-V ; -. • "'.Г. ;: - Просьба принять.участие в'заседантгСовега или прислать : .письменны и: отзыв по данному: .реферату .по адресу: : 125008, Москва А"-8,- . ул.- Тимирязевская; "47,- корп." 8, Ученый, .совет ТСХА. г''.',:-." ■ /О ; . : ' ■".. - Отзывы, заверенные пе^чатыр; "просьба" направлять -вг двух ■экземплярах.' 1/7

"/ученый*сёкретар'^Сове™^'

ВВЕДЕНИЕ

Широкое применение клубеньковых бактерий в практике сельскохозяйственного производства обусловлено их важнейшей особенностью метаболизма — способностью фиксировать молекулярный азот в симбиозе с растением-хозяином.

На взаимоотношения бобовых растений с клубеньковыми бактериями большое влияние оказывают условия произрастания растений* их физиологическое состояние и свойства самих бактерий, в частности, их вирулентность, активность, конкурентоспособность,

Исследованию конкурентной способности клубеньковых бактерий уделяется в последние годы особое внимание и тем не менее природа этого свойства, клубеньковых бактерий неясна (Мншустин, Шильнихова, 1973),

Вместе с тем успех инокуляции бобового растения микросимбионтом в полевых условиях нередко связывается именно сэтой биологической особенностью ризобий (Калниньш, 1963).

Большая практическая ценность клубеньковых бактерий, с одной стороны, и нерешенность многих вопросов, связанных как с процессом инфицирования бобового растения клубеньковыми бактериями, так и с характеристикой сущности конкурентоспособности последних, с другой стороны, определили основные задачи нашего исследования:

1. Детальное исследование процесса инфицирования растений клевера клубеньковыми бактериями клевера разной степени конкурентоспособности. Аналогичное исследование ино-куляционного процесса проведено на растениях люцерны при бактеризации активным и вирулентным штаммом клубеньковых бактерий.

2. Выявление возможной природы конкурентной способности клубеньковых бактерий. Для этой цели проводились сравнительные исследования их приживаемости на корнях растения-хозяина, ферментативной активности (в частности, пектинолитической) в симбиозе, сравнительных морфолого-анатомических свойств в чистой культуре и условиях симбиоза.

Работа состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка цитированной литературы (184 названия).

I глава представляет собой обзор литературы. Здесь рассматриваются вопросы развития клубеньковых бактерий в ризосфере бобового растения. Обсуждаются термин «конкурентоспособность» (агрессивность) и критерии конкурентоспособности. отграничивается понятие конкурентоспособности от вирулентности, рассматривается возможная природа конкурентоспособности: 1) не является ли конкурентоспособность синонимом приживаемости, 2) не коррелирует ли степень конкурентоспособности со степенью вирулентности, 3) можно ли заменять термин конкурентоспособности понятиями «приживаемость в почве» и «сапрофитическон активностью», 4) можно ли рассматривать влияние антагонистической почвенной микрофлоры на клубеньковые бактерии причиной конкурентоспособности. Дан также краткий обзор имеющихся данных по морфологии и анатомии клубеньковых бактерий.

Во II главе излагаются методы и объекты исследований, использованные при выполнении данной работы.

В III главе представлены результаты проведенных исследований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования были взяты штаммы клубеньковых бактерий клевера Rhizobium trifolii Ka 4 и № 8 — конкурентоспособные, № 1 и № 9 — неконкурентоспособные. Штаммы любезно предоставлены профессором А. Д. Калниньшем (Латвийская с.-х. академия). Штаммы клубеньковых бактерий люцерНЫ' Rhizobium meliloti 87, 132, 422 — активные, вирулентные, 26 — вирулентный-неактивный, 34 — слабовирулентный неактивный.

Взаимоотношения клубеньковых бактерий клевера с растением-хозяином изучали на клевере красном Trifolium pratense и люцерне посевной Medicago sativa.

Из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР были получены типичные представители ризосферных микроорганизмов: Pseudomonas putida В-34; Pseudomonas putida В-21; Pseudomonas fluorescens B-24; Aeromonas sp. B-46; Aerobacter aerogenes B-45; Agrobacterium radiobacter B-152; Erwinia herbicola B-73; Arthrobacter oxydans B-55; Brevibacterium imperiale B-67; Brevibacterium sp. B-258; Flavobacterium ferrugineum B-159; Flavobacterium sp, B-157; Alcallgenes faecalis BJ153; Flavobacterium sp. B-156; Flavobacterium sp. B-155: Xanthomonas malvacearum B-89; Promyxobacterium sp. B-245; Cho-romobacterium sp. B-123.

Кроме того методом Е. 3. Теппер (1949) нами были выделены культуры бактерий и актиномицетов из ризосферы и с корней Trifolium pratense, выращиваемого в условиях вегетационного опыта-на дерново-подзолистой почве. Почва была взята с полей фермы ТСХА из-тюд клевера.

Опыты в зависимости от задач исследования. проводили или в лабораторных условиях кафедры микробиологии ТСХА, соблюдая правила асептики, или в вегетационных условиях (в лаборатории искусственного климата ТСХА и в лаборатории почвенной микробиологии Научно-исследовательского института сельского хозяйства центральных районов нечерноземной зоны, Немчиновка).

При изучении взаимовлияния клубеньковых бактерий и растения-хозяина разработан новый мацерационный метод просмотра инфекционных нитей в корневых волосках. Наблюдения за взаимодействием симбионтов проводили под микроскопом Люмипан-Цейсса. Для исследования клеток клубеньковых бактерий клевера применяли электронномикроскотгиче-скую просвечивающуюмнкроекопйю (электронный микроскоп УЭМВ-ЮОБ для просмотра целых клеток и электронный микроскоп JEM-7 для просмотра ультратонких срезов). Для изучения целых клеток клубеньковых бактерий в чистой культуре и условиях симбиоза . была применена сканирущая (растровая) электронномикроскопическая техника (электронный сканирующий микроскоп «Hitachi» и «JEOL»),

Суммарную ггектн но л итн ч еск ую активность (ЛКА) чистых культур микроорганизмов определяли интерферометрнческим методом А. П. Рухлядьевой и.Г. Г. Кретининой (1968) на кафедре физики ТСХА, Полигалактуроказную активность (ПГА) чистых культур — методом Д. Б. Лифшица (1967), а также вискозиметрическим методом, описанным Фэреусом (Fahraeus. 1957), на вискозиметре Освальда; пектинметилэстеразную (ПМЭ)—методом титрования Смита (Smith, 1958). Все эти методы использовались и для условий симбиоза. В условиях симбиоза пектинметилэстеразную активность определяли, кро-м'е того, -по методу Субба-Рао и Сарма (Subba-Rao, Sarma, 1968).

Определение приживаемости конкурентоспособных и неконкурентоспособных бактерий клевера на корнях растения-хозяина проводили по методу Е. 3. Теппер (1949). Дыхательную активность клубеньковых бактерий определяли манометрическим методом Варбурга (Семихатова, Чулановская, 1965). Антагонистический и стимуляционный эффект ризо-сферных и корневых микроорганизмов в отношении клубеньковых бактерий изучали методом штрихов, продукты выделения микроорганизмов-стимуляторов идентифицировали методом хроматографии на бумаге. Данные опытов по изучению

характера взаимовлияния микро- и макросимбионтов обрабатывали статистически (Гатаулин, 1970). С помощью метода Р. Фишера были проверены - также гипотезы об одинаковых и разных соотношениях искривленных корневых волосков в двух соседних зонах с целью доказать неслучайность зонального распределения (а-преобразование) инфицированных корневых волосков по главному корню.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ КЛЕВЕРА, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПРОЦЕССА ИНОКУЛЯЦИИ

а. Определение срока инокуляции семян конкурентоспособными и неконкурентоспособными клубеньковыми бактериями клевера

Данные опыта (табл. I) свидетельствуют о том, что количество клубеньков, образуемых исследуемыми штаммами 1?ЫгоЫит ШГоШ, различно в зависимости от штамма и срока инокуляции. При инокуляции количество клубеньков, образуемых неконкурентоспособным штаммом № 1, снижалось с удлинением срока от посева до дня инокуляции. Это снижение было, однако, недостоверным для штамма № 9. Количество

Таблица 1

Определение оптимального срока инокуляции семян конкурентоспособными н неконкурентоспособными штаммами клубеньковых бактерий клевера

^НоШ Сроки инокуляции Средний вес 1 растения (мг) из 20 растений Среднее кол-во клубеньков на 1 растение (из 20 растений)

Штамм № 1 110 13,2

7 дней после посева . , . . 155 19,9

14 дней после посева , . . . 75 ■ 7,6

Штамм 4 В день посева .,,.,.. 102 24.0 -

7 дней после посева . , . . 135 25,2

14'дней после посева , . . . 145 29.1

Штамм № 8 В день посева ..... . . 129 16,5

7 дней после посева' .... . 167 24,5

14 дней лосле посева . , , . 167 24,5

Штамм № 9- В день посева ....... 103 18.5

7 дней после посева . . , . 99 17,0

14 дней после посева , . . . 77 15,0

клубеньков, образуемых конкурентоспособными штаммами № 4 и Яг 8, повышалось с удлинением времени от посева до дня инокуляции. Результаты опыта свидетельствуют о том, что срок инокуляции семян клевера имеет определенное значение для успеха инфицирования. Более поздние сроки инокуляции лучше.

Очевидно, и для клубеньковых бактерий клевера небезразличны токсические вещества семян, губительное действие которых снижается по мере удлинения периода от времени прорастания до момента инокуляции {Кгеатап а)., 1971).

При всех сроках инокуляции количество клубеньков, образуемых неконкурентоспособными штаммами, было меньше по сравнению с вариантами, где бактеризация осуществлялась конкурентоспособными штаммами.

б. Определение дозы кнокулюма конкурентоспособных и неконкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий

Данные лабораторных опытов, проводимых в условиях асептики при заражении растений только одним штаммом ризобний (табл. 2),-свидетельствуют о том, что даже минимальные количества клеток (3—14 клеток на I семя) 1?Ыго-Ьшт (гйоШ приводит к образованию клубеньков у растений клевера. В варианте,-где растения были инокулнрованы одной клеткой штамма № 1 (в этом случае клубеньков не было) размножившееся потомство этой клетки все же. очевидно, обеспечило некоторую стимуляцию роста растений по сравнению с контролем. Для образования клубеньков неконкурентоспособными штаммами № 1 и № 9 требуется соответственно 14 и 39 клеток на семя, конкурентоспособными № 4 и № 8 — соответственно 3 и 2 клетки. Причем с увеличением количества клеток ЙЬ. 1г1Го1Н на 1 семя среднее количество клубеньков на 1 растение и вес растения значительно возрастают. Наилучшими для неконкурентоспособных штаммов № 1 и № 9 являются дозы 1 млн. 460 тыс. клеток и 3 млн. 910 тыс. клеток на I семя. Для конкурентоспособных № 4 и № 8 — 343 тыс. и 2 млн. 480 тыс. соответственно. То есть, в конечном итоге, разницы в дозах , между конкурентоспособными и неконкурентоспособными штаммами практически нет. Для инокуляции в том и другом1 случаях можно считать, лучшими миллионные дозы клеток.

Данные вегетационного опыта представлены в таблице 3. Опыт был заложен в 'Немчиновке весной 1973 года с растениями 'клевера на почве, в которой 'присутствовали спонтанные клубеньковые бактерии. Несомненно, что часть клубеньков в вариантах с бактеризацией была образована именно этими спонтанными клубеньковыми бактериями. Однако

Таблица 2

Влияние ШигоЫит М(оШ (разного количества клеток) на образование клубеньков. Растение в возрасте 2 месяцев (Лабораторный опыт)

Rh. tri/olii № i Rh. trifolii № 4> Rh. trifolii № 8 Rh. trifolii № 9

Количество бактерий на 1 семя, тыс. Среднее количество клубеньков на 1 растение Средний вес 1 растения, ыг Количество бактерий на 1 семя, тыс. Среднее количество клубеньков на 1 растение Средний вес I растения, мг Количество бактерий на 1 семя, тыс. Среднее количество клубеньков на 1 растение Средний вес 1 растения, мг Количество бактерий на 1 семя, тыс. Среднее количество клубеньков на 1 растение Средний вес 1 растения, мг

146000 22,1 201 343000 22,6 193 284000 22,7 246 391 ООО 8,4 184

14600 23,5 225 34300 28,4 220 28400 26,5 263 391'OO 13,6 216

1460 34,4 209 3430 28,2 232 2840 37,3 268 3910 22,7 236

146 28,0 232 «3 39,1 270 284 32,8 267 391 21,8 242

14,60 27,6 235 34,3 33,1 223 28,4 29,2 232 39,1 18,5 199

1,46 24,3 220 3,43 30,5 247 2,84 21,6 246 3,91 17,6 228

0,146 18,2 194 0,343 25.6 233 0,284 14,5 224 0,391 103 165

0,014 8,6 183 0,034 18,6 242 0,028 14,0 214 0,039 2,6 139

0,001 — 164 0,003 7,4 169 0,003 5,3 154 0,004 — 136

— 138 — — 146 — 118 — 130

Таблица 3

Влияние количества клеток клубеньковых бактерий на образование клубеньков у растений клевера. Фаза стеблевания, возраст — 2 месяца

(вегетационный опыт)

5 « в ® ; и ¡5

я

5 £ ■

Дз « 56« X

<а га те Й-тс . I

и и х

8 £ К 1

-ё ё а £

ич«-

1-е 8'

^ о о о а а

е « 5*5 к § §.8 * К- .

§ § « а

а: К

<а « ж о.

¿8 О а

:3

Я

Щ ьй ■

Лв 4)

О ч-о.

.ьа ь

и

? о «

л ь ^

ч> о о я о.

РМхоЫит М1оШ N0 1 КЫгоЫит М1оИ1 N0 4

0,025 15,7 344.8 3,7 0,021 14.1 328,8 „

0,254 16,1 407,6 ' 22,9 0,217 16,1 347,4 4,5

2,5+1 16,3 435,0 31,3 2,173 16.7 403,4 21,3

25.410 ; 18.7 440,0 32,5 21,730 16,8 454,8 36,8

254,100 19,2 461,0 38,7 217,300 17,6 469.4 47,2

2541,000 21,6 499,2 50,2 2173,000 19,6 536,8 61,6

НЫгоЫит 1г|ЫЛ N0 8 РМхоЫит (гНоМ N0 9

0,034 14,0 343,6 3.4 0,023 14,1 333,4 0,3

0,346 15,4 440,8 35,6 0,234 14,7 356,2 7,1

3,462 17,0 495,4 49,0 2,340 16,7 389,4 17,1

34,620 18,6 537,2 61,6 23,400 17,8 418,0 25,7

346,200 19,9 647,8 94,8 234,000 19,3 454,2 36,6

3462,000 22,8 664.6 99,9

В контроле: среднее количество клубеньков на 1 растение — 333, средний вес одного растения —14 г.

при повышении количества бактерий на 1 растение увеличивается и количество клубеньков по сравнению с контролем, а также вес одного растения. Такая прибавка по фону клубеньковых бактерий в контроле свидетельствует о высокой активности примененных штаммов клубеньковых бактерий.

Судя по количеству клубеньков, конкурентоспособные штаммы № 4 н № 8 имеют некоторое преимущество перед неконкурентоспособными. Так, при дозе свыше 3 млн. клеток на семя конкурентоспособный штамм № 8 образовал клубеньков на 99,9% больше, чем в контроле, а неконкурентоспособный штамм № 1 при дозе около 2,5 млн.—только на 50,2%.

Опираясь на результаты лабораторного и вегетационного опытов, можно сказать, что лучшими являются миллионные дозы клеток ризобий на 1 семя. Вывод приемлем, конечно, только для данного типа почв.

Итак, для инокуляции клубеньковыми бактериями семян клевера (в-почвах спонтанные клубеньковые бактерии клеве-

ра, как широко распространенной культуры, встречаются обычно в больших количествах) лучше применять повышенные дозы инокулюма, независимо от того, конкурентоспособен или неконкурентоспособен данный штамм. Как правило, при* меняют для инокуляции 300 млн. клеток на 1 гектарную порцию семян (Доросинский, 1971), т. е. на 1 семя обычно в полевых условиях ■приходится 10 тыс. клеток, что значительно меньше тех величин, которые мы считаем необходимыми применять, иначе эффект нитрагинизации может не проявиться, поскольку преимущество получают спонтанные клетки клубеньковых бактерий. Наблюдаемый нами эффект образования клубеньков штаммами ЩигоЫит 1п(оШ в количествах 3— 30 клеток на семя в лабораторных условиях свидетельствует о том, что для инокуляции требуются единичные клетки. Это согласуется с данными Хофера (НоГег, 1938), который считает, что процесс инокуляции может осуществляться даже при наличии 5—40 клеток вблизи семени. Однако в условиях почвы необходимы высокие дозы инокулюма и здесь мы присоединяемся к мнению А. Д. Калниньша (1963) о необходимости увеличения титра клубеньковых бактерий в нитрагине.

в. Определение приживаемости конкурентоспособных и

неконкурентоспособных клубеньковых бактерий клевера на корнях растения-хозяина

При изучении приживаемости конкуренто- и неконкурентоспособных бактерий клевера на корнях растения-хозяина но методу Е. 3. Теппер (1949), несмотря на некоторые различия в опытах, обусловленные неадэкватностью режимов освещенности растений, в обоих случаях проявляются общие закономерности (рис. 1).

Количества -клеток конкуренто- и неконкурентоспособного штаммов ризобий в ризосфере клевера на протяжении всего исследуемого отрезка вегетационного периода- примерно одинаковы. Численность клеток обоих штаммов клубеньковых бактерий в период наиболее активного инфицирования практически равна,

В период активного инфицирования корня растения-хозяина (это соответствует 10 суткам в 1-м опыте и 6—8-м во 2-м) наблюдается подъем численности клеток ризобий в 1-м опыте и сохранение высокого числа клеток во 2-м опыте. В дальнейшем в том и другом опытах отмечается значительный спад числа клеток и сохранение их примерно на одном, но уже более низком уровне размножения.

Проведенный опыт позволяет сделать заключение, что приживаемость штаммов Ка I и № 8 в ризосфере растений клеве' 6

йсЛ» Численность клеток конкурентоспособного и ШКОШурвЯТОСЛОСОбНОГО ШТаИМОВ НМгоМит

"Сг1Г оШ в ризосфере клевера в дина-. мике развития растения.

pa практически одинакова и, стало быть, не коррелирует с конкурентными свойствами исследуемых штаммов. Следовательно, не правомочно^ конкурентоспособность клубеньковых ба,ктерий клевера, штаммов № 1.и:№ 8 считать равнозначной приживаемости.

ИССЛЕДОВАНИЕ НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ ПРОЦЕССА ИНФИЦИРОВАНИЯ КЛЕВЕРА И ЛЮЦЕРНЫ

а. Методом световой микроскопии

Все штаммы клубеньковых бактерий-клевера и люцерны при инфицировании вызывали: характерное искривление кончиков корневых волосков в видеручки зонтика с различной степенью искривленности. О специфической искривленности инфицированных корневых волосков-пишут ряд исследователей (Thornton, 1952; Шемаханова, 1973).

Первые корневые волоски с инфекционными нитями во всех вариантах опыта с растениями люцерны появились на 5—б-е сутки, однако их количество в общем числе было нет большим — не более 5—б, располагались они преимущественно в зоне 1,5—1,8 см (при общей средней длине корня 4,5 см). Максимальное количество (15—20) их наблюдалось к 10 суткам в зоне 3,0—5,0 см от конца корня при общей длине корня 8,4 см, то есть четко проявлялась локальность (зональность) действия клубеньковых бактерий в довольно обширной зоне средней части главного корня с четко выраженным максимумом в центре зоны. Если просматривать характер развития корневых волосков в этой зоне по мере продвижения вверх по корню, то выявляется следующая картина; сначала преобладают слегка искривленные средней длины корневые волоски, затем следуют волоски увеличенные, иногда гигантских (по сравнению со средней длиной .корневых волосков) размеров с усиливающейся степенью искривленности и, наконец, корневые волоски с максимально закрученными кончиками. Последние приходятся на центральную часть зоны (на 10-е сутки это соответствует зоне корня 4,3—4,7 см).

В связи с этим следует подчеркнуть, что при микроскопи-ровании корня с целью выявления инфицированных корневых волосков необходимо, прежде всего, выявить зону инфицирования. Для растений люцерны, например, нецелесообразно просматривать концевые участки главного корня. На 14-е сутки на главном корне корневых волосков с инфекционными нитями практически не было. Следовательно, важно при микроскоп ировани и учитывать и сроки наблюдений.

Появление первых инфицированных корневых волосков совпадало появлением 1-й пары-настоящих листьев и нача-

лом формирования боковых корней. В связи с этим определенный интерес представляют данные о значительном, усилении корневых, выделений в период формирования боковых корней (van Egeraat, 1972). Наибольшая степень инфицирования наблюдалась в период появления второй пары листьев.. Корневая система в этот тгериод имела уже достаточно развитые боковые корни-(общая длина боковых корней на растение составляла около 3 см). На 14-е сутки, когда на главном корне исчезали корневые волоски с инфекционными нитями, надземная масса растений была уже хорошо развита, а суммарная длина боковых корней достигала 13,5—14,0 см. В этот период центр инфицирования перемещался на боковые корни, расположенные в верхней: части корневой системы. В последующие, срони развития, центры. инфицирования на боковых корнях .смещались вниз по-ярусам корневой системы, причем характер зональности инфицирования сохранялся. В период, соответствующий развитию боковых корней, бесполезно искать активные центры инфицирования на главном корне.

Количество корневых волосков у контрольных, растений в течение исследуемого периода постепенно увеличивалось к 12—15-м суткам; В присутствии всех штаммов клубеньковых бактерий количество корневых волосков:резко возрастало в первые дни развития проростков и снижалось впоследствии.

Процессу внедрения клубеньковых бактерий в ткань корневого волоска предшествовало интенсивное их размножение в ризосфере. Затем в тех корневых волосках, в которых в последующем формировались инфекционные нити, возникали «очаги» заражения. Это проявлялось сначала в виде складки в центральной части кончика скручивающегося корневого волоска и в дальнейшем в форме.опгически плотного сферического образования, формирующегося в месте этой складки^

На следующем этапе наблюдалось образование инфекционных -нитей в корневых волосках.. Следует отметить, что в первые моменты формирования инфекционных нитей они не ориентированы по направлению к корню. Более того, при выходе из очага нити как бы расползаются в разные стороны; их количество при этом колеблется в ряде случаев от 3 до 8.

Ранее допускалась возможность инфицирования прямых корневых волосков (Мишустин, Шильникова, 1968, 1973). По-видимому, это определялось следующим. Нередко корневые волоски растений имеют- двуветвистую (или реже трехветви-стую) форму. Если искривленная ветвь располагается почти у основания корня и плохо просматривается под микроскопом вследствие маскировки ее окружающими корневыми волосками, а инфекционная нить, идущая из такой искривленной ветви ошибочно направляется не в сторону корня, а в сторону прямого ответвления корневого волоска вверх, это создает 10

впечатление, что прямые корневые волоски могут инфицироваться. Дойдя до верхушки прямого корневого волоска инфекционные нити обычно поворачивают в обратную сторону или абортируются.

При исследовании процесса инфицирования клевера конкурентоспособным и неконкурентоспособным штаммами особых различий не было установлено.

Основные закономерности процесса инфицирования, а именно, зональность, фазовость, ярусность, ■наблюдаемые для растений люцерны, проявлялись и в случае клевера. Следует подчеркнуть, однако, что у растений клевера не наблюдалось той: стимуляции развития корневых волосков (в длину) под действием ризобий, которая так характерна для бактеризованных растений люцерны; на корнях клевера было очень много искривленных* волосков (характер искривления неспецифический, но тем не менее каждый корневой волосок обычно по всей длине определенным образом, иногда даже судорожно искривлен), в то же время инфекционные нити обнаруживались только в очень коротких корневых волосках. Из-за своих-небольших размеров (по длине) такие корневые волоски с инфекционными нитями были как бы «замаскированы» корневыми волосками нормальной длины и слизью.

Доля укороченных корневых волосков с инфекционными нитями в общем числе корневых волосков мала. Поскольку, искривление корневых волосков под действием конкурентоспособного (К*, в) штамма происходило на 7 дней раньше, процесс формирования клубеньков в этом варианте совершался также на 7 суток быстрее и клубеньков образовывалось на 3—4' больше на 1 растение, можно сделать вывод, что конкурентоспособный штамм № 8 более вирулентен, чем неконкурентоспособный штамм № 1.

б. Методом сканирующей электронной микроскопии

Метод сканирования любой поверхности может дать представление о ее характере, локализации поверхностных структур, степени взаимовлияния поверхностных структур со структурами (и организмами) иного происхождения. Особо перспективны в этом плане исследования макро- и микроорганизмов в их взаимодействии (Hagenet а!., 1968).

Нас интересовала локализация конкуренто- и неконкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий клевера на корнях и корневых волосках растения-хозяина в разные сроки-с момента инокуляции семян: 2, 5—7 и 12—14-е сутки. Для просмотра в сканирующем микроокопе брали участки корня, предварительно просмотренные под световым микроскопом. Получены электронном икросколическне фотографии, убеди-

П

тельно демонстрирующие локальность распределения клубеньковых бактерий на поверхности корня и корневых волосков в виде популяций и отдельных клеток ризобий.

Клубеньковые бактерии в ризосфере активно размножаются перетяжкой. Различий в характере локализации конкурентов и неконкурентоспособных штаммов ризобий в сканирующем микроскопе не выявлено.

в: Методом просвечивающей электронной микроскопии

Ультраструктура клубеньковой ткани1клевера достаточно полно исследована И. М. Нестеровой (1969). Мы ставили задачу просмотра только стенок растительных клеток в период формирования клубеньковой ткани с целью выявления возможных путей перехода ризобий из клетки в клетку или из* межклеточных путей в клетку. Наличие пор во вторичной клеточной стенке растительных клеток (Гамалей, 1972) и приуроченность клеток клубеньковых бактерий к этим участкам клетки дает, основание считать, что одним из путей перемещения ризобий по ткани корня может быть путь прохождения через поры. Конечно, более убедительно было бы сфотографировать клетку бактерии в момент ее проскальзывания через пору клеточной стенки. Но, видимо, этот акт (если он существует) совершается чрезвычайно быстро.

ИЗУЧЕНИЕ ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ

КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ И РИЗОСФЕРНЫХ И КОРНЕВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

а. В чистой культуре

Ни один из исследованных штаммов клубеньковых бактерий клевера, люцерны, гороха, люпина в чистой культуре не обладал ПКА, ПГА, ПМЭ. Из 28 культур, выделенных из ризосферы клевера, 8 (6 культур актиномицетов и 2 культуры бактерии) дали положительную реакцию на ПКА. У остальных 20 культур (в культур актиномицетов и 12 культур бактерий) реакция на ПКА отрицательная. Следует отметить, что более активной ПКА характеризовались ризосферные актино-мицеты. Из 27 культур, выделенных с поверхности корней клевера, только 6 обладали ПКА (4 актиномицета и 2 бактерии). У корневых микроорганизмов выявляются более активные пектиназы, чем у ризосферных, уровень ПКА достигает 18—39 усл. ед/г, причем это в равной степени относится к актиномицетам и бактериям. Однако число микроорганизмов, обладающих пектинолитической активностью, выделен-

ных из ризосферы (28,4%), было больше выделенных с поверхности корней (22,2%).

Среди типичных ризосферных бактерий ПКА выявлена почти у 50% исследованных культур. Наиболее активными продуцентами пектиназ оказались Pseudomonas putida В-34, Flavobacterium sp. В-156 и Erwinia herbicola В-73.

б, В условиях симбиоза

В условиях симбиоза с растением-хозяином клубеньковые бактерии клевера, люцерны, люпина, гороха не дали положительной реакции на ПКА и ПМЭ. Это в равной.степени относилось к конкурентоспособным и неконкурентоспособным штаммам.

Для определения ПМЭ и ПГА симбиознрующих культур растений клевера и конкурентоспособных (неконкурентоспособных) штаммов клубеньковых бактерий клевера в присутствии ризосферных микроорганизмов из последних'были взяты только те, которые наиболее активно стимулировали развитие клубеньковых бактерий в чистых культурах и условиях симбиоза (табл. 4). Здесь, как и в предыдущих опытах, не установлено корреляции между, стимулирующим эффектом и пектиназной активностью ризосферных балтерий с одной стороны и конкурентоспособностью с другой. Различия в величинах ПМЭ и ПГА бобово-ризобиального симбиоза определяются в основном взятыми для опыта штаммами ризосферных бактерий, характером продуцируемых ими пектинолитнческих ферментов, а также штаммовьши особенностями клубенько-— вых бактерий.

/ Эти данные-не подтверждают ферментативной гипотезы ✓ внедрения клубеньковых бактерий в ткань корня бобового / растения.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ С МИКРООРГАНИЗМАМИ РИЗОСФЕРЫ, РИЗОПЛАНЫ И ПОЧВЫ

В данной главе представлены материалы по изучению характера взаимоотношений клубеньковых бактерий с ризо-сферными, ризопланными и почвенными микроорганизмами, в частности, исследованию стимулирующего эффекта ризосферных микроорганизмов на клубеньковые бактерии в связи с пектинолитическими свойствами данных тест-микроорганизмов, а также их возможной провоцирующей ролью в процессе внедрения рнзобий в ткань корня растения-хозяина. Все эти вопросы мы решали, применяя конкурентоспособные и некой-

Таблица 4

Пектинметилзстеразиая и полигалактуроназная активности у клевера, выращиваемого в присутствии конкурентоспособных и неконкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий клевера и ризосферных микроорганизмов

Варианты Активность ПМЭ 1 растения, мл 0,005 ПГА

Контроль......... . . 0,022

Rh. trifolii . . Штамм 4 0,022 0

» + Pseudomonas putida . , . В-34 0,03 0

s. +Pseudomonas Iluorescens , В-24 0 17.1

» +Flavobacterium sp..... В-157 0 17.1

» +Brevibacterium sp..... B-158 0.04 68.4

* + P romvxob aiteri um sp. . , . В-145 оде 68,4

* +K-36......... 0,69 4,9

» +P-146......... 0 68,4

0,022

Rh. trifolii. .... Штамм ] 0,022 0

» -(-Pseudomonas putida . . , В-34 0,044 0

» + Pseudomonas fluorescens . В-24 0 86.5

» +Flavobacterium sp..... В-156 0,084 0

> +Flabobacterium sp. .... В-157 0,046 51,3

> + Promyxobacterium sp. . , . В-145 0,068 119,03

» +K-256 ......... 0.074 0

* +K-36......... 0.074 0

курентоспособные штаммы клубеньковых бактерий. Очевидно, взаимоотношения клубеньковых бактерий разной конкурентной способности с местной сапрофитной (ризосферной и ризопланной) микрофлорой было бы логичнее исследовать в почвах, где произрастали бобовые растения, из клубеньков которых были выделены эти конкуренте- и неконкурентоспособные ризобии, однако исследование в почвах иного типа может, по нашему мнению, способствовать выяснению вопроса, связана ли конкурентоспособность штамма с его «сапрофн-тической способностью».

Исследование антагонистических свойств ризосферной и почвенной микрофлоры в отношении клубеньковых бактерий проводилось нами, к сожалению, не в связи с конкурентоспособностью клубеньковых бактерий, поскольку при изучении характера влияния сапрофитных микроорганизмов -при выращивании клевера нам не удалось выделить, ни одного антагониста.-14

а. Изучение стимуляционного эффекта микроорганизмов на развитие Rhizobium trifolii в чистой культуре

При изучении влияния фильтратов типичных ризосферных. бактерий на развитие Rhizobium trifolii наблюдались различные реакции исследуемых микроорганизмов. 53% типичных ризосферных микроорганизмов проявили стимулирующий эффект в отношении клубеньковых бактерий, остальные 47% такого влияния не оказывали. Разные виды микроорганизмов неодинаково действовали на развитие клубеньковых бактерий. Flavobacterium sp. В-156 и Chromobacterium sp. Б-123 обладали наиболее высоким стимулирующим влиянием на развитие разных штаммов. Под их влиянием степень развития клубеньковых бактерий, штаммов Ks 1, 4, в и 9 (по сравнению с кон-чролем} изменилась до 140, Л00, 60 и 160% и 100, 66, 120 и 180% соответственно, Следует отметить, что различий в реакции неконкурентных и конкурентных штаммов клубеньковых бактерий в отношении тест-микроорганизмов практически не обнаружено.

б. Изучение стимуляционного эффекта микроорганизмов на развитие Rhizobium trifolii в условиях симбиоза

Для исследования характера поведения клубеньковых бактерий в ризосфере расгения-хозяина и их влияния на растение на первых этапах инфицирования корневой системы, был использован метод Фэреуса (Fahraeus, 1957).

При инокулировании растений смешанными культурами. (Rh, trifolii+ ризосферные тест-микроорганизмы) наблюдалось искривление корневых волосков такое же по типу, как и в случае бактеризации одной культурой клубеньковых бактерий. В большинстве случаев число неспецифически искривленных корневых волосков при инокуляции смешанными культурами было больше, чем у растений, ннокулированных только клубеньковыми бактериями. Процент искривленных корневых волосков увеличивался по мере удаления срока со дня инокуляции. Например, Бри инохуляиин растений Rh. trifolii штаммом № 4 процент искривленных корневых волосков был 24,8 и 33,5 через 7 и 14 дней после инокуляции соответственно. Процент закрученных корневых волосков достигал 70% от общего их количества при инокуляции растений смешанной культурой (Rhiz«bium trifolii № 8-(-Pseudomonas putida B-34), при инокуляции растений только Rh. trifolii Ks 8 он был равен 35,0.

Качественный набор аминокислот, продуцируемых микроорганизмами-стимуляторами, и- степень их образования не коррелируют со степенью их стимуляционного эффекта.

в. Исследование антагонистического эффекта актиномицетов и микроскопических грибов в отношении клубеньковых бактерий фасоли (RMzobtum phaseoli)

В тяжелых суглинистых почвах Египта нередко на корнях растений фасоли отсутствуют клубеньки. Это явление связывается с токсическим эффектом почвы в отношении клубеньковых бактерий. Причина токсикоза почв не установлена. Нами из ризосферы фасоли Phaseolum vulgaris и почвы Египта были выделены культуры плесневых грибов и актиномице-тов н проверена их антагонистическая активность в отношении клубеньковых бактерий фасоли.

46% ризосферных и 18% -почвенных культур актиномице-тов характеризовались антагонистическим эффектом к клубеньковым бактериям фасоли. 58,3; 58,3; 41,6 и 25% ризо-сферных актиномицетов оказались антагонистами клубеньковых бактерий фасоли, штаммов Д400, Д405, Д7! и В1-Г23 соответственно. Подобные величины были сравнительно меньше у почвенных актиномицетов — 26,6; 26,6; 6,6 и 13,3%. Данные показывают, что актиномицеты из ризосферы фасоли более активно вырабатывают антагонистические вещества, чем почвенные актиномицеты.

Ризосферные плесневые грибы проявили подобный характер влияния, что и актиномицеты. Из исследуемых ризосферных грибов только у 28;6; 28,6; 6,6 и 14,3% выявлена антагонистическая активность в отношении Rbizobium phaseoli штаммов Д400, Д405, Д71 и В1-Г23 соответственно; из почвенных грибов —у 18,8; 18,8; 12,5 и 6,3%. 19% ризосферных грибов и 14% почвенных оказались антагонистами, что свидетельствует также о большей антагонистической активности ризосферных грибов по сравнению с почвенными.

Фильтраты исследуемых микроорганизмов препятствовали росту клубеньковых бактерий фасоли. Однако степень подавления различалась в зависимости от присхождения фильтрата и штамма Rh. phaseoli. Эти данные согласуются с результатами, полученными при посеве тест-микроорганизмов с Rh. phaseoli в чашках Петр и. Так, штамм Rh, phaseoli В1-Г23, полученный из Чехословакии, оказал активное сопротивление в отношении антибиотиков, выделяемых микроорганизмами. Степень подавления роста клубеньковых бактерий фасоли повышается с увеличением возраста тест-микроорганизмов. Максимальное подавление было обнаружено, если исследовали 8-дневиые тест-культуры актиномицетов. Возможно, это определяется присутствием большого- количества антибиотиков, синтезируемых и накапливающихся в старой культуре.

Мы полагаем, что для инокуляции растений фасоли в условиях Египта (тяжелые суглинистые почвы) следует приме-J6

нять штаммы клубеньковых бактерий, устойчивые к антагонистической микрофлоре египетских почв, в частности, такими штаммами в наших опытах оказались штаммы клубеньковых бактерий фасоли Д71 и В1-Г23 (оба.штамма получены из ЧССР).

ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ КОНКУРЕНТОСПОСОБНЫХ И НЕКОНКУРЕНТОСПОСОБНЫХ КУЛЬТУР КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ КЛЕВЕРА

Микроскопическое исследование клубеньковых бактерий клевера в сканирующем микроскопе в динамике показало, что на агаризованном бобовом отваре.клетки как конкурентоспособных (№ 4, N9 8), так и неконкурентоспособных штаммов (№ 1, № 9) имеют характерную палочковидную форму. Им свойственно типичное изоморфное деление перетяжкой, подобно другим грамотрицательным бактериям. Размеры клеток в этот период 0,6—1,0x1,6—3,2 мкм. Клетки, как правило, располагаются, одиночно или попарно. В этот период клетки хорошо прокрашиваются эритрозином и 'под световым микроскопом выглядят равномерно окрашенными. Однако, если под просвечивающим электронным микроскопом при обработке как фосфорновольфрамовой кислотой, так и хромом, на полюсах клеток почти всегда можно видеть электронно-плотные гранулы полифосфатной природы, то в сканирующем микроскопе они не выявляются.

В то же.время сканирующая электронномикроскопическая техника дает возможность выявить характер поверхности клеток бактерий (Чан Тхи Тхань, 1973). Только в очень молодых культурах (семичасовые, односуточные) клетки имеют относительно гладкую и ровную поверхность, в более старых культурах (двух-, семисуточных) она шероховата и даже бугриста. Очевидно, именно вследствие бугристости клетки клубеньковых бактерий под световым микроскопом выглядят всегда слегка-неправильными по форме палочками. У большинства клеток, особенно в старых культурах, при исследовании под сканирующим- микроскопом наблюдались нитевидные короткие выросты. Функции и природа их неясны. При старении'куль-туры (седьмые сутки) формы клеток становятся разнообразнее. Появляются более мелкие короткие палочки, длина которых «е превышает 2 мкм.

С помощью просвечивающего электронного микроскопа четко выявляются черты анатомического строения клеток, свойственные грамотрицательным бактериям. Как в клетках конкурентоспособного, так и неконкурентоспособного штамма

2 17

встречались довольно часто многослойные кольчатые мембранные структуры, соответствующие по положению мезосо-мам. Цитоплазма клеток представлена в основном гранулярным веществом рибосомальной природы. Расположение ну-клеоида соответствует осмиофобной зоне с беспорядочно разбросанными в ней осмиофильными фибриллами. Почти в каждой клетке на срезах можно увидеть электронноплотяьге гранулы полиофоофатной природы. Степень их плотности и число на клетку различны, но эти различия не связаны с конкурентоспособностью исследованных культур.

Одним из показателей метаболической активности организма является характер и степень использования кислорода в процессе дыхания. Интенсивность дыхания конкурентоспособного штамма № 4 была наивысшей и особенно резко отличалась от таковой неконкурентоспособного штамма № 1, характеризующегося низким уровнем поглощения кислорода. Вместе с тем штаммы № 8 и № 9 занимали как бы промежуточное положение по степени поглощения кислорода в единицу времени и проявляли даже противоположную закономерность. Так, у конкурентоспособного штамма № 8 поглощение кислорода в единицу времени шло несколько более замедленно, чем у неконкурентоспособного штамма № 9. У всех четырех штаммов доля поглощенного кислорода в единицу времени была приблизительно постоянной и не зависела от степени конкурентоспособности штамма.

Выводы

1. Электронном икр оскопически (сканирующий микроскоп) в сочетании с методом световой микроскопии прослежены последовательные этапы начального периода процесса инфицирования клубеньковыми бактериями клевера н люцерны соответствующего вида растения-хозяина.

2. Локализация клеток конкурентоспособных и неконкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий в зоне корневой системы растения-хозяина практически одинакова.

3. Приживаемость клубеньковых бактерий клевера в ризосфере растения-хозяина не коррелирует с конкурентными свойствами штаммов и, следовательно, неправомочно считать конкурентоспособность равнозначной приживаемости в ризосфере растения-хозяина.

4. Клубеньковые бактерии клевера и люцерны последовательно воздействуют на главные и боковые корни растения-хозяина (ярусность действия) в определенных участках-зонах корня (зональность или локальность действия), стимулируя развитие корневых волосков (особенно у растений люцерны). Их действие приурочено к определенным фазам развития

растения-хозяина (фазовость действия),. При наблюдении за процессом формирования инфекционных нитей в корневых волосках, люцерны и клевера следует учитывать данные закономерности.-

5. Установлена причина ошибочности описываемого в литературе факта внедрения клубеньковых бактерий в прямые корневые волоски, связанная с наличием нескольких разветвлений у-корневых волосков и отсутствием ориентации-инфек-ционного тяжа к корню в первый период после внедрения.

6. У клевера Trifolium pratense инфицируются обычно очень короткие корневые волоски, которые как бы замаскированы в массе более длинных корневых волосков. Это следует учитывать при наблюдении за процессом инфицирования растений клевера.

7. Разработан новый метод выявления инфекционных нитей, основанный на мацерации ткани корня и последующем окрашивании ацетокармином.

8. Различий в форме и ультра структуре клеток клубеньковых бактерий разной степени конкурентоспособности не выявлено. Не установлено корреляции между степенью поглощения кислорода в единицу времени и конкурентоспособностью исследуемых штаммов.

9. Клубеньковые бактерии разных видов не обладают пек-тинолитической суммарной, пектинметилэстеразной и поли-галактуроназной активностями. Эти данные не подтверждают «ферментативной» гипотезы внедрения клубеньковых бактерий в ткань корня бобового растения. Отсутствие пектинолн-тической активности у штаммов клубеньковых бактерий клевера, характеризующихся конкурентоспособностью, отрицательно решает вопрос о возможной связи между этими признаками.

10. При изучении влияния порознь конкурентоспособных и неконкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий клевера в условиях лабораторных и вегетационных опытов первые проявляют большую вирулентность. Инокуляция семян конкурентоспособными и неконкурентоспособными штаммами клубеньковых бактерий клевера на седьмые сутки выращивания растений дает больший эффект, чем инокуляция семян в день посева. Увеличение дозы инокулюма до нескольких миллионов клеток на одно семя способствует успеху инокуляции конкурентоспособных и неконкурентоспособных клубеньковых бактерий в условиях лабораторных (на агаре) и вегетационных (на дерново-подзолистой окультуренной почве) опытов.

П. В условиях тяжелых суглинистых почв Египта, где клубеньки на корнях растенийфасоли при инокуляции семян Rhizobium phaseoli местными штаммами (№ Д400, Д405, Д71, В1-23), практически не образуются вследствие подавле-

ния клубеньковых бактерий антагонистической микрофлорой почв, целесообразно для обработки семян фасоли применять устойчивые к микроорганизмам-антагонистам эффективные штаммы Rhizobium phaseoli. В наших опытах такими штаммами оказались Rh. haseoli № Д-71, В1-23, полученные из ЧССР.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах автора:

1. Ibrahim A. N„ Kamel М„ Shatta А. М. Occurence of antagonistic microorganisms in the rhizosphere of Phaseolus vulgaris. Agrochemistry and Soil Science, T. 20, No 1—2, 36—44, 1971.

2. Шилытикова В. К., Шатта А. М., Веселер 3. И., Агаджа-нян К. Г. Проверка гипотезы внедрения клубеньковых бактерий в ткань бобового растения. Изв. ТСХА, № 3, стр. 3, 1974.

3. Шильникова В. К.., Ярыгин Л. А., Шатта А. М. Начальные стадии процесса инфицирования люцерны 'клубеньковыми бактериями. Изв. АН СССР, Сер. биол. № 2, 1975.

Результаты исследований, изложенные в диссертации, докладывались на конференции ТСХА (декабрь, 1974).

Объем 1'Д п. л.

Тираж 150

Заказ 268.

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 1250Э8, Москва А-8, Тимирязевская ул., 44