Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Проточные бесклеточные системы сопряженной транскрипции-трансляции и репликации-трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Проточные бесклеточные системы сопряженной транскрипции-трансляции и репликации-трансляции"

РГБ ОД

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ хм. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи УДК. 547. 963. 3

МОРОЗОВ ИГОРЬ ЮРЬЕВИЧ ,

ПРОТОЧНЫЕ БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ СОПРЯЖЕННОЙ ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ И РЕПЛИКАЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ

ОЗ.00.03-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1994

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик А.С.Спирин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доктор биологических наук,

академик А.А.Богданов профессор Н.И.Матвиенко

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Зашита диссертации состоится 1994 г.

В 1Я- _ час на заседании Специализированного совета

Д 053.03. 70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан

«ÜL»

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Б. Н. Каграмано

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие техники рекокбинантных ДНК и методов экспрессии in vivo клонированных генов привело к так называемой биотехнологической революции, однако экспрессия in vivo чужеродных и синтетических генов находится под жестким контролем клетки, что приводит ко множеству ограничений. Эти проблемы, в принципе, могут быть решены с помощью бесклеточных систем экспрессии генов. Отсутствие механизмов клеточного контроля и возможность манипулировать составом инкубационной смеси делает , бесклеточные системы привлекательными. Однако короткое время ¡кизни и низкий выход белка были основными ограничениями, не допускавшими использование классических бесклеточных систем для препаративной экспрессии генов.

Одним из перспективных подходов для повышения эффективности экспрессии генов in vitro представляется сопряжение размножения кРКК и белкового синтеза . Размножение КРНК может осуществляться в сопряжённых системах с использованием как ДНК-, так и РНК-зависимых FHK-полкиераз. Синтез РНК с помощью бактериофаговых репликаз (например, Qp-репликазы), в отличие от транскрипции, можно проводить в экспоненциальном режиме, что является безусловным преимуществом для получения мРНК в препаративных .количествах. Однако это не решает проблемы последующей экспрессии мРНК из-за короткого времени жизни и низкого выхода белка классических бесклеточных системах трансляции, представляющих собой статические инкубационные смеси с постоянным обьемом.

В 1988 г. в Институте белка РАН академиком А. С. Спкркнык с сотрудниками было показано, что трансляция в течение длительного периода временя, приводящая к высокому выхода белка, может быть достигнута в проточных, так называемых CFCF-системах, где синтез полипептида проходит не в фиксированном объеме инкубационной смеси, а в протоке питательного раствора через бесклеточный экстракт. CFCF-система (continuous-flow cell-free system) обладает всеми преимуществами как клеточных, так и бесклеточных подходов для препаративной экспрессии генов, и лишена их ограничений и недостатков. Такие системы способны функционировать в длительном режиме, линейно синтезируя в течение десятка часов заданный полипептид с высоким выходом.

Целью настоящей работы была разработка высокоэффективных

CFCF-систем экспрессии генов, основанных на совмещении принципа протока с сопряжением синтеза кРНК и белка.

В связи с этим была поставлена экспериментальная задача экспрессии гена бактериальной дигидрофолат редуктазы (ДГФР) в сопряженных CFCF-систеках: 1) транскрипции-трансляции, содержащих эндогенную Е.coli или экзогенную фаговую SP6 РНК-полимеразы, и 2) репликации-трансляции с использованием ОЭ-репликазы. Научная новизна и практическая ценность работы. 1. Разработаны прокариотические проточные бесклеточные системы сопряженной транскрипции-трансляции с использованием РНК-полимераз Е.соli и фага SP6 для препаративного синтеза белка. 2. При трансляции в бесклеточной системе рекомбинантной RQ-мРНК, полученной путем клонирования бактериальной дигидрофолат редуктазы (ДГФР) в определенное место малой реплицирующейся RQ1351(-) РНК (сателлита фага QP), наблюдается увеличение эффективности трансляции и времени полужизни этой РНК по сравнению с контрольной. Показано, что RQ-ДГФР мРНК способна реплицироваться РНК-зависимой РНК-полимераз ой фага Q/3 (Q/3-репликазой). Сделан вывод о влиянии на трансляцию, стабильность и репликацию рекомбинантной RQ-иРНК 5'- и 3'-нетранслируемых участков малой RQ135 РНК. Показано, что при добавлении Qg-репликазы в бесклеточную систему трансляции наблюдается а) асимметричная амплификация RQ-ДГФР мРНК, при которой смысловые (+) цепи РНК синтезируются в избытке по отношению к антисмысловым (-) цепям рекомбинантной мРНК, б) взаимоусиливающий (синергический) эффект трансляции к репликации рекомбинантной RQ-ДГФР РНК, в) повышение эффективности CFCF-системы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференциях Института белка РАН (Пущино, 1989, 1993), на международных симпозиумах "Molecular organization of Biological Structures" (Москва, 1989) и "Modern Problems of Physical-Chemical Biology and Biotechnology" (Алма-Ата, 19891. Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии МГУ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована ^?Грисункаки и /'f таблицами. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Препаративная экспрессия генов в бесклеточных системах с использованием плазмидных ДНК.

Как отмечалось выше, существовавшую до недавнего времени проблему низкого выхода синтезированного продукта в бесклеточных системах удалось решить созданием проточных бесклеточных систем трансляции непрерывного действия (CFCF-систем). Эти бесклеточные системы трансляции нуждаются в очищенной индивидуальной предсинтезированной мРНК, препаративное получение которой является дополнительной и дорогостоящей процедурой. Одним из возможных решений этой проблемы могло бы быть сопряжение процессов транскрипции и трансляции в проточной системе.

Для исследования такой возможности была экспрессирована плазмида pDF34, содержащая гены /3-лактамазы и дигидрофолат редуктазы (ДГФР), в CFCF-системе на основе S30 экстракта из Е.coli. S30 экстракт содержал эндогенную РНК-полимеразу, способную транскрибировать плазмиду pDF34, в результате чего достигалось сопряжение транскрипции и трансляции в CFCF-систеке.

На рисунке 1 показана кинетика ДНК-зависимого синтеза белков,

j>

о зг

лГ о с о \о

>2 3 х X

о а о о.

10 QJ

н г э

о

kD ••

а» Ащ^т. »t •

1S4 4*2 •

Знл/ч •.* 1 /

>

-2 мл/ч

j ¿Г 0,008

f^ 0,004

,/Змп/ч f Лм 1

1/ • i i 0,5 1,0 t

200

100

20

40

60

4

2

Время, ч

рис.1. Кинетика экспрессии генов (З-яактамазы (1) и ДГФР (2) в проточной системе с S30 экстрактом из E.coli, содержащим эндогенную РНК-полимеразу. Вставка: кинетика белкового синтеза в стандартной системе того же состава и объёма .

закодированных в плазмиде pDF34, при инкубации системы в течение 55 часов при 37°С, с использование» ультрафильтрационной нембраны ХМ-100. Как видно, эффективность работы систены зависит от скорости протока питательной смеси: изменение скорости от 3 до 2 мл/ч уменьшает скорость синтеза более чем в 2 раза, а последующее переключение скорости с 2 до 3 мл/ч восстанавливает исходную скорость синтеза. Суммарный выход белка составил около 200 нкг (4 нмол) на 1 мл инкубационной смеси (выход продукта в статической системе с постоянным объёмом составил -0.4 мкг (8 пмол), рис. 1, нижняя вставка). Оба продукта, g-лактамаза (I) и ДГФР (2), синтезировались приблизительно в эквимолярных количествах (рис.1).

Однако имеются несколько лимитирующих факторов в использовании эндогенной РНК-полимеразы в бактериальном экстракте. Эти ограничения могут быть обойдены использованием сопряженных систем транскрипции-трансляции с экзогенными бактериофаговыми РНК-полимеразами вместо эндогенной клеточной РНК-полимеразы. Используя последовательность гена, находящегося в виде ДНК под контролем промотора (SP6) и соответствующую РНК-полимеразу можно получить эффективную транскрипцию мРНК с ДНК в проточной системе

л с: о £

с 450 х о с:

<D

\о

300

X г о ш

а. 150 э

О 6 12 18 24

Время, ч

Рис.2. Экспрессия гена ДГФР в проточной системе с S30 экстрактом из E.coli, содержащим экзогенную РНК-полимеразу фага SP6. Вставки: а) электрофоретичесхий анализ синтезированного продукта в фильтрате, через 5, 15 и 24 часа работы системы, б) кинетика синтеза ДГФР в стандартной системе того же состава и объёма.

я, следовательно, вместо индивидуальной мРНК, можно прямо использовать плазмидную ДНК для экспрессии генов в CFCF-системе. И как оказалось, такая система стабильна, способна к длительному и эффективному синтезу одного заданного белка.

На рисунке 2 показаны результаты экспрессии плазмиды pSP65, содержащей гены ДГФР под контролен SP6-промотора и ß-лактамазы под контролем промотора РНК-полимеразы E.coli. В инкубационную снесь была добавлена бактериофаговая SP6 РНК-полимераза. В эксперименте использовали ультрафильтрационную мембрану YM-100. Питательный расвор содержал антибиотик рифампицин для специфического ингибирования эндогенной клеточной РНК-полимеразы. Синтез вели около 24 часов прк 37°С. Выход белка составил - 400 пнол (в статической системе того же объёма смеси -1.5 пмол, рис. 26). Электрофоретический анализ синтезированного продукта с последующей авторадиографией обнаруживает единственную основную полосу, соответствующую ДГФР (рис.2а).

2. Амплификация матричной РНК в бесклеточной системе трансляции.

Q/3-репликаза (РНК-зависимая РНК-полимераза) обладает уникальной способностью эффективно размножать "свою" ("родную") РНК in vi tro. При амплификации природных ("родных") матриц QíS-репликазой, как исходная, так и вновь синтезированная комплементарная РНК являются одинаково эффективными для последующих циклов репликации, что приводит к экспоненциальному росту количества РНК. Qß-репликаза, кроме РНК фага - Qß, может амплифицировать целый класс малых реплицирующихся РНК, т. н. RQ РНК, размеры которых варьируют от десятков до сотен нуклеотидов. Они обнаружены в составе <20 фага и в зараженных им клетках. В противоположность эффективно реплицирующимся природным РНК (Qß и RC). чужеродные РНК не могут участвовать более чек в одном цикле репликации из-за образования дуплекса между исходной матрацей и продуктом реакции. Такой дуплекс не способен узнаваться Q/3-репликазой. Известно, что небольшие вставки чужеродной РНК (длиной до несколько десятков нуклеотидов) в RQ РНК могут реплицироваться Qß-репликазой. Однако, рекомбинантные РНК с более длинными вставками не способны к экспоненциальному синтезу in vitro, хотя, некоторые из матричных РНК, встроенные в RQ РНК, приобретают способность амплифицироваться Qß-репликазой in vivo. Была исследована способность мРНК ДГФР, фланкированной

последовательностью RQ135 гРНК, амплифицироваться в бесклеточной системе трансляции из Е. coli. 2.1.Конструкция реконбинантной мРНК.

В работе была использована рекомбинантная РНК (RQ-ДГФР РНК), содержащая кодирующую последовательность мРНК ДГФР из Е. coli, встроенной внутрь налой RQias^Î-ÎPHK, являющейся одной из эффективных матриц для Qß-репликазы. Структуры RQ1351(-)PHK и КО~ДГФР( +}РНК. показаны на рисунке 3. мРНК начиналась с GGG и заканчивалась ССС, что характерно для любой реплицирующейся РНК.

V А

С С С G С С

и л

А V

б С A Ü G С А С

а с

и—и-Ü с

а и-с с с с с с А и

с с с с с с и А с с

A U

С G С U

С С С А

С G С G С С и А A U С G С С

G С G С / А 5' \

D

° RQ135- т(-) Т7 Promoter jejt

4__

aaacttMGGG HtndM 53 15

RQ135-1(-> DHFR gene nght

ттш::^

4SÛ

CCCggg 60 $ma I

Ркс.З. Конструкция рекокбинантной RQ-ДГФP РНК. (Л) вторичная структура RQ135(-)РНК. (Б) схека Шпй111/5ша1 фрагмента плазмиды pT7RQ135(-)ДГФР(+).

2.2 Трансляция и стабильность реконбинантной НСЦ35_1(-)ДГ2Р(+) нРНК в бесклеточных системах.

На рисунке 4 показаны результаты трансляции кРНК ДГФР (1) и RQ-ДГФP (2) в 5100 бесклеточной системе трансляции. Видно, что несмотря на идентичность ранних кинетик трансляции, эффективность белкового синтеза на реконбинантной кРНК выше из-за белее продолжительной кинетики трансляции (до 90 минут), рисунок 4А. Сравнение кинетик деградации этих кРНК при трансляции в системе 8100 показало, что более ранний выход на плато контрольной мРНК ДГФР коррелирует с более быстрой деградацией этой мРНК в инкубационной смеси (рис.4Б). Различия в эффективности трансляции и устойчивости к рибонуклеазной деградации этих мРНК становится более выраженными в бесклеточной системе, основанной на использовании грубого 830 экстракта (рис. 5), обладающего более

и и

U

и V

? О

В о. о

й га ю со

100 80 60 40

20 О

30 60 90

Время, мнн

<-ЛГ»Р

й О'

10' 20' 40' 00* Э0' ** т Ш «ж

О' 10' 20' 40' 60' 90'

0 5 X 9 9 9

гг

Рис.4. Экспрессия мРНК ДГФР в ЭЮО бесклеточной системе трансляции. (А) кинетика синтеза белка ДГФР (контрольной мРНК ДГФР ;1) или ИО-ДГФР РНК (2)) и электрофоретический анализ продуктов реакции к 90 минутам инкубации, с последующей авторадиографией [вставка внутри). (В) электрофоретический анализ кинетик цеградации мРНК при трансляции в бесклеточной системе. В качестве чаркёров (г?) использовались соответствующие мРНК.

:ильной нуклеазной активностью по сравнению с белковой фракцией 3100 и очищенными рибосомами.

1.3. Усиление репликации рекомбинантной мРНК в присутствии бесклеточной системы трансляции.

На рисунке 6А показаны результаты репликации НО-ДГФР РНК 5)3-репликазой в чистой системе репликации. Как видно, юлноразмерная РНК синтезируется уже через 10 минут, дальнейшая же шкубация не приводит■ к значительному нарастанию количества фодукта (рис.бА). В то же время, исходная мРНК ДГФР практически ге реплицируется в тех же условиях (рис.6Б; 1). Предполагается, ;то присутствие элементов 1*0135 ]РНК усиливает узнавание 1екомбинэнтной мРНК О/З-репликазой.

На рисунке 6Б показано, что сопряжение О0-репликазной реакции

с работающей бесклеточной системой трансляции из Е.coli приводит к резкому усилению синтеза рекомбинантной RQ-ДГФР РНК (рис.6Б; 2, 3). В противоположность этому, полная бесклеточная система трансляции не стимулирует синтез РНК, если в качестве матрицы использовалась котрольная «РНК ДГФР (не показано). 2.4. Усиление репликации рекомбинантной мРНК происходит за счет вовлечения смысловых цепей в трансляцию.

Быстрая кинетика репликации 110-ДГФР( +) РНК (а также и (-) версий РНК - не показано) предполагает, что одноцепочечные формы

♦ДГФР

20 30

Время, мин

R 0* 2'5' 10'20" В О'2' 5' 10'20'

Рис.5, Экспрессия мРНК ДГФР в БЗО бесклеточной системе трансляции. (Л) кинетика синтеза белка ДГФР (контрольной мРНК ДГФР (1) или КО-ДГФР РНК (2)) и электрофоретический анализ продуктов реакции к 30 минутам инкубации, с последующей авторадиографией (вставка внутри). (Е) электрофоретический анализ кинетик деградации мРНК пр« трансляции в бесклсточной системе.

рекомбинантных РНК являются хорошими матрицами для 0/3-репликазы. Но отсутствие нарастания синтеза продукта (РНК) в дальнейшем говорит о том, что эти матрицы становятся не доступными (или менее доступными) для последующих циклов размножения, возможно из-за образования двуцепочечных структур между исходной РНК и продуктом.

Рис.6. Электрофоретический анализ продуктов репликации рекомбинантных мРНК: одноцепочечные [ ss) и двуцепочечные (ds) формы RQ-ДГФР РНК. (Л) синтез РНК с использованием 2 мкг очищенной Q/3-репликазы и 1 мкг И<5-ДГФР( + )РНК. (Б) синтез РНК с использованием 1 мкг Qp-репликазы, 1 икг контрольной мРНК ДГФР (1) или 1 мкг RQ-ДГФР(+)РНК (2 и 3) в отсутствии (1 и 2) или в присутствии (3) полной бесклеточной системы трансляции.

Это предположение нашло своё подтверждение в эксперименте, где вновь синтезированные (+) и (-) цепи, полученные в реакции, разделялись после расплавления и отжига с большим (20-ти кратным) избытком немеченной RQ^r$P( + ) РНК. В результате этого, меченные (-) версии РНК переходят в двуцепочечную форму (дуплекс), в то время, как большинство (+) цепей РНК остаются в виде одноцепочечной РНК и, следовательно, легко отделяются от (-) цепей электрофорезом в полиакриламидном геле. Из рисунка 7А видно, что в чистой системе при репликации RQ-ДГФР!+)РНК синтезируются в основном (-) цепи, в то время как ( + ) цепи едва детектируются (рис. 7А, 1). Из этого следует, что синтезированные Q/3-репликазой (-) версии РНК не могут участвовать в следующих циклах репликации. В то же время, в присутствии бесклеточной системы трансляции ( + ) цепи синтезируются в большой количестве (рис.7А, 2), что свидетельствует о том, что синтезированные в первом раунде репликации (-) цепи доступны для последующих циклов репликации.

Такая способность рекомбинантных мРНК эффективно реплицироваться in viro и в присутствии бесклеточной системы трансляции может быть связана, например, с участием некоторых клеточных РНКгсвязывающих белков, которые препятствуют образованию неактивных двуцепочечных форм РНК (отжигу). Однако, в неполной бесклеточной системе трансляции, не содержащей рибосом или S100 белковой фракции, не наблюдается ни усиления репликации RQ-ДГФР ни значительного синтеза (+) цепей рекомбинантной мРНК. Более того,

Л 1__2__3 , , . 4__5

10' 30' 90' 10' 30' 90' 10' 30' ЭО' 10" 30' 90' 10" 30' 90"

Б

Время, мин

Рис.7. Анализ вновь синтезированных [3*Р] (+) и (-) цепей RQ-ДГФР РНК 03-репликазой. (Л) результат разделения меченных (+) и (-) цепей гель-электрофорезом после расплавления и отжига их с избытком немеченной (+) RQ-мРНК. (Л) Синтез РНК в чистой системе репликации (1), в присутствии полной бесклеточной системы трансляции без добавления (2) или с добавлением О.S мМ пуромицина (3). Синтез РНК в присутствии неполной системы трансляции: или без S100 белковой фракции (4) или без рибосом (5). (Б) кинетика синтеза ( + ) (А) и (-) (А) цепей РНК в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции.

эффект стимуляции репликации RQ-ДГФР РНК бесклеточной системой трансляции исчезает в присутствии пуромицина, специфического ингибитора белкового синтеза (рис.7А, 3). Эти результаты предполагают, что репликация RQ-ДГФР РНК усиливается из-за вовлечения (+) цепей РНК в трансляцию. в поддержку этого предположения говорит тот факт, что репликация исходной RQ135 jPHK, не содержащей кодирующей последовательности, не стимулируется в присутствии бесклеточной системы трансляции, и почти не ингибируется пуромицином (рис.8).

2.5. Асимметричный синтез рекойбинантной мРНК в сопряженной

бесклеточной системе репликации-трансляции.

Время, мин

Рис.8. Репликация 110135 РНК в отсутствии (0, • ) или присутствии (Д, А) полной бесклеточной системы трансляции, без добавления (О.Л ) или с добавлением (• ) 0.5 нМ пуромицина.

В противоположность "симметричной" репликации Е0-135_1РНК в чистой системе, где комплементарные цепи синтезируются приблизительно в эквимолярных количествах, (+) цепи рекомбинантной ЕО-ДГФР РНК синтезируются в избытке по отношению к (-) цепям в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции, где в качестве исходной матрицы выступала смысловая (+) цепь рекомбинантной мРНК. Видно, что количество антисмысловых цепей, синтезированных на ранних временах, остается в дальнейшей почти неизменным, а синтез смысловых - продолжается в течение всего времени инкубации, и к 90 минутам, количество синтезированных (+) цепей становится - в 5 раз больше, чем (-) цепей РНК (рис. 7Б). 2. 6. Усиление трансляции, сопряженной с репликацией Я0~ДПР( + )РНК.

Добавление ор-репликазы в бесклеточную систему трансляции, где в качестве матрицы использовалась ( + ) цепь 142-ДГФР РНК, ТАБЛИЦА 1. Ферментативная активность синтезированной ДГФР к 90 минутам инкубации в бесклеточной системе трансляции 1*0-ДГФР( +)РНК.

Активность ДГФР

Добавленная С >(?-репликаза, Синтезированный Суммарная, Удельная,

мкг белок, пмол ед. »10 ед. х 10"/пмол

0 0. 078 8. 4 1. 1

1 0. 144 17. 7 1. 2

2 0. 195 28. 2 1. 4

приводит к увеличению синтеза функционально активной дигидрофолат

редуктазы (рис.9А и 9Б, дорожки 1 и 2, Таблица 1).

Усиление экспрессии 1}Сг-ДГФР1 + )РНК в сопряженной бесклеточной системе репликации-трансляции не связано с простой активацией трансляционного аппарата ((2|3-репликаза содержит клеточные ЕЕ-Ти, ЕГ-Тэ и белки), т.к. добавление в/З-репликазы не влияет на трансляцию контрольной кРНК (рис.9Б, дорожки 3 и 4).

Результаты выше описанных эсперикентов по трансляции и репликации КО-кРНК в бесклеточных системах показали, что эффективность экспрессии мРНК ДГФР, встроенной внутрь малой ЙСНЗЗ ^НК, повышается в несколько раз по сравнению с исходной

Б

I 2 _ Д _ 4

.„,' ' ': «.дгфр

Время, иин

Рис.9. Синтез дигидрофолат редуктазы в S100 бесклеточной системе трансляции. (Л) кинетики трансляций 1 мкг RQ-ДГФР(+)РНК з отсутстви [• ,0) или присутствии 1 мкг (^7 , й) или 2 мкг (■) Q/3-репликазы, без добавления (e.V.e) или с добавлением (0,Д) 0.5 мК пуромицина. (В) электрофоретический анализ синтезированного белка ДГФР к 90 минутам инкубации с 1 мкг Н0-ДГФР(+)РНК (1, 2) или с 1 мкг контрольной мРНК ДГФР (3, 4) в отсутствии (1, 3) или в присутствии (2, 4) экзогенно добавленной 2 мкг <20-репликазы.

матрицей в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции

(см. рис.9). Это происходит, возможно, за счет того, что

рекомбинантная RQ-ДГФР РНК приобретает, по крайней мере, два

свойства вирусных РНК: 1) относительную защиту от рибонуклеазной

деградации, и 2) способность амплифицироваться <20-репликазой.

Известно, что введение вирусных 5'- и 3'-нетранслируемкх последовательностей усиливают трансляцию мРНК in vivo и in vitro.

А

Однако, в нашем случае, нетранслируеные последовательности имеют невирусное происхождение, т. к. К0135 ^НК не обнаруживает гомологии с РНК 00 фага и почти вся её последовательность - это продукт рекомбинации гетерологичных РНК. Повышенную стабильность БО-мРНК к нуклеазам, по сравнению с контрольной, можно объяснить сильно выраженной вторичной (и возможно третичной) структурой 1*0135 ^РНК (см. рис.3), состоящей из черешка, образуемого взаимно комплементарными концевыми участками, и примыкающей к нему шпильки. Предполагается, что при конструировании НО-ДГФР РНК, вышеописанная структура сохранилась, поскольку данная рекокбинантная кРНК способна амплифицироваться 520-репликазой.

Также видно, что при комбинировании репликации и трансляции рекомбинантной ИО-мРИК получается истинное сопряжение этих двух процессов. Они активно влияют друг на друга, проявляя синергическое действие. Суммарный эффект может быть достигнут только сопряжением этих двух процессов.

Однако, наблюдаемая стимуляция трансляцией репликации К(2-ДГФР РНК неожиданна и не стыкуется с известным фактон, что трансляция и репликация ( + ) цепи <2(3 РНК взаимоисключают друг друга (наблюдается взаимное ингибирование этих двух прцессов), поскольку имеют различную направленность. Решение этого противоречия связано, как кажется, с двумя фактами, полученными в данной работе: во-первых, с ограничением вовлечения Ж2-ДГФР РНК во второй и последующие циклы репликации в отсутствие бесклеточной системы трансляции, вероятно из-за. дуплексообразования между исходной и вновь синтезированной РНК, и, во-вторых, с асимметричным синтезом смысловых и антисмысловых цепей рекомбинантной мРНК в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции. Вовлечение (+) цепей РНК в трансляцию, с одной стороны, ингибирует синтез (-) цепей РНК из-за конкуренции между Ор-репликазой и рибосомами, а с другой стороны, усиливает репликацию благодаря предотвращению дуплексообразования (+) и (-) цепей РНК. Когда, в качестве матрицы, используется хорошо реплицирующаяся РНК <3(3 фага, наблюдается только эффект ингибирования.

Накапливанию большого количества смысловых цепей РНК в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции помогают рибосомы (используя их в качестве матрицы для белкового синтеза), и при этом некоторая часть (+) цепей используется и для синтеза

(-) версий РНК. Стимуляция репликации в сопряжении с трансляцией проявляется на RQ-ДГФР РНК, а не на Q0 РНК, как матрице, возможно из-за присутствия в последнем случае специального регуляторного механизма, при помощи которого Qp-репликаза освобождает QJ3 РНК от рибосом конкурентным связыванием с инициаторным участком цистрона белка оболочки.

Кроме этого, в сопряжённой бесклеточной системе репликации-трансляции, растущие ( + ) цепи рекомбинантной РНК могут быть доступны рибосомам ещё'до того, как их вторичная и третичная структура будет сформирована, в результате чего создаются более благоприятные условия для инициации трансляции. Участие растущих (+) цепей в белковом синтезе, в свою очередь, объясняет увеличение эффективности репликации в сопряжённой системе (как in vitro, так и in vivo). В этой случае, трансляция вновь синтезированных (+) цепей РНК рибосомами может препятствовать образованию двуцепочечных структур с комплементарными (-) цепями (дуплексу), который не узнается как матрица Q^-репликазой.

3. Соряженная репликация-трансляция амплкфицмруюаейся RQ-ДГФР нРНК в проточной Бесклеточной системе.

Как отмечалось выше, мРНК приобретает способность одновременно и реплицироваться QiS-репликазой и транслироваться рибосомами в бесклеточной системе, если она встроена внутрь последовательности малой RQ135 jPHK. При сопряжении репликации и трансляции наблюдается взаимоусиливающий (синергический) эффект. Исходя из этого следовало бы ожидать, что сопряженная непрерывная бесклеточная система репликации-трансляции будет более эффективна по сравнению с CFCF-системой трансляции. Поэтому было проведено сравнение эффективностей трансляции амплифицирующейся

RQ—ДГФР (+)РНК в CFCF-системе в присутствии и в отсутствии Q/S-репликазы. Видно, что добавление Q/3-реплнказы приводит к 3 кратному увеличению синтеза белка за 24 часа инкубации (рис.10).

Различия в скорости, и, следовательно в продуктивности, по-видимому, связаны как с постоянным синтезом смысловых цепей <2£-репликазой, так и с более эффективной инициацией трансляции растущих (+) цепей РНК (не успевших приобрести полную пространственную структуру). Следовательно, при минимальном количестве мРНК можно получить длительно работающую систему, и при этом максимальный выход белкового продукта, используя только два

R/TR

«ДГФР

5

200 -

100 -

10 15 20

Время, ч

Рис.10. Трансляция рекомбинантной RQ-flr*P(+)PHK в CFCF-системах. (Л) кинетика синтеза бека ДГФР в присутствии (R/TR) И отсутствии (TR) Q/3-репликазы. (В) электрофоретический анализ с последующей авторадиографией белкового продукта в фильтрате после 5, 15 и 24 часов инкубации в системах трансляции (TR) и сопряжённой репликации-трансляции (R/TR).

природных принципа: протока и воспроизведения генетического материала в виде РНК с последующим синтезом белка.

ВЫВОДЫ

1. Разработана проточная бесклеточная система препаративной экспрессии генов, основанная на сопряженной транскрипции-трансляции с использованием принципа непрерывного отвода продуктов реакции и восстановления исходных концентраций низкомолекулярных субстратов в инкубационной смеси. Установлено, что скорость белкового синтеза зависит от скорости протока питательного раствора. Показано, что за 20-50 часов линейного синтеза из 1 мл инкубационной смеси можно получить до 4000 пколей белка - дигидрофолат редуктазы (ДГФР) - с чистотой - 70%.

2. Показано, что рекомбинантная мРНК (RQ-ДГФР), полученная путей клонирования последовательности ДГФР внутрь малой реплицирующейся RQ135_1PHK, обладает улучшенными трансляционными свойствами, по сравнению с ДГФР мРНК, и способна реплицироваться Qß-репликазой, благодаря присутствию 5' и 3' нетранслируемых участков RQ135 ^НК.

3. Показано, что повышение эффективности трансляции рекомбинантной RQ-ДГФР мРНК по сравнению с контрольной ДГФР мРНК, происходит, по крайней мере, за счет увеличения ее времени

полужизни в бесклеточных системах. Этот эффект может объясняться высокой структурированностью нетранслируемых RQ-областей реконбинантной мРНК, защищающей от действия рибонуклеаз.

4. Изучено взаимное влияние репликации и трансляции RQ-ДГФР мРНК в бесклеточной системе. Показано, что сопряжение Q^-репликазной реакции и трансляции приводит к: а) значительному повышению эффективности репликации реконбинантной мРНК; б) асимметричной репликации (смысловые (+) цепи РНК синтезируются в 5-кратном избытке по отношению к антиснысловым (-) цепям) за счет предотвращения дуплексообразования вовлечением смысловых цепей реконбинантной мРНК в трансляцию; в) усилению синтеза функционально активного белка ДГФР благодаря амплификации RQ-ДГФР мРНК в бесклеточной систене.

5. Проведено сравнение эффективности синтеза белка на RQ-ДГФР мРНК в проточных системах трансляции и сопряжённой репликации-трансляции. Показано, что добавление Q/3-репликазы повышает эффективность CFCF-систекы в 3 раза.

основные материалы диссертации опубликованы в статьях: 1-Baranov V.I., Alakhov Yu.B., Morozov I.Yu., Ovodov S.Yu., Ryabova L.A. & Spirin A.S. Preparative gene expression in cell-free systems. Abstracts of conf. "Molecular Organization of Biological Structures". June 19-24, 1989, Moscow.

¿.Ryabova L.A., Baranov V.I., Alakhov Yu.B., Morozov I.Yu., Ovodov S.Yu. & Spirin A.S. Preparative gene expression in cell-free systems. Abstracts of conf. "Modern Problems of Physical-chemical Biology and Biotechnology". September 21-23, 1989, 51, Alma-Ata. ¿.Baranov V.I., Morozov I.Yu., Ortlepp S.A. S Spirin A.S. Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. - Gene, 1989, 84, p. 463-466.

4.Morozov I.Yu., CJgarov V.I., Chetverin A.B. , & Spirin A.S. Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 9325-9329.

5.Ugarov V.I., Morozov I.Yu., Jung G.Y., Chetverin A.B. & Spirin A.Si- Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems. - FEBS Lett., 1994, 341, p. 131-134.

6.Morozov I.Yu., Ugarov V.I.' & Spirin A.S. Coupled replication-translatiqn of amplifiable dihydrofolate reductase mRNA