Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Противовирусное и иммуномодулирующее действие бетулина при вирусных респираторных инфекциях крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Противовирусное и иммуномодулирующее действие бетулина при вирусных респираторных инфекциях крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ВЕЛИЧКО Галина Николаевна

ПРОТИВОВИРУСНОЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БЕТУЛИНА ПРИ ВИРУСНЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЯХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2008

003456610

На правах рукописи

ВЕЛИЧКО Галина Николаевна

ПРОТИВОВИРУСНОЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БЕТУЛИНА ПРИ ВИРУСНЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЯХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой стеиени кандидата биологических наук

Щелково - 2008

Работа выполнена в лаборатории диагностики и профилактики респираторных болезней лошадей и крупного рогатого скота ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук и в лаборатории противовирусного иммунитета ГУ научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук

Щегловитова Ольга Николаевна

кандидат ветеринарных наук, лауреат премии Совмина СССР, Шуляк Анна Федоровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Пронин Александр Васильевич

доктор биологических наук, профессор Смоленский Владимир Иванович

Ведущая организация - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии»

Защита состоится 12 декабря 2008 г. в 10 час на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская область, Щелковский р-н, п/о Кашинцево, ВНИТИБП, тел/факс (495) 526-43-74; vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 11 ноября 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ' Ю.Д.Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуплыюсть темы. Доминирующую роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота (КРС) играют вирусы и, прежде всего, вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС).

Основным методом борьбы с ИРТ и ВД-БС КРС является вакцинация, эффективность которой зависит от качества применяемых вакцин, схемы иммунизации, состояния иммунной системы животных. Вакцинация в большинстве стран не является обязательной, поэтому всегда остается поголовье восприимчивых животных и возможность возникновения новых вспышек. В связи с этим поиск препаратов различного происхождения, обладающих лечебным и профилактическим действием, является актуальным.

С этой точки зрения представлялось перспективным испытать препарат «Бересты экстракт сухой», в дальнейшем именуемый «бетулин», компании «Березовый мир», полученный из коры березы и содержащий смесь тригерпе-новых соединений, главным компонентом которого является пентациклический тритерпеновый спирт бетулин.

При доклинических и клинических испытаниях в медицинской практике бетулин проявил самые разнообразные свойства: антисептическое, бактерио-стагическое и бактерицидное, антигипоксическое, антимутагенное, гепатопро-текторную активность, профилактическое действие в отношении туберкулеза, противовирусное и интерферониндуцирующее действие при гриппе и гепатите С на лабораторных животных.

Цель работы. Цель исследований заключалась в изучении лечебно-профилактической эффективности бетулина при вирусных респираторных инфекциях КРС.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: - изучить терапевтическую и профилактическую эффективность бетулина у крупного рогатого скота разных возрастных групп;

\

- оценить влияние бетулина на функционирование системы интерферона (ИФН) у инфицированных телят;

- изучить вирулицидное действие бетулина;

- разработать модель инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами на основе культуры эндотелиальных клеток (ЭК) кровеносных сосудов;

- исследовать способность культур ЭК продуцировать ИФН и цитокины при инфицировании респираторными вирусами и под воздействием бетулина.

Научная новизна.

Выявлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ. Установлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при смешанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС.

Впервые показана способность бетулина индуцировать синтез ИФН в организме телят при экспериментальной инфекции и вакцинации против ИРТ.

Впервые установлено вирулицидное действие бетулина в отношении вирусов ИРТ и ПГ-3.

Разработаны оптимальные условия выделения и культивирования ЭК кровеносных сосудов КРС.

Разработаны модели инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами КРС на основе культур ЭК. Установлена обратная зависимость между способностью респираторных вирусов индуцировать ИФН и их репродукцией в культурах ЭК КРС и человека.

Впервые показана способность бетулина индуцировать в культуре ЭК провоспалительные цитокины.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать бетулин для лечения и профилактики респираторных болезней, вызванных вирусами ИРТ и ВД-БС; получен патент: Я и №2278683 С1, 2004, «Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота»

Г.Н.Величко, А.Ф.Шуляк, О.Н.Щегловитова, К.П.Юров, В.В.Балакшин, Г.А.Прсснова, А.Н.Чистяков.

Разработаны и утверждены Ученым Советом ВИЭВ «Методические рекомендации по культивированию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов крупного рогатого скота» и «Методические рекомендации по применению бе-тулина при вирусных респираторных болезнях крупного рогатого скота» протокол № 10 от 2008 г.

Культура эндотелия кровеносных сосудов КРС может служить моделью для изучения:

- патогенеза вирусных болезней;

- оценки продукции ИФН и цитокинов при вирусных инфекциях;

- для скрининга лекарственных средств.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования, анализ и обобщение результатов выполнены автором самостоятельно при участии научных руководителей А.Ф.Шуляк и О.Н.Щегловитовой. Исследования по применению ПЦР для выявления ДНК вируса ИРТ выполнены совместно с сотрудником лаборатории И.Ю.Ткачевым.

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие положения:

результаты исследований по оценке терапевтической и профилактической эффективности бегулина при ИРТ и смешанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС;

- данные по интерфероногенной активности бетулина в организме КРС.

- результаты изучения вирулицидной активности бетулина;

- получение и применение культуры ЭК как модели для изучения патогенеза вирусных респираторных инфекций КРС;

- способность респираторных вирусов репродуцироваться в культурах ЭК КРС и их способность индуцировать синтез ИФН в этих культурах.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной конференции «Актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополу-

чия животноводства», г. Ялта, 2005 г.; представлены на международной выставке «Аптека-2004», (Бельгия) и международной фармацевтической выставке (Испания, 2006 г.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на заседаниях Ученого Совета и межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент на изобретение РФ.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения, список литературы. Список литературы содержит 166 источников, из них 47 - отечественные, 119 - иностранные. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 24 рисунками.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы Животные. Опыты проводили на 124 головах КРС: 12 клинически здоровых серонегативных телятах в возрасте 2-5 мес; 14 новорожденных телятах, 54 в возрасте 2-3 недели, 38 в возрасте 3-4 мес, 6 глубокостельных коровах. Клиническую реакцию животных на заражение оценивали по бальной системе.

Бетулин. В работе использовали препарат «Бересты экстракт сухой» производства ООО «Березовый мир», представляющий собой экстракт коры березы, очищенный от смол, таннидов, главным компонентом которого (не менее 87 %) является пентациклический тритерпеновый спирт бетулин.

Вирусы. Вирус ИРТ - вирулентный штамм ТНЛ-2 и вакцинный штамм ТК-А; вирус ВД-БС - вакцинный штамм ВК-1 В1 №28; вирус ПГ-3 - вакцинный штамм ПТК 45/86 (из коллекции отдела вирусологии ВИЭВ); вирус вези-

кулярного стоматита (ВВС) и вирус болезни Ньюкасла (ВБН) (из лаборатории препаратов интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи).

Культуры клеток. Перевиваемая культура клеток почки теленка (MDBK), перевиваемая культура клеток коронарных сосудов теленка (КСТ). Культуры клеток получали из отдела клеточной биотехнологии и питательных сред ВИЭВ. Линии клеток MDBK и КСТ культивировали на среде Игла MEM с добавлением 2м М глютамина, 5-10 % сыворотки крови КРС.

Титрование вирусов. Инфекционную активность вирусов определяли титрованием в культуре клеток в 96-луночных культуральных планшетах. Последовательными 10-кратными разведениями вируссодержащего материала на среде Игла MEM от 10"' до 10"7 инфицировали по четыре ряда на каждое разведение. Инкубировали при 37°С в атмосфере С02. Учет результатов проводили через 3-5 сут по наличию ЦПД. Титр вируса оценивали в lg ТЦД 50/100 мкл по методу Ксрбера.

Выявление вирусов в биоматериале проводили двумя методами: куль-туральным и в ПЦР.

От подопытных животных получали носовые секреты, которые обрабатывали общепринятым методом и использовали для заражения культуры клеток в 24-луночных культуральных планшетах. После адсорбции вируса в течение 1 ч культуры трижды отмывали раствором Хенкса, затем вносили по 1 мл поддерживающей среды Игла MEM и культивировали при 37°С, 5% С02. При отсутствии ЦПД в нервом пассаже проводили не менее 3 слепых последовательных пассажей. Выделенный вирус идентифицировали в реакции нейтрализации.

Выявление вирусной ДНК в носовых секретах проводили методом ПЦР с праймерами, специфичными для фрагментов гена тимидинкиназы BHV-1. Работа проводилась совместно с сотрудником отдела вирусологии ВИЭВ Ткачевым И.Ю.

Получение культуры ЭК кровеносных сосудов КРС. Кровеносные сосуды заполняли диспергирующим ферментом, после инкубации суспензию от-

делившихся клеток центрифугировали. Клетки ресуспендировали в среде 199 (Gibco), 10 % ЭТС (Ну Clone), 5 ед/мл гепарина, 50 мкг/мл фактора роста, 2 мМ L-глютамина, 50 мкг/мл гентамицина и культивировали в СОг-инкубаторе ( при 37°С, 5 % С02). В работе использовали монослойные культуры ЭК 1-го пассажа на 4-6 сут культивирования. Морфологию клеток изучали в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Инфицирование ЭК. Конфлуентные культуры ЭК инфицировали последовательными десятикратными разведениями вирусов ИРТ, ВД-БС и ПГ-3 в 24-луночных планшетах. После адсорбции в течение 1 ч (37°С, 5% С02) культуру ЭК трижды отмывали теплым раствором Хенкса. В динамике культивирования отбирали пробы среды для определения титра вируса и уровня ИФН.

Вирулицидное действие бетулина. Бетулин добавляли к вируссодер-жащей среде, выдерживали при комнатной температуре, периодически встряхивая, и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Содержание вируса в надосадочной жидкости определяли по инфекционной активности титрованием в чувствительных культурах клеток.

ИФН статус. Включал в себя показатели сывороточного ИФН, ИФН, продуцируемого спонтанно, под воздействием ВБН (ИФН-а) и ФГА (ИФН-у). ИФН индуцировали во взвеси лейкоцитов крови. Клеточную взвесь культивировали как без индуктора (синтез спонтанного ИФН), так и с добавлением модельного вируса ВБН (индуктор ИФН-а), вируса ИРТ (индуктор ИФН-а) и ФГА (индуктор ИФН-у). Пробы спонтанного ИФН отбирали через 24ч культивирования, пробы ИФН-а отбирали через 24 ч и обрабатывали 1 N НС1 при рН 2,0 в течение 5 дней, затем IN NaOH доводили рН до нейтрального значения. Пробы ИФН-у отбирали после 72 ч культивирования. Все пробы хранили при -20°С.

Активность ИФН в образцах культуральной среды и сыворотке определяли методом биотестирования на культуре МДВК. Для этого в 96-луночные культуральные планшеты с суточным монослоем МДВК вносили по 0,1 мл двукратных разведений титруемого образца в двух повторах. По окончании 24 ч инкубации в лунки вносили 100 ТЦД50/0,1 индикаторного вируса ВВС. Ре-

зультаты титрования учитывали через 24 ч по 50% задержке развития ЦПД индикаторного вируса.

Детекция цитокинов. Для количественного определения цитокинов применяли твердофазный иммуноферентный метод (ИФА) с использованием коммерческих наборов «РгоСоп» (Санкт-Петербург). Результаты ИФА оценивали на фотометре «Antos 2020» по коэффициенту оптического поглощения (ОП 450).

Серологические исследования. Уровень специфических антител к вирусам ИРТ и ВД-БС определяли в реакции нейтрализации (РН) на 96-луночных планшетах согласно европейскому стандарту. Учет результатов реакции проводили через 72 ч по наличию цитопатических изменений (ЦПД).

Реакцию гемадсорбции (РГАд) использовали для индикации вируса ПГ-3. В лунки с инфицированной культурой клеток вносили 100 мкл 1 %-ной суспензии эритроцитов морской свинки в физиологическом раствор^, оставляли при комнатной температуре на 10-15 мин. Реакцию учитывали под малым увеличением микроскопа и оценивали по 4-х крестной системе.

Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами. Достоверность результатов оценивали по критерию Стьюдента. Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Влияние бетулина на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом ИРТ у телят

Опыт проводили на клинически здоровых серонегативных телятах в возрасте 2-3 мес. Трем телятам ежедневно в течение 5-ти дней давали бетулин per os в дозе 4 мг/кг живой массы, а затем заражали интраназально вирулентным штаммом THJI вируса ИРТ в дозе 2 х 6,5 1§ТЦД5о/мл. В последующие 5 сут животные продолжали получать бетулин по указанной схеме. Параллельно

инфицировали трех контрольных телят, которые не получали бетулина. Клини-

0

ческие наблюдения проводили в течение месяца.

Рис. 1. Клиническая реакция телят на заражение вирулентным штаммом ТНЛ-2 вируса ИРТ

Клиническая реакция телят опытной и контрольной группы существенно отличалась друг от друга (рис.1). Телята опытной группы сохраняли удовлетворительное общее состояние, тяжесть клинического проявления экспериментальной инфекции не превышала 2 баллов. Животные контрольной группы, не получавшие бетулина, проявляли угнетение, анорексию, лихорадку, слезотечение, конъюнктивит, катаральный ринит, кашель. Симптомы респираторной болезни сохранялись в течение 5-7 дней, затем наступало выздоровление. Тяжесть клинических симптомов у телят контрольной группы достигала 10 баллов через 5 дней после начала эксперимента. Через неделю наблюдали понижение реакции до исходных значений.

У животных опытной группы вируснейтрализующие антитела не обнаруживались как до, так и через месяц после заражения. У телят контрольной группы через месяц после заражения выявлена сероконверсия, что свидетельствует об активной инфекции в организме.

У телят опытной группы вирус ИРТ не выделили как до, так и после инфицирования, тогда как у двух из трех телят контрольной группы через 7 сут после инфицирования был выделен вирус ИРТ. Выявление ДНК вируса ИРТ в ПЦР у двух из трех животных опытной группы через 7 сут после инфицирования дало положительный результат, также как и у всех животных контрольной группы. Таким образом, проведенный опыт показал, что бетулин при экспери-

ментальном заражении вирусом ИРТ предотвращал развитие болезни, репродукцию и экскрецию вируса с носовыми секретами, сероконверсию.

2.2. Влияние бетулина на спонтанную смешанную инфекцию, вызванную вирусами ИРТ и ВД-БС у КРС

В условиях хозяйства, стационарно неблагополучного по ИРТ и ВД-БС, была проведена серия опытов по изучению влияния бетулина на инфекционный процесс у животных различного возраста.

2.2.2. Профилактическая эффективность бетулина у новорожденных и 2-3 недельных телят

Клинически здоровым новорожденным телятам (7 голов) вводили бетулин per os с двухдневного возраста в течение 5-7 дней в дозе 4 мг/кг живой массы; 7 телят-аналогов не получавшие бетулин, служили контролем. Телята опытной группы хорошо росли и развивались и не проявляли симптомов респираторной болезни. Среди животных контрольной через 2-3 дня после начала опыта регистрировали признаки респираторной болезни: угнетение, покраснение носового зеркала, ринит, слезотечение; заболеваемость составила 70 %.

До начала эксперимента и через 7 дней в носовых секретах телят опытной группы ДНК вируса ИРТ не выявлена, в то время как у 3-х телят контрольных животных ПЦР дала положительный результат (43%).

На протяжении 6 мес животные опытной группы не проявляли признаков респираторной болезни в отличие от телят контрольной группы. Проведенный опыт продемонстрировал профилактическое действие бетулина, выражавшееся в предупреждении развития респираторной болезни, вирусоносительства и отсутствии заболеваемости животных в отдаленные сроки (до 6-ти мес).

В следующем опыте влияние бетулина изучали на клинически здоровых телятах в возрасте 2-3 недели. Опытная группа включала 12 телят, получавших бетулин per os с молоком на протяжении 5-7 дней в дозе 10 мг/кг живой массы. Контрольная группа из 12 телят не получала бетулина. Среди животных опытной и контрольной групп не регистрировали признаков респираторной болезни и гибели. После применения бетулина в носовых секретах двух из 12 телят (17

%) выявили ДНК вируса ИРТ, в то время как ПЦР была положительной у 7 контрольных животных (58 %).

Через полтора месяца средний титр антител в опытной группе сохранился на исходном уровне (3,03±0,25), а у контрольных животных наблюдали се-роконверсию - 4-16-кратный (18,04±0,25) прирост специфических антител против вируса ИРТ.

2.2.3. Терапевтическая эффективность бетулина у телят с признаками респираторной болезни

Опыт был проведен на телятах в возрасте 2-3 недели с манифестантной респираторной инфекцией: 14 животных получали бетулин per os с молоком на протяжении 5-7 дней в дозе 4 мг/кг живой массы; 14 животных, не получавших бетулина, служили контролем. После применения бетулина у больных животных в течение недели постепенно исчезали признаки респираторной болезни: нормализовалось общее состояние, восстанавливался аппетит, исчезали гиперемия носового зеркала, ринит, кашель. Сохранность животных в этой группе составила 100%. Больные телята контрольной группы в течение всего срока наблюдения (1 месяц) проявляли признаки респираторной болезни, значительно отставали в росте. Сохранность животных в контрольной группе составила 86%.

Дни

мф—группа 1-опытней « »-группа 2-контральная

Рис.2. Динамика развития заболевания у телят

Клиническая реакция телят, как видно на рисунке 2, существенно отличалась в опытной и в контрольной группе. Телята опытной группы через 7 сут выздоравливали, в то время как в контрольной группе клинические признаки со-

хранились и оценивались в 10-12 баллов на протяжении всего срока наблюдения.

Через 7 сут после обработки бетулином в носовых секретах трех опытных животных (21 %) и 9 контрольных (75 %) выявлена ДНК вируса ИРТ.

В течение 6 мес среди обработанных бетулином животных не регистрировали гибели и рецидивов респираторной болезни. Среди контрольных телят наблюдался рецидив респираторной болезни в возрасте 3 мес, и у трети животных развилась хроническая форма болезни.

Таким образом, терапевтический эффект бетулина проявлялся в выздоровлении животных, сокращении продолжительности клинической стадии болезни, отсутствии рецидивов и предупреждения развития хронической болезни.

2.2.4. Эффективность бетулина при хронической респираторной болезни телят

Бетулин вводили per os в капсулах в дозе 12 мг/кг живой массы через день на протяжении 10 сут 20-ти животным в возрасте 3-4 мес с признаками хронической респираторной болезни.; 18 телят-аналогов не получали препарат и служили контролем. У телят обеих групп на протяжении месяца не отмечали признаков выздоровления. Гибель составляла 10-12% как в опытной, так и в контрольной группе.

У обработанных бетулином телят ДНК вируса ИРТ выявлена в 35 % животных, а у контрольных - в 60 % случаев.

Таким образом, применение бетулина при хроническом течении болезни снижало число носителей вируса ИРТ, не оказывая при этом видимого терапевтического эффекта.

2.2.5. Влияние бетулина на вакцинацию КРС живой вакциной против ИРТ. ВД-БС и ПГ-3

В течение 3 дней трем глубокостельным коровам с высоким уровнем антител к вирусу ИРТ и ВД-БС вводили бетулин в дозе 4 мг/кг живой массы. Затем их вакцинировали против ИРТ, ВД-БС и ПГ-3. Через две недели провели повторную обработку бетулином и ревакцинацию. Параллельно вакцинировали

трех животных-аналогов, не получавших бетулин (контроль). Результаты серологического исследования коров представлены в таблице 1.

Таблица 1

Уровень нейтрализующих антител к вирусу ИРТ и ВД-БС, п=6

Группа животных Титр вируснейтрализующих AT к вирусу ИРТ Титр вируснейтрализующих AT к вирусу ВД-БС

До вакцинации После вакцинации (1 мес) До вакцинации После вакцинации (1 мес)

1-опыт, бету-лин+ 33,3±10,21 69,5±20,82 (Р>0,05) 97,33±20,7 61,5±22,69 (р>0,05)

2-контр, бе-тулин- 54±24,7 56,25±27,16 (р>0,05) 82±28,9 100±28 (р>0,05)

Результаты показали, что бетулин не повышал эффективности вакцинации (реакции антителообразования) на фоне высокого уровня AT.

2.3. Влияние бетулина на функционирование системы ИФН у К PC Значимость и универсальность контрольно-регуляторных функций интерферона (ИФН) делают его важнейшим фактором неспецифической резистентности. Сообщения ряда исследователей об интерфероногенной активности бетулина привело к предположению, что это свойство препарата может лежать в основе лечебно-профилактического действия.

2.3.1. ИФН-статус у телят при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ

Опыт провели на 6-ти серонегативных к вирусу ИРТ клинически здоровых телятах. Трем телятам в течение 5 дн ежедневно однократно вводили бетулин в дозе 4 мг/кг per os, затем заражали интраназально вирулентным штаммом THJI-2 вируса ИРТ в дозе 2x106,5 ТЦД 50/мл. После заражения в течение 5 дн продолжали применение бетулина. Одновременно заражали трех телят, не получавших бетулина (контроль). Результаты оценки функционального состояния системы интерферона у телят представлены на рис. 3,4, 5, 6.

600 600 400 | 300 | 200 100

Рис.З.Уровень сывороточного ИФН Рис.4. Уровень спонтанного ИФН

140 120

1 1W | .

I 60

20

Рис.5. Уровень ИФН-а Рис.б.Уровень ИФН-у

На фоне изначально высокого уровня спонтанного ИФН у контрольных инфицированных животных его титр не менялся в течение 72 ч. У инфицированных и обработанных бетулином телят продукция сывороточного ИФН увеличивалась с 256 до 426,7±85,3 ед/мл (р<0,05). Уровень продуцируемого лейкоцитами спонтанного ИФН у контрольных животных не менялся, а в опытной группе наблюдали его снижение с 426,7±85,3 до 128 ед/мл (р>0,05). Титр ИФН-а, продуцируемого лейкоцитами крови контрольных телят после индукции ВБН, снижался с 106,7±21,3 до 37,3±5,3 ед/мл (р<0,05), тогда как у получавших препарат телят он оставался без изменений в течение всего срока исследования. Продукция ИФН-у лейкоцитами крови контрольных животных увеличивалась с 96,0±32,0 до 256±0 ед/мл (р<0,05), а у телят, получавших бетулин, оставалась без изменений.

С целью изучения влияние бетулина на функционирование системы ИФН у сенсибилизированных вирусом ИРТ животных провели эксперимент на здоровых телятах, иммунизированных против ИРТ вирусвакциной «Bovilis IBR marker» («Интервет», Голландия). Трем клинически здоровым серопозитивным

ВРЕМЯ, ЧАС Вр<м. чае

^♦■ИРТ. 6Д1УД1И» -¿-.РТ. Caiyiw-1 | * >РТ ба^-н.. -»-ЦП

вакцинированным телятам и трем ееронегативным клинически здоровым телятам ежедневно в течение 3-х дней давали per os бетулин в дозе по 4 мг/кг. От животных в динамике получали пробы крови для определения ИФН-статуса. Результаты представлены на рис. 7,8,9,10,11.

Bp* и*. ч" Враш, **е

flmyi*« ♦ fietyiBH* | бчущи* —бв<улч* |

Рис.7. Уровень сывороточного ИФН Рис.8. Уровень спонтанного ИФН

!««♦—'аТ«| бгуями» 6»гугиу*'| [■+»»Ат*, бе туши» —^АТ., батулнн» |

Рис.9. Уровень ИФН-а Рис. 10. Уровень ИФН-а (ИРТ)

Через 24 ч после получения бетулина в сыворотке крови всех телят повышался титр ИФН (р>0,05), а к 72 ч понижался до первоначальных значений (рис. 7). Продукция спонтанного ИФН лейкоцитами серонегативных телят понижалась с 96,0±18,5 до 7,7±4,4 ед/мл (р<0,05), тогда как у серопозитивных животных повышалась через 24 ч с 13,3±2,7 до 72,0±30,3 ед/мл (р>0,05) и к 72 ч снижалась до 20,0±6,1 ед/мл (р>0,05).

Исходный уровень продукции ИФН-а лейкоцитами крови серонегативных телят (рис.10) был высоким - 160,0±32 ед/мл, и при индукции ВБН снижался, к 72 ч достигая уровня 3,7±1,5 ед/мл (р<0,05). У серопозитивных животных титр ИФН-а до начала исследования был низким - 8,7±1,8 ед/мл, через 24 ч после индукции ВБН повышался до 144,0±60,6 ед/мл и уменьшался к 72 ч до 32,0±16,0 ед/мл (р>0,05).

Продукция ИФН-а лейкоцитами крови серопозитивных телят при индукции ВН\М через 24 ч возрастала с 8,3±3,7 до 85,3±54,1 ед/мл (р>0,05). У серо-негативных животных высокий исходный уровень ИФН - 53,3±23,2 ед/мл -уменьшался и к 72 ч достигал 8,0±2,0 ед/мл (р>0,05).

Рис.11. Уровень ИФН-у

Представленные на рис.11 результаты свидетельствуют о том, что уровень ИФН-у, продуцируемого лейкоцитами серонегативных телят под действием бетулина изменялся незначительно (с 104,0±76,0 до 68,0±33,5 ед/мл, р>0,05); у вакцинированных серопозитивных животных этот показатель имел тенденцию к увеличению в динамике исследования с 88,0±54,5 до 181,3±46,5 ед/мл

Таким образом, использование теста ИФН-стагус позволило выявить им-муномодулирующие свойства бетулина, его влияние на потенциальную активность лейкоцитов инфицированных и вакцинированных животных, заключающееся в сохранении способности лейкоцитов продуцировать ИФН-а и -у.

2.3.2. Вирулицидное действие бетулина

В опытах по изучению лечебно-профилактического эффективности бетулина на естественно восприимчивых животных получены данные, свидетельствующие об ингибирующей активности препарата в отношении вируса ИРТ (отсутствие сероконверсии у зараженных телят, снижение уровня инфицированно-сги). В связи с этим изучали прямое воздействие бетулина на вирусы in vitro. При экспозиции 48 ч вирус ИРТ снижал свою инфекционную активность с 6,5 lg ТЦДзо/мл до невыявляемого уровня. Титр вируса ПГ-3 в обработанных образцах составлял 2 lg ТЦДзо/мл при 6,0 lg ТЦД50/МЛ в контроле. Инактивирую-

20

74

ВРЕМЯ ЧАС

Т2

AT* fioiylwH» Я AT бету1мн<

(р>0,05)

щего действия на вирусы ВВС, РПЛ и ВД-БС не установлено. Результаты представлены на рисунке 12.

контроль 3.контроль кон фол. контроль контроль □ вирус ■ омруобетутмн |

Рис. 12. Действие бетулина на инфекционный титр вирусов

По-видимому, прямое действие на вирусы ИРТ, ПГ-3 представляет собой один из механизмов лечебно-профилактической эффективности бетулина.

2.4. Моделирование инфекционного процесса, вызванного вирусами ИРТ, ВД-БС и ПГ-3 в культуре ЭК кровеносных сосудов

Патогенез инфекционных болезней сопровождается воспалительными процессами, вызывающими дисфункцию клеток сосудистой стенки. Эффективность ряда лекарственных препаратов связана с их корригирующим действием на функциональное состояние эндотелия, выстилающего внутреннюю поверхность сосудов. В связи с этим исследовали способность ЭК поддерживать репродукцию вирусов и продуцировать ИФН при вирусном инфицировании, а также способность бетулина индуцировать ИФН и цитокины в культурах ЭК. Для этого необходимо было подобрать условия выделения и культивирования ЭК КРС.

2.4.1. Оптимизация условий выделения и культивирования ЭК КРС

На первом этапе оценивали действие двух дезагрегирующих ферментов: коллагеназы (IV тип; 10 мг/мл) и диспазы (СиЬсо; 20 мг/мл) в концентрации 0,1%; 0,15% и 0,2 % и экспозиции 20 и 30 мин при температуре 37°С.

Коллагеназа не позволяла получать стабильные воспроизводимые результаты. Максимальный выход клеток получали при воздействии диспазы в концентрации 0,2 % в течение 30 мин. При сравнении различных источников ЭК

установили, что сосуды пупочного канатика новорожденных телят, аорта, сонные и легочные артерии взрослых животных пригодны для выделения ЭК, но предпочтительно использовать сонные артерии и крупные вены.

Результаты многократных экспериментов показали, что только среда 199 (&Ьсо) в качестве основного компонента срсды роста обеспечивала формирование конфлуэнтного монослоя клеток на 5-6 сут. Индекс пролиферации составлял 1,62-2,15. Монослой ЭК был представлен клетками полигональной формы с четко очерченными границами, характерными для эндотелия. При субкультивировании монослой формировался на 2-3 сут с коэффициентом пересева 1:2.

2.4.2. Репродукция вирусов ИРТ, ВД-БС и ПГ-3 КРС в культуре ЭК и их способность продуцировать ИФН в этих культурах

Репродукцию вирусов оценивали по развитию ЦПД и накоплению вируса в культуральной среде. Через 6, 24, 48 ч после инфицирования вирусами ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 отбирали образцы культуральной среды и определяли в них содержание ИФН. Результаты представлены на рисунке 13.

Рис.13. Репродукция вирусов ИРТ, ВД-БС и ПГ-3 в культурах ЭК

Максимальное накопление вируса ПГ-3 в культуре ЭК КРС составляло 6,0 ^ ТЦД 5о/мл через 48 ч как по ЦПД, так и по гемадсорбции. Максимальное накопление вируса ИРТ составляло 2,0 ^ ТЦД 50/мл через 48 ч после инфицирования и совпадало с проявлением ЦПД. Репродукции возбудителя ВД-БС не установлено.

В культуре ЭК КРС вирус ПГ-3 не стимулировал продукции ИФН (рис. 14). Вирус ВД-БС индуцировал ИФН, максимальный уровень которого - 32 ед/мл - отмечали через 6 ч. Затем титр ИФН снижался и к 72 ч достигал кон-

трольных значений. Вирус ИРТ стимулировал продукцию ИФН менее эффективно: максимальное значение - 24 ед/мл - регистрировали через 6 ч после заражения, а затем уровень ИФН снижался до контрольных значений.

ПГ-З, ЭК К PC ИРТ, ЭК крс ВД-БС, ЭК КРС иощрольЭК КРС

Рис.14. Продукция ИФН в культуре ЭК КРС при инфицировании вирусами ПГ-З, ИРТ и ВД-БС

В культуре ЭК человека вирус ПГ-З не стимулировал продукции ИФН (рис. 15). Вирус ВД-БС индуцировал ИФН, максимальный уровень которого -128 ед/мл - отмечали через 6 ч. Затем титр ИФН снижался и к 72 ч достигал контрольных значений. Вирус ИРТ стимулировал продукцию ИФН менее эффективно: максимальное значение - 64 ед/мл регистрировали через 6 ч после заражения, а затем его уровень снижался до контрольных значений.

Рис.15. Продукция ИФН в культуре ЭК человека при инфицировании вирусами ПГ-З, ИРТ и ВД-БС

Таким образом, отмечена обратная зависимость между уровнем репродукции вирусов и продукцией ИФН в культурах ЭК: вирус ПГ-З активно размножался в ЭК, а продукция ИФН при этом была практически на уровне контрольных значений; вирусы ИРТ и ВД-БС индуцировали продукцию ИФН, что сопровождалось отсутствием или слабой репродукцией этих вирусов. На осно-

вании полученных результатов можно заключить, что ЭК как КРС, так и человека могут служить моделью для изучения инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами КРС.

2.4.3. Способность культуры ЭК продуцировать цитокнны под действием вирусов ИРТ, ВД-БС и ПГ-3

В связи с отсутствием тсст-систем для определения цитокинов КРС, эксперименты выполняли на ЭК человека. Культуру инфицировали вирусами ИРТ, ВД-БС, ПГ-3. Образцы культуральной среды, полученные в динамике, исследовали на присутствие ИЛ-1р, ИЛ-б, ИЛ-8 и ФНОа методом иммунофер-ментного анализа.

Тестирование на ИЛ-10 и ИЛ-6 дало отрицательные результаты. Уровень ФНО-а существенно не отличался от контрольных значений. Уровень ИЛ-8 через 48 ч после заражения всеми тремя возбудителями был существенно выше (218-248 пг/мл), чем в контрольных образцах.

2.4.4. Способность бетулина индуцировть ИФН и нитокины в культурах ЭК

Монослойные культуры ЭК КРС и человека обрабатывали бетулином в дозе 0,5 мг/мл. Через 6, 24, 48 ч после инфицирования отбирали образцы культуральной среды. ИФН в этих образцах выявить не удалось.

Через 6 ч после заражения уровень ИЛ-6 превышал значения в контроле и составил 270,1 пг/мл. Через 24 ч количество ИЛ-6 понизилось до 67,74 пг/мл и через 48 ч достиг ало контрольных значений (10,43 пг/мл) (рис.16).

Через 6 ч уровень ИЛ-8 составил 789,84 пг/мл при 80,01 пг/мл в контроле. Через 24 ч продукция ИЛ-8 снизилась до 463,27 пг/мл и к 48 ч приближалась к контрольному показа телю (рис.17).

Бетулин не вызывал существенных изменений продукции ФНО-а: через 6 ч его уровень составлял 3,52 пг/мл и оставался без изменений.

ав^ЛП-в-КИ^О®! -4— бетулим Н^ юн доль |

Рис. 1 б.Продукция ИЛ-6 культурой Рис.17. Продукция ИЛ-8 культурой ЭК ЭК человека человека

Активация провоспалительных цитокинов приводит к развитию воспалительного процесса, направленного на освобождение организма от патогена. По-видимому, иммуномодулирующее действие, заключающееся в способности индуцировать синтез провоспалительных цитокинов, является одним из механизмов терапевтического действия бетулина.

ВЫВОДЫ

1. Бетулин оказывал профилактическое действие при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ, и при спонтанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, у телят в возрасте 2-дн., 2-3 недели, 2-3 мес. Применение бетулина предупреждало развитие респираторного синдрома, репродукцию и экскрецию вируса ИРТ с носовыми секретами.

2. Установлена терапевтическая эффективность бетулина при респираторной болезни, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, что проявлялось в сокращении продолжительности клинической стадии болезни, выздоровлении животных, снижении уровня инфицированное™ вирусом ИРТ, предотвращении рецидивов.

3. Применение бетулина при хронической респираторной болезни, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, не оказывало видимого терапевтического эффекта, но достоверно снижало уровень инфицированности телят вирусом ИРТ.

4. Использование теста ИФН-статус позволило выявить иммуномодулирую-щие свойства бетулина, его влияние на потенциальную активность лейкоцитов

инфицированных и вакцинированных животных, заключающееся в сохранении способности лейкоцитов продуцировать ИФН-а и -у.

5. Бетулин оказывал прямое воздействие на вирусы ИРТ и ПГ-3, снижая их инфекционный титр на 6,5 и 4 lg ТЦД5о/мл соответственно.

6. Вирус ПГ-3 репродуцировался в культурах ЭК как КРС, гак и человека. Вирус ИРТ размножался в ЭК КРС и не репродуцировался в культуре ЭК человека. Репродукции вируса ВД-БС не установлено в обеих культурах.

7. Вирусы ИРТ и ВД-БС индуцировали продукцию ИФН как в культуре ЭК КРС, так и в культуре ЭК человека. Установлена обратная зависимость между способностью этих вирусов индуцировать интерферон и степенью их репродукции.

8. Бетулин индуцировал продукцию ИЛ-6 и ИЛ-8 и не стимулировал синтез ИФН и ФНО-а культурой ЭК человека.

9. Первичные культуры и субкультуры ЭК КРС и человека могут служить модельными системами для изучения патогенеза вирусных инфекций и для скрининга лекарственных средств.

10. Механизм лечебно-профилактического действия бетулина связан с его с ви-рулицидным, интерфероногенным и иммуномодулирующим действием.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Применение бетулина для профилактики и лечения вирусных респираторных инфекций КРС. Патент: Ru № 2278683 С1, 2004, «Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота». (Величко Г.Н., Шуляк А.Ф., Щегловитова О.Н., Юров К.П., Балакшин В.В., Преснова Г.А., Чистяков А.Н).

Разработаны методические рекомендации по применению бетулина при вирусных респираторных инфекциях крупного рогатого скота. Утверждены Ученым Советом ВИЭВ протокол № 10 от 21 октября 2008 г. Разработаны методические рекомендации по культивированию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов КРС. Утверждены Ученым Советом ВИЭВ протокол № 10 от 21 октября 2008 г.

Культура клеток эндотелия кровеносных сосудов рекомендована в качестве модели для изучения патогенеза вирусных инфекций и для оценки продукции ИФН и цитокинов при вирусных инфекциях и при использовании лечебных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Патент: Ru № 2278683 С1.2004.

Величко Г.Н., Шуляк А.Ф., Щегловитова О.Н., Юров К.П., Балакшин В.В., Преснова Г.А., Чистяков А.Н. Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота.

2. Величко Г. Лечебное действие бересты эксракта сухого при инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота / Величко Г.Н., Шуляк А., Юров К., Балакшин В., Преснова Г., Чистяков А. // PharmaChem. - 2004. - С. 145-147.

3. Величко Г.Н. Влияние бетулина на вирусы инфекционного ринотрахеита и диареи-болезни слизисты оболочек крупного рогатого скота / Величко Г.Н., Шуляк А.Ф., Юров К.П., Щегловитова О.Н., Балакшин В.В., Преснова Г.А., Чистяков А.Н. // Сб. Ветеринарна медицина, 85. - Харьков, 2005. С. 214.

4. Шуляк А.Ф. Влияние бетулина на систему интерферона у крупного рогатого скота / Шуляк А.Ф., Щегловитова О.Н., Величко Г.Н., Юров К.П., Балакшин

B.В., Преснова Г.А., Чистяков А.Н., Склянкина H.H. // Российский ветеринарный журнал. - 2007. - 1: 31-33.

5. Величко Г.Н. Оптимизация условий культивирования клеток эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота / Величко Г.Н. // Труды Кубанского Государственного Аграрного Университета. - 2008. - 1(10): 71-74.

6. Шуляк А.Ф. Моделирование патогенеза вирусных респираторных инфекций в клетках эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота / Шуляк А.Ф., Щегловитова О.Н., Величко Г.Н. // Материалы международной научно-практической конференции: «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных и пчел». - 2008. -

C.291-297.

Отпечатано в ООО "Мещера" г.Щелково, Московская обл., ул.Свирская, д.8а, заказ № 937 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Величко, Галина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирусные респираторные инфекции крупного рогатого скота.

1.1.1. Распространение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

1.1.2. Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

1.2. Терапия вирусных болезней.

1.2.1. Роль интерферона в терапии вирусных болезней.

1.2.2. Фармакологическое действие бетулина.

1.3. Моделирование инфекционного процесса при вирусных инфекциях в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов.

1.3.1. Функции эндотелия кровеносных сосудов.

1.3.2. Клеточные медиаторы, продуцируемые эндотелием.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Влияние бетулина на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита у телят.

2.2.2. Действие бетулина на спонтанную смешанную инфекцию, вызванную вирусом инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота.

2.2.2.1. Профилактическое действие бетулина.

2.2.2.2. Действие бетулина на телят с признаками респираторной болезни.

2.2.2.3. Действие бетулина при хронической респираторной болезни телят.

2.2.2.4. Влияние бетулина на вакцинацию крупного рогатого скота живой вакциной против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и парагриппа-3.

2.2.3. Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота разного возраста при экспериментальной и спонтанной респираторной инфекции.

2.2.3.1. Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота при экспериментальной инфекции; вызванной вирусом инфекционного ринотрахеита.

2.2.3.2. Функционирование системы интерферона у крупного рогатого скота при спонтанной смешанной инфекции, вызванной вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек.

2.2.4. Противовирусное действие бетулина.

2.2.5. Моделирование инфекционного процесса, вызванного вирусами крупного рогатого скота, в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов.

2.2.5.1. Отработка условий культивирования клеток эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота.

2.2.5.2. Репродукция респираторных вирусов крупного рогатого скота в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота и человека.

2.2.5.3. Индукция интерферона в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов вирусами инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и парагриппа-3.

2.2.5.4. Продуция цитокинов в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов человека при инфировании вирусами инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек и пар-гриппа-3.

2.2.6. Способность бетулина индуцировть интерферон и цитокины в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4. ВЫВОДЫ.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Противовирусное и иммуномодулирующее действие бетулина при вирусных респираторных инфекциях крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Разнообразие этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота (КРС) являлось предметом многочисленных научных исследований. В то же время, как показал более чем пятидесятилетний опыт изучения этой проблемы, доминирующую роль в возникновении вспышек острых респираторных заболеваний в большинстве стран мира играют вирусы инфекционного ринотрахеита/пустулезного вульвоваги-нита (ИРТ/ИПВ) и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота.

Основным методом борьбы с этими инфекциями является вакцинация, эффективность которой зависит как от качества применяемых вакцин, схемы иммунизации, так и от состояния иммунной системы вакцинируемых животных. При заболеваниях ИРТ и ВД-БС применяются большое число вакцин. Сообщений об искоренении ИРТ и ВД-БС только за счет вакцинации в доступной литературе нет. Однако имеется информация о том, что обязательная иммунизация против ИРТ в сочетании с удалением серопозитивных животных в течение нескольких лет в ряде стран, например, в Нидерландах, привела к существенному улучшению эпизоотической ситуации. Вакцинация в большинстве стран не является обязательной. Кроме того, она проходит не всегда и не везде своевременно, и всегда остается поголовье восприимчивых животных. Возникает вопрос о том, какие меры принимать в условиях неблагополучного очага? Проблема с уже возникшим заболеванием актуализирует исследования, направленные на поиск альтернативных методов борьбы с данными болезнями.

Лечение животных, пораженных респираторными вирусами, включает применение иммунной терапии, симптоматических средств, иммуномо-дуляторов и антибактериальных препаратов для профилактики вторичных инфекций.

Количество противовирусных препаратов и лекарств, способствующих купированию вирусных инфекций в организме животных, крайне ограничено. Поэтому поиски препаратов различного происхождения, обладающих подобным действием, неизменно остаются актуальными.

Вариантом борьбы с вирусными болезнями может быть использование иммуномодуляторов, основное действие которых заключается в активации факторов защиты при их гипореактивности и нормализации при гиперактивности, что помогает бороться с уже развившимся заболеванием. При вирусном инфицировании происходит активация врожденного неспецифического иммунитета, проявляющегося в продукции факторов неспецифической защиты — интерферона и цитокинов. От баланса между активностью инфицирующего агента и активностью противовирусных механизмов защиты зависит возникновение заболевания, его течение и исход.

Перспективным направлением представляется подбор препаратов как этиотропного, так и иммунотропного действия.

Наше внимание привлек препарат бетулин, выделенный из бересты и представляющий собой смесь тритерпеновых соединений, главным компонентом которого является пентациклический тритерпеновый спирт бетулин. При доклинических и клинических испытаниях бетулин проявил самые разнообразные свойства: антисептическое, бактериостатическое и бактерицидное против кишечных бактерий Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri и Staphylococus aureus, гепатопротекторную активность, антигипоксическое, антимутагенное, превентивное в отношении туберкулеза действия. Его противовирусная и интерферониндуцирующая активность выявлена при гриппе и гепатите С на лабораторных животных (Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Львов Д.К., Балакшин В.В., 2003).

Вышеизложенная информация послужила основой для проведения исследований, обобщенных в данной диссертации.

Цель и задачи. Целью исследований было изучение лечебно-профилактической эффективности бетулина при вирусных респираторных инфекциях КРС.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить терапевтическую и профилактическую эффективность бетулина у КРС разных возрастных групп;

- оценить влияние бетулина на функционирование системы ИФН у инфицированных животных;

- изучить вирулицидное действие бетулина;

- разработать модель инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами, на основе культуры ЭК кровеносных сосудов;

- исследовать способность культур ЭК продуцировать ИФН и цитокины при инфицировании респираторными вирусами и под воздействием бетулина.

Научная новизна. Выявлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ. Установлена терапевтическая и профилактическая эффективность бетулина при смешанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС.

Впервые показана способность бетулина индуцировать синтез ИФН в организме телят при экспериментальной инфекции и вакцинации против ИРТ.

Впервые установлено вирулицидное действие бетулина в отношении вирусов ИРТ и ПГ-З.

Разработаны оптимальные условия выделения и культивирования ЭК кровеносных сосудов КРС.

Разработаны модели инфекционного процесса, вызванного респираторными вирусами КРС на основе культур ЭК. Установлена обратная зависимость между способностью респираторных вирусов индуцировать ИФН и их репродукцией в культурах ЭК КРС и человека.

Впервые показана способность бетулина индуцировать в культуре ЭК провоспалительные цитокины.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать бетулин для лечения и профилактики респираторных болезней, вызванных вирусами ИРТ и ВД-БС; получен патент: Ru №2278683 С1, «Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота» Г.Н.Величко, А.Ф.Шуляк, О.Н.Щегловитова, К.П.Юров, В.В.Балакшин, Г.А.Преснова, А.Н.Чистяков, 2004.

Культура эндотелия кровеносных сосудов КРС может служить моделью для изучения патогенеза вирусных болезней, оценки продукции ИФН и цитокинов при вирусных инфекциях и использовании лекаственных средств, для скрининга иммуномодуляторов.

Разработаны и утверждены Ученым Советом ВИЭВ «Методические рекомендации по культивированию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов крупного рогатого скота» и «Методические рекомендации по применению бетулина при вирусных репираторных болезнях крупного рогатого скота», протокол № 10 от 21 октября 2008 г.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной конференции «Актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства», г. Ялта, 2005 г.; представлены на международной выставке «Аптека-2004», (Бельгия) и международной фармацевтической выставке (Испания, 2006 г.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно-производственном совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент на изобретение РФ; рассмотрены Ученым Советом ВИЭВ 2 методические рекомендации.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Список литературы содержит 166 источников, из них 47 - отечественные, 119 - иностранные. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 24 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Величко, Галина Николаевна

4. ВЫВОДЫ

1. Бетулин оказывал профилактическое действие при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом ИРТ, и при спонтанной инфекции, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, у телят в возрасте 2-дн., 2-3 недели, 2-3 мес. Применение бетулина предупреждало развитие респираторного синдрома, репродукцию и экскрецию вируса ИРТ с носовыми секретами.

1. Установлена терапевтическая эффективность бетулина при респираторной болезни, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, что проявлялось в сокращении продолжительности клинической стадии болезни, выздоровлении животных, снижении уровня инфицированности вирусом ИРТ, предотвращении рецидивов.

2. Применение бетулина при хронической респираторной болезни, вызванной вирусами ИРТ и ВД-БС, не оказывало видимого терапевтического эффекта, но достоверно снижало уровень инфицированности телят вирусом ИРТ.

3. Использование теста ИФН-статус позволило выявить иммуномодули-рующие свойства бетулина, его влияние на потенциальную активность лейкоцитов инфицированных и вакцинированных животных, заключающееся в сохранении способности лейкоцитов продуцировать ИФН-а и -у.

5. Бетулин оказывал прямое воздействие на вирусы ИРТ и ПГ-3, снижая их инфекционный титр на 6,5 и 4 lg ТЦД5о/мл соответственно.

6. Вирус ПГ-3 репродуцировался в культурах ЭК как КРС, так и человека. Вирус ИРТ размножался в ЭК КРС и не репродуцировался в культуре ЭК человека. Репродукции вируса ВД-БС не установлено в обеих культурах.

7. Вирусы ИРТ и ВД-БС индуцировали продукцию ИФН как в культуре ЭК КРС, так и в культуре ЭК человека. Установлена обратная зависимость между способностью этих вирусов индуцировать интерферон и степенью их репродукции.

8. Бетулин индуцировал продукцию ИЛ-6 и ИЛ-8 и не стимулировал синтез ИФН и ФНО-а культурой ЭК человека.

9. Первичные культуры и субкультуры ЭК КРС и человека могут служить модельными системами для изучения патогенеза вирусных инфекций и для скрининга лекарственных средств.

10. Механизм лечебно-профилактического действия бетулина связан с его с вирулицидным, интерфероногенным и иммуномодулирующим действием.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Применение бетулина для профилактики и лечения вирусных респираторных инфекций КРС. Патент: Ru № 2278683 С1, 2004, «Способ лечения респираторных заболеваний крупного рогатого скота». (Величко Г.Н., Шуляк А.Ф., Щегловитова О.Н., Юров К.П., Балакшин В.В., Преснова Г.А., Чистяков А.Н).

Разработаны «Методические рекомендации по культивированию эн-дотелиальных клеток кровеносных сосудов крупного рогатого скота» и «Методические рекомендации по применению бетулина при вирусных респираторных болезнях крупного рогатого скота».

Культура клеток эндотелия кровеносных сосудов рекомендована в качестве модели для изучения патогенеза вирусных инфекций и для оценки продукции ИФН и цитокинов при вирусных инфекциях и при использовании лечебных средств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Величко, Галина Николаевна, Москва

1. Андреев Е.В. Вирусные инфекции слизистых оболочек крупного рогатого скота // Сб. Ветеринария К. 1974. - №38. - С.37-38.

2. Андреев Е.В. Ассоциированное воздействие на организм вируса и условно-патогенных бактерий // Ветеринария. 1984. - № 5. - С.25-27.

3. Баринский И.Ф., Львов Н.Д., Самойлович Е.О. Химиотерапия герпетической инфекции // Вопросы вирусологии. 1986. - № 1. — С.6-18.

4. Бочарова И.В., Демихова О.В., Ерохин В.В., Поспелов Л.Е.и др. Средство для лечения и профилактики туберкулеза. Патент РФ, 2 262 349 С 1,2004.

5. Василенко Ю.К. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы // Экспериментальная и клиническая фармакология,-1993. т.54 №4 - С.53-55

6. Величко Г.Н. Оптимизация условий культивирования клеток эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота // Труды Кубанского Аграрного Университета. 2008. - №1(10). - С.71-74.

7. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Петрова О.Г. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота // Ветеринария. -2002.-№3.-С. 17-21.

8. Гуненков В.В., Сухарев О.И. Болезни, вызываемые герпесвирусами. // Инфекционные болезни животных. Справочник. М. Агропромиздат. — 1987.-С.97.

9. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии: М.: Медицина, 1996. 240 с.

10. Ю.Ершов Ф.И. Антивирусные препараты: М.: Медицина, 1998. 123 с.

11. Ершов Ф.И. Интерферон и его индукторы, как противовирусные средства широкого спектра действия // Первый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». 1992. - 228 с.

12. Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Интерферон и его индукторы: М.: Медицина, 1980. 173 с.

13. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Балакшин В.В., Чистяков А.Н. Антимутаген. Патент РФ, 2 266 128 С1, 2004.

14. Калинкина М.А., Балакшин В.В., Чистяков А.Н. Антигипоксическое средство. Патент РФ, 2 252 773 С1, 2003.

15. Кондрахина К.Н., Фарбртко Г.Э. Выделение вируса ИРТ из проб спермы и желточной суспензии методом центрифугирования // Контроль и стандартизация средств специфической профилактики инфекционных болезней животных: сб. научн. Трудов ВГНКИ 1984. - С.63-66.

16. Коннов Н.М., Шарафутдинова К.Н., Гафаров Х.З., Гумеров В.Г. Керато-конъюнктивит телят, вызванный вирусом ринотрахеита телят // Тезисы докладов «Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов» М., 1982. - С.82-85.

17. Красочко П.А. Эпизоотологическое обследование коров на вирусы инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи по наличию антител всборном молоке // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по эпизоотологии. Новосибирск. 1991. - С. 123-124.

18. Крюков Н.Н., Белкина Н.М., Семенихин A.JI. Получение модифицированного вируса ИРТ и испытание его иммуногенных свойств // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - Вып. 14. - С.5-8.

19. Крюков Н.Н., Семенюта А.Т., Шегедевич Э.А. Микробный пейзаж и иммунологическая реактивность у телят, выращиваемых в условиях промышленной технологии // Труды ВИЭВ. 1984. -№ 60. - С. 15-23.

20. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: М.: Медицина, 1980.- 173 с.

21. Минеева М.Ф. Адаптогенное средство. Патент РФ, 2 240 799 С1, 2003.

22. Мозгис В.Я., Андерсонс З.С., Блузманис Я.Р.и др. Клиническое испытание рибамидина при лечении вирусных заболеваний крупного рогатого скота. Профилактика и лечение болезней молодняка в промышленном животноводстве // Рига: Зинатне. 1989. - С.75-79.

23. Морозов И.А., Шуляк А.Ф., Артюшин, Коромыслов Г.Ф. Дифференциация штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью рестрикционного анализа // Мол.генет., микробиол. и вирус. 1991. - № 4. - С.64-67.

24. Носик Н.Н., Балакшин В.В., Чистяков А.Н. Индуктор интерферона. Патент РФ, 2 252 775 С1, 2004.

25. Петрова О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в племенных хозяйствах среднего Урала и оптимизациясистемы противоэпизоотических мероприятий: Автореф.дис. д-равет.наук. М., 2002. - 47 с.

26. Петрова О.Г. Острые респираторные заболевания крупного рогатого скота. Диагностика, профилактика, лечение // Екатеринбург. 1995. — С.41.

27. Пронин А.В. Иммуномодуляция и вакцинопрофилактика: опыт применения препарата фоспренил // Российский ветеринарный журнал. — 2005. -№ 1. С.42-44.

28. Святовец Г.Д. Диагностика воспалительных процессов в половых органах быков //Ветеринария. 1988. - № 5. - С.50-51.

29. Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерфероны в теории и практике медицины. М.: Медицина, 1970. - 272 с.

30. Стикс Г. Очередная атака на СПИД // В мире науки. 2006.- № 9.- С.59-61.

31. Сухарев О.И. Особенности эпизоотического процесса в хозяйствах стационарно неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту // Актуальные вопросы эпизоотологии. // Тез. докл. Всес. науч. конф. по проблемам эпизоотологии. Казань, 1988. - С.42-43.

32. Трефилов В.Н. Диагностика генетальной формы инфекционного ринот-рахеита крупного рогатого скота // Сб. тр. Свердловского и Кировского с.-х. институтов. 1979. - Т.56. — С.24-27.

33. Усова Н.Ф. Клиническая картина и патологоанатомические изменения при инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота // Межвуз. СБ. науч. статей. Кишинев, 1980. - С.24-26.

34. ЗЭ.Филдс Б., Найп Д. Вирусология: В 3 т. М.: Мир, 1989. - Т. 2. - 496 с.

35. Флехтер О.В.и др. Синтез тритерпеноидов ряда лупана и их гепатопро-текторная активность // Биоорганическая химия. 2000. - № 26 (3). -С.215-230.

36. Фрейдлин И.С., Шейкин Ю.А. Эндотелиальные клетки в качестве мишеней и продуцентов цитокинов // Мед. Иммунол. — 2001. № 3(4).- С. 499-514.

37. Ямникова С.С., Федякина И.Т., Балакшин В.В., Чистяков А.Н. Средство для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц. Патент РФ, 2 283 126 С1, 2005.

38. Щегловитова О.Н. Ангиогенез и вирусные инфекции // Вопросы вирусологии. 2005 - Т.50, № 5. - С.4-9.

39. Щегловитова О.Н. Дисфункции эндотелия кровеносных сосудов человека при ВИЧ-инфекции // Вопросы вирусологии. 2005. - Т.50, № 6. -С. 4-9.

40. Юров К.П., Шуляк А.Ф., Петрова О.Г. и др. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в различных регионах России. // Труды ВИЭВ. — 2003.-№73.-С.15-22.

41. Ackermann M. Pro and contra IBR-eradication / Ackermann M., Engels M. I I Vet. Microbiol., article in press 2005.

42. Ackermann M., Engels M. Pro and contra IBR-eradication // Veterinary Microbiology. 2006. - 113: 293-302.

43. Ackermann M., Muller H.K., Bruckner L. The control of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) in Switzerland from 1978 to 1988 // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 1989. - 131: 397-407.

44. Ackermann M., Muller H.K., Bruckner L. Eradication of infectious bovine rhinotracheitis in Switzerland: review and prospects // Veterinary Microbiology. 1990.-23:365-70.

45. Allan E.M., Mcolla P.M. Scanning electron microscopy of the tracheal epithelium of calves inoculated with bovine herpes I // Res. Vet. Sci. 1980. -29: 325-327.

46. Ames T.R., Baker J.C. Management practices and vaccination programs that help control BVD virus infection // Veter. Med. 1990. - 85 (10): 1140 -1149.

47. Baglioni C., Maroney P.A. Mechanism of action of human interferons. Induction of 2>-5,-oligo (A) polymerase // J.Biol.Chem. 1980 - 225: 83908393.

48. Baker T.C. Bovine viral diarrhea virus: a review // J. Am. Vet. Med. Ass. -1987.-190: 1449-1458.

49. Baker T.S. Clinical aspects of bovine virus diarrhea virus infection // Rev. Sci. tech. Off. Int. Epiz. 1990. - 9 (1): 25-41.

50. Baker J.C. Bovine viral diarrhea virus: a review // Journal of the American Veterinary Medical Association. 1987. - 190: 1449-58.

51. Baker J.C. The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection // Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice. 1995. - 11: 425-45.

52. Barber D.M.L., Nettlebon P.F., Herring J.A. Disease in daru herd associated with the introduction and spread of bovine virus diarrhea vims II Vet. Rec. — 1985.-117:459-464.

53. Barchet W., Cella M. Plasmacytoid dendritic cells-virus experts of innate immunity // Colonna M. Semin Immunol. 2005. - 17(4): 253-61.

54. Baron B. L., Vales N. Biologia molecular de la pathogenesis por herpesvirus // Rev. Latinoamer. Microbiol. 1990. - 33 (1): 77-85.

55. Beck B.E. Infectious bovine rhinotracheitis encephalomyelitis in cattle and its differential diagnosis // Canad. Veter. J. 1975. - 16 (9): 143-325.

56. Bielefeldt-Ohmann H. The pathologies of bovine viral diarrhea virus infection. A window on the pathogenesis // Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice. 1995. - 11: 447-76.

57. Bitsch V. Infectious bovine rchinotracheitis virus infection in bulls, with special reference to preputial infection // Appl. Microbiol. 1973. - 26: 337343.

58. Bitsch V. Persistence of infection with infectious bovine rchinotracheitis virus in Danish cattle heds // Nord. Veter. Med. 1978. - 30.(4-5): 178-185.

59. Bitsch V., Hansen K.E., Ronsholt L. Experiences from the Danish programme for eradication of bovine virus diarrhoea (BVD) 1994-1998 with special reference to legislation and causes of infection // Veterinary Microbiology. 2000. - 77: 137-43.

60. Blatt L.M., Davis J.M., Klein S.B., Taylor M.W. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon // J. Interferon-Cytokine Res. 1996. - 16 (7): 489-499.

61. Boelaert F., Biront P., Soumare В., Dispas M. Prevalence of bovine herpesvi-rus-1 in the Belgian cattle population // Prev. Vet. Med. 2000. - 45: 285295.

62. Bolin S.R. Control of bovine virus diarrhoea virus // Revue Scientifique et Technique. 1990. - 9: 163-71.

63. Borden EC. Interferons: pleiotropic cellular modulators // Clinical Immunology & Immunopathology. 1992 - 62 (1- 2): 18-24.

64. Brock K.V., Chase, C.C. Development of a fetal challenge method for the evaluation of bovine viral diarrhea virus vaccines // Veterinary Microbiology.- 2000.-77:209-14.

65. Carmen Recio M. et.al. Investigation on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas // Planta Med. — 1995. -61:9-12.

66. CeIis E., Miller R.W. et al. Isolation and characterization of human T cell lines and clones reactive to rabies virus: antigen specificity and production of interferon-gamma // J.Immunol. 1986. — 136: 692-697

67. Charleston В., Fray M.D., Baigent S., Carr B.V. Establishment of persistent infection with non-cytopathic bovine viral diarrhoea virus in cattle is associated with a failure to induce type I interferon // Journal of General Virology.- 2001.-82:1893-7.

68. Chen Sun. Sythesis and anti-HIV activity of Betulin derivates // J.Med. Bio-organic Medical Chemistry Letters. 1998.-8:1267-1272.

69. Cines D.B., Pollak E.S., Buck C.A. Endothelial cells in physiology and in the-pathophysiology of vascular disorders // Blood. 1998. - 91: 3527-3561.

70. David M. Transcription factors in interferon signaling // Pharmacology & Therapeutics. 1995 - 65 (2): 149-161.

71. De Maeyer E., De Maeyer -Guignard J.Interferon and other reguiatory cytokines // Wiiey, New York. 1998.

72. Deptula W. Aktywnosc fagocytarna granulocytow obojetnochlonnych (Ko-morek PMN) krwi obwodowej u bydla zakazogeno wirusemlBR/IPV (Bovid herpesvirus-1)//Pol. Arch. Wet. 1991.-31 (1-2): 153-165.

73. Deregt D., Loewen K.G. Bovine viral diarrhea virus: biotypes and disease // J Can Vet. 1995. - 36 (6): 71-78.

74. Duffel S.J., Sharp M.V., Bates D. Financial loss resulting from BVD-MD virus infection in a dairy herd // Vet. Rec. 1986. — 118: 38 - 39.

75. Evers M. et.al. Betulinic acid derivates: a new class of human immunodefi-• ciency virus type 1 specific inhibitors with a new mode of action // J. Med.

76. Chem. 1996. - 39: 1056-1058.

77. Fields H.J., Reading MJ. The ingibition of bovine herpesvirus by methyl 2-pyridyl ketone thiosemicarbazone and its effects on bovine cells // Antiviral Res.-1987.-17: .245-256.

78. Fu X.Y, Kessler D.S., Veals S.A., Levy D.E. et al. The transcriptional activator induced by interferon alpha, consists of multiple interacting polypeptide chains // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990. - 87: 8555-8559.

79. Garotta G., Talmadge K.W., Pink J.R.L., Dewald B. Functional antagonist between type I and type II interferons on human marcrophges // Bio-chem.Biophys.Res.Commun. 1986. - 140: 948-954.

80. Gibbs E.P.J., Pweyemamu M.M. Bovine Herpesviruses. Part 1. Bovine Herpesvirus 1 // Veterinary Bulletin, Weybridge. 1977.-47: 317-343.

81. Gilliam S.E., Field H.J. The effect of (S)-l-(3-hydroxy-2-phosphonyl-methoxypropyl) cytosine (HPNPC) on bovine herpesvirus-1 (BHV-1) infection and reactivation in cattle // Antiviral Res. 1993. - 20 (1): 21-32.

82. Givens M.D., Heath A.M., Brock K.V. Detection of bovine viral diarrhea virus in semen obtained after inoculation of seronegative postpuberal bulls // AJVR. 2003. - 64 (4): 428-434.

83. Guadagni F., Roselli M., Schlom J., Greiner J.W. In vitro and vivo regulation of human tumor antigen expression by human recombinant interferons: a review// International Journal of Biological Marcers. 1994. - 9 (1): 53-60.

84. Gutekunst D.E., Malmquist W.A. Complement fixing and neutralizing antibody response to bovine viral diarrhea and hog cholera antigens // Can J. Сотр. Med.Vet. Sci. 1964.-28: 19-23.

85. Hage J.J., Glas R.D., Westra H.H. Reativation of latent bovine herpesvirus 1 in cattle seronegative to glycoproteins gB and gE // Veterinary Microbiology. 1998. - 60: 87-98.

86. Hayek E.W. A. et al. Bicentennial of Betulin // Phytochemistry. 1989. -28 (9): 2229-2242.

87. Higgins P.O., BaiTow G.I., Tyrele D.A.J. The efficacy of intranasal interferon in respiratory synsytial vims infection in volunteers // Antiviral. Res. — 1990.-14(1): 3-10.

88. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhea virus (BV/DV) infections // Vet. Microb. 1999. - 64: 89-107.

89. Houe H. Economic impact of BVDV infection in dairies // Biologicals. -2003.-31: 137-43.

90. Houe H. Risk assessment. In Bovine viral diarrhea virus: diagnosis, management and control // J. Blackwell Publishing Professional. Iowa. 2005. -P. 35-63.

91. Huang S., Hendricks W., Althage A., Hemmi S. Immune response in mice lack the interferon-gamma receptor // Science. 1993 — 259: 1742-1745.

92. Sellri C., Sato Т., Anderson S. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha suppress both early and late stages of hematopoiesis and induce programmed cell death // J Cell Physiol.- 1995 Dec.- 165 (3): 538-46.

93. Jericho K.W., Lejeune A., Tiffin G.B. Bovine herpesvirus 1 and Pasteurella haemolitica: aerobiology in experimentaly infected calves // Am. J. Of Vet. Res. - 1986. - 47 ( 2): 205-210.

94. Kelling C.L., Grotelueschen D.M., Smith D.R. Testing and Management Strategies for Effective Beef and Dairy Herd BVDV Biosecurity Programs // The Bov Pract. 2000. - 34 (1): 13-22.

95. Kendrick J.W. Infectious pustular vulvovaginitis of cattle // Cornell. Vet. 1958.-48 (3): 458-495.

96. Kramps I.A., Perrin В., Edwards S., van Oirchot J.T. A European interla-boratory rtial to evaluate the reliability of serological diagnosis of bovine herpesvirus I infections // Veterinary Microbiology. — 1996. 53: 153-61.

97. Lindberg A. Epidemiology and eradication of bovine viral diarrhoea virus infections. Studies on transmission and prenatal diagnosis of persistent infection // Thesis. Swedish University of Agricultural Sciences. 2002.

98. Lindberg A., Alenius S. Principles for eradication of bovine viral diarrhea virus (BDDV) infections in cattle populations // Vet. Microb. 1999. - 64: 197-222.

99. Lindberg A., Niskanen R., Gustafsson H., Bengtsson B. Prenatal diagnosis of persistent bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infection by detection of viral RNA in fetal fluids // S.Veterinary Journal. 2002. - 164: 151-5.

100. Lindberg A., Stokstad M., Loken Т., Alenius S.Indirect transmission of bovine viral diarrhoea virus at calving and during the postparturient period // Veterinary Record. 2004. - 154: 463-7.

101. Lindberg A., Alenius S. Principles for eradication of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infections in cattle populations // Veterinary Microbiology. 1999.-64: 197-222.

102. Mantovani A., Garlanda C., Introna M., Vecchi A. Regulation of endothelial cell function by pro- end anti-inflammatory cytokines // Transplant. Proc. 1998. - 30: 4239-4243.

103. McClurkin A.W., Littledike E.T., Cutlip R.C., Frank G.H. Production of cattle immunotolerant to bovine viral diarrhea virus // Can.J. сотр. Med. -1984.-48: 156-161.

104. Melnick J.L., Adam E., DeBakey M.E. Cytomegalovirus and atherosclerosis // Eur Heart J. 1993. - 14 (K): 30-38.

105. Metzler A.E., Matiele H., Gassmann U. European isolates of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites, polypeptides and reactivity with monoclonal antibodies // Arch. Virol.- 1985.- 85 (1-2): 57-69.

106. Metzler A.E., Wyler R. Praevalenz des Bovenen Herpesvirus 4 in der schweizerischen Rinderpopulation und moeglische Kreureaktion mit dem BovinenHerpesvirus 1 // Schweiz. Arch. Tierheilk. 1986. - 128: 459-467.

107. Meyers G., Thiel H.J. Molecular characterization of pestiviruses // Advances in Virus Research. 1996. - 47: 53-118.

108. Miller N.J. Infectious necrotic rhinotracheitis of cattle // J. Am. Ve. Med. Assoc. 1955. - 126: 463-467.

109. Minick C.R., Fabricant J., Litrenta M.M. Atheroarteriosclerosis induced by infection with a herpesvirus // Am J Pathol. 1979. - 96: 673-706.

110. Moennig V., Eicken K., Flebbe U., Frey H.R., Grummer В., Haas L., Greiser-Wilke I., Liess B. Implementation of two-step vaccination in the control of bovine viral diarrhoea (BVD) // Preventive Veterinary Medicine. -2005.-72:109-14.

111. Moennig V., Houe H., Lindberg A. BVD control in Europe: current status and perspectives // Anim Health Res. Rev. 2005. - 6: 63-74.

112. Moerman A., Straver P.J., de Jong M.C. A long term epidemiological study of bovine viral diarrhea infections in a large herd of dairy cattle // Vet. Res. 1993. - 132: 622-626.

113. Morris A.G., Lin Y.L., Askonas B.A. Immune interferon release when a cloned cytotoxic T-cell line meets its correct influenza-infected target cell // Nature. 1982 - 295: 150-152.

114. Muller U. et al. Functional role of type I and type II interferons in antiviral defence// Science. 1994.-264: 1918-1921.

115. Mweene A.S., Okazaki K., Kida H. Detection of viral genome in non-neural tissues of cattle experimentally infected with bovine herpesviruc I // Japabese Journal of Veterinary Research. 1996. —44: 165-174.

116. Nilsen T.W., Maroney P.A., Baglioni C. Double-srtanded RNA causes synthesis of 2,-5"-oligo(A) and degradation of messenger RNA in interferon-treated cells // J. Biol. Chem. -1981.- 256: 7806-7811.

117. Nylin В., Madin G.K., Ronsholt L. Reintroduction of bovine herpes virus type I into Danish cattle herds during the period 1991-1995: A review of the investigation in the infected herds // Acta ve. Scand. 1998. - 39 (4): 401413.

118. OIE. Infectious bovine rhinotracheitis / infectious pustular vulvovaginitis. Chapter 2.3.5. In: Manual of Standards Diagnostic Test and Vaccines 2000, Edition 4. Oddice International dea Epizooties.

119. Olafson P., McCulum A.D., Fox F.H. An apparently new transmissible disease of cattle // Cornell Vet. 1946. - 36: 205-213.

120. Pastoret P.-P., Thiry E., Vindevogel H. Problem lies a la latence lors de vaccination contre le virus de la rhinotracheite infectiuse bovine (Bovid Herpesvirus) // Develop. Biol. Standart. 1982. - 52: 455-461.

121. Perdrized J.A., Rebhun W.C., Dubovi E.J., Donis R.O. Bovine virus diarrhea: clinical syndromes in dairy herds // Cornell Vet. 1987. - 77: 46 - 74.

122. Pozo M.A., Sanchez-Mateos P., Sanchez-Madrid F. Cellular polarization induced by chemokines: a mechanism for leukocyte recruiment // Immunol. Today. 1996. - 17: 127-131.

123. Proietti E., Vanden Broecke et al. Specific interferon genes are expressed in individual cells in the peritoneum and bone marrow of normal mice // J. Interferon Res. 1992. - 12: 27-34.

124. Purdy C.W., Loan R.W., Popham T.W. Feeder calf vaccination management in semen southeastern states // Agri. Pract. 1987. - 8 (5): 16-20.

125. Radostits O.M., Littlejohns J.R. New concepts in the pathogenesis, diagnosis and control of diseases caused by bovine viral diarrhea virus // Vet. Rec.-1988.-123: 122-125;

126. Ridpath J.F., Bolin S.R. Delayed onset postvaccinal mucosal disease as a result of genetic recombination between genotype 1 and genotype 2 BVDV // Virology. 1995. - 212: 259-62.

127. Roeder P.L., Drew T.W. Mucosal disease of cattle: a late sequel to fetal infection // Vet. Rec. 1984. - 114: 309 - 313.

128. Roels S., Charlier G., Letellier C., Meyer G. Natural case of bovine herpesvirus I meningoencephalitis in an adult cow // Vet Microbiol. 2000. -146 (20): 233-240.

129. Ruth G.R. Bovine viral diarrhea: a difficult infection to diagnose // Vet. Med.-1986.-81: 870-874.

130. Saji M., Mriarty J., Ban Т., Singer D.S., Kohn L.D. Major histocompatibility complex class I gene expression in rat thyroid cells is well as interferon // Journal of Cliical Endocrinology & Metabolism. 1992. - 75(3): 871 -878.

131. Samuel CE. Antiviral actions of interferon. Interferon-regulated cellular proteins ■ and their surprisingly selective antiviral activities // Virology. — 1991.-183 (1): 1-11.

132. Schober Y., Braun R., Reiser H. et.al. T-lymphocytes are the producer cells of interferon-gamma //Exp. Cell. Res. 1984. - 152(2): 348 - 356.

133. Schroder С., Keil G.M. Bovine herpesvirus 1 requires glycoprotein H for infectivity and direct spreading and glycoproteins gH (W450) and gB for glycoprotein D-independent cell-to-cell spread // Journal of General Virology. 1999. - 57: P.57-61.

134. Span A.H., Grauls G., Bosman F., van Boven C.P., Bruggeman C.A. Cytomegalovirus infection induces vascular injury in the rat // Atherosclerosis. -1992.-93:41-52.

135. Srark G.R, Kerr I.M. Interferon-dependent signaling pathways: DNA element, transcription factors, mutations, and effects of viral proteins // J. Interferon Res. 1992 - 12 (3): 147-151.

136. Straub O.C. Advances in BHV 1 (IBR) research. Dtsch // Tiearaztl. Wochenchr. -2001. 108 (10): 419-422.

137. Stumpf Т.Н., Case R., Shimeld C. et al., Primary herpes simplex virus type I infection of the eye triggers similar immune responses in the cornea and the skin of the eyelinds // J. Gen. Virol. 2002 - 83 (7): 1579-1590.

138. Taylor P.M., Wraith D.C., Askonas B.A. Control of immune interferon release by cytotoxic T-cell clones specific for influenza // Immunology. -1985-54:607-614.

139. Tekes L., Markos В., Kecskemeti S., Mehesfalvi J., Mate Z., Kudron E. Prevalence of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) infection in Hungarian cattle herds // Acta Vet Hung. 1999. - 47: 303-309.

140. Thiry E., Saliki J., Bublot M., Pastoret P.P. Reactivation of infectious bovine rhinotracheitis virus by trasport // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 1987. - 10: 59-63.

141. Tovey M.G., Streuli M., Gresser I. et al. Interferon messenger RNA is produced Constitutively in the organs of normal individuals // Proc. Natl. Acad. Sci.USA.- 1987. 84: 5038-5042.

142. Van Oirshot J.T, Rijsewijk F.A., Straver PJ. et al. Virulence and genotype of a bovine herpesvirus I isolate from semen of a subclinically infected bulls // Vet. Rec. 1995b. - 137 (10): 235-239.

143. Van Oirshot J.T. Bovine herpesvirus in semen of bulls and the risk of trasmission: a brief review // Vet.Q. 1995a. - 17 (1): 29-33.

144. Van Schaik G. Introduction of BHV-1 on dairy farms. Risk assessment by cattle farmers and veterinarias // Tijdschr. Diergeneeskd. 1998. — 123 (6): 180-183.

145. Vercellotti G.M. Effects of viral activation of the vessel wall on inflammation and thrombosis // Blood coagul. Fibrinolysis. 1998. - 9 (Suppl. 2): 3-6.

146. Vercellotti G.M. Overview of infections and cardio-vascular diseases // J.Allergy Clin. Immunol. -2001. 108 (Suppl. 4): 117-120.

147. Virakul P., Fahning M.L., Joo H.S. et al. Fertility of cows challenged with a cytopathic strain of Bovine Viral Diarrhea virus during an outbreak of spontaneous infections with a noncytopatic strain // Theriogenology. 1988. -29(2): 441-449.

148. Vittori S., Salvatori D., Volpini R. et al. Deaza- and deoxyaenosine derivatives: synthesis and ingibition of animal viruses as human infection models // Nucleotides Nucleic Acids. 2003. - 22(5-8): 877-881.

149. Vonk Noordegraaf A. An epidemiological and economical simulation model to evaluate the spread and control of infectious bovine rhinotracheitis in the Netherland // Prev. Vet. Med. 1998. - 36 (3): 219-238.

150. Weiblen R., Kreutz L.C., Canabarro T. et al. Isolation of bovine herpesvirus I from preputial swabs and semen of bulls with balanopoatitis // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - 4 (3): 341-343.

151. Wellenberg G.I., Verstraten E.R., Jongejan F., Van Oirschot J.T. Susceptibility of bovine umbilical cord endothelial cells to bovine herpesviruses and pseudocowpox virus // Vet Res Commun. 2002. - 26 (5): 407-17.

152. Winkler M.T. Persistence and reactivation of bovine herpesvirus 1 in the tonsils of latently infected calves // Journal of Virology. 2000. - 74: 53375346.

153. Wong J.P., Saravolac E.G., Sabuda D. Prophylactic and therapeutic efficacies of poly (1С. LC) against respiratory influenza A virus infectionin inice // Antimicrob. Agents. Chemoter. 1995. - 39 (39): 2574 - 2576.

154. Wordin R.E., Ames T.R., Gogal S.M., Deries G.P. Diagnostic investigation of bovine viral diarrhea infection in a Minnesota dairy herd // J. Vet. Di-agn. Invest. 1989. - 1 (57): 61.

155. Yasucawa K. et.al. Sterol and derivates from plants // Oncogene. 1991. -48:62-76.

156. Yates W.D. Interaction between viruses and bacteria in bovine respiratory disease // Canad. Veter. J. 1984. - 25: 37-41.