Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Продукция пектатлиазы бактериями Erwinia carotovora Subsp. Atroseptica

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Продукция пектатлиазы бактериями Erwinia carotovora Subsp. Atroseptica"

ргб оа

.... ' ' • АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ з • ! "" ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

УДК 579.22:579.25+577.152.4

ЛИТВИНОВА Елена Валерьевна

ПРОДУКЦИЯ ПЕКТАТЛИАЗЫ БАКТЕРИЯМИ ERWШIA САКОТОУОКА ЭиВЗР. АТЕОБЕРИСА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск -1996

Работ« »ы юли сия • лаборатории нолекудярмой генетики бактерий при кь^дра «икробиалогш Белорусского государственного университета

Научи» рухоаадатели« доктор иедкцннскнх наук, профессор фомичев U.K.

кандидат биологических наук, доцент Евтушенко» А.Н.

Официальные оппоненты! доктор биологических наук, старший научный сотрудник Михайлова Р.В.

кандидат биологических наук, доцент Гриц Н.В.

Сплсмирукцал организация - Научно-исследоаательский и проектно-конструкторски!) педико-биотехнологический институт

Завита состоится 1996 г. в УЗ °С\.

на заседании совета со зшадте диссертаций Д 01.ЗА.01 в Институте микробиологии АН Беларуси по адресу! 220141, Минск, Жодинскал, 2.

С диссертацией кохно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан / teai-rftcb- 19% г.

Ученый секретарь совета

по зздите диссертаций к.б.н. Л.И.СТЕФАНОВИЧ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Е. carotovora subsp. atroseptlca - представитель группы бактерий, вызывающих "мягкие' гнили" растений. В >тличие от родственных видов Е.chrysantheml и Е. carotovora subsp. carotovora эти микроорганизмы чаще встречаются в зонах с смеренным и холодным климатом, где вызывают бактериоз стеблей сартофеля ("черную ножку") и "мягкие гнили" различных овощных сультур при вегетации и их хранении. В отдельных случаях от поранения "мягкими гнилями" гибнет до 20-50 55 собранного урожая (До-эожкин и соавт.. 1989; Colmer, Bateman, 1981; Perombelon, Kelman. 1987).

Вирулентные свойства Erwlnia в значительной степени обуслов-1ены способностью синтезировать деполимеризующие ферменты, в 1астности, пектолитические, эффективно разрушающие пектиновые ве-цества срединных пластинок и стенок растительных клеток, что приводит к мацерации тканей. Пектолитическая активность Erwlnia в количественном отношении обусловлена преимущественно пектатлиа-зой. представленной несколькими изоферментами. Очевидно, что для зыяснения роли этого фермента во взаимодействии Erwlnia с растениями необходимо детальное изучение свойств изоферментов пектат-лиазы и основных закономерностей регуляции их синтеза.

Ферменты Erwlnia отличаются широким оптимумом действия (рН 5,0 - 10,0) и различной субстратной специфичностью ( низко- и вы-сокометилированный пектин). Это обстоятельство обусловливает возможность использования пектолитических ферментов Erwlnia во многих технологиях, связанных с переработкой растительного сырья, вместо либо одновременно с широко применяемыми в настоящее время неполитическими препаратами грибного происхождения. Представляется перспективным применение бактериальных пектиназ в пищевой, винодельческой, легкой и фармацевтической промшнленноотях. Все вышесказанное определяет необходимость получения штаммов бактерий с повышенной продукцией пектолитических ферментов, в частности, пектатлиазы.

Кроме того,пектатлиаза,экскретируемая клетками Erwlnia во внешнюю среду,является удобным объектом для изучения механизма секреции белков грамотрицательными бактериями.Эта проблема пряобт рала особую актуальность в связи с использованием микроорганизмов F> качестве продуцентов ряда биологически активных рицесть be то-

В OÍ! ГрфиДЫ.

сертационная работа выполнялась в лаборатории молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии биологического факультета Белгосуниверситета в течение 1990 - 1995 гг. в соответствии о планами научно-исследовательских работ в рамках темы "Изучение детерминант вирулентности и сравнительный анализ геномов бактерии рода Erwlnla" (г/б 392/57).

Пел^ и задачи иссдекорация, Цель работы заключалась в изучении некоторых закономерностей синтеза и секреции пектатлиазы у бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca. что. в свою очередь, обусловило решение следующих задач:

- анализ качественного и количественного состава пектиназно-го комплекса, образуемого исследованными бактериями на средах с различными источниками углерода, а также некоторыми нативными компонентами растительных тканей;

- характеристика регуляторных мутантов Е. carotovora subsp. atroseptlca;

- изучение процессов синтеза и секреции пектатлиази в разных стадиях роста бактериальной культуры и распределения этого фермента в клетках дикого типа и секреторных мутантов;

- установление некоторых закономерностей продукции и секреция иектатлиаэ, детерминируемых в клетках Е. carotovora subsp. atroseptlca клонированными генами других бактерий рода Erwlnla.

Н^учцая новизца полученных результатов. Установлено, что пектатлиаза у исследованных бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca представлена несколькими (не менее пяти) изоферментами. Выявлены основные закономерности регуляции синтеза индивидуальных форм пектатлиази. Показано, что синтез иектатлиаэ у Е. carotovora subsp. atroseptlca, как и у других представителей рода Erwlnla. индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Продукция разных изоферментов регулируется независимо друг от друга и характеризуется различной чувствительностью к индуцирующим агентам и катаболнтной репрессии. Получены новые данные о формировании определенных спектров изоферментов пектатлиази в инфицированных растительных тканях в зависимости от их химического состава. Изолирован регуляторныи мутант бактерий Е. carotovora subsp. atroseptlca, характеризующийся повышенной продукцией нескольких укзофераентов (пектатлиазы. целлюлазы, про-

теазы) и нечувствительностью их синтеза к катаболитной репрессии глюкозой. Установлено, что данная мутация ведет к дерепрессии синтеза преимущественно одного изофермента - пектатлиазы Еса4.

Выявлен ряд закономерностей в процессе секреции пектатлиазы у Е. саго1оуога БиЬзр. а1гозериса: транслокация синтезируемого в цитоплазме фермента в периплазматическое пространство и экспорт его из периплазмы через наружную мембрану во внешнюю среду. На основании данных по изучению экспрессии в клетках Е. сагоюуога диЬэр. af.rosepti.ca клонированных генов пектатлиаз других представителей рода Еги1п1а можно сделать вывод о высокой специфичности системы секреции пектиназ у Еп»1п1а, принадлежащих не только к разным видам, но даже подвидам.

Практическая значимость полученных результатов, В результате экспериментов по изучению синтеза пектолитических ферментов с использованием синтетических сред с различными эффекторами синтеза пектатлиазы. а также сред с растительными компонентами выявлены основные факторы, позволяющие осуществлять модуляцию количественного и качественного состава пектолитических ферментов в процессе их синтеза. Показана также возможность использования различных источников углерода для получения пектолитических ферментов определенного состава.

Получены мутанты бактерий Е., сапНоУога зиЬзр. атэзериса 36А, по продуктивности пектатлиазы превосходящие в 2-6 раз исходный штамм. Мутанты могут найти применение для получения высокоэффективных ферментных препаратов пектолитического действия.

Результаты работы расширяют сведения о физиологии и биохимии факторов вирулентности одного из важнейших для Беларуси фитопато-генов Е. саго^уога эийзр. а^оэериса.

терий - продуцентов пектолитических ферментов, а также получаемые с их помощь» ферментные препараты мацерируицего действия могут представлять определенный интерес для использования в различных отраслях пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и в научных исследованиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- Регуляция синтеза пектатлиазы у Е. сагоГ.оуога БиЬер. а1,го-верИса осуществляется путем индукции пектиновыми веществами, г.а таболигной репрессии глюкозой и зависит от Фазы роста бактертчь-ных клеток.

- Пектатлиаза Е. сагоюуога виЬзр. аЬгоэериса представлена множественными молекулярными Формами, различающимися по степени индукции и чувствительности к катаболитной "репрессии.

- Показана возможность формирования определенных спектров изоферментов пектатлиазы в инфицированных растительных тканях.

- Охарактеризованы мутанты бактерий Е. сагоюуога эиРзр. а1-гозерИса с дерепресонрованным синтезом пектатлиазы, а также некоторых других внеклеточных ферментов (целлюлазы, протеазы). Установлено избирательное действие описываемой мутации на продукцию различных изоферментов пектатлиазы.

- Показана идентичность качественного состава внеклеточных и внутриклеточных пектатлиаз, продуцируемых бактериями Е. сагоюуога ааЬзр. а^роверИса дикого типа и секреторными мутантами.

- В .процессе секреции пектатлиаз из клеток Е. саго^уога зиЬзр. аИ'озерИса можно выделить две стадии: транслокация синтезируемого фермента в периплазму и экспорт через наружную мембрану во внешнюю среду.

- Выявлена высокая специфичность системы секреции пектатлиазы у Еп»1п1а; показана низкая эффективность секреции клетками Е. саго1оуога зиЬэр. а1гозериса изоферментов, принадлежащих к другим видам и подвидам данного рода.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал диссертационной работы получен, обработан и проанализирован автором.

Апробация результатов ж<?ертации. Результаты исследований представлялись на Всесоюзном совещании "Фитонциды. Бактериальные болезни растений" (Ужгород,. 1990), У1 съезде Белорусского отделения Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Горки, 1992), У1 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Минск. 1992), У1 конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994).

Опубликованность результатов, Результаты исследований опубликованы в пяти статьях в научных журналах и четырех тезисах конференций. Одна статья находится в печати (журнал "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология").

Структура и объем диссертации- Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, анализа и обобщения резуль татов исследований, выводов, списка использованных источников.

Работа изложена на 104 страницах машинописного текста,соде]

жит 14 таблиц. 16 рисунков, список использованных источников, включающий 139 наименований.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1 диссертационной работы является обзором литературы и состоит из 3-разделов. В первом разделе дана характеристика пектиновых веществ и пектолитических ферментов, катализирующих их расщепление, описаны свойства пектатлиазы. а также генетический контроль ее синтеза у бактерий рода Erwlnla. Второй раздел посвящен анализу информации по механизмам регуляции синтеза пектатлиазы у изученных представителей рода Erwlnla. В третьем разделе рассматриваются вопросы, связанные с современными представлениями о секреции различных ферментов ( в том числе и пектатлиазы) гра-мотрицательными бактериями, дана характеристика систем секреции трех типов.

В главе 2 представлена характеристика следующих используемых в диссертации объектов и методов исследования.

Объектами изучения были бактерии Е. carotovora subsp. atro-septlca 36A и E. carotovora subsp. atroseptlca 3-2. а также их мутанты с нарушенной секрецией пектатлиазы, устойчивые к катабо-литноП репрессии глюкозой и характеризующиеся повышенной продукцией пектатлиазы. Для изучения экспрессии генов использовали плазмиды pPL5-l, р27-1 и рЕА364, сконструированные на основе вектора pUC19. несущие участки хромосом с генами пектатлиаз Е. chry-santtieml EfíA49, Е. carotovora subsp. carotovora 17A и E. carotovora subsp. atroseptlca '36A соответственно. Бактериальные штаммы и плазмиды получены из коллекции кафедры микробиологии Велгосуни-верситета. .Для удобства изложения материала в дальнейшем штаммы Е. carotovora subsp. atroseptlca и Е. carotovora subsp. carotovora называются E. atroseptlca и E. carotovora.

Использовали минеральную среду 1A и полноценную среду LB (жидкую и плотную) (Миллер, 1976). Полипектат натрия готовили путём деэтерификации цитрусового пектина (Арасимович ' и соавт., 1970).

Культивирование бактерий осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при 28 0 С в течение 20 - 24 ч на качалке при 200 об/мин. • ■

Мутанты с погашенной активностью пектатлиазы получали путем

обработки клеток Е. atroseptica 36А Н-метил-N- -нитр'о-Н-нитрозогу-анидином (Миллер. 1976). Получение и очистку внеклеточных пектат-лиаз проводили по методике, разработанной Шевчиком и соавт. (1988).

Фракцис периплазматических белков выделали из клеток путем получения сферопластов модифицированным методом Weiss (1976). Для приготовления цитоплазматических фракций осажденные сферопласты суспендировали в 0.05 К трис-HCl-буфере (pH 8.5) и дезинтегрировали с помощью ультразвука в диспергаторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц в течение 20 сек с охлаждением. Препараты наружных мембран получали по методике, разработанной Nakamura. Mlzushlma (1976).

Электрофоретический анализ проводили в полиакриламидном геле с использованием методик, разработанных Евтушенковым и соавт. (1986) и Mlzushima. Jamada (1975).

Активность пектатлиазы и ß-галактозидазы определяли спектро-фотометрически (Шевчик и соавт.. 1988; Миллер, 1976).

Об активности. целлюлазы судили по количеству редуцирующих Сахаров, образующихся в результате действия ферментов на субстрат (На - КМЦ). Активность протеазы определяли модифицированным методом Anson (1939). Белок определяли с использованием кумасси ярко-синего G-250 (Bradford. 1976).

Приведенный в работе цифровой материал является результатом . не менее чем 3-5 кратной повторности опытов и измерений.

Трансформацию клеток Е. coll TG-I плазмидными ДНК проводили с применением 0,05 М СаС1г в 0,01 М трис-НС1-буфере (pH 8,0) (Иа-ниатис.и соавт., 1984). Трансформацию клеток Е. atroseptica 36А осуществляли с использованием TFB-буфера (Гловер, 1989).

В главе 3 представлены результаты исследования регуляции синтеза пектатлиазы у бактерий Е. atroseptica: изучено влияние эффекторов синтеза пектатлиаз на общую пектиназну» активность и синтез индивидуальных изофермеитов. дана характеристика мутантов с нарушенной регуляцией синтеза пектатлиазы.

Продукцию пектатлиазы (количественный и качественный состав) анализировали при культивировании бактерий Е. atroseptica 36А на средах, содержащих различные источники углерода: глюкозу (катабо-литный репрессор). пектат натрия (индуктор). глицерин и триптон.

Установлено, что синтез пектатлиазы у изучаемых бактерий является индудабедышм и существенно возрастает при внесении в сре-

ду культивирования пектата натрия. Значительная часть фермента (до' 90 %) локализована в культуральной жидкости, поэтому все эксперименты. результаты которых приводятся в данной главе, проводили только с внеклеточным ферментом.

Показано, что пектаглиаза Е. а1гозер!;1са 36А представлена пятью изоферментами (Еса1-Еса5). Продукция нейтральных пектатлиаз Еса1 и Еса2 очень низка во всех использованных средах и практически не изменяется при наличии в среде различных источников углерода. в том числе и индуктора. Иные закономерности выявлены для изоферментов ЕсаЗ, Еса4 и Еса5. На трех средах без пектата формируются идентичные изоферменгные спектры, т.е. уровень конститутивного синтеза каждой из отмеченных трех пектатлиаз не зависит от источника углерода. При внесении пектата в наибольшей степени возрастает продукция пектатлиаз ЕсаЗ и. особенно. Еса4, причем их количество увеличивается и при внесении индуктора в среду с глюкозой , тогда как Еса5 в этих условиях синтезируется на базальном конститутивном уровне (рис. I, табл. 1).

Вса1 Вса2 ВсаЭ Еса4 Вса5

22 гг

5

Ш го

г;

22

ш

а

Ш

22

2

23 20 55

Ш

Ш

48

21 Ш

[223

225

ш

ш

72. 222

ш ш

<1 <1

го

зо

93

222 Ш

^59

В

д

гг.

5

Ш

<1 <1

Т22

т. ш Ш

22

<1 3

га

69 <1

и

■ Рис. 1. Электрофореграмка препаратов внеклеточных пектатлиаз бактерий Е. а^озерИса 36А при культивировании в синтетической среде 1А. содержащей глицерин (а), глицерин и пектат (б), глюкозу (в), глюкозу и пектат (г), триптон (д). триптон и пектат (е). ткани стеблей льна (я), ткани клубней картофеля (з) и ткани стеблей картофеля (и). Еса2-Еса5 - обозначения изоферментов пектатли-азы. Цифры указывают значения пектатлиазной активности изоферментов (в % от общей активности образца)

Полученные данные позволяют говорить о наличии селективной регуляции синтеза различных изоферментов пектатлиазы у Е. а^оэери-са. Для изофермента Еса5 характерен довольно высокий уровень конститутивного синтеза, слабо подверженного индукции пектиновыми веществами (не более чем в 1,5-2.0 раза), в то время как синтез пектатлиаз ЕсаЗ и Еса4 индуцируется пектатом натрия в 5-7 раз.

Для моделирования условий продукции пектатлиаз в инфицированных растительных тканях были использованы минеральные среды с добавлением льняной соломки, ломтиков картофельных клубней и стеблей картофеля. Выявлено сходство уровней продукции всех изоферментов пектатлиазы в средах с тканями клубней с одной стороны и в синтетической с триптоном и пектатом - с другой. Аналогичная закономерность выявлена в средах со стеблями льна и картофеля и в синтетической с глюкозой и пектатом (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1

Продукция изоферментов пектатлиазы бактериями Е. а1гоэериса 36А на различных средах

Изоферменты Продукция! (Е/мг клеточного белка)

пектатлиазы на среде, содержащей:

ГЦ ГЦ+П ГЛ ГЛ+П Т Т+Л СЛ СК КК

Еса2 0. 02 0.04 0, 02 0,02 0.01 0.02 0,02 0.05 0,02

ЕсаЗ 0,24 1.50 0,24 0,56 0,20 1. 12 0.30 0,51 0,80

Еса4 0, 34 2, 40 0.20 0.98 0,30 1,46 1.68 1,22 1,78

Еса5 0,60 1,06 0, 54 0.14 0.50 1.16 0.01 0. 01 3,80

Суммарная

пектатлиаза 1,20 5,00 1.00 1.70 1.01 3.76 2.01 1,79 6.40

Примечание: ГЦ - глицерин, ГЛ - глюкоза. П - пектат натрия.

Т - триптон. СЛ - стебли льна. СК - стебли картофеля. КК - клубни картофеля.

Полученные результаты указывают на то, что закономерности продукции пектатлиазы бактериями Е. аЬгоэериса. выявленные на синтетических средах, могут быть распространены и на среды, содержащие растительные компоненты.

При анализе мутантных бактерий с повышенным уровнем синтеза пектатлиазы был отобран штамм (Е. ■ а(;гозериса 3310), продукция пектатлиазы, целлюлазы и протеазы которым была устойчива к ката-болитной репрессии глюкозой. В то же время синтез внутриклеточного фермента р-галактозидазы сохранял подверженность репрессирующему действию глюкозы (табл. 2).

Этот факт свидетельствует в пользу того, что мутантный фенотип не обусловлен нарушением общей регуляции катаболитных оперо-нов, - а, по-видимому, является следствием изменения регуляции синтеза именно экзоферментов.

Установлено, что описываемая мутация (обозначенная ехрЮ приводит к значительному повышению продукции изофермента Еса4,на долю которого приходится до 90 % внеклеточной активности при культивировании бактерий как в условиях конститутивного синтеза, так и в условиях индукции пектатом натрия и репрессии глюкозой. Этот факт свидетельствует о том, что синтез этой пектатлиазы в наибольшей степени подвержен регуляции соответствующим локусом.

Таблица 2

Продукция различных Ферментов бактериями Е. аЬгозерИса 3-2 и Е. а^оэерИса 3310

Среда культивирования Штамм Продукция (Е/мг клеточного белка)

пектатлиазы целлюлазы протеазы р-галакто-зидазы

ЬВ+пек- Е. аЬгозе-

. тат рЧса 3-2 7.40 10,36 3.01 54.70

Е.аСгоэе-

рИса 3310 24.58 19,62 13,48 29.04

ЬВ+пек- Е.а1гозе-

тат+тлю- рИса 3-2 2.90 5,87 1,43 4, 17

. коза Е. а1гозе-

рМса 3310 28.68 17,25 20, 58 4,20

В главе 4 рассматриваются вопросы, связанные с секрецией поктатлиаз клетками Е. а^озериса: динамика синтеза и огкреш<и

фермента в периодической культуре, локализация и качественный состав внутриклеточной пектатлиазы, а также влияние некоторых мутаций на секрецию этого фермента.

Установлено, что интенсивный синтез пектатлиазы происходит в течение экспоненциальной фазы и прекращается в стационарной фазе роста популяции. Практически вся синтезированная пектатлиаза сек-ретируется из клеток в среду роста.

В средах без пектата натрия регистрируется невысокий уровень конститутивного синтеза пектатлиазы, который осуществляется с постоянной скоростью на протяжении всей экспоненциальной фазы роста. При наличии в среде индуктора в начале экспоненциальной фазы роста отмечается незначительный конститутивный синтез фермента. а в середине этой фазы в течение 2-3 ч регистрируется резкое увеличение продукции пектатлиазы. что. очевидно, обусловлено началом индуцибельного синтеза и секреции фермента (рис. 2).

Анализ внутриклеточной пектатлиазы показал, что основная часть этого фермента (до 90%) локализована в периплазматическом пространстве клеток. Кроме того, не обнаружено каких-либо специфических форм пектатлиазы в периплазме Е. а1гозер(.1са 36А и Е. а1;~ говериса 3-2, за исключением того, что несколько изменено про-

Рис. 2. Кривые роста и синтеза пектатлиазы клетками Е. а1-гозериса 36А в синтетической среде 1А с глицерином (а), глицерином и пектатом натрия (б). 1 -рост культуры (ОП510), 2 - внеклеточная пектатлиаза(Е/мл).3 - внутриклеточная пектатлиаза (Е/мл)

центное соотношение разных изоферменгов. Так, если в культураль-ной жидкости бактерий обоих штаммов доминирует пектатлиэза Еса4. то в периплазме возрастает доля пектатлиаз ЕсаЗ и Еса5, а также фермента Еса2.

Изучение мутантов с нарушенной секрецией пектатлиазы (Out* -мутантов) позволило установить идентичность ее изоферментного состава в культуральной жидкости бактерий дикого типа (Е. atroseptica 3-2) и в периплазматическом пространстве мутантных клеток (Е. atroseptica JN433, JN470, JN472). Расчеты продукции каждого изофермента показали, что и количественные соотношения между различными молекулярными формами пектатлиазы в указанных образцах практически полностью совпадают (рис. 3). Этот факт в совокупности с данными о спектрах внутриклеточных пектатлиаз бактерий дикого типа может указывать на то. что локализация фермента в периплазме является промежуточным этапом в экскреции пектатлиазы во внеклеточную среду.

Во*2 ВоаЗ

Scsi

Еса5

ZZ

Ж

ш

zzz

э

1

13

83 Ш

zzz

ш

223

2Z

ш

Ейэ.

2Z

2Z

15 Щ

3

ZZ

Рис. 3. Электрофореграммы препа-

1 ратов внеклеточных пектатлиаз бактерий Е. atroseptica 3-2 (а)

w и периплазматических пектатлиаз Out"-мутантов Е.atroseptica

33JN470 (б). JN433 (в), JN472 (г).

2 Еса2 - Еса5 -обозначения изофер-ментов пектатлиазы. Цифры указывают значения пектатлиазной активности изоферментов (в % от общей активности образца)

1

в

Показано, что клетки секреторных мутантов аккумулируют в периплазме не только пектатлиазу. но также целлюлазу, в то время как секреция протеазы не нарушается. В этом отношении охарактеризованные в работе мутанты Е. atroseptica фенотипически сходны с ранее описанными мутантами Е. chrysantheml и Е. carotovora и могут рассматриваться как типичные Out~ -мутанты с нарушенной второй стадией двуступенчатой секреции, которая связана с экспортом ферментов из периплазмы через наружную мембрану во внешнюю среду.

Установлено отличие состава белков внешних мембран клеток Е. atroseptlca 3-2 и Out" -мутантов.

Материалы исследований, изложенные в главе 5, представляют некоторые закономерности продукции и секреции пектатлиаз. детерминируемых клонированными генами бактерий, принадлежащих к разным видам и подвидам рода Erwlnla.

Клетки Е. atroseptlca 36А были трансформированы рекомбинант-ными плаэмидами (производными вектора pUC19) pPL5~l (несет гены пектатлиаз Echl и Ech2 Е. Chrysanthen! 1 ENA49), р27-1 (несет гены-пектатлиаз ЕссЗ, Есс4. Есс5 Е. carotovora 17А) и рЕА364 (несет гены пектатлиаз ЕсаЗ и Еса4 Е. atroseptlca 36А). В количественном отношении плазмидные штаммы синтезировали в 5-7 раз больше пек-татлиазы, чем исходный штамм.

Установлено, что синтез пектатлиаз Echl и Ech2 происходит в клетках Е. atroseptlca 36ApPL5-l конститутивно, в противоположность этому синтез пектатлиаз. детерминируемых генами Е. carotovora 17А и Е. atroseptlca 36А. как и синтез собственных фементов. индуцируется пектатом (табл. 3). Увеличение дозы генов не сопро-

Таблица 3

Продукция изоферментов пектатлиазы бактериями £. atroseptlca 36А и их плазмидными производными

Штамм Изоферменты пектатлиазы Продукция в Е/мг клеточного белка'

• в LB-бульоне в LB-бульоне с 0,5 % пектатом

КК ПП КЖ ПП

1 2 3 4 5 , 6

Е.atrosep- ЕсаЗ 0.13 - 0,70 0,08

tlca 36 А Еса4 0.80 - 3,35 0.17

Еса5 0,02 - 0,06 0,03

Суммарная

пектатлиаза 0,95 - 4, И 0.28

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4 5 6

Е.аЬгоэер- ЕсЯ1 0,62 7.14 0,21 3.84

Иса ЕсИ2 0,97 15,16 2,50 12, 16

36АрРЬ5-1 ЕсаЗ 0.01 0. 01 2,75 -

Еса4 - - 3,64 -

Еса5 - - 0.12 -

Суммарная

пектатлиаза 1,60 22.31 9,22 16.00

Е.а!;гозер- ЕсаЗ 0.62 0,14 1.66- 0. 34

Иса Еса4 1.24 - 5,54 -

36Ар27-1 Еса5 0,04 - 0.06 -

Есс4 4, 15 0, 90 11,07 2.36

Есс5 0,15 1.32 0,19 0,37

Суммарная

пектатлиаза 6,20 2,36 18, 52 3,07

Е.а(,гозер~ ЕсаЗ 0,69 0,09 2,50 0,06

иса Еса4 3,60 0.10 27,00 0,41

ЗбАрЕАЗб-1 ■ Еса5 - - 0.07 0. 12

Суммарная

пектатлиаза 4.29 0.19 29, 57 0, 59

, Примечание: КЖ - культуральная жидкость, ПП - периплазма.

прочерк - отсутствие активности изофермента пек-татлиазы.'

вождается нарушением секреции пектатлиаз клетками Е. а^оэерЦса 36АрЕА364. В то же время преимущественное накопление (80-90 ■%) изоферментов Ест и Ес№ в периплазме клеток Е. аггозериса 36АрРЬ5-1.а также некоторая аккумуляция (15-25 %) пектатлиаз. детерминируемых клонированными генами, в клетках Е. а^оэериса 36Ар27-1 (табл. 3) и образование значительного периллазматическо-го пула фермента в 1оя-фазе роста этой культуры свидетельствуют о низкой эффективности секреции гетерологичных изоферментов.

Синтез и секреция резидентных изоферментов у плазмияных

штаммов происходят с той же эффективностью, что и у родительских клеток. г

Полученные данные свидетельствуют в пользу высокой специфичности системы секреции пектатлиаз у Еги1п1а. принадлежащих не только к разным видам, но и подвидам.

В заключительной части работы дан анализ и обобщены результаты выполненных исследований.

ВЫВОДЫ

1. У клеток бактерий Е. atroseptica пектатлиаза представлена минимум пятью изоферментами (Ecal, Еса2, ЕсаЗ. Еса4 и Еса5). синтез которых в различной степени подвержен индукции пектиновыми веществами и катаболитной репрессии- глюкозой. Наиболее индуци-бельными являются изофермекты ЕсаЗ и Еса4. в то время как для фермента Еса5 характерен относительно высокий уровень конститутивного синтеза. Фермент Еса5 в значительно большей степени чувствителен к репрессирующему действию глюкозы.

Кроме того, синтез пектатлиаз Е. atroseptica зависит от фазы роста бактериальной популяции, возрастая к концу логарифмической - началу стационарной фазы.

2. Изолирован мутантный штамм Е. atroseptica 3310, характеризующийся суперпродукцией нескольких зкзоферментов (пектатлиазы. целлюлазы, протеазы) и отсутствием чувствительности их синтеза к катаболитной репрессии глюкозой. Установлено, что увеличение активности пектатлиазы у последнего обусловлено преимущественно изоферментом Еса4. Фенотипическая характеристика бактерий Е. atroseptica 3310 может свидетельствовать о существовании локуса. являющегося специфическим регулятором генов, детерминирующих синтез зкзоферментов. -,

3. Идентичность изоферментного состава периплазматических и внеклеточных пектатлиаз у. бактерий Е. atroseptica дикого типа, а также у мутантов с нарушенной секрецией этого фермента (Out" -мутантов) указывает на отсутствие в периплазме каких-либо "специфических" внутриклеточных пектатлиаз.

Синтезируемая клетками Е.- atroseptica пектатлиеза эффективно секретируется во внешнюю среду в два этапа: 1) синтез фермента в цитоплазме и аккумуляция его в периплаэматическом пространстве:

2) экскреция пектатлиазы из периплазмы во внеклеточную среду.

4. Характер экспрессии пектатлиазных генов бактерий Е. chry-santheml, Е. carotovora и Е. atroseptlca в клетках нового хозяина Е. atroseptica свидетельствует о низкой, эффективности секреции ге-терологичных изоферментов и,тем - самым.о высокой специфичности систем секреции данных ферментов у бактерий Erwlnla. принадлежащих не только к разным видам, но и подвидам. В то же время присутствие в клетках Е. atroseptlca в составе плазмид генов пектат-лиаз бактерий других видов (подвидов) этого ¡se рода не влияет на продукцию и секрецию собственных ферментов, детерминируемых хромосомными генами.

СПИСОК ТРУДОВ. ОПУБЛИКОВАННЫХ.ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернов С, П., Бабицкая Е.В.. Евтушенков А.Н. Динамика процесса мацерации тканей клубней картофеля пектолитическими бактериями //Тез. докл. Всесоюзного совещания "Фитонциды. Бактериальные болезни растений". - Киев - Львов, 1990. - Ч.II. - С. 14.

2. Бабицкая Е.В., Шевчик В.Е., Евтушенков А.Н. Мутанты бактерий Erwlnla atroseptlca 36А с повышенной продукцией пектолити-ческих ферментов //Тез. док|. YI съезда Белорусского отделения ВОГиС. - Горки. 1992. - С. 98

3. Евтушенков А. Н .. Бабицкая Е. В., Шевчик В. Е. Экспрессия чуаеродных генов и секреция пектатлиаз клетками Erwlnla atroseptlca 36А // Тез. докл. YI съезда ВОГиС. - Иинск, 1992. - Ч. I.- С. 94.

4. Production of pectolytlc enzymes from Erwlnla grown on different carbon sources / Shevchlk V.E.. Evtushenkov A.M., Ba-bltskaya E.V.. Foalciiev Yu.K.// World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1992. - Vol.8. - P. 115-120.

5. Продукция пектатлиазы бактериями Erwlnla carotovora var. atroseptlca 36A / Бабицкая E.В., Шевчик В.E., Евтушенков А.Н.. Фомичев Ю. К. //Микробиология. - 1993. - Т. 62. N 4. - С. 12 - 15.

6. Экспрессия pel - генов Erwlnla Chrysanthemi ENA49 в клетках Erwlnla carotovora var. atroseptlca 36A /Бабицкая E.B., Евтушенков А.Н.. Шевчик В.Е.. Келдакова P.A. //Мол. генет., микроби-ол. и вирусол. - 1993. - Н 4. - С. 12 - 15-.

7. Бабицкая Е.В. Экспрессия ptl - генов бактерий Erwlnla са-

гсаочюга в клетках Егч»1п1а а^озерИса //Тез. докл. У1 Конф. Российской федерации "Новые направление биотехнологии". - Пущнно, 1994. - С. 100.

8. Бабицкая Е.В.. Евтушенков А.Н., Шевчик В.Е. Экспрессия генов пектатлиаз Ег«1п1а саго!;оуога эи^эр. саго^уога 17А и Егуг1-п1а сагоЮУога зиЬзр. а^озерИса 36А в клетках Ег*1п1а сэго1оуо-га зиЬэр. а^оэериса 36А //Мол. генет.. микробиол. и вирусол. -1994. - К 6.-С. 23-27.

9. Бабицкая Е.В., Песнякевич'А.Г.. Николайчик Е. А. Характеристика мутантов бактерий Ег«г1п1а саго!;оУога эиЬзр. а(;гозериса 3-2 с нарушенной секрецией пектатлиазы //Прикл. биохим. и микробиол. - 1995. - Т. 31. - N 4. .- С. 447-453.

РЭЗЮМЭ

дысертацыйнай працы Л1ТВ1НАВАЙ Алены Валер' еуны "Прадукция пектаглАазы бактэрыям1 Erwlnla carotovora subsp. atroseptl-са" • .

Ключавыя словы: ф1тапатагенныя бактэры1, прадукцыя, пектат-л1аза, 1заферменты,С1НТЭЗ, сакрэцыя. 1ндукцыя, катабал1тная рэп-рэс1я, мутаць!

Вивучани некаторыя заканамернасц! прадукцы1 (с1нтэзу 1 сак-рэцы1) пектатл1азы Ф1тапатагенным1 бактэрыям1 Erwlnla carotnvora subsp. atroseptica. Выкарыстаны генетычныя, б1ях1м1чния 1 м1кра-б1ялаг!чныя метады даследванняу. Устаноулена, што пектатл!аза прадстаулена некальк1м1 (не ненш за пяць) 1заферментам1. Выяуленн пэуныя заканамернасЩ рэгуляцы1 с1нтэзу 1ндыв1дуальных форм пек-татл1азы: 1ндукцыя пекц1навым1 рэчывам1 1 катабал1тная рэпрэс1я глюкозай. Прадукцыя розных 1заферментау рэгулюецца незалежна ад-з1н ад аднаго. Паказана магчымасць фарм1равання пэуных спектрау 1заферментау пектатл1азы у 1нф1цыраваных расл1нных тканках пад уздзеяннем 1х х1м1чнага складу. Вывучан уплыу некаторых мутаднй на прадукцыю пектатл1азы клетка^1 Е. carotovora subsp. atroseptica. Выяулены некаторыя заканацэрнасц1 сакрэцы1 пектатл1азы клеткам! Е. carotovora subsp. atroseptica. Паказана высокая спецыф1ч-насць с1стэмы сакрэцы1 пектатл1аз у Erwlnla. як1я належаць не тольк1 да розных в1дау, але нават 1 падв1дау.

Атрыманыя у працы вын1к1 пашыраюць звестк1 аб ф!з1ялог11 1 б1ях1м11 фактарау в1рулентнасц1 найважнейшага для Ееларус! пата-гена Е. carotovora subsp. atroseptica. Мутанты з павышанай пра-дукцыяй пектатл1азы могуць знайсц1 выкарыстанне для атрымання вы-сокаэфектыуных ферментных прэпаратау пэунага дзеяння.

РЕЗЮМЕ

диссертационной работы ЛИТВИНОВОЙ Елены Валерьевны "Продукция пектатлиазы бактериями Erwlnla carotovora subsp. atro-septlca"

Ключевые слова: фитопатогенные бактерии, продукция, пектатлиаза, изоферменты, синтез, секреция, индукция, катаболитная репрессия, мутация

Изучены некоторые закономерности продукции (синтеза и секреции) пектатлиазы фитопатогенными бактериями Erwlnla carotovora subsp. atroseptlca. Использованы генетические, биохимические и микробиологический методы исследования. Установлено, что пектатлиаза представлена несколькими (не менее пяти) изоферментами. Выявлены определенные закономерности регуляции синтеза индивидуальных форм пектатлиазы: индукция пектиновыми веществами и катаболитная репрессия глюкозой. Продукция разных изоферментов регулируется независимо друг от друга. Показана возможность формирования определенных спектров изоферментов пектатлиазы в инфицированных растительных тканях под воздействием их химического состава. Изучено влияние некоторых мутаций на продукцию пектатлиазы клетками Е. carotovora subsp. atroseptlca. Выявлены некоторые закономерности секреции пектатлиазы клетками Е. carotovora subsp. atroseptlca. Показана высокая специфичность системы секреции пектатлиаз у Erwlnla, принадлежащих не только к разным видам, но и подвидам.

Полученные в работе результаты расширяют сведения о физиологии и биохимии факторов вирулентности важнейшего для Беларуси патогена Е. carotovora subsp. atroseptlca. Мутанты о повышенной продукцией пектатлиазы могут найти применение для получения высокоэффективных ферментных препаратов определенного действия.

SUMMARY

of doctoral thesis of LITVINOVA Elena Valeryevna "Production of pectatelyase by bacteria Erwlnla carotovora subsp. atro-septlca"

Key words: phytopathogenlc bacteria, production, pectatelyase. Isoenzymes, synthesis, secretion. Induction, catabollte repression. mutation

Some regularities of production (synthesis and secretion) of pectatelyase by phltopatfiogenlc bacteria Erwlnla carotovora subsp. atroseptlca were studied. Genetlcal, biochemical and microbiological techniques were used. It was established that pectatelyase Is represented by several (not less than five) Isoenzymes. The certain conformities of regulation of individual pectatelyase Isoenzymes synthesis were revealed: Induction by pectlc substances and catabollte repression by glucose. Production of each of these isoenzymes Is regulated Independently. The possibility of formation of certain spectra of pectatelyase Isoenzymes In infected plant tissues is affected by their chemical composition was shown. An Influence pf some mutations on production of pectatelyase by E. carotovora $ubsp. atroseptlca cells was Investigated. Some regularities of pectatelyase secretion by E. carotovora subsp. atroceptlca cells were revealed. The high specificity of pectlnases secretory systems of Erwlnla belonging to different species and subspecies was demonstrated.

The obtained results extand information about physiology and biochemistry of virulence factors of E. carotovora subsp. atroseptlca, one of the most important phytopathogene for Belarus. The mutants with higher pectatelyase production can be used for obtaining of effective enzymatic preparates.