Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения

Бурунова, Вероника Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения"

На правах рукописи

Буруноза Вероника Вячеславовна

Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

2 7 ЯпЗ 2211

Москва, 2011

4843492

Работа выполнена в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии учреждения российской академии медицинских наук «НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН».

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, д.б.н., профессор

Официальные оппоненты:

Константин Никитич Ярыгин

Гл.н.с. лаб. медицинской биотехнологии ИБМХ РАМН, доктор биологических наук

Абакумова Ольга Юрьевна

Зав. каф. биологии МБФ РГМУ,

Антохин Александр Иванович

профессор, доктор биологических наук

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « » февраля 2011 года, в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.08 при ГОУ ВПО

«Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО

«Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «

п » декабря 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Саврова Ольга Борисовна

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

Выделение и культивирование клеток мезенхимального происхождения из постнатальных органов и тканей человека является основой для получения клеточных материалов (КМ), используемых в регенеративной медицине для терапии патологий различного генеза: заболеваний опорно-двигательного аппарата [Bruder S.P., 1994; Kassem M., 2004], неврологических заболеваний [Скворцова В.И., 2008,2009; Dezawa M., 2005], повреждений сердца [Miyahara Y., 2006; Tang J., 2006; Zhang D., 2007], сердечно-сосудистых заболеваний [Miranville A., 2004; Nakagami H., 2006], заболеваний печени и заболеваний кожи [УрываеваИ.В., 2009; Chien С.С., 2006]. Кроме того, иммуномодулирующие свойства клеток мезенхимального происхождения могут быть использованы, например, при аутоиммунных заболеваниях [Aggarwal S., 2005; Di Nicola M., 2002] и для иммунокоррекции в трансплантологии [Beyth S., 2005; Quirici N., 2002].

В настоящее время, в Российской Федерации проводятся разработки по созданию нормативно-правовой базы для регулирования медицинского применения КМ, а также единых стандартов их производства. Создание соответствующих законов нуждается в экспериментальном и теоретическом анализе проблем стандартизации при производстве КМ и в обобщении опыта, накопленного отечественными специалистами в области клеточных технологий (KT).

Принятию нормативных актов, регламентирующих медицинское применение KT, должно предшествовать появление унифицированного понятийного аппарата, лабораторных регламентов получения первичных клеточных культур и обеспечения их биологической безопасности и единых подходов к документированию продуктов и технологических схем.

Таким образом, исследования в области стандартизации производства и контроля качества КМ обладают несомненной научно-практической актуальностью.

1.2. Цель работы.

Разработка принципов стандартизации КМ из первичных клеточных культур мезенхимального происхождения на основе теоретического и экспериментального исследования всех этапов технологической цепочки их получения и контроля качества.

1.3. Задачи исследования:

1. Изучить закономерности изменения морфологии первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в зависимости от типа биоптата и длительности пассирования in vitro как основы визуального контроля качества клеточной культуры.

2. Разработать принципы верификации мезенхимальной природы первичных клеточных культур, полученных из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека по цитофенотипу, адгезивности к пластику и способности дифференцироваться по трём мезенхимальным направлениям (в кость, хрящ и жир).

3. Разработать метод оценки качества первичных клеточных культур по уровню метаболической активности с помощью МТТ-теста.

4. Проанализировать стабильность кариотипа клеток первичных культур мезенхимального происхождения в процессе пассирования.

5. Разработать лабораторный стандарт для различных этапов технологической схемы подготовки клеточных материалов на основе клеточных культур мезенхимального происхождения: получения, культивирования, криоконсервации, паспортизации и транспортировки.

1.4. Научная новизна работы.

Впервые были изучены особенности выделения мезенхимальных клеток из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека с учетом их использования для производства КМ. Были сопоставлены данные, полученные при выделении клеток из различных участков биопсийного материала, а также изучены причины гетерогенности, связанные с его особенностями. Предложены новые подходы к визуальной оценке КМ.

Предложена модификация методики кариотипирования клеток в составе монослойных культур с низкой митотической активностью без их перевода в суспензию, что позволяет осуществлять рутинное кариотипирование культур клеток мезенхимального происхождения в процессе производства КМ. Показано, что в рамках использованных технологических схем кариотип клеток остаётся неизменным на протяжении, по крайней мере, первых десяти пассажей в первичных культурах клеток мезенхимального происхождения из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека.

Впервые установлено, что оптический сигнал в МТТ-методе прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток мезенхимального происхождения, что позволяет использовать этот метод для экспресс-анализа жизнеспособности клеточных культур. Показано, что уровень дегидрогеназной активности в первичной культуре клеток мезенхимального происхождения возрастает на протяжении первых V-VII пассажей, после чего постепенно снижается.

Впервые изучена динамика жизнеспособности первичных клеточных культур в различных транспортировочных средах и условиях транспортировки. Получены данные выживания клеток первичных культур мезенхимального происхождения различных пассажей после долговременной криоконсервации в жидком азоте (-196 °С). Предложены образцы паспортов КМ, документирующих результаты контроля их состава, качества и безопасности.

1.5. Практическая значимость работы.

Разработан и внедрён лабораторный стандарт производства КМ на основе первичных культур клеток мезенхимального происхождения из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека, интегрирующий в единую технологическую схему все этапы получения и контроля качества клеточных культур: взятие биопсийного материала и выделение из него клеточной культуры; пассирование клеток in vitro; контроль жизнеспособности клеточных культур; контроль качества клеточных культур (включая уровень дегидрогеназной активности и стабильность кариотипа на различных пассажах); скрининг на наличие инфекционных агентов; долговременная криоконсервация клеток; наращивание необходимого количества клеток.

1.6. Внедрение в практику.

Разработанный лабораторный стандарт производства и контроля качества КМ успешно внедрён в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ

общей патологии и патофизиологии (ОПП) РАМН, в процессе выполнения исследований по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы», совместному научному проекту кафедры неврологии с курсом нейрохирургии медико-биологического ф-та Российского государственного медицинского университета, кафедры биологии педиатрического ф-та Российского государственного медицинского университета и лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН «Исследование эффектов трансплантации мезенхимальных клеток на окклюзионной модели ишемического инсульта у крыс».

С использованием разработанного лабораторного стандарта проведено изучение первичных культур мезенхимальных клеток из плаценты человека и подготовлена документация, на основании которого Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития выдала Разрешение ФС№ 2010/383 от 26.10.2010 на применение новой медицинской технологии «Получение, культивирование, хранение и транспортировка мезенхимальных клеток плаценты человека». Материалы диссертационной работы использовались в учебном процессе кафедры биологии РГМУ и ФГОУ «Всероссийский учебно-научно-методический Центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

1.7. Апробация диссертационной работы.

Результаты исследования докладывались и обсуждались специалистами в ходе проведения Всероссийской научно-практической конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, Россия; 17-18 ноября 2005 г.); V Международного Конгресса KiKosmetikExpo (Москва, Россия; 811 февраля 2006 г.); Конференции РГМУ (Москва, Россия; 24-25 мая 2006 г.); Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, Россия; 17-19 октября 2006 г.); Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, Россия; 1617 марта 2007 г.); Конференции РГМУ «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, Россия; 30-31 мая 2007 г.); 9-го международного семинара по магнитному резонансу (Ростов-на-Дону, Россия; 1520 сентября 2008 г.); 6-th World Stroke Congress (Vienna, Austria; 24-27 September 2008); IV Всероссийского съезда трансплантологов (Москва, Россия; 9-10 ноября 2008 г.); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, Россия; 8-10 декабря 2008 г.); Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe Conference (Edinburgh, England; 23-25 September 2009); XVI съезда педиатров России (Москва, Россия; 16-19 февраля 2009 г.); Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (Пятигорск, Россия; 20-21 мая 2010 г.); Материалы IV Всероссийского

Симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, Россия; 21-22 апреля 2010 г.).

1.8. Научные публикации по теме диссертации.

Результаты диссертационной работы отражены в 37 научных публикациях: в 15 статьях (в том числе, опубликованных в рецензируемых научных изданиях из списка ВАК - 12); в 22 тезисах научных конференций (15 - российских; 5 -международных, проводимых в России; 2 - международных, проводимых за рубежом).

1.9. Структура диссертационной работы.

Рукопись включает 213 с. машинописного текста, 91 рисунок, 20 таблиц и состоит из трёх основных частей: «Обзор литературы по теме диссертационной работы» (63 е., 18 рисунков, 1 таблица), «Материалы и методы исследований» (12 е., 5 рисунков), «Результаты и обсуждение» (104 с., 68 рисунков, 19 таблиц). Список использованной научной литературы включает 297 наименований.

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Выделение мезенхимальных клеток из кожи человека проводили из участка кожи взрослых доноров, который измельчали и инкубировали 2 ч при 37 °С в 0.1% растворе коллагеназы 1-го типа; полученную суспензию осаждали центрифугированием, и осадок ресуспендировали в ростовой среде, после чего содержимое переносили в чашки Петри и культивировали до достижения монослоем 80 %-ой конфлюэнтности. Затем клетки переносили в культуральные флаконы с площадью дна 25 см2, а при последующих пассажах - 75 см2.

2.2. Выделение кератиноцитов из кожи человека проводили из участка кожи взрослых доноров, который измельчали и инкубировали в смеси 0.1 % диспазы и 0.1 % коллагеназы I типа в течение 18 ч при + 4 °С. С помощью тонкого пинцета кусочки кожи разделяли на дерму и эпидермис. Эпидермис дополнительно обрабатывали 0.25 % трипсином 20 мин при 37 °С. После блокирования действия трипсина путём смены среды на 10 % FBS в DMEM-F12 и инкубации 15 мин при + 37 °С, обработанный эпидермис пропускали через стерильный нейлоновый фильтр. Фильтрат центрифугировали при 300 g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в полной ростовой среде для кератиноцитов (Defined K-SFM) с добавлением 10 % FBS и высевали из 200-300 тыс. кл/мл в 75 см2-ые культуральные флаконы с коллагеновым покрытием.

2.3. Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга человека осуществляли путём разделения аспирата костного мозга взрослых доноров в градиенте фиколл-урографина. Полученные клетки рассевали в концентрации 104 кл/мл в ростовой среде в культуральные флаконы с площадью дна 75 см2 и культивировали до достижения монослоем 80 %-ой конфлюэнтности со сменой ростовой среды каждые 3 дня.

2.4. Выделение мезенхимальных клеток из плаценты и пуповины человека проводили из ткани плаценты и пуповины человека после нормальных родов на 39-40 неделе гестации. Фрагменты плаценты или пуповины промывали раствором Хенкса и после непродолжительного мягкого механического воздействия инкубировали с 0.1 % раствором коллагеназы 1-го типа в течение 30 мин при 37 °С.

Полученную клеточную суспензию центрифугировали, осадок ресуспендировали в ростовой среде, после чего содержимое переносили в культуральные флаконы с площадью дна 75 см2 и культивировали до достижения монослоем 80 %-ой конфлюэнтности, после чего клетки переносили в культуральные флаконы.

2.5. Пассирование клеток осуществляли по стандартной методике в культуральных флаконах в С02-инкубаторе (37° С, 5 % С02, 80 % влажности). Состав ростовой среды: DMEM-F12; 10 % фетальная телячья сыворотка; 100 Ед./мл пенициллина; 100 Ед./мл стрептомицина; 2 мМ глютамина; 1 мМ пирувата натрия; 10 нг/мл (3-FGF. Смену среды осуществляли 2 раза в неделю. При достижении монослоем 80 %-ой конфлюэнтности, клетки переводили в суспензию с использованием раствора 0.25 % трипсина с версеном (1:1) и рассевали в соотношении 1 :3. Долговременная криоконсервация клеток осуществлялась в сосудах Дьюара с жидким азотом. Для замораживания использовали криопробирки и замораживатель MrFroster. Состав криоконсервационной среды: фетальная телячья сыворотка с 10 % ДМСО. Размораживание образцов клеточных культур проводили на водяной бане (37 °С).

2.6. Остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировка МСК человека проводилась в экспоненциальной фазе роста клеточной культуры с конфлюэнтностью 60-80 %, прошедшей визуальный контроль качества. Клетки снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина / версена (1 : 1) и определяли концентрацию клеточной суспензии с помощью камеры Горяева по стандартной методике. Клетки рассевали в 24-хлуночные культуральные планшеты с покровными стёклами на дне лунок из начальной концентрации 105 кл / лунку и культивировали на протяжение 3 недель с заменой среды каждые 3 сут. по стандартной методике в дифференцировочной среде: DMEM-F12, 0.1 мкМ дексаметазона, 0.05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерофосфата кальция для остеогенной дифференцировки, DMEM-F12, 0.1 мкМ дексаметазона, 0.05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл TGF-p для хондрогенной дифференцировки и DMEM-F12, 10% FBS, 1 мкМ дексаметазона, 0.5 мкМ 1ВМХ, 100 мкМ индометацина, 10 мкг/мл инсулина в случае адипогенной дифференцировки.

В случае хондрогенной дифференцировки МСК человека в микромассе, клеточную культуру в экспоненциальной фазе роста с конфлюэнтностью 60-80 % снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина / версена (1 : 1), после чего 5 млн. клеток с помощью мягкого центрифугирования (300 g) осаждали на дно 15 мл пробирки с коническим дном и культивировали далее в таком виде в среде DMEM без сыворотки, содержащей 100Ед./мл пенициллина, 100 Ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 нг/мл TGF-р в течение 3 недель. Через 21 сут. культивирования из полученных микромасс готовили срезы на криотоме для окрашивания коллагена толуидиновым синим с целью подтверждения хондрогенной дифференцировки.

Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 с установленной на нём цифровой камерой при помощи программного пакета AxioVision. Исследования иммуноцитохимических образцов осуществляли при помощи флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 200М, снабженного цифровой камерой и компьютерной программной средой AxioVision АС 4.1.

2.7. Окраска исключающим витальным красителем трипановым синим

(Trypan Blue) применялась для определения жизнеспособности клеточной культуры: мёртвые клетки окрашиваются в синий цвет и хорошо различимы в световой микроскоп.

2.8. Определение дегидрогеназной активности с помощью колориметрического МТТ-теста применялась для определения жизнеспособности клеточных культур. Клетки пересевали на 96-ти луночный планшет: в 8 лунок - по 5 ООО клеток, в другие 8 лунок - по 2 500 клеток, в другие 8 лунок - по 1 250 клеток. Через 6 ч, когда клетки полностью адсорбировались на пластике, из лунок удаляли среду и вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды без фетальной телячьей сыворотки и по 10 мкл раствора бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) 10 мг/мл в PBS.

После инкубации 1 ч при 37 °С в атмосфере 7.5 % С02. После инкубации из лунок культурального планшета осторожно удаляли среду (следя за тем, чтобы не захватить клетки) и вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для экстракции внутриклеточного МТТ-формазана. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 540 нм против 100 мкл ДМСО.

2.9. Индикация фосфата кальция методом окрашивания по Ван Коссу использовалась для подтверждения остеогенной дифференцировки МСК. Клеточную культуру, выращенную на покровных стёклах, троекратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем фиксированные клетки двукратно отмывали PBS и окрашивали 1-2% раствором нитрата серебра в течение 45-60 мин под ультрафиолетовым светом. Затем клетки промывали дистиллированной водой и фиксировали окраску 2.5-3.0% тиосульфатом натрия в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого клетки снова промывали дистиллированной водой. Отложения фосфата кальция окрашиваются в чёрный цвет.

2.10. Индикация коллагена методом окрашивания толуидиновым синим (Toluidine Blue О) позволяла подтвердить хондрогенную дифференцировку МСК по экспрессии коллагена - фибриллярного белка, составляющего основу хрящевой ткани. На криотоме готовили срезы клеточной культуры, выращенной методом микромасс. Полученные срезы окрашивали 1 % раствором толуидинового синего в 50 % изопропаноле. Коллаген окрашивается в синий цвет.

2.11. Индикация липидов методом окраски масляным красным (Oil Red О) использовалась для подтверждения адипогенной дифференцировки МСК, в результате которой последние накапливают жировые вакуоли. Культуру МСК, выращенную на покровных стёклах, троекратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки ещё дважды отмывали PBS. Окрашивание 0.3 % раствором масляного красного в 60 % изопропаноле проводили в течение 10 мин. Жировые вакуоли окрашиваются в красный цвет.

2.12. Получение препаратов для цитогенетического анализа. Клетки выращивали в культуральных флаконах (площадь 75 см2) в среде, содержащей 90 % DMEM, 10 % FBS и 2 мМ L-глютамин, до 80 % конфлюэнтности, после чего клетки промывали PBS и добавляли 2 мл подогретой до 37 °С смеси 0.25 % трипсина. Инкубировали 2-3 мин при 37 °С в С02-инкубаторе, при этом от пластика

откреплялись клетки преимущественно на стадии митоза, тогда как остальные клетки оставались прикрепленными. Затем суспензию переносили в пробирку и центрифугировали 5 мин при 150 g, и комнатной температуре на центрифуге. Супернатант удаляли, оставляя 300 мкл, и ресуспендировали осадок в этом остатке раствора, после чего добавляли суспензию клеток к 5 мл 0.075 KCl и инкубировали 20-40 мин. Затем клетки снова центрифугировали, осторожно ресуспендировали пипеткой осадок к 300 мкл раствора. По каплям добавляли 1 мл фиксатора (смесь этанола и уксусной кислоты 3 :1), а затем доливали ещё 4 мл фиксатора и оставляли на 15 мин. Фиксатор меняли три раза. После этого наносили каплю суспензии на стекла, которые предварительно охлаждали. После нанесения суспензии стёкла вносили в огонь, затем насыщали водяным паром и подсушивали. Окрашивание препаратов проводили раствором DAPI с добавлением заключающей среды для замедления выгорания препарата.

2.13. Анализ хромосомного состава клеток проводили путём цифровой обработки фотоизображений. Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 с установленной на нём цифровой камерой при помощи программного пакета AxioVision. Фотосъемку полученных цитогенетических микропрепаратов проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus ВХ61 с установленной на нем цифровой камерой при помощи программного пакета RSI Image. Дальнейшую обработку полученных цифровых фотографий проводили в программе Adobe Photoshop.

2.14. Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и внутриклеточных маркёров проводилась в культуре МСК, выращенной на покровных стёклах, которые троекратно промывали PBS и фиксировали клетки 4 %-ым раствором параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки отмывали PBS и пермеабилизировали с помощью PBS, содержащего 1 % Triton Х100, в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего отмывали PBS. Неспецифическое связывание моноклональных антител (МАТ) с подложкой блокировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0.5 % БСА, 2 % нормальную сыворотку крови козы, 0.05 % Tween-20, 0.01 % мертиолат. Разведение МАТ против поверхностных клеточных маркёров (первичных антител) - виментина, нестина, CD 34, CD 44 (Pgpl), CD 54 (ICAM-1), CD90(Thy-l), CD 105 (эндоглин), CD 106 (VCAM-1), HLA-ABC и HLA-DR - и вторичных (антивидовых) MAT готовили на этом же буфере. Затем клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 90 мин, отмывали PBS с добавлением 0.5 % БСА и 0.05 % Tween-20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин и также отмывали PBS с добавлением 0.5 % БСА и 0.05 % Tween-20. Ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для протектирования флуоресценции. В качестве вторичных антител применялись антивидовые антитела, меченные флуоресцентными красителями - родамином и флуоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC - fluorescein isothyocyanate).

2.15. Иммуноцитохимическая детекция маркёров клеточной дифференцировки проводилась для подтверждения остеогенной (остеонектина) и хондрогенной (хондроитина и коллагена I и II типов) дифференцировки МСК. После

дифференцировки МСК, покровные стекла с растущими на них клетками промывали PBS (рН 7.4) с 0.02 % Tween-20 и фиксировали охлаждённым 70 % этанолом в течение 20 мин при температуре + 4 °С. Фиксированные клетки троекратно промывали PBS (рН 7.4) и помещали на 30 мин в 2 % раствор FBS в PBS (рН 7.4) (для блокировки неспецифической сорбции антител). МАТ против остеонектина, хондроитина или коллагена I или II типов (первичные антитела) добавляли в рабочей концентрации согласно рекомендациям производителя в PBS (рН 7.4) с 2 %-ой FBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Покровные стекла с клетками троекратно промывали PBS (рН 7.4) с 0.02 % Tween-20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин и также отмывали PBS с 0.5 % БСА и 0.05 % Tween-20. Ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для защиты от выгорания флуоресценции. В качестве вторичных антител применяли антивидовые антитела, меченные флуоресцентными красителями - родамином и FITC.

2.16. Проточная цитофлуориметрия применялась для исследования экспрессии клетками поверхностных белков. Монослойную клеточную культуру переводили в суспензию с помощью версена. Окрашивание клеток проводили МАТ, меченными FITC, в PBS, содержащем 1 % FBS, с последующей фиксацией 2 % раствором параформальдегида. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Epics XL и программного пакета WinMDI 2.7.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Оптимизация технологии получения клеточных материалов мезенхимального происхождения.

Особенности выделения ФБТ кожи человека связаны со слоистым расположением кожных тканей и начинают играть роль уже на этапе взятия биопсии (небольшого кожного лоскута 2x2 мм) у пациента. Оптимальное взятие кожного лоскута заключается в максимальном захвате дермального слоя кожи.

При слишком поверхностном взятии кожного лоскута в клеточной культуре возрастает доля клеток немезенхимального происхождения. Так, при поверхностном взятии кожного лоскута и использовании полной ростовой среды для кератиноцитов, уже на 1-ые сутки культивирования в культуральных флаконах с коллагеновым покрытием появлялись локусы роста кератиноцитов. В том случае, когда использовалась обычная ростовая среда, после перенесения изолированных клеток в чашку Петри кератиноцитоподобные клетки формировали небольшие очаги роста в окружении ФБТ и удалялись после первого пересева. Чем меньше доля дермального слоя в биопсийном материале, тем меньше доля ФБТ после первичной изоляции и выше доля кератиноцитоподобных клеток. Поэтому поверхностное взятие кожного лоскута может привести к значительному увеличению времени накопления необходимого количества ФБТ для КМ.

Препятствием для осуществления глубоких срезов при биопсии кожи являются, главным образом, болевые ощущения у пациентов. Было проведено изучение влияния обезболивающего препарата лидокаина на последующий рост ФБТ в культуре in vitro, и во всех экспериментах не было обнаружено статистически значимых различий между скоростью роста ФБТ, полученных из кожного лоскута,

взятого с лидокаином, по сравнению с кожным лоскутом от того же пациента, взятым без лидокаина.

Особенности выделения МСК из костного мозга человека определяются трудностью доступа к этой ткани организма. Анатомические и функциональные особенности капиллярной сети костного мозга приводят к появлению практически неустранимой и существенной примеси крови в биопсийном материале, и при поступлении в лабораторию образец внешне не отличается от образца периферической крови такого же объёма, а примесь крови составляет величину, в среднем, свыше 50 %, а при неудачном взятии - приближаться к 100 %. Вместе с тем, примесь крови снижает лишь начальную посевную концентрацию МСК из костного мозга, поскольку эритроциты и лейкоциты не прикрепляются на пластик и легко удаляются сменой среды.

Особенности выделения МСК из плаценты человека заключаются в анатомическом строении этого органа. По нашим наблюдениям, в монослое из клеток амниона 80 % составляют эпителиоподобные клетки, которые мешают прикреплению и росту нужных МСК. Оптимальным является взятие кусочка хориона с амнионом вокруг «корня» пуповины, что позволяет доставлять их в одном транспортировочном контейнере.

Особенности выделения МСК из пуповины человека связаны с её вытянутостью и различным содержанием МСК на различном расстоянии от корня (под «корнем» понимают участок пуповины, переходящий в плаценту). Для изучения этой зависимости было исследовано количество МСК, выращенных за 9 сут. в 75 см2-ых культуральных флаконах из срезов пуповины толщиной 1 см, сделанных перпендикулярно продольной оси на различных расстояниях от корня (рис. 1): наиболее богатый МСК участок - это «корень» пуповины. Начиная с 10 см от «корня», снижение количества выделенных МСК статистически достоверно. Это позволяет рекомендовать доставлять в лабораторию лишь короткий (5-10 см) фрагмент пуповины.

3.2. Изучение особенностей морфологии клеток мезенхимального происхождения в процессе культивирования in vitro.

Морфологическая гетерогенность вследствие наличия исходной примеси клеток других тканей возникает вследствие особенностей взятия и пробоподготовки различных типов биопсии для получения первичных культур мезенхимальных клеток: ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины. При обработке образцов кожи взрослых людей коллагеназой I типа из неё выделялись несколько морфологически различающихся типов клеток, среди которых преобладали ФБТ кожи (рис. 2) и присутствовали округлые клетки (рис. 3) (предположительно, -кератиноциты), формирующие «островки роста». После первого пересева клеточные

V h 1 1S

0 | 10 J го 30 40 50 во 70 во 5 1S ш л

Рисунок 1. Зависимость числа клеток (14) через 9 сут. из фрагментов пуповины человека толщиной 1 см, вырезанных перпендикулярно оси на различных расстояниях от корня (с1; в см). Усреднённые данные для девяти образцов.

Рисунок 2. Локус роста Рисунок 3. Локусы

культуры содержали только ФБТ кожи, так как кератиноциты требуют особых условий культивирования.

Основная сложность

выделения МСК из костного мозга связаны с наличием в нём нескольких популяций клеток, способных прикрепляться на культуральный пластик. Поэтому вплоть до III пассажа первичные культуры клеток из костного мозга обладали значительной морфологической гетерогенностью. Преобладали два типа клеток: округлые клетки, создающие колонии и интенсивно делящиеся в течение первых 7-Юсут. культивирования in vitro (предположительно, -

предшественники эндотелиоцитов), и ФБТ-подобные клетки. Ко II пассажу культура выглядит полностью гомогенной и содержит ФБТ-подобные клетки.

При получении первичных культур МСК из плаценты и пуповины, как и в первичных культурах МСК из костного мозга, наблюдался высокий уровень морфологической гетерогенности клеток: наряду с ФБТ-подобными клетками имелись прикрепившиеся к культуральному пластику клетки крови (предположительно, моноцитарно-макрофагального ряда - рис. 4) и округлые клетки (рис. 5).

ФБТ кожи человека (0-ой пассаж, 8 сут. культивирования) с 50 %

конфлюэнтностью; видны остатки дермы и многочисленные митозы.

Увеличение 100.

роста кератиноцитов в первичной культуре ФБТ кожи человека (О пассаж, 2 сут.

культивирования); по всему полю зрения разбросаны эритроциты. Увеличение 200.

Рисунок 4. Первичная культура (0 пассаж, 5 сут. культивирования) МСК из плаценты (А) и пуповины (Б) человека, обладающая морфологической гетерогенностью (увеличение 100): 1. распластанные мезенхимальные клетки, переживающие адаптационный период; 2. клетки! крови, обладающие способностью прикрепляться на культуральный пластик; 3. эритроциты.

По нашим наблюдениям (33 образца плаценты, 37 образцов пуповины) уровень морфологической гетерогенности первичных культур МСК из плаценты |

всегда заметно выше, чем из пуповины. На I—II пассажах округлые клетки

Рисунок 5. Первичная культура (0 пассаж, 7 сут. культивирования) МСК из плаценты (А) и пуповины (Б) человека:

А - локус роста округлых эпителиоподобных клеток. Увеличение 200. ( Б - смесь округлых и веретенообразных клеток. Увеличение 100.

1. остаток ткани амниона; 2. ФБТ-подобные клетки; 3. округлые, предположительно, эндотелиальные клетки.

В период адаптации на нулевом пассаже ФБТ-подобные клетки из плаценты (рис. 6.А) и пуповины (рис. б.Б) были морфологически подобны друг другу и характеризовались распластанной формой с примерно одинаковыми размерами в продольном и поперечном направлениях. При этом, их распластанная форма заметно отличалась от веретенообразных ФБТ кожи (рис. 2) и ФБТ-подобных клеток из костного мозга. По мере приближения конфлюэнтности в процессе роста клеточной культуры к 100%, в интервале значений конфлюэнтности 85-100 % независимо от номера пассажа во всех случаях наблюдалось заметное снижение митотической активности первичных клеточных культур МСК всех типов. Вплоть до 80 %-ой конфлюэнтности контактное торможение роста первичных клеточных ' культур не наблюдалось. Это, в частности, обосновывает пересев и использование | для производства КМ клеточных культур не позже достижения ими 80 %-ой конфлюэнтности. Эффект контактного торможения роста первичных клеточных культур МСК носил локальный характер и проявлялся не только при нарастании гомогенного клеточного монослоя в культуральном флаконе на первом и последующих пассажах, но и в отдельных локусах роста на 0 пассаже (рис. 7).

Ещё одним источником морфологической гетерогенности первичных ! клеточных культур мезенхимального происхождения являлась различная степень зрелости клеток. Наиболее выраженной морфологическая гетерогенность такого типа была у первичных культур МСК из плаценты и пуповины; менее выраженной -у первичных культур из костного мозга; наконец, морфологическая гетерогенность по степени зрелости практически отсутствовала в культурах ФБТ кожи, где имел место высокий уровень гомогенности всей популяции.

Рисунок 6. Первичная культура (0 пассаж, 7 сут. культивирования) МСК из плаценты (А) и пуповины (Б) человека. Увеличение 100.: распластанные клетки в период адаптации; по

Рисунок 7. Локус роста первичной клеточной культуры со 100%-ой конфлюэнтностью в отсутствие митозов. Увеличение 100: А-ФБТ кожи человека (0 пассаж, 12 сут. культивирования); в центре - остатки дермы с кусочками волоса; Б - МСК из пуповины (0 пассаж, 9 сут. культивирования); в центре - остатки Варганова студня.

На рис. 8 показано постепенное увеличение доли мелких, митотически активных ФБТ-подобных клеток в процессе культивирования. Процесс снят на I одном и том же участке культурального флакона (с этой целью на дно культурального флакона наносилась метка, которая служила ориентиром при фотографировании).

После II пассажа первичные культуры МСК из всех источников становились морфологически гомогенными и содержали, в основном, небольшие митотически активные веретенообразные клетки. Их метаболическая активность была максимальна (период удвоения культуры - около 1 сут.) (рис. 9). Затем в культуре клеток происходил обратный процесс: после нескольких пересевов, приблизительно к У-У1 пассажу, клетки постепенно теряли свою митотическую активность, в культуре снова появлялись распластанные крупные клетки (рис. 6) и рост клеточной популяции практически останавливался. Кроме того, клетки в состарившейся I культуре уже не подвержены дифференцировке: при помещении их в специальные дифференцировочные среды они не способны к дифференцировке ни по одному из

направлений, характерных для МСК: остеогенному, хондрогенному или

3 сут. * 4сУЧ,- f % 6 сут.;

. ш ; 9ЩЩ||ЩЗдрШЯ|И! 7 суг. . ' ..... ' ' А,.;".

Рисунок 8. Формирование монослоя первичной культурой МСК из пуповины человека (О пассаж, 3-10 суг. культивирования). Увеличение 100. Съемка проводилась на одном и том же участке культурального флакона при одинаковом увеличении каждый день. Смена среды проводилась каждые 3 сут..

Осуществляя визуальный контроль, зная характерные морфологические признаки культуры с низкой митотической активностью, отбраковывая состарившиеся культуры клеток, можно использовать для производства КМ только митотически активные гаетеи^^ысоюн^'мвнемггом^^^щии и метаболизма

Рисунок 9. Формирование монослоя первичной культурой МСК из пуповины человека (II пассаж). Увеличение 100. Съемка проводилась на одном и том же участке культурального флакона при одинаковом увеличении. Смена среды проводилась каждые 3 сут..

3.3. Подтверждение мезенхимальной природы выделенных клеток.

Первичные клеточные культуры, полученные из всех источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека), были отрицательными по экспрессии поверхностных белков-маркёров гемопоэтических стволовых клеток: CD 34 и HLA-DR, которые не экспрессируются на поверхности МСК человека [Dominici М., 2006]. Вместе с тем, была обнаружена экспрессия молекул клеточной адгезии: CD 44 (рис. 10.А), CD 54, CD 90, CD 105 и CD 106, играющих важную роль в процессе миграции и хоуминга, что характерно для клеток мезенхимального ряда [Goodwin H.S., 2001; Gronthos S., 2001].

Самый высокий уровень экспрессии HLA-ABC наблюдали в культуре ФБТ кожи, средний - МСК из костного мозга, низкий - МСК из плаценты и пуповины (рис. 10.Б). При этом, первичные культуры МСК из плаценты и пуповины были неоднородны: в них встречались мелкие клетки со средним уровнем экспрессии HLA-ABC, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на

фоновом уровне. Это подтверждалось и данными проточной цитофлуориметрии. Основная масса клеток плаценты и пуповины приходилась на средний или низкий уровень экспрессии НЬА-АВС.

Ол; 68ДД СУ: 8.71

И12-132314665 (56.3 %)

ЩА-АВС

он 5ееэ

ОЛ ? 95

1*12-1023) 1243 (146»

Рисунок 10. Экспрессия МСК из плаценты человека: А - СБ 44; Б - НЬА-АВС. Слева: красная флуоресценция - СБ 44; синяя флуоресценция - ядра, окрашенные ЭАР1 (увеличение 630). Справа: гистограмма распределения интенсивности флуоресцеции; изотипический контроль обозначен чёрным, НЬА-АВС -ассоциированная флуоресценция - красным цветом.

Клетки всех первичных культур клеток мезенхимального происхождения экспрессировали виментин - белок цитоплазматического скелета. ФБТ кожи и МСК из костного мозга не экспрессировали, а МСК из плаценты и пуповины, напротив, экспрессировали нестин - маркёр незрелых и прогениторных клеток (рис. 11).

Таким образом, было показано, что фенотипы первичных клеточных культур мезенхимального происхождения, полученных из различных источников (кожи, костного мозга, плаценты и пуповины) следует учитывать при выборе КМ для медицинского использования. В частности, высокий уровень экспрессии НЬА-АВС и высокий уровень экспрессии белков, характерных для дифференцированных клеток, делает ФБТ кожи непригодными для аллогенных трансплантаций. МСК из костного мозга также экспрессируют НЬА-АВС на высоком уровне, что тоже делает их пригодными только для аутологичных трансплантаций, однако большое количество белков-маркёров, характерных для стволовых и прогениторных клеток, а также отсутствие белков, характерных для дифференцированных клеток, делает их терапевтически значимыми при подборе трансплантируемого клеточного материала. МСК из плаценты и пуповины экспрессировали маркёры МСК при низком уровне экспрессии МНС I класса, что делает их пригодными для использования в качестве донорского КМ при трансплантациях.

Способность клеток дифференцироваться в остеобласты оценивали по уровню экспрессии белков, специфических для костной ткани: остеонектина, эндогенной щелочной фосфатазы, а также по способности клеток накапливать фосфат кальция.

Рисунок 11. Экспрессия нестина МСК из плаценты человека: красная флуоресценция - нестин; синяя флуоресценция - ядра, окрашенные БАР1.

Показано, что МСК из костного 'мозга, плаценты и пуповины имеют изначально высокий уровень экспрессии рстеонектина, в отличие от ФБТ кожи, которые в обычных условиях не синтезируют этот белок. В течение 3 недель в условиях дифференцировки в костную ткань в клетках всех полученных культур, кроме клеток ФБТ кожи, уровень экспрессии остеонектина повышался (рис. 12).

Первичные культуры всех ¡клеточных культур мезенхимального

Рисунок 12. Окрашивание первичных клеточных культур МСК из плаценты человека на остеонектин (красная флуоресценция - с использованием родамин-меченных антител), ядра окрашены ЭАР1 (синяя флуоресценция): 1 сут. (А) и 21 сут. (Б) культивирования. Увеличение 630.

рроисхождения имели невысокий уровень

рстивности эндогенной щелочной фосфатазы на начальном этапе, и при дальнейшем Культивировании в условиях дифференцировки в остеобласты уровень активности [эндогенной щелочной фосфатазы возрастал (рис. 13). Однако щелочная фосфатаза 'обнаруживалась лишь в отдельных ФБТ кожи. В первичной культуре МСК из ¡пуповины человека, клетки, обладавшие повышенным уровнем активности эндогенной щелочной фосфатазы, формировали отдельные, довольно редкие, 1локусы. Только в первичной культуре МСК из костного мозга и плаценты '(рис. 13.Б) человека уровень активности эндогенной щелочной фосфатазы 'значительно возрастал практически во всех клетках.

I стандартные ус ловия ■ условия дифференцировки

2 3 4

время дифференцировки, недет

Рисунок 13. Остеогенная дифференцировка МСК из плаценты человека (увеличение 630): - окрашивание по Ван Коссу: тёмно-коричневые включения - связанные формы кальция; усиление активности щелочной фосфатазы в условиях остеогенной дифференцировки.

Для определения накоплений фосфата кальция в ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины в условиях дифференцировки в остеобласты проводили гистохимическое окрашивание клеток полученных культур по методу Ван Косса. На 'начальном этапе дифференцировки фосфат кальция в клетках не обнаруживался. При дальнейшем культивировании в условиях дифференцировки в остеобласты в (культуре ФБТ кожи только в отдельных клетках происходило накопление фосфата ¡кальция в вакуолях. В первичной культуре МСК из пуповины можно было обнаружить лишь единичные локусы клеток, обладающих морфологией остеобластов. В культуре МСК из костного мозга и плаценты происходило активное

накопление фосфата кальция и образование значительного количества локусов окостенения (рис. 13.А).

Дифференцировку первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в хондроциты оценивали гистохимически по окрашиванию срезов, полученных из микромасс, толуидиновым синим на присутствие коллагена, а также иммунохимически по окрашиванию клеток на хондроитин и коллаген I и II типов. Было показано, что ФБТ кожи при культивировании методом микромасс образовывали очень рыхлые структуры, легко распадающиеся на мелкие фрагменты, а клетки МСК из костного мозга и пуповины образовывали оформленные структуры, характеризующиеся наличием значительной массы экстрацеллюлярного матрикса.

Анализ экспрессии хондроитина и коллагена I и II типов в культуре МСК костного мозга показал, что при длительном культивировании в среде дифференцировки в хондроциты в отсутствие ТСИ-Р клетки синтезируют и накапливают преимущественно коллаген I типа. Экспрессия коллагена II типа и хондроитина оставалась на фоновом уровне. Такое соотношение коллагенов I и II типов характерно для фиброзного хряща. Длительное культивирование МСК костного мозга в среде дифференцировки в хондроциты, содержащей ТСР-(3, приводило к уменьшению уровня синтеза коллагена I типа и увеличению уровня синтеза коллагена II типа и хондроитина (данные не представлены). Такое соотношение характерно для гиалинового хряща [Павлова В.Н., 1988].

В случае адипогенной дифференцировки, к 14 сут. культивирования 100 % ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины человека накапливали жировые вакуоли, выявляемые с помощью окраски масляным красным

(окрашенные в красный цвет на рис. 14).

Полученные результаты позволили сделать вывод, что первичные клеточные культуры МСК из костного мозга, плаценты и пуповины обладают способностью дифференцироваться в жировую, хрящевую и костную ткань и являются мультипотентными МСК. ФБТ кожи дифференцировались только в адипоциты и, несмотря на свою мезенхимальную природу, они не обладают мультипотентностью, являясь, скорее, унипотентными клетками.

3.4. Применение МТТ-метода для определения изменений дегидрогеназной активности в процессе пассирования клеточных культур.

Значение оптической плотности О, измеряемой в МТТ-тесте, отражает суммарную дегидрогеназную активность исследуемой клеточной культуры. Проводя титрование клеток в лунках 96-тилуночного культурального планшета, можно легко и статистически достоверно в нескольких повторах оценить зависимость величины £> от числа клеток в лунке N. Зависимость для всех

типов исследованных первичных клеточных культур оказалась

Рисунок 14. Окраска жировых вакуолей масляным красным в МСК из плаценты человека после 4-хнедельной

направленной адипогенной дифференцировки (увеличение 630): жировые вакуоли окрашены в красный цвет; ядра клеток окрашены гематоксилином в синий цвет.

0.500-

прямопропорциональной (см. пример на рис. 15). Угол наклона прямой d~n имеет смысл оптической плотности МТТ-Ф, произведённого одной клеткой, т.е. пропорционален дегидрогеназной активности культуры в расчёте на одну клетку и носит название МТТ-Ф-продуктивности.

Исследование МТТ-

продуктивности клеточных культур в зависимости от пассажа позволяет установить изменение дегидрогеназной активности и метаболического потенциала первичной клеточной культуры в процессе подготовки КМ in vitro. Из графиков на рис. 16 видно, что после выделения клеток мезенхимального происхождения в культуру in vitro, дегидрогеназная активность (угол наклона прямойd~n) возрастает на протяжении нескольких первых пассажей, но после V пассажа начинает постепенно снижаться. Этот

0.100 ^f-"

0.000 1000

2000 3000 4000 5000 ^

Рисунок 15. Наилучшая прямая для зависимости D-N: £> = 0.0001 + 7.8771 10~5 ■ N ; ФБТ кожи человека (III пассаж). Оптическая плотность D измеряется в оптических единицах для 540 нм против DMSO. эффект объясняется тем, что сразу после выделения клеточная культура обогащена зрелыми, имеющими пониженный уровень метаболизма, фибробластами. Доля юных, метаболическиактивных клеток с каждым пассажем возрастает вследствие удаления из культуры зрелых клеток. Однако этот процесс не может продолжаться неограниченно долго, и постепенно доля метаболически активных клеток снова сокращается. Снижение доли метаболически активных клеток и приводит к снижению дегидрогеназной активности, а как следствие - к снижению МТТ-Ф-продуктивности в МТТ-тесте.

МСК из костного мозга

МСК из пуповины

МСК из плаценты

Л-

О I II III IV V О I II III IV V 0 I II III IV V 0 1 11 III IV V

Рисунок 16. Зависимость МТТ-Ф-продуктивности от пассажа для различных первичных клеточных культур мезенхимального происхождения.

Пассажи клеточной культуры в окрестностях пика дегидрогеназной активности (как правило, III—VI пассажи) наиболее пригодны для приготовления клеточных материалов. Полученные результаты согласуются с эмпирически выведенным правилом не использовать для приготовления клеточных материалов клеточные культуры старше V пассажа, так как в противном случае медицинское применение таких клеточных материалов имеет пониженную эффективность.

3.5. Разработка методики кариотипирования при малом количестве митозов.

Оценка стабильности кариотипа является обязательным условием для

II f t I I I I II tidtiiismiiu

»tilt» «I ltd

Рисунок 17. Результат кариотипирования ФБТ кожи человека: слева - метафазная пластинка; справа - кариограмма

(46, XX).

трансплантации КМ. Классическая методика приготовления цитогенетических препаратов была разработана для суспензионной культуры лимфоцитов [Hungerford D.A., 1965; Seabright М., 1971], а методическим вопросам кариотипирования стволовых клеток в научной литературе уделяется недостаточно внимания [Bochkov N.P., 2009]. В случае с МСК человека, приходится иметь дело не только с адгезивной культурой, что привносит свои технические сложности в процесс приготовления цитогенетических препаратов, но и с культурой, характеризующейся малым количеством митозов. Причём, чем старше пассаж, тем ниже митотическая активность клеточной популяции, но именно эти пассажи вызывают наибольшие подозрения и вопросы у исследователей в отношении стабильности кариотипа. Поэтому, прежде, чем приступить к изучению стабильности кариотипа первичных клеточных культур МСК в процессе пассирования in vitro, было необходимо

усовершенствовать методику кариотипирования, а именно - получить возможность учитывать все митозы в клеточной культуре, обладающей низкой митотической активностью, с минимальными потерями и без дополнительной стимуляции. Нами была предпринята попытка получить цитогенетический препарат с фиксацией клеток непосредственно в монослое. При аккуратном обращении с препаратом таким методом можно выявить все клетки, находящиеся в культуре на стадии митоза. Такие цитогёнетические препараты могут быть использованы для последующей флуоресцентной гибридизации in situ с зондами на специфические участки хромосом (FISH-метод) с достоверной выборкой клеточной популяции и минимумом потерь ценного КМ.

Анализ стабильности кариотипа в процессе пассирования клеточной культуры был проведен по стандартной методике. Было показано, что клетки, выделенные из всех четырех источников вплоть до V пассажа сохраняют стабильный диплоидный кариотип (рис. 17).

3.6. Паспортизация клеточных материалов мезенхимального происхождения.

Паспортизация является необходимой процедурой, документирующей результаты контроля состава, качества и безопасности КМ.

Общая структура паспорта клеточного материала включает в себя четыре обязательных блока: 1. общая информация: научное название клеток; происхождение клеточного материала; маркировка образца; информация о доноре клеток; 2. жизнеспособность клеток, внешний вид образца: жизнеспособность клеток; стерильность; величина рН; цвет и консистенция образца; общая концентрация клеток, кл/мл; объём образца; время выдачи; срок годности, условия хранения; 3. результаты тестирования образца на отсутствие инфекционных агентов из списка, общего для всех типов клеток; 4. результаты тестирования образца на отсутствие инфекционных агентов, специфических для данного типа клеток. Были

„ I

Паспорт клеточного материала Рисунок 18. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

ФИО ПАЦИЕНТА_

ВОЗРАСТ

Наименование показателя Норма по нормативно-технической документации Результат испытаний

Содержание жизнеспособных клеток, % Не менее 80 %

Внешний вид Суспензия клеток в розовой прозрачной жидкости

рН В диапазоне от 7.0 до 7.4

Стерильность препарата в отношении бактерий Бактерии в препарате отсутствуют

Стерильность препарата в отношении микроскопических грибов Микроскопические грибы в препарате отсутствуют

Наличие в клетках ДНК вируса гепатита В ДНК вируса гепатита В в клетках отсутствует

Наличие в клетках РНК вируса гепатита С РНК вируса гепатита С в клетках отсутствует

Наличие в клетках провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 1-го типа Провирусная ДНК вируса иммунодефицита человека 1-го типа в клетках отсутствует

Наличие в клетках провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 2-го типа Провирусная ДНК вируса иммунодефицита человека 2-го типа в клетках отсутствует

Наличие в клетках ДНК вируса простого герпеса 1-го типа ДНК вируса простого герпеса 1-го типа в клетках отсутствует

Наличие в клетках ДНК вируса простого герпеса 2-го типа ДНК вируса простого герпеса 2-го типа в клетках отсутствует

Наличие в клетках ДНК цитомегаловируса ДНК цитомегаловируса в клетках отсутствует

Наличие в клетках ДНК токсо плазмы ДНК токсоплазмы в клетках отсутствует

Наличие в клетках ДНК микоплазмы ДНК микоплазмы в клетках отсутствует

Заключение Клеточный материал (мезенхимальные клетки из костного мозга человека) может быть использован в медицинских целях. Срок годности препарата: 24 ч с момента выдачи при температуре хранения от + 2°С до + 8°С. Дата и время выдачи препарата:

Исполнитель Расшифровка подписи Дата Печать учреждения

разработаны формы паспортов для КМ мезенхимального происхождения (см. пример на рис. 18).

3.7. Оптимизация методов хранения и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения.

Жизнеспособность различных пассажей культур МСК после криоконсервации изучали в стандартной криоконсервационной среде: FBS с 10 % ДМСО. ависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для всех исследованных клеточных культур имеет постепенно убывающий характер (рис. 19). Данные по жизнеспособности ФБТ кожи человека после размораживания, суммированные по трём возрастным группам (30-39 лет, 40—49 лет, 50 лет и старше), показали отсутствие достоверных статистических различий в значениях жизнеспособности после размораживания для различных возрастов. Зная, что независимо от возраста пациента значение жизнеспособности ФБТ кожи после размораживания будет на II-III пассаже в диапазоне 88-90 %, можно подбирать оптимальное количество клеток как для криоконсервации, так и для извлечения из криоконсервации для наращивания КМ.

Таблица 1. Сводные данные по допустимой продолжительности транспортировки КМ в

различных средах при + 4 °С.

Препарат* Фирма-производитель Допустимое время транспортировки

NCTF135 «Filorga» (Франция) 24 ч

ФР с а^тологичной сывороткой крови ОАО «Красфарма» (Россия) 24 ч

ФР с глюкозой ОАО «Красфарма» (Россия) 12 ч

ФР ОАО «Красфарма» (Россия) 6ч

ФР с глюкозой и набором аминокислот ОАО «Красфарма» (Россия) 4ч

Collageno «Belnatur» (Испания) Не рекомендована

Acido Hialuronico «Alta Саге Laboratoires» (Италия) Не рекомендована

XADN Gel «Alta Саге Laboratoires» (Италия) Не рекомендована

В соответствие с убыванием предпочтительности использования в качестве транспортной среды.

Для КМ на основе ФБТ кожи и МСК из костного мозга, предназначенных для аутологичного применения.

Транспортировка КМ оказывает наиболее неоднозначное воздействие на состояние клеток, так как при этом на них влияет множество факторов различной природы. Нами был исследован ряд препаратов в качестве транспортной среды (табл. I). ИСТР135 оказался наиболее оптимальным, обладая способностью сохранять жизнеспособность КМ на стандартном (не менее 80 %) уровне в течение не менее 24 ч.

Выводы.

Разработан лабораторный стандарт получения, культивирования, криоконсервации, паспортизации и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения.

Описаны закономерности изменения морфологии первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в зависимости от типа биоптата и длительности пассирования in vitro как основа визуального контроля качества клеточной культуры.

Установлено, что оптический сигнал в МТТ-методе прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток мезенхимального происхождения, что позволяет использовать этот метод для экспресс-анализа жизнеспособности клеточных культур.

Показано, что уровень дегидрогеназной активности в первичной культуре клеток мезенхимального происхождения возрастает на протяжении первых V-VII пассажей, после чего постепенно снижается, что коррелирует со снижением терапевтического эффекта их использования.

Разработан метод кариотипирования клеток мезенхимального происхождения с низкой митотической активностью без их перевода в суспензию.

Кариотип клеток в первичной культуре мезенхимального происхождения остаётся неизменным на протяжении, по крайней мере, первых десяти пассажей.

Список научных публикаций по теме диссертации.

Материалы диссертации опубликованы в 15 статьях, из них 12 в рецензируемых научных изданиях из списка ВАК.

1. Ярыгин К.Н., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Воронов A.B., Петракова Н.В., Чеглаков И.Б., Ступин В.А., Ярыгин В.Н. Сравнительное исследование фибробластов кожи взрослого человека и фибробластоподобных клеток пуповины И Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006.

1.-С. 53-59.

2. Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Ярыгин К Н. Цитофлюорометрическнй анализ фенотипов фибробластоподобных клеток из костного мозга и пуповины человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 4. - С. 1-8.

3. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. Сравнение способности к дифференцировке мезенхимальных клеток человека, выделенных из разных источников, в ткани мезодермального происхождения // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2007,-№ 1.-С. 3-10.

4. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Петракова Н.В., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н. Сравнительный анализ цитофенотипов клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 1. - С. 38-45.

5. Бурунова В.В., Суздальцева Ю.Г., Воронов A.B., Чеглаков И.Б., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н. Разработка и внедрение производственных стандартов для клеточных материалов мезенхимального происхождения // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 2. -С. 97-101.

6. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н. Сравнение in vitro иммунологических свойств культивируемых мезенхимальных клеток человека, изолированных из разных источников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-Т. 145.-№2.-С. 188-191.

7. Усовецкий И.А., Бурунова В.В., Ковтун Н.Е., Суздальцева Ю.Г., Красильникова Ю.Б., Короткий Н.Г., Ярыгин К.Н. Получение смешанных культур керэтиноцитов и меланоцитов из биоптатов пигментированных участков кожи пациентов с витилиго // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2009. - Т. 148 .-№ 1. - С. 103-105.

8. Астасидис А., Ярыгин К.Н., Русских C.B., Бурунова В.В., Лупатов А.Ю., Ярыгин Н.В., Миронов С.П., Ярыгин В.Н. Разработка методов постгравматической регенерации спинного мозга на основе применения новейших методов регенеративной медицины, в том числе клеточных технологий, усовершенствованных методов реконструктивной микрохирургии и наноматериалов // Хирург. -2009.-№ 11. - С. 5-12.

9. Ярыгин К.Н., Холоденко И.В., Кониева A.A., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Чеглаков И.Б., Пирогов Ю.А., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. Механизмы положительного влияния трансплантации МСК плаценты человека на восстановление крыс после экспериментального ишемического инсульта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148. -№12.-С. 621-627.

10. Бурунова В.В., ГисинаА.М. Холоденко И В., Лупатов А.Ю., ШрагинаО.А., Ярыгин К.Н. Стандартизация биохимического профиля клеточных материалов мезенхимального происхождения методом зондирования уровня дегидрогеназной активности И Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - № 2. - С. 63-67.

11. Кониева A.A., Холоденко И.В., ШрагинаО.А., Холоденко Р.В., Бурунова В.В., БибаеваЛ.В., Ярыгин КН., Ярыгин В.Н. Функциональная оценка мезенхимальных стволовых клеток, меченных магнитными микрочастицами, in vitro и анализ их распределения в организме после трансплантации // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - № 3. - С. 147-152.

12. Усовецкий И.А., Бурунова В.В., Короткий Н.Г., Ярыгин К.Н. Консервативная терапия и трансплантация аутологичных меланоцитов при витилиго // Хирург. - 2010. - № 9. - С. 44-52.

Материалы диссертации опубликованы в 22 тезисах научных конференций (15 -российских; 5 - международных, проводимых в России; 2 - международных, проводимых за рубежом).

Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ.

Разработан лабораторный стандарт получения, культивирования, криоконсервации, паспортизации и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения. Были описаны закономерности изменения морфологии первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в зависимости от типа биоптата и длительности пассирования in vitro как основы визуального контроля качества клеточной культуры. С использованием МТТ-метода было установлено, что оптический сигнал прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток мезенхимального происхождения, что позволяет использовать этот биохимический метод для экспресс-анализа жизнеспособности клеточных культур. Была проанализирована стабильность кариотипа первичных культур клеток мезенхимального происхождения в процессе пассирования и предложен новый подход к кариотипированию первичных культур клеток с низкой митотической активностью.

Problems of standardization of at reception of cellular cultures mesenchymal origins: the experimental and theoretical analysis.

It has been worked out the laboratory standard of reception, cultivation, ciyoconservation, certification and transportation of cellular material of mesenchymal origins. It has been described the regularity of morphology changes of primary cellular cultures of mesenchymal origins depending on the type of biomaterial and duration of passivation in vitro as bases of the visual quality control of cellular cultures. It has been established, using the MTT - method, that the optical signal is directly proportional to the quantity of viable cells of mesenchymal origins, that allows to use this biochemical method for the express - test of cellular cultures viability. It has been analyzed the stability of caryotype of primary cell cultures of mesenchymal origins in the process of passivation. It is offered the new approach to caryotype of primary cell cultures with the low mitotic activity.

Подписано в печать: 23.12.10

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бурунова, Вероника Вячеславовна

Введение.

Актуальность проблемы.

Цель работы.

Задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Внедрение в практику.

Апробация диссертационной работы.

Научные публикации по теме диссертации.

Структура диссертационной работы. 11 Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы.

Глава 1.1. Типы стволовых клеток и источники их выделения.

§ 1.1.1. Основные характеристики стволовых клеток.

Концепция существования стволовых клеток.

Способность к дифференцировке.

Трансдифференцировка.

§ 1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки.

История открытия эмбриональных стволовых клеток. 17 Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток.

§1.1.3. Фетальные стволовые клетки.

Источники феталъных стволовых клеток.

Фетальные пренатальные стволовые клетки.

Фетальные перинатальные стволовые клетки.

§ 1.1.4. Региональные стволовые клетки.

Мезенхимальные стволовые клетки.

Нейрональные стволовые клетки.

Гемопоэтические стволовые клетки.

Клетки-предшественники эндотелия.

Индуцированные плюрипотешпные клетки.

Глава 1.2. Области применения клеточной терапии.

§ 1.2.1. Перспективы медицинского применения клеточных ^ материалов мезенхимального происхождения.

Лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Применение КМ мезенхимального происхождения в ^ неврологии.

Применения КМ мезенхимального происхождения при восстановлении повреждений сердца и лечения сердечно- 51 сосудистых заболеваний.

Использование КМ мезенхимального происхождения для лечения заболеваний печени.

Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов ^ мезенхимального происхождения.

Применение клеточных материалов мезенхимального происхождения в эстетической медицине, а также для 54 лечения заболеваний кожи.

§ 1.2.2. Современное состояние законодательной базы в области производства, стандартизации и применения клеточных материалов.

Отсутствие понятия «клеточный материал» в базовых законах Российской Федерации, регулируюгцих производство клеточных материалов.

Создание законодательной базы в области производства, ^ стандартизации и применения клеточных материалов.

Международные нормы правового регламентирования ^ деятельности в области клеточных технологий.

Часть II. Материалы и методы исследований.

Глава П.1. Методы культивирования клеток.

§ II. 1.1. Получение первичных культур мезенхимальных клеток. 64 Выделение фибробластов из кожи человека.

Выделение кератино%{итов из кожи человека.

Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга человека.

Выделение мезенхимальных клеток из плаценты человека. 65 Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека.

§ II. 1.2. Культивирование первичных клеточных культур ^ мезенхимального происхождения in vitro.

Пассирование мезенхимальных клеток.

Долговременная криоконсервация клеток.

Определение концентрации клеток в камере Горяева.

§ II. 1.3. Дифференцировка клеток мезенхимального ^ происхождения in vitro.

Остеогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ^ клеток человека.

Хондрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ^ клеток человека.

Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых ^ клеток человека.

Глава II.2. Биохимические и цитологические методы.

§ II.2.1. Биохимические методы.

Окраска исключающим витальным красителем ^ трипановым синим.

Индикация дегидрогеназной активности с помощью ^ калориметрического МТТ-теста.

Индикация фосфата кальция методом окрашивания ^ ^ по Ван Коссу.

Индикация коллагена методом окрашивания толуидиновым ^ ^ синим.

Индикация липидов методом окраски масляным красным.

§ II.2.2. Цитогенетические методы.

Получение препаратов для цитогенетического анализа.

Анализ хромосомного состава клеток. 1Ъ

§ II.2.3. Иммуноцитохимические методы.

Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и ^ внутриклеточных маркёров.

Иммуноцитохимическая детекция маркёров клеточной ^ дифференцировки.

Проточная цитофлуориметрия.

Часть III. Результаты и обсуждение.

Глава Ш.1. Оптимизация технологии получения и культивирования клеточных материалов мезенхимального происхождения.

§ 111.1.1. Оптимизация-технологии получения клеточных ^ материалов мезенхимального происхождения.

Особенности выделения фибробластое кожи человека.

Особенности выделения мезенхшшлъных стволовых клеток ^ из костного мозга человека.

Особенности выделения мезенхимальных стволовых клеток „ из плаценты человека.

Особенности выделения мезенхшшлъных стволовых клеток 0, из пуповины человека.

§ III. 1.2. Изучение особенностей морфологии клеток мезенхимального происхождения в процессе культивирования in vitro.

Морфологическая гетерогенность вследствие наличия ^ исходной примеси клеток других тканей.

Морфологическая гетерогенность вследствие наличия фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения различной степени зрелости.

Глава III.2. Оптимизация методов контроля качества клеточных материалов мезенхимального происхождения.

§ I1I.2.1. Подтверждение мезенхимальной природы выделенных ^ ^ j клеток.

Определение фенотипа выделенных клеток.

Подтверждение мулътипотентности выделенных клеток путём остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки.

§ III.2.2. Применение МТТ-метода для определения изменений дегидрагеназной активности в процессе пассирования клеточных 119 культур.

Необходимость экспериментальной верификации зависимости уровня измеряемого сигнала от количества 119 жизнеспособных клеток в МТТ-методе.

Экспериментальное изучение зависимости уровня измеряемого сигнала от количества жизнеспособных клеток в МТТ-методе.

Исследование МТТ-продуктивности клеточных кулыпур в ^ ^ зависимости от пассажа.

§ Ш.2.3. Разработка методики кариотипирования при малом ^о количестве митозов.

Обоснование г{елесообразности кариотипирования при ^о малом количестве митозов.

Оптимизация методики кариотипирования при малом количестве митозов для монослойной клеточной культуры 134 без открепления её от подложки.

Анализ стабильности кариотипа в процессе пассирования клеточной культуры.

§ Ш.2.4. Паспортизация клеточных материалов мезенхимального ^^ происхождения.

Общая структура паспорта клеточного материала.

Исключение инфекционных агентов в клеточном ^ ^ материале.

Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального ^ ^ происхожден ия.

Глава Ш.З. Оптимизация методов хранения и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения.

§ Ш.3.1. Криоконсервация клеточных материалов.

Подбор среды для криоконсервации клеточных материалов.

Оптимизации процесса подготовки и накопления клеточных ^ ^ материалов после криоконсервации. "

§ Ш.З.2. Транспортировка клеточных материалов.

Подбор среды и температурного режима ^ ^ транспортировки клеточных материалов.

Подбор контейнера для транспортировки клеточных ^^ материалов.

Выводы.

Список научных публикаций по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения"

Актуальность проблемы.

Выделение и культивирование клеток мезенхимального происхождения из постнатальных органов и тканей1 человека является основой для получения клеточных материалов (КМ), используемых в регенеративной медицине для терапии патологий различного генеза:1 заболеваний опорно-двигательного аппарата [Bruder-94, Kassem-04], неврологических заболеваний [Скворцова-08,09, Dezawa-05], повреждений сердца [Miyahara-06, Tang-06, Zhang-07], сердечно-сосудистых заболеваний [Miranville-04, Nakagami-05], заболеваний печени [Урываева-09, Chien С.С.-06], заболеваний кожи. Кроме того, иммуномодулирующие свойства клеток мезенхимального происхождения могут быть использованы, например, при аутоиммунных заболеваниях [Aggarwal-05, Di Nicola-02] и для иммунокоррекции в трансплантологии [Beyth-05, Quirici-02].

Принятию нормативных актов, регламентирующих медицинское применение КТ, должно предшествовать появление унифицированного понятийного аппарата, лабораторных регламентов получения первичных клеточных культур и обеспечения их биологической безопасности и единых подходов к документированию продуктов и технологических схем. Таким образом, исследования в области стандартизации производства и контроля качества КМ обладают несомненной научно-практической актуальностью.

Цель работы.

Задачи исследования:

Научная новизна работы.

Впервые были изучены особенности выделения мезенхимальных клеток из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека с учетом« их использования для производства КМ. Были сопоставлены данные,' полученные при выделении клеток из различных участков биопсийного материала, а также изучены причины гетерогенности, связанные с его особенностями. Предложены новые подходы к визуальной оценке КМ.

Предложена модификация методики кариотипирования клеток в составе монослойных культур с низкой митотической активностью без их перевода в суспензию, что позволяет осуществлять рутинное кариотипирование культур клеток мезенхимального происхождения в процессе производства- КМ. Показано, что в рамках использованных технологических схем кариотип клеток остаётся неизменным на протяжении, по крайней мере, первых десяти пассажей в первичных культурах клеток мезенхимального происхождения из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека.

Впервые установлено, что оптический сигнал в МТТ-методе прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток мезенхимального происхождения, что позволяет использовать этот метод для экспресс-анализа жизнеспособности клеточных культур. Показано, что уровень дегидрогеназной активности в первичной культуре клеток мезенхимального происхождения возрастает на протяжении первых У-УИ пассажей, после чего постепенно снижается.

Впервые изучена динамика жизнеспособности первичных клеточных культур в различных транспортировочных средах и условиях транспортировки. Получены данные выживания клеток первичных культур мезенхимального происхождения различных пассажей после долговременной криоконсервации в жидком азоте (- 196 °С). Предложены образцы паспортов

КМ, документирующих результаты контроля их состава, качества и безопасности.

Практическая значимость работы.

Внедрение в практику.

Разработанный лабораторный стандарт производства и контроля качества КМ успешно внедрён в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии (ОПП) РАМН, в процессе выполнения исследований по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», совместному научному проекту кафедры неврологии с курсом нейрохирургии медико-биологического ф-та Российского государственного медицинского университета, кафедры биологии педиатрического ф-та Российского государственного медицинского университета и лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН «Исследование эффектов трансплантации мезенхимальных клеток на окклюзионной модели ишемического инсульта у крыс».

С использованием разработанного лабораторного стандарта проведено изучение первичных культур мезенхимальных клеток из плаценты человека и подготовлена документация, на основании которого Федеральная» служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития выдала Разрешение ФС № 2010/383 от 26.10.2010 на применение новой-медицинской технологии «Получение, культивирование, хранение и транспортировка мезенхимальных клеток плаценты человека». Материалы диссертационной работы использовались в учебном процессе кафедры биологии РГМУ и ФГОУ «Всероссийский учебно-научно-методический Центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Апробация диссертационной работы.

24-27 September 2008); IV Всероссийского съезда трансплантологов (Москва, Россия; 9-10 ноября^ 2008 г.); итоговой конференции по результатам I выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления

Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007— ^ 2012 годы» (Москва, Россия; 8-10 декабря 2008 г.); Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe Conference (Edinburgh, England; 23— 25 September 2009); XVI съезда педиатров России (Москва, Россия; 1619 февраля 2009 г.); Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (Пятигорск, Россия; 20-21 мая 2010 г.); Материалы IV Всероссийского Симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, Россия; 21—22 апреля 2010 г.).

Научные публикации по теме диссертации.

Результаты диссертационной работы отражены в 37 научных публикациях: в 15 статьях (в том числе, опубликованных в рецензируемых научных изданиях из списка ВАК - 12); в 22 тезисах научных конференций (15 - российских; 5 - международных, проводимых в России; 2 -международных, проводимых за рубежом).

Структура диссертационной работы.

Рукопись включает 213 с. машинописного текста, 91 рисунок, 20 таблиц и состоит из трёх основных частей: «Обзор литературы по теме диссертационной работы» (63 с., 18 рисунков, 1 таблица), «Материалы и методы исследований» (12 е., 5 рисунков), «Результаты и обсуждение» (104 е., 68 рисунков, 19 таблиц). Список использованной научной литературы включает 297 наименований.

Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы. t

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Бурунова, Вероника Вячеславовна

Результаты исследования жизнесохраняющего потенциала для КМ в ФР с глюкозой и набором аминокислот представлены, в табл. 12—13 и рис. 84-85, соответственно. Из схемы эксперимента была исключена порция С, транспортируемая курьером.

ФР с глюкозой имеет незначительное преимущество по сравнению с ФР, а ФР с глюкозой и набором аминокислот уступает ФР по жизнесохраняющему потенциалу.

Тип КМ Жизнеспособность КМ, %

Время, ч Порция А (+ 4 °С) Порция В (+ 22 °С) Порция С (курьер)

1 2 3 4 5 М ± о 1 2 3 4 5 М± О 1 2 3 4 5 М±о

ФБТ кожи человека 0 99.1 98.9 99.0 99.2 97.4 98.7±0.7 98 4 97 9 99.5 98.2 99.6 98.7±0.8 98.2 99.2 98.8 99.1 98.8 98.8±0.4

2 88.8 96.1 89.2 89.6 91.4 91.0±3.0 78 6 88 1 86 5 81.4 78.9 82.7±4.4 81.9 84.3 76.2 80.5 81.9 81.0±3.0

4 80.9 89.0 84.2 87.1 85.3 85.3±3.1 60 7 67 2 61 4 62.6 60.9 62.6±2.7 62.6 58.1 63.0 58.9 57.2 60.О±2.7

6 84.7 76.3 85.6 80.5 83.5 82.1±3.8 57 1 53 8 48 2 53 4 50.3 52.6±3.4 52.7 45.9 58.8 52 1 52.2 52.3±4.6

8 70.9 61.2 68.6 62 3 62.0 65.0±4.4 44 5 36 3 45.7 47 2 45.8 43.9±4.4 41.2 40.1 44.2 48.3 44 6 43.7±3.2

10 55.7 53.2 57.1 47.8 50.1 52.8±3.9 37 2 35.9 35 3 32 4 33 8 34.9±1.9 38.3 30.8 35.6 32.5 37.8 35.0±3.3

12 52.3 41.7 46.6 49.1 44.9 46.9±4.0 180 15.7 13 2 12 1 183 15.5±2.8 17.2 11.3 15.3 168 12.4 14.6±2.6

24 1.0 0.5 0.8 0.2 1.1 0.7±0.4 0 1 0 1 0 1 02 0.1 0.1 ±0.04 0.1 0.3 0.1 0.2 0.1 0.2±0.1

МСК из пуповины человека 0 99.1 98.4 99.6 98.1 99.3 98.9±0.6 99 1 99 6 98 5 98 1 98 4 98.7±0.6 99.3 98.8 99.5 98.2 98.1 98.8±0.6

2 91.2 92.6 97.0 98.5 92.4 94.9±2.7 90 7 85 6 91.2 90.9 89 1 89.5±2.3 87.2 92.1 94.4 93.2 88.4 91.1±3.1

4 84.9 90.1 85.5 88.1 89 4 87.6±2.3 74 2 65 9 63 6 77.1 62 4 68.6±6.6 70 8 63.7 61.3 62.0 70.9 65.7±4.7

6 78.7 85 9 85.1 85.6 79.9 83.0±3.5 68 2 57 4 59 1 57 8 58 3 60.2±4.5 59.2 61.2 59.8 63.5 62.9 61.3±1.9

8 67.2 68.0 68.7 76.6 70.4 70.2±3.8 39 8 48 6 36 9 48 6 47.2 44.2±5.5 47.1 49.0 38.2 45.3 46.9 45.3±4.2

10 55.0 59.2 48 9 57.2 50.3 54.1±4.4 41.2 29.9 42 9 31 6 33 7 35.9±5.8 31.7 22.6 32.3 30.4 32.6 29.9±4.2

12 52.2 42.3 53.1 44.6 47.2 47.9±4.7 25 3 13.3 13.9 21 2 23 8 19.5±5.6 20.6 21.3 15.9 13.9 15.4 17.4±3.3

24 0.9 1.3 10 1.2 0.6 1.0±0.3 0.2 0.1 02 02 0.4 0.2±0.1 0.2 0.2 0.4 02 0.4 03+0.1

МСК из костного мозга человека 0 97.2 97.8 95.8 97.0 96.7 96.9±0.7 96 4 97.2 97 5 96.1 96 3 96.7±0.6 96.9 95.9 97.8 96.8 96.1 96.7±0.8

2 89.6 92.5 94.7 90.0 89.3 91.2±2.3 76 2 83 8 86 1 77 8 76 6 80.1±4.5 79 3 86 6 77 1 85 7 84.9 82.7±4.2

4 80.1 95.0 87.3 82.8 93.5 87.7±6.5 53 2 63 0 63 8 67 5 68.2 63.1±6.0 52.7 65.8 60.1 67.1 53 6 59.9±6.7

6 89.7 79.8 78 2 84.2 90.2 84.4±5.5 42 7 50.4 43 1 56 8 55.9 49.8±б.7 53.2 55.6 39.7 37.3 46.1 46.4±8.0

8 65 2 76.4 78.5 71.2 69.3 72.1±5.4 27.8 28.3 39 1 39 4 47.1 36.3±8.2 44.7 31.4 34.3 39.8 45.6 39.2±6.3

10 59.2 50.6 66.1 60.3 68.2 60.9±6.9 29.1 37.2 19.6 34 2 28 8 29.8±6.7 27.5 21.8 33.9 20.3 34.3 27.6±6.5

12 43.6 40.7 48.6 52.1 55.9 48.2±6.2 21.3 10.3 16.5 112 20 6 16.0±5.1 17.2 14.3 13.2 16.8 15.9 15.5±1.7

24 1.6 1.2 1.7 0.9 1.1 1Л±03 0.1 0.4 0.2 0 1 0 1 0.2±0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.2±0.1

Время, ч

Время, н

Порция А (+4 °С) порция В (+ 22 'С) Порция С (курьер)

10 12 Время, ч

Заключение

Клеточный материал (мезенхимальные клетки из костного мозга человека) может быть использован в медицинских целях. Срок годности препарата: 24 ч с момента выдачи при температуре хранения от + 2°С до + 8°С.

Дата и время выдачи препарата:

Ответственный исполнитель Расшифровка подписи

Исполнитель Расшифровка подписи

Дата Печать учреждения

Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального происхождения - ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины — представлены на рис. 78-81.

Паспорта КМ содержат все четыре перечисленных выше информационных блока, заключение о возможности медицинского применения: Паспорт скрепляется подписью ответственного исполнителя и печатью организации.

На протяжении нескольких последних лет заинтересованные специалисты ставят проблему регламентации производственных стандартов в сфере медицинских клеточных технологий. Проведенная работа по стандартизации технологии производства КМ является предпосылкой для разработки нормативной базы, регламентирующей безопасное использование культур клеток в доклинических и клинических испытаниях.

§ 111.3.1. Криоконсервация клеточных материалов.

Жизнеспособность различных пассажей культур мезенхимальных стволовых клеток после криоконсервации изучали в стандартной криоконсервационной среде: БВ8 («ОПэсо», США) с 10 % ДМСО («ПанЭко», РФ) [Белоус-87, Дузу-80].

ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека получали по стандартной методике и пассировали в 75 см" пластиковых флаконах («Сгетег», США) (см. § II. 1.1). После выделения (0 пассаж) и после каждого пассажа (с 1-го по У1-ой) по 1 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл криоконсервационной среды помещали в 1.8 мл криопробирки («Сгетег», США), замораживали в программном замораживателе МгБгс^ег

Сгетег», США) и хранили в сосудах Дьюара с жидким азотом (- 196 °С) в течение 60 сут. Затем образцы размораживали на водяной бане (37 °С) и рассевали в 75 см" пластиковых флаконах («Сгетег», США). Через 12 ч клетки снимали с пластика смесью трипсина и версена (см. §11.1.1) и проводили пятикратный подсчёт жизнеспособности клеток в камере Горяева с трипановым синим.

Выбор срока хранения образцов клеточных культур в условиях криоконсервации, 60 сут., связан с тем, что стандартная процедура мезотерапии повторяется с интервалом в 2 мес., т.е. именно через этот срок приходится размораживать клетки для приготовления КМ в практической деятельности. Поэтому проверка жизнеспособности клеток через 60 сут. криоконсервации имела не только теоретическое, но и очевидное практическое значение.

Непосредственно после выделения (0 пассаж) клетки обычно не закладывают на долговременное хранение, во-первых, вследствие их немногочисленности, во-вторых, — в силу недостаточной гомогенности клеточной культуры. Поздние пассажи, старше IV, также стараются не консервировать. Однако в данном разделе^ работы была поставлена цель установить основной тренд зависимости жизнеспособности от номера пассажа, поэтому и нулевой пассаж, и У-У1 пассажи были включены в эксперимент по криоконсервации.

Результаты представлены в табл. 7-8 и на рис. 82.

Зависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для всех исследованных клеточных культур имеет постепенно (с учётом статистических погрешностей — монотонно) убывающий характер. Для ФБТ кожи человека на первых шести пассажах снижение жизнеспособности наименьшее: примерно с 95 % до 89 %. Различия между пассажами достоверны для 0-1 и II—VI пассажей; кроме того, достоверно отличаются от остальных наиболее поздние (V—VI) пассажи (табл. 8).

Информация о работе

Бурунова, Вероника Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы