Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природные иммуноглобулины как нуклеазы и протеазы в норме и при ВИЧ-инфекции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природные иммуноглобулины как нуклеазы и протеазы в норме и при ВИЧ-инфекции"

На правах рукописи

ОДИНЦОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

ПРИРОДНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КАК НУКЛЕАЗЫ И ПРОТЕАЗЫ В НОРМЕ И ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата

003 160886

Новосибирск - 2007 г

003160886

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель

д б н, доцент Бунева Валентина Николаевна

Официальные оппоненты

д б н Рубцов Николай Борисович к б н , доцент Попова Нелли Александровна Ведущая организация

Институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится » 2007 г в У*«2,

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «/" »

Ученый секретарь

диссертационного совета д х н О С Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Природные антитела, представленные разнообразным набором циркулирующих иммуноглобулинов, являются частью иммунной системы и обеспечивают выведение патогенных веществ из кровотока Открытие каталитической активности антител существенно изменило традиционные представления о роли и функции иммуноглобулинов в иммунной системе организма Каталитически активные антитела обнаруживают у пациентов с такими аутоиммунными заболеваниями, как астма, системная красная волчанка, полиартрит, первичная микседема, рассеянный склероз, а также гепатитом и лейкемией, те при «срыве» толерантности к собственным антигенам и наработке антител к ним

СПИД - вирусное заболевание, связанное с серьезным поражением иммунной системы, представляет собой важную медицинскую и социальную проблему Особенность строения вирусной частицы заключается в наличии липидной оболочки - фрагмента клеточной мембраны хозяина с встроенными и экспрессированными на поверхности гликопротеинами вируса и белками собственного организма Это может служить одним из пусковых механизмов развития аутоиммунных реакций В материалах Международного Симпозиума по каталитически активным антителам (1994 г) опубликована информация об обнаружении ДНКазной активности в препаратах АТ из крови больных СПИД Однако ни доказательства принадлежности нуклеазной активности непосредственно антителам, ни свойства данных абзимов в литературе не приведены и не описаны У беременных и кормящих грудью женщин аутоиммунные процессы имеют временный характер и исчезают после окончания лактации Аутоиммунные реакции при ВИЧ-инфекции с развитием заболевания только усугубляются До сих пор не установлены как механизмы индукции, так и биологическая роль абзимов в норме и при аутоиммунных патологиях

Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе каталитических свойств антител с протеолитической и нуклеазной активностями из крови ВИЧ-инфицированных больных и молока здоровых доноров В процессе работы необходимо было решить следующие задачи:

• провести скрининг протеолитической и ДНК-гидролизующей активностей в препаратах антител крови ВИЧ-инфицированных больных,

• проверить критерии отнесения каталитических активностей антител из крови ВИЧ-инфицированных больных и молока рожениц непосредственно к иммуноглобулинам,

• изучить ферментативные свойства исследуемых абзимов с протеолитической и ДНКазной активностями (рН- и металл-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры

реакции гидролиза) и сравнить их с аналогичными активностями классических ферментов, • исследовать возможные корреляции выявляемое™ абзимов со стадиями заболевания и скоростью развития ВИЧ-инфекции Научная новизна и практическая ценность работы Впервые показано, что антитела из крови ВИЧ-инфицированных больных и молока здоровых рожениц обладают протеолитической активностью В работе проведено исследование выявляемое™ абзимов на разных стадиях заболевания и сопоставление этих данных с результатами клинико-иммунологического наблюдения, проведенного в ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета, позволяющими разделить группу больных на отдельные подгруппы со своими индивидуальными особенностями протекания заболевания Полученные данные могут служить основой для дополнительного диагностического критерия в оценке тяжести течения заболевания, а также в оценке эффективности проводимой противовирусной терапии

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы Результаты были представлены на 5 международных конференциях - "Chemical&Bio logical Problems of Pioteomics" (2004, Novosibirsk), "Chemical Biology" (2005, Novosibirsk), "Fundamental Science for Medicine" (2005, Novosibirsk), 20th IUBMB International Congiess of Biochemistry and Moleculai Biology and the 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto), "Physico-Chemical biology" (2006, Novosibnsk)

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы Работа изложена на 111 страницах, содержит 31 рисунок и 7 таблиц Библиография включает 197 литературных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение иммуноглобулинов из крови и молока человека

Антитела (AT) крови больных ВИЧ-инфекцией в течение 2002 года были выделены согласно разработанной в лаборатории ферментов репарации методике и любезно предоставлены Харитоновой М А (ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета) Препараты AT были проверены на отсутствие опасных для человека компонентов вируса и дальнейшие работы с этими препаратами проводились в ИХБФМ СО РАН Иммуноглобулины молока человека выделяли последовательными хроматографиями на Protein A-Sepharose и на DEAE-Cellulose с последующей элюцией иммуноглобулинов линейным градиентом концентрации соли

Электрофоретический анализ препаратов выделенных из крови больных ВИЧ-инфекцией и б^А молока показал их высокий уровень очистки (рис. 1) Образцы были электрофоретически и

иммунологически гомогенными согласно окраске белков серебром и иммуноблотингу после БОБ-ПААГ (рис. 1, а) После всех стадий очистки АТ были каталитически активными в реакциях гидролиза ДНК и белков

1 2 3 4 5

кДа 67 — 43 -»

20

14,1

кДа

220170

116

73 -

53 "

Рис 1 Анализ гомогенности препаратов БОБ-электрофорезом в 4— 12,5% ПААГ а — крови ВИЧ-инфицированных больных Дор 2, 3 — ^О после и до инкубации с 10 мМ ДТТ, (гель окрашен серебром), 4, 5 - АТ после и до обработки 10 мМ ДТТ, (мембрана окрашена

коньюгатом перо-ксидазы хрена с мышиными АТ против тяжелой цепи человека) б - sIgA молока здоровых доноров Дор 2 -

белок окрашен серебром, 3 - в^А (мембрана и окрашена мышиными АТ против б^А человека), 4 - АТ после обработки 10 мМ ДТТ, гель окрашен серебром Дор 1 - белковые маркеры

В препаратах э^А (рис. 1, б) молока было выявлено 2 полосы с молекулярными массами 380 и 330 кДа, соответствующие двум подклассам иммуноглобулинов После электрофореза препарата я^А в восстанавливающих условиях было выявлено три белковые полосы 23, 50 и 72 кДа, соответствующие по мол массам легкой, тяжелой цепям и секреторному компоненту антител Каких-либо других тестируемых по окраске серебром белковых полос обнаружено не было (рис. 1, 6)

Скрининг протеолитической и ДНК-гидролизующей активностей в препаратах антител крови больных ВИЧ-инфекцией

Для оценки протеолитической активности препаратов АТ использовали казеин как лучший субстрат, для ДНКазной — суперскрученную форму плазмидной ДНК, что обеспечивало высокую чувствительность метода детекции Относительный уровень активностей АТ сильно варьировал от пациента к пациенту

В стадии пре-СПИД увеличивалось количество пациентов, в крови которых содержатся абзимы с ДНК-гидролизующей и протеолитической активностями, но достоверного изменения среднего уровня активностей с изменением стадии заболевания не наблюдалось (табл. 1)

Таблица 1 Относительные протеин- и ДНК-гидролизующие активности препаратов АТ крови ВИЧ-инфицированных больных

Стадия заболевания (количество препаратов) Среднее значение относительной ДНКазной активности Среднее значение относительной протеазной активности

Генерализованная лимфоаденопатия (45)* 40,2 % ± 26,3 % 53,6 % ± 22,6 %

Пре-СПИД (65) 44,7 % ±21,3 % 51,5% ±25,9%

* - количество препаратов из крови больных на данной стадии заболевания

Внутри каждой группы больных на стадиях ГЛАП и пре-СПИД в Ростовском государственном медицинском университете были выделены подгруппы больных с быстро и медленно прогрессирующим течением заболевания В качестве критерия скорости прогрессии, в соответствии с рекомендациями Центра по контролю и профилактике болезней, была взята продолжительность перехода из стадии ГЛАП в стадию пре-СПИД (до и более двух лет) При медленной прогрессии заболевания на стадии ГЛАП каталитические активности (ДНКазная и протеолитическая) обнаруживались у большего числа препаратов, по сравнению с быстрой прогрессией (табл. 2) Это может указывать на положительную роль абзимов на ранних стадиях развития заболевания, когда иммунная система еще способна адекватно реагировать на инфекцию В стадии пре-СПИД наблюдалась картина обратная стадии ГЛАП - каталитическая активность препаратов была выявлена у большего количества пациентов при быстрой прогрессии заболевания Это можно объяснить поликлональной активацией В-лимфоцитов, и, как следствие, появлением аутореактивных клонов, перекрестно реагирующих с собственными клетками и белками организма

Таблица 2 Количество пациентов, содержащих в крови абзимы с протеолитической и ДНКазной активностями, при быстрой и медленной прогрессии заболевания

Стадия заболевания ГЛАП* Пре-СПИД

Скорость развития заболевания Быстрая прогрессия Медленная профессия Быстрая прогрессия Медленная прогрессия

ДНКазная активность 29,7 % 41,3 % 58,1 % 51,8%

Протеолитическая активность 41,7% 47,8% 55,8 % 50,7 %

*- генерализованная лимфоаденопатия

Доказательство наличия у антител из крови больных ВИЧ-инфекцией и молока здоровых доноров каталитических функций

Одним из наиболее существенных вопросов, возникающих при исследовании каталитической активности АТ, является чистота получаемых препаратов, так как наличие примесей ферментов в препаратах иммуноглобулинов приведет к искажению результатов Согласно современным представлениям, отнесение каталитической активности непосредственно к абзимам требует проверки ряда жестких критериев Для доказательства принадлежности исследуемых активностей антителам использовали наиболее активные препараты, поскольку гель-фильтрация в кислых условиях и электрофорез в присутствии ББЗ ведут к денатурации АТ и снижению их активности Выполнение первого из этих критериев - гомогенность препаратов АТ по данным электрофореза с последующей окраской белков серебром — описано выше

Гель-фильтрация в условиях «кислого шока»

При гель-фильтрации АТ в кислых условиях происходит разрушение нековалентных комплексов, т к кислый рН среды обеспечивает диссоциацию и последующее разделение всех компонентов иммунокомплексов, состоящих из АТ разных классов и связанных с ними АГ Для всех исследованных препаратов АТ крови ВИЧ-инфицированных больных профиль оптической плотности совпадал с профилем ДНК-гидролизующей активности (рис. 2) Аналогичные картины наблюдались для в^А молока и при исследовании протеолитической активности крови и ВИЧ-инфицированных больных

Рис 2 Высокоэффективная гель-фильтрация сыворотки крови одного из ВИЧ-инфицированных больных на 8ирегс1ех-200 в СЛу-НС1, рН 2,6 (-) - Оптическое поглощение элюата, высота столбиков соответствует

относительной активности АТ в гидролизе плазмидной ДНК

к 30 35 Номера фракции

Взаимодействие абзимов с аффинными сорбентами

Одним из критериев, свидетельствующих о наличии каталитических активностей у антител крови больных и молока здоровых рожениц,

является специфическое взаимодействие абзимов с аффинными сорбентами При хроматографии на сефарозе с иммобилизованными моноклональными антителами к Ь-цепям иммуноглобулинов человека АТ количественно связывались с сорбентом и профили активностей при элюции кислым буфером совпадали с профилем оптической плотности (рис. 3, а) После элюции с аффинного носителя АТ сохраняли свои казеин- ОТ-, ЧСА- и ДНК-гидролизующие активности Аффинная

Рис 3 а - Профиль оптической плотности при аффинной хроматографии гомогенного препарата ^О (—) сыворотки крови больного ВИЧ-инфекцией на анти-1§0 сефарозе и глубина протекания реакций гидролиза (•) - Р-казеина, (А) -ОТ ВИЧ, (■) - ЧСА б - Профили оптической плотности и протеолитической активности АТ при хроматографии б^А молока здоровых доноров на анти-1§ сефарозе, (А) - относительная эффективность гидролиза (%) (3-казеина относительно контроля (инкубация субстрата без АТ)

хроматография препаратов э^А из молока рожениц приводила к аналогичному результату, данные представлены на рис. 3, б Вышеперечисленные данные так же подтверждают вывод о том, что протеолитическая (субстраты - казеин, ОТ и ЧСА) и ДНКазная активности являются собственными свойствами иммуноглобулинов крови и молока человека, а не обусловлены примесями сывороточных ДНКаз и протеаз

Анализ активности антител в геле

Среди используемых в настоящее время критериев есть такие, выполнение которых однозначно свидетельствует о принадлежности каталитической активности непосредственно антителам, а не каким-либо примесям К таким критериям, относится обнаружение активности у АТ после разделения белков с помощью БББ-электрофореза в геле Известно, что БОБ-электрофорез является одним из самых жестких методов разрушения различного рода нековалентных комплексов Этот метод позволяет определять ферментативную активность в определенном фрагменте геля, соответствующем положению анализируемых белков

а

б

о

'т**.*****.**т*,'*1 . * "а'"' 1о

10 Н 2(1 25 10 15 40

Номера фракций

10 15 211 25 30

Номера фракций

после электрофореза в ПААГ. Одним из вариантов этого подхода является определение активности ферментов в элюагах, соответствующих различным фрагментам геля, ! 1а рис. 4 приведены результаты анализа активности ¡«0 из крови больных ВИЧ-инфекцией. Положение пиков активности я реакциях Шдролиза казеина, ОТ- и ЧСА соответствует положению белковой полосы кровн больных. Отсутствие белковых полос, а также протеолитической активности и элюатах, из других фрагментов геля Свидетельствуют о том, что все три протсолитические активности являются собственным свойством Iц.0 и не обусловлены примесями сывороточных п роте аз.

и +

Рис. 4. а — Анализ активности ]£С кропи больных ВИЧ-инфекцией после 803-электрофорет За 100% активности принят полный гидролиз анализируемого белка: (•) - (Э-казеин, (и) - ОТ, (А) ЧСА. П - Электроф еретический анализа белков. Дор. I - 1§0, окраска геля СоотаБ-че К-2 50, 2 белковые маркеры.

, 33 с г, гч г- — [-— .—

Второй подход к оценке ферментативной активности белка после 5ОБ-электрофореза белков в ПААГ - тестирование активности т 31Щ с использованием геля, содержащего штолимеризованнын субстрат. Данный метод был применен для доказательства принадлежности

12 3 4

кЛя 1 2

— 220 17« — £ кДа «—22(1

116 ; ■ч- [70

73

— 53 «-73

- 10 1-53

— 20

14.4

Рис. 5, а — Анализ т ¿(7ц каталитической активности ^бзимов крови больного ВИЧ-инфекцией после ЙПЗ-элсктрофорсза и геле, содержащем вполцмериЗО-

ванный ДНК-субстрат. Дор. 1 -АТ после обработки ДТ"Г, 2 - А Г без обработки ДТТ; 3, 4 белковые маркеры, гель окрашен Соошаях1е ¿-250. б Анализ активности з[§Л абзимов молока здоровых доноров т хии. Дор. 1 - гель окрашен Соотахх1е К-250.

ДНКазной активности антителам сыворотки крови ВИЧ-инфицированных больных (рис 5, а) и протеолитической антителам молока (рис 5, б) ДНКазная активность крови больных ВИЧ-инфекцией проявлялась в участке геля, соответствующем интактным а после восстановления

дисульфидных мостиков антител с помощью ДТТ - в участке, соответствующем положению легких цепей (рис. 5, а) В качестве субстрата протеолитической активности использовали р-казеин молока человека

Кинетические характеристики антитело-зависимого гидролиза ДНК

Начальная скорость реакции гидролиза ДНК для проанализированных абзимов возрастала с увеличением концентрации субстрата и описывалась кинетическим уравнением Михаэлиса-Ментен Для одного из препаратов поликлональных АТ обнаружено одно значение величин Км, = (53±9) нМ (рис. 6, а) Использование различных подходов к линеаризации данных, а также прямого линейного графика Эйзенталя и Корниш-Боудена, для второго препарата АТ (рис. 6, б) приводило к определению двух величин Км {(2,б±0,1) нМ и (4,4±0,9) нМ} Величина Км для суперскрученной формы плазмиды рВК322, гидролизуемой ДНКазой I человека, равна (46±8,6) 10"6 М, а полученные значения для обоих препаратов АТ ниже этой величины на несколько порядков Найденные величины Км абзимов крови больных, для ДНК лежат в диапазоне 10"9-10"6 М, что характерно для взаимодействий типа "антиген-антитело" Для первого и второго препаратов значения кса( отличались примерно на порядок и были оценены как (2,1±0,1) 10"2 мин"1, и - (6,67±0,1) Ю"2 мин"1 и (29,6±5) 10"2 мин"1), соответственно В целом, полученные величины кса, реакции гидролиза ДНК сопоставимы со значениями, полученными для РаЬ-фрагментов крови больных СКВ (2,7 10"2 мин"1)

Рис 6 Зависимости начальной скорости реакции от

концентрации ДНК в координатах Эйзенталя-Корниш-Боудена для двух препаратов (а и б) 1§0 сыворотки крови двух больных ВИЧ-инфекцией

Следует отметить, что препарат антител, кинетические данные которого представлены на рис 6, а, был выделен из крови больного,

а 6

находящегося в стадии ГЛАП, в то время второй больной (рис. 6, б) находился на более поздней стадии - пре-СПИД Возможно, с развитием заболевания увеличивается поликлональная активация В-лимфоцитов и идет наработка большого количества АТ различной специфичности, что проявляется в появлении нескольких значений Км и Умакс

Исследование ферментативных свойств антител с протеолитической активностью

Субстратная специфичность антител с протеолитической активностью из молока рожениц и крови больных ВИЧ-инфекцией

Для исследования субстратной специфичности поликлональных ^О крови больных ВИЧ-инфекцией и молока здоровых доноров использовали различные индивидуальные белки молока и сыворотки крови человека, животных, а также обратную транскриптазу ВИЧ-1 ^О крови больных ВИЧ-инфекцией эффективно гидролизовали ОТ, ЧСА и Р-казеины молока человека и коровы На рис 7 представлены данные по гидролизу белков одним из препаратов в условиях, когда ОТ и ЧСА гидролизованы почти полностью (~100 %) до коротких ол иго пептид о в, а Р-казеин крупного рогатого скота (в норме представлен 2 белковыми полосами) и ¡3-казеин человека в несколько в меньшей степени В то же время, ни один из препаратов ^О не гидролизовал с заметной скоростью в этих условиях другие белки человека а-лактальбумин, лактоферрин, лизоцим, а также а-лактальбумин крупного рогатого скота (рис. 7)

к'Да Рис 7 БОБ-электро-94 форетический анализ ^О-^ зависимого гидролиза различных белков (АТ крови больных ВИЧ-20 инфекцией) Дор 1, 2 -•*- 14,4 лактальбумин, 3,4 - казеин молока коровы, 5, 6 -лактоферрин человека, 7, 8 - казеин молока человека, 9, 10 - ревертаза ВИЧ-1, 11, 12- лизоцим человека, 13, 14 - человеческий сывороточный альбумин (нечетные дорожки - реакция в присутствии, а четные - в отсутствие АТ), 15 - белковые маркеры

Относительная скорость гидролиза трех белков-субстратов варьировала от препарата к препарату, но большая часть проанализированных препаратов гидролизовала с большей эффективностью В-казеин (~50%), чем ОТ (-34%) или ЧСА (-36%)

При исследовании субстратной специфичности протеолитической активности б^А молока здоровых рожениц (рис 8) было показано, что

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ш щш

• г: -

они специфически гидролизуют только казенны человеческого и коровьего молока, но не расщепляют ревертазу ВИЧ и другие указанные выше белки

а б в

12 12

Рис 8 а - БОЗ-электрофоретический анализ продуктов гидролиза белковых субстратов Б^А-абзимами молока здоровых доноров Дор 1 - инкубация казеина человека с АТ, 2 - без АТ б - Дор 1 - инкубация суммарного пула белков молока, очищенных от АТ и протеаз, с в^А молока, 2 - без АТ в - Дор 1,2- лактоферрин человека, 3, 4 - лактальбумин, 5, 6 - ревертаза ВИЧ, 7, 8 -лизоцим (нечетные дорожки - в присутствии, четные - в отсутствие АТ), М -белковые маркеры

Взаимодействие абзимов с казеин-сефарозой

Природные абзимы являются поликлональными АТ, представляющими собой набор моноклональных АТ к различным антигенам, которые иногда можно эффективно разделить на отдельные субфракции при хроматографии на аффинных сорбентах по сродству к соответствующему субстрату

Данные аффинной хроматографии ^О крови больных ВИЧ-инфекцией на казеин-сефарозе (рис. 9) свидетельствовали о том, что ~5% гомогенного препарата ^С имеет повышенное сродство к иммобилизованному казеину В то же время, фракция АТ, которая не связывается с сорбентом, как и фракция с повышенным сродством к казеину, проявляли активность в гидролизе субстратов (рис. 9, а), что свидетельствует о гетерогенности пула природных абзимов по сродству к казеину

В зависимости от индивида с казеин-сефарозой связывалось 30^15% всего пула поликлональных ^С крови больных ВИЧ-инфекцией Известно, что некоторые АТ являются полиреактивными и с тем или иным сродством могут взаимодействовать с различными лигандами, включая нуклеиновые кислоты и различные белки Таким образом, нельзя

Рис 9 Профили оптической плотности и относительных каталитических активностей при аффинных хроматографиях препаратов ^О крови больного ВИЧ-инфекцией (а) и э^А молока здорового донора (б) на казеин-сефарозе Относительная активность АТ-зависимого гидролиза а - ОТ — (А), плазмидной ДНК (•) и Р-казеина (■), б - Р-казеина (о), (—) - оптическая плотность при Х=280 нм

исключить, что часть АТ, адсорбированных казеин-сефарозой, взаимодействует с казеином неспецифически или за счет их полиреактивности Чтобы проверить это предположение, был проведен анализ активности АТ, связавшихся с казеин-сефарозой, в гидролизе ДНК и ОТ (рис. 9 а) Основная часть абзимов с ДНКазной активностью элюировалась при нанесении 1§в на колонку Интересно, что субфракции абзимов, активные в гидролизе ОТ, распределялись между первым и вторым пиком почти поровну Не исключено, что такое взаимодействие реализуется в связи с повышенной полиспецифичностью АТ, нарабатываемых при ВИЧ-инфекции В целом, эти данные свидетельствовали о том, что часть АТ, имеющих сродство к казеин-сефарозе, тем не менее, не являются антителами против этого белка

Аффинная хроматография б^А молока на казеин-сефарозе приводила к частичному разделению пула АТ молока на субфракции во время нанесения (рис. 9, 6), была выделена небольшая фракция АТ, обладающая повышенным сродством к казеин-сефарозе и проявляющая высокую казеин-гидролизующую активность Эти данные свидетельствовали о поликлональности э^А абзимов молока рожениц и их гетерогенности по сродству к казеину

Кинетические характеристики реакций гидролиза субстратов

В результате последовательных аффинных хроматографий фракций АТ, не обладающих сродством к казеин-сефарозе, сначала на альбумин-сефарозе, а затем на ревертаза-сефарозе были получены субфракции поликлональных АТ, имеющие повышенное сродство к альбумину и к обратной транскриптазе В обоих случаях элюцию АТ с аффинных сорбентов проводили с помощью линейного градиента концентраций

соли Данные субфракции составляли -1% от общего количества АТ, нанесенного на сорбент Полученные фракции были использованы для оценки кинетических параметров реакции протеолитического расщепления субстратов (табл. 3)

Таблица 3 Кинетические параметры, характеризующие реакцию гидролиза различных субстратов иммуноглобулинами класса в из крови больных ВИЧ-инфекцией* ____

Субстрат Км,М ксаЪ мин"1** кса! /Км, мин"1 МГ1

Ревертаза ВИЧ (4,9 ±0,5) 10"6* (2,2 ± 0,3) 10"3 4,5 103

Р-Казеин (5,3 ± 0,5) 10'6 (2,0 ±0,1) 10"2 3,86 10'

ЧСА (1,8 ±0,6) 10"8 (3,6 ± 0,2) Ю"2 2 10"'

* - Приведены усредненные данные трех экспериментов ** - ки,, определяли по формуле кс,«=У,шч / [АТ], где [АТ] - общая концентрация белка в реакционной смеси Погрешность измерений не превышала 20-40%

Полученные величины Км для белковых субстратов в реакции, катализируемой АТ крови больных ВИЧ-инфекцией (табл. 3), были сопоставимы с полученными ранее величинами Км для тиреоглобулина и АТ больных тиреоидитом Хашимото (3,9 10"8 М), а также для анти-ВИП антител больных астмой (3,8 10"8-1,2 10"7 М) только в случае ЧСА Высокие значения Км белковых субстратов в реакции АТ-зависимого гидролиза р-казеина и ОТ ВИЧ свидетельствовали о низкой эффективности связывания этих субстратов

В абзимологии принято характеризовать относительную скорость гидролиза с помощью величин кса(, и эти значения обычно определяют нижний предел возможных значений параметров, характеризующих скорость реакции Значения кса[ при гидролизе субстратов антителами из крови больных ВИЧ-инфекцией уменьшались в ряду р-казеин > ревертаза ВИЧ-1 > ЧСА

Гидролиз белковых субстратов абзимами молока здоровых доноров

Кинетические параметры, характеризующие реакцию гидролиза казеина человека поликлональными фракционированными на казеин-сефарозе антителами молока здоровых рожениц были определены в оптимальных условиях Значение Км для казеина было оценено равным (7,3 ± 1,2) мкМ Величина кса, была оценена как (0,75 ±0,05) мин"1 Величина Км для взаимодействия фракционированных на казеин-сефарозе э^А молока человека с 13-казеином была того же порядка, что и определенная для казеина в реакции гидролиза его антителами крови больных ВИЧ-инфекцией Но для реакции, катализируемой поликлональными фракционированными на казеин- сефарозе б^А-

абзимами, эффективность гидролиза была на 2 порядка выше, чем для фракционированных аффинной хроматографией JgG крови больных ВИЧ-инфекцией.

Определение кинетических параметров реакций гидролиза различных пептидов антителами молока показало увеличение сродства пептидов в ряду Boc-IEGR-MCA > Boc-VLK-7ÉCA> PFR-MCA. Эффективность гидролиза пептидов антителами молока здоровых доноров сильно варьировала от донора к донору. Следует отметить, что сродство slgA молока к казеину (в терминах Км) было выше, чем к коротким пептидам (2,3-10" -5,8 ЩгМ). Скорее всего, такие пептиды не могут взаимодействовать со «сем участком AT, предназначенном для узнавания казеина Учитывая это, следует полагать, что основное сродство AT к казеину обеспечивается вариабельным участком абзимов, непосредственно прилегающим к их каталитическому центру.

А пилил продуктов гидролиза казеина различными антителами и каноническими Лротеазами

Для определения продуктов гидролиза исследуемыми антителами крови, молока и классическими лротеазами был использован [12Р]-мече-ный казеин, фосфор ил ированный килазами молока (рис. 10). В настоящей

а

1'ис. И), л — 5ЕЙ5-электрофоретически й анализ (радиоавтограф) продуктов I идролиза р-казеина Каноническими лротеазами и ¡¡¡цЛ-абчммами молока здоровой роженицы. Дор 1,2,3 [1гР] р-казеин инкубировали с к^Л в течение 20, 40, и 60 мин, соответственно, 4, 5 инкубация с трипсином, 6, 7 инкубация с протеиназой К, 8 инкубация с химотрипсином. 9 - инкубация казеина в отсутствие ферментов. Слева показано положение 1! основных продуктов гидролиза казеина $1ёА молока человека б - Гидролиз казеина крови больных ВИЧ-ипфекпией. Дор, 1 - инкубация р* казеина в отсутствие АТ, 2 - инкубация 1 ^гС 1 от первого больною, 3. 4 - инкубация с от второго больного, 5 -инкубация ^О третьего больного ВИЧ-инфекцией. Слева стрелками показано положение 7 основных продуктов гидролиза казеина первым препаратом 1цО.

работе проведено сравнение продуктов гидролиза казеина крови

больных ВИЧ-инфекцией, *]»А молока здоровых рожениц и нескольких канонических протеаз. Для з^А-абзимов молока человека обнаружено образование около 11 детектируемых [32Р]-мечеНЫХ пол и пептидов. Продукты гидролиза казеина с молекулярными массами от 28 до 12 кДа для трипсина, химотрипсина и протеиназы К не совпадали с таковыми для молочных 51§А абзимов (рис. 10, а).

Картины гидролиза казеина тремя различными препаратами крови больных ВИЧ-инфекцией значительно различались (рис. 10, б). В первом случае наблюдали образование н основном семи полипептидов, во втором - шести, а в третьем - четырех.

Следует отметить, что всс исследованные препараты я1оА из молока человека демонстрировали практически одинаковые паттерны гидролиза (}-казеина. 13 то же время, из сыворотки крови исследованных больных ВИЧ-инфекцией, демонстрировали три типа различных наборов продуктов гидролиза казеина, которые отличались от таковых для АТ молока человека и для канонических протеаз.

Определение ч ипа протеолитической активности антител

Для установления типа протеолитической активности в работе были использованы специфические ингибиторы протеаз. Иодацетамид, йепстатинА н леипептин на казеин-гидролизующую активность антител крови больных ВИЧ-инфекцией и и ¡>^А молока пе влияли. Добавление ЭДТА в реакционную смесь с крови пе подавляло заметным образом

Рис. 11. а - Анализ в БОЗ-ПААГ продуктов гидролиза р-казеина до и после обработки ингибиторами протеаз 1цО-абзимов криви больных ВИЧ-инфекцией. Дор. 1,2- ЭДТА, 3, 4 - А£В5Р, 5, 6 - Иодацетамид, 7, 8 -леипептин, 9, 10 - пеп-статин А,

11 - АТ + казеин без ингибитора,

12 - р-казеин, инку-бировапный без А Г. 6 - Анализ продуктов гидролиза казеина в1цА молока здоровых доноров. Дор. 1,2 — инкубация субстрата без АТ, 3, 4

- АЕВЗР, 5, 6 лейпептин, 7, 8 -иодацетамид, 9, 10 — пепстатин А, 11, 12 - 11 и 12-АТ+ казеин. 13

- казеин в отсутствие ингибитора (гель окрашен серебром).

2 3 4 5 (1 7 Я 9 [01112 кДя

6 1 2 3 4 ? 6 ? § 1 1И11 П 13

ЧСА -г

активности АТ (рис 11, а) Добавление АЕВБР приводило к 90% ингибированию реакции гидролиза казеина АТ крови больных ВИЧ-инфекцией Добавление в реакционную смесь к б^А молока АЕВБР приводило к ингибированию реакции гидролиза на 10-50%, в то время как при добавлении ЭДТА наблюдалось ингибирование реакции гидролиза на 70-90% в зависимости от донора молока Полученные данные свидетельствовали о том, что казеин-гидролизующие больных ВИЧ-инфекцией, как и большая часть ранее открытых абзимов с протеолитической активностью в основном представлены субфракциями АТ с протеазной активностью серинового типа, а б^А молока содержат как протеазы серинового типа, так и абзимы, активируемые ионами металлов

Антитела-металлопротеиназы молока здоровых рожениц

В данной работе установлено, что наряду с АТ с активным центром, подобным сериновым протеазам, в пуле антител молока присутствуют абзимы, для активации которых необходимы ионы металлов Для выделения суммарной субфракции б1§А проводили хроматографию на Вепгаппёте-БерЬагозе Было показано, что абзимы-протеазы серинового типа, выделенные по стандартной методике, сорбируются на этом носителе, а АТ-метаплопротеазы элюируются в свободном объеме колонки

Ъ\

ш''

|М1| ч>|

[Мс] чМ

Рис 12 Зависимости относительной активности одного из препаратов э^А в реакции гидролиза казеина от концентрации различных ионов металлов

Анализ активности фракций в присутствии различных концентраций ионов металлов показал увеличение глубины реакции гидролиза В-казеина в присутствии ионов Са2+, Ре2+, №2+ и Со"+ (рис 12, я) Наибольшее увеличение глубины гидролиза было получено при добавлении ионов Ре2+ Ингибирование реакции гидролиза наблюдалось при добавлении ионов Ъхс\ Мп2+, Си2+ и (рис 12, 6)

выводы

1 Впервые в молоке здоровых рожениц и в крови ВИЧ-инфицированных больных обнаружены абзимы с протеолитической активностью На основании общепринятых критериев сделано заключение, что протеолитическая активность в^А молока здоровых доноров, а также протеолитическая и ДНК-гидролизующая активности 1§С из сыворотки крови ВИЧ-инфицированных больных являются их собственным свойством

2 Показано, что, в отличие от канонических протеаз, поликлональные крови ВИЧ-инфицированных больных, проявляют различное сродство к казеину, человеческому сывороточному альбумину и обратной транскриптазе ВИЧ и эффективно гидролизуют только эти, а не другие исследованные белки Показано, что э^А молока здоровых доноров эффективно гидролизуют только казеин, проявляя более высокую скорость гидролиза по сравнению с при ВИЧ-инфекции Продукты зависимого от абзимов гидролиза казеина отличаются от таковых в случае трипсина, химотрипсина и протеиназы К Кроме того, для поликлональных Б^А-абзимов молока продукты протеолитического расщепления были практически одинаковыми

3 Установлено, что суммарный пул антител крови больных ВИЧ-инфекцией содержит в основном абзимы с активным центром, подобным сериновым протеазам, в то время как пул э^А молока рожениц содержит также абзимы, для активации которых необходимы ионы металлов Активность этих абзимов возрастает при добавлении ионов металлов в следующем порядке Со3+ > Са2+ > М13+ > Ре3+, и ингибируется ионами гп2+, Мп2+, Си2+ и мё2+

4 Показано, что у ВИЧ-инфицированных больных выявляемость протеолитической и нуклеазной активностей антител зависит от стадии и особенностей течения заболевания Детекция уровня активности абзимов может служить дополнительным критерием в оценке скорости прогрессии ВИЧ-инфекции

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1 Odintsova Е S , Buneva V N , Nevinsky G A Casein-hydrolyzmg activity of slgA antibodies from human milk J Mol Recogmt 2005 V 18(5), P 413^121

2 Одинцова E С . Харитонова M A, Барановский А Г , Сизякина JIП , Бунева В Н, Невинский Г А Протеолитическая активность IgG антител из крови больных синдромом приобретенного иммунодефицита человека Биохимия 2006 Т 71(3), С 320-332

3 Одинцова Е С . Харитонова М А , Барановский А Г, Сизякина Л П , Бунева В Н, Невинский Г А ДНК-азная активность IgG антител из крови больных синдромом приобретенного иммунодефицита человека Молекулярная биология 2006 Т 40(5) С 857-864

4 Одинцова Е С , Бунева В Н , Невинский Г А Протеазная активность антител больных СПИД Труды 1-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Естественные науки Самара СТГУ 2005 Ч 29 С 72-75

Изд лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 30 08 2007 Формат бумаги 60 х 84/16 Бумага № 1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Печ л 1.2 Уч-изд л 1.0 Тираж 100 экз Заказ №80 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Одинцова, Елена Сергеевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Природные иммуноглобулины

1.1.1. Структура антител и основы их разнообразия

1Л .2. Антитела - ферменты

1.1.3. Взаимодействия антигенов с антителами

1.1.4. Уровни антител при аутоиммунных заболеваниях

1.2. ДНКазная активность антител

1.2.1. Ферменты, гидролизующие ДНК

1.2.2. Антитела к ДНК и абзимы с нуклеазными активностями при различных патологиях

1.2.3. Механизм действия ДНК-гидролизующих антител

1.3. Протеазы и антитела с протеолитической активностью

1.3.1. Протеазы человека

1.3.2. Абзимы-протеазы

1.4. Иммуноглобулины молока человека с каталитическими активностями

1.4.1. Компоненты молока человека и их роль

1.4.2. Иммуноглобулины молока

1.4.3. Абзимы молока человека

1.5. Природные каталитически активные антитела и их возможная биологическая роль в норме и при патологии

1.6. ВИЧ-инфекция

1.6.1. Некоторые особенности ВИЧ-инфекции

1.6.2. Функционирование системы иммунитета при вирусных инфекциях

1.6.2.1. Клеточный иммунный ответ

1.6.2.2. Гуморальный иммунный ответ

1.6.2.3. Нарушения гуморального иммунитета и аутоиммунный ответ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Методы

2.2.1. Очистка иммуноглобулинов крови больных ВИЧ-инфекцией

2.2.2. Выделение иммуноглобулинов из молока человека

2.2.3. Выделение казеина из молока человека

2.2.4. Выделение ревертазы

2.2.5. Концентрирование препаратов белков

2.2.6. Определение концентрации белка

2.2.7. Электрофоретический анализ белков

2.2.8. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивание коллоидным раствором серебра

2.2.9. Иммуноферментное окрашивание IgG и их субъединиц

2.2.10. Определение протеолитической активности антител

2.2.11. Определение ДНКазной активности антител

2.2.12. Определение типа протеолитической активности иммуноглобулинов методом ингибиторного анализа

2.2.13. Определение субстратной специфичности иммуноглобулинов

2.2.14. Определение оптимального значения рН в реакции гидролиза казеина

2.2.15. Тестирование казеин-гидролизующей активности антител in situ после SDS-электрофореза

2.2.16. Тестирование казеин-гидролизующей активности антител in situ в геле, содержащем субстрат

2.2.17. Тестирование ДНК-гидролизующей активности in situ в геле, содержащем субстрат

2.2.18. Исследование взаимодействия абзимов с аффинными сорбентами

2.2.19. Гидролиз казеина классическими протеазами: трипсином, химотрипсином, протеиназой К

2.2.20. Фосфорилирование В-казеина киназами молока

2.2.21. Разделение молекул антител с легкими цепями к- и Х-типа

2.2.22. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов

2.2.23. Гидролиз пептидов

2.2.24. Определение содержания металлов в образцах антител

2.2.25. Хроматография на Benzamidine-Sepharose

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение иммуноглобулинов из крови и молока человека

3.2. Скрининг протеолитической и ДНК-гидролизующей активности в препаратах антител крови больных ВИЧ-инфекцией

3.3. Доказательство наличия у антител из сыворотки крови больных ВИЧ-инфекцией и молока здоровых доноров каталитических функций

3.3.1. Гель-фильтрация в условиях «кислого шока»

3.3.2. Взаимодействие абзимов с аффинными сорбентами

3.3.3. Анализ активности антител в геле (зимография)

3.4. ДНК-гидролизующая активность иммуноглобулинов крови больных ВИЧ-инфекцией

3.4.1. Определение оптимума рН реакции гидролиза ДНК-абзимами крови

3.4.2. Кинетические характеристики антитело-зависимого jq гидролиза ДНК

3.5. Исследование ферментативных свойств протеолитически активных антител

3.5.1. Субстратная специфичность антител с протеолитической 72 активностью из молока рожениц и крови больных ВИЧ-инфекцией

3.5.2. Определение оптимума рН реакции гидролиза казеина

3.5.3. Взаимодействие абзимов с казеин-сефарозой

3.5.4. Взаимодействие абзимов с альбумин-сефарозой и ревертаза- jg сефарозой

3.5.5. Кинетические характеристики реакции гидролиза белковых субстратов

3.5.5.1. Гидролиз антителами из сыворотки крови больных 79 ВИЧ-инфекцией

3.5.5.2. Гидролиз белковых субстратов sIgA-абзимами go молока здоровых доноров

3.5.5.3. Анализ продуктов гидролиза казеина различными антителами и протеазами

3.6. Определение типа протеолитической активности антител

3.7. Определение типа легких цепей slgA, участвующих в гидролизе 39 казеина

3.8. Антитела-металлопротеиназы молока здоровых рожениц

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природные иммуноглобулины как нуклеазы и протеазы в норме и при ВИЧ-инфекции"

Природные антитела, представленные разнообразным репертуаром циркулирующих иммуноглобулинов, являются частью иммунной системы и обеспечивают выведение патогенных веществ из кровотока, следовательно, предотвращают их распространение по организму. Открытие каталитической активности антител изменило традиционные представления о роли и функции иммуноглобулинов в иммунной системе. Принципиальная возможность индукции каталитически активных антител - абзимов (антител-ферментов - ABZYME-AntiBody-enZYME) была высказана в 1948 г. JI. Полингом, который отметил общность узнавания антигена антителом и переходного состояния химической реакции ферментом.

Новые перспективы в области абзимологии появились в 1989 г. с открытием первых природных каталитически активных иммуноглобулинов класса G, расщепляющих вазоактивный нейропептид в сьюоротке крови больных астмой [1]. Аутоиммунные заболевания характеризуются наличием в организме высокого титра аутоантител -антител к эндогенным антигенам. Каталитически активные антитела обнаруживают у пациентов с аутоиммунными заболеваниями такими, как астма [1], системная красная волчанка [2-4], полиартрит [3], первичная микседема (болезнь Хашимото или аутоиммунный тиреоидит) [5], рассеянный склероз [6-8]; а также гепатитом и [3], лейкемией [9], т. е. при тех заболеваниях, когда происходит «срыв» толерантности к собственным антигенам и наработка антител к ним.

Показано, что во время беременности и особенно после начала лактации организм женщины временно характеризуется иммунным статусом, сходным с таковым для больных с аутоиммунными заболеваниями [10]. В молоке здоровых рожениц обнаружены slgA с ДНКазной, РНКазной [10, И], АТРазной [12], протеинкиназной [13-15], полисахарид-гидролизующей [16] и полисахаридкиназной [17,18], а также липидкиназной [17, 18] активностями. В то же время, согласно нашим данным, антитела из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (рак матки, молочной железы, кишечника), не проявляли заметной каталитической активности [10].

СПИД - вирусное заболевание, связанное с серьезным поражением иммунной системы, представляющее собой важную медицинскую и социальную проблему. Особенность строения вирусной частицы заключается в наличии липидной оболочки -фрагмента клеточной мембраны хозяина с встроенными и экспрессированными на поверхности гликопротеинами вируса и белками собственного организма. Это может служить одним из пусковых механизмов развития аутоиммунных реакций. В материалах Международного Симпозиума по каталитически активным антителам (1994 г.) опубликована информация об обнаружении ДНКазной активности в препаратах AT из крови больных СПИД. Однако ни доказательства принадлежности нуклеазной активности непосредственно антителам, ни свойства данных абзимов в литературе не приведены и не описаны. У беременных и кормящих грудью женщин аутоиммунные процессы имеют временный характер и исчезают после окончания лактации. Аутоиммунные реакции при ВИЧ-инфекции с развитием заболевания только усугубляются. До сих пор не установлены как механизмы индукции, так и биологическая роль абзимов в норме и при аутоиммунных патологиях.

Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе и сравнении ферментативных свойств антител с протеолитической и нуклеазной активностями из крови ВИЧ-инфицированных больных и молока здоровых доноров.

В процессе работы необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг протеолитической и ДНК-гидролизующей активностей в препаратах антител крови ВИЧ-инфицированных больных;

- проверить критерии отнесения каталитических активностей антител из крови ВИЧ-инфицированных больных и молока рожениц непосредственно к иммуноглобулинам;

- изучить ферментативные свойства исследуемых абзимов с протеолитической и ДНКазной активностями (рН- и металл-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза), и сравнить их с аналогичными активностями классических ферментов;

- исследовать корреляции выявляемости каталитических активностей со стадиями заболевания и скоростью развития ВИЧ-инфекции.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Одинцова, Елена Сергеевна

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые в молоке здоровых рожениц и в крови ВИЧ-инфицированных больных обнаружены абзимы с протеолитической активностью. На основании общепринятых критериев сделано заключение, что протеолитическая активность slgA молока здоровых доноров, а также протеолитическая и ДНК-гидролизующая активности IgG из сыворотки крови ВИЧ-инфицированных больных являются их собственным свойством.

2. Показано, что, в отличие от канонических протеаз, поликлональные IgG крови ВИЧ-инфицированных больных, проявляют различное сродство к казеину, человеческому сывороточному альбумину и обратной транскриптазе ВИЧ и эффективно гидролизуют только эти, а не другие исследдованные белки. Показано, что slgA молока здоровых доноров эффективно гидролизует только казеин, проявляя более высокую скорость гидролиза по сравнению с IgG при ВИЧ-инфекции. Продукты зависимого от абзимов гидролиза казеина отличаются от таковых в случае трипсина, химотрипсина и протеиназы К. Кроме того, для поликлональных sIgA-абзимов молока продукты протеолитического расщепления были практически одинаковыми.

3. Установлено, что суммарный пул антител крови больных ВИЧ-инфекцией содержит в основном абзимы с активным центром, подобным сериновым протеазам, в то время как пул slgA молока рожениц содержит также абзимы, для активации которых необходимы ионы металлов. Активность этих абзимов возрастает при добавлении ионов металлов в следующем порядке: Со3+ > Са2+ > Ni3+ > Fe3+; и ингибируется ионами Zn2+, Mn2+, Си2+ и Mg2+.

4. Показано, что у ВИЧ-инфицированных больных выявляемость протеолитической и нуклеазной активностей антител зависят от стадии и особенностей течения заболевания. Детекция уровня активности абзимов может служить дополнительным критерием в оценке скорости прогрессии ВИЧ-инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Одинцова, Елена Сергеевна, Новосибирск

1. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science 1989, V. 244, P. 1158-1162.

2. Поверенный A.M. Проблемы медицинской химии. M.; 1973.

3. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smimov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science 1992, V. 256, P. 665-667.

4. Li L., Kaveri S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Paul S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995, V. 764, P. 570-572.

5. Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Alexandrova E.S., Koralewski F., Demin A.V., Titov M.I., Avalle В., Tramontano A., Paul S., Thomas D., et al. Enzyme mimicry by the antiidiotype antibody approach. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, V. 97, P. 13526-13531.

6. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева B.H. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии. Биохимия 2000, т. 65, С. 1473-1478.

7. Kit Y.Y., Kim A.A., Sidorov V.N. Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein. Biomed. Sci. 1991, V. 2, P. 201-204.

8. Nevinsky G.A., Kit Y., Semenov D.V., Khlimankov D., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein phosphorylation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998, V. 75, P. 77-91.

9. Kit Y., Semenov D.V., Nevinsky G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. Biochem. Mol. Biol. Int. 1996, V. 39, P. 521-527.

10. Savel'ev A.N., Kanyshkova T.G., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Eneyskaya E.V., Filatov M.V., Nevinsky G.A., Neustroev K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. Clin. Chim. Acta. 2001, V. 314,141-152.

11. Karataeva N.A., Gorbunov D., Prokudin I.V., Buneva V.N., Kulminskaya A.A., Neustroev K.N., Nevinsky G.A. Human milk antibodies with polysaccharide kinase activity. Immunol. Lett. 2006, V. 103, P. 58-67.

12. Каратаева H.A., Невинский Г.А. Ферменты фосфорилирующие липиды и полисахариды. Биохимия 2007, т. 72, С. 367-379.

13. Попова Н.А. Иммунология. 2-е изд. Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т; 2006.

14. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М. "Медицина"; 2000.

15. Planque S., Bangale Y., Song X.T., Karle S., Taguchi H., Poindexter В., Bick R., Edmundson A., Nishiyama Y., Paul S. Ontogeny of proteolytic immunity: IgM serine proteases. J. Biol. Chem. 2004, V. 279, P. 14024-14032.

16. Gololobov G., Sun M., Paul S. Innate antibody catalysis. Mol Immunol 1999, V. 36, P. 12151222.

17. Kalaga R., Li L., O'Dell J.R., Paul S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1995, V. 155, P. 2695-2702.

18. Paul S., Nishiyama Y., Planque S., Taguchi H. Theory of proteolytic antibody occurrence. Immunol. Lett. 2006, V. 103, P. 8-16.

19. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Catalytic antibodies. Science 1986, V. 234, P.1566-1570.

20. Pollack S.J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an antibody. Science 1986, V. 234, P. 1570-1573.

21. Janda K.D., Schloeder D., Benkovic S J., Lerner R.A. Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science 1988, V. 241, P. 1188-1191.

22. Йегер JI. Клиническая иммунология и аллергология. М, Медицина; 1990.

23. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system. Ann. Immunol. 1974, V. 125, P. 373-398.

24. Friboulet A., Izadyar L., Avalle В., Roseto A., Thomas D, Abzyme generation using an anti-idiotypic antibody as the "internal image" of an enzyme active site. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994, V. 47, P. 229-237; discussion P. 237-229.

25. Hu R., Xie G.Y., Zhang X., Guo Z.Q., Jin S. Production and characterization of monoclonal anti-idiotypic antibody exhibiting a catalytic activity similar to carboxypeptidase A. J. Biotechnol. 1998, V. 61, P. 109-115.

26. Puccetti A., Madaio M.P., Bellese G., Migliorini P. Anti-DNA antibodies bind to DNase I. J. Exp. Med. 1995, V. 181, P. 1797-1804.

27. Wilson I.A., Stanfield R.L. Antibody-antigen interactions: new structures and new conformational changes. Curr.Opin. Struct. Biol. 1994, V. 4, P. 857-867.

28. Tsou C.L. Active site flexibility in enzyme catalysis. Ann. N YAcad. Sci. 1998, V. 864, P. 18.

29. Post C.B., Ray W.J. Jr. Reexamination of induced fit as a determinant of substrate specificity in enzymatic reactions. Biochemistry 1995, V. 34, P. 15881-15885.

30. Jimenez R., Salazar G., Baldridge K.K., Romesberg F.E. Flexibility and molecular recognition in the immune system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, V. 100, P. 92-97.

31. Braden B.C., Poljak R.J. Structural features of the reactions between antibodies and protein antigens. Faseb J. 1995, V. 9, P. 9-16.

32. Paul S., Tramontano A., Gololobov G., Zhou Y.X., Taguchi H., Karle S., Nishiyama Y., Planque S., George S. Phosphonate ester probes for proteolytic antibodies. J. Biol. Chem. 2001, V. 276, P. 28314-28320.

33. Sun M., Gao Q.S., Kirnarskiy L., Rees A., Paul S. Cleavage specificity of a proteolytic antibody light chain and effects of the heavy chain variable domain. J. Mol. Biol. 1997, V. 271, P. 374-385.

34. Hatiuchi K., Hifumi E., Mitsuda Y., Uda T. Endopeptidase character of monoclonal antibody i41 -7 subunits. Immunol. Lett. 2003, V. 86, P. 249-257.

35. Davies D.R., Padlan E.A., Sheriff S. Antibody-antigen complexes. Annu. Rev. Biochem. 1990, V. 59, P. 439-473.

36. Sun M., Li L., Gao Q.S., Paul S. Antigen recognition by an antibody light chain. J. Biol. Chem. 1994, V. 269, P. 734-738.

37. Thiagarajan P., Dannenbring R., Matsuura K., Tramontano A., Gololobov G., Paul S. Monoclonal antibody light chain with prothrombinase activity. Biochemistry 2000, V. 39, P. 6459-6465.

38. Mei S., Mody В., Eklund S.H., Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J. Biol. Chem. 1991, V. 266, P. 15571-15574.

39. Paul S., Sun M., Mody R., Tewary H.K., Stemmer P., Massey R.J., Gianferrara Т., Mehrotra S., Dreyer Т., Meldal M., et al. Peptidolytic monoclonal antibody elicited by a neuropeptide. J. Biol. Chem. 1992, V. 267, P. 13142-13145.

40. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stevens F.J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment. J. Biol. Chem. 1995, V. 270, P. 15257-15261.

41. Петров P.B. Иммунология M.: Медицина; 1987.

42. Леках И.В., Ротт Г.М., Поверенный A.M. Гетерогенность и авидность аутоантител, реагирующих с ДНК. Мол. биол. 1991, т. 25, С. 1391-1399.

43. Гармашова Н.В., Казанский В.Е., Тышкевич О.Б., Доронин Б.М., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Антитела к ДНК в крови больных клещевым энцефалитом. Мол. биол. 2004, т. 38, С. 723-730.

44. Барановский А.Г., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Дезоксирибонуклеазы человека. Биохимия 2004, т. 69, С. 725-742.

45. Peeva Е., Diamond В. Anti-DNA antibodies (Structure, assembly, and diversity). Edited by Lahita GL. San Diego: Elsevier; 2004.

46. Lafer E.M., Moller A., Nordheim A., Stollar B.D., Rich A. Antibodies specific for left-handed Z-DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, V. 78, 3546-3550.

47. Tan E.M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): their immunobiology and medicine. Adv. Immunol 1982, V. 33, P. 167-240.

48. Tan E.M. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 1989, V. 44, P. 93-151.

49. Friou G.J. Identification of the nuclear component of the interaction of lupus erythematosus globulin and nuclei. J. Immunol. 1958, V. 80, P. 476-481.

50. Rodriguez-Sanchez J.L., Gelpi С., Juarez С., Hardin J.A. Anti-NOR 90. A new autoantibody in scleroderma that recognizes a 90-kDa component of the nucleolus-organizing region of chromatin. J. Immunol. 1987, V. 139, P. 2579-2584.

51. Moroi Y., Peebles C., Fritzler M.J., Steigerwald J., Tan E.M. Autoantibody to centromere (kinetochore) in scleroderma sera. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, V. 77, P. 1627-1631.

52. Lerner M.R., Steitz J.A. Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythematosus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, V. 76, P. 5495-5499.

53. Andre-Schwartz J., Datta S.K., Shoenfeld Y., Isenberg D.A., Stollar B.D., Schwartz R.S. Binding of cytoskeletal proteins by monoclonal anti-DNA lupus autoantibodies. Clin. Immunol. Immunopathol. 1984, V. 31, P. 261-271.

54. Andrievskaia O.A., Buneva V.N., Zabara V.G., Naumov V.A., Iamkovoi V.I., Nevinskii G.A. Catalytic heterogeneity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus. Med. Sci. Monit. 2000, V. 6, P. 460-470.

55. Бунева B.H., Андриевская O.A., Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонуклеотидами. Молекуляр биология 1994, т. 28, С. 738-743.

56. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 1995, V. 154, P. 3328-3332.

57. Барановский А.Г. Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук 2004, Новосибирск.

58. Gololobov G.V., Mikhalap S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.F., Gabibov A.G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994, V. 47, P. 305-314; discussion P. 314-315.

59. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Schourov D.V., Chernova E.A., YadavR.P. DNA-hydrolyzing autoantibodies.^/. Biochem. Biotechnol. 1994, V. 47, P. 293302.

60. Андриевская O.A. РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук 1998, Новосибирск.

61. Marion T.N., Krishnan M.R., Desai D.D., Jou N.T., Tillman D.M. Monoclonal anti-DNA antibodies: structure, specificity, and biology. Methods 1997, V. 11, P. 3-11.

62. Jang Y.J., Stollar B.D. Anti-DNA antibodies: aspects of structure and pathogenicity. Cell Mol. Life Sci. 2003, V. 60, P. 309-320.

63. Radic M.Z., Mackle J., Erikson J., Mol C., Anderson W.F., Weigert M. Residues that mediate DNA binding of autoimmune antibodies. J. Immunol. 1993, V. 150, P. 4966-4977.

64. Gololobov G.V., Rumbley C.A., Rumbley J.N., Schourov D.V., Makarevich O.I., Gabibov A.G., Voss E.W. Jr., Rodkey L.S. DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity. Mol. Immunol. 1997, V. 34, P. 1083-1093.

65. Kim K., Keller M.A., Heiner D.C. Immunoglobulin G subclasses in human colostrum, milk and saliva. Acta Paediatr 1992, V. 81, P. 113-118.

66. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука; 1971.

67. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир; 1980.

68. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, т. 1. Под редакцией Антоновой В.К., Браунштейна А.Е. М.: Мир; 1982.

69. Oleksyszyn J., Powers J.C. Amino acid and peptide phosphonate derivatives as specific inhibitors of serine peptidases. Methods Enzymol. 1994, V. 244, P. 423-441.

70. Sampson N.S., Bartlett P.A. Peptidic phosphonylating agents as irreversible inhibitors of serine proteases and models of the tetrahedral intermediates. Biochemistry 1991, V. 30, P. 2255— 2263.

71. Bone R., Sampson N.S., Bartlett P.A., Agard D.A. Crystal structures of alpha-lytic protease complexes with irreversibly bound phosphonate esters. Biochemistry 1991, V. 30, P. 2263-2272.

72. Gao Q.S., Sun M., Rees A.R., Paul S. Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. JMol Biol 1995, V. 253, P. 658-664.

73. Liu R., McAllister C., Lyubchenko Y., Sierks M.R. Proteolytic antibody light chains alter beta-amyloid aggregation and prevent cytotoxicity. Biochemistry 2004, V. 43, P. 9999-10007.

74. Shennan D.B., Peaker M. Transport of milk constituents by the mammary gland. Physiol Rev 2000, V. 80, P. 925-951.

75. Говалло В.И. Иммунология репродукции. М: Медицина; 1987.

76. Канышкова Т.Г. Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека. In Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. Новосибирск; 1999.

77. Михеева И.Г., Курасова О.Б., Верещагина Т.Г., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А.А. Роль опиоидных пептидов эндогенного происхождения и бета-казоморфинов в питании детей первых месяцев жизни. Вопросы детской диетологии. 2004, т. 2, С. 21-25.

78. Kumar S., Clarke A.R., Hooper M.L., Home D.S., Law A.J., Leaver J., Springbett A., Stevenson E., Simons J.P. Milk composition and lactation of beta-casein-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, V. 91, P. 6138-6142.

79. Maisel H. Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins. Biopoly. 1997, V. 43, P. 119-128.

80. Hatzoglou A., Bakogeorgou E., Hatzoglou C., Martin PM, Castanas E: Antiproliferative and receptor binding properties of alpha- and beta-casomorphins in the T47D human breast cancer cell line. Eur. J. Pharmacol. 1996, V. 310, P. 217-223.

81. Xanthou M. Immune protection of human milk. Biol. Neonate. 1998, V. 74, P. 121-133.

82. Peterson J.A., Patton S., Hamosh M. Glycoproteins of the human milk fat globule in the protection of the breast-fed infant against infections.' Biol. Neonate. 1998, V. 74, P. 143-162.

83. Бабина C.E., Канышкова Т.Г., Бунева B.H., Невинский Г.А. Лактоферрин -дезоксирибонуклеаза человеческого молока. Биохимия 2004, т. 69, С. 1239-1250.

84. Mestecky J., Russell M.W. Passive and active protection against disorders of the gut. Vet. Q. 1998, V. 20 Suppl 3, P. S83-87.

85. Van de Perre P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine 2003, V. 21, P. 3374-3376.

86. Hanson L.A. Breastfeeding provides passive and likely long-lasting active immunity. Ann Allergy Asthma Immunol 1998, V. 81, P. 523-533; quiz PP. 533-524, 537.

87. Hanson L.A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta. Paediatr. 2000, V. 89, P. 252-258.

88. Herias M.V., Midtvedt Т., Hanson L.A., Wold A.E. Escherichia coli K5 capsule expression enhances colonization of the large intestine in the gnotobiotic rat. Infect. Immun. 1997, V. 65, P. 531-536.

89. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Natural catalityc antibodies abzymes. Edited by Keinan E. Weinheim: WILEY-VCH Velag GmbH&Co; 2005.

90. Каратаева H.A., Бунева B.H., Невинский Г.А. Полисахаридкиназная активность IgG антител из молока человека. Биохимия 2006, т. 71, С. 1488-1504.

91. Бунева В.Н. Природные иммуноглобулины с нуклеазными активностями. Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук 2005.

92. Janeway С. Beneficial autoimmunity? Waft/re 1982, V. 299, P. 396-397.

93. Weksler M.E., Relkin N., Turkenich R., LaRusse S., Zhou L., Szabo-P. Patients with Alzheimer disease have lower levels of serum anti-amyloid peptide antibodies than healthy elderly individuals. Exp. Gerontol. 2002, V. 37, P. 943-948.

94. Сучков C.B., Габибов А.Г. Введение в медицинскую абзимологию: состояние проблемы и перспективы. Вестник РАМН 2005, т. 10, С. 44-53.

95. Белозеров Е.С., Змушко Е.И. ВИЧ-инфекция: Питер; 2003.

96. Paul W.E. Fundamental immunology edn 4-th: Lippincott-Raven; 1999.

97. Фаучи Э. Внутренние болезни no Тисни P. Харрисону: "Практика" McGraw-Hill; 2002.

98. Sodroski J., Goh W.C., Rosen C., Campbell K., Haseltine W.A. Role of the HTLV-III/LAV envelope in syncytium formation and cytopathicity. Nature 1986, V. 322, P. 470-474.

99. Weissman D., Barker T.D., Fauci A.S. The efficiency of acute infection of CD4+ T cells is markedly enhanced in the setting of antigen-specific immune activation. J. Exp. Med. 1996, V. 183, P. 687-692.

100. Banda N.K., Bernier J., Kurahara D.K., Kurrle R., Haigwood N. Sekaly R.P., Finkel Т.Н. Crosslinking CD4 by human immunodeficiency virus gpl20 primes T cells for activation-induced apoptosis. J. Exp. Med. 1992, V. 176, P. 1099-1106.

101. Pantaleo G., Graziosi C., Butini L., Pizzo P.A., Schnittman S.M., Kotler D.P., Fauci A.S. Lymphoid organs function as major reservoirs for human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, V. 88, P. 9838-9842.

102. Weliky D.P., Bennett A.E., Zvi A., Anglister J., Steinbach P.J., Tycko R. Solid-state NMR evidence for an antibody-dependent conformation of the V3 loop of HIV-1 gpl20. Nat. Struct. Biol. 1999, V. 6, P. 141-145.

103. Kwong P.D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature 1998, V. 393, P. 648-659.

104. Laisney I.L., Strosberg A.D. Dual specificity of a human neutralizing monoclonal antibody, specific for the V3 loop of GP120 (HIV-1). Immunol. Lett. 1999, V. 67, P. 185-192.

105. Poignard P., Sabbe R., Picchio G.R., Wang M., Gulizia R.J., Katinger H., Parren P.W., Mosier D.E., Burton D.R. Neutralizing antibodies have limited effects on the control of established HIV-1 infection in vivo. Immunity 1999, V. 10, P. 431-438.

106. Muster Т., Steindl F., Purtscher M., Trkola A., Klima A., Himmler G., Ruker F., Katinge H. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 1993, V. 67, P. 6642-6647.

107. Semenov D.V., Kanyshkova T.G., Karotaeva N.A., Krasnorutskii M.A., Kuznetsova I.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Catalytic nucleotide-hydrolyzing antibodies in milk and serum of clinically healthy human mothers. Med. Sci. Monit. 2004, V. 10, P. BR23-33.

108. Zhou P., Goldstein S., Devadas K., Tewari D., Notkins A.L. Cells transfected with a non-neutralizing antibody gene are resistant to HIV infection: targeting the endoplasmic reticulum and trans-Golgi network. J. Immunol. 1998, V. 160, P. 1489-1496.

109. Ho D.D. Viral counts count in HIV infection. Science 1996, V. 272, P. 1124-1125.

110. Габибов А.Г., Фрибуле А., Тома Д., Демин А.В., Пономаренко Н.А., Воробьев И.И., Пиле Д., Паон М., Александрова Е.С., Телегин Г.В., et al.: Антитела протеазы: подходы к индукции каталитического ответа (обзор). Биохимия 2002, т. 67, С. 1413-1427.

111. Carotenuto P., Looij D., Keldermans L., de Wolf F., Goudsmit J. Neutralizing antibodies are positively associated with CD4+ T-cell counts and T-cell function in long-term AIDS-free infection. Aids 1998, V. 12, P. 1591-1600.

112. Sattentau Q.J., Moulard M., Brivet В., Botto F., Guillemot J.C., Mondor I., Poignard P., Ugolini S.: Antibody neutralization of HIV-1 and the potential for vaccine design. Immunol. Lett. 1999, V. 66, P. 143-149.

113. Jewett A., Giorgi J.V., Bonavida B. Antibody-dependent cellular cytotoxicity against HIV-coated target cells by peripheral blood monocytes from HIV seropositive asymptomatic patients. J. Immunol. 1990, V. 145, P. 4065-4071.

114. Sattentau Q.J. Neutralization of HIV-1 by antibody. Curr. Opin. Immunol. 1996, V. 8, P. 540-545.

115. Остерман Я А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука; 1985.

116. Yudelevich I.G., Cherevko A.S., Engelsht V.S., Pikalov V.V., Tagiltsevand A.P., Zheenbajev Z.Z. A two-jet plasmatron for the spectrochemical analysis of geological samples. SpectrochimicaActa. 1984, V. 39B, P. 777-785.

117. Shelpakova I.R., Zaksas N.P., Komissarova L.N., Kovalevskij S.V. Spectral methods for analysis of high-purity gallium with excitation of spectra in the two-jet arc plasmatron. J. Anal. At. Spectrom. 2002, V. 17, P. 270-273.

118. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М: Наука; 1981.

119. Merril C.R., Goldman D., Van Keuren M.L. Gel protein stains: silver stain. Methods Enzymol. 1984, V. 104, P. 441-447.

120. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A laboratory manual New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

121. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, V. 76, P. 4350-4354.

122. Scopsi L., Larsson L.I. Increased sensitivity in peroxidase immunocytochemistry. A comparative study of a number of peroxidase visualization methods employing a model system. Histochemistry 1986, V. 84, P. 221-230.

123. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases. J. Cell Mol. Med. 2003, V. 7, P. 265-276.

124. Nevinsky G.A., Favorova O.O., Buneva V.N. Catalytic antibodies: New characters in the protein repertoire. . Edited by Golemis E. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. Cold Spring Harbor; 2002.

125. Бунева B.H., Кудрявцева A.H., Гальвита A.B., Дубровская В.В., Хохлова О.В., Калинина И.А., Галенок В.А., Невинский Г.А. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации. Биохимия 2003, т. 68, С. 1088-1100.

126. Balint J.P. Jr., Ikeda Y., Nagai Т., Terman D.S. Isolation of human and canine IgM utilizing protein A affinity chromatography. Immunol Commun. 1981, V. 10, P. 533-540.

127. Косик О.Г. Физико-химические особенности IgA, IgM, IgG сыворотки крови здоровых людей, т. 1. М.: "Медицина"; 1991.

128. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A. Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science 1981, V. 211, P. 1437— 1438.

129. Grey H.M., Abel C.A., Yount W.J., Kunkel H.G. A subclass of human gamma-A-globulins (gamma-A2) which lacks the disulfled bonds linking heavy and light chains. J. Exp. Med. 1968, • V. 128,p. 1223-1236.

130. Koshland M.E. Structure and function of the J chain. Adv. Immunol. 1975, V. 20, P. 41-69.

131. Генералов И.И. Абзимная активность иммуноглобулинов. Витебск: Витебский государственный медицинский университет; 2000.

132. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: "Медицина", 1968.

133. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stevens F.J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment. J. Biol. Chem. 1995, V. 270, P. 15257-15261.

134. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Семенов Д.В., Бунева В.Н. Каталитически активные антитела и их возможная биологическая функция. Вестник РАМН 2001, т. 2, С. 38—45.

135. Gao Q.S., Sun М., Tyutyulkova S., Webster D., Rees A., Tramontano A., Massey R.J., Paul S. Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J. Biol. Chem. 1995, V. 270, P. 20870.

136. Brooks C.L. Calcium and calmodulin-dependent phosphorylation of kappa-casein by a bovine mammary casein kinase. J. Dairy. Sci. 1987, V. 70, P. 2226-2232.

137. Brooks C.L. Two physiological substrate-specific casein kinases are present in the bovine mammary gland. FEBSLett. 1989, P. 243, P. 385-388.

138. Sharoni Y., Feldman В., Teuerstein I., Levy J. Protein kinase activity in the rat mammary gland during pregnancy, lactation, and weaning: a correlation with growth but not with progesterone receptor levels. Endocrinology 1984, V. 115, P. 1918-1924.

139. Lasa M., Marin O., Pinna L.A. Rat liver Golgi apparatus contains a protein kinase similar to the casein kinase of lactating mammary gland. Eur. J. Biochem. 1997, V. 243, P. 719-725.

140. Hopper J.E., Papagiannes E. Evidence by radioimmunoassay that mitogen-activated human blood mononuclear cells secrete significant amounts of light chain Ig unassociated with heavy chain. Cell Immunol. 1986, V. 101, p. 122-131.

141. Stevens F.J., Solomon A., Schiffer M. Bence Jones proteins: a powerful tool for the fundamental study of protein chemistry and pathophysiology. Biochemistry 1991, V. 30, P. 6803-6805.

142. Ikhmyangan E.N., Vasilenko N.L., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Metal ions-dependent peroxidase and oxidoreductase activities of polyclonal IgGs from the sera of Wistar rats. J. Mol. Recognit. 2006, V. 19, P. 432-440.

143. Taylor R.G., Christiansen J.A., Goll D.E. Immunolocalization of the calpains and calpastatin in human and bovine platelets. Biomed. Biochim. Acta. 1991, V. 50, P. 491-498.

144. Dayton W.R., Reville W.J., Goll D.E., Stromer M.H. A Ca2+-activated protease possibly involved in myofibrillar protein turnover. Partial characterization of the purified enzyme. Biochemistry 1976, V. 15, P. 2159-2167.

145. Goll D.E., Thompson V.F., Taylor R.G., Zalewska T. Is calpain activity regulated by membranes and autolysis or by calcium and calpastatin? Bioessays 1992, V. 14, P. 549-556.

146. Harris A.S., Croall D.E., Morrow J.S. The calmodulin-binding site in alpha-fodrin is near the calcium-dependent protease-I cleavage site. J. Biol. Chem. 1988, V. 263, P. 15754-15761.

147. Stabach P.R., Cianci C.D., Glantz S.B., Zhang Z., Morrow J.S. Site-directed mutagenesis of alpha II spectrin at codon 1175 modulates its mu-calpain susceptibility. Biochemistry 1997, V. 36, P. 57-65.

148. Paul S., Nishiyama Y., Planque S., Karle S., Taguchi H., Hanson C., Weksler M.E. Antibodies as defensive enzymes. Springer Semin. Immunopathol. 2005, V. 26, P. 485-503.