Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа следовой гиперполяризации миелинизированных нервных волокон

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Природа следовой гиперполяризации миелинизированных нервных волокон"

УЛЬЯНОВСКИЙ ОРДЕНА "ЗНАК ПОЧЕТА" ГОСУДАРСТВЕННЫЙ р рП^АГО^ИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И. Н. УЛЬЯНОВА

' чЧТ псовах ШШШСИ

УЖ 612.813.2

КРОНЧЕВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА

природа следовой гиперполяризации ^lИEЛИHИЗИPOBAHHЫX нервных волокон

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УЛЬЯНОВСК, 1996

Работа выполнена на кафедре анатомиии, физиологии и гигие ны человека и животных Ульяновского ордена "Знак почета" гос\ дарственного педагогического университета им И.Н. Ульянова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор КАТАЛЫМОВ Л. Л.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор ЗЕФИРОВ А.Л. С г. Казань)

доктор биологических наук профессор ГЕНИНГ Т.П. С г. Ульянов«

Ведущая организация - Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН (г. Москвг

Запита состоится ^' 1996 г. в часс

на заседании специализированного совета К. 113.51.01 по присужде нию ученой степени кандидата биологических наук по специальное ти 03.00.13. - физиология человека и животных при Ульяновске ордена "Знак почета" государственном педагогическом университе' по адресу: 432700, г.Ульяновск, пл. 100-летия В.И.Ленина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновске го государственного педагогического университета по адресу: Ульяновск, пл. 100-летия В.И.Ленина, 4.

Автореферат разослан 1ддб г_

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук<, ^ О. Н. Балкиь

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы: Постспайковая следовая гиперполяризация мембраны (ПСГ), развивагацаяся после спайка одиночного потенциала действия, и поеггетаническая гиперполяризация СПТП, воз-никагацая после ритмической стимуляции нервного волокна, играет важную роль в деятельное™ нервной системы. С гиперполяризацией мембраны связаны субнормальная Фаза следовых изменений возбудимое™ нервных волокон CErlanger, Gasser, 1937; Lorente de No, 1947: Каталымов, 1976), возникновение спайковой частотной адаптации в возбудимых тканях (Eenardo, Prince, 1982; Storm, 1989), регуляция спонтанной импульсации пейсмекерных нейронов (Араке-лов, 1974!) и вызванной ритмической активности возбудимых образо-ванийС Lorente de No, 1947). Следовым потенциалам принадлежит также важная соль в процессах пространственного взаимодействия и интеграции нейронов в центральной нервной системе (Adelman, Palti, 1972: Русинов, 19S7). Однако до настоящего времени природа следовых потенциалов остается невыясненной. Поскольку в одиночных миелинизированных нервных волокнах лягушки с "закрытым" перехватом Ранвъе ПСГ выражена слабо, а ПТГ проявляется отчетливо (Каталымов, 1975), основное внимание в нашей работе было уделено изучению Феноменологии ПТГ.

Относительно природы ПТГ в литературе высказано несколько гипотез. С точки зрения наиболее распространенной гипотезы возникновение ПТГ обусловлено деятельностью злектрогенного Na+,К+-насоса (Ritchie, Straub, 1957: Connelly, 1959: Schoepfle, Katcholi, 1.973: Mс Düugal, Osborn, 1976: Каталымов, 1975). Приверженцы второй гипотезы объясняют возникновение ПТГ сохранением повышенной проницаемости мембраны для ионов К+ СGage, Hubbard, 1964, 1966: Mlnota. 1974: Goh, Pennefather, 1987: Toshihiko, Takayuki, 1990). Согласно третьей гипотезы ПТГ создается за счет выходящего К+-тока и усиления работы электрогенного Na+,К+-насоса (Nakajima, Takahashi, 1966: Rang, Ritchie, 1968: Hertog, 1973: Baker et al., 1987: Siegel, Birks, 1988). Наряду с этими гипотезами выдвигались предположения, что гиперполяризация мембраны может быть обусловлена входящим током ионов Cl- (Takashl et. al., 1990) или увеличением соотношения Pk/PNa за счет снижения Na^-проницэемости мембраны (Weight, Padjen, 1973: Smith, Weight, 1977: Wilson. Wachtel, 1978). Мнения исследователей противоречивы и не охватывают всей совокуп-

ности имевшихся экспериментальных ланньк. В связи с этим представлялось актуальным изучение ионно-мембранных механизмов генерации следовой гиперполяризации миелинизированных нервных волокон, используя разработанную в лаборатории методику регистрацш потенциалов в "закрытом" перехвате Ранвье.

Пяль и задачи исследования:

Цель работы заключалась в исследовании механизма ПТГ одиночных миелинизированных нервных волокон лягушки с интактным перехватом Ранвье. В соответствии с этой целью были поставлены следующее задачи:

1. Изучить вклад К+-насоса в генерацию ПТГ миелинизированных нервных волокон.

2. Выяснить роль К+-токов в механизме ПТГ нервных волокон лягушки в норме и в условиях блокирования активного транспорта.

3. Изучить вклад Ма+-тока в генерацию ПТГ в интактных нервных волокнах и при ингибировании Ыа-1", К^-иасоса.

Научная новизна:

В работе проведен фармакологический анализ следовой гиперполяризации, развивающейся после ритмической стимуляции одиночного миелинизированного нервного волокна лягушки.

В отличие от полученных ранее результатов в настоящей работе показано, что ингибирование Ыа-1-, К^-насоса специфическим бло-катором - оуабаином, блокатором Р~АТФаз - ортованадатом, блока-тором гликолиза - йодацетамидом, а также торможение работы насоса бескалиевым раствором, содержащим оуабаин, эквивалентной заменой в наружном растворе на и.4", охлаждением о мыв акте г< раствора - не устраняют постгетаническую гиперполяризацию одиночного нервного волокна. Впервые было обнаружено, что при блокировании К+-АТФазы оуабаином, ортованадатом, йодацетамидо) и П+ возникает задержка в генерации ПТГ в форме плато посттета-нической деполяризации (ГТШ. Выявлена зависимость плато ПТД о' частоты и длительности стимуляции и времени действия блокатора. Показано, что длительность ПТД возрастает под влиянием 4-АР, ГЛ5^, бескалиевого раствора и уменьшается при действи! ТЭА, лидпкапна и холин-хлорида. Высказано предположение, согласно которому плато ПТД, возникающее при блокировании активноп транспорта, обусловлено аккумуляцией ионов К"*" в межклеточной щели и активацией медленно инактивирукщихся Ма4"-каналов.

Подтверждены ранее установленные факты СКаталымов, 1975), что блокаторы К^-каналов ТЗА и 4-АР вызывают увеличение амплитуды ПТГ, а применение блокатора Ма+-каналов - ТТХ и местного анестетика лидокаина приводит к уменьшению и почти полному подавлению ПТГ. На основании полученных данных была выдвинута гипотеза, согласно которой ПТГ обусловлена снижением Na^-проницае-мости мембраны вследствие развития медленной инактивации ffeT-ка-налов.

Поппжрнмя. йынпгиммр на защиту!

1. Посттетаническая гиперполяризация СПТГ) "закрытого" перехвата Ранвъе не обусловлена деятельностью злектрогенного Na-1-, К+-насоса, поскольку вещества, тормозящие активный транспорт мекйраны нервного волокна, ее не устраняют, но вызывает появление плато постгетанической деполяризации СПТД).

2. ПТГ миелинизированных нервных волокон не связана с сохранением повышенной проницаемости мембраны аксона для ионов К+, поскольку блокаторы К*-каналов СТЭА, 4-АР, Вай+0 не вызывают снижения ее амплитуды.

3. ПТГ интактных нервных волокон обусловлена снижением натриевой проницаемости мембраны вследствие развития медленной инактивации Na^-каналов.

Научно-практическая значимость;

Проведенные исследования позволяют углубить существующие представления об ионно-мембранных механизмах генерации следовых потенциалов миелинизированных нервных волокон.

Результаты проведенных исследований представляют практический интерес для фармакологии, могут найти применение в теоретической и экспериментальной нейрофизиологии, исследованиях по моделированию процессов возбуждения в нервной системе.

Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе - в преподавании раздела "Ионно-мембранные механизмы генерации потенциала действия" курса Физиологии человека и животных.

Реализация пс-зулътатов мсолялойанмя:

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, результаты доложены на ежегодных внутривузовских конференциях Ульяновского

государственного педагогического университета С1992 - 1996), научно-практической конференции Ульяновского сельскохозяйственного института С1993, 1995), конференции молодых ученых Самарского С1992) и Казанского С1993) пединститутов. Результаты настоящей работы включены в лекционный курс по физиологии человека и животных для студентов Ульяновского государственного педагогического университета.

Стталступа и ппъем лыг-^рртаимм!

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы.

Работа изложена на 177 страницах машинописного текста, включая 42 рисунка и 8 таблиц.

Список литературы содержит 235 источников, из них 35 отечественных и 200 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на одиночных нервных волокнах с "закрытым" перехватом Ранвье, выделенных из седалищного нерва озерной лягушки Rana ridlbunda.

Для получения одиночного нервного волокна с "закрытым" перехватом препаровку производили по модифицированной СКаталымов, 1974) методике Тасаки СТасаки, 1957) в межперехватном участке, е перехват, от которого отводили потенциал действия СПД), оставляли интактным в нервном стволе. Препарат размещали в специальной камере с "воздушным мостиком-изолятором".

Раздражение нерва производили в проксимальной части прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1 мс сверхпороговой амплитуды, используя двухканальный стимулятор ЗС-10 с радиочастотным выходом.

В качестве отводящих использовали каломельные неполяризую-щиеся электроды. Для отведения однофазных ПД дистальный участок нерва инактивировали 2% раствором новокаина. Электрический сигнал с регистрирующих электродов подавали через катодный повторитель С входное сопротивление 20 ГОм) на усилитель постоянного тока УУ-2М, а затем на вход первого канала осциллографа и через дифференцировочную цепочку с постоянной времени 10 мс (R=10C

КОм, С=100 ПФ) на вход второго канала. Таким образом, на экране осциллографа воспроизводились два процесса - ПД и первая производная от мембранного потенциала CV).

В опытах использовали раствор Рингера следующего состава С в мМ): NaCl С114), КС1 С2.5), CaClg С2.0), МаНСОЗ (2.5). Величину рН раствора поддерживали на уровне 7.2-7.3, используя HEPES-бу-фер С Sigma). В опытах с безнатриевым раствором эквивалентно заменяли NaCl на холин-хлорид или Li+. В опытах с бескалиевым "раствором эквивалентно заменяли КС1 на NaCl. В качестве блокатора Na+, К"*"-АТФазы использовали оуабаин С Sigma) в концентрации 1-10 мМ и ортованадат С Sigma) -0,5 мМ: блокатора анионного обмена -SITS (Calbiochem) - 1 мМ: блокатора К+-каналов - тетраэтиламмо-ний С TEA, Sigma) - 10- 40 мМ, 4-аминопиридин С4-АР, Serva) -1-3 мМ и ионы блокатора гликолиза - йодацетамид CIA,

Sigma) - 1-5 мМ: блокатора Ма+-каналов - тетродотоксин СТТХ, Sigma) - 1*10-^ М и местный анестетик лидокаин - 1 мМ: модификатора №+-каналов - вератридин С VER, Serva) - 0,01 мМ; кальций-хелатируицего агента - ЭГТА - 25 мкМ.

При статистической обработке экспериментальным данных использовали t-критерий Стьюдента СЛакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В миелинизированных нервных волокнах лягушки с "закрытым"

перехватом Ранвье после ритмической стимуляции развивается псс-ттетаническая гиперполяризация СПТГ), амплитуда которой возрастает с увеличением частоты и длительности тетанизации. В наших опытах после 10-секундного раздражения частотой 300 имп/с развивалась ПТГ максимальной амплитудой 4,6±0,8 мВ С N=230: Р<0,001) и длительностью 7,1±1,1 секунды Сп= 230: Р<0,01).

ПТГ миелинизированных нервных волокон состоит из трех компонентов: быстрого с постоянной времени tl=0,1-0.2 секунды, среднего с 12=1-2 секунды и медленного с t3=7-15 секунд. С ростом частоты стимуляции с 50 имп/с до 300 имп/с происходит уменьшение постоянных времени быстрого и среднего С ti и t2) и увеличение медленного Ct3) компонентов ГПТ.

ктшянмр б.ттпкиппвания активного транспорта на амплитулу ПТГ МИА.ПИНИЗИрГ)ВвННМХ HRPRHMV вплсжпн.

С целью проверки общепринятой гипотезы о роли Na+,К+-насоса в механизме возникновения ПТГ С Connelly, 1959; Nakajlma, Takahashi, 1966: Rang, Ritchie, 1968: Каталымов, 1974; Osmanovic, Beleslin, 1985.1, мы исследовали влияние агентов, тормозящих работу Na+,К+-АТФазы: ее специфического блокатора - оуа-баина, неспецифического блокатора АТФаз - ортованадата, блокатора гликолиза - йодацетамида, а также совместного действия оуа-баина и бескалиевого раствора и раствора Рингера, в котором ионы Na+ эквивалентно замещены на ионы Li+. Если ПТГ миелинизиро-ванных нервных волокон обусловлена работой злектрогенного Na+,К+-насоса, то блокирование Na+, К+-АТФазы должно привести к устранению ПТГ.

Проведенные нами эксперименты показали, что при ингибирова-нии Ма+, К+-АТФазы специфическим блокатором - оуабаином С1, 2, 5 и 10 мМ) амплитуда ПТГ в первые 20 минут действия агента увеличивается с 3,6±0,4 мВ до 3,8±0,38 мВ Сп=9: Р<0,01). При более длительном воздействии блокатора происходит возвращение амплитуды ПТГ к исходному значению, но дальнейшего ее снижения не наблюдается и после 60-минутной аппликации блокатора. Амплитуда ПД в течение всего времени воздействия 1 мМ оуабаина практически не изменяется. Выдерживание препарата в растворе с более вы-

Рис.1. Следовые потенциалы одиночного нервного волокна с "закрытым" перехватом Ранвье в норме CAD и после воздействия оуабаина СБ).

А. ГШ мВ

ОУАБАИН

В.ПТЛ

60 50 40

зо 20 10

3

Б.ПТГ

N 10 20 30 40 50 мин ОУАБАИН

мВ-6 5 43 2 1-

N 10 20 30 40 50 мин

N 10 20 30 40 50 мин Рис.2. Влияние различных концентраций оуабаина на ПД, ПТГ и длительность плато ПТД одиночных нервных волокон лягушки: 1 - 1 мМ оуабаина: 2 - 2 мМ; 3 - 5 мМ: 4 - 10 мМ. сокими концентрациями оуабаина С 2,5 и 10 мЮ также не устраняет ГПТ, хотя и вызывает снижение амплитуды ПД на 32,8 %.

В данной серии опытов впервые выявлен феномен - через 20-25 минут действия оуабаина после прекращения стимуляции в генерации ПТГ возникает задержка в виде деполяризационного плато С Рис. 1), названного нами плато посттетанической деполяризации СПТД). Время появления плато ПТД зависит от концентрации оуабаина С Рис.2). При низких концентрациях блокатора (1 и 2 мЮ плато возникает через 20 минут и имеет длительность 0,3±0,05 секунды Сп=14: Р<0,01). Увеличение концентрации оуабаина до 5 и 10 мМ вызывает более раннее появление плато - через 10 минут после начала действия блокатора - длительностью 0,6±0,09 секунды Сп=10: Р<0,01). Плато увеличивается с ростом продолжительности стимуляции от 0,9±0,2 с после 10 секунд раздражения частотой 300 имп/с до 1,3±0,21 с после 20-секундной тетанизации Сп=5: Р<0,01). Продолжительность плато ПТД зависит и от частоты стимуляции. Низ-

кая частота стимуляции С 50 имп/с) не вызывает задержку даже после 60 секунд тетанизации. Плато ПТД появляется только при частоте более 100 имп/с и достигает наибольшего значения (1,4±0,1 с) при раздражении нервного волокна частотой 300 имп/с.

Можно предположить, что ПТГ обусловлена работой Ма+, К+-насо-са, нечувствительного к действию оуабаина, а ПТД связана с каким-то неспецифическим действием данного блокатора. Для проверки этого предположения мы изучали особенности действия на "закрытый" перехват Ранвье лягушки ингибитора Р-АТФаз - ортованада-та (Pedersen, Carafoli, 1987).

Проведенные эксперименты показали, что выдерживание одиночного нервного волокна в 0,5 мМ ортованадата приводит к снижению амплитуды ГШ на 32 % от исходного значения с 81±3 мВ до 55±2 мВ Сп=6: Р<0,001), но, вместе с тем, вызывает увеличение амплитуды ПТГ с 3,1±0,2 мВ до 5,7 мВ Сп=б: Р<0,001). Снижения амплитуды ПТГ в данной серии опытов не наблюдалось в течение 50 минут действия блокатора. Через 30 минут действия ортованадата возникает задержка в генерации ПТГ, аналогичная плато ПТД, наблюдаемому в опытах с блокированием активного транспорта оуабаином. Длительность плато ПТД в данной серии опытов была также прямо пропорциональна времени экспозиции блокатора, частоте и длительности стимуляции. Появление плато ПТД может быть связано с деполяризующим действием ионов К+, накопившихся в межклеточной щели в процессе ритмической стимуляции в результате блокирования Na-, К+-АТФазы CShopfle, Kathole, 1973; Jansen,Nicholls, 1973; Siegel, Birks, 1988).

Другим способом торможения работы Na+,К+-АТФазы является удаление ионов Na+ из наружного раствора путем эквивалентной замены их на ионы Li+, которые обеспечивают нормальную генерацию ГШ, но практически не откачиваются из клетки Na+,К+-насосом С Hodgkin, Katz, 1949: Skou, Esman, 1992). Опыты показали, что 30-минутное выдерживание препарата в Liрастворе снижает амплитуду ГЩ на 25 %, амплитуда ПТГ уменьшается на 35 % от исходной величины, однако, ее полного подавления не происходит и после 50 минут экспозиции исследуемого раствора. В данной серии опытов после тетанизации возникает задержка в генерации ПТГ, подобная плато ПТД в опытах с оуабаином и ортованадатом.

Аналогичный эффект - появление плато ПТД и отсутствие подавления амплитуды ПТГ - наблюдается при ингибировании процесса

гликолиза специфическим блокатором - йодацетамидом, при торможении Ма^, К+-насоса в результате совместного воздействия оуабаина и бескалиевого раствора. Так. 30-минутное воздействие оуабаина С 2 мМ) и бескалиевого раствора приводило к небольшому снижению СЮ 20 амплитуды ПТГ с 4,2*0,3 мВ до 3,8±0,3 мВ (п=5; Р<0,01). Полного устранения ПТГ не наблюдалось даже через 50 минут выдерживания препарата в бескалиевом растворе, содержащем оуабаин. При этом происходило резкое увеличение длительности плато ПТД с 0,8±0,2 с после 30-шнутного воздействия 2 мМ оуабаина до 5,6±0,06 с (п=5: Р<0,001) после 10 минут аппликации бескалиевого раствора, содержащего 2 мМ оуабаина. К 30 минуте экспозиции комплексного раствора длительность плато возрастает до 11,3±0,8 с, что в 14 раз превышает исходное значение. В данной серии опытов через 10 минут действия бескалиевого раствора, содержащего оуабаин, после окончания ритмической стимуляции развивается небольшая кратковременная гиперполяризация, за которой следует плато ПТД, резко переходящее в посттетеническую гиперполяризацию нервного волокна. Кратковременная гиперполяризация в данных условиях, по-видимому, имеет калиевую природу, поскольку устраняется при добавлении в омывающий раствор блокатора К+-каналов -ТЗА (10 мМ). Устранения ПТГ в этих условиях не происходит. Амплитуда ПТГ также не снижается при торможении работы Ма+,К+-АТФазы путем охлаждения С до 5 °С) наружного раствора, что свидетельствует о незначительном вкладе Ыа+, К+-насоса в генерацию ПТГ.

Итак, проведенные эксперименты не подтверждают гипотезу механизма ПТГ, связывающую ее возникновение с деятельностью электрогенного Ма+, К+-насоса, поскольку все агенты, тормозящие работу Ма+, К+-АТФазы, не устраняют ПТГ, а только вызывают появление

задержки в ее развитии в форме деполяризационнго плато.

BiMrkt гипепкя пмррпгп nar.tropa на ПТГ и ПТЛ. Следовая гиперполяризация мембраны может быть следствием сохранения повышенной проницаемости мембраны для ионов К+ CMeves, 1961: Gage, Hubbard, 1964, 1966: Ml nota, 1974: Goh, Pennefather, 1987: Costa et al., 1991). В следующей серии опытов мы исследовали влияние

гиперкапиевого раствора на ПТГ миелинизированных нервных волокон. Повышение концентрации ионов К"*" в омывающем растворе должно привести к устранению ПТГ вследствие развития деполяризации мембраны перехвата Ранвье С Hodgkin, Katz, 1949; Ulbricht, 1963).

Выдерживание препарата в течение 15 минут в растворе Ринге-ра, содержащем 20 мМ К"*", приводит к снижению амплитуды ГШ на 30 % от исходной величины и полному устранению ПТГ. Через 10 минут после замены исследуемого раствора на нормальный раствор Ринге-ра амплитуда ПД и ПТГ восстанавливалась до контрольной величины. Таким образом, опыты с повышенной ГК+]о не противоречат калиевой гипотезе происхождения ПТГ.

Для проверки предположения о том, что плато ПТД, полученное в экспериментах с оуабаином, вероятно, обусловлено аккумуляцией ионов К-1" в примембранном пространстве, мы провели серию опытов по изучению комплексного влияния оуабаина и гиперкалиевого раствора. Кратковременное С 5 минут) воздействие 2 мМ оуабаина и 20 мМ К+ наряду со снижением на 70 % амплитуды ПД вызывает устранение ПТГ и плато ПТД. Смена омывающего раствора на раствор Ринге-ра приводит к восстановлению амплитуды ГШ, ГПГ и двухкратному увеличению длительности плато ПТД, что свидетельствует о зависимости ПТД от накопления ионов К"1" в межклеточной щели.

Влияния блокаторов К^-каналов на ПТГ и ПТД hrprhmx впдпклн.

Результаты предыдущей серии экспериментов показали, что ПТГ миелинизированных нервных волокон может быть обусловлена сохранением повышенной калиевой проницаемости мембраны, а ПТД связана с аккумуляцией ионов К-1" в примембранном пространстве в процессе ритмической стимуляции. Для проверки этого предположения были проведены опыты с использованием специфических блокаторов К+-каналов - ТЭА и 4-АР. Если ПТГ обусловлена сохранением повышенной проницаемости мембраны для К+, то блокирование К^-токов должно привести к устранению ГПТ.

Проведенные эксперименты показали, что блокирование К^-кана-лов не устраняет ГПТ, но, напротив, значительно увеличивает ее амплитуду. Так, через 15 минут аппликации раствора, содержащего 10 мМ ТЭА, амплитуда ПД увеличилась с 72±2 мВ до 78±3 мВ Сп=10, Р<0,001), амплитуда ГПТ возросла на 57 % с 6,3±0,3 мВ до 9,9±0,4 мВ (п=10: Р<0,001). Аналогичное увеличение амплитуды ГШ и ГПТ происходило при действии другого блокатора К+-токов -

4-АР. Подобное увеличение ПТГ можно было бы объяснить участием особого нечувствительного к действию данных блокаторов медленного Са'^-активируемого К+-тока (Goh, Pennefather, 1937: Toshihiko, Takayukl, 1990). Однако против этого свидетельствуют факты отсутствия уменьшения амплитуды ПТГ при аппликации блокатора Са^-активируемых К""-каналов - Ва*-+, блокатора входа Сaz+ в клетку - или при действии кальций-хелатирущего агента -ЭГТА. Полученные данные позволяют отказаться от гипотезы, объясняющей происхождение ПТГ сохранением повышенной проницаемости мембраны для ионов К+.

ПТГ не связана с изменением проницаемости мембраны для ионов С1-, поскольку не снижается при аппликации 1 мМ раствора SITS, блокирующего анионный обмен в клетке. Остается предположить. что генерация ПТГ обусловлена изменением Ма^-проницаемоста мембраны нервного волокна.

В связи с обнаружением задержки в генерации ПТГ при действии блокаторов активного транспорта представлялось интересным изучить влияние блокаторов К+-каналов - ТЭА и 4-АР - на длительность плато ПТД. Если ПТД обусловлена накоплением ионов К+ в межклеточной щели вследствие ритмической стимуляции и блакировеъ ния насоса, то применение блокаторов К+-каналов должно затруднить выход ионов К+ из клетки и, следовательно, вызвать сокращение длительности ПТД. Проведенные эксперименты показали, что под влиянием ТЭА происходило уменьшение длительности плато ПТД С Рис. 3). Так, 30-минутная аппликация 2 мМ оуабаина вызвала задержку в генерации ПТГ длительностью 2, 2±0,2 с (п=6: Р<0,01). Через 5 минут после добавления в омывающий раствор 10 мМ ТЗА наблюдалось резкое Сприблизительно в 2 раза) сокращение длительности плато до 0,9±0,02 с Сп=б; Р<0,01), а через 10 минут аппликации исследуемого раствора яалержа полностью устранилась. Устранения ПТГ при этом не происходило, наоборот, ее амплитуда при совместном воздействии оуабаина и ТЭА увеличивалась на 76,6 % от исходного значения с 3,2±0,2 мВ до 5,3*0,3 мВ Сп=6: Р<0,01). Длительность плато, вызванного другими блокаторами активного транспорта - ортованадатом или литиевым раствором, также сокращалась под влиянием ТЭА.

Вместе с тем К+-гипотеза происхождения ПТД наталкивается на ряд противоречий: другой блокатор К+-каналов - 4-АР в отличие от ТЗА вызывает увеличение длительности плато ПТД. Так, 30-минут-

Рис.3. Влияние смеси оуабаина и блокаторов К+-каналов на ПД, ПТГ и длительность плато ПТД одиночных нервных волокон: 1 - оуабаин + 10 мМ ТЗА: 2 - оуабаин + 2 мМ 4-АР. ная аппликация 2 мМ оуабаина вызвала задержку в генерации ПТГ длительностью 4,0±0,5 с. Через 5 минут после добавления в омы-ваиций раствор 2 мМ 4-АР длительность плато возросла на 190 % и составила 7,6±0,6 с Сп=6: Р<0,013, устранения амплитуды ПТГ при этом не происходило. Данное увеличение плато можно объяснить тем, что 4-АР влияет не только на калиевую, но и натриевую систему, увеличивая Ыа+-проницаемость мембраны за счет сдвига кривой зависимости Рма от мембранного потенциала в сторону более отрицательных потенциалов (Mandrek, Golenhofen, 1977). Увеличение PNa и, соответственно, iNa поддержиает деполяризованное состояние мембраны и приводит к возрастанию длительности ПТД. При деполяризации мембраны блокирующее действие 4-АР снимается С Thompson, 1977: Hermann, Gorman, 1981), это приводит к увеличе-

нию i к и, следовательно, к накоплению ионов К+ в межклеточной щели, усиливающему деполяризацию мембраны и активирующему медленно инактивирующиеся Иа+-каналы (French et. al., 1990: Taylor, 1993). Дополнительному повышению [K^le также способствует активирующее действие 4-АР на Са^-зависимые К+-каналы (Hermann. Gorman, 1981: Зефиров и др., 1937; Гениатуллин. 1992).

К^-гипотезе генерации ПТД также противоречит факт увеличения длительности плато ПТД при действии двухвалентных ионов и Известно, что ионы N1%+ препятствуют развитию ¡^-деполя-

ризации мембраны ( Tasaki, 1959), а ионы Сай+ сдвигают кривую К+-активации в сторону положительных потенциалов

( Frankenhaeuser, Hodgkin, 1957: Ходоров, 1969), что, с точки зрения К+-гипотезы, должно привести к уменьшению длительности ПТД. В наших опытах 30-минутная аппликация 2 мМ оуабаина вызвала задержку в генерации ПТГ длительностью 2,0±0,4 с Сп=б: Р<0,01). Добавление в омывающий раствор 10 мМ Са^+ после 10 минут экспозиции увеличило продолжительность плато ПТД в 2 раза, что составило 4,3±0,3 с Сп=б: Р<0,01). Подобное увеличение длительности задержки наблюдалось при аппликации 1 мМ NiC.l2: плато возросло с 1,5±0,2 с после 30 минут воздействия 2 мМ оуабаина до 4,4±0,3 с (п=б: Р<0, 001) после 10 минут комбинированного действия оуабаина и 1 мМ Ni^. На амплитуду ПТГ двухвалентные моны (Си Ni5^) заметного влияния не оказывали.

Данные противоречия К+-гипотезы происхождения ГТГД могут быть объяснены, если принять, что деполяризация мембраны происходит не только за счет снижения Рк, но и за счет увеличения PNa вследствие активации медленно инактивирущихся Иа+-каналов (Вер-гун, 1994). Подтверждением данного предположения является Факт увеличения длительности ПТД при действии N1K+, так как данный ион замедляет инактивачип Ма^-каналов при потенциале покоя за счет сдвига кривой Иа^-инактивации в сторону положительных потенциалов С Frankenhaeuser, Hodgkin, 1957; Hille, 1968; Ходоров, 1969).

Влияние изменения Ма+-пронииаемости мембраны на ПТГ и ПТЛ

одиночного нервного ипппкня_лягушки..

Свидетельством того, что ПТД обусловлена не только аккумуляцией К+ в примембранном пространстве, но и повышением PNa вследствие активации медленно инактивируицихся Ыа^-каналов, является

Факт устранения плато ПТД при аппликации местного анестетика ли-докаина и специфического блокатора Ыа+-проницаемости ТТХ, которые блокируют все типы Ыа+-каналов, в том числе и медленно инак-тивирущиеся. В результате данные каналы не активируются при ритмической стимуляции, что ведет к снижению 1Ыа и проявляется в устранении плато ПТД. Так, после 30 минут аппликации 2 мМ оуа-баина развивается плато ПТД длительностью 1,7±0,3 с Сп=6:Р<0,01), добавление в омывающий раствор 1 мМ лидокаина через 5 минут вызывает его устранение. Подобное сокращение и устранение задержки в генерации ГГГГ наблюдается при действии безнатриевого раствора, где ионы Ма+ эквивалентно замещены на хо-лин-хлорид, и блокатора Ыа^-каналов ТТХ. Таким образом, можно предположить, что плато ПТД обусловлено аккумуляцией ионов К+ в межклеточной щели и повышением РЫа вследствие активации медленно инактивируицихся Ыа+-каналов в процессе ритмической стимуляции.

N 10 30 10 30 мин Рис.4. Влияние совместного воздействия оуабаина и блокаторов Ыа+-каналов на ГШ, ПТГ и длительность плато ПТД нервных волокон: 1 - лидокаин С2 мЮ; 2 - холин-хлорид СИЗ »Л).

Ыа+-еистема участвует и в генерации ПТГ, об этом свидетельствует Факт параллельного снижения амплитуды ПД и ПТГ при аппликации ТТХ и лидокаина. Данные вещества блокируют ЭДа^-кана-лы и снижают Ма+-пронииаемость мембраны, что должно проявиться в подавлении генерации ПД и ПТГ. Выдерживание одиночного нервного волокна в течение 25 минут в 1«10-6 М растворе ТТХ приводит к уменьшению амплитуды ПД на 63 % с 52±2 мВ до 19±1 мВ Сп=5: Р<0,001). Параллельно со снижением ГЩ при воздействии ТТХ наблюдается падение амплитуды ПТГ на 60 % с 2,5±0,2 мВ до 1,0±0,13 мВ (п=5: Р<0,001) и устранение плато ПТД. Влияние ТТХ обратимо: о-г-мывание препарата в течение 20 минут в нормальном растворе Рин-гера приводит к восстановлению амплитуды ПД до 45±2 мВ Сп=5: Р<0,001), амплитуды ПТГ - до 2.3±0,1 мВ Сп=5: Р<0,001). Сходное влияние на ПД и ПТГ миелинизированных нервных волокон оказывает местный анестетик лидокаин. Одновременное устранение плато ПТД и подавление ПТГ при действии ТТХ и лидокаина свидетельствует о том, что ПТГ является следствием процессов, развиваюяихся во время плато ПТД, и может быть связана со снижением Иа^-проницае-мости мембраны. Снижение проницаемости мембраны для ионов Ма+ происходит после ритмической стимуляции нервного волокна в результате развития медленной инактивации Ма+-каналов. В итоге доля данных каналов, открытых при потенциале покоя, уменьшается, и мембранный потенциал приближается к уровню Кч-равновесного потенциала, что выражается в развитии волны посттетанической гиперполяризации. Возвращение мембранного потенциала к уровню потенциала покоя можно объяснить освобождением от инактивации медленно инактивируюцихея №+-каналов.

О вкладе Ыа^-системы в генерацию ПТГ свидетельствует факт устранения посттетанической гиперполяризации и развитие вместо нее длительной следовой деполяризации при действии "натриевого агониста" - вератридина. Токсин взаимодействует с Иа^-каналами, замедляя их инактивацию и длительно поддерживая протекание по ним Ма+-тока, вызывая тем самым сильную деполяризацию мембраны. Быстрое снижение мембранного потенциала по механизму регенеративной реполяризации в данном случае невозможно, поскольку ве-ратридин сдвигает кривую Ма^-активации в сторону отрицательных потенциалов более чем на 110 мВ СЬеНэои^г е1 а1., 1986) и подавляет быструю Ыа+-инактивацию СХодоров, 1990). Этим можно объяснить значительное увеличение СД и отсутствие ГПТ в опытах с

вератридином.

На основании того, что ПТГ не устраняется при ингибировании активного транспорта (оуабаином, ортованадатом, йодацетамидом, Liраствором), блокировании К+-тока СТЗА, 4-АР и ионами Ва^"1") и анионного обмена С SITS), но уменьшается при воздействии на Na^-систему (вератридин, ТТХ, лидокаин), можно предположить, что генерация ПТГ обусловлена снижением Na^-проницемости мембраны в результате развития в процессе ритмической стимуляции нервного волокна медленной инактивации Na^-каналов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время наибольшим признанием пользуется гипотеза, согласно которой ПТГ обусловлена деятельностью злектрогенного Na+,К+-насоса и сохранением повышенной проницаемости мембраны для ионов К+ С Connelly, 1959; Nakajima, Takahashi, 1966; Rang, Ritchie, 1968; Каталымов, 1974, 1975 и др.). Сам Факт участия данных процессов в поддержании мембранного потенциала не вызывает сомнений. Данная гипотеза хорошо объясняет ряд экспериментально установленных фактов. Так, увеличение амплитуды ПТГ с ростом частоты стимуляции легко можно объяснить повышением концентрации ионов Ма+ внутри волокна в процессе тетанизации и. следовательно, усилением работы электрогенного К+-насоса. Повышение концентрации ионов Na+ в омываюцем растворе также вызывает увеличение амплитуды ПТГ, что, с точки зрения данной гипотезы, объясняется активацией Na"1", К+-АТФазы, вызванной увеличением входа Na+ в волокно во время стимуляции. Данная гипотеза объясняет также отсутствие медленного компонента ПТГ в препаратах с "открытым" перехватом Ранвье нарушением целостности волокна при препаровке и, следовательно, повреждением системы активного транспорта.

Однако, данная гипотеза наталкивается на ряд трудностей при объяснении других Фактов. Так, проведенные нами эксперименты показали, что ингибирование Na+, К^-насоса специфическим блокато-ром - оуабаином, блокатором Р-АТФаз - ортованадатом, блокатором гликолиза - йодацетамидом, эквивалентной заменой ионов Na+ в омывающем растворе на ионы Li+ не вызывало устранения ПТГ. Наоборот, в первые минуты действия оуабаина и ортованадата происходило увеличение Сна 23,8 %) ее амплитуды. Подавления ПТГ не наб-

людалось даже при длительном действии С 90 минут) высоких концентраций специфического блокатора Na+, К+-АТФазы - оуабаина, возникала только задержка в ее генерации в Форме деполяризационного плато. Подобное плато наблюдалось в опытах со всеми веществами, блокирующими активный транспорт мембраны.

Электрогенной природе происхождения ПТГ противоречат Факты отсутствия подавления амплитуды ПТГ при комбинированном воздействии оуабаина и бескалиевого раствора, при охлаждении до 5 °С омывающего препарат раствора Рингера. На основании получанных данных мы можем предположить, что Na-1-, К+-насос принимает участие только в востановлении трансмембранного градиента для ионов Na+ и К+, но не вызывает гиперполяризацию мембраны.

Вторым возможным объяснением возникновения ПТГ является сохранение повышенной проницаемости мембраны для ионов К+ (Gage, Hubbard, 1966: Minota, 1974: Goh, Ftennefather, 1987: Toshlhiko, Takayuki, 1990). Однако и эта гипотеза не в состоянии объяснить имеющиеся экспериментальные данные. Так, блокирование К+-каналов ТЭА и 4-АР не только не устраняло, но даже, наоборот, вызывало увеличение амплитуды ПТГ в среднем на 5&-60 % от исходной величины. Подобное противоречие можно было бы объяснить участием особого нечувствительного к действию данных блокаторов медленного Са^+-активируемого К^-тока СGoh. Pennefather, 1987; Toshihiko, Takayuki, 19903. Однако, против этого свидетельствует Факт нечувствительности ПТГ к воздействию блокатора Са^-активируемых К"ь-каналов-Ва5г",\ блокатора входа ионов в

клетку - Ni'^, а такж.е кальшй-хе датирующего агента - ЭГ'ГА.

Третье возможное объяснение происхождения ПТГ - увеличение проницаемости мембраны для ионов хлора, подобно тому, как это происходит в нейронах парасимпатического ганглия кролика CTakashi et. al., 1990). Проведенные исследования показали» что блокирование анионного обмена 1 мМ SITS не только не подавляла, но, даже, несколько увеличивала амплитуду ПТГ. Нечувствительность ПТГ к блокированию Cl--проницаемости мембраны за счет эквивалентной замены ионов С1~ в омывающем растворе на S04'2- или изотионат отмечалась в опытах на нейронах ЦНС пиявки С Jansen, Nicholls, 1973), безмякотнын нервных волокнах кролика (Rang, Ritchie, 1968), миелинизированных нервных волокнах лягушки С Катал ымо в, 1974). Таким образом, можно заключить, что С1~-ток не участвует в генерации ПТГ миелинизированных нервных волокон.

Полученные результаты не подтверждает* названные выше гипотезы происхождения ПТГ. Остается предположить, что ПТГ может быть связана с увеличением соотношения Pk/PNa за счет уменьшения РМа в покое. Снижением Na^-проводимости объяснялась длительная си-наптическая гиперполяризация в симпатических нейронах млекопитающих С Weight, Paüjen, 1973: Smith, Weight, 1977; Wilson, Wachtel, 1978). В миелиниэированных нервных волокнах уменьшение PNa в покое может быть связано с развитием медленной инактивации Ыа^-каналов, обеспечивающих Иа^-проницаемость покоящейся мембраны С Dubois, Bergman, 1973; Taylor, 1993). Эти медленно инактивирукщиеся Ыа^-каналы переходят в инактивированное состояние при длительной деполяризации мембраны, вызванной ритмической стимуляцией CGilly, Armstrong, 1984; Stafström et. al., 1985: Taylor, 1993). В результате доля данных каналов, открытых при потенциале покоя, уменьшается, и мембранный потенциал приближается к К+-равновесному потенциалу. Подтверждением предположения, что ПТГ обусловлена снижением Ма^-проницаемости, являются опыты с модификатором Ыа+-каналов - вератридином. Вератридин взаимодействует с Na^-каналами и подавляет их способность к инактивации, в результате чего данные каналы остаются в проводящем состоянии и поддерживают достаточно высокую Ыа+-проницае-мость после окончания ритмической стимуляции, что приводит к устранению ПТГ и развитию большой по амплитуде следовой деполяризации.

Другим свидетельством Ыа+-гипотезы генерации ПТГ являются опыты со специфическим блокатором Ма+-каналов _ ТТХ и местным анестетиком лидокаином. Данные вещества блокируют все типы Ыа+-каналов, в том числе и медленно инактивирукщиеся (Cteisz, Fortin, 1991: Taylor, 1993). В наших экспериментах ТТХ вызывал снижение Na^-проницаемости мембраны, что проявлялось в параллельном снижении амплитуды ПД и ПТГ. Сходные изменения амплитуды ПД и ПТГ происходили при аппликации местного анестетика - ли-докаина, что так же подтверждает Иа+-гипотезу происхождения ПТГ, согласно которой гиперполяризация мембраны обусловлена снижением PNa вследствие инактивации медленно инактивируицихся Ыа+-каналов, развивающейся в процессе ритмической стимуляции.

ВЫВОДЫ

1. Следовая гиперполяризация интактного перехвата Ранвье, развивающаяся после окончания высокочастотной стимуляции нервного волокна С ПТГ) не может быть объяснена активностью электрогенного Ыа+,К+-насоса, поскольку она не ослабляется при блокаде этого насоса оуабаином (1, 2, 5, 10 мМ), ортованадатом, эквивалентной заменой Ма-1" в омывающем растворе на охлаждением наружного раствора до 5 °С.

2. При блокировании N3""% К^-насоса оуабаином выявлена задержка в генерации ПТГ в форме плато посттетанической деполяризации СПТД). Длительность плато ПТД при действии блокатора С 1,2,5 и 10 мМ) увеличивается с ростом частоты и длительности стимуляции, концентрации и времени экспозиции блокатора. Бескалиевый раствор, двухвалентные ионы Са^-Ч 10 мМ) и Г-Л^-1! 1 мЮ, специфический блокатор К^-каналов 4-АР С2 мМ) увеличивают продолжительность плато ПТД, а ТЭА СЮ мМ) вызывает его сокращение.

3. Блокаторы К--каналов: 4-АР (2 мМ), ТЭА С1&-40 мМ) и Ва^+С1 мМ) и агенты, ослабляющие Са^-активируемый К^-ток: ЭГТА (25 мкМ) и Щ^С! мМ) не оказывают существенного влияния на ПТГ.

4. Блокирование Ыа+-каналов ТТХ С1*10-е М) и лидокаином С 2 мМ) вызывает устранение плато ПТД и подавление амплитуды ПТГ.

5. Полученные экспериментальные данные о свойствах и условия« возникновения ПТГ могут быть наилучшим образом интерпретированы, если принять, что ПТГ обусловлена частичной Ма+-инакти-вацией, развивающейся при деполяризации мембраны перехвата во время длительной высокочастотной стимуляции. Происходящее при этом снижение натриевой проницаемости покоящейся мембраны приближает потенциал покоя к калиевому равновесному потенциалу, что и проявляется в виде ПТГ. Последняя имеет преходящий характер, поскольку гиперполяризация мембраны устраняет Ыа+-инактивацию, что и приводит к возвращению мембранного потенциала к уровню потенциала покоя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валкина 0.Н., Крончева С. Н. Влияние рН омывающего раствора на посттетаническую гиперполяризацию миелинизированных нервных волокон// Тез. докл. I Поволжской конФ. молодых физиологов. - Самара: 1992. - С. 10.

2. Крончева С. Н. Влияние 4-аминопиридина на посттетаничес-кую гиперполяризацию миелинизированных нервных волокон// Материалы научно-методической конференции. - Ульяновск: УГПУ им. И. Н. Ульянова. 1994. - С. 21-22.

3. Валкина 0. Н., Вергун 0. В., Крончева С. Н. Влияние 4-АР и С02 на следовые потенциалы миелинизированных нервных волокон// Успехи Физиол. наук. - 1994. - Т. 25, N1. - С. 78-79.

4. Vergun 0. V., Kroncheva S. N., and Valkina O.N. 4-Aminopy-ridine Increases Afters-Potentials and Induces the Spontaneous Activity in Single Myelinated Nerve Fibres// Membr. and Cell Biol. - 1995. - V.9. - P.69-74.

5. Крончева С. H. Влияние ионов никеля на электрическую активность нервных волокон озерной лягушки// Региональные зколо-го-фаунистические исследования как научная основа фаунистическо-го мониторинга: Тез. докл. научно-практической конф. - Ульяновск: УлГПУ, 1995. - С. 172-173.

6. Крончева С. Н. Влияние оуабаина на ПТГ миелинизированных нервных волокон// Материалы научной конференции "Актуальные проблемы физиологии человека и животных". - Ульяновск: УлГПУ. -1996. - С. 17-18.