Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прионные и неприонные амилоиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Прионные и неприонные амилоиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
На правах рукописи
ВИШНЕВСКАЯ АЛЕКСАНДРА БОРИСОВНА
ПРИОННЫЕ И НЕПРИОННЫЕ АМИЛОИДЫ ДРОЖЖЕЙ ХАССНАЯОМУСЕЯ СЕКЕУШАЕ
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2006
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Федерального Государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва.
Научный руководитель:
Кандидат биологических наук В. В. Кушниров
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Л.Ю. Фролова кандидат биологических наук А.В.Воротников
Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится «30» ноября 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208.073.02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологи ФГУ РКНПК Росздрава.
Автореферат разослан «30» октября 2006 года.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических
наук
Венгерова Т.И,
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Более 20 болезней человека связаны с аномалиями в формировании пространственной структуры белков, что приводит к образованию амилоидов, представляющих собой агрегаты фибриллярной структуры, состоящие из растворимых в норме клеточных белков. Такие заболевания называют амилоидными или амилоидозами. Из амилоидозов наиболее известны болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона, весьма распространенные среди пожилого населения развитых стран. Значительное количество данных указывает на то, что к амилоидозам относятся и прионные заболевания. В отличие от прочих амилоидозов, прионные заболевания инфекционны. Уникальность прионов состоит в том, что их инфекционность связана не с ДНК или РНК, а с белком. К прионным заболеваниям относят ряд неизлечимых нейродегенеративных болезней человека и животных, таких как болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, куру человека, скрейпи овец и коз, бычью губчатую энцефалопатию (коровье бешенство). Все эти прионные болезни связаны с единственным белком, называемым РгР-
Можно полагать, что феномен прионов и амилоидов гораздо шире распространен в природе, чем это известно на сегодняшний день, и необязательно связан с развитием заболеваний. Прионные свойства некоторых белков обуславливают эпигенетическое наследование признаков у дрожжей ЗассЫготусез сегеушае и ЗсЫгозасскаготусех ротЬе и гриба РснЗозрога аюеппа. Прионоподобные свойства одного из белков улитки Лр1уз1а саН/огпгса могут лежать в основе механизмов формирования долговременной памяти. Более того, у млекопитающих найдены амилоидные белки, выполняющие в норме важные физиологические функции. Так, амилоидные полимеры белка Рше117 являются матрицей для полимеризации предшественника меланина.
Хотя прионы дрожжей были обнаружены значительно позже, чем прионы и амилоиды животных, в настоящее время они во многих отношениях изучены более подробно. Это связано с удобством дрожжей для изучения фундаментальных свойств прионов и амилоидов. Ключевыми достоинствами Я. сеге\пз1ае в качестве модельного объекта для изучения прионов являются как их безопасность, так и прекрасная разработанность в качестве генетического и молекулярно-биологического объекта.
Несмотря на значительный прогресс в изучении прионов и амилоидов, многое в их природе остается не выясненным. В частности, не ясно, чем прионы отличаются от амилоидов. Другими словами, почему прионные заболевания трансмиссивны, то есть
могут передаваться инфекционным путем, в то время как остальные амилоидозы этой способностью не обладают? В чем заключается природа барьера на пути передачи прионной инфекции между организмами, относящимися к разным видам? Поиску ответов на эти и некоторые другие вопросы и посвящена настоящая работа.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение свойств, отличающих прионные и неприонные амилоидные полимеры. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи;
1. Исследование прионоподобных полимеров белка Sup35, возникающих при его сверхпродукции;
2. Изучение лрионных и амилоидных свойств глутамин-богатых белков.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые показано, что белки дрожжей S. cerevisiae Sup35 и Rnql могут образовывать как прионные, так и неприонные, то есть йена следуемые, полимеры, сходные с амилоидами млекопитающих. Показано, что в отличие от нрионных полимеров, образующихся в клетках дрожжей, неприонные полимеры неэффективно фрагментируются и не наследуются в клеточных поколениях, присутствуя за счет постоянного возникновения de novo. Обнаружена способность амилоидов, образованных разными белками, способствовать возникновению друг друга, что указывает на роль ко-полимершадии различных амилондогенных белков б патогенезе амилоидных заболеваний человека. Исследована способность белков, содержащих протяженные полиглутаминовые последовательности образовывать в клетках дрожжей прионные и неприонные амилоидные полимеры. Полученные результаты позволили определить прионы дрожжей как амилоиды, способные фрагментироваться. Сформулирована гипотеза о молекулярной основе межвидового барьера на пути передачи прионной инфекции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института Экспериментальной Кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава (2006); III съезде ВОГиС 6-12 июня 2004, Москва; 8-ой Международной Пущикской школе-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г., Пущино; HHMI Meeting of International Research Scholars, Merida, Mexico, June 22 - 25, 2005; Prion Biology - Joint Cold Spring Harbor Laboratory/ Wellcome Trust Conference, Hmxton, UK, September 7- 11, 2005; British Yeast Group Meeting, 5-7 April 2005, University of Kent, Canterbury.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья и S тезисных сообщений, 2 статьи находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 160 страницах и включает 24 рисунка, 4 таблицы и список литературы, содержащий 190 ссылок,
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы S. cerevisiae и К coli. В работе использовали штаммы дрожжей: 5V-H19 (MAT a ade2-l SUQ5 canJ-100 Ieu2-3J12 ura3-52 [PS/*] [P/N*] или [рл ]f>i7f])(Ter Avanesyan et al, 1994); 5V-H19-35C (МАТй ade2-l SUQ5 can!-100 Ieu2-3,U2 uraS-52 SVP35C [PIN*] или \pin\) (Kryndushkin et al., 2003); 74-D694 (MATa ura3-S2 leu2-3,112 trpl-289 his3-A2QQ adel-lA) (Chernoff et. al., 1995), Производные этого штамма с делецнями генов SUP35, RNQ1, HSP104 и заменой гена SUP35 на SUP35-Q66 получены в данной работе. Для стандартных процедур молекулярного клонирования был использован штамм Е. coli DH5a [supE44 Mac U169 (ф80 lacZ№A\5) hsdRM recAl endA\ gyrA96 thi-\ relAX\ (S ambro ok et al, 1989a). Для бактериальной экспрессии белков использовали штамм Е. coli В BL21-CodonPlus-R3L {[ГотрТhsdS(TbmB~) dcm+ Tef gal endA Hte\argUileYleuW Cam')} (Stratagene).
Генетические методы. Трансформация микроорганизмов. В работе использовали стандартные' методы генетики дрожжей (Sherman et al., 1986). Трансформацию дрожжей S. cerevisiae проводили согласно Gietz et al. (1995). Трансформацию Е. coli DH5a (Sambrook et al., 1989) осуществляли по методу Inoue et al. (1990), Для выявления детерминанта [PS/*] была использована генетическая система, основанная на супрессии мутации adel-14t позволяющая определять наличие детерминанта [PS/*] или любого другого супрессорного фенотипа визуально по цвету колоний. Колонии клеток, не содержащих детерминант [PS/*3, то есть \psi\ имеют красный цвет и не растут на среде без аденит. Колонии клеток [PS/*] имеют розовый или белый цвет в зависимости от варианта [PS/4] и растут при отсутствии аденина в среде.
Конструирование плазмнд и другие генно-инженерные манипуляции. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli и конструирование плазмид проводили в соответствии со стандартным протоколом Sambrook et al. (1989). Секвенирование ДНК производили в соответствии с Sanger et al. (1977).
Измерение Jî-галактозидазной активности в клетках дрожжей. Измерение Д-галактозидазной активности и определение эффективности сквозного прочтения нонсено-кодонов проводили в соответствии с Staiisfîeld et al. (1995),
Флуоресцентная микроскопия. Дяя визуализации амилоидных агрегатов клетки дрожжей были трансформированы плазмидой, кодирующей белок Sup3 5NM~eGFP. Просмотр препаратов вьшолняли на микроскопе Axioskop 40FL (Carl Zeiss) с использованием объектива ЮОх Plan-NEOFLUAR. Фотографирование выполняли с помощью фотокамеры QIMAGING micropublisher TV 2/3 " 0,63x 1069-414.
Экспрессия в В. cotí, аффинная очистка белка Rnql-His<,. Экспрессию рекомбинантного белка в бактериальных клетках проводили согласно протоколу Sambrook et al., (1989). Для проведения аффинной очистки Rnql- HÍSú применяли смолу TALON IMAC (Clontech) в соответствии с протоколом.
Получение и очистку антител к белку Rnql-HIsc осуществляли согласно протоколу (Остерман, 1983),
Белковый гель-электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методике Laemmli (1970). Для электрофоретического разделения пр ионных полимеров использовали метод полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) (Kryndushkin et al.t 2003). Электрофоретическое разделение полимерной и мономерной форм Sup35 или его гибридов осуществляли согласно Kushnirov et al. (2006). Для анализа белков методом иммуноблоттинга проводили их электрический перенос на нитроцеллюлозную мембрану (после SDS-PAGE) или вакуумный перенос на мембрану PVDF (после SDD-AGE). Белки идентифицировали с помощью видоспецифических антител, коньюгированных с лероксидазой хрена, активность которой проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (Amersham Bioscience).
Прионнын переход Sup35 in vitro. Переход белка Sup35 в прионную форму in vitro был осуществлен в соответствии с Paushkin et al. (1997а).
' РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сверхпродукция белка Sup35 в клетках [pif] [MTV*] приводит к образованию его амилоидной формы. Фактор термянации трансляции дрожжей Sup35 (eRF3) имеет четко выраженную модулярную структуру и состоит из трех районов, часто называемых доменами. Аминоконцевой домен белка (N) не существенен для его функции, но необходим и достаточен для возникновения и наследования [PSf], то есть для перехода белка Sup35 в прионную форму. Роль срединного района (М) до конца не выяснена.
Карбоксиконцевой домен (С) жизненно важен и отвечает за функцию белка в терминации трансляции. Функциональная инактивация фактора терминации трансляции Sup35 (eRF3) в результате мутаций в соответствующем гене или перехода белка в прионное состояние приводит к появлению нонсенс-супрессорного фенотипа. Модулярная структура Sup35 позволяет использовать его для проверки прионогенного потенциала других белков или их отдельных участков. Для этого при помощи манипуляций с ДНК прнонный домен Sup35 заменяют исследуемым полипептидом и изучают способность полученного химерного белка вызывать в клетках дрожжей фенотип подобный [Р£Г]. Можно также заменять не прионный, а функциональный домен Sup35. Часто домен С Sup35 меняют на зеленый флуоресцирующий белок (GFP), что позволяет следить за прионными агрегатами в клетках дрожжей по появлению флуоресцирующих структур, имеющих форму точек, пятен, а иногда и жгутов.
Парадоксально, но сверхпродукция Sup35 также может вызывать супрессию нонсенс-мутаций. При этом супрессия не связана с возникновением приона [PSf~\> поскольку супрессорный фенотип не наследуется: он не проявляется в условиях, не селективных для супрессии, и исчезает при отсутствии сверхпродукции Sup35. Молекулярная основа феномена этой «мультикопийной супрессии» неясна. Известно, что мультикопийная супрессия зависит от наличия прионного домена белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al, 1993), а также от прионного детерминанта [PIN*], который способствует появлению [PS/*] при сверхпродукции Sup35 (Deikatcb et al, 1997).
Для исследования механизма «мультикопийной супрессии», в клетки [р^Г] [/V//*] вводили мультикопийные плазмиды, несущие либо ген SUP35, либо SUP35NM-eGFP (кодирует район NM белка Sup35, сшитый с зеленым флуоресцирующим белком) или контрольный вектор (не несущий ген SUP35). Отсутствие супрессорного фенотипа у большинства колоний (о чем судили по их красному цвету) говорило о том, что Sup35 находился в неприонной форме. Тем не менее, в результате электрофоретического анализа (SDD-AGE) лизатов клеток полученных трансформантов мы обнаружили в \psf\ клетках, сверхпродуцирующих Sup35, SDS-устойчивые полимеры (рис. 1).
Устойчивость к SDS при комнатной температуре характерна для амилоидных фибрилл Sup35, полученных in vitro (Serio et al., 2000), и прионных частиц Sup35 из дрожжевых лизатов (Kryndushkm et al., 2003), Интересно, что обнаруженные полимеры Sup35 имели гораздо больший размер, чем прионные в клетках [Р5Г]. Известно, что для наследования приона [Р57*] в ряду клеточных поколений (т.е. его «инфекционности») необходим шаперон Hspl04, который фрагментирует прионные полимеры, размножая инфекционные «семена» (Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998; Kryndusbkin et al, 2003).
Большой размер полимеров ЭирЗЗ, выявленных в нашей работе, указывает на то, что эти полимеры фрагментируются неэффективно, что должно приводить к уменьшению эффективности полимеризации мономерного 5ир35 (КгупйизЫап е1 в/., 2003) (поскольку при этом уменьшается количество концов полимеров, с которыми связываются мономеры 5ир35 в процессе полимеризации). При этом может не происходить увеличение уровня
Рисунок 1. Прн сверхпродукции Бир35 образует 505-нерастворимые полимеры. Клеточные лизаты были проанализированы при помощи БОБ-АОЕ. Иммуноблоттннг с антителами против Бир35, (I), клетки [РЗ/*]; (2), клетки [¿ш^ЦР/Л^], трансформированные контрольным вектором УЕр1ас181; (3)-(5), трансформанты, несущие мультвкопийную плазмиду УЕр1ас181-5ир35. Плазмиду вводили в клетки штаммов с генотипами: (3) [иПЕ^О; (4) \рзГ\\рт\, (5) \psrWPBf\dmql (делеция гена КЫ<21 была осуществлена после трансформации плазм идой Уер1ас181-5иР35).
Количественный анализ подтвердил, что эффективность прочтения всех трех нонсенс-кодонов при введении многокопийной плазмиды с геном БиР35 в штаммы \р$г\ не увеличивается, а остается на прежнем уровне, что согласуется с антисупрессорным фенотипом этих клеток (данные в автореферате не приведены).
Характерным свойством амилоидных и прионных белков является способность инициировать полимеризацию белка того же типа ш у//го. Агрегаты гибридного белка БирЗ 5ЫМ-еСРР, выделенные из трансформангов, сверхпродуцирующих данный белок, были способны инициировать полимеризацию вир35 т и/го, хотя и с меньшей эффективностью, чем агрегаты Бир35 из клеток [Р5Г] (рис. 2).
Мы сравнили количество общего и растворимого ЭирЗЗ в клетках \р$г][Р1ЬГ}, в • норме и при сверхпродукции 5ир35. Оказалось, что количество общего и растворимого Бир35 при его сверхпродукции превышало количество общего БирЗ 5 в норме в 20 раз и в 3 раза соответственно (данные в автореферате не приведены). Таким образом, 15% ЭирЗЗ в клетках таких трансформантов присутствовало в растворимой форме, а 85%- в полимеризованной. Следовательно, минимум 85% клеток содержало полимеры 5ир35 при сверхпродукции этого бедка.
прочтения нонсенс-кодонов.
г
Стаот
кДа 4200
1 2 3 4 5
740 205
мономер Эир35
(мономер) '^чТТ:
Sup35NM-eGFP ^^fjf- .Jffr¡.^Ш^^У^ Источник агрегатов [psí] \pin] [ps/] [pin"] [Psí]
Рисунок 2. Полимеры Sup35NM-eGFP, полученные при его сверхэкспресснн, инициируют полимеризацию Sup35 in vitro. Лиззты штамма \psr]\pirí] были смешаны с лизатами штаммов twritpml, [рл^Р/Л^] и [PSt), сверхпродуцирующих Sup35. Смеси инкубировали в течение 2 часов, фракционировали улътрацентрифугнрованием и анализировали ори помощи SDS-PAGE с последующим иммуноблоггингом с антителами против Sup35. О переходе белка Sup35вприонное состояние судили по его появлению во фракции осадка. Т, тотальный лизат; S, супернатант; Р, осадок.
Характерным свойством прионных полимеров Sup35 является зависимость их возникновения от детерминанта [/VAT] (Derkatch et al, 1997), который соответствует прионному состоянию белка Rnql (Derkatch et alt 2001, Sondheimer and Lindquíst, 2000). При этом важно, что наследование [PS7*] от детерминанта [PIN*] не зависит (Derkatch et al., 2000). Мы проверили, зависят ли обнаруженные полимеры Sup35 от [PIN*). Для этого в штаммах и [psr\[pbi] ([pin'] означает отсутствие детерминанта [-Р/АЛ])
сверхэкспрессировали Sup35. Оказалось, что клетки штамма [PIN*) содержали SDS-устойчивые полимеры, а клетки штамма [pin) таких полимеров не содержали (рис. 1). При сверхпродукции Sup35NM-eGFP в тех же штаммах в клетках [PIN*] наблюдали агрегаты (в виде зеленых светящихся точек или пятен), а в [pin') - нет (диффузное свечение) (рис. 3).
Таким образом, возникновение полимерного состояния Sup35 de novo зависит от [PIN*]. Более того, элиминация [PIN*] при делеции гена RNQI в клетках [¿wf][/YjV*], содержащих полимеры Sup35, приводила к их исчезновению, что было показано методом SDD-AGE (рис.1) и с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 3).
Таким образом, мы показали, что как возникновение de novo, так и существование в клетке данных полимеров Sup35 зависело от [Р/ЛП- Это свидетельствует о том, что они отличны от прионных, то есть плохо наследуются в клеточных делениях и существуют за счет постоянного образования de novo. О неэффективной фрагментации этих полимеров шаперонами (следствием чего является плохое наследование) говорит их большой размер и высокий уровень растворимого Sup35. Таким образом, неспособность к наследованию (т.е. отсутствие прионных свойств) дают основание относить такие амилоидные полимеры к неприонному типу.
LP/ЛП
\DÍn\
Arnal
Рисунок 3. Возникновение de novo агрегатов белка Sup35 зависит от детерминанта IPAV*].
Приведены фотографии клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа.
[Р/Л*], [pin] - клетки (/»ir], содержащие детерминант [PIN*] и не содержащие его ([ргл*]), были
трансформированы мулътикопийной шшмидой YEpiac 181 -Sup35NM-eGFP, Агрегацию белка,
(появление светящихся пятен), наблюдали только в клетках [PIN*].
J rnql - в клетках ¡pjí"J трансформированных мультикопийной плазмидой
YEpiac 181 -Sup35NM-eGFP, был делегирован ген RNQL Агрегация белка Sup35NM-eGFP в таких клетках исчезала, о чем свидетельствовало диффузное свечение.
Полимеры белка Sup35 содержат Rnql. Строгая зависимость полимеризации Sup35 при его сверхпродукции от детерминанта [РЖ*] согласуется с ранее полученными данными о том, что фибриллы Rnql ускоряют прионный переход Sup35NM in vitro (Derkatch et ai, 2004), что может свидетельствовать об инициации полимеризации Sup35 на полимерах Rnql. Чтобы проверить эту гипотезу, мы попытались обнаружить белок Rnql в составе полимеров Sup35, образующихся in vivo. Для этого мы разработали метод аффинного выделения амилоидных полимеров Sup35 из лизатов клеток дрожжей. Штамм [PIN*], в геноме которого находился аллель SUP35-C, кодирующий только С-домен Sup35, трансформировали многокопийными плазмцдами, кодирующими гибридный белок Sup3 5NM-Hísé, представляющий собой белок Sup35NM, к которому подшита последовательность из 6 гистидинов, а также белок Sup35NM-eGFP, который был нужен для визуального контроля за процессом выделения полимеров. В контрольном трансформанте экспрессировали только Sup35NM-eGFP. Известно, что к растворению в SDS при комнатной температуре в лизатах клеток дрожжей устойчивы только амилоидные комплексы (Kryndushkín et al, 2003). Если амилоидная форма Sup35 кополимеризуется с Rnql, то связь между этими белками должна быть устойчива к действию SDS. Тотальная фракция амилоидных полимеров, в составе которой находилась искомая фракция полимеров Sup35, была выделена из дрожжевых лизатов путем
ультрацентрифугирования в присутствии 2% БОЭ (КияИтгоу е? а/., 2006). Из полученного таким образом препарата выделили полимеры белка БирЗЗ методом аффинной хроматографии на хелатной смоле в присутствии ЗОБ. Анализ выделенных полимеров 5ир35 с помощью БВЗ-РАОЕ выявил наличие в них белка причем эти полимеры
содержали примерно 1/5 от его общего количества в клетке (рис. 4).
Рисунок 4, Белок Кгщ1 присутствует в полимерах 5ир35. Электрофорегический анализ образцов, выделенных с помощью аффинной хроматографии. Иммуноблотшнг с антителами прошв БирЗЗ и 1^1. (1), фракция полимеров 5ир35>1М-Н15б и 8ир351ЧМ-еСРР; (2), тот же образец, что и в полосе (1), но разведенный в 5 раз; (3)-{4), контроль (полимеры Зир35ЫМ-еОРР); (5)-(7), последовательные 5-кратные разведения исходных клеточных экстрактов
.. 1. 2 3 4 5 6 7
SUD35NM- '''' '"'."'г' /
-eGFP +ГТ-:
Sup3SNM-' -His> Rnq1
Наличие Rnql в составе амилоидных полимеров Sup35 подтверждает гипотезу прямой инициации полимеризации Sup35 прионными полимерами Rnql, а также предположение о том, что такие полимеры существуют в клетках дрожжей благодаря постоянному возникновению novo на матрице, образованной полимерами Rnql.
Агрегация белка Sup3S приводит к супрессии нонсенс-мутаций. Обнаруженные амилоидные полимеры белка Sup35, образующиеся при его сверхэкспрессии, могли являться принципиальной основой «мультикопийного» супрессорного эффекта, проявляющегося в условиях селекции на супрессию, т.е. при росте на среде, не содержащей аденин (рис. 5),
0
' Sup35 Sup3 5NM-eGFP
Рисунок 5. «Мультикопнйная супрессия» в клетках [ржГЦИЛЛ], сверхпродуцирующнх белок 8ир35. Рост трансформантов на среде, селективной для супрессии (не содержащей аденин). (0) - контрольный вектор (не содержит ген 5ир35у, (Бир35), (5ир35КМ-еСРР) -мультикогшйные векторы УЕр1ас181-8ир35 и \Тр1асШ-8ир35^-еОРР, с генами, кодирующими соответствующие белки. Однако, возникает вопрос, в чем причина супрессорного фенотипа, если исходно в клетках, сверхпродуцирующих БирЗЗ, присутствует избыток мономерной формы этого
белка, что обусловливает антнсупрессорный фенотип? Логично предположить, что при переносе таких трансформантов в среду, не содержащую аденина, то есть селективную для супрессии, происходит селекция клеток с уменьшенным количеством растворимого Sup35. Чтобы это проверить, мы проанализировали мономерную фракцию Sup35 разработанным в нашей лаборатории электрофоретическим методом разделения полимерной и мономерной форм белка Sup35 в SDS-PAGE (Kushnirov et al., 2006). Оказалось, что количество растворимого Sup35 существенно уменьшается при выращивании клеток на среде, не содержащей аденина (рис. б). Таким образом, причиной мультикопийной супрессии является недостаток в клетке функционального Sup35.
^^^ '■^'•wvS*-' ^«^Ж-'-Т^ММЧ*^ „.;<■-, ■ ,-,,. ..vv
разведения Н/зг'шбИд мм чд ' им м/2 ' i j сред 4 +Ädi ^ ' -Ade
Рисунок 6. «Мультнкопнйная супрессия» происходит за счет уменьшения количества функциональной формы Sup35. Определение уровня растворимого Sup35. Клеточные лизаты были выровнены по общему количеству белка, разведены, как указано, смешаны с буфером для образцов, содержащим SDS, нанесены на SDS-PAGE без кипячения и после электрофореза проанализированы иммуноблоггингом с антителами против Sup35. На рисунке представлена фракция мономеров Sup35, поскольку полимеры этого белка застревают при входе в полиакриламкдный гель вследствие своих больших размеров. (+Ade), наличие аденина в среде; (-Ade), его отсутствие.
Помимо уменьшения количество мономерного Sup35 в клетках, выращенных на среде, селективной для супрессии, наблюдали уменьшение среднего размера полимеров этого белка (рис. 7). При неизменном общем количестве Sup35 уменьшение размеров его полимеров означает возрастание их числа, а значит, и количества концов полимеров, по которым происходит полимеризация (KryndushkLn et al., 2003).
Рисунок 7. Размер полимеров Sup35 зависит от условий, в которых выращены клетки, сверхпродуцирующне этот белок. Клеточные лизаты были проанализированы с помощью SDD-AGE. Иммуноблоттивг с антителами против Sop35. Клетки свсрхпр оду пирующие Sup35, выращивали на среде, селективной для поддержания плазмиды, которая содержала (1) или не содержала (2) аденни. Клетки, выращенные, как указано в пункте (2), переносили в среду, селективную для плазмиды, но содержащую аденин (3),
Полиглутамнновые и полиглутамин-тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуютси in vivo. При болезни Хантингтона, для которой не была показана инфекционность, в нервных клетках образуются амилоидные отложения белка хантинггина, содержащего удлиненные глутаминовые последовательности. Известно, что способность прионных белков полимеризоваться определяется специфическим аминокислотным составом их прионобразующих доменов, обогащенных глутаминовыми или аспарагиновыми остатками. Для этих доменов типичными являются также остатки незаряженных аминокислот глицина и тирозина. Аминокислотный состав прионного домена более важен для определения прионных свойств данного белка, чем его специфическая аминокислотная последовательность (Ross et al., 2005). Можно предположить, что наследование прионных амилоидов происходит за счет узнавания шаперонами гидрофобных остатков, таких как тирозин, которые экспонированы наружу. Полиглутаминовая последовательность не обладает гидрофобными свойствами и, значит, должна неэффективно опознаваться шаперонами и, следовательно, плохо фрагментироваться. Можно было предположить, что добавление гидрофобных тирозиновых остатков, содержание которых в прионном домене Sup35 очень высоко, улучшит узнавание полиглутаминовых полимеров. В данной работе мы исследовали амилоидогенные свойства белков, содержащих полиглутамнновые последовательности разной длины, а также полиглутамнновые последовательности, содержащие тирозиновые остатки.
Чтобы определить, какие особенности аминокислотной последовательности амилоидогенных белков необходимы для взаимодействия сформированных ими полимеров с шаперонами, мы сконструировали 2 серии плазмид, кодирующих потенциальные прионобразующие домены, сшитые с доменами М- и С- белка Sup35: polyQ серия и polyQY серия. Плазмиды первой серии кодировали белки с гомополимерными полиглутаминовыми последовательностями вместо прионного домена белка Sup35. Плазмиды второй серии кодировали белки с полиглутаминовыми последовательностями, в которые были добавлены остатки тирозина в соотношении 4:1,
В работе были использованы мультикошшные плазмиды, кодирующие гибридные полиглутамнновые белки под контролем промотора гена SUP35, поскольку в такой конфигурации обеспечивался уровень синтеза гибридных белков, наиболее близкий к количеству Sup35 в штамме дикого типа. Для изучения свойств polyQ(Y) белков был получен штамм Asup35 [PIN*] с делецией гена SUP35, жизнеспособность которого поддерживалась за счет экспрессии аллеля SVP35-C, находящегося на центромерной
плазмиде. Этот штамм трансформировали длазмидами, кодирующими гибридные polyQ(Y) белки, с последующей потерей центромерной поддерживающей плазмиды с SUP35-C.
В отличие от [Л£Г], полимеризация гибридных белков происходила без всякой селекции клеток с супрессорным фенотипом. Клетки штаммов, синтезирующие белки poIyQ(Y), сразу проявляли супрессорный фенотип, интенсивность которого зависела от степени полимеризации соответствующего белка (данные в автореферате не приведены).
Для изучения процесса полимеризации белков polyQ(Y) с полиглутаминовой последовательностью различной длины был использован метод SDD-AGE. Полимеры этих белков появлялись в течение 30 поколений с момента начала экспрессии (30 поколений представляет их минимальное количество для того, чтобы получить из одной трансформированной клетки достаточную биомассу для биохимического анализа). Было обнаружено, что минимальная длина последовательности polyQ(Y), приводящая к полимеризации гибридного белка, составляла 51 аминокислоту для серии polyQ и 46 аминокислот для серии poIyQY. Поскольку белок QY46 на 5 аминокислотных остатков короче белка Q51, можно заключить, что добавление тирозиновых остатков к полиглутаминовой последовательности улучшает способность таких белков полимеризоваться. Кроме того, по своим размерам полимеры белков polyQ оказались значительно больше полимеров белков polyQY (рис. 8), что указывает на улучшенную фрагментацию последних, что мы и предполагали.
Рисунок 8. Полимеризация белков polyQ(Y) в клетках (Р/Л7*]. Анализ размера полимеров polyQ(Y) белков. Клеточные лизаты были проанализированы при помощи SDD-AGB с последующим иммуноблоттиыгом с антителами против Sup35. Клетки выращивали в течение 30 поколений после начала продукции гибридных белков. Продуцируемые белки указаны снизу.
Влияние шаперона Hspl04 на полимеризацию полиглутаминовых белков. Известно, что шаперон Hspl04 необходим для наследования (Chernoff et al, 1995),
поскольку он отвечает за фрагментацию прионных полимеров Sup35 (Kushnirov and Ter-
• м- Старт
Avanesyan, 1998; Kryndushkin et al, 2003). Оказалось, что делеция гена HSP104 блокирует полимеризацию белков Q70, Q85, Q131 и QY50 (рис. 9), что отражается в усилении ангисупрессорного фенотипа (данные в автореферате не приведены) и согласуется с полученными ранее данными (Krobitsch and Lindquist, 2000 Meriin et al., 2002).
Склонность к полимеризации увеличивалась с удлинением polyQ(Y)-последовательности, что отражалось в меньшей зависимости от шаперона Hspl04, Так, небольшое количество полимеров Q131 возникало через 60 поколений после начала экспрессии соответствующего гена. Эффект делеции гена HSP104 на полимеризацию белка QY76 разительно отличался от эффекта на полимеризацию белков Q70, Q85, QI31 и QY50. Полимеризация белка QY76 не прекращалась, но при этом размер полимеров QY76 был значительно больше исходного (рис. 9Е).
В
■Щ
г *
■щ
Шщ
■ J."-' J i-.^'PA
ШШ л fi :С;; mi -3' ' '' L' JfflW
ЛН164 „ S к 5 5: ^ 1 N ^ _ 5 к Й £ ^ _ 3 £ ^
Q70 Q85 Q131 QY50 QY76
Рисунок 9. Влияние делеции HSP1Q4 на полимеризацию polyQ(Y) белков. Клетки [Р/ЛГ] трансформировали плазмидами, кодирующими белки Q70 (A), Q85(B), Q13I (С), QY50 (D) и QY76 (Е). После трансформации штаммы были делегированы по HSP104 и выращены в течение 30 (АН 104*) и 150 поколений (АН]04). Клеточные лизаты были проанализированы с помощью SDD-AGE и последующего иммуноблоттинга с антителами против Sup35NM.
Полученные данные свидетельствуют о том, что Hspl04 является основным фрагментирующим фактором для полимеров белков polyQ и polyQY. Кроме того, они подтверждают наше исходное предположение о том, что гидрофобные остатки в составе
амилоидогенных последовательностей могут способствовать узнаванию соответствующих поилмеров шалеронами и их Н5р104-зависимой фрагментации. Действительно, добавление тирозиновых остатков в толиглутаминовую последовательность резко уменьшало размер образующихся амилоидных полимеров, что указывало на увеличение эффективности фрагментации (рис. 8). Следует отметить, что наличие гидрофобных остатков само по себе не гарантирует узнавание шалеронами, поскольку они обычно находятся внутри белковой глобулы. Однако разница во фрагментации полимеров poIyQ и polyQY позволяет нам предположить, что, по крайней мере, некоторые тирозиновые остатки были экспонированы на поверхности полимеров.
Способность белков polyQ к полимеризации в клетках Arnql зависит от длины полиглугаминовой последовательности. Ранее было показано, что агрегация полиглутаминовых белков (Meriia et at., 2002), также как и образование прионных полимеров Sxip35, зависит от наличия детерминанта [PIN*]. Мы решили детально изучить, каким образом этот детерминант влияет на появление полимеров белков poIyQ(Y) de novo. Для этого в клетки штаммов [PIN*], [pin] или Arnql были введены плазмиды, кодирующие белки Q70, Q85, QI3I, QY50 и QY76. Оказалось, что склонность к полимеризации увеличивалась с удлинением полиглутаминовой последовательности, что отражалось в быстром образовании полимеров белков polyQ(Y). При этом для белков poJyQ наблюдали следующую тенденцию: в клетках [PIN*] белки Q70 и Q85 полимеризовались сразу, в клетках [pin] полимеры начинали появляться через 150 поколений после трансформации, а в случае клетках с делецией гена RNQ1 полимеры не были обнаружены даже через 150 поколений (рис. 10А). Полимеризация белка Q131 начиналась сразу и в клетках [pin], и в клетках Arnql, но происходила менее эффективно (рис. 10В). Появление полимеров белка QY76 de novo не зависело от [Р/Л^-статуса клеток, а его полимеризация происходила эффективно во всех случаях (рис. ЮС).
А
В
С
12 12 12
12 12
Л mql \pin"\
4 * * ьЗ ^ 1*
[рт] Amql
Q70 Q85
Q131
QY76
Рисунок 10. Появление полимеров белков po)yQ{Y) в клетках \pin\ и Jrnql. Плазмиды, кодирующие белки Q70, Q85 (A), Q131 (В), QY76 (С) вводили в клетки штаммов [PIN*], [pin"], а также в клетки с делецией гена RNQ1 (Jrnql). (1), 30 поколений после трансформации; (2), 150 поколений после трансформации- Клеточные лизаты анализировали методом SDD-AGE с последующим иммуноблоттингом с антителами против Sup35.
Таким образом, существование в клетках дрожжей полимеров белков, содержащих протяженные полиглутаминовые последовательности, зависело от прионного детерминанта [PIN*]. Эти данные, однако, не указывают на то, какой именно этап, -возникновение или поддержание (то есть, наследование) таких полимеров полиглутаминовых белков зависит от [PIN*]. Для того, чтобы выяснить механшм зависимости от [PIN*], этот детерминант был элиминирован в клетках трансформантов, содержащих полимеры белков Q51, Q65, Q70, Q85 и QY76. С этой целью в соответствующих штаммах был делегирован ген RNQI. Оказалось, что доля полимеров в клетках таких трансформантов существенно зависела от длины полиглутаминовой последовательности. Полимеры практически полностью исчезали в случае белков Q51 и Q65, В то же время эффективность полимеризации белков Q70 и Q85 не уменьшалась (рис. 11 А). Генетические данные подтвердили биохимические: усиление антисупрессорного фенотипа наблюдали для тех штаммов, в клетках которых была
ухудшена полимеризация, т.е. в случае белков (¿51, <365, но не (370, С>85 и 0У76 (данные в автореферате не приведены). Что касается белка С>У76, то его полимеризация не ухудшалась при делецииЛЛ'2/(рис. 11В).
Рисунок 11. Влнянне делецнн гена RNQ1 на полимеризацию белков polyQ(Y). (+), ген RNQ1 дикого типа; (Д), делеция гена RNQJ. (А^В) Анализ полимеров polyQ(Y) белков методом SDD-AGE с последующим иммуноблотшнгом с антителами против Sup35NM.
Таким образом, полимеры белков polyQ(Y) могут возникать de novo и поддерживаться в отсутствие детерминанта [Р/Л^], причем эффективность их возникновения и поддержания зависит от длины полиглутаминовой последовательности и наличия в ней тирозинов. Учитывая тот факт, что шаперон Hspl04 необходим для поддержания полимерного состояния белков Q70 и Q85, а также то, что их поддержание не требует приона [PIN*\ полимеры этих белков можно отнести к классу наследуемых (прионных) амилоидов. Полимеры белков Q51 и Q65 следует относить к классу неприонных амилоидов, поскольку их поддержание в большой степени зависит от приона [PIN*], а значит за счет эффективного появления de novo.
Кополимеризацня полиглутамнн-содержащнх белков с другими глутамин-богатыми белками. Большое количество данных свидетельствует о взаимозависимости возникновения различных прионов дрожжей (Derkatch et al.t 2000; Derkatch et al, 2001; Derkatch et al, 2004; Oscherovich and Weissman, 2001). Было также показано, что амилоидные фибриллы бычьего панкреатического инсулина и легких цепей
А
В
+ Д+ Д+ Д+ + д 051 065 Q70 085 QY76
иммуноглобулинов человека ускоряют прионный переход Sup35NM in vitro (Derkatch et al., 2004), а также что агрегация гибридного белка Q82-CFP приводит к коагрегации дрожжевого глутамин-богатого белка HRP1 мышечных клетках нематода Chaenorhabdiíis elegans (Satyal et al, 2000). Мы решили детально изучить эффекты экспрессии белков polyQ(Y) на другие глутамян-богатые белки клеток дрожжей.
Появление полимеров белка Q70 в клетках [pirí], т.е. в клетках, содержащих мономерную форму белка Rnql, могло означать, что это происходило за счет возникновения детерминанта [Р/АЛ], Электрофорез в SDS-агарозном геле выявил, что белок Rnql начинал полимеризоваться через 150 поколений после введения в клетки [pin ] плазмиды, кодирующей белок Q70. Однако, когда такие клетки потеряли эту плазмиду, полимеры Rnql исчезали. Таким образом, наблюдаемые полимеры Rnql принадлежали к ненаследуемому типу амилоидов, поскольку их возникновение и поддержание зависело от появления в клетках полимеров Q70 (рис. 12А). Те же закономерности полимеризации были обнаружены и для глутамин-богатого дрожжевого белка Publ. Полимеры этого белка появлялись в клетках [pin ] одновременно с полимерами Q70 и исчезали при потере плазмиды, кодирующей Q70 (рис. 12В).
В Pub!
12- 12-
[PIN+] Q70 Q85 Q70
t ■■
1 2 -
070
Рисунок 12, Полимеры белков Q70 и Q85 инициируют полимеризацию ненаследуемых полимеров Rnql и Publ. В клетки tpin') вводили плазмнды, кодирующие белки Q70 или Q85. (1), 30 поколений после трансформации; (2), 150 поколений после трансформации; (-), после 150 поколений плазмнды были потеряны. Клеточные лизаты анализировали методом SDD-AGE с последующим имунноблоттингом с антителами против Sup35NM (А) или Publ (В).
[pin]
[pin]
Мы также обнаружили, что полимеры белков poIyQ(Y), также как и прион [P/jV*], способствуют возникновению de novo амилоидной формы Sup35, В клетках с делецией гена RNQ1, которые синтезировали белки Q70 и QY76, полимеры этих белков выступали в роли [PIN*], вызывая полимеризацию Sup35NM-eGFP. Полимеры Sup35NM-eGFP принадлежали типу ненаследуемых амилоидов, поскольку исчезали при потере плазмид, кодирующих Q70 и QY76 (рис. 13).
Sup35NM- Q70, eGFP QY76
Таким образом, полимеры polyQ белков могут инициировать полимеризацию других глугамин-богатых белков, В данной работе было показано, что прионные полимеры белка Rnql инициируют полимеризацию амилоидной формы Sup35. Аналогично паре Rnql-Sup35, можно предположить, что polyQ(Y) белки кополимеризуются с белками Rnql, Publ и Sup35 и, вероятно, с иными дрожжевыми глутамин-богатыми белками. Полученные данные имеют значение для понимания механизмов патогенеза амилоидных заболеваний. Известно, что мутантный белок htt при болезни Хантингтона может оказывать влияние на экспрессию многих генов в нейронах вследствие вовлечения в свои агрегаты важных глугамин-богатых транскрипционных факторов, таких как СВР (Li and Li, 2004) и ТВР (Stevanin et at, 2003). Можно предположить, что это происходит за счет кополимеризации СВР и ТВР и хантинггина.
Рисунок 13. Полимеры белков <370 и \г76 провоцируют появление ненаследуемых полимеров белка 8ир35КМ-СГР.
В клетках [рл ] Лтд! сверхпродуцировали белок 5ир351ЧМ-СРР. (+), клетки, синтезирующие также белки р70, <УУ7б; (-), потомки этих клеток, потерявшие плазмнды, которые кодируют (¡70, <УУ76, Клеточные лизаты анализировали методом 5Г)0-АСЕ с последующим иммуноблопингом с антителами против СИ» или5ир35С.
[PIN*]
Q70 QY76 Q70 QY76
Arnql
Межвидовой барьер на пути передачи прионного состояния. Известно, что передача прионного состояния РгР между разными видами животных затруднена или не происходит, не смотря на то, что отличия в аминокислотной последовательности гетерологичных РгР составляют лишь несколько аминокислотных остатков (Prusiner et al., 1998), Считается, что этот эффект, известный как межвидовой барьер на пути передачи прионной инфекции, является результатом того, что кополимеризация может быть нарушена даже минимальными расхождениями в первичной структуре участвующих белков. Пару белков Rnql-Sup35 можно считать моделью данного эффекта. Хотя отличия между прио иными доменами этих белков значительно больше, чем между гетерологичными РгР, их кополимеризация т vivo, как мы показали, происходит довольно эффективно. В то же время, передача прионного состояния с Rnql на Sup35 происходит очень редко, поскольку большинство возникающих полимеров Sup35 не обладает прионными свойствами. Это позволяет предположить, что и в случае РгР межвидовая передача прионного состояния затруднена не вследствие плохой кополимеризация, а потому, что возникающая при этом полимерная укладка второго белкадсотсутствием прионных свойств вследствие плохой фрагментируемости.
выводы
1, Сверхпродукция Sup35 в присутствии прионной формы белка Rnql (детерминант [РШ*]) приводит к полимеризации Sup35 с образованием амилоидов в большинстве клеток, В отличие от прионных полимеров [PS/% такие полимеры Sup35 относятся к классу неприонных амилоцдов, поскольку поддерживаются в клетках не благодаря наследованию, а за счет постоянного возникновения de novo. Получено свидетельство того, что прионные полимеры Rnql служат матрицей для инициации полимеризации Sup35.
2, Феномен трансляционной супрессии при сверхпродукции Sup35 в [P/.V*] клетках связан с образованием неприонных амилоидных полимеров белка Sup35 и уменьшением количества его мономерной формы,
3, Белки Sup35, содержащие вместо прионного домена протяженные участки остатков глутамина (белки polyQ) и глутамина с тирозином (4:1, белки polyQY) с высокой частотой образуют амилоидные полимеры в клетках дрожжей. Полимеры белков с последовательностями 70 (Q70) и 85 (Q85) глутаминовых остатков обладают свойствами дрожжевых прионов. Белки с более короткими полиглутаминовыми участками (Q51, Q56 и Q66), образуют только ненаследуемые амилоидные полимеры.
4, Фрагментация полимеров белков polyQ и polyQY зависит от присутствия шаперона Hspl04, Полимеры, образованные белком QY76, могут поддерживаться и в отсутствие Hspl04, что свидетельствует о наличии в клетках дрожжей полямер-фрагментирующей активности, независимой от Hspl04, Полученные результаты позволяют определить прионы дрожжей как амилоида, подверженные фрагментации.
5, Полимеры белков polyQ и polyQY способны инициировать образование неприонных амилоидных полимеров глутамин-богатых белков дрожжей Rnql, Sup35 и Publ.
Список опубликованных работ
I. Salnikova АВ (Vishnevskaya АВ), Kryndushkin DS, Smirnov VN, Kushnirov W, Ter-Avanesyan MD (2005), Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J Bio! Ckem. 280(10): 8808-12.
2. M.D. Ter-Avanesyan, A.B. Vishnevskaya, I.M. Alexandrov and V.V. Kushnirov. «Prion and non-prion amyloids: a comparison inspired by the yeast Sup35 protein» (принято к публикации для книги "Protein-Based Inheritance", издательство Landes Bioscience. Статья доступна в сети Интернет: bftp://www.eurekah. eom/chaptpr/3074)
3. А.Б. Вишневская, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян. Нейродегенеративные амилоидозы: дрожжевая модель (принято к публикации для журнала «Молекулярная биология»).
4. А.Б. Сальникова (АЛ*. Вишневская), Д.С. Крындушкин, И М. Александров, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян "Нестандартные прионные состояния белка Sup35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae" HI съезд ВОГиС 6-12 июня 2004, Москва. Сборник трудов, Том 2, стр.343
5. , А.Б. Сальникова (А.Б. Вишневская), ДС. Крындушкин, И.М. Александров, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян "Разнообразие амнлоидоподобных состояний белка Sup35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae" 8-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых 17-21 мая 2004 г., Пущино. Сборник тезисов, стр. 31
6. Salnikova A. (Vishnevskaya A.), Shkundina I., Alexandrov I., Kushnirov V., Ter-Avanesyan M. Heritable and Nonheritable Amyloids in Yeast Are Distinguished by Susceptibility to Fragmentation. HHMI Meeting of International Research Scholars, Merida, Mexico, June 22 - 25, 2005. Book of abstracts, p. SO.
7. Shkundina I., Salnikova A. (Vishnevskaya A), Alexandrov J,, Kushnirov V., Tuite M. and Ter-Avanesyan M. Propagation and variability of the yeast Sup35 prion. Prion Biology -Joint Cold Spring Harbor Laboratory/ Wellcome Trust Conference, Hmxton, UK, September 7-11, 2005. Book of abstracts, p. 5.
8. Salnikova AB (Vishnevskaya AB), Kryndushkin DS, Kushnirov W, Ter-Avanesyan MD. The "Stealth" [PSt] variant: implications for the prion "species barrier". British Yeast Group Meeting, 5-7 April 2005, University of Kent, Canterbury. Programme and Abstract Book, p. 33
Список сокращений
кДа - кил о Дальтон
CFP - Синий флуоресцирующий белок (Cyan Fluorescent Protein) GFP — Зеленый флуоресцирующий белок (Green Fluorescent Protein) polyQ — полиппутаминовые белки
polyQY - полиглутаминовые белки, перемежающиеся с остатками тирозина SDS - Додецил сульфат натрия (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDD-AGE - Полуденатурирующий SDS электрофорез в агарозном геле (Semi Benaturating JJetergent Agarose Sel Electrophoresis)
SDS-PAGE — SDS электрофорез в полиакриламидном геле (SDS- Ео1уДсгуlomide Gel Electrophoresis)
Принято к исполнению 27/10/2006 Исполнено 30/10/2006
Заказ №819 Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вишневская, Александра Борисовна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Прионы млекопитающих.
1.1. История открытия прионного белка PrPSc.
1.2. Доказательства прионных свойств белка PrPSc.
1.3. Свойства белка РгРс и его прионной изоформы PrPSc.
1.4. Молекулярные механизмы прионного перехода.
1.5. Существование межвидового барьера. Штаммы прионов.
2. Амилоиды и амилоидозы.
2.1. Амилоидозы человека.
2.2. Структура амилоидных фибрилл.
2.3. Любой ли белок может стать амилоидом?.
2.4. Чем обусловлено различие в инфекционности прионов и амилоидов?.
3. Прионы низших эукариот.
3.1. Цитоплазматический детерминант [HET-s] гриба Podospora anserina.
3.2. Нехромосомный детерминант [URE3] дрожжей Sciccharomyces cerevisiae.
3.3. Детерминант [PSf"\\ генетические проявления и молекулярная основа.
3.3.1. Доказательства прионных свойств Sup35. Изучение прионного перехода белка Sup35 in vitro.
3.3.2. Структура и функции белка Sup35.
3.3.3. Прионный домен Sup35: роль аминокислотного состава и олигопептидных повторов в определении прионных свойств.
3.3.4. Двухуровневая структура прионных агрегатов Sup35.
3.4. Нехромосомный детерминант [PIN*] дрожжей Sciccharomyces cerevisiae.
3.5. Роль шаперона Hspl04 в поддержании [РЯ/1-].
3.6. Варианты [PSf].
3.7. Феномен мультикопийной супрессии.
4. Исследование болезни Хантингтона в дрожжевой системе.
4.1. Факторы, влияющие на агрегацию полиглутаминовых белков.
4.1.1. Зависимость агрегации от экспрессии и количества остатков глутамина.
4.1.2. Взаимодействие шаперонов с полиглутаминовыми белками.
4.1.3. Способность прионных и амилоидных белков инициировать полимеризацию гетерологичных белков.
5. Биологическое значение и распространенность в природе прионов и амилоидов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Прионные и неприонные амилоиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
Более 20 болезней человека связаны с аномалиями в формировании пространственной структуры белков, что приводит к образованию амилоидов, представляющих собой агрегаты фибриллярной структуры, состоящие из растворимых в норме клеточных белков. Такие заболевания называют амилоидными или амилоидозами. Из амилоидозов наиболее известны болезни Альцгеймера и Паркинсона, весьма распространенные среди пожилого населения развитых стран. Значительное количество данных указывает на то, что к амилоидозам относятся и прионные заболевания. В отличие от прочих амилоидозов, прионные заболевания инфекционны. Уникальность прионов состоит в том, что их инфекционность связана не с ДНК или РНК, а с белком. К прионным заболеваниям относят болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, куру, а также фатальную семейную бессонницу человека, скрейпи у овец и коз, бычью губчатую энцефалопатию (коровье бешенство), и другие энцефалопатии, встречающиеся у кошек, оленей и других животных. Все эти прионные болезни связаны с единственным белком, называемым РгР.
Помимо животных и человека, белки с прионными свойствами были обнаружены у дрожжей Басскаютусез сегеу1з1ае. У дрожжей «инфекционность» этих прионных белков проявляется как не-Менделевское наследование соответствующих фенотипов. Прионное состояние белка 8ир35 дрожжей (фактор терминации трансляции еИРЗ) приводит к трансляционной супрессии нонсенс-кодонов. Этот фенотип, называемый [Р51/], стабильно наследуется и передается всем потомкам при скрещивании или цитодукции (обмен клеток цитоплазмой). [Р5/] может спонтанно возникать с низкой частотой и может теряться при росте на определенных средах,
Можно полагать, что феномен прионов и амилоидов гораздо шире распространен в природе, чем это известно на сегодняшний день, и может быть использован в биологически значимых механизмах. Наличие белков с прионными свойствами показано не только для дрожжей б1, сегеушае, но и для ЗсЫгозасскаготусез ротЬе, а также гриба РойоБрога атеппа, а также предположительно для улитки Ар1уя1а саИ/огтса. Для трансляционного регулятора СРЕВ, который играет ключевую роль в механизмах, связанных с долговременной памятью, были показаны прионоподобные свойства в дрожжах. Более того, у млекопитающих найдены амилоидные белки, выполняющие в норме важные физиологические функции. Так, было показано, что амилоидные полимеры белка Рте117 являются матрицей для полимеризации предшественника меланина. Предшественник меланина токсичен, в то время как его полимеры защищают клетки от различных вредный воздействий, в частности, ультрафиолета и оксислительного стресса. Множество белков, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей, было выявлено у различных организмов при поиске в банках генов. Это может говорить о том, что белки, способные формировать амилоидную структуру, широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке.
Вопросы о том, чем отличаются прионы и амилоиды, и действительно ли они имеют принципиально сходную основу, достаточно значимы для данной темы. Это важно и для понимания особенностей прионных и амилоидных заболеваний, и для понимания свойств полезных механизмов связанных с амилоидами, и для выявления новых таких механизмов.
Представленная здесь работа началась с наблюдения полимеров белка Бир35, по свойствам более близких к неинфекционным прионам, чем к амилоидам. Это показало принципиальное сходство прионов и амилоидов и дало удобную модель для изучения их отличий. В работу также вошел систематический анализ зависимости прионных и амилоидных свойств от первичной последовательности белка, выполненный на искусственных белках, содержащих полиглутаминовые фрагменты.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Вишневская, Александра Борисовна
выводы
Сверхпродукция Sup35 в присутствии прионной формы белка Rnql (детерминант [PIN*']) приводит к полимеризации Sup35 с образованием амилоидов в большинстве клеток. В отличие от приоиных полимеров [PSf], такие полимеры Sup35 относятся к классу неприонных амилоидов, поскольку поддерживаются в клетках не благодаря наследованию, а за счет постоянного возникновения de novo. Получено свидетельство того, что прионные полимеры Rnql служат матрицей для инициации полимеризации Sup35.
2.Феномен трансляционной супрессии при сверхпродукции Sup35 в [PINh] клетках связан с образованием неприонных амилоидных полимеров белка Sup35 и уменьшением количества его мономерной формы.
3.Белки Sup35, содержащие вместо приониого домена протяженные участки остатков глутамина (белки polyQ) и глутамина с тирозином (4:1, белки polyQY) с высокой частотой образуют амилоидные полимеры в клетках дрожжей. Полимеры белков с последовательностями 70 (Q70) и 85 (Q85) глутаминовых остатков обладают свойствами дрожжевых прионов. Белки с более короткими полиглутаминовыми участками (Q51, Q56 и Q66), образуют только ненаследуемые амилоидные полимеры.
4.Фрагментация полимеров белков polyQ и polyQY зависит от присутствия шаперона Hspl04. Полимеры, образованные белком QY76, могут поддерживаться и в отсутствие ITspl04, что свидетельствует о наличии в клетках дрожжей полимер-фрагментирующей активности, независимой от Hspl04. Полученные результаты позволяют определить прионы дрожжей как амилоиды, подверженные фрагментации.
5.Полимеры белков ро1у0 и ро1уОУ способны инициировать образование неприонных амилоидных полимеров глутамин-богатых белков дрожжей 11гк]1, Бир35 иРиЫ.
Заключение
До настоящей работы был слабо изучен вопрос о том, чем же именно отличаются неинфекционные и инфекционные амилоиды (прионы). В данной работе впервые было показано, что белки дрожжей сегеу1з1ае 8ир35 и могут образовывать как прионные, так и ненаследуемые полимеры, сходные с амилоидами млекопитающих. Это является весомым аргументом в пользу того, что прионы и амилоиды принципиально сходны. По этому важному вопросу до последнего времени в научном сообществе не было единого мнения. Мы охарактеризовали свойства ненаследуемых амилоидов, отличающие их от прионов. Это плохая фрагментация шаперонами и высокая частота возникновения, из чего вытекают их прочие свойства: большой размер, отсутствие наследования и зависимость поддержания от наличия других прионов в клетке. Такие же отличия проявляют прионы и амилоиды млекопитающих. Например, отсутствие наблюдаемых амилоидов во многих случаях приониых заболеваний было использовано как обоснование принципиального различия прионов и амилоидов. Однако наша работа позволяет полагать, что именно таковы и должны быть свойства инфекционного амилоида: вследствие эффективной фрагментации прионные частицы малы и могут не образовывать бляшек.
Важный вывод работы касается способности различных амилоидов помогать возникновению друг друга. Такое предположение было сделано до нашей работы, и оно важно для понимания механизмов возникновения амилоидозов. Прежде оно базировалось на наблюдениях появления прионов [Р571] и [Р/АЛ], которое происходит с весьма низкой частотой. В нашей работе мы наблюдали, что неприонные амилоиды возникают на несколько порядков чаще, чем прионные. Это значит, что взаимная инициация амилоидами появления друг друга гораздо более значима, чем можно было считать ранее, и возникновение амилоидоза нельзя предсказывать, рассматривая лишь один конкретный амилоидогенный белок.
Мы также смоделировали появление прионов и амилоидов на искусственных белках, содержащих полиглутаминовые фрагменты. Эта часть работы имела также отношение к медицине, поскольку удлиненные полиглутаминовые фрагменты в некоторых белках приводят к их полимеризации и амилоидозам, например, болезни Хантингтона. При этом было обнаружено, что образование ненаследуемых амилоидов требует некоторой минимальной длины полиглутаминового фрагмента, а при его увеличении полимеры приобретают прионные свойства. Согласно этому, у человека полиглутамины с длиной более 70 могли бы вести себя как "внутриклеточные" прионы, то есть отличаться принципиально более быстрой полимеризацией. Кроме того, фрагментация и наследуемость сильно улучшались при добавлении в полиглутаминовые фрагменты остатков тирозина, которые, по нашему предположению, должны улучшать распознавание и фрагментацию шаперонами. Наконец, мы обнаружили эффективную кополимеризацию полиглутаминовых белков с другими глутамин-богатыми белками. Это значит, что одним из механизмов проявления болезни может быть исчезновение некоторых глутамин-богатых белков из фракции функциональных мономеров.
Таким образом, главные выводы данной работы состоят в том, что неприонные амилоиды отличаются от прионных низкой эффективностью фрагментации и повышенной частотой возникновения; а также в том, что взаимодействие амилоидогенных белков в ходе их полимеризации должно играть важнейшую роль в возникновении и проявлениях амилоидозов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вишневская, Александра Борисовна, Б.м.
1. Aigle M. and Lacroute F. (1975). Genetical aspects of URE3., a non-mitochondrial, cytoplasmically inherited mutation in yeast. Mol. Gen. Genet., 136: 327-335.
2. Alper T., Cramp W.A.,.Haig D.A, and Clarke M.C. (1967). Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature, 214: 764-766.
3. Alper, T., Haig D.A., and Clarke M.C. (1966). The exceptionally small size of the scrapie agent. Biochem.Biophys. Res. Commun, 22:278-284.
4. Bagriantsev S, Liebman SW. (2004). Specificity of prion assembly in vivo. PS1+. and [PIN+] form separate structures in yeast. J Biol Chem, 279(49):51042-8.
5. Baker HF, Ridley RM, Duchen LW, Crow TJ, Bruton CJ (1994). Induction of |3(A4)-amyloid in primates by injection of Alzheimer's disease brain homogenate. Mol Neurobiol, 8:25-39.
6. Bates GP, Harper PS, Jones AL. (2002). Huntington's Disease. Oxford, UK: Oxford University Press
7. Bence N.F., Sampat R.M., Kopito R.R. (2001) Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science, 292: 1552-1555.
8. Bessen, R. A., and Marsh, R. F. (1994). Distinct PrP properties suggest the molecular basis of the strain variation in transmissible milk encephalopathy. J. Virol, 68:7859 7868.
9. Bessen, R.A, Kosicko, D.A., Raymond, G.J., Nan dan, S., Lansbury P.T., and Caughey, B. (1995). Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein Nature, 375:698-700.
10. Bessen, R.A., and Marsh, R.F. (1992b). Identification of two bilologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters J. Gen. Virol, 73:329-334.
11. Brachmann A., Baxa U. and Wickner R.B. (2005). Prion generation in vitro: amyloid of Ure2p is infectious. EMBOJ., 24: 3082-3092.
12. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248254.
13. Bradley M.E., Edskes H.K., Hong J.Y., Wickner R.B. and Liebman S.W. (2002). Interactions among prions and prion "strains" in yeast. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A, 99: 16392-16399.
14. Brown, D.R., Wong, B.S., Hafiz, F„ Clive, C., Haswell, S.J., and Jones, I.M. (1999). Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochem. J., 344 Pt 1:1-5.
15. Brown, J.C. and Lindquist, S.L. (2005). Characterization of the prion-like phenotype for glucosamine resistance in Saccharomyces cerevisiae. In abstracts of "Prion Biology" Joint Cold Spring Harbor Laboratory / Wellcome Trust Conference,
16. Bueler H., M. Fischer, Y. Lang, H. Bluethmann, H.P. Lipp, S.J. DeArmond, S.B. Prusiner, M. Aguet, and C.Weissmann (1992). Normal development and behavior of mice lacking the neuronal cell-surface Pip protein. Nature, 356:577-582.
17. Bukau B, Horwich AL. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. (1998). Celt, 92(3): 351-66.
18. Carlson, G.A., D.T.ICingsbury, P.A. Goodman, S. Coleman, S.T. Marshall, S. deArmond, D. Westaway, and S.B. Prusiner (1986). Linkage of prion protein and scrapie incubation time genes. Cell, 46:503-511.
19. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., and Lansbury, P. T., Jr. (1995). Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. J Chem. Biol., 2: 807 817.
20. Chapman, M.R., L.S. Robinson, J.S. Pinkner, R. Roth, J. Heuser, M. Hammar, S. Normark, and S.J. Hultgren. (2002). Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295:851-855.
21. Chernoff Y.O., Derkach I.L. and Inge-Vechtomov S.G. (1993). Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet., 24: 268-270.
22. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G. and Liebman S.W. (1995). Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor piz+. Science, 268:880-884.
23. Chernoff YO, Lindquist SL, Ono B, Inge-Vechtomov SG, Liebman SW. (1995). Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor psi+. Science, 268(5212):880-4.
24. Chernoff, Y. O., Inge-Vechtomov, S. G, Derkatch, I. L., Ptyushkina, M.V., Tarunina, O.V., Dagkesamanskaya A.R., and Ter-Avanesyan, M.D. (1992). Dosage-Dependent Translational Supression in yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 8: 489-499.
25. Chernoff, YO. (2004). Amyloidogenic domains, prions and structural inheritance: rudiments of early life or recent acquisition? Curr Opin Chem Biol. 8(6): 665-71.
26. Chiti, F., Stefani, M., Taddei, N. Ramponi, G. and Dobson, C.M. (2003). Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature, 424: 805-808.
27. Clarke A.R., Jackson G.S. and Collinge J. (2001). The molecular biology of prion propagation. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. ScL, 356: 185-195.
28. Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Flettericlc, R. J., and Prusiner, S. B.1994). Structural clues to prion replication. Science, 264: 530 531.
29. Collin,P., Beauregard,P.B., Elagoz,A. and Rolceach,L.A. (2004). A non-chromosomal factor allows viability of Schizosaccharomyces pombe lacking the essential chaperone calnexin. J. Cell ScL, 117: 907-918.
30. Collinge J., Palmer M.S., Sidle K.C., Gowland I., Medori R., Ironside J. and Lantos P.1995) Transmission of fatal familial insomnia to laboratory animals. Lancet, 346: 569-570.
31. Coughlan C.M., Brodsky J.L. (2005). Use of yeast as a model system to investigate protein conformational diseases. Molecular Biotechnology!, 30(2): 171-80.
32. Coustou V., Deleu C., Saupe S. and Begueret J. (1997). The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A, 94:9773-9778.
33. Coustou-Linares V., Maddelein M.L., Begueret J. and Saupe S.J. (2001). In vivo aggregation of the HET-s prion protein of the fungus Podospora anserina. Mol. Microbiol., 42:1325-1335.
34. Cox B. (1965). PSI, a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. Heredity, 20: 505-521.
35. Cox B.S., Tuite M.F. and McLaughlin C.S. (1988). The psi factor of yeast: a problem in inheritance. Yeast, 4: 159-178.
36. Creutzfeld, H.G. Uber eine eigenartige herdformige Erkrankung des Zentralnervensysteins. (1920). Neurol. Psychiatry, 57:1-18.
37. Dagkesamanskaia AR, Kushnirov VV, Paushkin SV, Ter-Avanesian MD. (1997) Fusion of glutathione S-transferase with the N-terminus of yeast Sup35p protein inhibits its prion-like properties. Genetika, 33(5):610-5.
38. DePace, A.H. and Weissman, J.S. (2002). Origins and kinetic consequences of diversity in Sup35 yeast prion fibers. Nat. Struct. Biol, 9: 389-396.
39. Derkatcb I.L., Bradley M.E., Hong J.Y. and Liebman S.W. (2001). Prions affect the appearance of otherprions: the story of PIN(+). Cell, 106: 171-182.
40. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G. and Liebman S.W. (2000. Dependence and independence of PS1(+). and [PIN(+)]: a two-prion system in yeast? EMBO J., 19: 1942-1952.
41. Derkatch I.L., BradleyM.E., Zhou P., Chemoff Y.O. and Liebman S.W. (1997.) Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSf. prion in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 147:507-519.
42. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G. and Liebman S.W. (1996). Genesis and variability of />£/. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 144: 1375-1386.
43. Dickinson, A.G., Meikle V.M.H. and Fraser H. (1968). Identification of a gene which controls the incubation period of some strains of scrapie in mice. J.Comp.Pathol, 78: 293299.
44. Dobson C.M. Protein folding and misfolding. (2003). Nature, 18: 884-890
45. Dobson, C.M. (2001). The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos. Trans. R. Soc. Lo/ul B Biol. Sci., 356:133-145.
46. Dobson,C.M. (1999). Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci., 24: 329-332.
47. Dobson,C.M. (2001). The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci., 356: 133-145.
48. Dos Reis, S., Coulary-SaIin,B., Forge,V., Lascu,L, Begueret,J. and Saupe,S.J. (2002). The HET-s prion protein of the filamentous fungus Podospora anserina aggregates in vitro into amyloid-like fibrils. J. Biol. Chem., 277: 5703-5706.
49. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B.S. and Tuite M.F, (2000). Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant PSI(+). of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97: 240-244.
50. Eaglestone,S.S., Cox,B.S. and Tuite,M.F. (1999). Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism. EMBOJ., 18:1974-1981.
51. Elghetany, M.T. and Saleem, A. (1988). Methods for staining amyloid in tissues: a review. Stain Technol, 63, 201-212.
52. Fandrich, M. and C. M. Dobson. (2002). The behaviour of polyamino acids reveals an inverse side chain effect in amyloid structure formation. EmboJ, 21(21): 5682-90.
53. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S. and Tuite M.F. (2001). The elimination of the yeast PSf. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation. Mol. Microbiol., 40: 1357-1369.
54. Furlong RA, Narain Y, Rankin J, Wyttenbach A, Rubinsztein DC. (2000). Alpha-synuclein overexpression promotes aggregation of mutant huntingtin. Biochem J. , 346 Pt 3:577-81.
55. Gabriel, J.M., Oesch,B., Kretzschmar,H., Scott,M. and Prusiner.S.B. (1992). Molecular cloning of a candidate chicken prion protein. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 89, 9097-9101.
56. Gajdusek, D. C., Gibbs, C. J., Jr., and Alpers, M. (1966). Experimentae transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees. Nature, 209: 794 796.
57. Ganusova EE, Ozolins LN, Bhagat S, Newnam GP, Wegrzyn RD, Sherman MY, Chernoff YO. (2006). Modulation of prion formation, aggregation, and toxicity by the actin cytoskeleton in yeast Mol Cell Biol. 26(2):617-29.
58. Gerstmaim, J. Uber ein noch nicht beschriebenes Reglexphanomen bei einer Erkrankung des zerebellum systems. (1928). Wien Med. Wochenschr., 78:906-908.
59. Gerstmann, J., E. Straussler, and I. Scheinker Uber eine eigenartige hereditary-familiare erlaankung des zerebellum systems. (1936) Neurology, 154:736-762.
60. Gietz,R.D. and Sugino,A. (1988) New ye&st-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene, 74: 527534.
61. Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure. Yeast, 11: 355360.
62. Gillcs N, Kedersha N, Ayodele M, Shen L, Stoecklin G, Dember LM, Anderson P. (2004). Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1 Mol Biol Cell, 15(12):5383-98.
63. Giorgini F, Guidetti P, Nguyen Q, Bennett SC, Muchowski PJ. (2005).A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat Genet. 37(5): 526-31.
64. Glover J.R. and Lindquist S. (1998). Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel cbaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell, 94: 73-82.
65. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J. and Lindquist S. (1997). Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PSI*., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell, 89:811-819.
66. Glover JR, Lindquist S. (1998). Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell, 94(1): 73-82.
67. Griffith J. S. (1967). Self-replication and scrapie. Nature, 215: 1043 1044.
68. Guijarro J.I., Sunde M., Jones J. A.,. Campbell I. D, and Dobson C. M. (1998). Amyloid fibril formation by an SH3 domain Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 95 (8): 42244228.
69. Hadlow W.J. (1959). Scrapie and kuru. Lancet; ii: 289-290.
70. Harjes P., Wanker E.E. (2003). The hunt for huntingtin function: interaction partners tell many different stories. Trends Biochem. Sci. 28: 425-433.
71. Hawthorne, D.C., and R.K. Mortimer. (1968). Genetic mapping og nonsense supressors in yeast. Genetics, 60: 735-742.
72. Hetz,C., Maundrell,K., and Soto,C. (2003). Is loss of function of the prion protein the cause of prion disorders? Trends Mol. Med., 9: 237-243.
73. Hughes RE, Lo RS, Davis C, Strand AD, Neal CL, Olson JM, and Fields S (2001)Altered transcription in yeast expressing expanded polyglutamine. PNAS, 98(23): 13201-13206.
74. Inoue,H., Nojima,H., and OIcayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96:23-28.
75. Jarrett, J. T., and Lansbury, P. T. (1993). Seeding "one-dimensional-crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell. 73:1055 -1058.
76. Johan K, Westennarlc G, Engstrom U, Gustavsson O, Hultman P, and Westennarlc P. (1998). Acceleration of amyloid protein A amyloidosis by amyloid-like synthetic fibrils. Proc Natl Acacl Sci USA, 95(5): 2558-2563.
77. Jones GW, Tuite MF. (2005). Chaperoning prions: the cellular machinery for propagating an infectious protein? Bioessays. 27(8): 823-32.
78. Kajava, A.V., Baxa, U., Wickner, R.B. and Steven,A.C. (2004). A model for Ure2p prion filaments and other amyloids: the parallel superpleated beta-structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 101: 7885-7890.
79. Kascsak RJ, Rubenstein R, Carp RI. (1991). Evidence for biological and structural diversity among scrapie strains. Cnrr Top Microbiol Immunol, 172:139-52.
80. Kedersha, N., and Anderson, P. (2002). Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochem. Soc. Trans. 30: 963-969.
81. Kimura Y, Koitabashi S, Kakizuka A, Fujita T. (2001). Initial process of polyglutamine aggregate formation in vivo. Genes Cells. Oct; 6(10): 887-97.
82. Kimura Y, Koitabashi S, Kakizuka A, Fujita T. (2004)The role of pre-existing aggregates in Hspl04-dependent polyglutamine aggregate formation and epigenetic change of yeast prions. Genes Cells. 9(8):685-96.
83. King C.Y. and Diaz-Avalos R. (2004). Protein-only transmission of three yeast prion strains. Nature, 428: 319-323.
84. King CY, Tittmann P, Gross H, Gebert R, Aebi M, and Wiithrich K.(1997) Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. PNAS, 94:
85. Kisilevsky R, Lemieux L, Boudreau L, Yang DS, Fraser P. (1999). New clothes for amyloid enhancing factor (AEF): silk as AEF. Amyloid. 6(2):98-106.
86. Klein MA, Frigg R, Flechsig E, Raeber AJ, Kalinke U, Bluethmann H, Bootz F, Suter M, Zinkernagel RM, Aguzzi A. (1997). A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390(6661): 687-90.
87. Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Valouev I.A., Kushnirov V.V., Smimov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. (2001). Psi(+). prion generation in yeast: characterization of the 'strain' difference. Yeast, 18: 489-497.
88. Krishnan, R. and Lindquist,S.L. (2005). Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity. Nature, 435: 765-772.
89. Krobitsch S, Lindquist S. (2000). Aggregation of huntingtin in yeast varies with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins. Proc Natl AcadSci USA. Feb 15; 97(4): 1589-94.
90. Kryndushlcin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D. and ICushnirov V.V. (2003) Yeast PSf. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04. J. Biol. Chem., 278: 49636-49643.
91. ICushnirov V.V. and Ter-Avanesyan M.D. (1998) Structure and replication of yeast prions. Cell, 94: 13-16.
92. ICushnirov,V. V., Kryndushlcin,D.S., Boguta,M., Smirnov.V.N. and Ter-Avanesyan,M.D. (2000). Chaperones that cure yeast artificial PS/4. and their prion-specific effects. Curr. Biol., 10:1443-1446.
93. Lacroute F. (1971). Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast. J. Bacteriol., 106: 519-522.
94. Laemmli,U.IC. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.
95. Landles C, Bates GP. (2004). Huntingtin and the molecular pathogenesis of Huntington's disease. Fourth in molecular medicine review series. EMBO Rep, 5(10):95863.
96. Legname,G., Baslcakov,I.V., Nguyen,H.O., Riesner,D., Cohen,F.E., DeArmond,S J. and Prusiner,S.B. (2004). Synthetic mammalian prions. Science., 305, 673-676.
97. Leroy E., Boyer R., Auburger G. (1998). The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature. 395: 451-452.
98. Li S.H., and Li X.J. (2004). Huntingtin-protein interactions and the pathogenesis of Huntington's disease. Treincls Genet, 20: 146-154
99. Lindquist S. (1997). Mad cows meet psi-chotic yeast: the expansion of the prion hypothesis. Cell, 89: 495-498.
100. Litvinovich S.V., Brew S.A., Aota S., Akiyama S.K., Haudenschild C., and Ingham K.C. (1998); Formation of amyloid-like fibrils by self-association of a partially unfolded fibronectin type III module. JMol Biol, 280: 245-258.
101. Lund P.M. and Cox B.S. (1981). Reversion analysis of psf. mutations in Saccharomyces cerevisiae. Genet. Res., 37:173-182.
102. Lundmark K, Gunilla T. Westermark, Sofia Nystrom, Charles L. Murphy, Alan Solomon, and Per Westermark (2002). Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. PNAS, 99(10): 6979-6984.
103. Maddelein M.L., Dos Reis S., Duvezin-Caubet S., Coulary-Salin B. and Saupe S.J. (2002). Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious. Proc. Natl. Acacl. Sci. U. S. A, 99: 7402-7407.
104. Mager W.H., Winderickx J. (2005). Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Science. 26(5): 265-73.
105. Marks, M.S., and M.C. Seabra. 2001. The melanosome: membrane dynamics in black and white. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2:738-748.
106. Meriin AB, Zhang X, Miliaras NB, Kazantsev A, Chemoff YO, McCaffery JM, Wendland B, Sherman MY. (2003). Aggregation of expanded polyglutamine domain in yeast leads to defects in endocytosis. Mol Cell Biol. Nov; 23(21): 7554-65.
107. Meriin, A. B., X. Zhang, X. He, G. P. Newnam, Y. O. Chemoff, and M. Y. Sherman. (2002). Huntington toxicity in yeast model depends on polyglu-tamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql. J. Cell Biol. 157:997-1004.
108. Michael D. Ter-Avanesyan (2006) Methods 39(l):50-5.
109. Michelitsch, M.D., Weissman, J.S., (2000). A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions. Proc Natl Acad Sci USA; 97(22): 11910-11915.
110. Miller JH (1972). Experiments in molecular genetics. Colcl Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 352-354.
111. Moriyama H., Edskes H.K. and Wickner R.B. (2000). URE3. prion propagation in Saccharomyces cerevisicie: requirement for chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone Ydj lp. Mol. Cell Biol, 20: 8916-8922.
112. Muchowski PJ, Schaffar G, Sittler A, Wanker EE, Hayer-Hartl MK, Hartl FU. (2000). Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proc Natl Acad Sci USA. 97(14): 7841-6.
113. Nakayashiki T, Ebihara K, Bannai H, Nakamura Y. (2001). Yeast PSI+. "prions" that are crosstransmissible and susceptible beyond a species barrier through a quasi-prion state. Mol Cell 7(6):1121-30
114. Ness F, Ferreira P, Cox BS, Tuite MF. (2002). Guanidine hydrochloride inhibits the generation of prion "seeds" but not prion protein aggregation in yeast. Mol Cell Biol, 22(15):5593-605.
115. Nollen E.A., Garcia S.M., van Haaften G., Kim S., Chavez A., Morimoto RI, Plasterk R.H. (2004). Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 64036408
116. Oesch, B„ Westway, D., Walchli, M., McICinley, M. P., Kent, S. B. H„ Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B. Hood, L. E., Prusiner, S. B., and Weistmann, C. (1985). A cellular gene encodes scrapie PrP 27 30. Cell, 40: 735 - 746.
117. Osherovich L.Z., Cox B.S., Tuite M.F. and Weissman J.S. (2004). Dissection and design of yeast prions. PLoS. Biol., 2(4): e86.
118. Osherovich, L. Z., Weissman, J. S., (2001). Multiple Gln/Asn-Rich prion domains confer susceptibility to induction of the yeast PSI+. prion. Cell, 106(2): 183-194.
119. Owen, F., M. Poulter, R. Lofthouse, J.Collinge, T.J. Crow, D.Risby, H.F. Baker, R.M. Ridley, K. Hsiao, and S.B. Prusiner (1989). Insertion in prion protein gene in familial Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet; i:51-52.
120. Parham S.N., Resende C.G. and Tuite M.F. (2001). Oligopeptide repeats in the yeast protein Sup35p stabilize intermolecular prion interactions. EMBO J., 20: 2111-2119.
121. Parsell DA, Kowal AS, Singer MA, Lindquist S. (1994). Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature, 372(6505): 475-8.
122. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R. and Lindquist S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science, 273: 622-626.
123. Pattison, I.H. (1965). Resistance of the scrapie agent to formalin. J. Comp.Pathol, 75:159-164.
124. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smimov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. (1996). Propagation of the yeast prion-like psi+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. EMBO J., 15:3127-3134.
125. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smimov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. (1997b). In vitro propagation of the prion-like state ofyeastSup35 protein. Science, 277: 381-383.
126. Perutz, M.F., Finch, J.T., Berriman, J. and Lesk, A. (2002a). Amyloid fibers are water-filled nanotubes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 99: 5591-5595.
127. Prions in Saccharomyces and Podospora spp.: protein-based inheritance. Microbiol Mol Biol Rev, 63(4):844-61.
128. Prusiner, S. B., Scott, M. R., DeArmond, S. J., and Cohen, F. E. (1998). Prion protein biology. Cell, 93: 337 348.
129. Prusiner, S.B., Bolton,D.C., Groth,D.F., Bowman,IC.A., Cochran,S.P., and McKinley,M.P. (1982). Further purification and characterization of scrapie prions. Biochemistry, 21: 6942-6950.
130. Prusiner,S.B, McKinley,M.P., Bowman,K.A., Bolton,D.C, Bendheim,P.E., Groth,D.F., and Glenner,G.G. (1983). Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell, 35: 349-358.
131. Prusiner, S.B. (1991). Molecular Biology of Prion Disiases. Science, 252: 15151522.
132. Raposo, G., and M.S. Marks. (2002). The dark side of lysosome-related organelles: specialization of the endocytic pathway for melanosome biogenesis. Traffic. 3:237-248.
133. Rivera-Mi 11a,E., Stuermer,C.A. and Malaga-Trillo,E. (2003) An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA. Trends Genet., 19, 72-75.
134. Ross ED, Edskes HK, Terry MJ, Wickner RB. (2005). Primary sequence independence for prion formation. Proc Natl Acad Sci USA. 102(36):12825-30.
135. Sakahira H, Breuer P., Hayer-Hartil M.K., Hartl F.U. (2002). Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity Proc. Natl Acacl Sci USA, 99 (Suppl 4): 16412-16418.
136. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989a). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd eel. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.
137. Sanger,F., Nicklen,S., and Coulson,A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acacl. Sci. U. S. A, 74: 5463-5467.
138. Santoso, A., Chien, P., Osherovich, L.Z., and Weissman, J.S. (2000). Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell, 100: 277-288.
139. Satyal SH, Schmidt E, Kitagawa K, Sondheimer N, Lindquist S, Kramer J M., and Morimoto RI. (2000) Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. PNAS 97 (11): 5750-5755.
140. Saupe S.J. (2000). Molecular genetics of heterokaryon incompatibility in filamentous ascomycetes. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 489-502.
141. Schwimmer C. and Masison D.C. (2002). Antagonistic interactions between yeast PSI(+). and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperone Ssalp but not by Ssa2p. Mol. Cell Biol., 22:3590-3598.
142. Seikoe, D.J. (2003). Folding proteins in fatal ways. Nature, 426: 900-904.
143. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Colcl Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.
144. Shorter, J., and Lindquist, S. (2006). Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hspl04 remodeling activities. Mol. Cell 23(3): 425-38.
145. Si,K., Lindquist,S., and Kandel,E.R. (2003b). A neuronal isoform of the Aplysia CPEB has prion-like properties. Cell, 115: 879-891.
146. Simons K. and Ehehalt R. (2002). Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest, 110:597-603.
147. Sondheimer N. and Lindquist S. (2000.) Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol. Cell, 5: 163-172.
148. Stansfield,!, Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1995a). A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes. Curr. Genet., 27: 417-426.
149. Sunde, M. and Blake, C. (1997). The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. Adv. Protein Chem, 50, 123-159.
150. Tanaka M., Chien P., Naber N„ Cooke R. and Weissman J.S. (2004). Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature, 428: 323-328.
151. Ter-Avanesyan M, Derkatch I, Baskakov I, Kushnirov V. (2005). Unraveling prion structures and biological functions. Genome Biol. 6(13):366.
152. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V. and Smirnov V.N. (1994). The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non
153. Mendelian determinant psi+. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 137: 671676.
154. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,.!. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A, 76: 4350-4354.
155. True,H.L. and Lindquist,S.L. (2000). A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature, 407: 477-483.
156. Tuite M.F., Mundy C.R. and Cox B.S. (1981). Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psf ] in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 98: 691-711.
157. Uptain,S.M., SawicIci,G.J., Caughey,B. and Lindquist,S. (2001). Strains of PSI(+). are distinguished by their efficiencies of prion-mediated conformational conversion. EMBO J., 20: 6236-6245.
158. Valouev LA., Kushnirov V.V. and Ter-Avanesyan M.D. (2002). Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil. Cytoskeleton, 52: 161-173.
159. Vitaly V. Kushnirov, Ilya M. Alexandrov, Olga V. Mitkevich, Irina S. Shlcundina and
160. Wickner R.B. (1994). URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science, 264:566-569.
161. Wickner RB, Taylor ICL, Edskes HK, Maddelein ML, Moriyama H, Roberts BT. (1999). Prions in Saccharomyces and Podospora spp.: Protein-Based Inheritance. Microbiol Mol Biol Rev, 63(4): 844-861.
162. Willingham S, Outeiro TF, DeVit MJ, Lindquist SL, Muchowski PJ. (2003). Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science, 302: 1769-1772.
163. Xing Y, Nakamura A, Chiba T, Kogishi K, Matsushita T, Li F, Guo Z, Hosokawa M, Mori M, Higuchi K. (2001). Lab Invest., 81(4): 493-9.
164. Zhang CC, Steele AD, Lindquist S, Lodish HF. (2006). Prion protein is expressed on long-term repopulating hematopoietic stem cells and is important for their self-renewal. Proc Natl Acad Sci USA, 103(7):2184-9.
165. Zhou P., Derkatch I.L., Uptain S.M., Patino M.M., Lindquist S. and Liebman S.W. (1999). The yeast non-Mendelian factor ETA+. is a variant of [PSf], a prion-like form of release factor eRF3.EMBOJ., 18: 1182-1191.
166. Zigas, V., and D.C. Gajdusek (1957). Kuru: clinical study of a new syndrome resembling paralysis agitans in natives of the Eastern highlands of Australian New Guinea. Mecl.J. Aust, 2:745-754.
167. Инге-Вечтомов С.Г. и Адрианова В.М. (1970). Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. Генетика, 11, 103-115.
168. Остерман JI.A. (1983). Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Москва, издательство «Наука».
169. Тер-Аванесян М.Д., Паушкин С.В., Кушниров В.В., Кочнева-Первухова Н.В. (1998). Молекулярные механизмы "белковой" наследственности: прионы дрожжей. Молекулярная биология, 32(1):3б-46.
170. Чернов О.Ю., Деркач И.Л., Дагкесаманская А.Р., Тихомирова B.JL, Тер-Аванесян М.Д. (1988). Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции. Доклады Академии Наук СССР, раздел «Генетика»; 301(5).1. БЛАГОДАРНОСТИ
171. Я очень признательна М.О.Агафонову, О.В. Митькевич, В.Н. Уракову, Г.В. Фоминову, Н.В.Кочневой-Первуховой, И.А. Валуеву, И.С. Шкундиной за полезные методические советы, обсуждение результатов работы и дружеское участие.
172. Я хочу отдельно поблагодарить моего мужа и Илью Александрова за помощь в подготовке рукописи диссертации и автореферата, а также В.Н. Уракова за антитела к белку РиЫ.1. СОВМЕСТНАЯ РАБОТА
173. Результаты, представленные в разделе «Влияние шаперона НэрКМ на полимеризацию полиглутаминовых белков», получены совместно с Александровым И.М.
-
Вишневская, Александра Борисовна
-
кандидата биологических наук
-
Б.м., 0
-
ВАК 03.00.03
- ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro
- Характеристика нового нехромосомного детерминанта [NSI+]дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Факторы, влияющие на фрагментацию и токсичность амилоидных полимеров в клетках дрожжей
- Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
