Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы аттенуации патогенных бактерий на модели сальмонелл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Принципы аттенуации патогенных бактерий на модели сальмонелл"

1 ^ ноя ®

На правах рукописи

МАРАКУША Борис Иванович

ПРИНЦИПЫ АТТЕНУАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ САЛЬМОНЕЛЛ

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1996

На правах рукописи

МАРАКУША Борис Иванович

ПРИНЦИПЫ АТТЕНУАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ САЛЬМОНЕЛЛ

( 03.00.07 - микробиология )

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный консультант - заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук.

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Костюкова

доктор медицинских наук, профессор Е'. А. Ведьмина

доктор медицинских наук, профессор И.П.Фомина

Ведущее учреждение: Московский медицинский университет имени Н.И.Пирогова

часов на заседании Диссертационного Совета Д001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. (123098 г.Москва, ул. Гамалеи,18 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

профессор В.Г. Петровская

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Актуальность темы.

Род Salmonella включает более 2200 различных сероваров, большинство представителей которых являются патогенными для человека или животных или животных и человека. Сальмонеллезы в настоящее время признаны серьезной проблемой здравоохранения в мире, что связано с значительным ростом заболеваемости этими инфекциями во многих странах. Так, только в США ежегодно регистрируется более 3 млн. заболеваний сальмонеллезами людей, причем эти данные являются заниженными из-за недостаточно полной их регистрации. По имеющимся данным, в нашей стране также наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний этими инфекциями (примерно на 30-40% ежегодно) (Покровский В.И. и др..1989;Кондрусев А. Н., 1990; Доклад комитета экспертов ВОЗ, 1991;Chalker R., Blazer А., 1989;Chatfleid S.et al., 1994).

Эта проблема тесно связана с высоким уровнем заболеваемости сельскохозяйственных животных в связи с тем, что разные серовары сальмонелл вызывают заболевания как у животных, так и у людей (зооантропонозы). Большой материальный ущерб наносят сальмонеллезы в животноводческих хозяйствах Российской Федерации, в которых возбудителями инфекций Являются S. typhimurlum, S:dublln и S. ente-ritidis (Черкасский Б. Л. и др., 1995; Черкасский Б. Л. .Рожнова С. III., 1995; Доклад комитета экспертов ВОЗ, 1991;Сергевнин В. И. и др.,1991;Rodrique D.etal.,1990; De Louvoice J.,1993; Rubino S. et al..1993).

Очевидно, что борьба с сальмонеллезами у животных может привести и к снижению заболеваемости этими инфекциями у людей (общими для человека и животных). Для профилактики кишечных инфекций, вызываемых различными видами энтеробактерий,в частности сальмо-

- г -

неллами. у животных и у человека наряду с санитарно-гигиеническими мероприятиями важное значение придается специфической профилактике этих заболеваний - вакцинации (Доклад комитета экспертов ВОЗ,1991; Chatfield S. et al., 1994). Из существующих или разрабатывающихся в настоящее время различных типов вакцинных препаратов против этих инфекций живые сальмонеллезные вакцины на основе аттенуированных мутантов наиболее эффективно используются на практике, обеспечивая создание выраженного как гуморального, так и клеточного иммунитета в организме хозяина .(Robertson R.et al.. 1983;Hormaeclie С. et al., 1992;Curtiss R. et al., 1993).

Известно, что патогенность бактерий является сложным биологическим феноменом, проявляющимся вследствие взаимодействия как специфических факторов патогенности, так и различных компонентов бактериальных клеток, играющих существенную роль в их жизнедеятельности. Для получения эффективных вакцинных штаммов необходимы точные знания факторов, определяющих развитие инфекционного процесса при сальмонеллезах и их генетического контроля, которые в отношении этих возбудителей изучены недостаточно. Так, не выяснена до конца роль плазмид в проявлении сальмонеллами вирулентных свойств, не изучен в полной мере генетический контроль синтеза энтеротоксина.

Необходимо, также, подчеркнуть, что в настоящее время имеются лишь отдельные сообщения о значении компонентов жизненно важных для бактерий систем (наружная мембрана, РНК-полимераза, сгр, суа белки и другие (Vaara М., 1992; Botsford J., Harman J.,1992; Linde К. et al., 1990) для экспрессии вирулентности у сальмонелл. Проведение исследований, направленных на выявление такого типа факторов и изучение их роли в вирулентности патогенных бактерий

может иметь как теоретическое, так и практическое значение в плане разработки эффективных методов получения потенциальных вакцинных штаммов сальмонелл.

Следует отметить, что для оценки значения ряда структур в различных клеточных процессах удобным инструментом являются антибиотики с определенным механизмом действия, позволяющие получать мутанты патогенных бактерий, включая и сальмонеллы, несущие мутации в генах, кодирующих синтез соответствующих структур и исследовать их влияние на вирулентность.

В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования являлось изучение влияния мутаций в генах, детерминирующих резистентность к некоторым антибиотикам и синтез отдельных факторов пато-генности сальмонелл, на их вирулентность и разработка принципов аттенуации патогенных бактерий.

Задачи исследования:

1. Получить мутанты S. typhimurlum, S.dublin, S. enteritidis. S abortus ovis, устойчивые к антибиотикам, действующим на клеточную оболочку бактерий (полимиксин, бицикломицин,ЛИБ-71) и связывающимися с рибосомальными белками (спектиномицин, стрептомицин, неамин) и исследовать их свойства.

2. Определить локализацию мутаций, детерминирующих снижение вирулентности у указанных мутантов, на хромосоме сальмонелл.

3. Изучить действие мутаций, приводящих к нарушению синтеза рибосомальных белков, на точность трансляции генетического материала.

4. Исследовать влияние мутаций, сообщающих устойчивость к спектиномицину, неамину и стрептомицину, на вирулентность штаммов патогенных бактерий: Shigella flexneri, Yersinia pseudotubérculo-

sis, Listeria monocytogenes. Legionella pneumophila, Francisella tularensis.

5. Изучить генетический контроль продукции термолабильного эн-теротоксина некоторыми штаммами сальмонелл и оценить значение этого признака для вирулентности и иммуногенности этих бактерий.

6. Исследовать молекулярно-генетические характеристики плазмид вирулентности штаммов S.enteritidis, S.typhimurium и S.dublin, получить производные с вставками транспозона в гены, существенные для проявления ими патогенных свойств.

7. Сконструировать штаммы S.typhimurium, S.dublin,S.enteritidis. S.abortus ovis. несущие мутации в различных генах, связанных с вирулентностью этих бактерий и'исследовать их свойства на разных моделях инфекции.

8. Изучить некоторые полученные аттенуированные штаммы сальмонелл в качестве живых вакцин в опытах на различных сельскохозяйственных животных.

Научная новизна

В результате проведенной работы выявлена у S typhimurium, S.dublin. S.enteritidis. S.abortus ovis мутация, сообщающая устойчивость к антибиотику бицикломицину, повреждающему клеточную стенку, приводящая к значительному снижению вирулентности мутантов для мышей на различных моделях. Мутация картирована на хромосоме S. typhimurium у mal Е гена.

Установлено, что неаминрезистентные мутанты исследованных сероваров сальмонелл в зависимости от чувствительности к стрептомицину характеризовались наличием различных мутаций, снижающих их

вирулентность: чувствительные к этому антибиотику несли мутацию пеа А, устойчивые к умеренным концентрациям стрептомицина - пеа и rpsL, к высоким концентрациям - пеа В и rps L. Мутации, приводящие к появлению устойчивости к этим антибиотикам, картированы на хромосоме сальмонелл в rps L - rps Е области.

Установлена зависимость между действием выявленных нами мутаций резистентности к спектиномицину, стрептомицину и неамину на активность амбер супрессора и влиянием на вирулентность: мутации, ■ сообщающие устойчивость к спектиномицину и не влияющие на точность считывания генетической информации, не изменяли вирулентности сальмонелл, тогда как мутации, детерминирующие устойчивость к стрептомицину и неамину и ограничивающие действие амбер супрессора, приводили к снижению вирулентности сальмонелл. Показано общебиологическое значение выявленной закономерности на мутантах такого типа других видов патогенных бактерий - Shigella flexnerl. Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes. Legionella pneumophila, Francisella tularensis.

Впервые показано важное значение для вирулентности S.enteri-tidis плазмиды молекулярной массой 65 МД. Идентифицирован 6.8 кб Есо RI-Hind III фрагмент плазмиды, содержащий гены, связанные с размножением этих бактерий в РЭС. Установлена у части штаммов S.enteritidis. выделенных от больных, птиц и из окружающей среды, интеграция плазмиды молекулярной массой 36 МД в хромосому этих бактерий.

Впервые показано, что плазмида S. typhimurium молекулярной массой 54 МД контролирует синтез термолабильного энтеротоксина, сходного по свойствам с термолабильным энтеротоксином Е.coli и V.cholerae. Идентифицирован 6, 9 кб Ваш Hl - Есо RI фрагмент плаз-

миды, кодирующий синтез термолабильного энтеротоксина сальмонелл.

На модели сальмонелл разработаны способы аттенуации бактерий, основанные на использовании или двух мутаций отдельно, снижающих вирулентность и сообщающих устойчивость к неамину и стрептомицину. бицикломицину и полимиксину или в сочетании с использованием сероварспецифических плазмид с вставкой в их область, связанную с вирулентностью, транспозонов. Получены аттенуированные мутанты сальмонелл различных сероваров, L.pneumophila. L.monocytogenes, Y.pseudotuberculosis, которые характеризовались высокой иммуно-генностью, безопасностью при тестировании,на лабораторных животных и имели маркеры для их дифференциации от других культур.

Практическая значимость работы

С помощью разработанных методов аттенуации патогенных бактерий получены аттенуированные штаммы S. typhimurium, S.dublin. S.enteritidis, S. abortus ovis, обладающие высокой иммуноген-ностью, безопасные и стабильные в отношении уровня остаточной вирулентности.

Полученные аттенуированные генетически безопасные мутанты сальмонелл были использованы в качестве штаммов-носителей реком-бинантных плазмид в экспериментах, проведенных в Всероссийском центре прикладной микробиологии.

Получены с помощью одного из разработанных способов аттенуированные штаммы S.dublin 13-20 NS (против сальмонеллеза телят) и S.abortus ovis 17НС (против аборта овец), устойчивые к антибиотикам неамину и стрептомицину (умеренные концентрации). Живые вакцины из штаммов S.dublin 13-20 NS и S.abortus ovis 17НС были де-

тально исследованы в опытах на сельскохозяйственных животных и показали стабильность остаточной вирулентности, высокую иммуно-генность. безопасность использования. Широкие испытания живых вакцин из полученных штаммов сальмонелл в неблагополучных по сальмонеллезам хозяйствах выявили их высокую эффективность. Разработана и утверждена научно-техническая документация на производство живых вакцин из штаммов S.dublln 13-20 HS и S.abortus ovls 17НС. В настоящее время эти вакцинные штаммы широко используются в хозяйствах Казахстана для профилактики сальмонеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных.

Утверждены методические рекомендации о применении вакцин из указанных штаммов для профилактики сальмонеллеза у животных.

Получено 5 авторских свидетельств на изобретения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Современные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их решения", г.Гродно, 1987 г.; на X Мечниковской конференции молодых ученых-медиков "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии ". г.Одесса, 1987 г.; на 2-ой Всесоюзной конференции " Бактериальные токсины", г. Юрмала,1989 г.; на VI Всероссийском съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов, паразитологов им.И.И.Мечникова, г.Горький, 1991г.; на проблемной комиссии НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи "Генетика и молекулярная биология бактерий", 1991 г.; на Международном симпозиуме " Пищевые зоонозы - сальмонеллезы,кампилобакте-риоз.иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики", г.Москва, 1995 г.; на 5 конференции Европейской рабочей группы по легионеллезным инфекциям, г.Москва, 1990 г.; на 1 конгрессе Международного общества по эндотоксинам, США (Сан-Дй-

его), 1990 г.; на Международной конференции " Медицинская биотех- ' нология, иммунизация и СПИД", Ленинград, 1991 г.; на совещании рабочей группы экспертов ВОЗ по проблеме иммунизации животных против сальмонеллезных инфекций, Германия (Йена), 1993 г.; на 2 конференции Международного общества по эндотоксинам, Вена, 1992 г.; на Международной конференции " Вакцины против кишечных инфекций", Англия (Кембридж), 1992 г.; на XXIV национальном конгрессе по микробиологии, Мексика (Гвадалахара), .1993 г.;на 3 конференции Международного общества по эндотоксинам, Хельсинки, 1994 г.; на 3 Международной конференции Кембриджского института "Вакцины:новые технологии и применения", США (Александрия), 1995 г.; на 4 Между- . народной конференции Кембриджского института "Вакцины: новые технологии и применения", США (Мак Лин), 1996 г.; на 7 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (1995 г., Вена, Австрия), на юбилейных чтениях, посвященных 90-летию со дня рождения В.Д. Тимакова, в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи. 1995 г.; на конференции Отдела медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН. 1996 г.

Публикации. По теме диссертации■опубликована 31 печатная работа. утверждены 1 методические рекомендации, получено 5 авторских свидетельств.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введе-

I

ние, 3 главы обзора литературы. 9 глав результатов собственных исследований, обсуждение. Отдельная глава включает описание методов исследования. Заключают диссертацию выводы и список цитированной литературы, содержащий 28 наименований отечественных и 193 зарубежных работ. Работа изложена на 302 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 57 таблицами.

- 9 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Использованные штаммы и бактериофаги. В работе использовали 82 штамма S. typhimurlum, 16 штаммов S.enteritidis, 5 штаммов S. dublln и 3 штамма S.abortus ovis, выделенных от людей, животных и из окружающей среды. Культуры бактерий были получены из музейных и авторских коллекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, различных учреждений медицинского и ветеринарного профиля Москвы. Санкт-Петербурга, Ростова-на-Дону, Алма-Аты (Казахстан), Еревана (Армения), Тбилиси (Грузия). Также, в исследовании применялись культуры S.flexnerl, L.monocytogenes. Y.pseudotuberculosis. L.pneumophila, F. tularensis. генетически маркированные штаммы E.coll K-12 и S. typhimurlum из лабораторных музеев НИИЗМ им.Е.Ф.Гамалеи. В генетических экспериментах и для характеристики полученных штаммов были использованы бактериофаги с различной антигенной специфичностью, любезно переданные отечественными и зарубежными авторами.

Среды. Для выращивания кишечных бактерий применяли полноценные среды фирмы Дифко, мясопептонные бульон и агар производства НИИЭМ им. Гамалеи, а также минимальные среды М9 и А. Культивирование легионелл и возбудителя туляремии осуществляли на специальных средах, как описано в работах (Кормилицына М.И..Маракуша Б. И.. 1983; Marakusha В. I. et al.. 1990).

Методы исследования. Фаготипирование изучаемых штаммов сальмонелл проводили классическим методом, модифицированным в Тбилисском НИИВС (Чиракадзе И.Г., Чанишвили Т.Г..1981). Химический мутагенез, коньюгационные скрещивания и трансдукцию изучаемых маркеров с использованием бактериофагов Р22 и PI осуществляли общепринятыми методами (Миллер Д. ,1976). Транспозицию Tnl.TnS, TnlO

и элиминацию маркированных транспозонами плазмид проводили по методам, описанным в работах (Дэвис Р.и др.,1984; Dougan G. et al.,1993). Способность разных мутаций супрессировать нонсенс мутации или ограничивать это свойство определяли как описано Лыче-вой Г. А. и Алешкиным Г.И. (1977).

Выделение плазмидной ДНК осуществляли по методам Birnboim H. и Doly J. (1979) и Kado С. и Llu S.(1981), а также как описано Ма-ниатис Т. и др. (1984). Выделение хромосомной ДНК проводили фе-нольным методом (Stone G.et al.(1994). Обработку ДНК эндонуклеа-зами. лигирование фрагментов ДНК, ДНК-ДНК гибридизацию осуществляли как описано в руководстве (Маниатис Т. и др.,1984). Препараты ДНК анализировали с использованием электрофореза в 0,8-1,2% агарозном геле, а также путем электрофореза в пульсирующем электрическом поле в аппарате CHEF DRII (Bio Rad)(Lai E. et al., 1989).

Биологические тесты. Качественную кератоконьюнктивальную пробу на морских свинках , внутрибрюшинное, внутривенное и перо-ральное заражение мышей, динамику размножения бактерий in vivo и оценку протективной активности выполняли как описано нами ранее (Маракуша Б. И., Миролюбова Л. В., 1981; Маракуша Б. И. и др.. 1986). Тест перевязанной петли кишечника кролика и кожную пробу выполняли по методам, приведенным в статье (Deubert I.,Peterson J., 1985). Взаимодействие штаммов сальмонелл с эпителиальными клетками изучали с помощью культуры клеток линии HeLa (Маракуша Б. И.. Миролюбова Л. В.. 1981).

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам, определяя достоверность различий по критерию Сть-юдента (Урбах В.Ю.,1975).

- 11 -РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Изучение генетического контроля продукции термолабильного (ТЛ) энтеротоксина у Б. 1урЬ1шигШш Так как известно, что противоречивость в данных разных авторов о роли тех или иных компонентов клеток сальмонелл связывается, как одна из причин, ' с различиями в характеристике культур этих бактерий, то мы. с целью отбора объектов исследования -• штаммов сальмонелл, обладающих наиболее типичными для данного се-ровара свойствами, выраженной вирулентностью и наличием изучаемых признаков, предварительно сравнили биологические и генетические характеристики штаммов Б. 1урМтиг1ит, Б. <ЗиМ1п и Б. егПег!Ш1з различного происхождения. Было показано, что штаммы Б. 1урМтиг1-ит, Б.сЗиЬПп и Б. еМегИЛсИв, выделенные от людей и животных, относятся, в основном, к наиболее распространенным фаговарам, несут сероварспецифические плазмиды, характеризуются значительной вирулентностью при тестировании на различных моделях инфекции. "Госпитальные" культуры Б. 1урЬ1шиг1иш и выделенные из окружающей среды проявляли сниженную вирулентность для мышей, что подтверждает имеющиеся в литературе данные (Покровский В.И.и др.,1989), однако, они более часто вызывали коньюнктивальную реакцию у морских свинок и сохраняли характерную для этого серовара сальмонелл плазмиду. Эти данные отражают их более высокую колонизирующую активность и, вероятно, свидетельствуют о неадекватности используемых моделей для оценки вирулентности таких штаммов.

На основании полученных результатов, для проведения дальнейших исследований нами были отобраны высоковирулентные для мышей антибиотикочувствительные штаммы Э. ЪурМтиг1ит, Б. ег^егШсПэ 1 фаговара, а также Б.сЗиЬНп, выделенные от людей и животных.

Анализ продукции энтеротоксинов у исследованных культур :альмонелл показал, что значительная часть штаммов (90% - S.typ-ilraurium. все культуры S.dublln и S.enteritidis) образует ТЛ эн-геротоксин, иммунологически родственный энтеротоксину Е.coll и V.cholerae, при изучении в разных тестах In vivo и in vitro. 74% штаммов S. typhlmurium, все культуры S.dublln и §1% - S.enteritidis синтезировали быстрый ФП, сходный с термостабильным энтеро-токсином, что подтверждает данные других исследователей (Ketyi I.,1985; Kristiansen К. et al.. 1987 ). Высокая частота продукции штаммами сальмонелл ТЛ энтеротоксина, а также его важная роль в патогенезе гастроинтестинальной формы сальмонеллеза, послужили основанием для изучения генетического контроля его образования и возможности использования инактивации структурных генов, кодирующих синтез этого признака, при создании вакцинных штаммов. Нами (совместно с В.Г.Мотиным). при проверке гипотезы, высказанной некоторыми авторами (Jayasheela М. et al., 1987), о возможной плаз-мидной локализации гена ТЛ энтеротоксина сальмонелл, в опытах ДНК-ДНК гибридизации с помощью генетического зонда на основе клонированных генов ТЛ энтеротоксина Е.coll при исследовании плаз-мидной ДНК 7 штаммов S.typhimurium, которые продуцировали высокий уровень ТЛ энтеротоксина в разных тестах, положительный результат был показан только с 2 штаммами S.typhimurium - 417 и L19. В опытах элиминации и коньюгационных скрещиваниях плазмид с последующим исследованием полученных производных в разных тестах на продукцию энтеротоксина и в реакции ДНК-ДНК гибридизации было показано. что синтез ТЛ энтеротоксина у изученных нами штаммов детер-■ минирует плазмида молекулярной массой 54МД, несущая 2 копии гена ТЛ (рис.1).

А

i г з ч s

б

i jji

«»•v '

6,1 ^ 4,1

3.1

hi

Рис. 1. Результаты ДНК-ДНК гибридизации различных плазмид с генетическим зондом на основе 0,78 кб Hind Ill-фрагмента плазмиды рЬТ307(ТЛ+) Е.coll. А. Электрофорез в 0,755 геле рестрикционных (Pst I) фрагментов плазмидной ДНК: 1-р1Е454/Н74-114; 2-DLT307/J53; 3-pIE454-33/J53; 4-pST54/L19; 5-ДНК (Hlnd III). Б. Результат гибридизации с зондом.

Путем транспозонового мутагенеза и рестрикционного анализа был выявлен на плазмиде 54 МЛ Ваш HI-Eco RI фрагмент величиной 6.9 кб, вставки ТпЮ в который приводили к снижению уровня продукции ТЛ энтеротоксина производными штамма S. typhlmurium L19, несущими только плазмиду 54МД. Этот фрагмент был клонирован в составе Pst I фрагмента величиной 10 кб из указанной плазмиды, однако, следует отметить, что рестрикционная карта клонированного фрагмента плазмиды pST54 (рис.2) отличалась от 6,3 кб Eco Rl-Pstl фрагмента хромосомной ДНК, содержащего ген ТЛ энтеротоксина S.typhlmurium Q1, клонированного американскими исследователями (Chopra A. et al.,1987). Тем не менее, из-за низкого уровня экспрессии ТЛ энтеротоксина детально исследовать свойства клонированных ге-

•_I

Зк§

I I 11 I I—I-1 11 I и-m-n-n—I I к I-n-1 I I I I— POI-'l

ЧЕРЕВ H h EB6EEP НЕЕ Ин/pßEE^EE H (5BEE P

/ »

p STMM19-54 n / I M Y ю KS

i P-S EM

pchp4 p1 6,3ks

Рис. 2. рестрикционные карты плазмиды pST54 штамма S. typhi-murlum 19, клонированного Pst I фрагмента величиной 10 кб (плазмида pSTMM19-54) и фрагмента хромосомной ДНК величиной 6,3 кб (рСНР4), клонированного Chopra А.и др.(1987). Буквы под полосками, обозначающими линейную молекулу ДНК и клонированные фрагменты, указывают участки расщепления эндонуклеазами (Н -Hind III, Е - Eco RI, X - Xho I, В - Bam HI, P -Pst I. Pv - Pvu I).

нов и их продуктов не представлялось возможным.

Эти данные, а также только частичная нейтрализация энгеро-токсической активности штамма L19 антитоксической сывороткой позволили нам предположить продукцию этим штаммом другого ТЛ-подоб-ного энтеротоксина. детерминанты которого могут локализоваться на хромосоме, как это показано для энтеротоксигенных Е.coli (Kaura Y. .Sharma V., 1988). Это, как и отсутствие адекватной модели для оценки иммуногенности производных сальмонелл, дефектных в синтезе ТЛ энтеротоксина, не позволило нам оценить роль этого признака в иммуногенности живых вакцинных штаммов Salmonella.

2. Выявление и идентификация мутаций у сальмонелл. ■ приводящих к снижению их вирулентности

Для выявления мутаций у сальмонелл, обеспечивающих их атте-нуацию. был использован ряд антибиотиков с известными сайтами действия. Путем оценки вирулентности для мышей различных антибио-тикоустойчивых производных штамма S.typhlmurium 494 нами были

'отобраны 2 группы препаратов для выделения мутантов и их изучения. 1 группа - антибиотики, действующие на компоненты клеточной оболочки, которая имеет важное значение для вирулентности разных патогенных бактерий и их адаптации в окружающей среде (Gllleland Н., 1988; Whitfield С.,Valvano М., 1993) - полимиксин, бицикломи-цин (наружная мембрана), сюда мы отнесли условно и ЛИБ-71, так как исследовали мутанты, имеющие повреждения, вероятно,в поверхностных структурах клеток. 2 группа - антибиотики, взаимодействующие с рибосомальными белками, которые играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов (Тер-Аванесян М. Д., Инге-Вечто-мов с.Г.,1988;Tapio S..Isaaksson L.. 1988) - спектиномицин, стрептомицин и неамин.

Мутанты сальмонелл, устойчивые к полимиксину, представляли интерес в связи с тем, что этот антибиотик обладает способностью нейтрализовывать различные биологические эффекты эндотоксинов грам-отрицательных бактерий (Vaara М., 1992). Полученные нами производные S typhimurium, S.dublin, S.enteritidls, S.abortus ovls, резистентные к высоким концентрациям этого антибиотика (300 мкг/мл)(Ршхг), проявляли повышенную чувствительность к гидрофобным и гидрофильным антибиотикам, что указывает на повреждение структуры наружной мембраны, в частности, ЛПС (Sukupolva S., Vaara М., 1988;Vaara М., 1992). Об этом также свидетельствует появление устойчивости к бактериофагу Р22, который имеет рецептор в ЛПС (Rletschel Е. et al., 1992). Однако, нами не было выявлено существенных изменений в структуре ЛПС в препаратах такого типа мутантов, исследованных с помощью электрофореза в полиакриламид-ном геле. Отсутствие различий в чувствительности к другим бактериофагам - Р221,0x2. PH31.FP3, имеющим рецепторы на компонентах

наружной мембраны (белки, фосфолипиды), у Ршхг производных в сравнении с исходными культурами указывает, по видимому, на их неидентичность с структурами, определяющими устойчивость к поли-миксинам.

Исследование мутантов сальмонелл, резистентных к бицикломи-цину (Всшг), сайтом действия которого является белок наружной мембраны (Sukupolvu S., Vaara М., 1988), а также производных, устойчивых одновременно к ЛИБ-71 и азлоциллину (LlbrAzlr), показало наличие у них, также как и у Pmxr производных, повышенной чувствительности к детергентам и к некоторым гидрофобным антибиотикам. - эритромицину, розамицину, амфотерицину, новобиоцину, ампициллину и карбенициллину (причем у Всшг-только к первым двум). Это свидетельствует о наличии повреждений в структуре наружной мембраны. регулирующей проницаемость клеточной оболочки для различных веществ (Whitfield С.,Valvano М., 1993), обусловленной, вероятно, нарушением биосинтеза белковых компонентов. Однако, у этих штаммов не было выявлено изменений в.чувствительности ко всем исследованным бактериофагам, специфичным в отношении некоторых компонентов ЛПС и белков наружной мембраны Огар С, А и D, а также, в структуре ЛПС при исследовании с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле. Можно предположить, что мутанты LibrAzlr , вероятно. имеют дефект или в белке наружной мембраны, который обеспечивает транспорт гидрофильных (но не гидрофобных) хинолоновых антибиотиков в клетку (Vaara М., 1992)(исследуемые нами мутанты обладали перекрестной устойчивостью к ципрофлоксацину, но не нали-диксовой кислоте или некоторым другим антибиотикам такого класса) или в структурном компоненте цитоплазматической мембраны (Wolfson

J., Hooper D., 1989).

Изучение вирулентности производных S typhimurlum, S.dublin. S.enteritldls. S.abortus ovls, резистентных к высоким концентрациям полимиксина. бицикломицину, а также ЛИВ-71 и азлоциллину. показало ее значительное снижение для мышей при внутрибрюшинном и пероральном их заражении, при этом было отмечено снижение скорости размножения в органах РЭС, что приводило к укорочению времени .персистенции выделенных мутантов в организме в сравнении с исходными культурами (до 7-16 суток). Также, Bcnf производные S.typhlmurium и S.dublin сохранили способность к пенетрации в эпителиальные клетки линии HeLa на уровне исходных культур, тогда как мутанты Ршхг проявляли более низкую пенетрационную активность.

Эксперименты по картированию мутаций у исследуемых аттенуи-розанных мутантов путем коныогационных скрещиваний с использованием Hfr штаммов и в опытах трансдукции показали, что мутация устойчивости к бицикломицину локализуется на хромосоме S.typhlmurium у mal Е маркера (частота котрансдукции 4,2-6.8%)(рис.3) и обусловливает снижение вирулентности мутантов. Расположение мутации, определяющей устойчивость к ЛИБ-71 и азлоциллину. было определено примерно в trp области, так как более точное картирование •было затруднено из-за отсутствия удобного маркера, а также, из-за локализации в этом районе нескольких генов, мутации в которых детерминируют повреждения клеточной оболочки, приводящие к сходному фенотипу (Vaara M., 1992; Sanderson К. étal., 1995). Передача указанной мутации путем трансдукции в исходный штамм сальмонелл приводила к значительному снижению его вирулентности для мышей.

Что касается мутантов, устойчивых к спектиномицину, неамину и стрептомицину, то неаминустойчивые мутанты по чувствительности

Рис. 3. Схематическая карта хромосомы S. typhlrnurium с изображением точек начала и направления переноса генов различными Hfr штаммами, а также обозначением rps L -rps Е области и места локализации bcm маркера

к стрептомицину были разделены на 3 класса: 1) сохранившие чувствительность к стрептомицину на уровне исходного штамма; 2) приобретшие устойчивость к умеренным концентрациям (до 100 мкг/мл) этого антибиотика, и 3) резистентные к высоким концентрациям стрептомицина (500 мкг/мл и более).

При изучении вирулентности полученных производных S. typhirnurium. S. dublin, S. enterItidis и S. abortus ovls на модели внутриб-рюшинного заражения мышей было установлено, что мутанты, устойчивые к спектиномицину, сохраняли ее на уровне исходных культур. Неаминустойчивые мутанты сальмонелл, резистентные к небольшим

концентрациям стрептомицина, в также часть чувствительных к стрептомицину и резистентных к высоким концентрациям этого антибиотика производных, характеризовались снижением вирулентности для мышей при их внутрибрюшинном и пероральном заражении и скорости размножения в РЭС (длительность их персистенции составляла 7-16 суток). При изучении динамики взаимодействия указанных производных S.typhimurium и s.dublin с клетками линии HeLa не бы, ло выявлено различий в сравнении с исходными культурами, т. е.у них была сохранена способность к адгезии и пенетрации в эпителио-циты.

В опытах трансдукции мутация, сообщающая устойчивость только к неамину у сальмонелл указанных сероваров, была картирована в районе rps Е гена (частота котрансдукции 55,8-65,8%)(рис.3) и идентифицирована нами как пеа А. аналогично такого типа мутации E.coll К12 (Bachman В., 1990), тогда как пеа мутация мутантов, устойчивых к высоким концентрациям стрептомицина, локализовалась у rps L маркера (частота котрансдукции 32,7-40,9%) и сходна с пеа В мутацией Е.coll К12. Что касается мутаций, сообщающих устойчивость к неамину и умеренным концентрациям стрептомицина, то первая была картирована у rps Е маркера (частота котрансдукции 53,1-65.3%), а другая - в rps L гене.

3. Влияние мутаций, нарушающих синтез некоторых рибосомаль-ных белков, на вирулентность патогенных бактерий

Так как литературные данные свидетельствуют о том, что мутации, сообщающие устойчивость к некоторым аминогликозидным антибиотикам, влияют на точность считывания генетической информации (Hornig Н. et al., 1987;Ringstrom К., Isaacsson L., 1988), то нами было предположено, что механизм влияния на вирулентность саль-

монелл идентифицированных мутаций может быть обусловлен их таким действием. Для проверки этой гипотезы мы использовали модель оценки влияния мутаций на супрессию, предложенную Г.И. Алешкиным и включающую штамм с супрессорной мутацией и амбер мутант бактериофага Т4. Было показано (табл.1), что пеа А и rps L мутации неами-нустойчивых мутантов S. typhlmuriuro и S.dublln, резистентных к высоким концентрациям стрептомицина и обе мутации мутантов НеагБ-trr50-150 сильно ограничивали действие амбер супрессора в отличие от rps Е и rps L мутаций контрольных штаммов. Таким образом, мутации сальмонелл, ограничивающие действие амбер супрессора и изменяющие точность трансляции генетической информации, снижали вирулентность, тогда как мутации резистентности к спектиномицину, не оказывающие такого действия, не изменяли ее.

Эта закономерность была подтверждена на полученных нами мутантах S. flexneri, Y.pseudotuberculosis. L.monocytogenes, L.pneumophila и F.tularensls, что указывает на универсальный характер этого феномена - мутанты, устойчивые к неамину и небольшим концентрациям стрептомицина, характеризовались снижением вирулентности (табл.2), тогда как мутация к Spcr штаммов указанных видов бактерий не влияла на нее. Следует отметить, что неаминустойчивые мутанты возбудителя туляремии характеризовались, в отличие от Spcr мутантов, сниженной вирулентностью, однако, были нестабильными и для выяснения влияния Near мутаций на их вирулентность необходимо продолжение исследований.

Так как изученные нами неаминрезистентные мутанты сальмонелл и других патогенных бактерий, устойчивые к небольшим концентрациям стрептомицина, характеризовались наличием 2 мутаций, каждая из

- 21 -

Таблица 1. Характеристика способности пеа, грз Ь и грэ Е мутаций штаммов Э. 1ур111шиг1ит и З.йиЬИп влиять на супрессию амбер мутации бактериофага Т4аш54.

Штамм-донор мутации Изучаемая мутация Число клонов Число клонов, допускающих рост бактери-фага Т4аш54 Процент клонов, ограничивающих действие амбер супрессора

Б. 1урМ1ШГ1! 49-4 апо грз Ь 20 1 95

49-5 пеа А 25 0 100

494-23 грэ Е 20 20 0

49-39 грз 1 25 25 0

■ 49-54 пеа 25 0 100

49-54 грз Ь 20 0 100

Б.биЫЩ 13-86 грэ Ь 20 0 100

13-52 пеа А 15 0 100

1379-6 грэ Е 20 20 0

13-116 грэ Ь 25 25 0

13-20 грэ Ь 20 0 100

13-20 пеа 20 0 100

Контроль: Е.со11ВЬ-401 грз Ь 25 0 100

которых приводит к аттенуации, генетической безопасностью, достаточным уровнем остаточной вирулентности, выраженной иммуноген-ностью, то получение такого типа производных на среде с неамином (100 мкг/мл) и стрептомицином (50 мкг/мл) нами было предложено в качестве способа отбора потенциальных вакцинных штаммов патогенных бактерий, на который получено авторское свидетельство Ш 902453, выдано 1981 г.).

Таблица 2. Биологические свойства мутантов S.flexneri.Y.pseudotuberculosis, L.monocytogenes, L.pneumophila и F. tu-larensis, устойчивых к спектиномицину, неамину и стрептомицину

Исследуемый вид Фенотип Вирулентность штаммов на модели Число бактерий в РЭС мышей через 7 дней

морских свинках внутрибрюшинное заражение мышей

Shigella flexneri Spcr вирулентные ни ни

Near аттенуированные ни ни.

Near Strr аттенуированные ни ни

Y. pse-udotuberculosis Spcr вирулентные вирулентные увеличено

Kear аттенуированные аттенуированные снижено

Near Strr аттенуированные аттенуированные снижено

Listeria mono-cyto genes Spcr вирулентные вирулентные увеличено

Near аттенуированные аттенуированные снижено

Near Strr аттенуированные аттенуированные снижено

L. pneumophila Spcr вирулентные ни ни

Near аттенуированные* ни ни

Near Strr аттенуированные * ни ни

F. tula-rensis Spcr вирулентные вирулентные ни

tiear аттенуированные аттенуированные ни

Near Strr аттенуированные аттенуированные ни -

Примечание. Меаг мутанты Р. Шагепэ^ были нестабильны * - часть мутантов сохранила вирулентность

4. Молекулярно-генетическая характеристика сероварспецифи-ческих плазмид Б. 1урЬ1тиг1иш, З.йиЬИп и Б. еп1ег!ий1з и их значение для вирулентности сальмонелл Важным объектом нашего исследования были характерные для

штаммов S. enteritidis. S.typhlrnurium и S.dublin плазмиды молекулярной массой 36 МД. 60 МД и 50 МД. соответственно. При оценке значения генов, локализованных на указанных плазмидах, для вирулентности сальмонелл нами были получены производные штаммов S.еп-teritidis, S.typhlrnurium и S.dublin. которые или утратили плазми-.ды 36МД, 60МД. 50МД, соответственно, или несли вставки транспозо-нов, что приводило к снижению вирулентности для мышей при различных способах заражения и скорости размножения в органах РЭС мышей в сравнении с культурами исходных штаммов, а у штаммов S: typhimu-rilim. S. dublin - к повышение чувствительности к нормальной сыворотке морских свинок (табл.3). Эти результаты подтверждают данные других исследователей о важности сероварспецифических плазмид указанных представителей сальмонелл для экспрессии их вирулентности (Gullg Р. , Doyle Т., 1993; 0'Byrne С., Dorman С., 1994). ■ Также, бесплазмидные штаммы S. typhlrnurium и S.dublin проявляли сниженную способность к пенетрации эпителиальных клеток линии HeLa. что также было показано в работах ряда исследователей (Jones G. et al.. 1982;FangF. et al., 1991), но не подтверждено некоторыми другими авторами (Gullg P., Curtiss R., 1988) из-за,использования. вероятно, различных штаммов этих бактерий и линий клеток. отличающихся по чувствительности к сальмонеллезной инфекции.

Рестрикционный анализ маркированных транспозонами плазмид у »

аттенуированных производных сальмонелл показал, что встраивание транспозонов произошло в область Hind III фрагмента (рис.4), которая в работах ряда исследователей идентифицирована как связанная с вирулентностью Salmonella и локализована на 8 кб Sal I-Xho I фрагменте, гомологичном у плазмид вирулентности S.typhimurium. S.dublin, S.choleraesuis, S.enteritidis и некоторых других серо-

Таблица З.Епруленткость аттенуировакных штаммов сальмонелл, несущих сероварспецифическпе

■ плавмиды со вставками тракаповоков.при исследовании на различных моделях инфекции

; Штамм J сальмонелл ! I ! Наличие •пли отсутствие вставки* Вирулентность при заражении If числа бактерий в селезенке мышей черев 5-7 дней от качала инфекции а*-* Чувствительность к сыворотке морских ОЕИКОК 4А

оральном а* ЕКуТриСрЮ-шикном ** коньюн- ктпва- льком

NrfS 5,1+0,2 2,1+0 ,"2 КК 7,44+0,20 ieo

i ( -х J i wlJ + Q Л ±.Г) О 4,7+0,2 V 3,16+0,35 10

i2«^! - 5,9+0,2 1,1+0,3 КК 7,18+0,32 150

; 12-i£pSDE0 • + 7,4+0,3 3.5+0.3 к 2,12+0,30 л ^

S.entsrítidis

-з-см ¡ 621 PSE36 ' - ¡ 6,6+0,4 2 3+0 3 КК 7,12+0,30 ! 250

1 |821-42pSE3e + ¡ i 9,0 5,9+0,4 к 2,90+0,39 ¡ 23G

Примечания. * + или - наличие пли отсутствие плзгмпд в зтзмме;

a-a - вирулентность для мъглей оценивали путем вычисления IgLDso о последующим -определением средней величины ив ig- LD50 исследуемых культур сальмонелл; аа-а - среднее количество бактерии в селевекке мышей черев 5-7 дней после перо-

рального введения IC-IO-m.k. исследуемых щтаммов: 4а - процент выживших черев 43 часов после обработки 10" сывороткой морских свинок; 1-Х и - - положительная и отрицательная реакции в кератококькнкгпвальном тесте;

i

p S£Jß

ВстаЬки Tn 10

НЕ ЕЕ ЕЕЕН M ЕЕ ИХ EHE X ЕИ H in 11 . i I..1I .ч .и и i.ii : X. ni

ntttn i i nui it

• i л

ён CH 'x EH » SE 65

H 1 1 ' ТГ1 p

I k5

Рис.4. Рестрикционные карты плазмид pSE36 и pSE65 S.enteritl-dis. Стрелками указаны сайты вставки транспозонов.Буквы над полосками, обозначающими линейные молекулы ДНК. указывают участки расщепления эндонуклеазами (Н -Hind III,' Е - Eco RI, X - Xho I). Под картой плазмиды pSE65 вынесены участки ДНК, отсутствующие в плазмиде PSE36. 1- pSE36 штамма S.enteritidis 602;2-pSE65 штамма 738.

варов сальмонелл (Matsui H. et al.. 1990;0-Byrne С., Dormán С.,

ленных из различных источников, было установлено, что 2 культуры, выделенные от больных, несли плазмиду молекулярной массой не 36 МД. а 65 МД. которая не была описана в работах других авторов. При исследовании ее молекулярно-генетической характеристики и значения для проявления вирулентности Salmonella с помощью элиминации и транспозонового мутагенеза было установлено, что эта плазмида является, также как и плазмида pSE36, плазмидой вирулентности, обеспечивающей размножение сальмонелл In vivo. Клони-

1994).

При анализе плазмидного состава штаммов S.enteritidis, выде-

рованяый Hind Ш-Есо RI фрагмент этой плазмиды величиной 6,8 кб (pPV738-65), содержащий 1 сайт рестрикции для эндонуклеазы Eco RI и 3 - для Ваш HI и восстанавливающий вирулентность бесплазмидных производных, имел значительное сходство с фрагментом, выявленным в плазмиде pSE36 и связанным с ее вирулентностью (рис.5), Можно предположить, что эта плазмида является результатом рекомбинации плазмиды pSE36, с которой она имеет высокий уровень гомологии и другой, криптической плазмиды S.enteritldis.

Рис.5. Рестрикционная карта плазмиды рР\Г738-65 Б.еп1егП1й1з.

Стрелками указаны участки расщепления эндонуклеазами.Во внешнем круге цифры указывают координаты в т.п.н. Во внутреннем круге в виде полоски изображен клонированный фрагмент, а тонкой линией - вектор риС19

Использование клонированного фрагмента ДНК плазмиды pSE65 с инактивированными генами, существенными для вирулентности сальмонелл, в плане аттенуации этик возбудителей затрудняла нестабильность его наследования в исследуемых штаммах.

В плане возможного решения этой проблемы интерес представляло изучение культур S.enteritidis, выделенных из разных источников и характеризовавшихся отсутствием сероварспецифической плазмиды. Путем многократных пассажей через организм мышей, а также в реакции ДНК-ДНК гибридизации с использованием в качестве зонда клонированного 6,8 кб Hind III-Eco RI фрагмента плазмиды 65МД S.enteritidis (рис. 6) нами было установлено, что плазмиды вирулентности у ряда выделенных штаммов S. enteritidis интегрировали в их хромосому. Заражение такими культурами экспериментальных животных приводило к возникновению инфекционного процесса за счет перехода плазмиды вирулентности в автономное состояние.

s

I Z 3 4 5 6 1

ю. a з

Рис.15. Результаты ДНК-ДНК гибридизации in situ меченной згР плазмидной ДНК pPV738-65-2 с штаммами S.enteritidis. Расположение образцов: 1-5 - штаммы S.enteritidis 2494,206,497,2675,737; 6 - бесплазмидный штамм S.enteritidis 738-12: 7 - Е. coli НВ101; 8 - S. typhlrnurium 49-33 бесплазмидный: 9 - S. typhlrnurium 494; 10 -S.dublin 1379.

Следует подчеркнуть, что некоторыми авторами (Jones G. et al., 1982) высказывалось предположение о возможности интеграции плазмиды вирулентности S. typhlmurlum молекулярной массой 60 МД в хромосому. Можно предположить, исходя из того, что исследованные штаммы были выделены от больных людей, воды и кур, что интеграция плазмиды вирулентности обусловлена генотипическими особенностями культур S.enteritidls, а возможный механизм ее связан с наличием собственных инсерционных элементов на плазмиде и в хромосоме. ■ Более детальное исследование таких штаммов позволит определить причину интеграции плазмид в хромосому.

Полученные данные подтверждают ранее сделанный вывод о сложности генетическогб контроля патогенности сальмонелл, основанного на взаимодействии хромосомных и внехромосомных генов (Петровская В. Г., Бондаренко В. М., 1994).

5. Характеристика аттенуированных мутантов S. typhlmurlum, S.dublin, S.enteritiöis и S. abortus ovls Проведенные эксперименты позволили получить разными способами набор аттенуированных мутантов сальмонелл разных сероваров, которые характеризовались наличием двух мутаций, сообщающих устойчивость к неамину и стрептомицину или бицикломицину и полимик- . сину в сочетании с отсутствием плазмиды вирулентности или вставкой в ее область, связанную с вирулентностью,транспозона. Следует отметить, что при сравнении иммуногенности для мышей бесплазмид-ных штаммов сальмонелл с производными, несущими плазмиды со вставками транспозонов, нами было показано, что наличие или утрата плазмиды не влияют на эту характеристику исследованных культур. Мутация LibrAzlr нами не использовалась, так как она не была точно картирована. В опытах по исследованию протективной активно-

сти мутантов, стабильности, длительности персистенции было пока-• зано (табл.4), что наиболее выраженной протективной активностью обладают неаминустойчивые мутанты, резистентные к небольшим концентрациям стрептомицина и мутанты, устойчивые к бицикломицину и полимиксину, содержащие плазмиду вирулентности сальмонелл с вставками транспозона. Такого типа производные были безопасными при

Таблица 4. Остаточная вирулентность и протективная активность аттенуированных штаммов сальмонелл

Исследуемые штаммы Генотип Остаточная вирулентность (18ЬП50) Иммуноген- ность (IS EDSo> Длительность персистенции (в днях)

S. tvphlmurium 49-54 nea rps L 7, 20+0.20 5. 76+0,16 12-14

49-54ТШ0 nea rps L pST60:: TnlO 7,70+0.25 5, 72+0.18 10

■ 49-7 bcm pmx 7.00+0,18 5, 80+0. 20 10-12

49-7ТП10 bom pmx pST60::TnlO 7,45+0,25 5,76+0.14 8

S.dublln 13-20 nea rps L 7,20+0.22 5,60+0,12 13-15

13-2 nea rps L pSD50:: TnlO 7, 60+0, 20 5,62+0,14 10

13-14 bcm pmx бесплазмидный 7, 60+0,20 5, 82+0,14 6-8

S.enter!tldls 60-13 nea rps L 7,40+0.14 5, 75+0,18 12-14

• 60-13 nea rps L pSE36::Tnl0 7,70+0,12 5,68+0,14 8-10

60-84 bcm prnx pSE36:: TnlO 7, 70+0, 20 5,72+0,14 8

S.abortus ovli 46-12 nea rps L 8. 00+0,30 6. 84+0. 22 10-14

46-23 bcm pmx 8,20+0,32 6, 76+0, 20 8-10

использовании в опытах на мышах, стабильно сохраняли сниженную вирулентность и маркеры, приводящие к аттенуации. Наличие 3 атте-нуирующих маркеров обеспечивает полную генетическую безопасность таких производных, так как возможность реверсии одновременно по этим мутациям находится на уровне, практически недостижимом в экспериментальных исследованиях. Таким образом, выделенные нами аттенуированные мутанты полностью соответствуют требованиям, к'ог торые предъявляет ВОЗ к вакцинным штаммам (Charles I., Dougan G., 1990;Hormache С. et al., 1992;Curtlss R. et al., 1993). '

Исходя из полученных результатов, нами был предложен способ отбора атгенуированных иммуногенных мутантов патогенных бактерий путем введения 2-х- мутаций, сообщающих устойчивость к бицикломи-цину и полимиксину (высоким концентрациям) или неамину и стрептомицину (50-150 мкг/мл) в сочетании с инактивацией транспозоном генов сероварспецифических плазмид, существенных для вирулентности (для повышения безопасности мутантов), на который было получено авторское свидетельство (N 1538511, выдано 1989 г.).

Предлагаемый метод аттенуации обеспечивает высокую безопасность вакцинных штаммов и позволяет повторно выделять такого типа культуры после снижения иммуногенности ранее выделенными. Наличие маркеров антибиотикорезистентности позволяет контролировать состояние штаммов при длительном хранении, а также дифференцировать последние от диких культур в полевых опытах. Полученные таким методом производные могут использоваться в качестве потенциальных вакцинных штаммов после детального изучения на сельскохозяйственных животных. Очевидна целесообразность использования принципа инактивации генов, связанных с вирулентностью сальмонелл, локализованных на плазмидах вирулентности как способа увеличения безо-

пасности конструируемых вакцинных штаммов.

Таким образом, на основании проведенных исследований, нами были идентифицированы мутации в генах, контролирующих синтез поверхностных структур сальмонелл и рибосомальных белков, а также в генах сероварспецифических -плазмид. кодирующих синтез факторов патогенности этих бактерий, которые приводили к снижению вирулентности у полученных мутантов. Это позволило нам разработать на модели сальмонелл принципы аттенуации патогенных бактерий, заключающиеся в использовании для получения аттенуированных штаммов двойных мутаций, каждая из которых приводит к утрате вирулентности, обеспечивая безопасность таких производных, а также, дополнительно, применение инактивации генов, связанных с вирулентностью, локализованных на сероварспецифических плазмидах, что повышает безопасность потенциальных вакцинных штаммов патогенных бактерий. Эти принципы легли в основу разработанных нами методов аттенуации. позволяющих получать аттенуированные мутанты сальмонелл различных сероваров, которые характеризовались наличием или хромосомных или сочетанием хромосомных и плазмидных мутаций, приводящих к снижению вирулентности, высокой иммуногенностью, безопасностью при тестирований на лабораторных животных и имели маркеры для их дифференциации от других культур.

6. Эффективность живых вакцин на основе аттенуированных мутантов S.dublln 13-20NS и S.abortus ovis 17НС Для выяснения возможности практического использования в качестве живых вакцин полученных производных аттенуированные штаммы S.dublln 13-20NS (против сальмонеллеза телят) и S.abortus ovis 17НС (против сальмонеллезного аборта овец) были детально исследованы в опытах на различных сельскохозяйственных животных совмест-

но с сотрудниками лаборатории микробиологии и вирусологии Алма-Атинского зооветеринарного института.

'Живые вакцины из штаммов S. dublin 13-20 MS и S.abortus ovls 17НС были безвредны и безопасны для телят (10-20-дневного возраста) и овец, соответственно, высокоиммуногенны при подкожной иммунизации S. dublin в дозе 1 млрд. и S.abortus ovis в дозе 1,5 млрд.м.к., защищая 100% животных (телят и овец) от смертельной инфекции вирулентным штаммом при внутрибрюшинном заражении (табл.5). При патоморфологическом исследовании в органах РЭС жи-

Таблица 5. Стабильность сохранения остаточной вирулентности и аттенуирующих маркеров штаммов S.dublin 13-20NS и S. abortus ovls 17НС в различных условиях

Способ проверки стабиль- Исследуемый штамм Число клонов МИК антибиотиков в мкг/мл Остаточная.вирулентность (пределы колебаний lg LD50)

неамина неоми-цина стрептомицина

Обработка нитрозогуани дином S.d. 5 100 50 150 7,18 - 7,54

S.ao. 4 100 30 50 7,98 - 8.48

Пассажи через мышей: 1 - 5 S.d. 11 100 50 150 .7,00 - 7,53

6-10 16 100 50 150 6,98 - 7,48

1 - 5 S. ао. 10 100. 30 50 8,00 - 8,40

6-10 10 100 30 50 7,95 - 8.54

Пассажи через телят:. (5 пассажей) S.d. 14 100 50 150 7.00 - 7,40

Пассажи через овец: (5 пассажей) S.ao. 5 100 30 50 7,90 - 8,15

Примечание. S.d. и S.ao.-обозначение штаммов S.dublin 13-20NS

и S.abortus ovis 17НС, соответственно

вотных, иммунизированных указанными вакцинами, развивался иммунологический ответ на введение живых вакцин, длительность персис-тенции аттенуированных культур составляла 14-17 дней. Обе вакцины были использованы с высокой эффективностью в хозяйствах Казахстана. неблагополучных по сальмонеллезам, вызванным указанными серо' варами сальмонелл. На них разработана и утверждена научно-техническая документация и они в настоящее время широко используются для профилактики сальмонеллезов.

Также, вакцинный штамм 13-20NS был использован для создания бивалентной вакцины против сальмонеллеза телят (вместе с аттенуи-рованным штаммом S. typhimurium 274). На такую вакцину разработана и утверждена научно-техническая документация, живую вакцину такого типа готовят на Алма-Атинском биокомбмнате и широко используют в ветеринарной практике.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена у S typhimurium, S.dublin. S.enteritldls,, S.abortus ovls мутация, сообщающая устойчивость к антибиотику би-цикломицину, повреждающему клеточную стенку, приводящая к повышению их чувствительности к детергентам и некоторым антибиотикам и снижению вирулентности мутантов для мышей на различных моделях. МутациЯ'Картирована на хромосоме S.typhimurium у mal Е гена (частота котрансдукции 4.2-6,8%)

2. У S typhimurium, S.dublin, S.enteritldls, S.abortus ovis н^аминустойчивые мутанты по чувствительности к стрептомицину были разделены на 3 класса: 1) сохранившие чувствительность к стрептомицину на уровне исходного штамма; 2) приобретшие устойчивость к умеренным концентрациям (до 100 мкг/мл) этого антибиотика, и 3)

резистентные к высоким концентрациям стрептомицина (500 мкг/мл. и более).- Все производные сальмонелл второго класса, а также часть мутантов 1 и 3 классов характеризовались значительным снижением вирулентности для мышей и скорости размножения в органах РЭС.'

3. В опытах трансдукции мутация, сообщающая устойчивость только к неамину у S. typhimurium, S.dublin, S.enteritMls и S. abortus ovis была картирована в районе rps Е гена (частота кот-рансдукции 55,8-65.8%) и идентифицирована нами как пеа А, аналогично такого типа мутации E.coli К12. пеа мутация мутантов сальмонелл, резистентных к высоким концентрациям стрептомицина, локализовалась у rps L маркера (частота котрансдукции 32,7-40,9%) и сходна по расположению с пеа В мутацией E.coli К12. Мутации, сообщающие устойчивость к неамину и умеренным концентрациям стрептомицина. картированы у rps Е маркера (частота котрансдукции 53,1-65,3%) и в rps L гене, соответственно.

4. Установлена зависимость между действием выявленных нами мутаций резистентности к некоторым аминогликозидным антибиотикам на активность амбер супрессора и влиянием на вирулентность: мутации в гене, кодирующем синтез рибосомального белка S5, сообщающие устойчивость к спектиномицину и не влияющие на точность считывания генетической информации, не изменяли вирулентности сальмонелл, тогда как мутации, детерминирующие устойчивость к стрептомицину и неамину, изменяющие синтез рибосомальных белков S12, S17 и ограничивающие действие амбер супрессора, приводили к снижению вирулентности сальмонелл.

5. Показано общебиологическое значение выявленной закономерности - такого типа мутанты других видов патогенных бактерий, относящихся к внутриклеточным паразитам: Shigella flexneri, Yersi-

•nia pseudotuberculosis. Listeria monocytogenes. Legionella pneumophila, Francisella tularensis не изменяли вирулентности в случае приобретения устойчивости к спектиномицину и снижали ее при возникновении устойчивости к неамину.

6. Плазмида некоторых штаммов S. enteritidis молекулярной массой 65 МД, также как и плазмида 36 МД, имеет важное значение для вирулентности этих бактерий, обеспечивая их размножение в органах РЭС. Построена рестрикционная карта плазмиды pSE65 и идентифицирован фрагмент на этой плазмиде, существенный для вирулентности S. enteritidis. Клонированы гены, определяющие размножение сальмонелл этого серовара в органах ретикулоэндотелиальной системы.

7. Установлено, что часть штаммов S.enteritidis, выделенных от больных, животных и из окружающей среды, не содержат сероварс-пецифическую плазмиду вирулентности. С использованием генетического зонда на основе фрагмента плазмиды 65 МД, необходимого для экспрессии вирулентности, показана интеграция плазмиды молекулярной массой 36 МД в хромосому S.enteritidis, приводящая к снижению вирулентных свойств этих бактерий.

- 8. Показано, что плазмида молекулярной массой 54 МД штамма S. typhimurium, контролирует синтез термолабильного энтеротоксина. сходного .по свойствам с термолабильным энтеротоксином E.coll и V.cholerae. Построена рестрикционная карта плазмиды и выявлен район. кодирующий синтез термолабильного энтеротоксина сальмонелл.

9. На модели сальмонелл разработаны способы аттенуации бактерий, основанные на использовании двух мутаций, сообщающих устойчивость к неамину и стрептомицину или бицикломицину и полимиксину в сочетании с использованием сероварспецифической плазмиды с

вставкой в ее область, связанную с вирулентностью, транспозона. Получены аттенуированные мутанты сальмонелл различных сероваров: которые характеризовались высокой иммуногенностью, безопасностью при тестировании на лабораторных животных и"имели маркеры для их дифференциации от других культур.

10. Получены с помощью одного из разработанных способов атте-нуированные штаммы S.dublln 13-20 NS (против сальмонеллеза телят) и S.abortus ovls 17НС (против аборта овец), устойчивые к антибиотикам неамину и стрептомицину (умеренные концентрации). Живые вакцины из штаммов S.dublin 13-20 NS и S.abortus ovls 17НС были детально исследованы в опытах на сельскохозяйственных животных и показали стабильность остаточной вирулентности, высокую иммуно-генность, безопасность использования. Широкие испытания живых вакцин из полученных штаммов сальмонелл в неблагополучных по сальмонеллезам хозяйствах выявили их высокую эффективность. Разработана и утверждена научно-техническая документация на живые вакцины из штаммов S.dublln 13-20 NS и S.abortus ovls 17НС. В настоящее время эти вакцинные штаммы широко используются для профилактики сальмонеллезной инфекции.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ получения авирулентных иммуногенных мутантов энте-робактерий // Авторское свидетельство N 902453, выдано 1981 г. (соавт. Петровская В.Г.).

2. Биологическая характеристика резистентных к спектиномици-ну штаммов туляремийного микроба // Антибиотики,- 1983.- N.6.-С.434-436 (соавт. Кормилицына М.И.).

3. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плот-

ной среде для выявления продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки // Журн. микробиол., эпидемиол. .иммунобиол. - 1983,- N. 7. - С. 92-97 (соавт. Шагинян И. А.).

4. Хромосомные маркеры лекарственной устойчивости как селекторы потенциальных вакцинных штаммов // Антибиотики.- 1984. -М.2.- С. 124-126 (соавт. Бондаренко В.М.).

5. Получение и характеристика биологических и генетических' свойств устойчивых к неамину мутантов Salmonella typhimurium и Salmonella dublln, перспективных для создания вакцин // Журн.мик-робиол..эпидемиол.,иммунобиол. - 1986.- N.10,- С.3-8 (соавт. Петровская В. Г.. Волковой К. И.).

6. Генетическая характеристика и протективные свойства неа-минрезистентных мутантов Salmonella typtiimurlum и Salmonella dublin классов NearStrr и NearStrr500 // Журн.микробиол. .эпидемиол., иммунобиол. - 1987,- N.4. - С.3-8 (соавт. Петровская В.Г.. Волковой К. И.).

7. Характеристика плазмид штаммов Salmonella различного про- у похождения// Журн. микробиол. .эпидемиол. .иммунобиол. - 1987,-

N.4. - С.14-21 (соавт. Яковлева О.Н., Петровская В.Г.).

8. Биологические свойства бесплазмидных штаммов Salmonella typhlmurlum и Salmonella dublln // Журн. микробиол.. эпидемиол..иммунобиол. - 1987,- N.6. - С.6-11 (соавт. Яковлева О.Н.).

9. 1986 год: Ранние этапы инфекционного процесса (достижения и проблемы) // Журн. микробиол., эпидемиол.. иммунобиол. - 1987,-N.10. - С. 107-116 (соавт. Петровская В.Г.).

10. Биологическая и генетическая характеристика мутантов Salmonella typhimurlum и Salmonella dublln. резистентных к неко-

торым аминогликозидным антибиотикам и их протективные свойства // Кн. "Современные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их решения":Тез.докл. - Гродно, 1987.- С.121 (соавт. Петровская В. Г.).

11. Штамм Salmonella dublin 13-20NS для изготовления живой вакцины против сальмонеллезной инфекции // Авторское свидетельство N 1314665. выдано 1987 г. (соавт.Петровская В.Г., Матвиенко Б. А., Бияшев К. Б., Рабочая Л. М.).

12. Значение плазмид в вирулентности Salmonella typhlmurlum и S. dublin // Кн. " Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии ": Тез. докл. X Мечниковской конференции молодых ученых-медиков. - Одесса, 1987.- С.194-195 ( Тартаковский И.С., Ларвиш К., Варфоломеева Н. А.).

13. Знтеротоксигенность штаммов Salmonella различного происхождения // Журн. микробиол.,эпидемиол., иммунобиол. - 1988.-N. 3. - С. 3-10 (соавт. Петровская В.Г.).

14. Факторы патогенности Yersinia pseudotuberculosis и их генетический контроль // Журн.микробиол., эпидемиол., иммунобиол. -1988. - N.7.- С. 78-87 (соавт. Петровская В. Г.).

15. Штамм бактерий Salmonella typhlmurlum, используемый для моделирования длительной персистенции сальмонелл // Авторское свидетельство N 1412500, выдано 1988 г. (соавт. Степанова Л.К., Агеева В. А., Петровская В. Г., Белая Ю. А.).

16-, Технические условия "Вакцина сухая живая против сальмо-неллеза телят из штамма S.dublin 13-20NS" // ТУ-10-19-14-88: Утв. Главн. управл. ветер. Госагропрома СССР 3.06. 1988,- 16 с. (соавт. Петровская В.Г., Матвиенко Б.А., Бияшев К.В., Тулкибаев К. А.).

17. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят из штамма S.dublln 13-20NS и наставление по применению: Утв. Главн. управл.ветер. Го-сагропрома СССР 26.02.1988.- 23 с. (соавт.Петровская В.Г., Матвиенко Б.А., Бияшев К.Б., Тулкибаев К.А.).

18. Знтеротоксигенность штаммов Salmonella различного происхождения // Кн. " Бактериальные токсины" : Тез.докл. 2-ой Всесоюзной конференций. - Юрмала, 1989.- С.71 (соавт. Петровская В. Г.).

19. Штамм бактерий Salmonella abortus ovls 17НС, используемый для изготовления живой вакцины против сальмонеллезного аборта овец // Авторское свидетельство М 1490956, выдано 1989 г. (соавт. Петровская В. Г. , Матвиенко Б.А., Тулкибаев К.А.).

20. Технические условия "Вакцина сухая живая против сальмонеллезного аборта овец из штамма S.abortus ovls 17НС"// ТУ-10-19-15-88: Утв. Главн.управл. ветер. Госагропрома СССР 8.06. 1988.- 16 с. (соавт.Петровская В.Г., Матвиенко Б. А., Тулкибаев К. А.).

21. Временная инструкция по изготовлению' и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят из штамма S.abortus ovls 17НС и наставление по применению: Утв.Главн. управл.ветер. Госагропрома СССР 26.02.1988.- 23 с. (соавт.Петровская В.Г., Матвиенко Б. А., Тулкибаев К.А.).

22.. Способ получения аттенуированных иммуногенных мутантов энтеробактерий // Авторское свидетельство N 1538511. выдано 1989 г. (соавт. Петровская В. Г.).

23. Сальмонеллезы животных и меры борьбы // Методические рекомендации.- Алма-Ата, 1991,- 41 с. (соавт. Бияшев К.Б.. Омаров

М. Лолысбаев Б..Т., Жанузаков Н.. Тулкибаев К. А., Бондаренко.В.М., Романова Ю. М.).

24. Новые подходы к конструированию потенциальных вакцинных-. штаммов // Тез.докл. VI Всероссийского съезда Всесоюзного научного общества микробиологов,эпидемиологов, паразитологов им.И. И.Мечникова. - Горький, 1991,- Т.1. - С.190 (соавт.Петровская В.Г.).

25. Биологические свойства штаммов Salmonella enteritidls, выделенных из различных источников в период с 1969 по 1989 г. // Журн.микробиол. .эпидемиол. .иммунобиол. - 1995. - N. 3,- С. 65-70 (соавт. Рожнова С.Ш., Христюхина О. А., Алимбекова Б. И., Петровская В. Г.).

26. Плазмидный контроль и клонирование генов, детерминирующих синтез термолабильного энтеротоксина Salmonella typhimurium // Кн." Пищевые зоонозы - сальмонеллезы.кампилобактериоз.иерсини-озы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики" :Тез.докл. Международного симпозиума,- Москва. 1995.-С. 50-51 (соавт. МотинВ.Г., ДарвишК.,, Тартаковский И. С., Петровская В. Г.).

27. Живые сальмонеллезные вакцины // Журн.микробиол.,эпидемиол. .иммунобиол. - 1996. - N. 3,- С.65-70 (соавт. Бондаренко В. М., Петровская В.Г.).

28. Genetical aproach to the study of Legionella virulence // In: "Legionella - 5". Abstr.book'of Eur. working group on Legionella infections. - Moscow, 1990.- P. 10. (Tartakovskii I.S., Proso-rovskii S. V.).

29. Biological and genetic properties of polymyxin resistant mutants of Salmonella // In: "END0T0XIN-1990". Abstr.book the 1 Congress of the Int. Endotoxin Soc.- San Diego. 1990. - P.102 (Pet-

rovskaya V. G.).

30. Some mechanisms of attenuation of pathogenic bacteria // In: "Medical Biotechnology, Immunization and AIDS". Leningrad. -1991,- P.4-13 ( Petrovskaya V.G.).

31. Vaccine strains of Salmonella dublin and Salmonella abortus ovis // Vaccine.- 1992,- Vol.10.- N.4. - P. 279.

32. The characteristics of the outer membrane-defective mutants of Salmonella // In: "END0T0XIN-1992". Abstr.book the 2 Conference of the Int.Endotoxin Soc.- Vienna, 1992.- P.211.

33. Plasmid characterization of strains of Salmonella ente-ritidis // Abstr. book XXIV Natl.Congress of Microbiol.- Guadalajara (Mexlca), 1993,- M.86 (Petrovskaya V.G., Raygoza-Anaya M).

34. Adhesion and ultras trueture of the colonies of the outer membrane-defective mutants of S.typhimuriuro and S.dublin // In: "END0T0XIN-1994". Abstr.book' the 3 Conference of the Int.Endotoxin Soc. - Helsinki, 1992,- P. 204 (Darwich K., Pavlova I.B.).

35. A new approach in construction of vaccine strains of Salmonella// In:"Vaccines:New Technologies and Applications". Abstr. book 3d Ann.Conference. - Alexandria. 1995.-P.156 (Darwich K.).

36. Effectivlty of S.dublin live vaccines against salmonellosis in calves // In:"Vaccines: New Technologies and Applications". Abstr.book 4d Ann.Conference.- Mc Lean (USA), 1996.- P.210.

37. Biological characteristics of L.pneumophila mutants resistant to different antibiotics and defect to production biolo-gicflly active compounds // Abstr.book of the 4th Sci.Meeting of the European Soc.Chemotherapy.- Athens, 1996.- P. 54 (Temezhnikova N. D., Tartakovskii I.S).