Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение холинэстерназных биосенсоров в анализе объектов окружающей среды и контроле качества воды

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Применение холинэстерназных биосенсоров в анализе объектов окружающей среды и контроле качества воды"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рухопиои

ИСКАНДЕРОВ Ренат Равилевич

ПРИМЕНЕНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ БИОСЕНСОРОВ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАВШЕЙ СРЕДЫ И КОНТРОЛЕ КАЧЕСТВА ВОД

03.00.23 Биотехнология,

11.00.11 Охрана окружающей среды и рациональное использование природных реоурсов

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химичесхих наук

КАЗАНЬ - 1993

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета.

Научные руководители - доктор химических наук

Латыпова В.3., доктор химических наук Никольская Е. Б.

Официальные оппоненты - докюр химических наук

Фридланд С.В., кандидат химических наук Бабкина С. С.

• Ведущая организация - Московский государственный университет

им. М. И. Ломоносова

Защита состоится "^0" ¿¿¿^/¿сТ^" 1994 г. в часов на заседании Специализированного ученого совета К 063.37.05 при Казанском государственном технологическом университете.

Адрес: 420015, г. Казань, ул. К.Маркса, 68, КГТУ, Учений совет,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГТУ. Автореферат разослан 'Ъ*гГ' января 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета К 063.37.06 , / ^^

кандидат технических наук Килеева З.Ш.

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы, Исследование особенностей функционирования ферментов, иммобилизовании:* в мембранах, представляет собой важное направление развития биотехнологии. Выявление факторов, обусловливающих удельную активность фермента в мембране, плялние диффузионных ограничений на скорость ферментативного процесса необходимо для оптимизации функционирования ферментных колоночных и пленочных реакторов, процессов биоочистки в аэро-тенках и других областях биотехнологии. Крем? того, применение иммебнлнзоданных ферментов для решения конкретных практически:: задач ."."'-¡гностики биологически активных соединений позволяет существенно расширить возможности.применения- ферментов и круг определяемых соединений.

Так, актуальна задача разработки экспресс-методов групповой диагностики загрязнителей окружающей среди, относящаяся к приоритетным направлениям развития экологического мониторинга ¡1 приборостроения. Указанные методы долган обеспечить быстрое предварительное обнаружение присутствия приоритетных токсикантов в объектах окружающей среды, а такге сцепку потенциальной опасности загрязнения (токсичности). Решение указанной задачи требует развития новых подходов,оснозанных на применении биологических и биохимических методов исследования. Реализация досг тоииств указанных подходов осуществляется в создании биосенсоров - аналитически:! устройств на основе иммобилизованных биокомпонентов (ферменты, микроорганизмы и т.д.), 3 них сочетаются простота и миниатюрность химических сенсоров и чувствительность и селективность ферментативных реакций. К настояееку времени биосенсоры, и в частности ферментные электроды, редко применяются для решения практических задач экологического мониторинга, что связано с недостаточной методической и аппаратурной базой для их использования.

Работа выполнялась в рамках приоритетного направления развития химической науки и технологии N 29 по теме 29.8.9. "Биосенсора и анализ окрузапцей среды: разработка ферментсодергаилх мембран для сенсоров" и в рамках программы ОФ РАН Н. 1.2. "Физиологические механизмы, обеспечивающие нормальное развитие и ус- 3 -

• тойчнвость организма человека и гивотных", а также в рамках программы "Университеты России" (4. Экология) и при поддзрхче Специального фонда талантливых молодых ученик С грант А1.23).

Целью настоящего исследования явилось создание и практическая апробация потенциоиетрических холиностер^эных йиосенсо-ров для определения фос§орорганических пестицидов и оценки общей загрязненности (токсичности) водной среды. Для реализации поставленной цели в работе необходимо ре-шпть следующие задачи:

1. Исследовать функционирование ферментных электродов на основе различных мембран с иммобилизованной бутирилхолинэстера-зой (Кф 3.1.1.8, ХЭ) в различных условиях измерения и найти оптимальные условия определения с их помощью ингибиторов ферментативного процесса.

2. Исследовать зависимость чувствительности определения ингибиторов от природы ингибитора, материала мембраны, условий пробоподготовки.

3. Разработать метод активации тионобых пестицидов с помощью электрохимической пробоподготовки.

4. Провести сравнительные испытания холинэстеразных биосенсоров и методов биотестирования для контроля загрязненности природных и технологических вод.

Научная новизна и практическая значимость заключаются ь том, что:

- впервые проведено сравнительное исследование влияния способа иммобилизации фермента на границы определяемых содержаний фосфорорганических пестицидов и эксплуатационные характеристики потенциометрических холинэстеразных биосенсоров в одинаковых экспериментальных условиях;

- на основании этих исследований углублены представления о закономерностях использования иммобилизованных холинэстераз для определения ингибиторов, в тоы числе в объектах окружающей среды;

- впервые показана возможность использования холинэстеразных ,, биосенсоров как средства биотестирования для обобщенной оценки

загрязненности природных и технологических вод по суммарному ингибирувдему эффекту имеющихся примесей на фермент йутирилхо-линэстераэу;

- разработан новый электрохимический метод активации тионо-вых пестицидов аисдньтн окислением их в присутствии галогенидов до кислородных аналогов;

- использована новая конструкция хояинэстераэнкх биосенсоров со сменной мембраной, что позволило существенно упростить и регламентировать процесс изготовления и эксплуатации подобного рода биосенсоров;

- предложен способ дифференциации определения ингибиторов ХЭ, варьированием (.'".олоз пробоподготовки и процедуры измерения;

Часть эксп. .■.■'ментальных результатов и выводы на их основе юпользоргшм к учебном процессе в Казанском государственном ('ниверсмпрл --.гении общего курса "Основы экологического нб-шторинга" и спег:.урса "Методы биологического мониторинга".

Положения, впюспмне на защиту:

- создание и практическая апробация потенцисметрических хо-тнэстераэннх с'^сенсоров с .г.елатиновыми, нитратцеллслознимл я 'умаетыми мембранами для определения фосфорорганических пести-,идов и сценки общей загрязненности (токсичности) водной среды;

- исследование особенностей функционирования ферментных био-енсоров на основе БуХЭ в различных условиях и оптимизация ус-овий определения субстратов и ингибиторов и определение преде-ов их обнаругения;

- новый метод активации тионовых пестицидов с помощью элекТ7 эхимпческой окисления в присутствии галогенидов;

- определение фосфорорганических пестицидов в водных раство-эх и растительных экстрактах с помодью холинэстеразных биосен-эров на уровне установленных норм;

- сравнительные испытания холкнэстеразного биосенсора с ке->дами биотестирования для первичного контроля качества вод н ¡пользование биосексора для этой цели.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на 1учних конференциях Казанского государственного университета в 191, 1992 гг., на конференции "Концепция создания экологически стых регионов" Сг. Волгоград, 1991), на заседаниях Московского родского семинара по анализу С1990, 1992 г.), на Международ-й конференции'"Сенсор-Техно-93" СС-Петербург,1993) и Междуна-дном семинаре "Экоанализ" СС.-Петербург, 1993).

- 5 -

По теме диссертации опубликовано 3 статьи, 11 тезисов докладов к одна депонированная работа.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 93 страницах машинописного текста, содерглт 14 рисунков, 12 таблиц. Состоит из введения, двух глав, заключения и выводов, списка литературы, включающего 146 ссылки на отечественные и эарубекнне работы.

Во Ведении обоснована актуальность работы, ее новизна и практическая значимость, сформулированы цель исследования и основное задачи. В первой главе "Литературный осзср. Определение загрязнения окружающей среди с помощью ферментных методов анализа" дана характеристика обцих принципов особенностей применения ферментов для анализа объектов окрукаю^е:! среды. Рассмотрены применение ХЭ в анализе ингибиторов - (¡юсфорорганпчоских и карбамнатных пестицидов, а такг.е особенности конструирования а аналитического применения биосенсоров на основе холинэстераз :: других ферментов в экологическом мониторинге. Вторая главе "Экспериментальная часть" состоит из двух частей. В первой части представлена характеристика исходных материалов, использованных з работе, описаны методики выполненных экспериментов. Бс второй части представлены и обсул;дены результаты экспериментальных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЙ РАБОТЫ - '

Материалы ц методы исследования. Холинэстеразлые мембраны изго товляли путем кросс-сшивки бутирилхолинзетеразы из сыворотк крови лошади глутаровы.м альдегидом на носителе (желатин, кальк чертеглая, нитрат целлюлозы). Физико-химические характеристик мембран приведены в таблице 1.

Возыоглость определения малых ингибируюишх эффектов, следовательно, шшшй предел обнаружения фосфорорганически пестицидов с помоцыэ холинэстеразных биосенсоров зависит, помп мо других факторов, от величины и точности определения отклик биосенсора. Поэтому предварительно было проведено исследоьш: функционирования биосенсоров при варьировании концентрации и г фосфатного буферного раствора. Полученные характеристики бис

- 6 -

сенсоров приведены в табл.2..

Особенности поведения сенсоров с мембранами на основе различных носителей обусловлены различие): в скорости ферментативного процесса я массопереноса компонентов в мембране. Величина отклика при постоянной концентрации субстрата Св изученном диапазоне ее изменения) уменьшается в ряду гелатин > бумага > нитрат целлюлозы СНЦ). По эксплуатационным характеристикам (продолжительность использования, механическая прочность, стабильность показаний) изученные мембраны располагаются следующим образом: бумага > 11Ц > аелатин. Были такхо изучены условия опрэ-. деления субстрата в проточном режиме.

Таблица 1 •

Некоторые физико-химические характеристики холинзстеразных мембран

Параметр Материал мембраны

Желатин Бумага Нитрат целлюлозы

Удельная активность ХЭ 2.2+0.2 0.005+ 1.4+0.1

ность Е/см^ 0.001 С4.2+0.2 £/ttr)

Толщина в сухом состо- 0.018+0.002 0.045+ 0.0010+0.0005

янии, мм 0.001

Сохранение активности 35+5 0.5+0.2 7+3

при иммобилизации,'/,

Набухаемость, У. 70+3 4.0+0.5 37+3

Продолжительность хра- 2 года 1.5 года 0.5 года

нения в сухом состоянии

Константа Михазлиса Кд, 220+30 100+15 150+30

мкмоль/л С400+10)

Удельная макс, скорость 0.17+0.02 0.005+ 0.045+0.005

\ах' мкмоль/л,-с'см^ (0. 40±0.02) 0.001

Примечания, а). Субстрат бутирилхолин иодид, фосфатный буфер

0.002 моль/л + 0.1 моль/л НаС1; рН 7.8; 25°С.

б). В скобках приведены соответствующие значения для нативного

фермента.

Определение фосфороганических пестицидов с помощью холинэсте-разных'биосенсоров. Эксперимента проводили на модельных водных растворах фосфорорганических соединений - распространенных ин-сектоакарйцидов - тетраэтилмонотиопирофрсфат СТЭМТПФ), диаэинон [ 0-С 2-из опропил-4-метил-пириыядил-6)-0,О-диэтилгиофосфат1, фо-залон [0,0-диэтил-Б-(6-хлор-2-оксобензоксазолшшл-3-метил)- ди-тиофосфат], МВФ [ 0,0-диметил-О-С2,2-дихлорвинил)-фосфат].

Необратимые ингибиторы фермента определяли по степени ин-гибирования С154 - относительное снижение отклика биосенсора), которую рассчитывали по величине отклика биосенсора до и после

Таблица 2

Некоторые характеристики холшюстеразшлх потешюмотрических сенсоров с различным! типами мембран

Материал мембраны

Параметр Желатин 1 Бумага Нитрат целлюлозы

Время отклика при 12 - 15 8-10 5-7

С,- = 0.002 моль/л,мин

Величина отклика при 80 - 90 50 - 60 40 - 50

Со = 0.002 моль/л, ыВ

о Диапазон определяемых 1-10"4- 4-10'4- 3-10"4-4-10"3

концентраций субстрата 4-Ю-3 8-Ю-3 -

моль/л

Предел обнаружения. 6-Ю"3 2-10-4 8-Ю-4

моль/л

Угловой коэффициент 66+1 72±1 54+1

электродной функции,мВ Сп=18) Сп=24) Сп=15)

Погрешность определе- 7 5 5

ния С1д Сд), %

Время функционирова- 6-7 >21 >21

ния, суток

Воспроизводимость 4 3 3

отклика биосенсора, Я

Приыечадае а). Субстрат бутирилхолин иодкд, фосфатный буфер 0.002 иоль/л + 0.1 моль/л НаС1; рН 7.8; 25°С - 8 -

контакта фермента с ингибитором (стадия инкубирования).

Для определения тионовых фосфорорганических пестицидов, являющихся слабыми ингибиторами холинэстеразы, их предварительно окисляли до кислородных аналогов. Для этого была разработана процедура электрохимической "активации" пробы электролизом ее в бездиафрагменной ячейке на стеклоугл;родных электродах в присутствии хлорида или бромида калия. Результаты электрохимической "активации" полностью соответствует стандартной процедуре окисления тионовых пестицидов бромной водой. По-видимому, окисление в процесса электролиза происходит под действием электро-генерироваиных галогенов (хлора или брома). В отсутствии гало-генидов процесс протекает неэффективно: за время электролиза (5 мин.) окисляется не более 7% исходного количества пестицидов в пробе. Применение электрохимического окисления позволило исключить контакт исследователя с токсичным бромом, сократить продолжительность и уменьшить разбавление пробы в процессе пробо-подготовки.

При определении степени ингибиров; ния использовались две методики, различающиеся проведением стадии инкубирования: в методике 1 инкубирование проводили в отдельном сосуде, после чего биосенсор ополаскивали и переносили в рабочую ячейку, куда затем вносили субстрат. При этом условия инкубирования (рН, соловой состав) могли отличаться от услоелй измерения отклика. По методике 2 ингибитор добавляли непосредственно в рабочую ячейку, содержащую фосфатный буфер,' и через 5 мин. в нее г.е вводили субстрат. Методика 2 упрощает процедуру измерения и сокращает общую продолжительность анализа, однако накладывает определенные' ограничения, связанные со стабильностью ингибитора в щелочном растворе. Результаты определения фосфороргаиических соединений по методикам 1 и 2 приведены в табл.3.

Самым широким диапазоном линейности и наименьшей нишей границей определяемых содержаний ингибиторов характеризуются бносенсоры с мембранами на основе нитрата целлюлозы. При применении желатина в качестве материала мембраны высокая активность иммобилизованной ХЭ приводит к снижению ее чувствительности к действию ингибитора: внутри мембраны активные центры фермента не насыщены ингибитором и компенсируют спад активности

- 9 -

поверхностных слоев мембраны. В случае бумажной мембраны пониженная чувствительность к действию фосфорорганических пестицидов по сравнению с нитратцеллюлозной мембраной может быть связана с ограниченной пространственной доступностью активного центра фермента, Кроме того, при использовании нитрата целлюлозы можно ожидать адсорбции на поверхности мембраны гидрофобных молекул ингибиторов, что также будет способствовать снижению нижней границы определяемых содержаний. В случае присутствия в модельной смеси нескольких пестицидов наблюдаемая степень инги-бирования представляет собой сушу соответствующих значений, полученных для растворов отдельных ингибиторов, что было установлено для системы диазинон-тетраэтилыонотиопирофосфат.

Для всех изученных пестицидов наблюдается корреляция мзвду

Таблица 3

Аналитические характеристики биосенсоров с различными мембранами для определения фосфорорганических пестицидов Сп=5.Р=0. 95?

Материал 1% = а + Ь-1д[ I) Диапазон■определяемых

Пестицид мембраны а Ь г2 концентраций, мг/л

м е т о дик а 1

Диазинон бумага 103 30 0.98 3-Ю"3 - 2-Ю"1

Диазинон желатин 123 34 0.97 3-10Г3 - 2-10"1

Диазинон НЦ 138 42 0.98 2-Ю"3 - 1-Ю"1

Фозалон бумага 73 22 0.93 1-Ю-3 - 4-10"1 - '

Фозалон желатин 138 39 0.96 4-Ю"3 - 4-Ю"1

Фозалон НЦ 205 52 0.98 4-10"3 - 7-10"2

МВФ бумага 35 19 0.96 5 10"1 - 5.0

МВФ желатин 67 28 0.97 2-Ю"1 -1.0

МВФ НЦ 156 58 0.94 1-Ю"1 - 2.0

ТЭМТПФ НЦ 162 37 0.98 6-10"5 - МО"3

м е толика 2

Диазинон бумага 126 38 0.98 6-Ю"3 - 3-Ю"1

Фозалон бумага 126 56 0.98 МО"2 - 2-Ю"1

МВФ бумага 44 19 0.97 9-Ю"1 - 4.5

ТЭМТПФ бумага 143 40 0.98 4-Ю"4 - 2-Ю"3

Примечание: Погрешности определения а не более 6 а, Ь - не более 5 У.

еличиной угла наклона прямых 1'/, - 1дШ, полученных. для одного того же пестицида на разных мембранах, и нижней границей оп-еделяемых содержаний пестицида. Угол наклона зависит также от родолжительности инкубирования. Поэто>лу при применении методи-и 2 он несколько больше, чем при работе по методике 1 Свремя нкубирования S и 10 мин. соответственно). Это несколько сужает иапаэон определяемых концентраций . Для методики 2, кроне тоо, несколько выше нижние границы определяемых содержаний, месте с тем, общая продолжительность определения по методике 2 е превышает 10-12 мин. , тогда как по методике 1 за счет необ-однмости предварительного кондиционирования электрода в рабо-эй ячейке и за счет увеличения продолжительности стадии ишсу-ировакия весь цикл измерения составляет 20-25 мин.

По особенностям эксплуатации и чувствительности к действию нгибиторов на основе представленных данных можно сделать сле-усаие рекомендации к применению мембран для решения конкретных адач контроля объектов окружаюцей среды:

1. Для анализа природных вод наиболее подходят нитратцел-олозные мембраны, отличающиеся быстрый откликом и высокой увствительностью к действию пестицидов. Их использование оканчивается относительной трудоемкостью изготовления и необходи-зстью формирования мембраны непосредственно на поверхности аектрода.

2. Желатиновые мембраны отличаются наибольшим сроком хра-эния, однако обладают низкой механической прочностью, что лидирует продолжительность эксплуатации биосенсора. По чувстви-эльности к действию ингибиторов они незначительно уступают гсратцеллюлозным мембранам. Желатиновые мембраны, по-видимому, эжно рекомендовать к использованию для систем экспресс-контро-i аварийных ситуаций или в составе тестов для передвижных ла-зраторий, где необходим длительный срок хранения используемых )епаратов, в том числе и в неблагоприятных условиях:" Желатино-ie мембраны имеют минимальную себестоимость изготовления.

3. Бумажные мембраны менее чувствительны к действию инги-1торов по сравнению с другими типами мембран. Вместе с тем, га отличаются высокой механической прочностью и требуют ыини-шьных навыков для применения," поскольку легко крепятся к

- И -

электроду, не набухают и практически не меняют отклика в про цессе эксплуатации. Поэтому бумагнне мембраны могут применятье, для диагностики аварийных уровней загрязнения, а также при ана лиэе вод и растительных образцов с дополнительной пробоподго товкой (экстракция).

Определение пестицидов в растительном материале.

Для оценки возможного воздействия компонентов растительно матрицы на поведение холинэстеразных биосенсоров по методике были изучены модельные растворы , содержащие соли щелочных щелочно - земельных металлов, крахмал, а также этиловый спир или ацетон - растворители-экстрагенты для фосфорорганически пестицидов. Было показано, что биосенсоры имеют достаточно ста бильные характеристики, постоянные в следующих диапазонах кон центраций указанных соединений: калий и магний - до 20 г/л кальций - до 2 г/л, крахмал - до 1 г/л, альбумин - до 10 мг/л В присутствии более чем 5 г/л крахмала продолжительность фунци онирования биосенсора после однократного.применения крахмал сокращается до 2-3 дней. По-видимому, это связано с осаждение частиц крахмала и, возможно, олигомерных продуктов его частич ного гидролиза в порах мембраны и стерическим блокированием ак тивных центров фермента. Кроме того, было установлено, что вве дение до 10 об. % этанола или ацетона не оказывает существенно! влияния на активность иммобилизованной ХЭ. Однако для нитрат целлюлозных мембран присутствие более чем 5 об, у. ацетона привс дит к сокращению срока службы мембраны до 1-2 дней, по-видимс му, вследствие набухания мембраны и последующего вымывания фер мента в раствор. Кроме того, для учета возможного влияния бис генных аминов - обратимых ингибиторов ХЭ - было проведено исс ледование влияния продолжительности экстракции пшеницы и смес высушенных зеленых кормов водно-ацетоновым раствором на отт холинэстеразного сенсора. Было показано, что влияние природнь ингибиторов проявляется при продолжительности экстракции боле 20 мин. При продолжительности экстракции 5 и 10 мин. величш отклика существенно не изменяется.

Построение градуировочных зависимостей определения ТЭМТ1 и диазин'она в комбикорме С методика 1), полученных при испол!

- 12 -

>вашш оптимальной процедуры экстракции зараженных образцов мбнкорма, показало, что водно-ацетоновая смесь позволяет изв-¡чь не более 70% пестицида при продолжительности экстракции 10 гн., причем дальнейшее увеличение продолжительности экстракции ! влияет на эту величину. Угол наклона соответствующих зависимей в координатах IX - Igt 13 С26 для диазинона и 28 для тет-зтилмонотиопирофосфата) несколько ниже найденного для модель-х водных растворов. Применение бумажных мембран и методики 2 случае ТЭМТПФ позволило существенно сократить продол:штель-сть эксперимента, однако нижняя граница определяемых содержа-й при этом возросла с 1-10"^ до 2-Ю-1 мг/кг.

ределенке качества природных и сточных вод. Для изучения воз-жностц применения холинзстераэных биосенсоров для оценки об-й загрязненности Стоксичности) природных и сточных вод на мольных водных растворах были проведены сравнительные испытания «более чувствительных биосенсоров Снитратцеллюлозная мембрана стандартном рН-метрическом электроде) и метода, основанного измерении замедленной флуоресценции хлорофилла Chlorella Igaris Beyer. Результаты испытаний приведены,в таблице 4. Как ?дует из полученных данных, холпнэстераэный биосенсор имеет ■<ствителыюсть к токсикантам, сопоставимую с результатами би-гстирования. Причем, помимо веществ антихолинэстеразного )ствня (фосфорорганические соединения, ионы тяжелых нетал-з), отклик биосенсора снижается в присутствии геществ, не об-1ающих антнхолинэстеразной активностью Сдильдрин, нитрофе-i), что, вероятно, связано со стерическш блокированием ак-(ного центра фермента и позволяет использовать датчик как ин-:атор общей загрязненности (токсичности) вод. Результаты по-щх испытаний в Волго-Ахтубинской пойме летом 1991 г. поладили корреляцию между показаниями обоих методов, а также •том качества вод по трофической активности Dafnia magna.

В табл.5 приведены результаты тестирования сточных вод в остях сезонного регулирования Астраханского гаэоперерабаты-щего завода (проба 1 - в месте сброса сточных вод, проба 2 -словно чистом месте водоема). Как следует из приведенных ных, острая токсичность вод по отношению к тест-объекту сни-

- 13 -

Таблица 4

Результаты сравнительных испытаний тестирования токсикантов с помощью холинэстеразного биосенсора и по методу замедленной флуоресценции микроводорослей Сп=3, Р=0.95)

Ингиби- ПДК, II]. Ингибирование тест-реакции. Г/.

тор мг/л ед.ПДК ЗФ хлореллы Биосенсор

Ртуть 1-Ю"5 1 0 0

(2+) 5 21 0

10 29 7

100 43 10

Медь l-10"d 1 0 5

С 2+) 5 23 28

10 30 34

100 47 ' 42

Фозалон 1'10"а 0.1 39 14

1 48 23

5 51 30

10 62 35

Хлорофос 5-10"а 0.1 15 14

1 34 18

5 54 26

10 67 39

Дильдрин 1-Ю"8 0.1 6 5

1 3 10

5 2 10

10 0 10

2,4-ди- 3-10~а 0.1 10 26

нитрофе- 1 33 41

нол 5 51 50

10 56 56

Примечание, а) ЗФ - замедленная флуоресценция хлорофилла хло реллы; б) инкубирование: хлорелла - 24 часа, ХЭ - 10 мин. изме рение отклика холинэстеразного биосенсора: 0.002 М. фосфатны буфер, содержащий 0.1 моль/л NaCl, pH 6.86 , 37°С, бутирилхоли: иодид 0.002 моль/л (методика 1, нитратцеллюлозная мембрана);

- 14 -

мается при одних и тех же разбавлениях вод, что позволяет рекомендовать холинэстеразный биосенсор для предварительного экспресс-контроля качества очистки сточных вод некоторых производств. Таюг.е с помощью холинзетеразпого биосс-нсора провели тестирование технологических и промывных вод процесса алкилиро-вания солей нитрозогидроксиламина С НПО ни.Ленина, г.Казань). По химическому составу телеологические води ькломали на 1000 г воды 235 г тринатрайфосфата, 1300 г сульфата натрии, 1200 г м->-тялсульфоката натрия, метанол и яобольашо- к.<л:г;сотва исходного препарата и продукта. Все присутствовавшие в прсблх езоторгани-ческие соединения обладягл* слабой с-цтлхолиазст&рауиол активность». Кроме того, сбрат/мым инглбзтором ХЭ является метанол. Полученное значения степ:нл ингкбирсьаиия (Iii) приведены в табл.5. Увеличение наклона зависимости 1?; -lgCl/V) при переходе от технологических к про.'олшш водам ооьясалетсл огавтяым действием метилового спирта - обратимого ингибитора ХЗ - в отнесении необратимых ингибиторов. Снятие холипзстеразной токсичности достигается при разбавлении промывных вод в 200 раз, а

Таблица 5

Тестирование вод емкости сезонного регулирования

Астраханского газоконденсатного завода Сп=3, Р=0. 93)

Ii пробы Разбавление тест-обгектСотносительное изменение,'О

ХЭ Daphnia М. ЗФ Ch. vulgaris

1 неразбавл. -16.5 -27 148

1:1 -9 -14 81

1:5 -5.5 8 52

1:10 2 8 52

2 неразбавл. -8 -9 82

1: 1 5 0 28

1:5 7 0 28

1:10 2 0 | 27

Примечания, а) ХЭ - холинэстеразный биосенсор (нитратцеллюлоз-ная мембрана, методика 1, инкубирование 10 мин.), Daphnia М. -трофическая активность, экспозиция 1 час., ЗФ Ch. vulgaris - замедленная флуоресценция, экспозиция 24 часа, б) Положительные значения отвечают стимулированию активности, отрицательные -ингибирсванию тест-функции объекта по Отношению к контролю.

- 13 -

Таблица О

Результаты тестирования промывных (1) и технологических (2) вод процесса алкилирования солей нитрозогидроксила-мииа с помощью холинэстеразного сенсора Снитратцеллюлозная мембрана, методика 1, п=5, р=0.95)

Разбавление 1% С1) Разбавление Г/. (2)

1:10 72 1:200 60

1:20 54 1:500 48

1:50 32 1:1000 33

1:100 12 1:2000 31

1:200 <4 1:5000 14

технологических - в 10000 раз. Это позволяет отнести их к высокотоксичным водам . 96-часовой -дафниевый тест на острую токсичность подтвердил данные выводы: во всех пробах была зафиксирована 100% смертность особей.

Зависимости величины 1% от степени разбавления 1/У описываются следующими регрессионным! уравнениями:

технологические воды: 1% = 134 + 32.31д(1/\0, г=0.937 промывные воды: 1'А = 132 + 59.51дС1/\0, г=0.999

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы изготовления холинэстеразных мембран на основе желатина, нитрата целлюлозы и бумаги и потенциометри-ческие биосенсоры на их основе. Показано, что характеристики отклика биосенсоров определяются не только активностью иммобилизованного фермента, но и условиями массопереноса компонентов реакции в ферментсодержащей мембране.

2. Изучены условия функционирования разработанных холинэстеразных мембран в составе биосенсоров в зависимости от состава реакционной среды и температуры в стационарном и проточном режимах. Определены оптимальные условия эксплуатации и оценены области применения различных ферментсодержащих мембран и биосенсоров на их основе.

!. Разработан новый электрохимический метод профподготовки образцов, содержащих тноновке фосфорорганические пестициды, основанный на их окислении до более токсичных кислородных аналогов в процессе электролиза в присутствии хлоридов или бромидов калия, натрия. Показано, что окисление осуществляется электрогенерпрованнкми бромом или хлором и в отсутствии добавок галогенидов неэффективно.

. На модельных водных растворах ряда фосфорорганических пестицидов - необратимых ингибиторов холинэстеразы - показана еоэ-моаюсть детектирования их присутствия на уроьпо 1-5 ПЛИ. Определена зависимость аналитических характеристик биосенсоров от материала мембраны и условий эксперимента.

. Разработана методика экспресс-диагностики присутствия остаточных' количеств фосфорганических пестицидов в растительном материале Скомбикорма), включающая экстракцию пестицида и последующий анализ без удаления экстрагента. Исследовано влияние компонентов растительной матрицы (полисахариды, белки, щелочные и цепочно-земельные металлы, природные ингибиторы холинэстеразы) на продолжительность функционирования биосенсора и его чувствительность. Найдены оптимальные условия про-боподготовки растительного образца и последующего анализа.

На основе сравнительных испытаний холинэстеразного биосенсора и метода замедленной флуоресценции хлорофилла микроводорослей как средства биотестирования качества вод показано, что оценка ингибирования иммобилизованной холинэстеразы позволяет существенно повысить экспрессность диагностики токсических свойств водной среды при незначительном повышении порога обнаружения токсикантов.

В результате полевых испытаний в Волго-Ахтубинской пойме и на сточных водах ряда химических производств показана корреляция результатов тестирования с помощью холинэстеразного биосенсора с общей загрязненностью (токсичностью) вод.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях: Евтюгин Г. А., Искандеров Р. Р., Гольфрид В. У.. Потенциометри-

ческий ферментный электрод в анализе объектов окружающей среды.// Конф. молодых ученых МГУ С январь 1930): 'Геэ.дикл. -М. . 1990,- С. 64.

2. Евтюгин Г.А., Искандеров P.P., Гольфрид В.У. Использование процессов ферментативного катализа для высокочувствительного

• определения ингибиторов. // VI Всесоюзная конф. молодых ученых "по Физической химии (июнь 1990): Тез. докл. - М. ,НйИТЭ};ИМ: 1990,- Т. 1,- С. 197.

3. Евтюгин Г.А., Искандеров P.P., Латыпова В.З. и др. Использование холинэстеразиого датчика в контроле токсичности объектов окружающей среды. //"Экологические проблемы фармакологии и токсикологии" (сентябрь 1990): Тез. докл.- Казань, 1900.-С. 23.

4. Евтвлш Г.А., Искандеров P.P., Латыпова В.З. п др. Оценка загрязнения объектов окружав*,ой среды тяжелыми металлами с помощью иммобилизованной холппестеразн. //"Химические и биологические методы в охране окру.тавщей среды от загрязнения тяжелыми металлами" (сентябрь 1990): Тез.докл.- Усть-Каменогорск-Москва, Изд-во ВНИИСЭПТИ: 1990,- С. 44.

5. Соколова С. А. , Евтюгин Г. А., Искандеров P.P. и др. Тестирование качества вод с помощью иммобилизованной холинэстеразы. / Влияние антропогенного фактора на экосистему озер. Сб. научи. трудов ГосНИОРХ. - Л., Изд-во ГосНИОРХ: 1991,- Вал. 313.-С. 122-136.

6. Евтюгин Г. А.', Искандеров Р. Р. , Никольская Е. Б. и др. Экспресс-определение пестицидов в объектах окружающей соедн. /> "Концепция создания экологически чистых регионов1' (ма! 1991): Тез.докл. - Волгоград, 1991,- С. 107.

7. Соколова С.А., Евтюгин Г.А., Искандеров P.P. и др. Биотестирование природных вод Волго-Ахтубинской пойми, сточных во; Астраханского газоконденсатного комплекса. //"Концепция создания экологически чистых регионов" (май 1991): Тез.докл. ■ Волгоград, 1991.- С. 204.

8. Евтюгин Г.А., Искандеров P.P., Латыпова В.З. и др. Экспрес< -оценка качества вод с помощью иммобилизованной холинэстеразы. / В сб.: Эколого-токсикологическая характеристика г.Ка зани и пригородной зоны,- Казань, Изд-во КГУ: 1991. ■ С. 126-130.

9. Евтюгин Г. А., Искандеров Р. Р. , Латыпова В. 3. Бнотестировани* природных и сточных вод: экспрессный датчик для экологичес кого мониторинга. // Казанский медицинский журнал.- 1992. Т. 73.- N4.- С. 310-314.

10. Евтюгин Г. А., Искандеров Р. Р. , Латьшова В.З. . Никольска Е.Б. Экспресс-оценка загрязненности природных и произволе твенных вод с помощью биохимических диагностикумов и биосен соров. // "Загрязнение окружающей среды. -Проблемы токсиколо гии и эпидемиологии": Тез.докл.межд.конф. - М. -Пермь, 1993. С. 43-44.

11. Никольская Е. Б. , Евтюгин Г. А., Искандеров P.P. и др. Нал равленное изменение избирательности и чувствительности био сенсоров для решения конкретных аналитических задач. //"Сен сор-Техно-93": Тез.докл. межд.конф.- С.-Петербург, 1993. С. 281-282.

2. Никольская Е. Б. , Евтюгин Г.А., Искандеров Р.Р. и др. Определение присутствия фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах с помощью сенсорных устройств на основе холи-нэстераэы. //"Сенсор-Техно-93Тез. докл. межд. конф. - С. "Петербург. 1993,- С. 278.

3. Nikolskaya Е. В., Evtugyn G. А., Iskanderov R. R. , Lalypova V.Z., Enzymatic Potentiometrie sensors for water control.// "Sensor-Techno-93 ". - Proceedings abstracts,- St.Peterburg.-1993. - P. 68.

4. Евтюгин Г, А., Искандеров P.P., Латшюва В.З. и др. Определение эфнров холина в потоке с помощью холинэсторазного потен-циометрического сенсора. / Рук. деп. ОНИИТЭхим. г. Черкассы 12.02.93. - N26-xn 93. - 11 с.

3. Никольская Е. Б. , Евтюгин Г. А. , Искандеров Р. Р. Биотестирование остаточных количеств пестицидов в объектах окружающей среды. //"Организация аналитических слухб экологического контроля и современные методы экоанализа": Тез.докл. - С.-Петербург, 1993. - С. 18-19.

Соискатель

7

таз 5

Тирах 00 экз.

Офсетная лаборатория КГТУ 420015, Казань, К.Маркса, 68