Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прикрепление Agrobacterium radiobacter 5D-1 на корнях однодольных растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Прикрепление Agrobacterium radiobacter 5D-1 на корнях однодольных растений"

На правах рукописи

егС '•'" О г^

и,;

из и-

Соловова

Галина Константиновна

Прикрепление гоЬаМегшт гасИоЬасХсг 5Б-1 на корнях однодольных растений

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН г. Саратов).

Научные руководители:

доктор биологических наук, доцент В.И.Панасенко,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.И.Чумаков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор C.B. Каменева доктор медицинских наук, старший научный сотрудник И.А.Дятлов

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова (г.Москва, Ленинские горы, МГУ)

Защита состоится " 19 ' декабря 1996г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"(410005, г. СаратоЕ, ул.Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб'\

Автореферат разослан 15 ноября 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.А.Корнеев.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Особое место в повышении урожайности сельскохозяй-:твенных культур принадлежит выяснению взаимоотношений между микроорганизмами почвы и растениями, направленному управлению ими.

Адгезия микроорганизмов представляется важным этапом в жизнедеятельности микроорганизмов. Она экологически оправдана - адгезия помогает микробам удержаться в почвенном профиле и не подвергаться вымыванию в нижележащие горизонты, адгезированные клетки оказываются на границе раздела твердого тела и жидкости, где сосредоточены основные питательные вещества.

Доказана роль адгезии и прикрепления для симбиотических и паразитических ззаимоотношений. Внимание к вопросу об адгезии микроорганизмов было при-злечено и в связи с тем, что стало ясно, что адгезия является одним из начальных этапов многих инфекционных болезней, и если предотвратить адгезию, то можно предотвратить и возникновение заболевания. Наиболее изученной является адгезия оизобий на корневых волосках бобовых растений и патогенных агробактерий к по-зерхности двудольных растений, отчасти изучена адгезия у азоспирилл и фитопато-"енных микроорганизмов.

Механизм прикрепления агробактерий к поверхности клеток однодольных эастений, в частности злаков, мало изучен. Долгое время существовала точка зре--(ия, что агробактерии не способны к успешному взаимодействию с поверхностью эднодольных растений, поскольку на их поверхности отсутствуют соответствующие эецепторы. Однако в литературе описаны случаи прикрепления агробактерий к поверхности однодольного растения. Ряд авторов полагают, что агробактерии спо-:обны прикрепляться к клеткам однодольного растения, хотя и в ограниченном ко-тичестве (Draper, et а!., 1983. Graves et а!., 1988) .

В настоящее время опубликовано много данных, касающихся проблем взаимо-этношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. Однако, до сих пор эстаются невыясненными механизмы таких взаимоотношений, представляющие эольшой интерес, как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.

Ощущается необходимость расширения круга объектов для изучения ассоциативного взаимодействия. Изучая свойства штамма Agrobacterium radiobacter 5D-1, выделенного из корней пшеницы М.И.Чумаковым (ИБФРМ, РАН), нами установлено положительное влияние штамма на содержание азота и веса надземной части 1шеницы. Обнаружена высокая активность продукции фитогормона ИУК, способность к продукции цитокининов. Мы пришли к выводу, что штамм A.radiobacter 5D-1 является удобной моделью для изучения процесса ассоциативного взаимодействия.

Настоящая работа посвящена исследованию процесса прикрепления Agrobacterium radiobacter 5D-1 на корнях однодольных растений.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось изучение условий и молекулярных механизмов взаимодействия клеток ^.radiobacter 5D-1 с корневой поверхностью злаков. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод определения количества прикрепившихся бактерий к корням эднодольных растений. Определить оптимальные условия прикрепления агробакте-эий к поверхности растительных клеток.

Определить способность непатогенных агробактерий прикрепляться к корням зднодольных растений и сравнить временную динамику прикрепления непатогенных уробактерий к корням однодольных растений с динамикой прикрепления патогенных агробактерий к поверхности двудольных растений.

. Изучить колонизацию поверхности различных сортов пшеницы и риса агробакте-иями.

4. Определить способность АгасИоЬа^вг 5Б-1 конкурировать за места прикрепления с патогенами и ингибировать опухолеобразование.

5. Оценить роль липополисахаридов и поверхностных белков непатогенных агробактерий в процессе прикрепления их к поверхности растительной ткани.

6. Изучить участие жгутиков и целлюлозных фибрилл в процессе прикрепления А.гасЛоЬаМег 50-1 к корням пшеницы.

7. Исследовать прикрепление к корням пшеницы транспозонных мутантов, дефектных по подвижности и продукции поверхностных полисахаридов.

Научная новизна работы. Впервые на пшенице показано сходство и различие молекулярных механизмов прикрепления патогенных и непатогенных агро-бактерий к поверхности однодольных растений.

Установлено, что временная динамика прикрепления непатогенных агробактерий к корням однодольных растений носит сходный характер с динамикой прикрепления патогенных агробактерий к поверхности клеток двудольного растения.

Установлено, что агробактерии прикрепляются с одинаковой активностью к различным сортам пшеницы и риса.

Впервые документально установлено, что непатогенные агробактерии способны прикрепляться к корням однодольных растений с образованием специальных структур, аналогичных структурам, которые образуются при взаимодействии ризобий с бобовыми и патогенных агробактерий с двудольными растениями.

Показано, что в прикреплении непатогенных агробактерий к корням пшеницы принимают участие бактериальные и растительные белки.

Впервые показано участие жгутиков агробактерий в прикреплении к корням пшеницы.

Экспериментально доказано, что в состав фибриллоподобных структур у непатогенных агробактерий входят вещества полисахаридной природы.

Практическая значимость. Изучение взаимоотношений растений и микроорганизмов представляет интерес в теоретическом и в практическом аспектах, поскольку выяснение механизма взаимодействия растений и микроорганизмов дает ключ к увеличению урожая, за счет повышения эффективности минерального питания и уменьшения потерь от болезней, вызванных фитопатогенами. В часности, доказана возможность предотвращения опухолей на томатах и подсолнечнике, вызванных патогенными агробактериями.

Изучение ранних этапов адсорбции и прикрепления агробактерий к поверхности корня растений позволяет' лучше понять механизм колонизации корней растений и последующую инфекцию.

Полученные результаты позволяют распространять подходы по трансформации, отработанные на двудольных, на однодольные растения.

Разработанный метод определения количества прикрепившихся бактерий использовался в НИР лаборатории физиологии растений НИИСХ Юго-Востока; при проведении полевых экспериментов в Поволжском научно-исследовательском институте животноводства и биотехнологии (программа по получению экологически чистой продукции) и при проведении НИР в лаборатории физической химии клеточных структур (ЛШХКС) ИБФРМ РАН по теме "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" ДО гос. регистрации 01890017743).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработка метода определения количества прикрепившихся бактерий к корням однодольных растений.

2. Определение способности непатогенных агробактерий прикрепляться к корням однодольных растений и ингибировать опухолеобразование у двудольных растений.

3. Определение роли бактериальных полисахаридов, липополисахаридов и по-¡ерхностных белков в процессе прикрепления непатогенных агробактерий к по-¡ерхности корней злаков.

4. Установление участия бактериальных жгутиков и фибрилл в процессе при-срепления Aradiobacter 5D-1 к корням пшеницы.

5. Изучение сортовой вариабельности при колонизации корней пшеницы и риса уробактериями.

Работа выполнена в группе почвенной микробиологии и биологического азо-а лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в соответствии с планом НИР по теме: "Выделение новых форм бактерий, ассоциированных со злаками и 1зучение генетических основ их взаимодействия со злаками".

Данное исследование поддержано частично Российским фондом Фундаменталь-<ых исследований (грант 94-04-13373, 96-04-50697) и Российским Министерством <ауки и технической политики (грант "Ассоциативные бактерии").

Апробация работы. Основные результаты и положения работы были пред-:тавлены на: Всесоюзной научной конференции "Микробиология в сельском хо-¡яйстве" (Пущино, Россия, 1992); VIII Восточно-европейском симпозиуме по биоло-ической азотфиксации "Nitrogenf¡x-92" (Саратов, Россия, 1992); VI Международном :импозиуме по Биологической азотфиксации у небобовых (Исмаилия, Египет, 1993); 1ервом Международном конгрессе по полисахаридной инженерии (Трондхейм, Норвегия, 1994); Первой Европейской конференции по азотфиксации (Сегед, Зенгрия, 1994); Рабочем совещании "Азоспирияла V и близкородственные микроор-анизмы" НАТО (Шарвар, Венгрия, 1994); 9 Баховском коллоквиуме по азотфикса-<ии (Москва, Россия, 1995); X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Тетербург, Россия, 1995); Международном Рабочем совещании по ассоциативному ¡заимодействию азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов, Россия, 1995); Международной конференции, посвященной памяти ак. Баева A.A. (Москва, Россия, I996); VIII Международном конгрессе по молекулярному взаимодействию растений i микроорганизмов (Ноксивил, США, 1996); Второй Европейской конференции по !зотфиксации (Познань, Польша, 1996); VII Международном симпозиуме по азотфиксации небобовых (Фейсалабад, Пакистан, 1996) и на отчетных конференциях 1БФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ в отечественной и ¡арубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, ¡ключающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, из-тожения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 96 страницах, иллю-:трированна 12 рисунками и содержит 17 таблиц. Список использованных литера-урных источников включает 96 наименований, в том числе 80 зарубежных.

Краткое содержание работы

Литературный обзор представлен в первой главе, где обсуждены проблемы 1рикрепления агробактерий и ризобий к поверхности растений. Рассмотрено счастие полисахаридов и белков бактериальной поверхности, а также жгутиков и фимбрий в прикреплении к растительной клетке. Обсуждена возможность прикреп-1ения агробактерий и ризобий к поверхности клеток однодольных растений.

Материалы и методы

Штаммы : использовали штамм Agrobacterium radiobacter 5D-1 выделен, идентифицирован и охарактеризован М.И.Чумаковым (ИБФРМ, РАН). Мутанты Agrobacterium radiobacter 5D-1 (226, 227, 228, 5005) получены М.И.Чумаковым, мутанты Agrobacterium radiobacter 5D-1 ( 195, 207, 362) получены Беликовым В.А. (ИБФРМ, РАН). Штамм Escherichia co/i S 17-1, несущий плазмиду pSUP5011 с транспозоном Tn5-mob, получен нами от Dr. Simon (Германия). Штамм Escherichia co/i С-600 получен от Злотникова К.М (Россия). Штаммы Agrobacterium rhizogenes LMG 140, LMG 150, Agrobacterium tumefaciens LMG 187 представлены в наше распоряжение De Ley (Бельгия),

Агробактерии выращивали на установке для культивирования микроорганизмов УВМТ-12-250 в течение 18 часов при 30° С в жидкой среде 16 следующего состава (г/л): глюкоза — 10; дрожжевой экстракт - 10; (NH4)2S04-1; К2НР04 - 0,25, водопроводная вода — до 1 л (рН 7,0); Azospirillum brasilense (г/л): яблочная кислота — 5; К2НР04 - 0,4; КН2Р04 - 0,4; NaCI -0,1; NaOH - 4,8; MgS04 - 0,2; MnS04 - 0,01; FeS04x7H20-NTA - 0,02; дрожжевой экстракт - 0,02; Na2Mo04 - 0,02; CaCI2 -0,02; культуры £.co/i C600, Ecoli S17-1 — на среде LB (г/л): триптон — 10, дрожжевой экстракт — 5, NaCI — 5. Выращенные клетки дважды отмывали центрифугированием в течение 15 минут в фосфатном буфере рН 7,0 и доводили оптическую плотность суспензии до требуемой концентрации-

Растения: использовали пшеницу вида Triticum aestivum L. Сорта: Саратовская 29, Саратовская 55, Саратовская 210; подсолнечник (сорт Степной), сорго ( сорт Саратовское сахарное), кукуруза (сорт Коллективный 147), томаты (сорт Факел). Сорта культур получены из НПО " Элита Поволжья"(Саратов). Сорта риса: Taipei 309, Nipponbare, 1R36, 1R54, Lemont получены от Dr. G.S.Khush (Филиппины).

При стерилизации зерен пшеницы зерновки обрабатывали 5 минут в 0,02% водном растворе КМп04 , затем дважды отмывали стерильной водой. После этого погружали в 96% этиловый спирт и снова дважды отмывали в стерильной воде. Далее зерновки на 20 мин. помещали в 4% раствор Са(0С1)2 вновь отмывали в стерильной дистиллированной воде.

Радиоизотопный метод: использовали для определения количества прикрепившихся клеток к корням пшеницы. К 5 мл суспензии бактериальных клеток заданной концентрации добавляли 30 мкл меченого препарата 14С-глюкозы активностью — 10 МБк./мл. Суспензию инкубировали в течении 2 часов при 30° С. Затем клетки осаждали при 5000 g в течении 20 мин и ресуспендировали в фосфатном буфере до оптической плотности 0,1 при 600 нм в сантиметровых кюветах. 100 мг корней помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. К навеске корней вносили 3 мл суспензии бактерий и инкубировали в течении 120 мин. При снятии динамики процесса прикрепления Aradiobacter 5D-1 к корням пшеницы время инкубации варьировали от 5 сек до 120 мин. После инкубации корни пшеницы помещали на фильтровальную бумагу в воронку и отмывали 10-кратным объемом фосфатного буфера рН 7,0. Отмытые корни высушивали при 100°С в течении 2 часов и помещали во флаконы с 3 мл раствора сцинтиллятора следующего состава: толуол (Реахим, Россия)- 750 мл, тритон Х-100 (Serva)-250 мл; РРО (Sigma)- 3 г/л, РОРОР (Sigma)-0,75 г/л. Радиоактивность образца измеряли на счетчике RacBeta 1211/1212 (LKB, Wallac, Швеция).

Предобработка бактериальных клеток и корней пшеницы: для предобработки суспензии бактериальных клеток использовали следующие вещества: трипсин (Reanal) — 1 мг/мл; N-ацетил-О-глюкозамин (Serva)— 50 мМ; целлюлаза (из Trichoderma viridae, Boehringer Manheim) - 1,7 мг/мл; ЭДТА - 10 мМ; ЭГТА - 10 мМ; CaCI2- от 1.4 до 14 мМ.

Бактериальную суспензию инкубировали в течение 15 минут, затем центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут и ресуспендировали в фосфатном буфере рН ',0. Для обработки корней (100 мг) использовали трипсин в концентрации 1 мг/мл 1 1% глутаровый альдегид (Serva). Экстракт липополисахарид-белкового комплекса ЛПС) из внешней мембраны Aradiobacter 5D-1 был нам любезно предоставлен :отрудником лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН Ма-ора Л.Ю. Корни инкубировали в 3 мл фосфатного буфера с соответствующими >еществами в течение 15 минут, после чего отмывали фосфатным буфером.

Сканирующая и трансмиссионная микроскопия: для изучения взаимодействия >актериальных клеток с корнями растений использовали корешки в зоне корневых юлосков. Материал фиксировали в растворе глутарового альдегида в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 один час в 2,5% -ном растворе ; препараты обезвоживали в ерии растворов ацетона с последовательно возрастающими концентрациями ( 50% - 25 мин, 70% - 20 мин, 90 % - от 1 до 12 часов, 95% -от 25 мин до 4 часов, 00% — от 30 мин до 2 часов) при комнатной температуре /Уикли, 1975/. Сушку репаратов проводили на установке фирмы "Hitachi НСР-2" Высушенные и прикреп-енные клеем к объектному столику отрезки корней напыляли золотом и палладием напылителе "JFC-1100, JEOL, Japan". Просмотр препаратов проводили на элек-ронном сканирующем микроскопе "JSM-T100, JEOL, Japan " при ускоряющем наряжении 15 и 25 кВ. Для трансмиссионной (просвечивающей) микроскопии (ТМ) Iradiobacter 5D-1 выращивали на среде TSA в течении 24 часов при 30° С, фикси-овали с помощью осьмиевой кислоты и затем анализировали в просвечивающем лектронном микроскопе BS-500 (TESLA, CSFP) при ускоряющем напряжении 60 В. Подготовка и съемка образцов проводилась при участия Ю.В. Кривопалова 4БФРМ РАН).

Измерение концентрации клеток: измерение концентрации клеток в среде выра-(ивания проводили методом спектротурбидиметрии и методом предельных разве-ений. При измерении методом спектротурбидиметрии показания оптической плот-ости снимали на длинах волн 400, 450, 500, 550, 600 нМ на спектрофотометре Specord М 40" (Germany) против контроля в качестве которого использовали среду ыращивания. Расчет проводили по программе разработанной Н.Г.Хлебцовым и .Ю.Щеголевым (ИБФРМ АН СССР, Саратов, 1986).

Определение конкурентоспособности: растения инокулировали в ранки стебля 20 кл бактериальной суспензии при концентрации 14x10® клеток. При совместном несении Aradiobacter 5D-1 и Atumefaciens LMG187 культуры брали в соотноше-ии 10:1. При последовательном внесении, A.tumefac¡ens LMG187 вносили через дки после инокуляции Aradiobacter 5D-1. Для анализа брали вес стебля с опу-элью длинной 2 см (подсолнечник) и 2.5 см (томаты). Все опыты проводились не енее чем в 5 повторностях. Результаты подвергались статистической обработке на ВМ с помощью специальной программы.

Полученные результаты и их обсуждение

С- 20

к 5 и х

^ о 15 Эх*

со X и

| | n. 10

К 5 §

I X 5

о с; I

0

С

А

Л

50

100

150

200

Вес корней (мг)

Рис.1. Зависимость количества прикрепившихся клеток А.гааюЬасГвг 50-1 от веса корней

=; г

к § © и *

V

II40

р ¿20 ^ с:

V

О. С

О

¿1

-ь

Г±1

1. Отработка метода определения количества бактерий прикрепившихся к корням однодольных растений

Для изучения процесса прикрепления непатогенных агробактерий к корням однодольных растений необходимо было отработать методику определения количества прикрепившихся клеток. Для этой цели был выбран радиоизотопный метод. Были проделаны следующие эксперименты:

1. Определено влияние веса корней на количество прикрепившихся бактерий (рис.1). На диаграмме мы видим, что вес корней не имеет большого значения, и в пересчете на один грамм корня количество прикрепившихся бактерий примерно одинаково.

2. Определена зависимость количества прикрепившихся клеток от концентрации клеток в суспензии. Увеличение концентрации клеток в суспензии вызывало увеличение количества прикрепившихся клеток, до определенного предела. При дальнейшем увеличении концентрации клеток, увеличение количества бактерий на поверхности корня не наблюдалось (рис.2). Можно предположить, что количество мест для прикрепления на поверхности корня ограничено и клетки бактерий прикрепленные не в первом слое слабее удерживаются на поверхности растительной клетки и смываются буфером.

3. Изучалась зависимость адгезии от времени инкубации бактерий с корнями (рис.3). Из графика видно, что прикрепление А.гасИоЬа^ег 5Э-1 к поверхности корня начинается с первых минут после контакта, быстро увеличивается в течении 40 мин. и достигает максимума через 2 часа. В последующих экспериментах двухчасовая инкубация была выбрана как оптимальная.

4. Была определена зависимость активности меченых бактериальных клеток от времени инкубации. На рисунке 4 мы видим, что после двух часов инкубации активность клеток начинает падать. Вероятно происходит выделение меченого углерода при дыхании. Таким образом, 2-х часовая инкубация бактериальных клеток с препаратом меченой глюкозы представляется оптимальной.

В

17 38 156

Кгщентраиа кписх (г*н кп/кл дсгега^

Рис.2. Зависимость количества прикрепившихся клеток А.гаШоЬас1ег 50-1 от концентрации бактериальных клеток в суспензии

120 мин

Рис.3. Зависимость количества прикрепившихся бактерий от времени совместной инкубации с корнями пшеницы

5. На рисунке 5 показана зависимость шчества прикрепившихся клеток от воэ-:та культуры. Из графика видно, что ссимальное время выращивания бакте-! для эксперимента - 20 часов. В после-5щих экспериментах использовали 16-овую культуру.

6. Была определена зависимость актив-:ти прикрепления от среды выращивания :терий. Состав среды, как видно из таб-(ы 1, оказывает сильное влияние на ко-1ество прикрепившихся бактерий. Большое значение имеют концентрации три рода содержащихся в среде солей,

По результатам полученных данных пи определены оптимальные условия 1 проведения экспериментов по при-¡плению, бактерий на корнях растений, и экспериментов использовали: недель; проростки растений, 16-часовую бак-бальную культуру, 100 мг отрезанных >ней, 2-х часовую инкубацию бактерий с экозой, 2-х часовую инкубацию корней с :териями, оптическую плотность суспен-I при мечении бактериальных клеток 1.0, при инокуляции корней 0=0.1 ( при длине волны 600 нм).

Таблица 1

Зависимость количества прикрепившихся клеток от среды выращивания

Количество Количество

Среда прикрепившихся бактерий, (10б клеток/г корня) прикрепившихся бактерий, %

эеда D твердая с малатом 876 61

ЗА твердая 1080 44

ЗА жидкая 340 14

эеда 16 твердая с глюкозой 129 44

i 1.5

0)

* е 1 ¡2 —

О ^ 0.5

"Г" Т ♦

m Ж

&

а-;.'

1

тк

Ф

Ife

>к

'."SB

rb

5

Время инкубации (час) Рис.4. Зависимость активности меченой бактериальной клетки от времени инкубации с корнями пшеницы

40 • 35 .30 25 . 20 15 10 . 5 О

Ь rf-

Ф

14 16 18 20 22 24 Возраст культуры (час)

Рис.5. Зависимость количества прикрепившихся клеток А.гас1юЬааег 50-1 от возраста культуры

Общая характеристика прикрепления A.radiobacter 5D-1 к корням злаков

1олгое время существовала точка зрения, что агробактерии неспособны прикреп-ься к корням однодольных растений. Считалось, что прикреплению агробактерии :леткам однодольных растений припятствует отсутствие на их поверхности соот-ствующих рецепторов. Сравнивая процесс адсорбции на поверхности корней стерий различных культур (Escherichia, Azaspirillum, Agrobacterium) мы наблюда-что непатогенные агробактерии, в отличии от Eco/i, способны прикрепляться к эням пшеницы а большем количестве, чем ассоциативный диазотроф Abrasilense 245 (таб.2). Следует оговориться, что оптимальные условия прикрепления £ coli и

А Ьга$Непве не были подобраны, поэтому это справедливо, возможно, только для условий указанных ранее экспериментов.

Таблица 2

Прикрепление бактерий различных родов на корнях пшеницы

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, (106 клеток/г корня) M ± 5 Количество прикрепившихся бактерий, %

£ соП С-600 не зафиксировано -

А. ЬгавИепве Эр-245 17,8 ±4,7 1

А. гадюЬас1ег 5Р-1 58,6 + 8,3 4

М - среднее арифметическое значение

б - среднее квадратическое отклонение

Изучая прикрепление патогенных и непатогенных агробактерий к корням пшеницы и риса мы пришли к выводу, что непатогенные агробактерии прикрепляются к растительным клеткам гораздо лучше, чем патогенные бактерии и способны конкурировать с вирулентными бактериями за места прикрепления (таб. 3).

Таблица 3

Прикрепление агробактерий к корням пшеницы и риса

Количество Количество

Вариант опыта прикрепившихся бактерий, (106 клеток/г корня) М ± 5 прикрепившихся бактерий. %

Пшеница

1. A.radiobacter 5D-1 67,1 ±2,3 31

2.A.tumefaciens LMG 187 4,5 ± 1,7 2

3.A.rhizogenes LMG-140 20,2 ± 4,5 13

Рис

A.A.radiobacter 5D-1 38.8 ± 9,0 17

A.tumefaciens LMG 187 4,5 ± 1,6 3

6,A.rhizogenes LMG-140 4,6 + 1,1 3

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии):

С, - 22х10б; С2 - 23х106; С3 - 16х106; С4- 23х106; С5- 17х106; С6 - 14 х106

Как сообщалось ранее, непатогенный штамм А.гасИоЬааег 50-1 был выделен из корней пшеницы.

Нами было проверено прикрепление данного штамма к различным растениям. Для эксперимента были взяты следующие культуры: подсолнечник (Степной), сорго (Саратовское сахарное), кукуруза (Коллективный 147), пшеница (Саратовская 29). Мы видим, что штамм Ага/ИоЬаМег 50-1 более активно колонизовал корни пшеницы.

С другой стороны, он способен колонизовать корни и других растений (таб.4). Вероятно специфичности у непатогенных агробактерий не существует, как и у патогенов. Объяснение факту более активной колонизации корней пшеницы вероятно, нужно искать в физико-химических свойствах поверхности корня пшеницы.

Таблица 4

Прикрепление A.radiobacter 5D-1 к корням различных культур

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, (10б клеток/г корня) М ± 5 Количество прикрепившихся бактерий, %

Пшеница 38,0 ± 6,7 17

Подсолнечник 19,3 ± 5,7 8

Сорго сахарное 5,7 ± 1,0 7

Кукуруза 7,3 ± 4,3 3

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): Ci — 23x106

В литературе описана сортовая вариабельность риса по способности к агробак-териальной трансформации (Иа1пеп е1 а)., 1990 ). Поскольку этап прикрепления бактерий является важным для дальнейшей инфекции, то можно предположить, что сорта риса, способные к более эффективной трансформации более активно колонизуются агробактериями. С помощью радиоизотопного метода мы исследовали прикрепление агробактерий к различным сортам пшеницы (таб. 5) и риса (таб. 6).

Таблица 5

Прикрепление A.radiobacter 5D-1 к корням пшениц Саратовской селекции

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, (10б клеток/г корня) М ± 5 Количество прикрепившихся бактерий, %

Саратовская 29 57,0 + 6,6 34

Саратовская 55 66,0 ± 3,3 39

Саратовская 210 53,0 ± 6,8 31

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): С\ — 17x10°

По данным Д.М.Рейнери с сотрудниками агробактерии с большей эффективностью трансформировали рис сорта Nipponbare (Raineri et al.,1990). По нашим данным агробактерии колонизовали корни этого сорта примерно в 2,4 раза менее интенсивно, чем корни сорта Lemont. Возможно, что способность к агробактериаль-ной трансформации и способность агробактерий к прикреплению между собой не

Таблица б

Прикрепление A. rhizogenes LMG 150 к корням различных сортов риса

Количество Количество

Вариант опыта прикрепившихся бактерий, (106 клеток/г корня) М ±5 прикрепившихся бактерий, %

Nipponbare 2,8 ± 0,6 2

1R 54 4,0 ± 1,9 3

1R 36 2,3 ± 0,5 2

Taipei 309 3,9 ± 0,8 3

Lemont 6,8 ± 3,6 5

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): С! _ 14х106

связаны . Различия в прикреплении Агас/юЬаМег 50-1 между сортами пшениц е менее выражены.

Таким образом, мы пришли к выводу, что непатогенные агробактерии прикр ляются к растительным клеткам гораздо лучше, чем патогены и способны конку ровать с вирулентными бактериями за места прикрепления. Этот вывод был экс риментально проверен и рассмотрен в главе 7 настоящей диссертации.

3. Участие поверхностных белков в прикреплении Агаё'юЬааег 50-' корням однодольных растений

Известно, что в процессе прикрепления бактерий семейства ЯЬаоЫасеае, к; входит род АдгоЬас(еаит, к поверхности клеток двудольных растений кроме по сахаридов могут принимать участие поверхностные белки бактерий. Как было по зано ранее, прикрепление клеток АгасНоЬаМег 50-1 к поверхности корня наибо интенсивно протекает в первые 40 минут после инокуляции.

На рисунке б показана динамика прикрепления АгасИоЬааег 50-1 к пове ности корня пшеницы без блокировки и с блокировкой бактериальной суспен погружением пробирки с суспензией в кипящую воду на пять минут.

2 5 0

к и 01 Z

3 а з с а а. х s а С

0.2 1 10 20 40 120 мнн

^ без блокировки о

□ блокировка 5 иинут те и п е р ату р о й 1 0 О С

Рис.6. Зависимость прикрепления A.radiobacter 5 0-1 к корням пшеницы от блокировки температурой

Мы видим, что количество прикрепившихся бактерий, подвергавшихся нагр« нию, ниже, чем в контроле. Вероятно, что прикрепление непатогенных агробакте опосредуется температурочувствительными молекулами. Было сделано предполо ние, что это белки или гликопротеины. Нами было установлено, что преинкуба клеток A.radiobacter 5D-] или корней пшеницы с различными веществами , ока вающими воздействие на поверхностные белки, может значительно снизить полностью блокировать прикрепление. Известно, что глутаровый альдегид (ГА) зывает образование "сшивок" в белковых молекулах по S-S связям, нарушая т тичную структуру. Предобработка клеток A.radiobacter 5D-1 ГА блокировала г крепление бактериальных клеток к корням. Полный ингибирующий эффект на г цесс прикрепления оказывала одновременная предобработка бактериальной < пензии и корней пшеницы. Эти данные свидетельствуют об участии бактериальнь растительных белков в прикреплении непатогенных агробактерий к корням пшен (таб.7).

Предобработка клеток трипсином, гидролизующим белковые молекулы по i тидным связям, также снижало количество клеток, прикрепившихся к корням в раза (таб.8).

Таблица 7

Влияние глутарового альдегида на прикрепление A.radiobacter 5D-1 к корням пшеницы

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, (106 клеток /г корня) M ± 5

Контроль (НК + НБ) 128,0 ± 24,8

НК + бактерии + ГА не обнаружено

(Корни + ГА) + НБ 13,0 ± 4,0

(Корни + ГА) + (бактерии + ГА) не обнаружено

Примечание: НК-необработанные корни

НБ-необработанные бактерии ГА-глутаровый альдегид

концентрация клеток в суспензии-6х107 кл/мл.

Таблица 8

Влияние предобработки 1% раствором трипсина на прикрепление А.гаё'юЬа&ег 5й-1 к корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Вариант опыта бактерий, (10® клеток /г корня)

M ± 5

Контроль (НК + НБ) 33,0 ± 5,6

(Корни + трипсин) + НБ 3,0 ± 0,3

Корни ■+• (бактерии + трипсин) 19,0 ± 1,6

Примечание: НК-необработанные корни

НБ-необработанные бактерии концентрация клеток в суспензии-бхЮ7 кл/мл

Известно, что лектины обладают свойством изменять конформацию при воздействии некоторыми моносахаридами и аминокислотами. При этом происходит потеря способности этих белков образовывать комплекс с полисахаридами растительного происхождения. Воздействуя на корни растения моно- и аминосахарами можно блокировать прикрепление Rhizobium trífol/i к корням клевера ( Dazzo, 1984). Проведя предобработку клеток A.radiobacter 5D-1 N-ацетил-О-глюкозамином мы обнаружили некоторое снижение количества клеток, но полной блокировки не происходило. Также не происходило полной блокировки после предварительной инкубации корней пшеницы с рядом моносахаридов: глюкозой, фруктозой, сахарозой, фукозой, маннозой, арабинозой и галактозой. Исходя из этих данных, можно предположить, что на поверхности клеток штамма Aradiobacter 5D-1 отсутствуют белки, аналогичные известным адгезинам ризобий.

Методом радиоизотопного анализа было показано снижение количества прикрепившихся бактерий на корнях пшеницы после обработки веществами хелатирую-щими двухвалентные катионы (ЭДТА и ЭГТА) и таким образом влияющими на конформацию поверхностных белковых структур (таб.9).

Таблица

Влияние ЭДТА и ЭГТА на прикрепление АгасИоЬааег 50-1 к корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Вариант опыта бактерий, (106 клеток /г корня)

М ± 8

АгасГюЬааег 50-1 9,3 ± 2,7

А.гас/юЬасГег 50-1 + ЭДТА 5,6 ± 1,0

АгаЫоЬа^ег 50-1 + ЭГТА 7,5 ±2,1

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии):

Сг23х106 , С2-19х106 , Сз"22х106

ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота

ЭГТА - этиленгликоль-бис-(Р-амино-этил)-эфир

При исследовании прикрепления кЫгоЫит ¡вдитто&агит Ы. у/'свае к корневь волоскам гороха Г. Смит с соавторами заметили, что выращивание ризобий с п ниженным содержанием ионов кальция снижает способность бактерий к прикрепл нию (БтИ е1 а1., 1986}. В дальнейшем было показано, что прикрепление ризобий корневым волоскам гороха опосредуется кальций - зависимым белком (Бт^ е4 г 1987), который был обозначен как рикадгезин. Было высказано предположение, ч рикадгезин является общим белком для бактерий родов ЙЫгоЫит и АдгоЬас1еп\ семейства ЯЫгоЫасеае и опосредует прикрепление не только к бобовым, но и однодольным (БпиЧ е1 а1.,1989).

По нашим данным наличие кальция в среде выращивания в концентрации 7мМ не оказывало значительного стимулирующего влияния на прикрепление непат генных агробактерий к корням пшеницы (таб.10), за исключением концентрации 1 мМ ( 24% к контролю).

Таблица

Влияние ионов кальция на прикрепление А,гасИоЬас1ег 50-1 к корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Концентрация кальция бактерий, (106 клеток /г корня)

лпМ М ± 5

Контроль (без кальция) 177,4 ±21,8

1.4 233,4 ±30,9

7.0 175,4 ±39,1

14.0 189,8 ±30,6

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): С, - 15х106; С2- 14х106; С3 - 13x106; с4. 17хк)б

Отсутствие кальция в буфере при совместной инкубации корней и бактер также не оказывало отрицательного влияния на количество прикрепившихся бак" рий (таб. 11).

Полученные данные указывают на то, что взаимодействие агробактерий с корн ми пшеницы, видимо идет без участия кальций-зависимого белка.

Таблица 11

ияние содержания ионов кальция в буфере на прикрепление АгасИоЬас1ег 5Э-1 к

корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Концентрация кальция бактерий, (106 клеток /г корня)

тМ M ± §

Контроль (без кальция) 9,4 ± 1,8

1.4 8,0 ± 1,0

7.0 6,6 ± 1,3

имечание: СаС!? добавляли при инкубации корней с бактериями нцентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): -20x106

4. Прикрепление мутантов А.га<ИоЬа&ег 50-1 к корням пшеницы

Нами было проанализировано прикрепление сА^-минус Тп-5 - мутантов штамма ад'юЬааег 50-1, выделенных на среде, содержащей краситель калькофлуор, свя-вающийся с полисахаридами и изменяющий их спектр поглощения в ультрафио-ге при 364 нм. Было отобрано 3 сЛу-минус мутанта, которые не обладали гением на этой среде в ультрафиолете. Полученные мутанты обладали пони-нной способностью к прикреплению к поверхности корня. Анализ этих мутантов юмощью радиоизотопного метода показал, что количество прикрепившихся кле-с падает в среднем в 3 раза (таб.12). С помощью сканирующей микроскопии были наружены единичные (в случае мутантов 226, 227) прикрепившиеся клетки с очень жими фибриллами, причем совсем не наблюдалось клеток на поверхности корне-х волосков (рис.7).

Таблица 12

Прикрепление с/и<-мутантов А.гасИоЬааег 50-1 к корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Вариант опыта бактерий, (106 клеток /г корня)

М ± §

гаёЬЬасХег 50-1 10,0 ±3,3

гасГюЬааег 50-1 ( 226 ) 4,0 ±2,3

гасНоЬаМег 50-1 ( 227 ) 2,8 ±0,2

гас/ЬЬасГег 50-1 ( 228 ) 10,0 ±2,7

нцентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): Сг24х106, С2-18хЮ6, С3-20х106, С4-19х106

Краситель калькофлуор не является специфичным. Он может окрашивать поли-<ариды, имеющие различные типы связей. Вероятно, на поверхности бактериаль-й клетки могут быть различные полисахариды, участвующие в прикрепление. По нным электронной микроскопии, транспозонный Тп5-мутант 5005, с повышенной эсобностью к продукции калькофлуорсвязывающих полисахаридов, также облает повышенной способностью прикрепляться к корням пшеницы (рис.8), что под-¡рждается радиоизотопным методом (таб.13).

Рис.8. Прикрепление Тп-5 мутанта штамма А.га(ИоЬа&ег 50-1 (5005) с повышенной способностью к продукции калькофлуор-связывающих полисахаридов к корню пшеницы

Таблица 13

Прикрепление сДу-мутантов А.гасЛоЬас{ег 50-1 к корням пшеницы

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, {106 клеток /г корня) М ±5

A.radiobacter 5D-1 153,0 ± 20,0

Aradiobacter 5D-1 (5005) 338,0 ± 65,0

Aradiobacter 5D-1 ( 227 ) 12,0 ± 2,0

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): Сг15х106, Сг18х10б, С3-17х106

В ходе исследования методом транспозонного мутагенеза были получены хемо-тактические мутанты к ряду моносахаридов и органических кислот.

Также были получены мутанты не обладающие подвижностью. Анализ транспо-зоиных мутантов A.radiobacter 5D-1 (207, 362), потерявших подвижность показал, что у большей части клеток мутантов отсутствуют жгутики. Исследование прикрепления полученных мутантов к поверхности корня пшеницы показало, что che-мутанты обладали сходной способностью к прикреплению с исходным штаммом, в то время как /fo-мутанты прикрепляются в меньшем количестве (таб.14).

Анализ способности неподвижных мутантов продуцировать бета-глюканы на среде с калькофлуором показал, что колонии штаммов 207 и 362 обладают сходным свечением с исходным типом, что указывает на сходный спектр бета-глюканов.

* Анализ поверхности штамма 5D-1 и мутантов 207 и 362 с помощью антител на 0-антигенную часть липополисахарида 5D-1 показал, что меченые антитела способны взаимодействовать как с исходным штаммом, так и с мутантами. Прикрепившиеся к

Рис.7. Прикрепление cfw-минус Тп-5 No 227 штамма A.radiobacter 5D-1 к корням пшеницы

Таблица 14

Прикрепление мутантов A.radiobacter 5D-1 к корням пшеницы

Количество прикрепившихся

Вариант опыта бактерий, (10® клеток /г корня)

М ±5

radiobacter 5D-1 128,0 ± 20,0

radiobacter 5D-1 N195 (che) 174,0 ± 14,0

radiobacter 5D-1 N 207 (fía) 81,0 ± 38,0

radiobacter 5D-1 N 362 (fia) не прикрепляются

нцентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): Ci-18x10®, С 2-24x10®, 12x10®, Q-23x106

эню пшеницы клетки мутантов 207 и 362 имели такие же фибриллы как и исход-й штамм. Таким образом было установлено, что наличие жгутиков у непатогенных юбактерий коррелирует с большей активностью прикрепления агробактерий к зерхности растительной клетки.

5. Изучение роли лилополисахаридов внешней мембраны А radiobacter 5D-1 в прикреплении к поверхности корней пшеницы

В 1976 году М. Ватлей с соавторами и позднее А. Маттисс с соавторами (1978) казали, что липополисахарид (ЛПС) из внешней мембраны А. tumefeciens прини-ет участие в сайт-специфичном прикреплении к поверхности растительной клетки удольных растений. В ряде других работ это предположение не подтвердилоь. Мы проверили предположение о роли ЛПС в прикреплении непатогенных агро-ктерий к поверхности однодольных растений. По нашим данным ЛПС из внешней мбраны A.radiobacter 5D-1 не оказывает влияния на прикрепление непатогенных эобактерий к корням пшеницы в концентрации 0,4-20 мкг/мл (таб. 15).

Таблица 15

Влияние липополисахаридов на прикрепление A.radiobacter 5D-1 к корням

пшеницы

Концентрация ЛПС Количество прикрепившихся бактерий, (106 клеток /г корня) М ±6 Количество прикрепившихся бактерий, %

Контроль (без ЛПС) 54,3 ± 10,0 23

5 мг/г корня 53,3 ± 15,0 23

10 мг/г корня 86,0 ± 19,0 37

20 мг/г корня 46,7 ± 18,0 20

жцентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): ^-23x10®

На основании полученных данных следует сделать вывод о том, что липополиса-рид агробактерий не принимает непосредственного участия в прикреплении к по-рхности растительной клетки однодольных растений, а участвует на других стади-взаимодействия (инфекции).

6. Образование фибрилл при прикреплении А.га<ЛаЬа&ег 50-1 к корням пшеницы

С помощью сканирующей микроскопии было установлено, что спустя 30 мин. после начала совместной инкубации часть прикрепившихся к поверхности корня пшеницы клеток имеют нитевидные структуры, связывающие поверхность бактериальной и растительной клеток (рис.9). Спустя 120 мин. количество прикрепившихся бактерий возрастает и в отдельных местах образуют подобие сети (рис.10).

Рис.9. Клетки А.гаёюЬа&ег 50-1 на поверхности корневого волоска пшеницы: время инкубации 30 минут

Рис. 10. Сеть фибрилл, связывающая Л.гасИоЬааег ЗТ)-! и поверхность корня пшеницы, зона растяжения: время инкубации 2,5 часа

Предобработка клеток 'АгааюЬаМег целлюлазой снижала количество прикрепившихся клеток в 1,9 раза, что может свидетельствовать о целлюлозной природе фибрилл (таб.16).

Таблица 16

Влияние предобработки целлюлазой клеток А.гасИоЬа^ег 50-1 на прикрепление к

корням пшеницы

Вариант опыта Количество прикрепившихся бактерий, 106 клеток \ г корня М ±5

Контроль (бактерии без обработки) 9,3 ± 1,0

Бактерии обработанные целлюлазой 5,0 ± 0,3

Концентрация клеток при инокуляции (кл/мл суспензии): С-| - 4 х 106

Целлюлозные фибриллы способны об-азовываться и в чистой культуре на сре-IX, содержащих углеводы, что указывает 1 неиндуцированный растением характер ункционирования генов, ответственных за чнтез целлюлозы. Эти данные были под-;ерждены при исследовании прикрепле-1Я АгасИоЬаМег 50-1 к нейлоновой мем-эане (рис.11).

Вероятно, формирование фибрилл не (ляется специфическим этапом при при->еплении агробактерий к поверхности ■ 1Стительной клетки, а является более эщим приспособительным свойством бакте-1Й при фиксации на твердых поверхностях.

Ркс.11. Формирование фибрилл у А.гаШоЬааег прикрепившихся к нейлоновой мембране

7. Ингибирование опухолеобразования у двудольных растений предобра-эткой Ага&оЬаМег 5Э-1

актериальный фитопатоген А. ^те^ас/елз *еет широкий круг хозяев, вызывая олу->ли у большого числа представителей го->семенных и двудольных покрытосемен-■IX. Круг хозяев А Гитв/аа'епз включает |Д культурных растений, а также ряд важ-:йших сельскохозяйственных культур, что ждает проблеме опухолеобразования >актический интерес. В целом опухоли не !Ивают растения, но существенно подав-1ЮТ их общий рост, жизнеспособность, >вышают восприимчивость к грибковым фекциям и к стрессовым условиям среды, [Нося таким образом серьезный ущерб льскому хозяйству (Пирузян, 1985). Ави-лентный штамм АгаёюЬааег 50-1, иноку-|руемый в раны листьев или стеблей чтения совместно с А. tumвfaciens Ю187, способен конкурировать с виру-нтными бактериями за сайты прикрепле-я и ингибировать опухолеобразование ис. 12).

Внесение А.га<ИоЬас№г 50-1 совместно А ^те/аа'епз 1_МС187 уменьшает вес ухоли у подсолнечника на 29%, у тома-в на 95%. Внесение А.гасИоЬа^вг 50-1

сутки до инокуляции А Ште/аа'епз 1_МС187 уменьшает вес опухоли зенно на 47% и 124% (таб.17).

а

•ДКг-';.

'Шф

М-

ь

"■я .¿к

с

Рис.12. Ингибирование опухолеобразования у подсолнечника штаммом А. гай'юЬааег ЗБ-) а- А^тЬасшпит тте[асшп$ ЬКЮ187 Ь- Л^оЬааепит гаёюЬайег 50-1 с- А^гоЬааепит гасИоЬааег 50-1 + А^гоЬааепит Ште/ааепБ ЬУГСШ (1:1)

соответ-

Таблица 17

Влияние штамма АгасИоЬаМег 50-1 на опухолеобразование подсолнечника и томатов

Вариант Подсолнечник вес стебля (мг) % М ± 5 к контролю Томаты вес стебля (мг) % М ± 5 к контролю

Контроль (без инокуляции) 90,6 ±11,7 47,0 ±11,1

* АгаЫоЬааег 50-1 + A.tumefac¡ens 1_МС187 114,3 ± 13,0 107 52,6 ± 5,7 112

А.садюЬаМег 50-1 + А. (ите/ас/епз 1_МС187 (10 : 1) 120,7 ± 20,1 115 66,4 ± 14,1 141

А. 1ите1ааеп$ [.МвШ 153,0 ± 19,0 154 110,8 ±43,7 236

А. гасИоЬа^ег 5 0-1 95,8 ± 17,3 101 68,8 ± 6,5 104

* Внесение Atumefaciens 1_М0187 через сутки после внесения А.гасИоЬааег 50-1

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что непатогенные агробак-терии адсорбируясь на растительных клетках в большем количестве , чем патогены, обладают способностью конкурировать за места прикрепления и ингибировать опухолеобразование,

ВЫВОДЫ

1. Непатогенные агробактерии способны прикрепляться к корням ряда однодольных растений. Прикрепление клеток начинается с первых минут, быстро увеличивается в течении 40 мин. после начала инкубации и достигает максимума через 2 часа.

2. Установлено, что количество мест для прикрепления Агас/юЬас(ег 50-\ на поверхности корня ограничено и увеличение концентрации клеток в суспензии больше чем на 17х106 кл/мл не дает увеличения количества прикрепившихся клеток.

3. Непатогенные агробактерии прикрепляются к растительным клеткам лучше чем патогенные агробактерии и способны конкурировать с ними за места прикрепления, ингибируя опухолеобразование.

4. Этап прикрепления не связан с эффективностью трансформации сортов риса агробактериями.

5. В прикреплении непатогенных агробактерии к корням пшеницы принимают участие бактериальные и растительные белки. Однако, на поверхности клеток штамма А.гас1юЬас(вг 50-1 не выявлены белки, аналогичные адгезинам ризобий.

6. На поверхности бактериальных клеток имеются калькофлуорсвязывающие полисахариды, участвующие в прикреплении непатогенных агробактерии к корням однодольных растений.

7. Жгутики непатогенных агробактерии принимают участие в процессе прикрепления бактериальных клеток к корням пшеницы.

8. Липополисахариды Aradiobacter 5D-1 в концентрации 5-20 мг/г корня не сазыают заметного влияния на прикрепление бактерий к корням пшеницы.

9. Непатогенные агробактерии способны образовывать полисахаридные фибрил->1 в процессе контакта с поверхностью растений. Первые фибриллоподобные руктуры появляются спустя 15 минут после инокуляции корней пшеницы.

Список публикаций по теме диссертации

.Чумаков М.И., Соловова Г.К. Непатогенные агробактерии (Aradiobacter) способны к адсорбции на поверхности корней однодольных растений // IV Всесоюзная конференция "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", 1992, Пущино, Абстр., С. 209-210.

. Chumakov M.I., Krivopalov Yu.V., and Solovova G.K. Adsorption of Agrobacterium radiobacter to wheat roots. Vllth Eastern European Symp. on Biol. Nitr. Fix., 22-26 Sept., 1992 , Saratov, Book of abstract, P.73. 5.Chumakov M.I.,Gorban V.V., Kovler L.A., Solovova G.K. Isolation and characterization of diazotrophic bacterium Agrobacterium radiobacter 5D-1 from histosphere of wheat.// Vllth Eastern European Symp. on Biol. Nitr.Fix., 22-26 Sept., 1992, Saratov, Book of abstract, P.40. 1. Chumakov M.I., Krivopalov Yu.V., and Solovova G.K. Cellulose fibrile-like structure are involved in adhesion of Agrobacterium radiobacter 5D-1 to wheat roots. Sixth Int. Symp. on Biol. Nitr. Fix with Non-Legumes, 6-10 Sept., 1993, Ismailia, Egypt, Book of abstract, P.129. ). Chumakov M.I., Krivopalov Yu.V., Solovova G.K., Gorban V.V., Velikov V.A. and Ishin V.A. Interaction between associative diazotrophic bacterium Aradiobacter 5D-1 and monocotyledonous plants. Sixth Int. Symp. on Biol. Nitr. Fix with Non-Legumes, 6-10 Sept.,1993, Ismailia, Egypt, Book of abstract, P.129. j. Solovova G., Velikov V., Dykman L., Bogatyrev V., Shelud'ko.A., and Chumakov,M. The evidence involving of polysaccharides of Agrobacterium radiobacter 5D-1 in attachment process to wheat roots.//The First International Conference on Polysaccharide Engineering, 6-8 June, 1994 , Trondheim, Norway, Abstract P.8. 1. Chumakov, M., Velikov,V., Solovova,G., Matora,L., and Shchyogolev,S. Root associated non-pathogenic Agrobacteria from wheat.// Abstr.lst Europian Nitrogen Fixation Conference, 2-3 September, 1994, Szeged, Hungary, 68. 3. Chumakov, M., Solovova G., Velikov V., Kurbanova.l., Matora,L. and Shchyogolev.S. Wheat root-associated Agrobacterium radiobacter. Proceedings of 1st European Nitrogen Fixation Conference and workshop on "Save application of genetically modified microorganisms in the environment", 2-3 September, 1994, Szeged, Hungary/eds. G.B.Kiss, G.Endre, Szeget, Pharmacina Press, P. 275-279. .Solovova,G., Matora.L., Bogatyrev,V., Dykman,L., Shchyogolev,S. and Chumakov,M. Short-term colonization and attachment of bacteria of the family Rhizobiaceae and of the genus Azospiri/ium to plant roots.//NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Relatted Microorganisms.4-7 September, 1994. Sarvar/Hungary. Abstract .

i.Соловова Г.К., Беликов B.A., Шустова Е.Б., Курбанова И.В., Чумаков М.И. Инокуляция непатогенными агробактериями сельскохозяйственных куль-тур.//Конференция "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду." 31 мая - 2 июня 1994, Москва, абстракт. .Chumakov M.I., Krivopalov Yu.V., Solovova G.K., Gorban V.V.„ Velikov V.A. and Ishin A.G. Interaction between associative diazotrophic bacterium Aradiobacter 5D-1 and monocotyledonous plants. Sixth Int. Symp. on Biol. Nitr. Fix. with Non-Legumes, 6-

10 Sept., 1993, ismalia, Egypt /Eds. N.A.Hegari, M.Fayer and M.Monib, 1994, The American Universirty in Cairo Press, P. 367 - 370.

12.Соловова Г.К., Беликов B.A., Чумаков М.И. Адгезия Rhizobium и Agrobocterium на корнях злаков // 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации. Москва, 24-26 января 1995 г., Абстр. С. 80.

13.Solovova G.K., Velikov V.A., Krivopalov Yu.V., and M.I.Chumakov. Analysis of attachment of Agrobocterium radiobacter 5D-1 and its cfw, che and fla - mutants to wheat roots. // 10th International Congress on Nitrogen Fixation. Russia. Saint-Petersburg, May 28 - June 3, 1995. Abstract P. 129.

14.Chumakov M.I., and Solovova G.K. Rhizobium and Agrobocterium attacment to Ovena sativa L. and Triticum aestivum L. root surface. //International Workshop on associative interactions of Nitrogen-Fixing bacteria with plants. Russia. Saratov, June 5-8, 1995. Abstract P. 64.

15.Solovova G.K., Panasenko V.I. and Chumakov M.I. Studies of wheat interactions of Aradiobacter 5D-1//International Workshop on associative interactions of Nitrogen-Fixing bacteria with plants. Russia. Saratov, June 5-8, 1995. Abstract P.54.

16.Solovova G., Velikov V., Krivopalov Yu. and Chumakov M.I. Short-term attachment of bacteria from the Rhizobiaceae family to the roots of cereals./ AzospiriUum VI and related microorganisms: genetics, physiology, ecology/ Eds. I.Fendrik, M. del Gallo, J.Vanderleyden, M. de Zamaroczy NATO ASI series G, Ecological Science, vol. 37, Springer Verlag Berlin Heidenberg, 1995, P. 223-230.

17.Соловова Г.К., Кривопалов Ю.В., Беликов B.A., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobocterium radiobacter к корням пшеницы //"Микробиология", 1995, том 64, С. 526-530.

18.Solovova G.K., Velikov V.A., and Chumakov M. I. Wheat root colonization by nonpathogenic agrobacteria // Moieculare ecology, 1994, vol.3, No 6, P.610. Meeting abstracts. Proc. of the Fallen Leaf Lake Conference on Microbial Ecology and Biological Control, 15-18 September, 1994, Fallen Leaf Lake, South Lake Tahoe, California / Eds. T.Burke, R.Seider, H.Smit Blackwell Scientific Publication, Oxford, London, Edinburg, Boston, Melbourne, Paris, Berlin, Vienna.

19.Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Gorban V.V., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatirev V.A., and C.Kennedy Associative interactions Agrobocterium radiobacter 5D-1 with mono- and dicotyledonous plants // Nitrogen fixation: Fundamentals and Application. Proc. 10th Int. Congress on Nitrogen Fixatioc (May 28 - June 3,1995), S-Petersburg, Russia / Eds. Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.I., and W.E. Newton , Kluwer Academical Publishers, Dordrecht, Boston, London, 1995, P. 822-823.

20.Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., and S.Yu. Schyogolev Involving of cellulose microfibrils of A.radiobacter in attachment to wheat roots/ Abstr. Beiyerink Centinential Conference, Haugue, The Netherlands, December 16-21, 1995.

21.Чумаков М.И., Соловова Г.К., Калаптур K.B., Панасенко В.И. Изучение ранних этапов контактного взаимодействия агробактерий с поверхностью однодольных растений //Международная конференция посвященная памяти акад. А.А. Баева, 20-22 мая 1996г. Москва, Россия, абстр. С. 41.

22.Chumakov M.I., Solovova G.K., Kalaptur O.V., Kurbanova I.V., and Panasenko V.I. Studies of agrobacterial contact interactions with wheat roots and wheat root hair surfaces //8th International Congress molecular plant-microbe interactions, Knoxville, TN, July 14-19, 1996, Abstr. F. 5.

23. Chumakov M.I, Solovova G.K., Kalaptur K.V., and Panasenko V.I Interactions of bacteria of the family Rhizobiaceae with wheat roots and the root hair surface //2 nd European Nitrogen Fixation Conferece, September, 8-13, Poznan, Poland, P. 138.

Kurbanova I.V., Solovova G.K., Matora LYu.., Panasenko V.l. and Chumakov M.I. Behaviour of applied non-pathogenic Agrobacteria in the rhizosphere of wheat //2 European Nitrogen Fixation Conferece, September, 8-13, Poznan, Poland,

Chumakov M.l, Solovova G.K., Kalaptur K.V., and Panasenko V.I. Involvement of surface molecules and surface structures in attachment of Aradiobacter to the wheat root and root hairs//7th International Symposium Nitr. Fix. with Non Legumes, October, 16-21, 1996, Faisalabad, Pakistan, P.166.

Chumakov M.l, Solovova G.K., Kalaptur K.V., and Panasenko V.I. Specific and non-specific bacterial adsorption during colonization of the wheat root surface //7th International Symposium Nitr. Fix. with Non Legumes, October, 16-21, 1996, Faisalabad, Pakistan, P.64.

P. 162.