Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины

Абзаева, Наталья Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины"

На правах рукописи

004690096

АБЗАЕВА Наталья Вячеславовна

ПОВЫШЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ Yersinia pestis EV В БИОМАССЕ ВАКЦИНЫ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Ставрополь - 2010

004600096

Работа выполнена

в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумным институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Будыка Дмитрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Тюменцева Ирина Степановна;

доктор биологических наук ! Тохов Юрий Мухамедович

Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр

прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «с?С1 ^(Ш! 2010 г. в (2 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан М-ЛЬипд 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Живые вакцины представляют собой иммуно-профилактические препараты, состоящие из наследственно измененных форм возбудителей инфекционных болезней. Применение вакцинации как средства специфической профилактики особо опасных инфекций в течение длительного времени свидетельствует о сохранении ее весомой роли в системе противоэпидемических мероприятий (Исупов И.В., Бугоршва С А, Кутырев В.В., 2004). В нашей стране для профилактики чумной инфекции используют живую вакцину из штамма Yersinia pestis EV.

Стабилизация качества препарата, а именно необходимость сохранения всех свойств микробных клеток в течение длительного времени, является наиболее значимым вопросом в производстве живых вакцин. Последнее время в орбите научных интересов, касающихся совершенствования биотехнологии производства вакцины чумной живой, оказались методические приемы, направленные на дальнейшую стандартизацию коммерческого препарата по показателю жизнеспособности клеток Y. pestis EV (Ракитина EJI, 1988; Буцы-ка Д.А., 2002; Ефременко А.А., 2005). Современная тактика совершенствования вакцины чумной направлена на разработку и внедрение в производство дополнительных условий стабилизации числа живых микробных клеток в прививочной дозе коммерческой вакцины.

В результате ранее проведенных исследований была разработана производственная биотехнология вакцины чумной живой с содержанием от 20 до 50 доз в ампуле (Ефременко А.А., 2005). Полученный с нашим участием по новой биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и включен в действующий промышленный регламент № 01897080-09-09 на производство вакцины чум ной живой.

Имеющиеся литературные данные (Алутин И.М., 1974) дают основание предполагать, что снижение температуры культивирования чумного микроба до 20-25 °С может значительно улучшить качество вакцины за счет возрастания в биомассе процента живых клеток, так как здесь температурный фактор определяет соответствующий уровень физиологической и метаболической активности микробных клеток. Вышеизложенное послужило основанием для апробации режимов культивирования вакцинного штамма при температуре (21±1) °С вместо регламентированных в ПР на вакцину чумную (27±1) °С, что способствовало большей устойчивости к лиофилизации на одноименном этапе производства препарата вакцины (коррекция биологических параметров) (Тинкер А.И., Будыка Д.А., Гайдина В.В. и др., 1993; Тинкер А.И., Гончарова М.Н., Будыка Д.А. и др.,

1994; Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Тинкер А.И. и др., 1997; Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Гюдушанян К.С., Руднев С.М. 1998; Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Тинкер А.И. и др., 1998).

Полученные результаты определяют целесообразность и перспективность доработки и внедрения пониженной температуры культивирования биомассы (21+1) °С в процесс производства вакцины чумной живой. Кроме того, приведенные сведения являются достаточным экспериментально-теоретическим обоснованием для отработки и внедрения в биотехнологию вакцины чумной живой сочетанного воздействия обоих указанных выше факторов: физико-биологического и количественно-объемного.

Отработка и внедрение в биотехнологию выращивания биомассы препарата вакцины чумной живой пониженной температуры культивирования, а также сочетание с оптимизацией ее параметров на этапах сведения и розлива, позволивших повысить исходную жизнеспособность и стабилизировать число живых микробных клеток в прививочной дозе, определяют актуальность данной работы.

Цель исследования: Повысить показатель жизнеспособности микробных клеток и стабилизировать их число в прививочной дозе вакцины чумной.

Задачи исследования:

1. Экспериментально обосновать целесообразность корректировки температурных условий культивирования вакцинной суспензии в биотехнологии вакцины чумной живой.

2. Изучить в эксперименте сравнительные показатели жизнеспособности и повреждаемости микробных клеток в различных сочетаниях температурных и количественных характеристик биомассы.

3. Изучить основные показатели качества препарата вакцины чумной живой, полученной в условиях оптимальной сочетанной корректировки количественных и температурных параметров вакцинной суспензии.

4. Стабилизировать число живых микробных клеток в препарате вакцины в процессе хранения за счет оптимизации температурных и количественных показателей микробной биомассы.

5. Изучить иммуногенность и напряженность иммунитета, индуцируемого вакциной чумной, полученной из микробных клеток при предлагаемых условиях приготовления суспензии. Определить бактерицидную активность по-лиморфноядерных лейкоцитов в периферической крови белых мышей при инфекционных и вакцинных процессах в качестве косвенных показателей их иммунологической перестройки.

Научная новизна работы. Впервые разработаны и внедрены температурные режимы культивирования вакцинной биомассы в градиенте (21±1) °С,

вместо регламентированных (27±1) °С, что позволяет получить более высокий исходный показатель живых микробных клеток как в биомассе, так и в вакцине, полученной из нее.

Впервые предложен »реализован научно-методический подход к повышению жизнеспособности микробных клеток У. р^Ш ЕУ в вакцинной суспензии за счет сочетанного применения оптимальных температурного (21) °С и количественно-объемного ((1-4)х 1010микробных клеток в объеме 1 мл в ампуле) параметров в биотехнологии производства вакцины чумной живой: Показано,-что в условиях регламентированного режима лиофилизации повышается эффективность стабилизации свойств микробных клеток у препарата с меньшей концентрацией вакцинной суспензии и снижением ее объема в ампуле, особенно у образцов со сниженной температурой культивирования (2 !± 1) °С. Впервые показано, что устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией полиморфноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), обеспечиваемой главным образом кисэтородзависимой миелЬперокСадазой (МПО) при вспомогательном участии кислороднезависимых неферментных катионньк белков (КБ). Изменение уровня активности МПО и КБ ПМЯЛ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Отработан диапазон пониженной температуры культивирования микробной биомассы вакцины чумной живой (21±1) °С вместо регламентированного (27±)) °С, позволяющий увеличить число живых микробных клеток в готовом препарате на 12-20 % и стабилизировать его в процессе хранения.

Вакцина чумная живая, полученная по предложенной схеме, прошла контроль в лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора, из которого получено положительное заключение.

Доказано, что сочетанное изменение температурного и количественно-объемного параметров при получении вакцины обеспечивает наилучшие показатели качества готового препарата, в частности его жизнеспособности.

Практическая ценность работы подтверждена следующими документами:

1. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 01897080-01-04 предусматривают выпуск вакцины со сниженным количеством доз в производственной упаковке.

2. Методические рекомендации «Определение иммуногенности вакцины чумной живой в модели феномена «переживания» на белых мышах», утверждены директором ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора (протокол заседания Ученого Совета института от 16 апреля 2009 г. № 4).

3. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 01897080-09-09, предусматривающие выпуск вакцины как при температуре культивирования (27±1) °С, так и при (21±1) °С, утверждены в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора 22.122009 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Пониженная температура культивирования биомассы X /?ел7лу ЕУ стимулирует биологическую активность микробных клеток, что позволяет увеличить количество живых микробных клеток в вакцине.

2. Полученный при пониженной температуре культивирования препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и предназначен как для планового практического применения, так и для массовых иммунизации.

3. Сочетанное изменение температурных и количественно-объемных параметров вакцинной суспензии позволяет достичь наиболее высоких показателей качества в готовом препарате вакцины чумной живой, особенно жизнеспособности и стабилизации свойств при хранении, что сопряжено с более низким показателем повреждаемости микробных клеток.

4. Иммуногенные свойства полученных образцов вакцины, изученные как двухэтапным методом, так и в модели феномена «переживания», соответствуют регламентированным нормам.

5. Цитоэнзимохимические показатели полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у белых мышей отражают степень ответной реакции организма экспериментальных животных на введение инфекционного и вакцинного агентов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», посвященном 80-летию Санкт-Петербургского института им. Пастера (Санкт-Петербург, 3-5 сентября, 2003); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 21-22 марта, 2007); научно-практической конференции «Основные итоги научно-практической деятельности молодых ученых и специалистов СтавНИПЧИ» (Ставрополь, 9 июня, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном

мире» (Оболенск, 21-22 апреля, 2009); научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 14-15 мая, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках двух государственных тем НИР «Стабилизация показателя живых микробных клеток в чумной вакцине за счет оптимизации некоторых количественных параметров на этапах приготовления коммерческого препарата» (№ Госрегистрации 01200109089); «Разработка научно-методических подходов к повышению жизнеспособности микробных клеток штамма ЕВ чумного микроба в вакцинной суспензии в биотехнологии приготовления вакцины чумной живой сухой» (№ Госрегистрации 01200700918), отражено в 12 опубликованных научных работах, в том числе две работы - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образо- • вания и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объём работы. Диссертация излажена на 122 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 26 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 206 источников, из них 175 - отечественных и 31 - зарубежный.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Материалом для выполнения экспериментальной части работы служили 3 коммерческие, 6 экспериментально-производственных и 12 экспериментальных серий вакцины чумной живой из штамма У. реяИв ЕУ линии НИИЭГ, приготовленные в научно-производственной лаборатории чумных вакцин ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора

Для заражения лабораторных животных использовали вирулентный штамм У. ре$1к 461, полученный из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Все питательные среды и среды высушивания, использованные в работе, получены из лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов ¡-IV групп патогенности ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

В опытах были использованы: 402 беспородные белые мыши массой 18-20 г, 340 морских свинок массой 250-300 г, 12 кроликов массой 1,5-2,5 кг.

Критерии качества препарата вакцины чумной живой определяли в соответствии с ФСП 42-8654-07.

В инкубируемых бульонных культурах высчитывали длительность периодов роста, число клеточных делений и время одной генерации (Дж.

Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967; Г. Шлегель, 1987).

Повреждаемость микробных клеток в процессе экспериментальной отработки препарата вакцины оценивали с помощью электронно-микроскопического метода Жизнеспособность микробов в вакцинах определяли кулмураль-ным методом по ФСП 42-8654-07. Оптическую концентрацию находили в соответствии с «Инструкцией по применению отраслевого стандартного образца (ОСО 42-28-8511) для визуального определения мутности бактериальных взвесей, стеклянного», 10 МБ которого эквивалентны К 109 м.к. чумного микроба.

Иммуногенность всех образцов вакцины чумной живой определяли в соответствии с методикой, изложенной в действующей ФСП на вакцину чумную. Иммуногенность вакцинных препаратов в феномене «переживания» изучали в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению степени иммуногенности авирулрнтных штаммов чумного микроба для белых мышей» (1984), используя нелинейных белых мышей.

Динамику кислород-зависимой бактерицидной системы определяли по активности миелопероксидазы (МПО), кислород-независимой системы - по уровню катионных белков (КБ) ПМЯЛ крови у белых мышей после иммунизации и в инфекционных процессах различной модификации с помощью питоэнзимохимических методов (Лецкой В.Б., 1973; Пигаревский В.Е., 1978).

Пирогенные свойства готового препарата вакцины чумной изучали по методике, описанной в ХД Государственной фармакопее (2008), на кроликах массой 1,5-2,5 кг.,, ,=

Показатель термостабшьности вакцины рассчитывали в соответствии с ФСП 42-8654-07.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы «МИНИСТАТ», которая позволяет определить среднее значение (М), среднеквадратическую ошибку (ш) при заданных значениях уровня и количестве степеней свободы.

Результаты исследований Выращивание популяции клеток вакцинного штамма К рЫ'ш ЕУ при температуре культивирования (21±1) °С.

Первый этап наших исследований был направлен на совершенствование вакцинного сырья в условиях измененного температурного режима культивирования микробов - снижения его до (21±1) °С (экспериментальная линия) вместо (27±1) °С (контроль), для чего выращивали штамм У. ре.ч1к ЕУ в бульоне

Хотпшгера при обеих температурах. В рядах проводили сравнительную характеристику микробной популяции, для чего определяли количество живых микробных клеток в различные сроки исследования (накопление биомассы) и число клеточных делений в каждый из исследуемых сроков, что позволило рассчитать время одной генерации. Эксперимент выявил, что хотя микробы биомассы, культивируемой при (21±1) °С, имеют более длительную фазу приспособления, чем при (27± 1) °С варианты (9 ч и 6 ч соответственно), однако в логарифмической фазе роста максимальное количество жизнеспособных особей в эксперименте достигает 954,5±9,1 млн. против 112,(Ж),4 млн. в контрольной линии (t =92,9). Через 48 ч (срок наблюдения) число живых микробных клеток в контроле опускается до 88,Ott 1,0 млн., а в эксперименте-до 155,0±5,8 млн. (t=l 1,4). Следовательно, абсолютные показатели живых клеток в сравниваемых образцах выше в биомассе с температурой культивирования (21±1) °С (таблица 1).

Таким образом, в условиях культивирования микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV при температуре (21±1) °С в бульоне Хотпшгера получена гораздо более жизнеспособная популяция, чем при (27±1) °С выращивании, исключая период адаптации (6-9 ч). Полученные результаты определили дальнейшие исследования, которые коснулись как получения большего числа живых особей при выращивании на плотной питательной среде, так и оценки устойчивости их к процессу замораживания - высушивания и последующему хранению. Для этого исследовали биомассы и полученные из них вакцины - опытные серии ((21± 1) °С) и контроль ((27±1) °С).

Через 48 час выращивания при обеих температурах накапливалось примерно одинаковое количество биомассы, при этом «урожай» с 1 мл питательной среды составлял не менее 4 млрд. м.к. Однако биологическая концентрация оказалась статистически выше (р<0,05) в сериях, выращиваемых три (21±1) °С. Так, процент живых микробных клеток через 48 ч составил 86,3±3,5 % у экспериментальных линий, и 57,3±3,9 % - у контроля, а их количество в суспензии -140,6±20,0 млрд./мл в опыте и 92,0±10,2 млрдУмл в контроле. Далее из обеих суспензий были приготовлены экспериментально-производственные серии вакцины чумной живой. После лиофилизации вновь проверили показатели жизнеспособности (таблица 2).

Таблица 1

Накопление биомассы Y. pestis EV при различных температурных режимах культивирования

Темгкра-тура выра-щнания. °С (21:1).......

Количество живых МАфобных клеток (мпн/мл) в заисимосм от возраста культуры (ч)

ie-

ход-

1,03

(2М)

1,03

1.03±

i,4

=£0,1

1,9 ¿ОД

4,4 ¿0,4

3,4

k>,3"

19,6±

: аз

58,4 753,0± ±3,0 ! 46.7

126,3t| 104,3 6,7 j 3.S.S

954,5 ± 9,1

112,0 ±0,4

742,5± 12,3

-99,8 : ±1,7

856,3 ± 28,4

93,3 ±0,9

27 : 30

81,9 ±| 1863 ± 6,6 j 25,7

113,0±; 106,5 11,2 i ±6,5

140,5 ± 2,6

129,3± 7Д

175,8±

__9.6_

142,5± 5.8

160,3± 6,0

1303± 13,6

186,3 ± 17,9

132, Si 9,8

180,0±! 155,(it: 19,9 I 5.8

112,0± 88,0 11,6 ±1,0:

5,6

38,6

9.3 ! 13,7

92,9

51,8

26,9

2,4

3,0

1,5

3,0

2,0

2,6

3,0 I 11,4

Примечание: t —степень достоверности различия средних арифметических

Таблица 2

Жизнеспособность вакцины чумной в зависимости от температуры выращивания после лиофплизации

Температура выращивания, °С (2Ш) Количество определений ......... 7 Концентрация микробных клеток

Обшая, млрдУмл 57.1Ы,7 Биалошческая % млрд/мл 56,817.2 31.6! 2,6

(27±1) 7 64,3±4,2 36.6т 1.6 23,7±2,2

1 - - 2,7 2,3

Выявлено, что экспериментальные серии, полученные при температуре выращивания (21±1) °С, проявили большую устойчивость к процессу замораживания-высушивания, чем контрольные. Расчет количества подкожных доз показал, что в опытном препарате их содержится 105, а в контрольном - 80.

Приготовленные экспериментально-производственные серии прошли контроль по всем показателям качества в НПЛ чумных вакцин и ЛБТК, а также в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, где данные серии признаны соответствующими всем требованиям ФСП на вакцину чумную.

Таким образом, как суспензия, так и вакцина, полученная при (21±1) °С культивирования, имеет преимущество по показателю жизнеспособности перед (27±1) °С контролем, при этом следует, очевидно, говорить о более выраженном периоде физиологической стабильности популяции (21±1) °С микробов.

Сравнительный анализ критериев качества различных экспериментальных образцов вакцины чумной живой

Следующий этап исследований был направлен на изучение препарата вакцины чумной живой, полученного при сочетанном изменении физико-биологического (температура выращивания) и количественного (концентрация микробных клеток и объем в ампуле) параметров.

Для этого проводили выращивание вакцинного штамма на матрацах при температуре (21±1) °С - экспериментальные серии, и (27±1) °С - контрольные серии. Из полученной биомассы бьши приготовлены серии вакцины чумной живой, отличающиеся по концентрации вакцинной.суспензии (90 и 20 млрд./мл) и объему вакцины в ампуле (2 и 1 мл соответственно). В полученных сериях определяли жизнеспособность, терМбсТабйльНоетЬ,. Повреждаемость, потерю в массе при высушивании, реактогенность.

Анализ полученных данных вновь показал, что температура выращивания оказывает существенное влияние на показатели жизнеспособности пре-

парата как до, так и после этапа лиофильного высушивания. Жизнеспособность препарата, выращенного при (21 ± 1) °С, практически во всех образцах превосходит таковую у вакцины, выращенной при (27±1) °С не только после высушивания, но и при хранении в течение двух лет в условиях «холодовой цепи» при (4±2) °С (таблица 3).

При сравнительной характеристике жизнеспособности вакцинных образцов выявлено, что во все сроки хранения при температуре (4±2) °С данный показатель был выше у экспериментальных серий вакцины, при этом даже через два года он превышал 35 %, в отличие от контроля, те регистрировалась жизнеспособность ниже 25 %. Следует заметить, что у исследованных образцов экспериментальной (21±1) °С вакцины, приготовленной с уменьшением количественно-объемных показателей, во все сроки наблюдения разница в жизнеспособности была существенно выше, чем у (27±1) °С аналогов (р<0,05).

Таблица 3

Жизнеспособность различных серий вакцины чумной живой

в процессе хранения при (4±2) °С, %

Температура оптическая коицентрацля оптическая концентрация

выращивания, 20 млрд/мл, 80млрд./мл,

°с объем в ампуле 1 мл объем в ампуле 2 мл

после через 1 через 2 после через 1 через 2

сушки год года сушки год года

(27±1) 26,8±3,0 24,3±0,8 24,2±1,2 28,1±0,9 24,4±1,2 24.1±1,б

(27±1) 30,8±2,6' • 30,2±0,3 25,Ш,3 30,6±3,1 25,2±],6 24,7±3,4

М±т 28,8±2,0 27,3±3,0 Г24,6±0,4 29,4±1,3 24,8±б,4 24,4±0,3

(2111) 35Д±2,6 32,4±1,2 30,1±2,4 36,1±1.7 34,3±0,6 29.3±3,6

(21±1) 49,2±7.3 43,6±3,9 39,8±0,8 53,4±4,8 44,5±2,2 42,9±1.3

(21±1) 43,8±4.8 40,2±0,5 36,6±2,2 - - -

(21±1) 37,7±3,5 35,8±1,9 29.1±1,2 - - -

(21±1) 38,4±3,0 38,1±1,6 35,2:0,7 ■■ ■ . - -

(21±1) 4 6,1 ±2,0 45,0±4,1 40,9±1,8 ■ ■ - - -

М±т 41,7±2.2 39,2±1,9 35,3±2,0 44.8±8,7 39,4±5,1 36.1±6,8

г 4,3 3,4 52 1,8 2,9 1.7

Воздействие стрессового температурного фактора (хранение при (37± 1) °С) на исследуемые образцы показало, что серии, полученные при температуре культивирования (21±1) °С, в целом обнаруживали большую резистентность к экстремальному воздействию, причем наиболее устойчивыми оказались образцы с меньшей концентрацией и объемом суспензии в ампуле, имеющие также меньшие показатели потери в массе при высушивании (1,7% против 2,4 % у контрольных). Процент жизнеспособности через 30 сут составил у таких серий 7,8±3,3, а у контрольных образцов - 3,6±0,8 % (р<0,05).

Была определена термостабильность опытных и контрольных серий вакцины. Достоверной разницы не выявлено, хотя в целом показатели всех серий соответствуют регламентированной норме (не менее 4 сут).

С помощью электронной микроскопии определили степень повреждаемости микробных клеток исследуемых образцов. Наименьший достоверный показатель повреждаемости оказался у серий, полученных при сочетанием изменении температурных и количественно-объемных характеристик биомассы - 4,0±0,2 %, тогда как в контроле он составил 7,5±0,6 % (р<0,05).

Суммированные данные описанных качественных показателей различных образцов вакцины представлены в таблице 4.

Таким образом, вакцина, полученная из культивируемой при (21±1) °С биомассы, по своим свойствам превосходит коммерческие образцы, при этом оптимальное сочетание физико-биологического (температура культивирования) и количественно-объемного (концентрация и объем в ампуле) параметров дает наилучшие достоверные (р<0,05) результаты по основным показателям качества, таким как жизнеспособность и стабильность свойств при хранении.

Таблица 4

Сравнительная характеристика жизнеспособности, термосгабильности

и повреждаемости вакцин, полученных при различных условиях выращивания и с различным объемом суспензии в ампуле

Т выращивания, °С Концентрация, млрд./мл Повреждаемость, % Жизнеспособность, % Термостабнль-ность, сут

(21±1) 75 6,3±0,3 53,4±4.8 9.6

20 4,0+0.2 40,7±2,7 12,5

(27±1) 90 7,5+0,6 30,6±3,1 10,7

21 5,4+0.7 30,8±2,6 10,8

В полученных сериях вакцины чумной живой определяли реактогенность по совокупным данным пирогенности и специфической безопасности. Отклонений экспериментальных серий от контрольных не выявлено.

Изучение штуногенности различных серий вакцины чумной регламентированным методом и на модели феномена «переживания»

Помимо жизнеспособности, основной критерий живой вакцины - ее иммуногенность, то есть способность создавать длительный (до Г года) и достаточный по напряженности иммунитет. Поскольку экспериментальные и контрольные серии были получены при сочетанном изменении температурного и количественно-объемного параметров, то нас интересовал их сопряженный иммунологический отклик.

Первоначально иммуногенные свойства экспериментальных и контрольных серий были изучены регламентированным двухэтапным методом на морских свинках и белых мышах (таблица 5).

Таблица 5

Иммуногенность вакцины чумной для белых мышей и морских свинок _ в зависимости от параметров суспензии_

Температура Концентрация. Объем в ЕО50. Ж.М.К.

выращивания, млрдУмл ампуле, мл для морских I для белых

°С свинок мышеи

" " (27 Н) 90 2 5852 4844

21 1 2601 7254

(21 ±1) 75 2 5206 9465

21 1 3468 ! 5971

Эксперимент выявил, что как опытные, так и контрольные образцы имеют достаточно высокие защитные свойства, так как показатель ЕБ50 во всех случаях имел допустимое значение.

Для более развернутой характеристики иммуногенных свойств экспериментальных и контрольных образцов были проведены исследования данного показателя на модели феномена «переживания» на белых мышах (таблица 6).

Таблица 6

Иммуногенность вакцинных препаратов для белых мышей в феномене . _«переживания»_

Вакцина Кол-во животных в опыте ЬОэд (жм.к. / П)с1)

ЬГ>5о шш ш5(, тах

Экспериментальная (21±1) °С 60 10960/219 27540/551 109600/2.192

Контрольная (27±1)°С 60 3900/78 10950/219 38900/778

Анализ полученных данных показал, что препараты на основе штамма У. р^Ш ЕУ имеют высокий уровень защиты, при этом экспериментальные образцы (ЬО50 27540 ж.м.к.) обладают почти двукратным преимуществом по сравнению с контролем (10950 ж.м.к.).

Оценка цитоэнзимохимических показателей полиморфпоядерных лейкоцитов в различных типах ипфекционно-ващинального процесса Для дополнительной оценки эффективности бактерицидной защиты при иммунизации чумной вакциной и последующем заражении проведены исследования по цитоэязимохимической активности ПМЯЛ крови белых мышей. Исследовались содержание КБ и активность МПО в различных схемах чумной инфекции и вакцинального процесса. Полученные данные сравнива-

ли с контролем (искомые показатели у интактных животных), который составил для КБ -1,6±0,03 и для МПО - 1,09±0,Й7.

Показатели бактерицидной активности ПМЯЛ у подопьгшых животных исследовали соответственно методике определения иммуногенности коммерческого препарата вакцины чумной живой, изложенной в действующей ФСП на препарат. Аналш полученных данных выявил, что иммунизация вызывает снижение показателей бактерицидных систем ПМЯЛ у белых Мышей в процессе формирования поствакцинального иммунитета к чуме. ''

После заражения иммунных животных вирулентной культурой (таблица 7) происходило снижение содержания КБ во всех группах по сравнению 6 Ш значением к моменту заражения, особенно на 3-7 сут, что, по-видимому, связано с разгаром инфекционного процесса.

В динамике активности МПО у данных животных также отмечается наименьшее ее значение в период развития чумНой инфекции. На 14 и 21 Сут четко прослеживается разделение подопытных животных на три группы. В первой группе, где животные проиммунизированы наименьшей дозой (су-биммунизирующей - 800 м.к.), регистрируется снижение уровня МПО до 0,98±0,05. Во второй, промежуточной, группе, где животные были проиммунизированы дозой 4x103 м.к., показатели МПО достигли 1,02±0,02. В третью группу объединены животные, получившие эффективные иммунизирующие дозы (2х104 и 105 м.к.), показатель МПО у которых превысил контрольный и составил 1,13±0,03.

Таблица 7

Бактерицидная активность ПМЯЛ белых мышей, иммунизированных против чумы, после заражения К рех/я 461

Сроки исследования Группы животных / дозы вакцины (ж.м.к.)

(сут) 1/8х10л II/4><103 III/2* 104 IV /105

фон КБ 1,60±0,03 1,60±0,03 1,60±0,03 1,60±0,03

МПО 1,09±0,07 1,09±0,07 1,0а±0,07 1,09±0,07

1 КБ 1,26±0,11 1,38±0,11 1,19±0,04 1,21 ±0,07

МПО 0,78±0,03 0,73±0,04 0,61±0,05 0,96±0,13

3 КБ 1,18±0,03 1,14±0,06 1,13±0,05 1,30±0,11

МПО 0,67±0,05 0,66±0,05 0,66±0,05 ' 0,61 ±0,07

7 КБ 1,05±0,02 1,16±0,11 1,30±0,05_1 1,18±0,08

МПО 0,72±0,03 0,59±0,04 0,73±0,05; 1 0,71±0,06

14 КБ 1,14±0,05 1,18±0,03 1,24±0,09 1.221.0.11

МПО 0,80±0,04 0,88±0,05 0,80±0,04 0,78±0,04

21 КБ 1,14±0,02 1,19±0,08 1,21±0,03 1,21±0,02

МПО 0,98±0,05 1,02±0,02 1,14±0,04 1,12±0,02

Кол-во животных в опыте 15 14 10 11

Кол-во выживших 5 7 7 9

% выживших (М±т) 30,2±12,2 50±13,9 70±15,3 81,8±12,2

Изученный далее инфекционный процесс в модели феномена «переживания» также показал довольно четкое и стереотипное реагирование обоих изучаемых факторов бакгерицидности в данной экспериментальной системе. Существенное снижение уровня КБ в динамике развития инфекционного процесса на 1,3,7 сут сменялось постепенным нарастанием его активности на 14 и 21 сут наблюдения, причем цифровые значения, возможно, свидетельствуют об интегрирующем воздействии вирулентного, либо вакцинного штаммов в разных фазах эксперимента. Сопряженно реагирует и МПО, закономерно повторяя динамику снижения активности на 1,3 и, в особенности, на 7 сут наблюдения. Однаю данная система снова довольно быстро восстанавливается — уже на 14 сут ее активность достигает величины на старте инфекционного воздействия, а на 21 сут поднимается до контрольных (интактных) показателей.

Таким образом, изменение показателей КБ и МПО может служить основанием для характеристики иммунной активности организма в течение инфекционного процесса, а также позволяет оценить степень реакции на введение вакцинного штамма, которая говорит о формировании иммунитета, что подтверждают и литературные источники (Руднев С.М., Локтев H.A., 1992; Руднев С.М., Локтев H.A., Дальваданц В.Г., 1993).

ВЫВОДЫ

1. Культивирование микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis ЕV при температуре (21±1) °С как в бульоне, так и на агаре, обеспечило накопление гораздо более жизнеспособной их популяции, чем при (27± 1) °С.

2. Культуры штамма Y. pestis ЕV чумного микроба, выращенные в АКМ-Ш при температуре (21±1) °С, целесообразно использовать для приготовления вакцинного препарата в связи с высоким показателем количества живых микробных клеток и устойчивостью их к лиофильному высушиванию и последующему хранению.

3. Разработан и включен в промышленный регламент препарат вакцины со сниженным количеством доз в ампуле (от 20 до 50), являющийся более экономичной и удобной формой для практики прививочных мероприятий в небольших коллективах.

4. Экспериментальные образцы вакцины чумной живой, полученной при оптимальном сочетании температурных и количественных параметров вакцинной суспензии, характеризуются наилучшими качественными показателями готового препарата, такими как жизнеспособность и стабильность свойств при хранении, что сопряжено с наименьшими показателями повреждаемости.

5. Иммуногенные свойства различных серий вакцины чумной, изученные в системе, воспроизводящей феномен «переживания» на белых мышах, соответствуют предъявляемым к вакцинам требованиям. Обоснована возможность для внедрения указанного иммунологического приема наряду с классическим методом оценки иммуногенности вакцины чумной живой на модели белых мышей.

6. Устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией ПМЯЛ, обеспечиваемой главным образом МПО при вспомогательном участии КБ. Изменение уровня активности МПО и КБ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ TIO ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. Будыка, Д.А. Перспективы совершенствования живой чумной вакцины за счет стабилизации показателя живых микробных клеток / Д.А. Будыка, Е.И. Слынько, Г.Ф. Иванова, Д.В. Сергеев, Н.В. Абзаева // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы: Мат. международного юнгр., посвящ. 80-летию Санкт-Петербургского инсг. им. Пастера (Санкт-Петер-6ypi; 3-5 сентября 2003 г.). - Санкт-Петербург, 2003. -С. 128-129.

2. Ефременко, A.A. Иммуногенные свойства экспериментальных серий вакцины чумной живой сухой / A.A. Ефременко, ДА. Будыка, Н.В. Абзаева // Естествознание и 1уманизм: Сборник научных работ. -Томск, 2005. -Т. 2, № 1 -С. 38.

3. Шиянова, Е.С. Контроль биотехнологии производства и качества вакцины чумной живой сухой / Е.С. Шиянова, О.И. Коготкова, ДА. Будыка, Г.И. Лямкин, Н.В. Чурикова, A.A. Зуенко, В.Д. Майская, A.A. Ефременко, Г.Ф. Иванова, Д.В. Ефременко, Н.В. Абзаева // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Мат. VII Межгосударственной научно-практ. конференции государств-участников СНГ. -Оболенск, 2006. - С. 256-257.

4. Иванова, Г.Ф. Сравнительное изучение эффективности противочумных вакцин, полученных из биомасс, выращенных при (21±1) °С / Г.Ф. Иванова, Д.А. Будыка, Н.В. Абзаева // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. - Ставрополь, 2007. - Вып. 2. - С. 186-188.

5. Абзаева, Н.В. Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов крови белых мышей в динамике чумной инфекции / Н.В. Абзаева // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Мат. научно-практ. конференции, 21 -22 марта 2007 г. - Ставрополь, 2007. - С. 3-4.

6. Абзаева, Н.В. Активность факторов бактерицидности полиморфноядер-ных лейкоцитов крови белых мышей в феномене «переживания» / Н.В. Абзае-

ва, Д.А. Будыка, Г.Ф. Иванова, С.М. Руднев II Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Мах гег/чко-практ. конференции 21-22 марта 2007 г. - Ставрополь, 2007.-С. 4-6.

7. Абзаева, Н.В. Исследование показателей активности бактерицидных систем ПМЯЛ в периферической крови белых мышей в процессе иммунизации и заражения чумной инфекцией / Н.В. Абзаева, Д.А. Будыка, Г.Ф. Иванова, С.М. Руднев // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге Россш: Мат. науч-но-практ. конференции, 21-22 марта 2007 г. - Ставрополь, 2007. - С. 6-8.

8. Будыка, Д.А. Сравнительная оценка препаратов вакцины EV, приготовленных из различных по плотности и объему суспензий, в процессе трехлетнего хранения / Д.А. Будыка, A.A. Ефременко, Г.Ф. Иванова, Н.В. Абзаева, A.A. Фисун, С.Е. Гостшцева, В. Д. Майская, А.И. Бондаренко // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Мат. научно-пракг. конференции, 2 ] -22 марта 2007 г. - Ставрополь, 2007. - С. 54-56.

9. Абзаева, Н.В. Повышение показателя живых микробных клеток в препарате чумной вакцины EV за счет оптимального сочетания физико-биологического и количественного параметров ее приготовления / Н.В. Абзаева, Д.А. Будыка, Г.Ф. Иванова, С.Е. Гостшцева, A.A. Фисун, А.И. Бондаренко // Биологическая безопасность в современном мире: Мат. научно-пракг. конференции молодых ученых и специалистов научно-иссл. учреждений Роспотребнадоора (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г).-Оболенск, 2009.-С. 212-214.

10. Будыка, Д.А. Сравнительное изучение иммуногенных свойств живой чумной вакцины ЕВ, полученной при различных температурах культивирования / Д.А. Будыка, Н.В. Абзаева, С.Е. Гостищева, JI.B. Ляпустина // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: Тез. докл. междунар. научно-практ. конференции 14-15 мая, 2009г.-Новосибирск, 2009.-С. 229-232.

11. Будыка, Д.А. Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов крови белых мышей привитых против чумы и в различных схемах инфицирования чумной инфекцией / ДА. Будыка, Н.В. Абзаева, С.М. Руднев, Г.Ф. Иванова, АЛ. Фисун, С.Е. Гостищева, А.И. Бовдаренко II Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2009.-№ 2 (100). - С. 56-60.

12. Будыка, Д.А. Сравнительный анализ экспериментальных серий вакцины чумной живой по показателям жизнеспособности и термостабильности / Д.А. Будыка, Н.В. Абзаева, Г.Ф. Иванова, С.Е. Гостищева, A.A. Фисун, JI.B. Ляпустина // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2009. -№4 (102).-С. 68-71.

Подписано в печать 15.03.2010 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,1 Уч.-изд.л. 0,83 Бумага офсетная _Тираж 100 экз. __Заказ 66

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, I.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абзаева, Наталья Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБНОЙ СУСПЕНЗИИ У рс^ ЕУ В ПРОЦЕССЕ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ЧУМНОЙ ЖИВОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЕЕ

ЭФФЕКТИВНОСТИ (обзор литературы).

1.1 Вакцина чумная живая, характеристические особенности и пути повышения показателя жизнеспособности, как основной компоненты качества.

1.2 Иммуногенность вакцины чумной живой.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Характеристика вакцинных противочумных препаратов и вирулентных культур.

2.1.2 Характеристика питательных сред и стабилизаторов.

2.1.3 Характеристика лабораторных животных.

2.1.4 Использованная аппаратура.

2.1.5 Производственные критерии качества вакцины чумной живой.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Приготовление экспериментальных серий вакцины чумной живой.

2.2.2 Определение фаз роста микробных клеток К реБ^я ЕУ.

2.2.3 Определение повреждаемости микробных клеток.

2.2.4 Определение жизнеспособности микробных клеток.

2.2.5 Подготовка вирулентного штамма.

2.2.6 Определение иммуногенности вакцин.

2.2.6.1 Изучение иммуногенности в модели феномена переживания».

2.2.7 Определение бактерицидной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

2.2.8 Определение пирогенности.

2.2.9 Определение специфической безопасности.

2.2.10 Определение термостабильности.

2.2.11 Определение потери в массе при высушивании:.

2.2.12 Статистическая обработка материала.

Глава 3 ВЫРАЩИВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ВАКЦИННОГО ШТАММА К реБйэ ЕУ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (21±1) °С И ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ СЕРИЙ ВАКЦИНЫ.

Глава 4 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕГЛАМЕНТИРОВАННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ СЕРИЙ ВАКЦИНЫ ЧУМНОЙ ЖИВОЙ.

4.1 Сравнительная характеристика различных серий вакцины чумной по показателю жизнеспособности.

4.2 Анализ термостабильности различных серий препарата.

4.3 Анализ динамики жизнеспособности образцов вакцины чумной живой в зависимости от параметров вакцинной суспензии в условиях длительного температурного воздействия.

4.4 Сравнительный анализ различных серий вакцины чумной живой по степени повреждаемости, жизнеспособности и термостабильности.

4.5 Изучение реактогенности различных серий вакцины чумной живой.

Глава 5 ОЦЕНКА ИММУНОГЕННОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ СЕРИЙ ВАКЦИНЫ ЧУМНОЙ, ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОЭНЗИМОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ БЕЛЫХ МЫШЕЙ НА ФОНЕ ИММУ

НИЗАЦИИ И ИНФИЦИРОВАНИЯ.

5.1 Изучение иммуногенности различных серий вакцины чумной регламентированным методом.

5.2 Изучение иммуногенности различных серий вакцины чумной в феномене «переживания».

5.3 Оценка цитоэнзимохимических показателей полиморфно-ядерных лейкоцитов белых мышей, привитых против чумы, и в различных схемах инфицирования У. реяИз.

5.3.1 Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов белых мышей, инфицированных возбудителем чумы.

5.3.2 Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов белых мышей, привитых против чумы.

5.3.3 Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов белых мышей, привитых против чумы, после заражения.

5.3.4 Бактерицидная активность полиморфноядерных лейкоцитов белых мышей на модели феномена «переживания».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины"

Актуальность проблемы. Живые вакцины представляют собой имму-нопрофилактические препараты, состоящие из наследственно измененных форм возбудителей инфекционных болезней. Применение вакцинации как средства специфической профилактики особо опасных инфекций в течение длительного времени свидетельствует о сохранении ее весомой роли в системе противоэпидемических мероприятий (Исупов И.В., Бугоркова С.А., Ку-тырев В.В., 2004). В нашей стране для профилактики чумной инфекции используют живую вакцину из штамма Yersinia pestis EV.

Стабилизация качества препарата, а именно необходимость сохранения всех свойств микробных клеток в течение длительного времени, является наиболее значимым вопросом в производстве живых вакцин. Последнее время в орбите научных интересов, касающихся совершенствования биотехнологии производства вакцины чумной живой, оказались методические приемы, направленные на дальнейшую стандартизацию коммерческого препарата по показателю жизнеспособности клеток К pestis EV (Ракитина E.JL, 1988; Будыка Д.А., 2002; Ефременко A.A., 2005). Современная тактика совершенствования вакцины чумной направлена на разработку и внедрение в производство дополнительных условий стабилизации числа живых микробных клеток в прививочной дозе коммерческой вакцины.

В результате ранее проведенных исследований была разработана производственная биотехнология вакцины чумной живой с содержанием от 20 до 50 доз в ампуле (Ефременко A.A., 2005). Полученный с нашим участием по новой биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и включен в действующий промышленный регламент № 01897080-09-09 на производство вакцины чумной живой.

Полученные результаты определяют целесообразность и перспективность доработки и внедрения пониженной температуры культивирования биомассы (21±1) °С в процесс производства вакцины чумной живой. Кроме того, приведенные сведения являются достаточным экспериментально-теоретическим обоснованием для отработки и внедрения в биотехнологию вакцины чумной живой сочетанного воздействия обоих указанных выше факторов: физико-биологического и количественно-объемного.

Задачи исследования:

5. Изучить иммуногенность и напряженность иммунитета, индуцируемого вакциной чумной, полученной из микробных клеток при предлагаемых условиях приготовления суспензии. Определить бактерицидную активность полиморфноядерных лейкоцитов в периферической крови белых мышей при инфекционных и вакцинных процессах в качестве косвенных показателей их иммунологической перестройки.

Научная новизна работы. Впервые разработаны и внедрены температурные режимы культивирования вакцинной биомассы в градиенте (21±1) °С, вместо регламентированных (27±1) °С, что позволяет получить более высокий исходный показатель живых микробных клеток как в биомассе, так и в вакцине, полученной из нее.

Впервые предложен и реализован научно-методический подход к повышению жизнеспособности микробных клеток У. резйь ЕУ в вакцинной суспензии за счет сочетанного применения оптимальных температурного (21±1) °С и количественно-объемного ((1-4)х1010 микробных клеток в объеме 1 мл в ампуле) параметров в биотехнологии производства вакцины чумной живой. Показано, что в условиях регламентированного режима лиофилиза-ции повышается эффективность стабилизации свойств микробных клеток у препарата с меньшей концентрацией вакцинной суспензии и снижением ее объема в ампуле, особенно у образцов со сниженной температурой культивирования (21 ± 1) °С. Впервые показано, что устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией полиморфноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), обеспечиваемой главным образом кислородзависимой мие-лопероксидазой (МПО) при вспомогательном участии кислороднезависимых неферментных катионных белков (КБ). Изменение уровня активности МПО и КБ ПМЯЛ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Отработан диапазон пониженной температуры культивирования микробной биомассы вакцины чумной живой (21±1) °С вместо регламентированного (27±1) °С, позволяющий увеличить число живых микробных клеток в готовом препарате на 12-20 % и стабилизировать его в процессе хранения.

Практическая ценность работы подтверждена следующими документами:

2. Методические рекомендации «Определение иммуногенности вакци-' ны чумной живой в модели феномена «переживания» на белых мышах», утверждены директором ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора (протокол заседания Ученого Совета института от 16 апреля 2009 г. № 4).

3. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 01897080-09-09, предусматривающие выпуск вакцины как при температуре культивирования

27±1) °С, так и при (21 ±1) °С, утверждены в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасе-вича Роспотребнадзора 22.12.2009г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Пониженная температура культивирования биомассы У. рсбИб ЕУ стимулирует биологическую активность микробных клеток, что позволяет увеличить количество живых микробных клеток в вакцине.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы бы ли. представлены на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», посвященном 80-летию Санкт-Петербургского института им. Пастера (Санкт-Петербург, 3-5 сентября, 2003); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 21-22 марта, 2007); научно-практической конференции «Основные итоги научно-практической деятельности молодых ученых и специалистов СтавНИПЧИ» (Ставрополь, 9 июня, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля, 2009); научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 1415 мая, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках двух государственных тем НИР «Стабилизация показателя живых микробных клеток в чумной вакцине за счет оптимизации некоторых количественных параметров на этапах приготовления коммерческого препарата» (№ Госрегистрации 01200109089); «Разработка научно-методических подходов к повышению жизнеспособности микробных клеток штамма ЕВ чумного микроба в вакцинной суспензии в биотехнологии приготовления вакцины чумной живой сухой» (№ Госрегистрации 01200700918), отражено в 12 опубликованных научных работах, в том числе две работы - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 26 таблицами и 7

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Абзаева, Наталья Вячеславовна

выводы

1. Культивирование микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба У. резйз ЕУ при температуре (21±1) °С как в бульоне, так и на агаре, обеспечило накопление гораздо более жизнеспособной их популяции, чем при (27±1) °С.

2. Культуры штамма У. реэНз ЕУ чумного микроба, выращенные в АКМ-Ш при температуре (21±1) °С, целесообразно использовать для приготовления вакцинного препарата в связи с высоким показателем количества живых микробных клеток и устойчивостью их к лиофильному высушиванию и последующему хранению.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Живые вакцины не потеряли своей актуальности как средство профилактики инфекционных заболеваний. На территории России и сопряженных стран расположены активные природные очаги чумной инфекции, а значит вакцина против чумы сохраняет свою роль в системе противоэпидемических мероприятий (Кокушкин A.M., Наумов A.B., Кологоров А.И., Марысев В.Б., 1994; Дальвадянц С.М., Сероглазое В.В., Белобородов P.A. и др., 1997; Они-щенко Г.Г., 1998).

В настоящее время в Ставропольском противочумном институте выпускается препарат вакцины чумной живой в виде лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. Препарат представляет собой лиофилизированную из объема 1 или 2 мл живую культуру Y. pestis EV линии НИИЭГ. Главной характеристикой качества препарата чумной вакцины является ее жизнеспособность, а так же стабильность этого показателя в процессе длительного хранения. Согласно ФСП 42-8654-07 количество живых микробных клеток в готовом препарате должно быть не менее 25 %. Вторым наиважнейшим свойством живой чумной вакцины является ее иммуногенность. ED50 не должна превышать для морских свинок 1x104, для белых мышей - 4x104 живых микробных клеток. Однако, несмотря на четкую регламентированность всех этапов производства вакцины чумной, в различных сериях готового препарата отмечается достаточно широкая вариабельность этих показателей. Так, жизнеспособность коммерческих серий может колебаться от 25 до 50 % при оптической концентрации микробных клеток от 50 до 100 млрд./мл. (Ракитина E.JL, 1988).

Согласно литературным данным, повышение и стабилизация жизнеспособности препарата вакцины чумной живой зависит от множества факторов: условий культивирования микробных клеток и фаз их роста, концентрации бактериальной суспензии, используемого стабилизатора, параметров лиофилизации, условий хранения (Данилова М.В., Надирова И.М., Кудрявцев В.И., 1967; Долинов К.Е., 1969; Аркадьева З.А., 1983; Файбич М.М., 1983; Будыка Д.А., Тинкер А.И., Бондаренко А.И., 2000; Ефременко A.A., 2005).

Что касается температуры культивирования микробных клеток вакцинного штамма, то согласно ПР на производство вакцины чумной она должна быть (27±1) °С. В таких условиях культивирования чумной микроб интенсивно размножается и обладает высокой жизнеспособностью, в то время как при 37 °С эти показатели значительно ниже на всех фазах роста (Алутин И.М., 1974). Однако этот же автор приводит данные о том, что снижение температуры культивирования чумного микроба до 20-25 °С повышает биологическую активность микробных клеток. Применительно к вакцинному штамму это означает, что качество вакцины может улучшиться за счет возрастания в биомассе процента живых микробов (Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Гюлушанян К.С., Руднев С.М., 1998; Иванова Г.Ф., Будыка Д.А., Абзаева Н.В., 2007; Абзаева Н.В., Будыка Д.А., Иванова Г.Ф. и др., 2009).

Экспериментально доказано, что вакцина с измененными количественно-объемными характеристиками (снижение концентрации и объема суспензии в ампуле) по своим характеристикам превосходит стандартные коммерческие образцы (Свиридова JI.C., 1963; Тинкер А.И., Будыка Д.А., Верховце-ва Г.Н., Печников Н.Е., 1991; Будыка Д.А., 2002; Ефременко A.A., 2005; 2007). Более сбалансированное соотношение микробных клеток со стабилизатором (среда высушивания) позволило достичь состояния глубокого анабиоза в процессе лиофилизации. Вакцина с уменьшенным количеством доз в ампуле (от 20 до 50), имеющая объем 1 мл, включена в ПР на вакцину чумную живую и может быть использована для планового практического применения, дополняя арсенал профилактических препаратов для массового применения против чумы.

Наши исследования были направлены на совершенствование вакцинного сырья в условиях измененного температурного режима культивирования микробов - снижения его до (21±1) °С (экспериментальная линия) вместо (27±1) °С (контроль). Для этого проводили выращивание штамма У. pestis EV в бульоне при различных температурах. В обоих рядах проводили сравнительную характеристику микробной популяции, для чего определяли количество ж.м.к. в различные сроки исследования (накопление биомассы) и число клеточных делений в каждый из исследуемых сроков, что позволило рассчитать время одной генерации. Эксперимент выявил, что хотя микробы биомассы, культивируемой при (21±1) °С, имеют более длительную фазу приспособления, чем (27±1) °С варианты (9 ч и 6 ч соответственно), однако в логарифмической фазе количество жизнеспособных особей в эксперименте достигает 950 млн. против 100 млн. у контрольной линии. Через 48 ч (срок наблюдения) число живых микробов в контроле опускается до 90 млн., а в эксперименте — до 155 млн. Следовательно, абсолютные показатели живых клеток в сравниваемых образцах выше в биомассе с температурой культивирования (21 ±1) °С.

Что касается более детальной характеристики фаз роста, то во все сроки исследования число клеточных делений в обоих образцах мало отличается, как и время одной генерации в минутах, хотя некоторые отличия, подтверждающие общую картину жизнеспособности микробов обоих популяций, все же выявлены.

Таким образом, в условиях культивирования микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV при температуре (21±1) °С в бульоне получена гораздо более жизнеспособная популяция, чем при (27±1) °С выращивании, исключая период адаптации, который составил 6-9 ч. Полученные результаты определили дальнейший круг исследований, который коснулся как получения большего числа живых особей при выращивании на плотной питательной среде, так и оценки устойчивости микробных клеток к процессу замораживания-высушивания и последующему хранению. Для этого исследовали биомассы, выращенные при различных условиях культивирования, и вакцину, полученную из них - опытные образцы ((21±1) °С) и контроль ((27±1) °С).

Через 48 ч выращивания при обеих температурах накапливалось примерно одинаковое количество биомассы вакцинного штамма, при этом «урожайность» его обеспечивала выход с 1 мл питательной среды не менее 4 млрд. м.к. Однако биологическая концентрация оказалась статистически выше у образцов, выращиваемых при (21±1) °С. Так, процент живых микробов через 48 ч выращивания составил 86,3±3,5 у экспериментальных линий, и 57,3±3,9 у контроля (1=5,5), а количество живых микробов в суспензии было 140,6±20,0 млрд./мл в опытных и 92,0±10,2 млрд./мл в контрольных образцах (1=2,2).

Далее из обеих суспензий были приготовлены экспериментально-производственые серии вакцины чумной живой. После лиофилизации вновь проверили показатели жизнеспособности. Выявлено, что опытные образцы, полученные при температуре выращивания (21±1) °С, проявили большую устойчивость к процессу замораживания-высушивания (процент жизнеспособных клеток составил 56,8±7,2, а их количество — 31,6±2,6 млрд./мл), чем контроль (жизнеспособных м.к. 36,6±1,6 % и 23,7±2,2 млрд./мл). Расчет подкожных доз в показал, что в опытном препарате их содержится 105, а в контрольном - 80. Приготовленные экспериментально-производственные серии прошли контроль по всем показателям качества в НТО! чумных вакцин и ЛБТК, а также в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, где полученные серии признаны соответствующими всем требованиям НД.

Таким образом, как суспензия, так и вакцина, полученная при (21±1) °С культивирования, имеет преимущество по показателю жизнеспособности перед (27±1) °С контролем, при этом следует очевидно говорить о более выраженном периоде физиологической стабильности популяции (21±1) °С микробов.

Следующий этап исследований был направлен на изучение препарата вакцины чумной, полученного при сочетанном изменении физико-биологического (температура выращивания) и количественного (концентрация и объем в ампуле) параметров.

Для этого проводили выращивание вакцинного штамма на матрацах при температуре (21±1) °С - экспериментальные серии, и (27±1) °С - контрольные серии. Из полученной биомассы были приготовлены серии вакцины чумной живой, отличающиеся по концентрации вакцинной суспензии (90 и 20 млрд./мл) и объему вакцины в ампуле (2 и 1 мл соответственно). В полученных сериях определяли жизнеспособность, термостабильность, повреждаемость, потерю в массе при высушивании, реактогенность.

Анализ полученных данных вновь показал, что температура выращивания оказывает существенное влияние на показатели жизнеспособности препарата как до, так и после этапа лиофильного высушивания. Так, у контрольных образцов, разлитых в ампулу по 1 мл процент жизнеспособности до лиофилизации составил 39,8±3,3, а после - 28,8±2,0; у серий из этой же биомассы, но разлитой по 2 мл - 43,8±2,6 и 29,4±1,3 % соответственно. Что касается образцов, полученных из биомассы, выращенной при (21±1) °С, то жизнеспособность вакцины, разлитой по 1 мл составила 53,2±3,0 % до лиофилизации и 41,7±2,2 % - после; разлитой по 2 мл - 52,9±9,8 и 44,8±8,7 % соответственно. Показатель жизнеспособности полученных экспериментальных и контрольных серий был изучен при хранении в течение двух лет в условиях «холодовой цепи» - (4±2) °С, а также в условиях экстремального воздействия повышенной температуры (37±1) °С на препарат в течение 30 сут.

При сравнительной характеристике жизнеспособности вакцинных образцов выявлено, что во все сроки хранения при температуре (4±2) °С данный показатель был выше у экспериментальных серий вакцины, при этом даже через два года он превышал 35 %, в отличие от контроля, где регистрировалась жизнеспособность ниже 25 %. Следует заметить, что у исследованных образцов экспериментальной (21±1) °С вакцины, приготовленной с уменьшением количественно-объемных показателей, во все сроки наблюдения разница в жизнеспособности была существенно выше, чем у (27±1) °С аналогов.

Воздействие стрессового температурного фактора на исследуемые образцы показало, что серии, полученные при температуре культивирования (21±1) °С, в целом обнаруживали большую резистентность к экстремальному воздействию, причем наиболее устойчивыми оказались образцы с меньшей концентрацией и объемом суспензии в ампуле, имеющие также меньшие показатели потери в массе при высушивании (1,7 % против 2,4 % у контрольных). Процент жизнеспособности через 30 сут хранения при повышенной температуре составил у таких серий 7,8±3,3 (у контрольных образцов — 3,6±0,8 %).

Была определена термостабильность опытных и контрольных серий вакцины чумной живой. В среднем, термостабильность экспериментальных серий составила 11,8±1,0 сут против 10,8±0,1 сут у контроля. Здесь особенно заметна тенденция к увеличению срока термостабильности у вакцины со сниженными количественно-объемными параметрами (до 14,3 сут), хотя в целом показатели всех серий соответствуют регламентированной норме (не менее 4 сут).

С помощью электронной микроскопии определили степень повреждаемости микробных клеток исследуемых образцов. Наименьший показатель повреждаемости оказался у серий, полученных при сочетанном изменении температурных и количественно-объемных характеристик биомассы -4,0±0,2, что на 47 % меньше, чем аналогичный показатель в сериях, полученных в регламентированных условиях (7,5±0,6). Между тем, как в сериях вакцины, полученных при изменении только одного параметра (температура культивирования или объем и концентрация в ампуле), отличие от серий, приготовленных согласно ПР, составляет 16 % (6,3±0,3) и 28 % (5,4±0,7) соответственно. При этом микробные клетки вакцинного препарата, выращенного при (21±1) °С, имели меньший размер в сравнении с микробными клетками контрольных образцов (0,670±0,0275 и 0,815±0,015 мкм соответственно). В целом, экспериментальная вакцина с меньшим процентом повреждаемости показала существенно более высокую жизнеспособность (47,1±6,3 %) по сравнению с контрольными образцами (30,7±0,1 %).

Таким образом, вакцина, полученная из культивируемой при (21±1) °С биомассы, по своим свойствам превосходит коммерческие образцы, при этом сочетание физико-биологического (температура культивирования) и количественно-объемного (концентрация и объем в ампуле) параметров дает наилучшие результаты по основным показателям качества, таким как жизнеспособность, стабилизация свойств при хранении и термостабильность.

В полученных сериях вакцины чумной живой определяли реактоген-ность по совокупным данным пирогенности и специфической безопасности.

Результаты определения безвредности показали, что морские свинки, которым вводили как экспериментальные, так и контрольные образцы, не теряли в весе, у животных не было отмечено изменений, характерных для специфического инфекционного процесса (обширные кровоизлияния, очаги воспаления, узелки, абсцессы), и роста чумного микроба в посевах из крови и легких.

Пирогенные свойства изучали по методике, описанной в XII Государственной Фармакопее (2008). Как следует из результатов исследований, вакцина чумная живая обоих образцов обладала определенными пирогенными свойствами, что согласовалось с данными литературы (Тинкер А.И., Печни-коваИ.В., 1978). В сравнении с контрольными сериями, пирогенные свойства вакцины чумной живой, приготовленной с изменением температурного режима культивирования, обладали более низкими показателями, а тиомочеви-новая среда высушивания и 0,9 % раствор натрия хлорида не вызывали выраженной пирогенной реакции.

Помимо жизнеспособности, основной критерий живой вакцины — ее иммуногенность, то есть способность создавать длительный (до 1 года) и достаточный по напряженности иммунитет. Поскольку экспериментальные и контрольные образцы были получены при сочетанном изменении температурного и количественно-объемного параметров, то нас интересовал их сопряженный иммунологический отклик.

Первоначально иммуногенные свойства экспериментальных и контрольных серий были изучены регламентированным двухэтапным методом на морских свинках и белых мышах. Полученные данные выявили, что как опытные, так и контрольные образцы имеют достаточно высокие защитные свойства, так как показатель ED5o во всех случаях имел допустимое значение. На морских свинках просматривается тенденция к увеличению иммуноген-ных свойств (21±1) °С вакцины в сравнении с (27±1) °С за счет уменьшения эффективной иммунизирующей дозы (3468 ж.м.к. против 6016 ж.м.к.).

Согласно литературным данным, иммуногенность препарата вакцины чумной живой можно изучать также на модели феномена «переживания» (Голубева В.К, Анисимова Т.И., 1965; Будыка Д.А., Тинкер А.И., Иванова Г.Ф., Ракитина E.JL, 1987; Будыка Д.А., 2002). Для более развернутой характеристики иммуногенных свойств экспериментальных и контрольных образцов такие исследования были проведены как на белых мышах, так и на морских свинках. Анализ полученных данных при воспроизведении феномена «переживания» на белых мышах показал, что препараты на основе штамма Y. pestis EV имеют высокий уровень защиты, при этом экспериментальные образцы обладают почти двукратным преимуществом по сравнению с контролем (LD50 27540 ж.м.к. против 10950 ж.м.к.).

Что касается морских свинок, то полученные в эксперименте данные подтвердили литературные сведения о том, что проявление феномена «переживания» на данной биомодели зависит от индивидуальной иммунобиологической реактивности животных, и реализация его происходит не всегда (Гинсбург H.H., 1969; Анисимова Т.И., Свинцова Е.М., 1976).

Для дополнительной оценки инфекционного воздействия вирулентного штамма чумного микроба, а также эффективности бактерицидной защиты при иммунизации чумной вакциной и последующем заражении проведены исследования по цитоэнзимохимической активности ПМЯЛ крови белых мышей. Исследовались содержание КБ и активность МПО в инфекционном и вакцинном процессе. Полученные данные сравнивали с контролем (искомые показатели у интактных животных), который составил для КБ - 1,60±0,03 и для МПО - 1,09±0,07.

Вначале исследуемые показатели определяли у животных, инфицированных различными дозами вирулентного штамма У. рея/и 461. Опыт показал, что содержание КБ в ПМЯЛ периферической крови достоверно снижается во всех группах и остается ниже уровня контроля во все сроки наблюдения, все же постепенно повышаясь по мере затухания инфекционного процесса у выживших животных I и II групп, зараженных 2-3 и 10 микробными клетками вирулентного штамма (0,95±0,03 и 1,04±0,12 соответственно). Аналогичная динамика наблюдается и у МПО, однако снижение активности фермента к 7 сут после заражения сменяется у выживших животных повышением его на 10 сут до уровня контроля (1,11±0,08 в I группе, зараженной 2-3 м.к. и 1,04±0,02 во II группе, зараженной 10 м.к.).

Далее показатели бактерицидной активности ПМЯЛ у подопытных животных исследовали соответственно методике определения иммуногенности коммерческого препарата вакцины чумной живой, изложенной в действующей ФСП на вакцину чумную. Анализ полученных данных выявил, что иммунизация вызывает снижение показателей бактерицидных систем ПМЯЛ у белых мышей в процессе формирования поствакцинального иммунитета к чуме.

После заражения иммунных животных вирулентной культурой при всех дозах заражения происходило снижение содержания КБ во всех группах по сравнению с их значением к моменту заражения, особенно на 3-7 сут, что, по-видимому, связано с разгаром инфекционного процесса. В динамике активности МПО у данных животных также отмечается наименьшее ее значение в период развития чумной инфекции. На 14 и 21 сут четко прослеживается разделение подопытных животных на три группы. В первой группе, где животные проиммунизированы наименьшей дозой (субиммунизирующей

800 м.к.), происходит снижение уровня МПО до 0,98±0,05. Во второй, промежуточной, группе, где животные были проиммунизированы дозой 4x103 м.к., показатели МПО достигли 1,02±0,02. В третью группу объединены животные, получившие эффективные иммунизирующие дозы (2x104 и 105 м.к:), показатель МПО у которых превысил контрольный и составил 1,13±0,03.

Таким образом, после заражения иммунных к чуме белых мышей выявлена защитная функция бактерицидных факторов ПМЯЛ периферической крови, обеспечиваемая обеими системами: МПО и КБ. При этом роль МПО, по нашим данным, предпочтительней; хотя система КБ проявляла склонность, к более серьезному истощению и не восстанавливалась к 21 сут - продуктивной фазе поствакцинального иммунитета против чумы. Такая динамика несомненно свидетельствует в пользу задействования в бактерицидной защите ПМЯЛ и системы КБ.

Смоделированный далее инфекционный процесс в модели феномена «переживания» также показал довольно четкое и стереотипное реагирование обоих изучаемых факторов бактерицидности ПМЯЛ крови белых мышей в данной экспериментальной системе. Существенное снижение уровня КБ в динамике развития инфекционного процесса на 1, 3, 7 сут сменялось постепенным нарастанием его активности на 14 и особенно на 21 сут наблюдения, причем цифровые значения, возможно, свидетельствуют об интегрирующем воздействии вирулентного, либо вакцинного штаммов в разных фазах эксперимента. Сопряженно реагирует и МПО, закономерно повторяя динамику снижения активности на 1, 3 и, в особенности, на 7 сут наблюдения. Однако данная система снова довольно быстро восстанавливается — уже на 14 сут ее активность достигает величины на старте инфекционного воздействия, а на 21 сут поднимается до контрольных (интактных) показателей.

Таким образом, изменение показателей КБ и МПО может служить основанием для определения иммунной активности организма в различных стадиях инфекционного процесса, а также позволяет оценить степень реакции на введение вакцинного штамма, которая говорит о формировании иммунитета, что подтверждают и литературные источники (Сафронова В.М., Дятлов А.И., Лазарева И.Г. и др., 1985; Руднев С.М., Локтев H.A., 1992; Руднев С.М., Локтев H.A., Дальвадянц В.Г., 1993). То есть полученные данные показали возможность оценки эффективности иммунизирующего действия чумных вакцин у экспериментальных животных с помощью цитоэнзимохимических показателей ПМЯЛ при оценке невосприимчивости к чуме.

Следовательно, проведенные исследования убедительно подтверждают преимущество вакцины с измененной температурой культивирования, особенно в совокупности с уменьшенными количественно-объемными параметрами, за счет оптимизации, с одной стороны, температуры выращивания, с другой стороны - более оптимального соотношения количества микробных клеток на единицу стабилизирующих компонентов среды высушивания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абзаева, Наталья Вячеславовна, Ставрополь

1. Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей // М: Медицина, 2002. 344 с.

2. Алиев, М.Н. Механизм иммунизирующего действия живой противочумной вакцины: дис. . канд. мед. наук. / М.Н. Алиев. Саратов, 1958.-200 с.

3. Алутин, И.М. Влияние температуры окружающей среды на биологическую активность возбудителя чумы: автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) / И.М. Алутин. Саратов, 1974. - 19 с.

4. Анисимова, Т.И. Изучение иммуногенности различных субкультур эталонного вакцинного штамма ЕВ по ЕД50 для белых мышей и морских свинок / Т.И. Анисимова и др. // Пробл. особо опасных инфекций. -Саратов, .1968. Вып. 1. - С. 70-75.

5. Анисимова, Т.И. Сравнительное изучение жизнеспособности и имму-ногенности чумной вакцины в зависимости от сред высушивания и сроков хранения / Анисимова, Т.И. и др. // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1970. - Вып. 3. - С. 106-113.

6. Анисимова, Т.И. Оценка качества и перспективы стандартизации чумных вакцин / Т.И. Анисимова // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 1979. Вып. 2 (66). - С. 25-28.

7. Анисимова, Т.И. Определение аллергизирующего и стрессорного действия чумной сухой живой вакцины на организм людей / Т.И. Анисимова и др. // Патогенез, аллергия и иммунитет к возбудителям особо опасных инфекций. — Саратов, 1982. — С. 3-6.

8. М.Апарин, Т.П. Методические рекомендации по определению степени иммуногенности авирулентных штаммов чумного микроба для белых мышей / Т.П. Апарин, Т.И. Вершинина. Иркутск, 1984. - С. 8.

9. Аркадьева, З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения / З.А. Аркадьева // Биол. науки. 1983. - № 4 (232). - С. 93-105.

10. Ахапкина, И.Г. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов / И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова // ЖМЭИ. —2001.-№6.-С. 99.

11. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

12. Бахрах, Е.А. Химический состав чумного микроба / Е.А. Бахрах, И.А. Кузмиченко // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. -Вып. 5 (21).-С. 190-204.

13. Белоус, A.M. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении / A.M. Белоус, В.А. Бондаренко // Наукова думка. — Киев, 1982.-400 с.

14. Бланков, Б.И. Применение лиофилизации в микробиологии / Б.И. Бланков, Д.А. Клебанов // М.: Медгиз, 1961. С. 209-211.

15. Богаутдинов, З.Ф. Методические рекомендации по биолюминесцентному определению жизнеспособности бактерий в лиофилизированных вакцинах / З.Ф. Богаутдинов, Л.М. Балинер, В.Г. Фрунджян // Москва,2002.-4 с.

16. Бондаренко, А.И. Разработка электронно-микроскопического способа количественного определения^ поврежденных клеток чумной вакцины ЕВ: автореф. дис. . канд. мед. наук / А.И. Бондаренко. Ставрополь, 1995.-21 с.

17. Бондаренко, Л.Н. Оптимизация плотной среды для аппаратного культивирования чумного микроба в бифазной системе: автореф. дис.канд. мед. наук / Л.Н. Бондаренко. Саратов, 1988. - 19 с.

18. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов // Учебник, 3-е изд. — Москва, 2002. 736 с.

19. Брагинская, В.П. Активная иммунизация и профилактика поствакцинальных осложнений у детей / В.П. Брагинская, А.Ф. Соколова // М., 1977.

20. Будыка, Д.А. Стабилизация свойств маточной культуры эталонного вакцинного штамма ЕВ в биотехнологии чумной живой вакцины / Д.А. Будыка и др. // Деп. в ВИНИТИ 18.07.00, № 1987-В00. Ставрополь, 2000.- 12 с.

21. Будыка, Д.А. Изучение иммуногенности противочумных профилактических препаратов в феномене «переживания» / Д.А. Будыка // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2001. - № 81. - С. 128-133.

22. Будыка, Д.А. Научно-методические основы совершенствования живой чумной вакцины: дис. . док. мед. наук: (03.00.07) / Д.А. Будыка. -Ставрополь, 2002. 279 с.

23. Будыка, Д.А. Пути совершенствования биотехнологии изготовления живой чумной вакцины / Д.А. Будыка, A.A. Васильева // Актуальные проблемы медицины: Сб. научн. работ. Томск, 2004. - С.312.

24. ЗБ.Бургасов, П.Н. Критерии по отбору новых вакцинных штаммов чумного микроба / П.Н. Бургасов и др. // Профилактика чумы в природных очагах: Матер, конфер., март 1973 г. Саратов, 1973. - С. 139-143.

25. Бывалов, A.A. Идентификация и выделение антигена, защищающего морских свинок от экспериментальной чумы / A.A. Бывалов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2005. - № 1(89). — С. 54-58.

26. Быстрый, Н.Ф. Влияние сред высушивания на выживаемость микробов в сухой противочумной вакцине / Н.Ф. Быстрый и др. // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: Сб. науч. работ противочумных учреждений страны. Саратов, 1964. — С. 274-277.

27. Вихоть, Н.Е. Бактерицидная активность фагоцитирующих клеток / Н.Е. Вихоть, Е.У. Пастер // Иммунология: Практикум. Киев, 1989. -С. 275-280.

28. Васильева, A.A. Анализ некоторых показателей биотехнологии изготовления живой чумной вакцины и экспериментально-теоретические аспекты повышения ее качества / A.A. Васильева // Сб. науч. работ «Актуальные проблемы медицины». Томск, 2004. - С. 312.

29. Воробьев, A.A. Проблемы физико-химической биологии и биотехнологии в микробиологии и иммунологии / A.A. Воробьев // Журнал микробиол. 1982. - № 11 - С. 3-8.

30. Гинсбург, H.H. Живые вакцины / H.H. Гинсбург. М.: Медицина, 1969.- 336 с.

31. Гинсбург, H.H. Некоторые вопросы теории живых вакцин и прививки против полиомиелита вакцинами А. Сэбина / H.H. Гинсбург // Вопросы вирусологии. 1959. - № 5. - С. 620 - 624.

32. Голубева, В.К. О наличие «феномена переживания» у белых мышей при одновременном введении вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба / В.К. Голубева, Т.И. Анисимова // Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций:

33. Сборник научных работ противочумных учреждений. Саратов, 1965 - С. 248-251.

34. Гольдфарб, Д.М. Введение в генетику бактерий / Д.М. Гольдфарб. -М.: Наука, 1966. С. 160 - 168.

35. Гончарова, М.Н. Некоторые аспекты сравнительного изучения чумных вакцин: автореф. дис. . канд. биол. наук. / М.Н. Гончарова. Саратов, 1981.-22 с.

36. Гюлушанян, К.С. Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины ЕВ: дис. . канд. биол. наук / К.С. Гюлушанян. Ставрополь, 1994. - 148 с.

37. Дальвадянц, С.М. Исследования по иммунизации против чумы. Сообщение 4. Опыт ревакцинации волонтеров «химической» и живой чумной вакцинами / С.М. Дальвадянц и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2006. - № 1(91). — С. 57-61.

38. Данилова, М.В. Лиофилизация бактерий / М.В. Данилова, И.М. На-дирова, В.И. Кудрявцев // Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов: Сборник науч. тр. М.: Наука, 1967. - С. 119-135.

39. Долинов, К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К.Е. Доли-нов. М.: Медицина, 1969. - 232 с.

40. Домарадский, И.В. Использование соевых бобов для приготовления кислотного гидролизата / И.В. Домарадский, Н.З. Трофименко, Л.И. Носкова // Бюл. по обмену опытом. Улан-Уде, 1961. - Вып. 1. - С. 78.

41. Домарадский, И.В. Биохимия и генетика возбудителей чумы / И.В. Домарадский и др. М.: Медицина, 1974. - 165 с.

42. Дорохин, В.В. Изучение свойств биомассы вакцинного штамма ЕВ чумного микроба, выращенного посредством многократных пересевов на плотной питательной среде в АКМ-Ш: дис. . канд. мед. наук / В.В. Дорохин. Саратов, 1980. - 191 с.

43. Ефременко, A.A. Иммуногенные свойства экспериментальных серий вакцины чумной живой сухой / A.A. Ефременко, Д.А. Будыка, Н.В. Абзаева // Естествознание и гуманизм: Сборник научных работ. -Томск, 2005. Т. 2, № 1 - С. 38.

44. Ефременко, A.A. Оптимизация параметров вакцинной суспензии в биотехнологии производства вакцины чумной живой сухой / A.A. Ефременко // Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. Деп. В .ВИНИТИ 23.05.05. - № 134. - В 2005. - Ставрополь, 2005. - 9 с.

45. Ефременко, A.A. Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человекодоз в производственной упаковке (ампуле): дис. . канд. мед. наук: (03.00.23; 03.00.07) / A.A. Ефременко. Ставрополь, 2005. - 117 с.

46. Жемчугов, В.Е. Некоторые данные об иммуногенности культур чумных микробов, выращенных в двухфазной системе / В.Е. Жемчугов, А.Ф. Филиппов; Саратовский н.-и. «Микроб». Деп. в ВИНИТИ МЗ СССР, № 5469-82. - Саратов, 1982. - 8 с.

47. Исупов, И.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры / И.В. Исупов, С.А. Бугорков, В.В. Кутырев.- Саратов, 2004. 180 с.

48. Кадетов, В.В. Криоконсервирование и лиофилизация холерных фагов: автореф. дис. . канд. биол. наук: (03.00.07) / В.В. Кадетов. Саратов, 1994.-24 с.

49. Канчурин, А.Х. Характеристика аллергических реакций организма на введение вакцинных препаратов / А.Х. Канчурин // В кн.: Критерии оценки иммунологической эффективности и безопасности бактерийных вакцин. М.: Медицина, 1976. - С. 38-39.

50. Каретникова, Э.С. Двукратное использование питательной среды для производственного выращивания холерных вибрионов: автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) / Э.С. Каретникова. Ставрополь, 1981. -18 с.

51. Касмаенко, О.М. Разработка аппаратного метода культивирования чумного микроба и холерного вибриона на полунепроницаемых мембранах: дис. . канд. биол. наук / О.М. Касмаенко. — Саратов, 1981 — 194 с.

52. Козлов, М.П. О зависимости между вакцинальной и аллергическими реакциями у привитых чумной вакциной / М.П. Козлов, А.Е. Лемехо-ва, Д.О. Норовд // Журн. микробиол. 1960. - № 8. - С. 102-105.

53. Кондрашин, Ю.И. Влияние температуры выращивания на состав внешних и внутренних мембран / Ю.И. Кондрашин, A.A. Щербаков,

54. H.A. Видяева // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов. Материалы симпозиума. Пущино, 1978. Пущино, 1979. - С. 110111.

55. Кондрашкова, Т.В. Производственное приготовление кислотных гид-ролизатов белковых субстратов с использованием ионообменной смолы / Т.В. Кондрашкова, Г.А. Никитин // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. - Вып. 2(6). - С. 129-133.

56. Коробкова, Е.И. Живая противочумная вакцина / Е.И. Коробкова. М.: Медгиз, 1956.-205 с.

57. Коробкова, Е.И. Профилактика инфекций живыми вакцинами / Е.И. Коробкова // Живая противочумная вакцина. М., Медгиз, 1960. - С. 303-323.

58. Красикова, М.А. Влияние отдельных этапов производства на качество чумной живой сухой вакцин: автореф. дис. . канд. мед. наук / М.А. Красикова. Алма-Ата, 1968. - 20 с.

59. Лебединский, В.А. Оценка эффективности различных методов иммунизации чумной живой вакциной ЕВ при аэрозольном заражении / В.А. Лебединский и др. // Журн. микробиол. 1979. - № 9. - С. 11-14.

60. Ленская, Г.Н. Испытание безвредности аттенуированных штаммов чумного микроба 3413Р6, 100Р6 и 2 / Т.Н. Ленская и др. // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: Сборник работ противочумных учреждений. Саратов, 1968.- Вып. 3. - С. 143-146.

61. Лобанов, В.Н. Характеристика безвредности аттенуированных штаммов чумного микроба 100Р6 и 2, 3413Р6 по данным патоморфологического исследования / В.Н. Лобанов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969.-Вып. 1(5).- С. 123-132.

62. Лопатина, Н.В. Питательная среда для культивирования вакцинного штамма Y. pestis-76 / H.B. Лопатина и др. // Реф. мед. журн. микро-биол. сан. и мед. 1991. - № 6 - 6 Ц393П.

63. Лопатина, Н.В. Оптимизация защитной среды для лиофилизации культур вакцинного штамма EV чумного микроба / Н.В. Лопатина и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1994. - Вып. 4 (47). — С. 122-128.

64. Майский, И.Н. Иммунология туляремии. Теория и практика вакцино-профилактики. / И.Н. Майский. М.: Изд-во АМН СССР, 1953. - С. 143.

65. Мартенс, Л.А. Получение питательных сред из кислотных гидролиза-тов рыбокостной муки // Ученые записки Дагестанского НИИ питательных сред. 1964. - Вып. 4. - С. 87-97.

66. Машков, A.B. Опыты одновременного заражения белых мышей туля-ремийными культурами вирулентной и Гайского / A.B. Машков // Журнал микробиол. 1951. - № 9. - С. 44-49.

67. Мейер, К. Эффективность живых и убитых чумных вакцин для человека / К. Мейер // Бюл. ВОЗ. Женева, 1971. - Т. 42. - № 5. с. 689704.

68. Мейнелл, Дж. Количественная оценка размножения бактерий / Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл // В кн.: Экспериментальная микробиология: (Теория и практика). М.: Мир, 1967. - С. 38-45.

69. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96. М: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. — 128 с.

70. Методические рекомендации по определению степени иммуногенно-сти авирулентных штаммов чумного микроба для белых мышей. Иркутск, 1984. - 6 с.

71. Муравьева, Н.К. Применение казеиновых сред в вакцинном производстве / Н.К. Муравьева, А.Н. Крайнова, О.П. Маслова // Особо опасные и природноочаговые инфекции: Сб. науч. работ противочумных учреждений М., 1962. - С. 207-211.

72. Никифоров, В.Г. Химический мутагенез / В.Г. Никифоров // Общая генетика. М.: Наука, 1965. - С. 113-172.

73. Николаев, Н.И. Опыт применения бульона из кислотного гидро-лизата казеина в производстве сухой живой чумной вакцины / Н.И. Николаев и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1969. -Вып. 1 (5).-С. 175-181.

74. Определение иммуногенности вакцины чумной живой в модели феномена «переживания» на белых мышах: Методические рекомендации / Д.А. Будыка и др. Ставрополь, 2009. - 6 с.

75. Оптимизация температурного режима выращивания бактериальной массы в технологии производства чумной вакцины: Отчет о НИР (закл.) / Ставроп. н-и. противочум. ин-т.; рук. Будыка Д.А. Ставрополь, 1999.-29 с.

76. Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: Методические указания МУ 3.3.1.1113-02. 63 с.

77. Пастер, Е.У. Иммунология: практикум / Е.У. Пастер и др. К.: Выща школа, 1989. - 304 с.

78. Печникова, И.В. Влияние состава среды высушивания на термоустойчивость чумной живой сухой вакцины ЕВ в процессе длительного хранения: автореф. дис. . канд. мед. наук / И.В. Печникова. Саратов, 1967. - 19 с.

79. Пигаревский, В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства / В.Е. Пи-гаревский. Москва, 1978. - 128 с.

80. Пирогенность // Государственная Фармакопея Российской Федерации XII. Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. - С. 125-127.

81. Плешакова, Т.В. Лиофилизация и реактивация возбудителя ме-лиоидоза: дис. . канд. мед. наук / Т.В. Плешакова. Волгоград, 1992. - 184 с.

82. Приказ № 31 от 13 января 1983 г. «Об унификации методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов». — М., 1983.

83. Приказ № 1179 от 10 октября 1983 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». — М., 1983.

84. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири / Под. ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева // ОАО «Издательство «Медицина», 2004. 192 е.: ил.

85. Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций -Ставрополь, 2004. -215 с.

86. Пути дальнейшей стабилизации количества живых микробных клеток в чумной вакцине: Отчет о НИР (закл.) / ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора; рук. Будыка Д.А. Ставрополь, 1995. - 152 с.

87. Пушкарь, Н.С. Введение в криобиологию / Н.С. Пушкарь, A.M. Белоус // К.: Наукова думка, 1975. С. 16-21.

88. Ракитина, E.JL Оптимизация доз чумной вакцины ЕВ по количеству живых микробных клеток: дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) / Е.Л. Ракитина. Ставрополь, 1988. - 194 с.

89. Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1992.-279 с.

90. Салтыков, P.A. Стабильность сухой живой вакцины в глютами-новой среде высушивания при различных условиях ее хранения / P.A. Салтыков и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1964. - № 4. - С. 130-134.

91. Самойлова, Л.В. Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой чумной вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации: автореф. дис. . канд. мед. наук / Л.В. Самойлова. -Саратов, 1963. 24 с.

92. Сафронова, В.М. Практическое пособие по цитоэнзимохимиче-ским методам исследования / В.М. Сафронова, Н.А. Локтев, С.М. Руднев // Деп. в ВИНИТИ. 1994. - № 1424. - В. 94.

93. Сафронова, В.М. Морфологическое и цитоэнзимохимическое изучение крови сусликов различных популяций из Приэльбрусья / В.М. Сафронова и др. // Ставрополь. 1984. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 5.10.84.-№6578-84.

94. Сафронова, В.М. Цитоэнзимологические показатели периферической крови сусликов из Приэльбрусья при экспериментальном заражении их чумой / В.М. Сафронова и др. // Ставрополь, 1985. 9 с. - Деп. в ВИНИТИ 1.03.85 г. -№ 1613-85.

95. Свиридова, Л.С. Влияние соотношения защитной среды и микробной суспензии на жизнеспособность вакцины ЕВ при высушивании и хранении / Л.С. Свиридова // Матер, науч. конф. по природной очагов. и профилакт. чумы. Алма-Ата, 1963. - С. 207-208.

96. Смирнова, Е.Б. Биохимический анализ мясного гидролизата, используемый в приготовлении микробиологических сред / Е.Б. Смирнова // Тез. докл. X итоговой науч. конф. молодых ученых и студентов.-Ставрополь, 2002.- С. 413-414.

97. Питательные среды» МЗ РФ (15-17 сент., 2003 г.). Махачкала, 2003. -С. 36.

98. Сумароков, A.A. Прививочное дело / A.A. Сумароков, JI.B. Сал-мин. М.: Медицина, 1983. - 198 с.

99. Терентьев, А.Н. Влияние некоторых криопротекторов на состояние воды в клетках Y. pestis 76 при замораживании-оттаивании / А.Н. Терентьев, A.B. Зинченко, В.Д. Зинченко // Проблемы криобиологии. -1992. -№3.- С. 27-30.

100. Тимаков, В.Д. Основы экспериментальной медицинской бактериологии / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб. М.: Медгиз, 1958. - 348 с.

101. Тинкер, А.И. К вопросу об оптимальных условиях лиофильного высушивания живой противочумной вакцины из штамма ЕВ, выращенной на твердых питательных средах: дис. . канд. мед. наук / А.И. Тинкер. Ставрополь, 1964. - 185 с.

102. Тинкер, А.И. Влияние сублимационного (лиофильного) высушивания на штамм ЕВ чумного микроба: дис. . док. мед. наук / А.И. Тинкер. Ставрополь, 1971. — 351 с.

103. Тинкер, А.И. Выживаемость микробов в производственных сериях чумной вакцины ЕВ, приготовленных на плотных и жидких питательных средах / А.И. Тинкер и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. - Вып. 4 (20). - С. 71-76.

104. Тинкер, А.И. Жизнеспособность чумной вакцины ЕВ, приготовленной из суспензии с низкой плотностью клеток / А.И. Тинкер и др. // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Материалы Рос. науч. конф. Саратов, 1993. - С. 158.

105. Тинкер, А.И. Влияние условий выращивания биомассы на жисне-способность чумной вакцины ЕВ / А.И. Тинкер и др. // Профилактика и меры борьбы с чумой: Материалы межгос. конф., посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы. Алматы, 1994. - С. 137.

106. Трофименко, Н.З. Среды из соево-кислотного гидролизата для выращивания чумного микроба / Н.З. Трофименко и др.// Докл. Иркутского противочумного ин-та. — 1963. — Вып. 5. — С. 48-52.

107. Урбах, В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях / В.Ю. Урбах. М.: Медицина, 1975. - 296 с.

108. Файбич, М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения / М.М. Файбич // Успехи микробиологии. -М.: Наука, 1983.-№ 18.-С. 193-215.

109. Фармакопейная статья «Вакцина чумная живая сухая» 42-326 ВС-92.

110. Фармакопейная статья предприятия «Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций» 42-8654-07. Ставрополь, 2007. - 16 с.

111. Филиппов, А.Ф. Изучение стабильности иммуногенных свойств противочумной сухой живой вакцины в процессе длительного хранения: автореф. дис. . канд. мед. наук / А.Ф. Филиппов. Саратов, 1964.-21 с.

112. Филиппов, А.Ф. Свойства культур чумного микроба, выращенных на средах из аутолизатов рыбы / А.Ф. Филиппов и др.// Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1974. - Вып. 3 (37). - С. 62-66.

113. Филиппов, А.Ф. Непрерывное культивирование микроорганизмов пассажным способом на твердых питательных средах /А.Ф. Филиппов, В.В. Дорохин // Иммунол. и профилакт. особо опасных инфекций. Саратов, 1982. - С. 25-32.

114. Филиппов, А.Ф. Перспективы совершенствования вакцины чумной живой сухой / А.Ф. Филиппов, Т.И. Анисимова // Проблемы биотехнологии и иммунохимии особо опасных инфекций. — Саратов, 1984.-С. 3-10.

115. Хазан, М.А. Конструирование из непищевого сырья плотных питательных сред для диагностики и накопления бактериальной массы чумного микроба: автореф. дис. . канд. биол. наук / М.А. Хазан. -Саратов, 1987.-24 с.

116. Хаитов, P.M. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения / P.M. Хаитов, Б.П. Пинегин // Иммунология. -2000. -№ 5.-С. 4-7.

117. Цитоэнзимохимические исследования лейкоцитов. Возрастные колебания цитохимических показателей: Методические рекомендации под ред. В.Б. Лецкого). — 1973. 32с.

118. Чернова, Э.А. Возможность оценки качества сухой живой чумной вакцины ЕВ в процессе хранения по количеству содержащихся в ней живых микробов: автореф. дис. . канд. мед. наук / Э.А. Чернова. — Ставрополь, 1967. 20 с.

119. Чичерин, Ю.В. Выживаемость микробов ЕВ в чумной живой вакцине НИИС и ее иммуногенность в процессе длительного хранения / Ю.В. Чичерин, В.А. Лебединский, В.И. Евстигнеев // Журнал, микро-биол. 1977. - № 8. - С. 139-140.

120. Чичерин, Ю.В. Стабильность иммуногенных свойств чумного микроба вакцинного штамма ЕВ линии НИИЭГ в условиях длительного хранения /Ю.В. Чичерин, В.А. Лебединский, В.И. Евстигнеев // Журн. микробиол., 1979. № 4. - С. 39-42.

121. Шеремет, О.В. Содержание фракции I и VW антигенов в культурах чумного микроба, выращенных на средах DK, DX и ДП / О.В. Шеремет и др. // Журн. микробиол. - 1987. - № 6. - С. 18-21.

122. Шиманек, Н.Я. Влияние температуры культивирования на ферменты метаболизма сиаловых кислот у чумного микроба / Н.Я. Шиманек, Б.Н. Мишанькин // Микробиологический журнал. 1982. — Т. 44. -№ б. - С. 49-53.

123. Ширанович, М.П. Некоторые механизмы приобретенной резистентности к чуме. / М.П. Ширанович // НИПИ Кавказа и Закавказья. — Библиогр. 98 назв. Деп. в ВИНИТИ 26.04.85 - № 2779-85. - Ставрополь, 1985.-24 с.

124. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. -566 с.

125. Шмутер, М.Ф. Жизнеспособность, реактогенность и иммуноген-ность живой сухой чумной вакцины, приготовленной на разных средах высушивания // М.Ф. Шмутер и др. / Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1979. - Вып. I. - С. 26-30.

126. Шпилевая, Э.Г. Культивирование чумного микроба аппаратным способом на агаре из сухих кормовых дрожжей: дис. . канд. биол. наук; (03.00.07) / Э.Г. Шпилевая. Ставрополь, 1983. - 220 с.

127. Шпилевая, Э.Г. Культивирование чумного микроба на средах из непищевого сырья в производственных условиях / Э.Г. Шпилевая, А.И. Тинкер, МН., Т.В. Таран; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. // Деп в ВИНИТИ 26.02.93. № 478 В93.

128. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации по выведению животных из эксперимента. — М., 1985. — 1 с.

129. Aaby, Р. Humoral immunity in measles infection. A criyical factor. / P. Aaby et al. // Med. Hypotheses. 1987. - V. 23. - № 3.- P. 287-301.

130. Anderson, G.W. Short- and long-term efficacy of single dose submit vaccines against Yersinia pestis in mice / G.W. Anderson et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg, 1998. - Jun. - № 58(6). - P. 793-799.

131. Anderson, G.W. Recombinant V antigen protects mice against pneumonic and bubonic plaque, caused by F1-capsul-positive and-negative strains of Yersinia pestis / G.W. Anderson et al. // Infect. Immun., 1996. — Nov. № 64(11). - P. 4580-4585.

132. Ashwood-Smith, M.J. Mutations by freeze-drying / M J. Ashwood-Smith, E. Grant // Ciyobiology 1976. - V.13. - № 2. - P. 206-213.

133. Bossi, P La peste, acte possible de bioterrorisme / P. Bossi, F. Bricaire // Presse Medicale. Issue 17.-17 May 2003. - P. 804-807.

134. Calcott, P.H. The effect of cooling and warming rates on the survival of a variety of bacteria / P.H. Calcott, S.K. Lee, R.A. Mac Leod // Canad. J. Microbiology 1976. - V. 22. - № 1.- P. 106-109.

135. Friendlander, A.M. Relationship between virulence and immunity as revealed in recent studies of the F1 capsule of Yersinia pestis / A.M. Friendlander et al. // Clin. Infect. Dis., 1995. Oct. - № 21. Suppl. 2. - P. 178181.

136. Giori, G.S. Protective effect of adonitol bacteria subjected to freeze -drying / G.S. Giori et al. // Appl. Microbiol. 1983. - V. 45 - № 1. - P. 302 -304.

137. Girard, G. L etat actual de la peste a Madagascar et la prophylaxis vaccinale par le virus vaccine E.V. / G. Girard, J. Robic // Bull. Soc. Patch. Exot., 1942. V. 35. - № 1-2. - P. 42.

138. Girard, G. La vaccination de L home contre la peste an moyen des bacillus vivant (virus vaccine E.V.) / G. Girard, J. Robic // Bull, offic. Internai O. Hyd. Publ., 1936. -V. 28. P. 1078.

139. Girard, G. Vaccination contre la peste an mouen duse souche de bacillus de Jersin vivants de virulens attenu / G. Girard, J. Robic // Bacill. Acad. Med., 1934. V. 11. - P. 939-945.

140. Gomez, F. Characteristics of freeze dried cells / F. Gomez, M. Ta-kano, A.J. Sinskey // Cryobiology. - 1973/ - V. 10, № 5. p. 368-374.

141. Griffin, K. Protective efficacy of a recombinant plague vaccine when co-administrated with another sub-unit or live attenuated vaccine // K. Griffin et al. // FEMS Immunology and Medical Microbiology. — Vol. 43. Issue 3. - 1 March 2005. - P. 425-430.

142. Grosfeld, H. Effective protective immunity to Yersinia pestis infection conferred by DNA vaccine coding for derivatives of the F1 capsular antigen / H. Grosfeld et al. // Infect. Immun. 2003 Jan. - V. 71 (1). - P. 374-83.

143. Kaplow, L.S. Histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood and marrow / L.S. Kaplow// Blood. 1955. - V. 10.-P. 1023-1029.

144. Leary, S.E. Active immunizations with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague / S.E. Leary et al. // Infect. Immun., 1995. Aug. - № 63(8). - P. 2854-2858.

145. Leary, S.E. Expression of Yersinia pestis V antigen in attenuated salmonella typhimurium development of a novel vaccine for plaque / S.E. Leary et al. // Contrib. Microbiol. Immunol., 1995. № 13. - P. 216-217.

146. Leary, S.E. Expression of an Fl/V fusion protein in attenuated Salmonella typhimurium and protection of mice against plaque / S.E. Leary et al. // Microb. Pathol., 1997. Sep. - № 23(3). - P. 167-179.

147. Merlin, M. Vaccination antipesteuse: le passé et les perspectives d'avenir / M. Merlin // Bull Soc Pathol Exot. 1999, Dec. - V. 92 (5 Pt 2). -P. 423-431.

148. Morichi, T. Factors affecting repair of sublethal injury in frozen or freeze dried bacteria / T. Morichi, R. Jric / Cryobiology, 1973. - V. 10 -№5.-P. 393-399.

149. Perry, W.R. J. gen. Microbiol. / W.R. Perry // 1955 № 13. - P. 12.

150. Reddin, K.M. Large scale purification of the F I antigen of Yersinia pestis / K.M. Redding et al. // Contrib. Microbiol. Immunol., 1995. - № 13. -P. 329-330.

151. Roussos, D. Plague / D. Roussos // Primary Care Update for Ob. Gyns. Vol. 9. - Issue 4. - 2002. - P. 125-128.

152. Scott, W.J. A mechanism causing death during storage of dried microorganisms / W.J. Scott // Recent Research in Freezing and Drying. Oxford, 1960.-P. 188-202.

153. Titball, R.W. Yersinia pestis (plague) vaccines / R.W. Titball, E.D. Williamson // Expert Opin Biol Ther. 2004 Jun. - V. 4 (6). - P. 965-73.

154. Valdes, G.F. Effect of drying medium on residual moisture content and viability of freeze dried lacticaeid bacteria / G.F. Valdes et al. // Appl. And Envuon. Microbiol., 1985. - V. 49. - № 2. - P. 413-415.

155. Valdes, G.F. Protective effect of adonitol bacteria subjected to freeze drying / G.F. Valdes et al. // Appl. Microbiol., 1983. - V. 45. - № 1. - P. 302-304.

156. Williamson, E.D. Local and systemic immune response to a microencapsulated sub-unit vaccine for plague / E.D. Williamson et al. // Vaccine, 1996. Dec. - № 14(17-18).-P. 1613-1619.

157. Williamson, E.D. A new improved sub-unit vaccine for plaque the basis of protections / E.D. Williamson et al. // Immunol. Med. Microbiol., 1995. Dec. - № 12(3-4). - P. 223-230.

158. Williamson, E.D. A sub-unit vaccine elicits IgG in serum, spleen cell cultures and bronchial washings and protects immunized animals against pneumonic plague / E.D. Williamson et al. // Vaccine, 1997. Jul. - № 15(10).-P. 1079-1084.

Информация о работе

Абзаева, Наталья Вячеславовна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы