Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Повышение эффективности искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Повышение эффективности искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой"

003488398

На правах рукописи

ДОБРОВОЛЬСКИЙ Геннадий Александрович

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ КОРОВ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМОЙ

06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Лесные Поляны Московской области 2009

003488398

Работа выполнена во Всероссийском научно -исследовательском институте

племенного дела.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ерохин Анатолий Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кононов Валентин Петрович кандидат сельскохозяйственных наук Шаркаев Валерий Исманлович

Ведущее учреждение: Российская академия менеджмента в

животноводстве.

Защита диссертации состоится 6 ноября 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.017.01. при Всероссийском научно -исследовательском институте племенного дела.

Адрес института: 141212, Московская область, Пушкинский район, п.Лесные Поляны, ВНИИплем, факс: 8 (495) 515-95-57.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИплем.

Автореферат разослан 25 сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Ерохин А.С.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время для искусственного осеменения крупного рогатого скота во многих странах в основном применяется криоконсервированная сперма. Но несмотря на широкое применение, результативность осеменения коров всё ещё остается не достаточно высокой. При этом имеется целый ряд недостаточно изученных вопросов, которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров и тёлок замороженной спермой. Например, в процессе замораживания спермы быков погибает более половины сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка более совершенных синтетических разбавителей для спермы быков позволило бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе замораживания - оттаивания и их оплодотворяющую способность.

Слабо изучен также вопрос прогнозирования криоустойчивости спермы быков. Решение данной проблемы могло бы помочь в подборе производителей для племпредприятий с высокой устойчивостью спермы к замораживанию.

Как известно, имеются производители с высокой и пониженной устойчивостью половых клеток к процессу замораживания, что проявляется в различной подвижности и живучести сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания, а также в их оплодотворяющей способности.

В этой связи необходимы дальнейшие углубленные исследования в области совершенствования синтетических сред для замораживания спермы быков и изучения причин неодинаковой устойчивости половых клеток к криообработке.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение эффективности осеменения коров спермой, замороженной в различных средах и выяснение возможности прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов у быков.

Для достижения этой цели в диссертации были поставлены следующие задачи:

• изучить криозащитное влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина;

• выяснить влияние срока хранения спермы быков, замороженной в среде с соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток;

• изучить эффективность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с сухим соевым лецитином и нативным желтком куриного яйца;

• проанализировать воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость сперматозоидов быков;

• исследовать возможность прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков с помощью различных биологических методов.

Научная новизна исследований. Впервые изучено криозащитное влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина. Выяснено влияние разных сроков хранения спермы быков, замороженной с сухим соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток. Проведены научно-производственные испытания эффективности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис - фруктозо - глицериновой среде с соевым лецитином и желтком куриного яйца. Проанализировано криопротективное влияние на сперму быков низкоинтенсивного лазерного излучения. Изучена взаимосвязь между уровнем АТФ в сперматозоидах быков и их оплодотворяющей способностью. Исследована возможность прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков по содержанию в них продуктов перекисного окисления липидов и антиокислительных ферментов.

Практическая значимость. Усовершенствованная трис - фруктозо -лимоннокислая кислота способствует повышению фертильности спермы быков, замороженной как с сухим соевым лецитином, так и с нативным желтком куриного яйца в сравнении с использованием лактозо - желточно -глицериновой среды. Изучение уровня антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезно с целью прогнозирования её криоустойчивости.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

• Ученом Совете ВНИИплем, 2007 -2008 гг;

• Научно- производственной конференции на ВВЦ, 2007 г;

• Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Сухой соевый лецитин обладает высокими криопротективными свойствами при замораживании семени быков.

Осеменение коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином, не снижает результативности искусственного осеменения.

Замораживание семени быков в усовершенствованной трис-фруктозо- лимоннокислой среде с желтком куриного яйца способствует повышению результативности искусственного осеменения коров по сравнению с ЛГЖ средой.

Изучение активности антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезным для отбора производителей с высокой устойчивостью семени к глубокому осеменению.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в рецензируемом журнале.

Объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация включает 23 таблицы. Список литературы содержит 192 источника, в том числе 105 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены в отделе биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВНИИплем, в ОАО «Омское по племенной работе», и ряде хозяйств Омской и Московской областей. Все эксперименты проводились согласно прилагаемой схемы исследований (рис 1).

Влияние различных видов сухого соевого лецитина на криоустойчивость спермы быков определяли по подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов вне организма и по результатам искусственного осеменения коров.

Эффективность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис - фруктозо - лимоннокислой среде и ЛГЖ среде, сравнивали при использовании в составе сред желтка куриных яиц и сухого соевого лецитина Центролекс — Ф. Для замораживания семени быков использовали эякуляты с подвижностью 80-85% и концентрацией сперматозоидов не менее 1 млрд/мл. Замораживали сперму в виде гранул объемом 0,5 мл. Оттаивали сперму в 3% растворе цитрата натрия или водяной бане при 37°С. Коров осеменяли двукратно в течение половой охоты. Результативность осеменения учитывали по данным ректального исследования.

Концентрацию АТФ в сперматозоидах быков определяли с помощью портативного люминометра EMILITE - 100 ЗА по методу Угаровой (1991).

Анализ активности глутатионредуктазы в сперме быков определяли по окислению NADPH, а глутатионпероксидазы - в сопряженной глутатионредуктазной системе с использованием гидроперекиси третбутила в качестве субстрата. Уровень малонового диальдегида в сперме быков определяли по методу Saton (1978). Определение концентрации липидных гидроперекисей проводили спектрометрическим методом.

Определение фосфолипидов в липидных экстрактах сперматозоидов быков с различной криоустойчивостью спермы проводили с помощью тонкослойной хроматографии по методу Skripsky (1982).

Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость спермы быков изучали с использованием арсенид -галлиевого (Ars - Ga) и гелий - неонового (Не - Ne) лазеров конструкции МГТУ им Баумана. Эксперименты проводили в 5 различных режимах. Отличающихся по частоте излучения лазера, мощности излучения и времени экспозиции. Анализировали защитное действие лазерного облучения на сперматозоиды быков при холодовом шоке и глубоком замораживании.

Биометрическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ для ПК - Microsoft Excel.

Рис 1. Общая схема исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение защитного влияния сухого соевого лецитина на устойчивость семени быков к глубокому замораживанию

3.1.1. Анализ криозащитного влияния на сперматозоиды быков различных марок сухого соевого лецитина

В последние годы проводятся интенсивные исследования по возможности разработки синтетических разбавителей для семени сельскохозяйственных животных, в составе которых не содержится продуктов животного происхождения (молока, желтка куриных яиц и т.д.). Эти исследования перспективны с точки зрения снижения риска переноса различных инфекционных заболеваний при искусственном осеменении животных (Christensen Р.Е.е.а., 2000; Vishwanat R., Shannon P., 2000; Thiber M., Guerin В., 2000; Евтух В.П., 2004).

В задачу нашей работы входило изучение защитного действия различных торговых марок сухого соевого лецитина, полученного из соевых бобов, на устойчивость семени быков к глубокому замораживанию.

В наших экспериментах изучалось криозащитное действие на сперматозоиды быков пяти видов лецитинового порошка из соевых бобов : Stempur PC (Германия); Центролекс Ф (Германия); Солекс - Ф ( Германия); Леципро (Китай) и Stempur PC гранулированный, обезжиренный (Германия). При этом было изучено действие различных дозировок этих веществ на криоустойчивость семени быков.

3.1.2. Влияние срока хранения спермы быков, замороженной с сухим соевым лецитином на биологическую полноценность сперматозоидов

С целью выяснения влияния сроков хранения спермы быков, замороженной в усовершенствованной среде с сухим соевым лецитином, на биологическую полноценность оттаянных сперматозоидов, нами были проведены соответствующие исследования.

Свежеполученные эякуляты с подвижностью не менее 80% разбавляли 1 : 9 трис-фруктозо-лимоннокислой средой с добавлением в неё 8 % сухого соевого лецитина марки «Центролекс Ф». В контрольной группе сперму разбавляли этой же средой. Но вместо сухого лецитина, в неё добавляли 20% желтка куриных яиц. Сперму замораживали в гранулах объемом 0,2 мл. Замороженные образцы семени хранили в жидком азоте. После хранения спермы в замороженном состоянии в течение 1 - Зх лет, мы оттаивали образцы семени и изучали следующие показатели: подвижность

сперматозоидов, сохранность акросом, абсолютный показатель

выживаемости сперматозоидов при 37° С и концентрацию АТФ в половых клетках.

Результаты влияния сроков хранения спермы быков, замороженной в среде с сухим лецитином на показатели качества сперматозоидов показали, что хранение спермы быков, замороженной с сухим лецитином в течение 3-х лет, не оказало отрицательного влияния на такие биологические показатели, как: подвижность и живучесть сперматозоидов, а также сохранность их акросом. Во все изученные периоды эти показатели в опытных группах были практически сходными с таковыми в контрольной группе, где сперму быков замораживали с 20% желтка куриных яиц.

Для выяснения вопроса о влиянии разных сроков хранения спермы быков, замороженной с сухим соевым лецитином, на энергетический метаболизм в оттаянных сперматозоидах, нами были проведены опыты по изучению концентрации АТФ в оттаянных образцах половых клеток. Результаты этих экспериментов показали, что динамика изменений концентрации АТФ в сперматозоидах всех групп находилась примерно на одном уровне, что свидетельствует об отсутствии отрицательного влияния изученных сроков хранения на энергетический метаболизм сперматозоидов, замороженных с сухим соевым лецитином.

3.1.3. Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной среде с сухим соевым лецитином

В задачу наших исследований входило проведение научно -производственных испытаний эффективности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис- фрукгозо -лимоннокислой среде с сухим соевым лецитином в сравнении с этой же средой, где вместо сухого соевого лецитина использовали 20% желтка куриных яиц. Для этого были проведены специальные эксперименты.

В каждом хозяйстве было отобрано для осеменения две группы коров. Коров опытной группы осеменяли спермой, замороженной в усовершенствованной трис - фрукгозо - лимоннокислой среде с добавлением 7% сухого соевого лецитина марки «Центролекс Ф». Контрольную группу коров осеменяли спермой, замороженной в этой же среде, но с добавлением 20% желтка куриного яйца. В дозе для осеменения содержалось 15 млн. подвижных сперматозоидов. Коров всех групп осеменяли двукратно в течение эструса. Результативность искусственного осеменения учитывали по данным ректального исследования через 3 месяца после осеменения. Данные этих опытов представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, результативность осеменения коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином, была практически одинаковой с группой, где использовали сперму, замороженную с желтком куриного яйца.

Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в различных синтетических средах

Синтетическая среда Осеменено коров Выбыло из опыта Стельных через 3 месяца

голов %

Опытная (с сухим соевым лецитином) 317 14 142 46,9

Контрольная (с 20% желтка) 295 12 135 47,7

На основании проведенных исследований можно заключить, что сухой соевый лецитин обладает высокими криозащитными свойствами и может использоваться в качестве заменителя желтка куриных яиц в средах для замораживания семени быков.

3.1.4. Эффективность осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис - фруктозо - лимоннокислой среде с желтком куриного яйца

Как известно, в практике скотоводства в нашей стране до сих пор применяется для замораживания семени быков лактозо - глицерино -желточная среда, предложенная в 1964 году японскими учеными Нагадо и Нива (Nagase Н.К, Мша Т., 1964). Данная среда давно не используется для криоконсервации семени быков в различных странах.

В этой связи, в задачу наших исследований входило изучение эффективности использования усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среды, содержащей 20% желтка куриного яйца для замораживания семени быков, в сравнении с применением лактозо-глицерино-желточной среды.

С целью выяснения влияния усовершенствованной среды на биологические показатели качества спермы быков и её фертильность, нами были проведены эксперименты в хозяйствах Московской и Омской областей по искусственному осеменению коров спермой, замороженной в двух сравниваемых средах.

Результаты изучения подвижности и уровня АТФ в сперматозоидах быков, замороженных в сравниваемых средах, суммированы в таблице 2.

Влияние состава среды на подвижность и уровень АТФ в заморожено - оттаянных сперматозоидах быков

Образцы семени Трис-фруктозо-лимоннокислая среда с желтком Лактозо-глицерино-желточная среда

Подвижность спермиев, в % Содержание АТФ, нмоль/108 спермиев Подвижност ь спермиев, % Содержание АТФ, нмоль/108 спермиев

До замораживания 82 ±3,0 16,4 ±0,9 80 ±3,7 16,1 ± 0,7

После оттаивания:

Через 5 мин 44 ±1,8 8,6 ±0,3 41 ± 0,7 8,0 ± 0,8

Через 60 мин 38 ± 1,4х 7,4 ±0,4" 30 ± 0,8х 6,1 ±0,3"

Через 120 мин 32 ±0,9" 6,3 ± 0,2х 25 ± 0,6х 5,3 ± 0,2х

Через 180 мин 25 ± 0,6х 4,2 ± 0,3х 17 ± 0,6х 3,2 ± 0,1х

х - Р<0,05

Из результатов таблицы 2 видно, что замораживание спермы быков в трис-фруктозо-лимоннокислой среде с 20% желтка, способствует увеличению подвижности оттаянных сперматозоидов и повышению уровня АТФ по сравнению с использованием лактозо-глицерино-желточной среды. Так, подвижность сперматозоидов в трис - фруктозо - лимоннокислой среде через 5; 60; 120 и 180 минут после оттаивания, была выше, чем в ЛГЖ среде, соответственно, на 7,3 % ; 26,6 % ; 28 % и 47 % (Р<0,05). Содержание АТФ в оттаянных сперматозоидах, при использовании этой же среды, в изучаемые периоды времени было выше, чем в ЛГЖ среде, соответственно, на 7,5%; 21% ; 18,8% и 31,2% (Р<0,05).

Следовательно, усовершенствованная трис-фруктозо-лимоннокислая среда обладает более высокими защитными свойствами при замораживании спермы быков по сравнению с ЛГЖ средой.

Затем нами были проведены сравнительные опыты по искусственному осеменению коров спермой, замороженной в этих двух сравниваемых средах (таблица 3).

Результативность осеменения коров спермой, замороженной в разных

средах

Синтетическая Осеменено Выбыло из Стельных через 3 месяца

среда коров опыта голов %

Опытная (с сухим соевым лецитином) 295 12 135 47,7*

Контрольная (с 20% желтка) 279 И 109 40,7

*- Р <0,05

Полученные результаты показали, что усовершенствованная трис -фруктозо - лимоннокислая среда с 20% желтка обладает более высокими защитными свойствами. При осеменении коров спермой, замороженной в этой среде, оплодотворяемость была выше на 7 % по сравнению с ЛГЖ средой.

Таким образом, на основании наших исследований можно заключить, что усовершенствованная трис-фруктозо-лимоннокислая среда может успешно применяться для замораживания семени быков в двух вариантах: как с сухим соевым лецитином, так и с нативным желтком куриного яйца.

3.2. Изучение воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость семени быков

3.2.1. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку

Из литературных данных известно, что оптические квантовые генераторы в настоящее время применяются в различных областях биологии и медицины. В частности, проведён ряд экспериментов по использованию лазеров для обработки семени сельскохозяйственных животных (Николов И., Нестерова Ю., 1994; Николов И.и др., 1986; Ерохин A.C. и др., 1997). При этом было установлено, что облучение семени баранов арсенид - галлиевым лазером способствует повышению устойчивости половых клеток к холодовому шоку и глубокому замораживанию. Анализ полученных ранее данных позволяет предположить, что лазерная энергия обладает избирательным модифицирующим воздействием на разнообразные биохимические и биофизические процессы в половых клетках (Девятков Н.Д. и др., 1987).

В этой связи мы решили изучить возможность повышения биологической полноценности криоконсервированной спермы быков с помощью воздействия лазерного излучения.

В первом эксперименте мы изучали влияние оптических квантовых генераторов на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку.

Источниками излучения служили гелий - неоновый (Не - Ne, длина волны 0,63 мкм) и арсенид - галлиевый (Ars - Ga, длина волны 0,89 мкм) лазеры. Эксперименты проводили в 5 различных режимах, которым соответствовали определенные значения мощности и частоты.

Для изучения защитного влияния лазеров при холодовом шоке половых клеток, свежеполученную сперму быков разбавляли изотоническим раствором цитрата натрия в 10 раз. Затем в пробирки наливали по 1 мл разбавленного семени и облучали их лазерами в течение 20 - 120 секунд. Облученную сперму инкубировали при 30° С в термобоксе в течение 15 минут , а затем помещали пробирки на 15 минут в тающий лед. После чего анализировали подвижность сперматозоидов до и после холодового шока. Результаты облучения спермы быков перед Холодовым шоком Ars - Ga лазером показали отсутствие защитного влияния на сохранение подвижности половых клеток при всех изученных режимах. Анализ данных по облучению спермы быков перед Холодовым шоком с помощью гелий - неонового лазера также свидетельствует об отсутствии защитного влияния против холодового шока данной обработки.

3.2.2. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов

быков к глубокому замораживанию

В следующих экспериментах мы изучали влияние облучения семени быков перед замораживанием на устойчивость половых клеток к замораживанию.

Для этого смешанные эякуляты быков голштинской породы разбавляли 1:9 лактозо - глицерино - желточной средой и облучали изучаемыми лазерами перед эквилибрацией семени в течение определенного периода времени. Контрольную группу не подвергали облучению. После замораживания и оттаивания спермы, мы изучали подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их выживаемости при 37°С.

Результаты влияния гелий - неонового лазерного излучения на подвижность сперматозоидов быков сразу после оттаивания показали, что облучение сперматозоидов быков перед замораживанием с помощью гелий - неонового лазера в течение 30- 120 секунд не оказало положительного влияния на подвижность оттаянных сперматозоидов при всех режимах облучения.

Облучение семени арсенид - галлиевым лазером также не привело к повышению подвижности сперматозоидов быка после оттаивания. Таким

образом, проведенные нами сравнительные эксперименты

показали, что облучение семени быков перед замораживанием с помощью изученных лазеров и режимов излучения не оказали положительного влияния на подвижность оттаянных сперматозоидов быков. Также не было отмечено заметного положительного влияние данной обработки на абсолютный показатель живучести сперматозоидов после оттаивания.

3.3. Исследование возможности прогнозирования криоустойчивости спермы быков

3.3.1. Изучение уровня АТФ в сперме быков с различной оплодотворяющей способностью

Широкое использование криоконсервированной спермы быков в практике искусственного осеменения КРС требует разработки более надежных методов оценки её биологической полноценности. С целью совершенствования методов замораживания спермы быков необходимы более углубленные знания причин неодинаковой устойчивости семени различных производителей к глубокому замораживанию. Как известно, имеются быки с высокой и пониженной устойчивостью половых клеток к процессу замораживания, что проявляется в различной подвижности и живучести сперматозоидов после процесса замораживания - оттаивания (Наук В.А., 1982; Ерохин A.C., 1994).

По данным ряда исследователей, на подвижность сперматозоидов быков оказывает влияние концентрация АТФ в сперме (Aalbers J.G. е.а., 1985). Однако, оплодотворяющая способность спермы при этом не анализировалась.

Поэтому мы решили изучить содержание АТФ в нативных и криоконсервированных сперматозоидах быков, и взаимосвязь данного показателя с оплодотворяющей способностью спермы. Для опытов было отобрано 3 группы быков: с низкой, средней и высокой оплодотворяющей способностью спермы.

В первом опыте мы выясняли влияние криоконсервации спермы быков на содержание АТФ в половых клетках (таблица 4). Результаты этих опытов показали, что через 5 минут после оттаивания концентрация АТФ в сперматозоидах снизилась на 54% по сравнению с уровнем до замораживания. Пропорционально снижению уровня АТФ уменьшалась и подвижность сперматозоидов. Дальнейшая инкубация оттаянной спермы при 37°С в течение 2 часов практически не влияла на уровень АТФ в сперматозоидах, хотя их подвижность за этот период достоверно снизилась на 37% по сравнению с первоначальной.

Влияние криоконсервации на уровень АТФ в сперматозоидах быков

Образцы семени Число исследованных эякулятов Подвижность спермиев, % Содержание АТФ, нмоль/108 спермиев

До замораживания 105 80 ±3,7 16,2 ±0,7

Через 5 мин после 105 43 ± 1,8х 8,7 ± 0,3х

оттаивания

Через 60 мин после оттаивания 105 35 ± 1,0х 8,9 ± 0,4х

Через 120 мин

после оттаивания 105 28 ± 0,8х 8,5 ± 0,3х

х- Р<0,05

При этом нами установлена достоверная положительная корреляция между уровнем АТФ в спермиях и их подвижностью: 11=0,5 ( Р <0,01 ).

В следующем опыте мы проанализировали содержание АТФ в нативных и криоконсервированных сперматозоидах быков с различной оплодотворяющей способностью спермы. Анализ полученных данных показал, что у быков с высокой оплодотворяющей способностью спермы концентрация АТФ в нативных сперматозоидах была соответственно выше на 5 и 11% по сравнению с быками, характеризовавшимися низкой и средней фертильностью спермы. При определении содержания АТФ в сперматозоидах через 5 и 60 минут после оттаивания не было выявлено достоверных различий по этому показателю во всех группах. Через 2 часа инкубации оттаянной спермы при 37°С, концентрация АТФ в группе быков с высокой фертильностью была на 9% выше по сравнению с животными двух других групп (Р<0,05). В этой же группе сохранялась и более высокая подвижность сперматозоидов. Изучение коэффициента корреляции между содержанием АТФ в нативных сперматозоидах и оплодотворяющей способностью спермы быков разных групп, выявило незначительную положительную корреляцию по данным признакам. Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что по содержанию АТФ в нативных и криоконсервированных сперматозоидах нельзя надёжно прогнозировать оплодотворяющую способность спермы быков.

3.3.2. Уровень пероксидацни липидов в сперматозоидах быков с

различной устойчивостью к замораживанию

В литературе имеются данные, что при криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных могут активизироваться процессы перекисного окисления липидов в мембранных структурах половых клеток (Кононов В.П., 1982; Наук В.А., Гуськов А.М., 1983; Ерохин A.C. и др., 1991; Jones R.,Mann Т., 1976). В этой связи задачей наших исследований было изучение уровня содержания продуктов перекисного окисления липидов в оттаянной сперме у быков с высокой и низкой устойчивостью к замораживанию.

Для экспериментов на племпредприягии «Омское по племенной работе» было отобрано две группы быков черно-пестрой породы. Животные опытной группы характеризовались более высокой подвижностью и живучестью сперматозоидов. Подвижность сразу после оттаивания составляла 49%, а через 5 часов инкубации при 37°С - 32%. У быков контрольной группы была более низкая подвижность и живучесть половых клеток после оттаивания: сразу после оттаивания - 38%, а через 5 часов -11%. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида и липидных гидроперекисей) проводили сразу после оттаивания и через определенные интервалы времени инкубации спермы при 37°С. Результаты изучения содержания продуктов перекисного окисления липидов в образцах заморожено-отгаянной спермы быков разных групп представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Концентрация продуктов ПОЛ в оттаянных образцах спермы быков

Продолжительность инкубации оттаянной спермы при 37°С, мин Липидные гидроперекиси, отн.ед/мл Малоновый диальдегид, нмоль/мл

Опыт (п=5) Контроль (п=5) Опыт (п=5) Контроль (1=5)

5 мин после оттаивания 0,56 0,54 5,2 5,0

30 мин после оттаивания 1,26* 1,29* 5,6 5,4

60 мин после оттаивания 1,03* 1,05* 5,1 4,9

120 мин после оттаивания 0,75 0,79 5,1 5,2

*- Р < 0,05

Из таблицы видно, что через 5 минут после оттаивания концентрация липидных гидроперекисей в сперме быков с различной криоустойчивостью была практически одинаковой: 0,56 и 0,54 отн. ед/мл. Через 30 минут инкубации спермы быков при 37°С, концентрация липидных гидроперекисей увеличилась в группе с высокой криоустойчивостью половых клеток (опыт) в 2,2 раза, а в группе с пониженной устойчивостью -в 2,3 раза (Р<0,05). Затем концентрация липидных гидроперекисей в обеих группах снижалась практически в одинаковой степени. Уровень содержания малонового диальдегида в оттаянных образцах спермы был практически одинаковым в изучаемые интервалы времени у быков контрольной и опытной группы.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что различия в устойчивости сперматозоидов быков к глубокому замораживанию не были связаны с уровнем перекисного окисления липидов в опаянной сперме.

3.33. Активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью семени к замораживанию

В связи с изучением причин неодинаковой устойчивости половых клеток различных быков к глубокому замораживанию, мы решили выяснить вопрос о сравнительной активности в сперматозоидах быков с различной криоустойчивостью семени таких антиокислительных ферментов, как глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза. Известно, что от активности этих ферментов в значительной степени зависит устойчивость различных видов клеток к свободнорадикальному окислительному процессу (Журавлёв А.И., 1968; Афанасьев И.Б., 1988; Журавлев А.И., Пантюшенко В.Т., 1989; Владимиров Ю.А. и др., 1983; 1991).

Для экспериментов была отобрана сперма быков, которые характеризовались высокой или низкой устойчивостью к замораживанию. В каждой группе было по 5 быков. Сперму от этих быков замораживали в жидком азоте и после оттаивания анализировали подвижность половых клеток и активность в них антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Эксперименты показали, что в группе быков с низкой криоустойчивостью спермы подвижность оттаянных половых клеток в процессе инкубации при 37°С снижалась в гораздо более высокой степени, по сравнению с группой с высокой криоустойчивостью спермы. При этом подвижность оттаянных сперматозоидов в группе быков с пониженной криоустойчивостью была меньше через 5,60, 120,180,240 и 300 минут после оттаивания, соответственно, на 34,7% ; 35,8% ; 50% ; 54,1% ; 62,9% и 65,7% в сравнении с труппой с повышенной криоустойчивостью.

Анализ содержания антиоксидантных ферментов в сперматозоидах быков с разной криоустойчивостью семени показан в таблице 6.

Активность антиоксидантных ферментов в сперме быков с различной криоустойчивостью

Группа быков Исследовано ДОЗ Подвижность сперматозоидов сразу после оттаивания, % Активность глутатионпероксидазы, ед/г белка Активность глутатионредуктазы, ед/г белка

С высокой криоустойчивостью 15 49 ±1,7 34 ± 2,8х 4,0 ±2,1

С низкой криоустойчивостью 15 32 ±2,0 25 ±1,7 3,8 ± 1,5

х - Р<0,05

Результаты таблицы 6 свидетельствуют, что в сперматозоидах быков с повышенной криоустойчивостью семени активность фермента глутатионпероксидазы была на 36% выше по сравнению с группой быков с низкой криоустойчивостью семени (Р <0,05). В тоже время, активность фермента глутатионредуктазы была практически одинакова в сперматозоидах сравниваемых групп быков.

Таким образом, результаты этих исследований показали, что у быков с повышенной криоустойчивостью семени отмечается более высокая активность в половых клетках фермента глутатионпероксидазы.

3.3.4. Анализ фосфолипидного состава сперматозоидов с различной криоустойчивостью

В следующем опыте мы провели сравнительное изучение фосфолипидного состава половых клеток у быков двух сравниваемых групп. Результаты эксперимента показали, что заметных различий в фосфолипидном составе сперматозоидов сравниваемых групп быков не отмечается, за исключением уровня лизофосфатидилхолина.

У быков с высокой криоустойчивостью семени содержание этого фосфолипида было ниже на 27% по сравнению со второй группой (Р >0,05). В группе быков с низкой криоустойчивостью семени было выше на 4,3 % содержание фосфатидилэтаноламина (Р>0,05).

4. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что все изученные марки сухого соевого лецитина, за исключением «81егприг РС-гранулированный, обезжиренный», оказывают высокий защитный эффект при замораживании семени быков.

2. Изучение динамики изменений концентрации АТФ в замороженных сперматозоидах быков в связи со сроками хранения спермы, не выявили отрицательного влияния замораживания семени с сухим соевым лецитином на энергетический метаболизм в половых клетках.

3. Показано, что результативность осеменения коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином практически одинакова с группой, где использовали сперму, замороженную с желтком куриного яйца ( 46,9 % против 47.7%).

4. Выяснено, что замораживание семени быков в усовершенствованной трис-- фруктозо-лимоннокислой среде с добавлением желтка куриного яйца, способствует повышению подвижности, живучести и фертильности сперматозоидов по сравнению с использованием лактозо-глицерино-желточной среды. Оплодотворяемость при использовании усовершенствованной среды была выше на 7 % по сравнению с ЛГЖ средой.

5. Облучение семени быков перед замораживанием с помощью гелий-неонового и арсенид-галлиевого лазеров не оказало положительного влияния на устойчивость сперматозоидов к холодовому шоку и замораживанию, при всех изученных режимах обработки.

6. Изучение взаимосвязи между содержанием АТФ в дативной и криоконсервированной сперме быков и ее оплодотворяющей способностью, не выявило достоверной связи между этими показателями.

7. Установлено, что различия в устойчивости сперматозоидов разных быков к глубокому замораживанию не связаны с уровнем перекисного окисления липидов в оттаянных образцах семени.

8. Анализ содержания антиокислительных ферментов в сперме быков с различной устойчивостью к замораживанию показал, что в группе производителей с повышенной криоустойчивостью семени отмечается более высокая активность в половых клетках фермента глутатионпероксидазы.

9. Изучение фосфолипидного состава в семени быков с высокой и низкой криоустойчивостью, не выявило заметных различий по данному показателю между сравниваемыми группами.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагаем племпредприятиям для проведения широких производственных испытаний усовершенствованную трис-фруктозо-лимоннокислую среду с сухим соевым лецитином для замораживания спермы быков следующего состава: вода дистиллированная - 100 мл; трис-(оксиметил)-аминометан - 2,75 г; фруктоза - 0,8 г; лимонная кислота - 1,4 г, сухой соевый лецитин - 6 - 7 г; глицерин - 6 мл; полиген - 30 мг.

2. Рекомендуем племпредприятиям для замораживания семени быков использовать вместо лактозо-глицерино-желточной среды усовершенствованную трис-фруктозо-лимоннокислую среду с 20% желтка куриного яйца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ерохин A.C.. Добровольский Г.А. Замораживание семени быков в среде с сухим соевым лецитином. (Ерохин A.C., Добровольский Г.А.). // Молочное и мясное скотоводство. - 2009. - №5. - с. 16-17.

2. Добровольский Г.А. Влияние срока хранения спермы быков, замороженной в среде с соевым лецитином на биологическую полноценность сперматозоидов (Добровольский Г.А.). // Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. - Лесные Поляны, М.О. - 2008. - вып. 21. - с. 90 - 93.

3. Добровольский Г.А. Влияние лазерного излучения на криоустойчивость сперматозоидов быков (Добровольский Г.А). //Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. - Лесные Поляны, М.О. - 2009. - вып. 22. -с. 9-13.

4. Добровольский Г.А. Изучение пероксидации липидов и концентрации АТФ в сперматозоидах с различной устойчивостью к замораживанию. (Добровольский Г.А). //Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. - Лесные Поляны, М.О. - 2009. - вып. 22. - с. 35 - 38.

5. Ерохин A.C., Добровольский Г.А. Содержание антиокислительных ферментов в половых клетках быков с различной криоустойчивостью(Ерохин A.C., Добровольский Г.А.). //Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. - Лесные Поляны, М.О. - 2009. - вып. 22. - с. 115 - 117.

Заказ № 7_Объем 1.0 п.л._Тираж 60 зш.

Типография ВНИИ плем

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Добровольский, Геннадий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Воздействие повреждающих факторов при криоконсервацин семени сельскохозяйственных животных.

1.2. Приемы повышения устойчивости спермы быков к замораживанию.

1.3. Основные синтетические среды для криоконсервацин семени быков.

1.4. Способы прогнозирования устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию.

2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Изучение защитного влияния сухого соевого лецитина на устойчивость семени быков к глубокому замораживанию.

3.1.1. Анализ криозащитного влияния на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина.

3.1.2. Влияние срока хранения спермы быков, замороженной с лецитином, на биологическую полноценность сперматозоидов.

3.1.3. Результативность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной среде с сухим соевым лецитином.

3.1.4. Эффективность осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с желтком.

3.2. Изучение воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость семени быков.

3.2.1. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к холодовому шоку.

3.2.2. Влияние лазерного излучения на устойчивость сперматозоидов быков к глубокому замораживанию.

3.3. Исследование возможности прогнозирования криоустойчивости спермы быков.

3.3.1. Содержание уровня АТФ в сперме быков с различной фертильностью.

3.3.2. Уровень пероксидации липидов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью к замораживанию.

3.3.3. Активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах быков с различной устойчивостью семени к замораживанию.

3.3.4. Анализ фосфолипидного состава' сперматозоидов с различной криоу стойчивостью.

4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Повышение эффективности искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой"

Актуальность работы. В настоящее время для искусственного осеменения крупного рогатого скота во многих странах в основном применяется криоконсервированная сперма. Но несмотря на широкое применение, результативность осеменения коров всё ещё остается не достаточно высокой. При этом имеется целый ряд недостаточно изученных вопросов, которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров и тёлок замороженной спермой. Например, в процессе замораживания спермы быков погибает более половины сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка более совершенных синтетических разбавителей для спермы быков позволило бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе замораживания - оттаивания и их оплодотворяющую способность.

Слабо изучен также вопрос прогнозирования криоустойчивости спермы быков. Решение данной проблемы могло бы помочь в подборе производителей для племпредприятий с высокой устойчивостью спермы к замораживанию.

Как известно, имеются производители с высокой и пониженной устойчивостью половых клеток к процессу замораживания, что проявляется в различной подвижности и живучести сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания, а также в их оплодотворяющей способности.

В этой связи необходимы дальнейшие углубленные исследования в области совершенствования синтетических сред для замораживания спермы быков и изучения причин неодинаковой устойчивости половых клеток к криообработке.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение эффективности осеменения коров спермой, замороженной в различных средах и выяснение возможности прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов у быков.

Для достижения этой цели в диссертации были поставлены следующие задачи:

• изучить криозащитное влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина;

• выяснить влияние срока хранения спермы быков, замороженной в среде с соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток;

• изучить эффективность искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис-фруктозо-лимоннокислой среде с сухим соевым лецитином и нативным желтком куриного яйца;

• проанализировать воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения на криоустойчивость сперматозоидов быков;

• исследовать возможность прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков с помощью различных биологических методов.

Научная новизна исследований. Впервые изучено криозащитное влияние на сперму быков различных видов сухого соевого лецитина. Выяснено влияние разных сроков хранения спермы быков, замороженной с сухим соевым лецитином, на биологическую полноценность половых клеток. Проведены научно-производственные испытания эффективности искусственного осеменения коров спермой, замороженной в усовершенствованной трис - фруктозо - глицериновой среде с соевым лецитином и желтком куриного яйца. Проанализировано криопротективное влияние на сперму быков низкоинтенсивного лазерного излучения. Изучена взаимосвязь между уровнем АТФ в сперматозоидах быков и их оплодотворяющей способностью. Исследована возможность прогнозирования криоустойчивости сперматозоидов быков по содержанию в них продуктов перекисного окисления липидов, антиокислительных ферментов и фосфолипидов.

Практическая значимость. Усовершенствованная трис - фруктозо -лимоннокислая среда способствует повышению фертильности спермы быков, замороженной как с сухим соевым лецитином, так и с нативным желтком куриного яйца в сравнении с использованием лактозо - желточно — глицериновой среды. Изучение уровня антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезно с целью прогнозирования её криоустойчивости.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

• Ученом Совете ВНИИплем, 2007-2008 гг;

• Научно- производственной конференции на ВВЦ, 2007 г;

• Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в рецензируемом журнале.

Основные положения , выносимые на защиту:

- Сухой соевый лецитин обладает высокими криопротективными свойствами при замораживании семени быков.

Осеменение коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином, не снижает результативности искусственного осеменения.

Замораживание семени быков в усовершенствованной трис-фруктозо- лимоннокислой среде с желтком куриного яйца способствует повышению результативности искусственного осеменения коров по сравнению с ЛГЖ средой.

Изучение активности антиокислительных ферментов в сперме быков может быть полезным для отбора производителей с высокой устойчивостью семени к глубокому замораживанию.

Объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация включает 23 таблицы. Список литературы содержит 192 источника, в том числе 105 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Добровольский, Геннадий Александрович

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что все изученные марки сухого соевого лецитина, за исключением «Sternpur PC-гранулированный, обезжиренный», оказывают высокий защитный эффект при замораживании семени быков.

2. Изучение динамики изменений концентрации АТФ в замороженных сперматозоидах быков в связи со сроками хранения спермы, не выявили отрицательного влияния замораживания семени с сухим соевым лецитином на энергетический метаболизм в половых клетках.

3. Показано, что результативность осеменения коров спермой, замороженной с сухим соевым лецитином практически одинакова с группой, где использовали сперму, замороженную с желтком куриного яйца ( 46,9 % против 47.7 %).

4. Выяснено, что замораживание семени быков в усовершенствованной трис-- фруктозо-лимоннокислой среде с добавлением желтка куриного яйца, способствует повышению подвижности, живучести и фертильности сперматозоидов по сравнению с использованием лактозо-глицерино-желточной среды. Оплодотворяемость при использовании усовершенствованной среды была выше на 7% по сравнению с ЛГЖ средой.

5. Облучение семени быков перед замораживанием с помощью гелий-неонового и арсенид-галлиевого лазеров не оказало положительного влияния на устойчивость сперматозоидов к холодовому шоку и замораживанию при всех изученных режимах обработки.

6. Изучение взаимосвязи между содержанием АТФ в нативной и криоконсервированной сперме быков и ее оплодотворяющей способностью, не выявило достоверной связи между этими показателями.

7. Установлено, что различия в устойчивости сперматозоидов разных быков к глубокому замораживанию не связаны с уровнем перекисного окисления липидов в оттаянных образцах семени.

8. Анализ содержания антиокислительных ферментов в сперме быков с различной устойчивостью к замораживанию показал, что в группе производителей с повышенной криоустойчивостью семени отмечается более высокая активность в половых клетках фермента глутатионпероксидазы.

9. Изучение фосфолипидного состава в семени быков с высокой и низкой криоустойчивостью не выявило заметных различий по данному показателю между сравниваемыми группами.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагаем племпредприятиям для проведения широких производственных испытаний усовершенствованную трис-фруктозо-лимоннокислую среду с сухим соевым лецитином для замораживания спермы быков следующего состава: вода дистиллированная - 100 мл; трис-(оксиметил)-аминометан - 2,75 г; фруктоза - 0,8 г; лимонная кислота - 1,4 г; сухой соевый лецитин - 6 - 7 г; глицерин - 6 мл; полиген - 30 мг.

2. Рекомендуем племпредприятиям для замораживания семени быков использовать вместо лактозо-глицерино-желточной среды усовершенствованную трис-фруктозо-лимоннокислую среду с 20% желтка куриного яйца.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Добровольский, Геннадий Александрович, п. Лесные Поляны Московской обл.

1. Аветисян Б.Н., Манасян А.С., Саакян Ш.С. О значении двойного лучепреломления и ориентации молекул в мембранах в оценке качества семени быка /Аветисян Б.Н., Манасян А.С., Саакян Ш.С.// Армянский биологический журнал. 1985. - т.38 - 33. - с. 272 - 273.

2. Антонюк B.C. Биохимический контроль за качеством спермы хряков /Антонюк B.C.// Доклады ВАСХНИЛ. 1980. - №1. - с, 27 - 30.

3. Афанасьев И.Б. Свободнорадикальные ингибиторы и промоторы в биологических процессах /Афанасьев И.Б. //Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига. - РМИ. - 988. - с. 9 - 25.

4. Белоус А.Н., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении /Белоус А.Н., Бондаренко В.А.//Киев.: Наукова Думка. 1982.-256 С.

5. Бернштейн А.Д., Петропавловский В.В. Влияние неэлектролитов на переживание сперматозоидов /Бернштейн А.Д.,.Петропавловский В.В.// Бюл. Экспер; Биологии и Медицины. 1937. — вып. 1. - с. 21 - 25.

6. Бородин И.Ф., Будаковский А.В., Будаковская О.Н. и др. Использование когерентного электромагнитного излучения в производстве продукции растениеводства /Бородин И.Ф., Будаковский А.В., Будаковская О.И; и др. // Доклады РАСХН. 1996. - № 5. - с. 41 - 44.

7. Бугров , А.Д. Способ оттаивания замороженной спермы- быков в различной упаковке /Бугров А.Д. //Животноводство!- 1976.-№ 2 — с.57 — 59.

8. Бугров А.Д. Способ оттаивания замороженной спермы быков в различной упаковке /Бугров А.Д. // Животноводство. — 1976. № 12. - с. 57-59.

9. Ю.Бугров А.Д., Осташко Ф.И., Олесенко Т.И. Сверхбыстрое оттаивание спермы быков-производителей /Бугров А.Д., Осташко Ф.И., Олесенко Т.И. // Молочное и мясное скотоводство. 1978. - № 12.-е. 24 -25.

10. Варнавский А.Н. Влияние метода замораживания и глицерина на подвижность и ультраструктуру живчиков /Варнавский А.Н. // Овцеводство. 1970. - № 8. - с. 22-23.

11. Варнавский А.Н. Изучение акросомы спермиев барана с помощью фазовоконтрастной микроскопии /Варнавский А.Н.//Доклады ВАСХНИЛ. 1978. - № 8. - с. 33 - 34.

12. Вишневский В.И., Скорняков Б.А. Низкотемпературное криоконсервирование спермы сельскохозяйственных животных. // Актуальные проблемы криобиологии /Вишневский В.И., Скорняков Б.А.// Киев: Наукова Думка. -1981.-е. 248 - 280.

13. Вишневский В.И. Повышение качественных показателей спермы быков УЗ обработкой /Вишневский В.И.//УЗ в сельском хозяйстве. Межвуз. сб. н. тр. - Москва. - 1988. - с. 55 - 57.

14. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко Л.Я. Биофизика /Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко Л.Я.//— М. Медицина. -1983.

15. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев О.А. и др. Свободные радикалы в живых системах /Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев О.А. и др. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1991. - т. 29.

16. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови /Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. // Лабораторное дело. 1983. - № 3.-е. 33-35.

17. Гуськов A.M. Криогенные изменения липидов и функциональная полноценность гамет хряков и быков /Гуськов А.М.//Автореф. дисс. канд. биол. наук. Львов. - 1984.

18. Гуськов A.M., Дмитриенко Н.Г., Букарчук М.Г. Особенности криогенных изменений липидов плазматических мембран и функционального состояния гамет быка и хряка /Гуськов A.M., Дмитриенко Н.Г., Букарчук М.Г. //Доклады ВАСХНИЛ. 1989.- № 2. -с. 26-28.

19. Данов Д.Т., Ковачев К., Попов Д.В. Исследования ввъерху ультраструктурните изменения на сперматозоидите на коча при криоконсервация /Данов Д.Т., Ковачев К., Попов Д.В.// Криобиология на половите клетки. София. - 1983. - с. 155 — 179.

20. Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Лапрун И.Б. и др. Физико химические механизмы биологического действия лазерного излучения /Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Лапрун И.Б. и др.// Успехи совр. биологии. - 1987. — Вып. 1 - т. 103.-с. 31-43.

21. Деряженцев В.И. Синтетическая среда для замораживания спермы быков в соломинках /Деряженцев В.И.// Биология воспроизведения и технология искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. М. - 1986. - с.31 - 37.

22. Евтух В.П. Совершенствование метода криоконсервации семени крупнорогатого скота с использованием биологически активных веществ /Евтух В.П. // Автореф. дисс.канд. биол. наук. Лесные Поляны. М.О. -2004. 20 с.

23. Ерохин А.С., Платов Е.М., Тимофеев К.Н. Структурное состояние мембраны сперматозоидов барана и быка после криовоздействия /Ерохин А.С., Платов Е.М., Тимофеев К.Н.// Доклады ВАСХНИЛ- 1989. № 3. - с. 19-21.

24. Ерохин А.С., Деряженцев В .И. Перекисное окисление липидов в сперме баранов /Ерохин А.С., Деряженцев В.И.// Овцеводство. 1991. - № 3. - с. 17-19.

25. Ерохин А.С. Изучение пероксидации липидов в компонентах • разбавителей спермы животных /Ерохин А.С.// Доклады ВАСХНИЛ.1992.-№6.-с. 42-44.

26. Ерохин А.С. Физиологические аспекты криорезистентности. спермы баранов и быков /Ерохин А.С.// Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Дубровицы. 1994.

27. Ерохин А.С., Коган И.Г., Барсель В.А. Активность супероксиддисмутазы в сперме барана и быка при криоконсервации /Ерохин А.С., Коган И.Г., Барсель В.А.//Сельскохозяйственная биология. 1995.-№4.-с. 50-51.

28. Ерохин А.С., Лехмус И.А. Определение содержания АТФ биолюминисцентным методом в сперматозоидах барана после криообработки /Ерохин А.С., Лехмус И.А.// Доклады РАСХН. 1996. -№ 1. — с. 32-34.

29. Ерохин А.С., Дунин И.М., Евтух В.П. и др. Синтетическая среда для замораживания спермы быков /Ерохин А.С., Дунин И.М., Евтух В.П. и др. // Патент на изобретение № 2323701.- Бюлл. № 13 2008.

30. Журавлев А.И. Биоантиокислители и их роль в регуляции окислительных процессов /Журавлев А.И.// М. - 1968 - с. 7 - 14.f

31. Зверева Г.В., Чухрий В.Н., Клевец JI.A. Сукцинатдегидрогеназная активность спермы быков и качество спермы /Зверева Г.В., Чухрий В.Н., Клевец JI.A.// Сельскохозяйственная биология. 1989. -№ 6.-с. 30-33.

32. Ковалев М.Г. Способ удлинения переживаемости и повышения оплодотворяющей способности спермы /Ковалев М.Г.// Описание изобретения к авт. свид. № 402365 — 19.10. 1973 г.

33. Кононов В.П. Замораживание семени хряка. Теория и практика /Кононов В.П. //Автореф. дисс.докт. биол. наук. Дубровицы. - 1982.

34. Кононов В.П. Глубокое замораживание семени хряков. Новое в теории и практике /Кононов В.П.//Теория и практика воспроизведения животных. М.: Колос. - 1984. - с. 241 - 256.

35. Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных /Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В.// Л.: Агропромиздат - 1988. - 256 С.

36. Ленинджер А. Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции /Ленинджер А.// М.: Мир. - 1966.

37. Лозино-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии: адаптация и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам /Лозино-Лозинский Л.К.// Л.: Наука. - 1972. - 288 С.

38. Лопатко М.И., Тюпина К.Ф. Замораживание спермы быка без глицерина /Лопатко М.И., Тюпина К.Ф.// Молочное и мясное скотоводство. 1971. - № 4. - с. 24.

39. Луговой В.И., Моисеев В.А. Влияние низких температур на растворимые ферменты /Луговой В.Н.3 Моисеев В.А.// Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1978. - т. 9. - с. 53 - 79.

40. Лянсберг Э.С. Изучение защитного действия гипертонических сред и полиолов при замораживании семени барана /Лянсберг Э.С.// Направления' и новые результаты исследований' по биологии воспроизведения. Дубровицы-. - 1974.- ч. 1. — с. 27 - 30i

41. Максудов Г.Ю., Артюшенкова В.А., Трошко Е.В. Оценка качества семени животных. Консервация генетических ресурсов /Максудов Г.Ю., Артюшенкова В.А., Трошко Е.В.// - Пущино. - 1987. - 43 С.

42. Малиновская В.А. Оптимальные режимы замораживания спермы быков в соломинках /Малиновская В.А.//Совершенствование методов воспроизводства и искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. М. 1983. - с. 100 - 108.

43. Маринов П.И., Златарев С.Т., Грудова Ч.Н. Среды за консервация на овчи сперматозоиди /Маринов П.И., Златарев С.Т., Грудова Ч.Н.// Криобиология на половите клетки. София. — 1983. — с. 86 101.

44. Милованов В.К., Соколовская И.И. Теория холодового удара живчиков млекопитающих /Милованов В.К., Соколовская И.И.// Доклады ВАСХНИЛ. 1959. - № 8. - с. 3 - 9

45. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственного осеменения животных /Милованов В.К.// М. - 1962.

46. Милованов В.К., Жильцова JI.C. Комплексонаты металлов в средах для семени сельскохозяйственных животных /Милованов В.К., Жильцова JI.C. //Вестник сельскохозяйственной науки. 1982 - № 2. - с. 58 - 66.

47. Милованов В.К., Соколовская И.И. Теория и практика воспроизведения животных /Милованов В.К., Соколовская И.И.// М. 1984.

48. Мороз Л.Г. Значение серосодержащих соединений в устойчивости спермы к замораживанию /Мороз Л.Г. // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. -№9.-с. 51-55.

49. Нарижный А.Г., Ерохин А.С., Рогачев Н.В. Влияние антиоксидантов и способов криоконсервацин на пероксидацию липидов в сперме хряка /Нарижный А.Г., Ерохин А.С., Рогачев Н.В. //Доклады РАСХН. 1993. -№ 6. - с. 32-34.

50. Нарижный А.Г., Ерохин А.С. Активность супероксиддисмутазы в нативной и криоконсервированной сперме хряков /Нарижный А.Г., Ерохин А.С. // Доклады РАСХН. 1995. - № 1. - с. 37 - 38.

51. Наук В.А. Синтетическая среда для разбавления и замораживания семени сельскохозяйственных животных /Наук В.А.//Бюлл. изобретений и открытий. 1976. - № 4.

52. Наук В.А. Криоконсервация семени животных. Консервация генетических ресурсов /Наук В.А.// -Пущино. 1982.

53. Наук В.А., Гуськов A.M. Особенности перекисного окисления липидов при замораживании спермы быков и хряков /Наук В.А., Гуськов A.M. // Доклады ВАСХНИЛ. 1983. - № 2. - с. 27 - 29.

54. Николаев И., Георгиев С., Чизмаров К. Влияние на лазерного изльчване въерху семена течност от бици при технологиятаза криоконсервация /Николаев И., Георгиев С., Чизмаров К.// Животновъдни науки. София.- 1986.-т. 23.-№ 11.-с. 3-7.

55. Николов И. Нестерова Ю. Ефект на нискоинтензивно лазерно лъчение въерху биологичните качества и оплодителната способност на сперматозоиди от кочове /Николов И. Нестерова Ю.//Животновъдни науки. София. - 1994. - № 1 - № 4 - с. 210 - 212.

56. Осташко Ф.И. Причины и механизмы холодового удара клеток /Осташко Ф.И.// Международный сельскохозяйственный журнал. 1964.- № 3 с. 106- 109.

57. Осташко Ф.И., Строна В.И, Кузнецов Г.Н. Влияние Р глюкуронидазы на качественные показатели спермы производителей /Осташко Ф.И., Строна В.И, Кузнецов Г.Н.// Животноводство. - 1974. - № 4. - с. 53 - 54.

58. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей /Осташко Ф.И.// Киев. Урожай. 1978. - 254 С.

59. Пакенас П.И. Исследование сперматогенеза и усовершенствование технологии взятия и обработки семени /Пакенас П.И. // Автореф. дисс. .докт. биол. наук. Таллин. 1972.

60. Пакенас П.И., Гинкявичус Г., Ленкутис В. Байсогальская технология кормления, содержания, подготовки быков к взятию семени, его криоконсервации и использования /Пакенас П.И., Гинкявичус Г., Ленкутис В.// Вильнюс. - 1980. - 89 С.

61. Панасенко О.М. Перекисное окисление липидов влияет на перенос холестерина между липопротеинами высокой плотности и биомембранами /Панасенко О.М. // Биологические мембраны. 1987. -т. 12-№4.-с. 1319- 1324.

62. Платов Е.М. Теоретические и практические основы замораживания семени производителей сельскохозяйственных животных /Платов Е.М. // Автореф. дисс.докт.биол.наук. Дубровицы. - 1973.

63. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков И.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования /Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков И.Д.// Киев: Наукова Думка. - 1984.

64. Рэ JI. Консервация жизни холодом /Рэ JI.// М. - 1962.

65. Семаков В.Г. Активность сукцинатдегидрогеназы в процессе замораживания и оттаивания спермы быков и хряков /Семаков В.Г. // Доклады ВАСХНИЛ. 1984.- № 2. - с. 26 - 27.

66. Семенова В.А. Защитные свойства отдельных факторов желтка куриного яйца при замораживании семени животных /Семенова В.А. // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Дубровицы. - 1987.

67. Смирнов И.В. Сохранение спермы сельскохозяйственных животных посредством глубокого охлаждения /Смирнов И.В.// Дисс. канд. биол. наук. -М. 1949.

68. Смирнов И.В. К теории глубокого охлаждения спермы /Смирнов И.В.// Животноводство. 1974. - № 11. - с. 65 - 70.

69. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения /Смит О.// М.: И.Л. - 1963.

70. Соколовская И.И., Ойвадис Р.Н., Абилов А. О значении акросомы в оценке семени самцов /Соколовская И.И., Ойвадис Р.Н., Абилов А.//Животноводство. 1981. - № 9. - с. 45 - 46.

71. Солсбери Г.У., Ван Демарк Н.Л. Теория и практика искусственного осеменения коров в США /Солсбери Г.У., Ван - Демарк Н.Л. // М.: Колос. - 1966.

72. Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Трдян И.О. и др. Биолюминисцентные методы анализа в микробиологии /Угарова Н.Н., Бровко Л.Ю., Трдян И.О. и др. //Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - т. 21 - № 1. — с. 134-141.

73. Успенский А.Н. Углеводно-белковые соединения и воспроизводительная функция животных /Успенский А.Н.//Автореф. дисс .докт. биол. наук. — Дубровицы. — 1991.

74. Ушатинская Р.С. Скрытая жизнь и анабиоз /Ушатинская P.C.//-ML: Наука. 1990.

75. Федина Н.И. Криозащитное влияние различных антиоксидантов и БАД при хранении спермы хряков в охлажденном и замороженном состоянии /Федина Н.И.// Автореф. дисс.канд. биол. наук. Лесные Поляны. -2007. - 20 С.

76. Хабибуллин И.Х., Каримов Л.Г., Цуканов Д.Ш. и др. Синтетические соломинки для хранения семени быков /Хабибуллин И.Х., Каримов Л.Г., Цуканов Д.Ш. и др. // Животноводство. 1973. - № 1. - с. 24 - 25.

77. Чухрай Б.Н., Клевец Л.А. Физиологические показатели спермы быков и оплодотворяющая способность сперматозоидов /Чухрай Б.Н., Клевец Л.А.// Сельскохозяйственная биология. — 1992. № 6. — с. 50 — 58.

78. Ющенко Н.П., Семаков В.Г., Левин К.Л. Замораживание спермы быков в гранулах без применения сухого льда /Ющенко Н.П., Семаков В.Г., Левин К.Л. // Молочное и мясное скотоводство. 1968. - № 5. - с. 32 -37.

79. Ющенко Н.П. Методические рекомендации по криоконсервацин, хранению и использованию семени быков, замороженного в гранулах жидким азотом /Ющенко Н.П. //- М. 1979.

80. Ahmad K., Foote R.H. Motility and ferbility of frozen^ bull spermatozoa in tris yolk and milk extenders containing amicacin sulphate /Ahmad K., Foote R.H.// J.Dairy Sci. - 1985. - v. 68. - p. 2083 - 2086.

81. Ahmad K., Foote R.H. Post-thaw survival and fertility of frozen bull spermatozoa treated with antibiotics /Ahmad K., Foote R.H. // J. Dairy Sci. -1986.-v. 69.-p. 535-541.

82. AI-Hanak X., Грудова Ч., Захариев Э е.а. Влияние на витамин А въерху някои показатели сперматозоидите от бик при криоконсервации /Al-Hanak X., Грудова Ч., Захариев Э е.а.// Животновъдни науки 1989. - т. 26. - № 5. - с. 80-83.

83. Almquist J.O. Effect of cold shock after thawing on acrosomal maintenance and mobility of bovine spermatozoa frozen in plastic straws /Almquist J.O.// J. Dairy Sci. 1976. - v. 59. - p. 1825 - 1829.

84. Amann R.P. Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accurately /Amann R.P. // J. Androl. 1989. - v. 10. - p. 89-98.

85. Arriola J., Foote R. Glycerolation and thawing effect on bull spermatozoa frozen in deterdent treated egg-yolk and whole egg extenders /Arriola J., Foote R. // J. Dairy Sci, 1987. - v. 70. - p. 1664 - 1670.

86. Belorkar P.M., Dhami A.J., Kodagali S.B. Physico-biochemical semen haracteristics of good and poor freezability crossbred bulls /Belorkar P.M., Dhami A.J., Kodagali S.B. // Indian J. Anim. Sci. 1988. - v. 58. - № 12. - p. 14-16.

87. Brooks D.E. Observation on the content of ATP and ADP in bull spermatozoa using the firefly luciferase system /Brooks D.E.// J. Reprod. Ferttil. 1970. - v. 23. - p. 525-528.

88. Cassou R. La method des paillettes en plastique adapt a la generalization de la congelation /Cassou R.//5lh proc. Int. Cong. Anim. Reprod. And A.I. Trento - 1964-p. 14-17.

89. Chen Y., Foote R.H., Brockett C.C. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine and blood serum on survival of frozen bull sperm /Chen Y., Foote R.H., Brockett C.C. //Cryobiology. 1993. - v. 30. - p. 223-231.

90. Christensen P., Guo Z., Pedersen K.M. e.a. The viability, motility and fertility of bovine semen frozen in Triladyl and Biociphos plus /Christensen P., Guo Z., Pedersen K.M. e.a.// ESDAR Newsletter. 2000. - № 5. - p. 25.

91. Comhair F., Vermeubn L., Chedira К. e.a. ATP in humansemen /Comhair F., Vermeubn L., Chedira K. e.a. // Fertil. Steril. 1984. - v. 40. - № 3-4. - p. 500-504.

92. Curry M.R., Watson P.F. Osmotic effects on ram and human sperm membranes in relation to thawing injury /Curry M.R., Watson P.F.// Cryobiology. 1994. - v. 31. - p. 39 - 46.

93. Darin Bennet A., Poulos A., White J. The effect of cold shock and freeze - thawing on release of phospholipids by ram, bull and boar spermatozoa /Darin - Bennet A., Poulos A., White J. // Austr. J. Biol . Sci. - 1973. - v. 26.-p. 1409-1420.

94. Darin- Bennet A., Poulos A., White J. The fatty acid composition of the major phosphoglycerides of ram and human spermatozoa /Darin- Bennet A., Poulos A., White J. // Andrologia. 1976. - v. 8. - p. 37-45.

95. Davis I.I., Bratton R.W. Foote R.H. Livability of bovine spermatozoa at 5 -25 and 85 С in Tris — buffered and citrate — buffered yolk — glycerol extenders /Davis I.I., Bratton R.W. Foote R.H. // J. Dairy Sci. - 1963. - v. 46 -p. 333 -336.

96. Elliot F.J., Sherman J.K. A photographic method of measuring percentage of progressively motile sperm cell using Dark-Field microscopy /Elliot F.J., Sherman J .K.// 8 Int. Simp. Zoot. Milan, - 1973. - p. 160-169.

97. I.Evans R.W., Setchell B.P. Association of exogenousphospholipids with spermatozoa /Evans R.W., Setchell B.P.//J. Reprod. Fertil.- 1978. v. 53. - № 2. - p. 357 - 362.

98. Evenson D.P., Darzynkiewich Z., Melamed M.R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility /Evenson D.P., Darzynkiewich Z., Melamed M.R.// Science. 1980. - v. 210. - p. 1131-1133.

99. Fahy G.M. The relevance of cryoprotectant toxicity to cryobiology /Fahy G.M. // Cryobiology. 1986. - v. 23. - p. 1-13.

100. Folch J., Lees M., Sloane -Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues /Folch J., Lees M., Sloane -Stanley G. // J. Biol. Chem. 1957. - v. 226. - p. 497-509.

101. Foote R.H., Chen Y., Brockett C.C. Fertility of bull spermatozoa frozen in whole milk extenders with thehalose, taurine or blood serum /Foote R.H., Chen Y., Brockett C.C.// J.Daily Sci. 1993. - v. 76. - p. 1908 - 1913.

102. Foote R., Kaproth M.T. Sperm numbers inseminated in dairy cattle and non- return rates revisited /Foote R., Kaproth M.T. // J. Dairy Sci. 1997. - v. 80.- p: 3072-3076.

103. Foote R., Brockett C.C., Kaproth M.T. Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants /Foote R., Brockett C.C., Kaproth M.T. // Animal Reprod. Sci. 2002. - v. 71. - p. 13-23.

104. Foulkes J. The separation of lipoproteins from egg yolk and their effect on the motility and integrity of bovine spermatozoa /Foulkes J.// J. Reprod. Fertil.- 1977 v. 49.-p. 277-284.

105. Foulkes J.A., MacDonald B.J. The relationship between ATP content and motility of bovine spermatozoa /Foulkes J. A., MacDonald B.J.// Theriogenology. 1979. - v. 11. -№>4.-p. 313-319.

106. Garner D.L. Assessment of spermatozoal function using dual fluorescent staining and flow cytometric analyses /Garner D.L. // Biol. Reprod. 1986. -v. 34. - № Г.-p. 127-138.

107. Gamer D.L., Johnson L.A. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide /Garner D.L., Johnson L.A. // Biol. Reprod. 1995. - v. 53. - p. 276-284.

108. Grafter Т. Effect of catalase on fertility results of frozen bull semen /Grafter Т. // 11 Int. Congr. Anim. Reprod. and A.I. Dublin, Ireland.- 1988.-v. 3. p. 264.

109. Graham J.K., Hammersteadt R.H. Differential effects of butylated hydroxytoluence analogs on bull sperm subjected to cold-induced membrane stress /Graham J.K., Hammersteadt R.H. // Cryobiology. 1922. - v. 29. - p. 106-117.

110. Graham j.k., Foote R.H. Effect of several lipids, fatty acyl chain length and degree of unsaturation of the motility of bull spermatozoa after cold shock and freezing /Graham J.K., Foote R.H.// Cryobiology. 1987. - v. 24. - p. 42-52.

111. Graham J.K., Kunze E., Hammerstedt R.H. Analysis of sperm cell viability, acrosomal integrity and mitochondrial function using flow cytometry /Graham J.K., Kunze E., Hammerstedt R.H.// Biol. Reprod. 1990. -v. 43. -№ l.-p. 55-64.

112. Hammerstedt R.H., Parks J.E. Changes in sperm surfaces associated with epididymal transit /Hammerstedt R.H., Parks J.E. // J. Reprod. Fert. 1987. -suppl. 34.-p. 133-149.

113. Harrison R.A., Hancock D.D., Conrad H.R. Vitamin E and selenium for reproduction of the dairy cows /Harrison R.A., Hancock D.D., Conrad H.R. // J. Dairy Sci. 1984. - v. 67. - p. 123-132.

114. Jeyendran R. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to their semen characteristics /Jeyendran R.// J. Reprod. Fert. 1984. - v. 70. - №1. - p. 218-219.

115. Jones R.C. Influence of diluents and processing times after ejaculation on the survival of deep-frozen ram spermatozoa /Jones R.C.// Austr. J. Biol. Sci.- 1969. v. 22. - № 4. - p. 995 - 1004.

116. Jones R., Mann T. Lipid peroxidation in spermatozoa /Jones R., Mann T.// Proc. R. Soc. Lond. 1973 - v. 184. - p. 103-107.

117. Jones R., Mann T. Lipid peroxidation in spermatozoa : formation, role of plasmologen and physiological significance /Jones R., Mann T.// Proc. R. Soc. Lond. В.-1976.-v. 193.-p. 317-333.

118. Jones R., Stewart D. The effect of cooling to 5°C and freezing and thawing on the ultrastructure of bull spertizoa /Jones R., Stewart D.// J. Reprod. Fert. -1979.-v. 56.-№ l.-p. 233-238.

119. Junca A.M., Man delblaun G., PlachotM. Test de fecondance du sperme human : iteret, limites, perspectives /Junca A.M., Man delblaun G., Plachot M. // Contr. Fertil. Sexual. 1984. - v. 12. - № 3. - p. 491-494.

120. Kampachmidt R.F., Meyer D.T., Herman H.A. Lipid and lipoprotein constituents of edg — yolk in the resistence and storage of bull spermatozoa /Kampachmidt R.F., Meyer D.T., Herman H.A. // J.Daily Sci. 1953. - v. 36. - № 3 - p. 733 - 742.

121. Killian G., Honadel Т., McNutt Т. e.a. Evaluation of butylated hydroxytoluence as a cryopreservative added to whole or skim milk diluent for bull sperm /Killian G., Honadel Т., McNutt T. e.a. // J. Dairy Sci. 1989. -v. 72.-p. 1291 - 1295.

122. Kjaestad H., Ropstad E., Andersen Berg K. Evaluation of spermatological parameters used to predict the fertility of frozen bull semen /Kjaestad H., Ropstad E., Andersen Berg K. // Acta Vet. Scand. 1993. - v. 34. - p. 299303.

123. Kreider J.L., Tindall W.C., Potter G.D. Inclusion of bovine serum albumin in semen extenders to enhance maintenance of stallion sperm viability /Kreider J.L., Tindall W.C., Potter G.D. // Theriogenology. 1985. - v. 23. -p. 399-408.

124. Kruu V.J., Keith A.D. The importance of cell membrane lipids in cryobiology /Kruu V.J., Keith A.D.// Cryobiology. -1975. -v. 12. № 6.- p. 553.

125. Kunze C., Peter W., Mudra K. e.a. Vergleich ende Untersuchungen zur Gefrierkonservirung von Ebersperma /Kunze C., Peter W., Mudra K. e.a.// Arch. Exper. Vet Med. 1982. - v. 36. - № 1. - p. 133-139.

126. Levitt J.A. Sulphydril disulfide hypothesis of frost ihjurity and resistance in plants /Levitt J.A. // J. Theoret. Biol. - 1962. - № 3. - p. 183

127. Linford E. The relationship between semen evaluation methods and fertility in the bull /Linford E. // J. Reprod. Fert. 1976. - v. 47. - p. 283-291.

128. Lovelock J.E., Bishop M.W. Preventation of fruziny damage to living cell by dimethyl sulphoxide /Lovelock J.E., Bishop M.W.// Nature. -1959.-v. 183.-p. 1384- 1395.

129. Luyet B.J., Gehenio P. Life and death at low temperatures /Luyet B.J., Gehenio P. // Biodynamica. 1940 - p. 1 - 341.

130. Mahmoud M.F. Comparative study of the phosphatases activity in fresh and frozen semen of bovine /Mahmoud M.F. // Ind . Vet. J.- 1986. -v. 63. № 5.-p. 393-396.

131. Mann T. The biochemistry of semen and of the male reproduction tract. /Mann T.//-N-Y. —1964.

132. Maryman H.T., Williams R.J., Douglas M.S. Freezing injurey from "Solution effect" and its prevention by natural or artificial cryoprotection /Maryman H.T., Williams R.J., Douglas M.S.// Cryobyology. 1977. - v. 14. - № 3. - p. 287-302

133. Mazur P. Kinetics of water loss from sell at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing /Mazur P.// J. Gen. Physiol. 1963. - v. 47.-p. 347-369.

134. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems /Mazur P.// Science. 1970. - v. 168. - № 5153 - p. 939-959.

135. Mazur P. The role of intracellulare fruzing in the death of cell cooled at supraoptimal rates /Mazur P. // Cryobiology. 1977. - v. 14. - p. 251 - 272.

136. Mazur P. Freezing of living cells : mechanisms and implications /Mazur P. // Am. J. Physiol. 1984. - v. 247. - p. 125 - 142.

137. Melrose D.R. Artificial insemination in cattle /Melrose D.R.// In: Maule J.P. (Ed). The semen of animals and artifitial insemination. Commowealth Agricultural Bureau, Farnham Royal, Bucks, England. 1962. — p. 1 - 181.

138. Mohan G., Sahni K.L., Dhami A.J. e.a. Prediction of freezability on the basis of seminal plasma enzymatic profiles in Murrah, Friesian and crossbred bulls /Mohan G., Sahni,K.L., Dhami A.J. e.a. // Ind. J. Anim. Sci. 1992. - v. 62;-№ 9.-p; 811-815.

139. Nagase H., Niwa N; Deep- freezing bull semen in concentrated pellet form /Nagase H., Niwa N. // 5 Int. Congr. Animal Reprod. Trento. 1964. - v. 4 -p. 410-415.

140. Nagase H. Protective effect of poliols against freezing injury of bull spermatozoa /Nagase H. // 6 Int. Congr. Anim. Reprod. and A.I. Paris. -1968.-v. 2.-p. 1103.

141. Nath J. Correlative biochemical and ultrastructural studies on the mechanism of freezing damage the ram semen /Nath J.// Cryobiology. 1972. - v. 9. - p. 240-246.

142. Pace M., Graham E. Components in egg yolk wich protecr bovine spermatozoa during freezing /Расе M., Graham E. // J.Anim.Sci. 1974. - v. 39.-p. 1144-1149.

143. Pangawkar G.R., Sharma R.D. Phosphatase and transaminase activity in the seminal plasma of bull in relation to freezability of semen /Pangawkar G.R., Sharma R.D. // Theriogenology. 1988. - v. 29. - № 6 - p. 1393 -1399.

144. Parkinson T. J., Whitfield C. Optimisation of freezing condition for bovine spermatozoa /Parkinson T. J., Whitfield C. // Theriogenology. 1987. - v. 27. -p. 781-797.

145. Phillips P.H., Lardy H.A. A yolk buffer pabulum for the preservation of bull semen /Phillips P.H., Lardy H.A. // J. Dairy Sci. - 1940. - v. 23. - p. 339404.

146. Philpott M. The dangers of disease transmission by artificial insemination and embryo transfer /Philpott M. // Br. Vet. J. 1993. - v. 149. - p. 339 -369.

147. Pickett В., Hall R.C., Lucas J.J.e.a. Investigations on thawing frozen bovine spermatozoa /Pickett В., Hall R.C., Lucas J.J.e.a.// Fertil. Steril. 1965. - v. 16.-p. 642-651.

148. Plammer J.M., Robertson L., Watson P.F. Accumulation' of calcium in cold-shocked spermatozoa of the ram and its intracellular localization using pyroantimonate /Plammer J.M., Robertson L., Watson P.F. // J. Physiology. -1985.- v. 365. -№ l.-p. 65.

149. Polge С., Smith A.I., Parkers A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and degidratation at low temperature /Polge C., Smith A.I., Parkers A.S. // Nature. ~ 1949. v. 164. - № 4172.- p. 666-667.

150. Polge C., Rowson L.E. Fertilization capacity of bull spermatozoa after freezing at -79°C /Polge C., Rowson L.E. // Nature. 1952. - v. 169. - № 4307. - p. 626-627.

151. Prendergast E., Vishwanath R., Shannon P. e.a. Charged lipoprotein fractions of egg yolk in bovine semen diluents /Prendergast E., Vishwanath R., Shannon P. e.a. // Proc. 26 Ann. Conf. Austr. Soc. Reprod. Biol. -Brisbane. 1994. - v. 26. - p. 113.

152. Robertson L., Watson P. Calcium transport in diluted or cooled ram semen /Robertson L., Watson P. // J. Reprod. Fertil. 1986. - v. 77. - p. 177-185.

153. Rodrigues Martinez H. Optimization of sperm quality in A.I. bulls /Rodrigues - Martinez H. // Reprod. Domest. Animals - 1998. - v. 33. - p. 233-237.

154. Salisbury G.W., Van Demark N. L. Physiology of reproduction and artificial insemination of cattle /Salisbury G.W., Van Demark N. L.// Freeman, San Francisko. 1961.

155. Saton K. Serum lipid peroxide in celebrovascular disorders determined by a new colorimetric method /Saton K. // Clinica Chemica Acta. 1978. - v. 90. -p. 37-43.

156. Skripsky V.P., Barclay M. Methods of phospholipids analysis /Skripsky V.P., Barclay M. II Meth. Enzym. 1982. - v. 14. - p. 530.

157. Slaweta R., Laskowska T. The effect of glutathione on the motility and fertility of frozen bull sperm /Slaweta R., Laskowska T. // Anim. Reprod. Sci. 1987. - v. 4.-p. 249-253.

158. Steinbach J., Foote R. Effect of catalase and anaerobic conditions upon the post thawing survival of bovine spermatozoa frozen in citrate and tris -buffered yolk extenders /Steinbach J., Foote R. //J. Dairy Sci. - 1964. - v. 47. -p. 812-815.

159. Taylor M.J., Richardson T. Antioxidant activity of skim milk: effect of sonification /Taylor M.J., Richardson T. // J. Dairy Sci. 1980. — v. 63. - p. 1939-1942.

160. Thibier M., Guerin B. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial insemination /Thibier M., Guerin B. // Anim. Reprod. Sci. 2000. -v. 62.-p. 233-251.

161. Thomson J.G., Cummins J.M. The effect of washing and protein supplementation on the acrosome reaction of ram spermatozoa in vitro /Thomson J.G., Cummins J.M. // Anim. Reprod. Sci. 1985. -v. 9. - № 1. ~ p. 75-78.

162. Upreti G.C., Oliver D.M., Dyganzich D.M. e.a. Development of a chemically ram semen diluent (RSD-1) /Upreti G.C., Oliver D.M., Dyganzich D.M. e.a. //Anim. Reprod. Sci. 1995. - v. 37. - p. 143-157.

163. Urban F., Zizlavsky J. Vliv laseroveno zareni na reprodukci scotu /Urban F., Zizlavsky J.// Acta Universitatis agriculturae. 1993. - v. 41. - p. 261 -271.

164. Vishwanath R.Results of LIC research; Trial 2. Straw thawing /Vishwanath R. // N Z. Dairy Exporter. - 1998. - v. 73. - p. 122.

165. Watson P.F. The preservation of semen in mammals /Watson P.F. // Oxford Rev. Reprod. Biol. 1979. - v. l.-p. 283-350.r>

166. Watson P.F. The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5°C by egg yolk lipoprotein /Watson P.F. // J. Reprod. Fertil. 1981. - v. 62. - p. 482-492.

167. Wishart G. Maintenance of ATP of fertilizing ability of fowl sperm /Wishart G. // J. Reprod. Fert. 1982.- v. 66. - p. 457-462.

168. Woelders H. Fundamental and recent development in cryopreservation of bull and boar semen /Woelders H. // Vet, Q. -1997. v. 19. - p. 135-138.

169. Wrathall A.E. Risks of transmitting scrapic and bovine spongiform encephalopathy by semen and embryos /Wrathall A.E. // Rev. Sci. Tech. OIE. 1997.-v. 16.- p. 240-264.

170. Yanagimachi R., Yanagimachi H., Rogers B.J. The use of zona-free animal ova as a test-system for the assessment of the fertilizing capacity of human spermatozoa /Yanagimachi R., Yanagimachi H., Rogers B.J. // Biol. Reprod. 1976. - v. 15.-p. 471-476.