Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повторяющиеся последовательности ДНК и проблема видового типирования на примере изучения ящериц Кавказа

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Повторяющиеся последовательности ДНК и проблема видового типирования на примере изучения ящериц Кавказа"

5 ОД

На нравах рукописи Ь УДК 577.212.32

С V! > Ч -"Г

Рябинин Дмитрий Михайлович

Повторяющиеся последовательности ДНК и проблема видового типирования на примере изучения ящериц Кавказа

специальность 03.00.26 — "молекулярная генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН в лаборатории ор1 низации генома и в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгар РАН а группе изотопных исследований.

Научные руководители:

член—корр. РАН, доктор биологических наук, профессор А. П. Рысков кандидат биологических наук В. В. Гречко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН А. С. Антонов доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров

Ведущая организация:

Институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН Защита диссертации состоится " (¿6 " (У^/ЬОМ/^ 199

Ж-

_" часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01

Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекул* ной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "_ <2Ь - ШЛЛМШ 1997 г.

~т

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук ^^^^^СГ^^Ц^с^ гРабовская л- с-

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пробчема »ндообр.попшшя и тесно связанная с ней проо\ема филогенетического родства групп животных, объединяемых по сумме морфологических, экологических и зтолигических признаков и таксономический1 группы, являются важнейшими в биологии. До недавнего времени система! ика животного царства, как наука, базировалась на морфологических признаках, по которым судили о родстве групп и об их возможном происхождении и эволюции. С развитием методов молекулярной биологии и, в частности, методов секвенирования и полимеразной цепной реакции появилась возмож — ность анализа непосредственного носителя генетической информации — ДНК — и изучения филогенетического родства организмов при сравнении тех или иных участков геномной ДНК, нетранслируемых РНК и митохондриальной ДНК. При этом в поисках филогенетического сходства и родства отдельных групп организмов было бы целесообразно опираться на такие свойства геномной ДНК, которые проявляли бы наименьшую степень индивидуального и популяционного полиморфизма.

В группе под руководством В. В. Гречко и А. Н. Федорова было замечено, что общая характеристика высокоповторяющихся последовательностей ДНК по их способности гидролизоваться рестрикционными экдонуклеазами и выявляться при электрофорезе в виде отдельных, обогащенных мономерными единицами полос консервативна для вида в целом и специфична для него при сравнении с другими родственными видами. К этому выводу привели результаты исследования рыб (бычков—подкаменщиков) коттоидного комплекса оз. Байкал и некоторых видов ящериц сем. Lacertidae Кавказа (Федоров и соавт., 1992). Было предложено назвать такие паттерны таксопринтом. При анализе литературы было выяснено, что ранее некоторыми авторами (Elizur et al., 1982; Peacock et al., 1981; Turner et al., 1991) было подмечено то же явление, и авторы высказывали мнение, что оно могло бы быть использовано в эволюционных исследованиях. Однако, применявшаяся авторами модификация, основанная на использовании метода разделения и обнаружения фрагментов ДНК в геле шарозы с последующим окрашиванием бромистым этидием, оказалась малочувствительной. С ее помощью можно было обнаруживать только высокомолекулярные фрагменты гидролизата ДНК. В нашей группе была использована модификация, обычно применяемая

при анализе малых ДНК типа мшохондриальных или плазмидных. При использовании, в основном, мслкощепящи.х рестрикциопных опдонуклеаз и концевог метки фрагментов были получены весьма информативные электрофоретаческш паттерны полос, содержащие как специфические для популяции, так и общи< полосы для нескольких к идо в одного рода и даже нескольких родов семейства Отсутствие индииидуальных и половых различий давало возможность использовать эту общую характеристику повторов ДНК, отражающую, по сути, распределение сайтов гидролиза для рестриктаз и мутации в них, для определения сте — пени родства и общих корней в различных таксонах. Так, с использованием предложенного в группе А. Н. Федорова и В. В. Гречко подхода за эти годы были исследованы виды мышей и хомячков (Потапов и Рысков, 1993; Потапов и соавт. 1994;), некоторых рыб (Медников и соавт., 1995), некоторых представителей сем Bovidae (Потапов и соавт., 1994; Рысков и соавт., 1994), ежей и кротов (Банникова и соавт., 1995), а также популяций человека и некоторых обезьян (Гречко и соавт., 1997).

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование политипической группы скальных ящериц Кавказа сем. Lacertidae предложенные методом таксоприпта для выяснения филогенетических взаимоотношений между представителями этого семейства.

Для достижения этой цели решались следующие задачи: 1) исследоват! методом таксопринтного анализа ДНК возможно большего числа видов комплекса L. saxícola Кавказа для установления степени их специфичности по изучаемому признаку, для установления степени их взаимного родства и, есл* удастся, построения филогенетического древа этой группы рептилий на основании изучаемых молекулярных признаков; 2) исследовать ДНК геномов пятт партеногенетических ви'дов упомянутой группы в сравнении с ДНК видов предположительно участвовавших в гибридогенезе при образовании прародительского партеноклЬна. Предполагалось исследовать некоторые виды, родственные изученным ранее, участие которых в гибридогенезе нельзя исключит! априори.

Научная новизна работы. В результате данной работы впервые было показано наличие высокоповторяющихся последовательностей в геноме большой группы ящериц сем. Lacertidae. Установлен факт наличия молекулярных приз-

UdKOU Определенных ДВу1!0«ИХ »»",\">! 11 ft'Ul >Mt> партеногрнетиЧС'СКИХ, ЧТИ под -тверждает их гибридное происхождение, предсказанное И. С. Даревским (1967). Построенное филогенетическое древо коррелирует с ШШШШШями традиционной систематики. Также была показана видо— и родоспецифичность таксо -принтов пи каждой рестриктазе и схожесть популяций одного вида но всем так — сопринтам. Данные исследования не проводились ни в этой группе чешуйчатых, ни в какой — либо другой группе рептилий.

Практическая ценность работы. Рассмотренный в данной работе материал обосновывает возможности, предоставляемые общим анализом повторов Д1 П\ для филогенетических сопоставлений. Правомочностью такого подхода, не имеющего пока в своем арсенале сведений о природе и функциях изучаемой области ДНК, является его адекватность с точки зрения общих представлений о биологии и степени родства изучаемого таксона. Применение нового подхода к таксономическому анализу различных видов — метода таксопринта — было обосновано на большой группе ящериц сем. Lacertidae.

Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII съезде Европейского герпетологического общества (Испания, 1993 г.); на II Международном герпетологическом конгрессе (Австралия, 1994 г.); на VIII съезде Европейского герпетологического общества (Германия, 1995 г.) и на VI международной конференции памяти А. Н. Белозерского "Перспективы биохимии и молекулярной биологии" (Москва, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах и

состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, приложения и список литературы. Библиография включает в себя

Ж...... источников. Работа проиллюстрирована 2 таблицами, 1 схемой и 13 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве объекта исследования были выбраны представители обширного отряда Squamata, подотряда Sauria, семейства Lacertidae, рода Lacerta. Среди них были исследованы, в основном, виды, объединяемые в условную группу "аг — chaeolacertas" (Arnold, 1989), в которую включены скальные ящерицы Кавказа и несколько лесных. Были исследованы также в качестве контрольных некоторые

другие мидм рода Lacctla (так называемые "зеленые" ящерицы н L. vivípara), ¿ также представители родов Podareis, Uremias и Ophisops того же семейства.

Генетическое родство двуполых видов рода Lacerta на основе метода

таксопринта.

Основные результаты получены при использовании 7 рсстрикционньо эидонуклеаз (Mspl, Taq\, CspbI, Asuí, Hirtfl, Hindlll, HcoRl + f /indUl).

При анализе таксопринтов исходили из допущения, что в каждой полосе содержится условный локус, представляющий собой сумму повторяющих« мономеров какого —либо семейства повторов (Donehower & Gillespie, 1979; Southern, 1975). Одинаковые по положению в геле полосы у разных видов рассматривались как гомологичные. Гетерогенные полосы могли происходить либо и: неродственных семейств повторов, либо из гомологичных, но претерпевших мутационные изменения. Очевидно, что точечные мутации в сайтах рестрикции любой из эидонуклеаз или перестройки типа делеция/вставка будут приводить ъ изменению длины образующихся при гидролизе мономеров повторов, т. е. к из — менению паттерна таксопринта; так исчезновение полосы может рассматриваться также как изменение генома в результате события делеция/вставка i прародительском виде или потомке.

Таким образом, таксопринты регистрируют наличие и распределение сай — тов гидролиза для используемых эидонуклеаз рестрикции, т. е. наличие и распределение некоторых мутаций во всей сумме повторов ядерной ДНК ящерицы Каждая новая рестриктаза регистрирует новые мутации, и чем больше ira6oj анализируемых фрагментов, полученных в разных таксопринтах, тем больше статистическая значимость результатов.

Внутрипопуляционная консервативность таксопринтов.

В начале работы было показано, что все исследованные особи каждого видг обладают одинаковым, видоспецифическим рисунком (набор полос и их интенсивность) таксопринта при использовании любой из названных выше нуклеаз Так, было исследовано в одном опыте ДНК 3, 4 и 5 особей L, portschinskii, L. ros-tombekovi и L. mixta соответственно (рис. 1, А). Далее, практически все исследованные виды были представлены несколькими (от 3 до 12) особями от одно! или нескольких популяций, ДНК которых при- гидролизе какой—либо нуклеазо! давала идентичный набор полос в таксопринте. Таксопринт одного вида с одно!

нуклс<|зой воспроизводился с разными препаратами ДНК из данного вида, вы доленными из особей, отловленных в тех же местах с годичными и более про межутками, с разными партиями одного фермента, разными женериментато рами нашей лаборатории.

Иг и э II на «■ я в и у г? н» а л

ь . II I)

Ml 3 3

Ai

160« M 1

US

13«

по

00 Э8

I

CT

i:

i 11:: itèsist t

¿I? -го|. i»: 1Й>-

00« wt

145

ta-

iio-

90-

те с?

ii.

I

'i'

¡L ¡.

é.

Ill

u

I

i.

i: ii

î

*t«M 'í

Рис. 1. Сравнение таксопринтов индивидуальных ДНК некоторых видов ящериц. А. Csp6I — таксопринт. 1—4 — L. rostombekovi; 5—9 — L. mixta; 10—12 — L. portschinskii. Б. Hinfl — так — сопринт, 1—12 — L. agilis (1 — agilis; 2 — boemica;3—G brevicaudata; 7, 8 — chersonensis; 9—12 — exigua); 13—26 — L. saxícola /13, 14 — brauneri; 15—18 — darevskii; 19—22 — lindholati; 23—26 — saxícolaj; 27-32 - L. radis (27 - bishopi; 28 - chechenica; 29-32 - obscura).

Несмотря на то, что в нашем распоряжении не имелось более 10 особей в каждом случае, тот факт, что ни в одном из исследованных видов не было замечено отклонений от указанной закономерности (а было изучено препаратов ДНК не менее/около 150 особей), позволяет нам заключить, что внутрипопу— ляционная консервативность любого паттерна является фактом. Это позволило рассматривать как статистически значимые результаты, полученные даже на небольшом числе случайно выбранных представителей каждой популяции. Этот вывод совпадал с полученными одновременно с нашими результатами других авторов на других таксонах животного мира, упоминавшихся в обзоре лите — ратуры. Особенно демонстративен опыт Федоровой Л. В., в котором сравнивали Hinfl— таксопринты ДНК 29 индивидуумов из 6 популяций человека, которые оказались полностью идентичными (Гречко и соавт., 1997). При использовании

еще 3 |>"< трнкционных Л1Д< >нукле<>:! результаты на ДНК человека были принципиально такими же.

Таблица ! Виды ящериц, иак»\ь:!0!шши\ в ¡idóoTt? и их моем обитания (I—'21 — "агс(мео1асег-1а", '22 —"2" - группа "ngilis" (-шлиные нщорици), '29 - жиииролшцая ящирица. 30—34 — вид! взятые контроля)^

Na п/п Кпд Подвид Местообитание

1 L. portschinskii portschinskii Армения, Гош

2 L. mixta mixta Грузия, Ахалдаба

3 L. valentini valentini Армения, Лчашен

4 L. rtaírensis nairensis Армения, Лчашен

5 L. raddei raddei Армения, Гош

6 " " " Егегнадзор

7 " " Хосров

8 L. rudis bishopi Турция

9 " chechenica Дагестан, Тляр—Ата

10 obscura Грузия, Ахалдаба

1! L. saxícola brauneñ Россия, Сочи

12 " darevskii Россия, Сочи

13 lindholmí Россия, Крым, Ялта

14 saxícola Россия, Кисловодск

15 L. caucasica , daghestanica Дагестан, Махачкала

16 L. deijugirti üerjugíni Грузия, Ахалдаба

17 L. praticola pontíca Россия, Сочи

18 L. párvulo adj arica Грузия, Ахалдаба

19 L. aimeniaca (партеновид) Армения, Севан

18 L. dalúi (партеновид) Армения, Дилижан

19 L. rostombekovi (партеновид) Армения, Дилижан

20 L. unisexualís (партеновид) Армения, Такярлу

21 L. uzzelli (партеновид) Турция

22 L. agilis agilis Германия, Мюнхен

23 boemica Дагестан, Махачкала

24 brevicaudata Армения, Арагац, с. Кучак, Анкаван

25 " chersonensís Россия, Калининград

26 exigua Казахстан, Талды-Курган Россия, Астраханская обл.

27 L. strigata strigata Дагестан, Кумторкала Армения, Спитак

~28 L. viridis viridis Украина, Днепропетровск

29 L. vivípara vivípara Россия, Ст—Петербург

30 O. elegans elegans Армения, Гарни

31 P. muralis muralis Испания, Алмаццо

32 P. ta úrica tauríca Россия, Крым, Ялта

33 E. argata deserti Россия, Калмыкия

34 E. velox velox Ср. Азия, оз. Балхаш

Сравнение таксопринтов популяций и подвидов одного вида.

Вывод, сделанный в предыдущем разделе, подтвердился результатами

[ытоа по сравнению разных популяций хорошо детерминированного вида

^сриц. Так, не отличались друг от друга Hinf—таксопринты (рис. 1, Б) 5 —ти

1ДИИДОВ L. agilis (дор. 1 — agilis; 2 — bocmica; 3—6 — brevicctudata; 7, 8 — cher—

itensis, 9—12 — exigua;); 4-х подвидов L. saxícola /дор. 13, 14 — braunerí; 15—18

darcvskií; 19—22 — lindholmi; 23—26 — saxícola;); 3-х подвидов L. rudis /дор. 27

bishopi; 28 — сhechenica; 29—32 — obscura). В случае видов с неясным стату —

м его отдельных популяций, как, например, это имеет место в случае L. raddei

L. nairensis, сам видовой статус которых подвергается сейчас сомнению (Eiselt

Darevsky, личное сообщение), удалось показать, что 3 из четырех исследо —

иных популяций L. raddei абсолютно одинаковы, а четвертая имеет отличия

infl—таксопринте.

L?4H _ Hlîi

А

ш

р2Ы •2» •2Й »201 *Й0 • lío

alto «¡g

• 125 [в НО

О 90

ад

ко isola н?*

И0|-

90-

3G-

j

Ci

Рис. 2. Сравнение таксопринтов 3-х популяций L raddei raddei. А. £со130!-таксопринт. -3 - L. raddei (Егегнадзор, Гош, Хосров соответственно). Б. НшЛ - так - сопринт. Обозначения же.

На рис. 2 представлены Есо1301 — и НтЛ — таксопринты трех популяций ddei (см. табл. 1), одна из которых (из Егегнадзора) не отличалась от других по :о1301—таксопринтам (рис. 2, А: дор. 1), равно как и по всем остальным, но знаруживала существенные отличия в Нтй — таксопринтах (рис. 2, Б: дор. 1). гсьма любопытно, что именно у этой популяции обнаруживались существенные гличия рестриктазных карт мтДНК в опытах Моритца и соавт. (1992), и именно

она была наиболее сходна по мтД1 IK с одним из паргеногепетических видов (L. rostombekovi), родителем которого, по морфологическим признакам, является, по — видимому, L. radciei.

Таким образом, в трех популяциях L. raddei — Гош, Хосров и, как было показано в отдельных опытах, Гегард — до сих пор не обнаружено ни одного отличия ни в одном таксопринте. Четвертая же — из Егегнадзора — могла бы претендовать на более высокий систематический статус. Во всяком случае, об — наруженные отличия сопоставимы с теми наименьшими различиями, которые наблюдаются между другими видами комплекса L saxícola — 1—4 полосы из примерно 100.

Эти данные коррелируют с данными Моритца и соавт. (1992), так и с данными аллозимЕюго анализа Бобин и соавт. (1996), согласно которым группа rad — dei/nairensis представляет собой, по —видимому, сумму популяций, в которой группа L. nairensis обладает большим сходством с двумя группами L. raddei (Гош и Гегард), чем все они с группой L. raddei из Егегнадзора. По этим данным, Егегнадзорская группа обладает большим сходством с Хосровской, чего в нашем случае не наблюдается.

При исследовании 4 кавказских популяций собственно I. saxícola, которым придан сейчас статус подвидов, было показано, что ни один из подвидов Кавказа (brauneri, darevskii, saxícola) не отличались друг от друга ни по одному так — сопринту.

В то же время, подвид L. saxícola lindholmi, обитающий в Крыму, обнаруживает отчетливые различия с подвидами Кавказской группы по нескольким таксопринтам. На рис. 3 представлены данные по 7aq\ — (рис. 3, А) и HindIII— (рис. 3, Б) таксопринтам L. saxícola, иллюстрирующие сказанное выше. Различия между кавказскими так называемыми подвидами, не отличающимися по этим таксопринтам, и крымским настолько существенны, что вполне сопоставимы с различиями на видовом уровне других исследованных в нашей работе видов. Таким образом, популяции отдельного вида и даже такие из них, которым придан классификаторами статус подвида, как это видно в случае L. saxícola, не отличаются друг от друга по изучаемому признаку.

При изучении 5 подвидов другого вида — I. agílis (см. табл. I) — было показано, что все они чрезвычайно сходны по всем таксопринтам. Незначительные

отличия наблюдались для них в Есо 130! — таксопринте (рис. 3, В), также как это было показано для двух подвидов /.. гисНа в ШпЛ—таксопринте (рис. 1, Б).

Рис. 3. Сравнение таксоприятов разных подвидов L. saxícola, L agilís и L. radis. A. Taq\ — таксопринт. 1—14 — L. agilís (1 »- agilis; 2 — boemica; 3—6 — brevicaudata; 7—12 — exigua; 13, 14 — chersonensis); 15-30 - L. saxícola (15, 16 - brauneri; 17-20 - darevskii; 21-25 - ímdhoímí; 26-30 -saxícola); 31—34 — L. rudis (31 — bishopi; 32 - chechenica; 33, 34 - obscura). Б. Hindltt—таксопринт. 1—4 — L. saxícola (brauneri; darevskii; lirtdholmi; saxi—cola). B. Eco 1301—таксопринт. 1-10 — L. agilis (1 — agilis; 2 — boemica; 3—5 — brevicaudata; 6—7 — chersonensis; 8—10 — exigua); 11—21 — L. saxica/a (И, 12 - brauneri; 13-15 - darevskii; 16-18 - lindholmí; 19-21 - saxícola); 22-26 - L. rudis (22 -bishopi; 23 — chechenica; 24—26 — obscura).

Эти данные уточняют высказанное выше суждение о внутривидовом кон — серватизме таксопринтов в том смысле, что это действительно так в популяциях данного вида, не отличающихся от номинативного по ключевым признакам и не имеющих собственной эволюционной истории; некоторые подвиды начинают приобретать некоторые незначительные отличия, поэтому следует говорить лишь о консервативности таксопринтов на популяционном уровне, считая, что все популяции, по крайней мере, подвида, если он есть, обладают этим свойством. Очевидна корреляция между началом видообразования, если рассматривать подвид как объективное отражение эволюции, и началом изменения в распределении мутаций в повторяющихся регионах ДНК.

Межвидовые отличия, выявляемые методом таксопринта при изучении ящериц.

При рассмотрении таксопринтов разных видов стало очевидным, что рисунок таксопринтов имеет специфические черты сходства у разных таксонов как на уровне родов и, по —видимому, семейств одного отряда, так и практически у всех (за редкими исключениями, имеющими свое объяснение (см. далее)), исследованных видов одного рода. Как будет показано ниже, степень сходства таксопринтов разных видов тем больше, чем более они близкородственны. Далее будут представлены некоторые из приведенных в диссертации иллюстраций.

TagI—таксопринт. Показано, что группа видов "archaeolacertas", кроме L caucasica, L. praticola и L. saxícola ¡indholmi, обладают ярко выраженными чертами наибольшего сходства (рис. 4), однако, и между другими видами и родами имеются общие полосы, говорящие об их генетическом родстве. Видно, чтс представители всех четырёх родов сем. Lacertidae (Podareis, дор. 1—3-, Lacerta, 430; Eremias, 31; Ophisops, 32) имеют одну ярко выраженную, общую для всех ню полосу ("65 п. н.). Кроме того, роды Lacerta и Podareis имеют ещё одну общук для них полосу — около 50 п. н., которой нет у двух других.родов. Все представители рода Lacerta, помимо укзанных, имеют, по крайней мере, ещё 2 общие полосы (~80 и~125 п. н.).

Следующий, более тесный уровень сходства имеют 12 видов скальныз ящериц, включая 5 партеногенетических (L. armeniaca, L. dahli, L. rostombekovi, L unisexualis, L uzzelli, L. mixta, L. nairensis, L. portschinskii, L. raddei, L. rudis che-chenica, L. rudis obscura, L. saxícola darevskii, L. valentini; дор. 4 — 21), а также L derjugini (дор. 30); все они обладают полосой около 155 п. п., отражающей наличие в них огромного по числу повторяющихся единиц семейства повторов. Н< имеют этой полосы представители вида L. caucasica (daghestanica) (дор. 22), L. saxícola подвида lináticlmi (дор. 20) и L. praticola (дор. 29), что может отражать кш наличие мутаций в сайте Taql гомологичного семейства этих видов, так и отсутствие этого семейства повторов вообще.

Внутри группы из 12 сходных по полосе 155 п. н. видов имеются различи) по полосам ~85 и 90 п. н., которые отчетливо видны у L. raddei, L, nairensis i партеногенетических L. unisexualis, L. uzzelli и L rostombekovi, но практичесы отсутствуют у всех остальных видов. Помимо этого специфические и уникальны! для них полосы ~120 п. н. имеются у L caucasica (дор. 22), L. praticola (дор. 29), L derjugini (дор. 30) и L. saxícola подвида lindholmi (дор. 20).

Взятая в качестве контрольной группа видов "зеленых" ящериц и L. vivípara (дор. 23 — 28) имеют семейство повторов, мономеры которого располагаются в районе ~210 п. п.. слегка отличаясь друг от друта, а также ряд полос, специфичных для каждого из этих видов.

и I J 5 ? 9 U U tf" RH В 21 2} 2S 2? Я h*

HsM í ¡ =

lio»

901 €71

Рис. 4. Cp'iEHPHHí тексопринтов всего Hifopa имеющихся видсч ящериц. Taqi — таксо-принт. 1 - Р. táurico; 2, 3 - 1'. maialis■ 4, 5 - L. mix a, t, 7 - L. valentini; í. 9 - L. portschinskii; 10 -L armenia:'a; 11 — L. itatüi; 12, 13. Í4 — L. rcddei (Егегнадзср, Гош Xocpobj, ¡5 — L. nairensis; 16 — L rostombekcfi; 17 — l.. unisexaaiis 18. 19 -- L. rudis ichechenica, obscura); 20, 21 — L. saxícola (lind— holmi, dare.skii); 2.1 — L caucaste* (dagheslanica); 23 — I. strigata; 24 — L. viridis; 25, 26, 27 — L. agilis (chersonemis, boeaúca igilisl; 28 — L. vivípara; 29 — L. praticola (pontica); 30 — L. derjugini; 31 — E. velox; 32 — O, elegans.

Представители рода Podareis (дор 1—3), Eremias (дор. 31) и Ophisops (дор. 32), помимо упомянутых выше общих для всех Lacertidae полос, имеют набор специфических для них полос. Можно отметить, что два вида рода Podareis (Р. muralis из Западной Европы и Р. tauiica из Крыма) обладают сходными и специфическими для них паттернами, причем имеются и видовые различия между этими двумя видами. Два вида рода Eremias (Е. argvta и Е. velox из Средней Азии) также имеют характерный для них родовой паттерн с видовыми различиями между ними.

CspGl—таксопринт. При использовании этой рестриктазы были обнаружены более существенные различия в группе скальных ящериц, чем в Taql— таксопринтах. На рис. 5 представлены соответствующие данные. Видно, что L.

гас1(1(ч, па1геп$15, ип1зе.хиа11.ч, Ь. гоэ^тЬекоУ! (дор. 9—12) имеют три резко выраженных одинаковых у всех них полосы, не имеющихся ни в одном до сих пор исследованном виде. Это полосы ^65, 95 и дополнительная к полосе-155 п. н.

Рис. 5. Сравнение тахашринтов всего набора имеющихся видов ящериц. Csp6I—таксо — принт. J — Р. táurica; 2, 3 — P. mural is; 4 — L. portschinskii; 5 — L. dahli; 6 — L. mixta; 7 — L. arme— iliaca; 8 — I. valentini; 9 — 1. unisexualis; 10 — I. noírensís; It — L. raddei (Гош); 12 — L. rostombekovi, 13, 14 — L. rudis (chechenica, obscura); 15, 16 — L. saxícola flindholmi, darevskii); 17 — L. caucasica (daghestanica); 18 — L strigata; 19 — L. viridis; 20 — I, лgilis (chersonensis); 21 — L. vivípara; 22 — L. praticola fponticaj; 23 — L. derjugmi; 24 — L. media.

С другой подгруппой, не имеющих этих полос, в которую входят L. mixta, L portschinskii, L. aimeniaca, L dahli и L. valentini (дор. 4—8), полностью сходна I. saxícola (а/в darevskii) (дор. 16) и сходна I. derjugini (дор. 23), имеющая также дополнительную специфическую полосу "310 п. н. Остальные виды этой подгруппы — L. rudis, L saxícola (а/в lindholmi), L. caucasica (п/в daghestanica), L. strigata, L. viridis, L. agilis и I. praticola (дор. 13—15, 17—20, 22) не имеют специфической для подгруппы 1 полосы ~155 ц. н. и специфических для подгруппы .2 (raddei/nairensis) полос ~95 и 65 п. н. Вид L. vivípara (дор. 23) отличается по наличию двух—трех специфических для нега одного полос (~80 и несколько полос между 120 и140 п. н.).

Виды рода Podareis (дор. 1—3) имеют в этом таксопринте 5—6 общих полос с лацертами и 3 — 4 — специфических. Eremias velox и Ophisops elegans тличаются в гораздо большей степени и от тех, и от других (дор. 25, 26).

Обращает на себя внимание тот факт, что n Csp61 — таксопринтах также отчетливо прослеживаются несколько общих полос, свидетельствующих о близ — ком родстве родов Laceria и Podareis (53, 68, 70, 94 п. п.), и только одна нижняя полоса говорит о родстве геномов Lacerta и Uremias. Вид рода Ophisops практически не имеет сходства с остальными тремя родами по этому таксопринту.

В этих опытах обнаружено резкое отличие условной подгруппы 2 (L. raddei, L.nairensís и трех партеногенетических видов от всех остальных лацерт. Так же, как и в Taql—таксопринтах, обнаруживается большее сходство между видами под группы 1, включая L. saxícola подвида darevskii и L. derjugini. Следует отметить, что подвид I. saxícola lindholmí здесь также отличается от подгруппы 1 и другого подвида L. saxícola — darevskii — по отсутствию мажорной полосы ~ 160 п. н.

Asul—таксопринт. Продолжая поиски признаков, которые могли бы быть специфическими для видов, входящих в подгруппы 1 и 2, мы использовали peer — риктазу Astil (не представлено). Так же, как в других таксопринтах, видны общие для всех четырех родов полосы в низкомолекулярной области (50-70 п. п.), для родов Lacerta и Podareis — в более высокомолекулярной области (~90—400 п. н.). Два вида Podareis отличались от общей группы скальных ящериц по наличию 2 — 3 специфических полос и отсутствию 1—2 полос, общих для скальных.

Было обнаружено также отличие L. mixta от L. saxícola (подвида darevskii), в других таксопринтах не отличавшихся друг от друга. Характерная полоса ~-160 п. н. у L. mixta отсутствует у L saxícola, но имеется у видов L caucasica, у L. рга— ticola и у L. derjugini. Однако, наиболее важный результат заключается в том, что удалось обнаружить специфическое отличие L. mixta и L. armeniaca от I. port— schinskii и L. valentini (полоса ¿160 п. н.).

Можно сказать, что Asul— таксопринт свидетельствует об общем происхождении всех лацерт и близком сходстве видов рода Podareis. Роды Eremias и Ophisops обнаруживали гораздо большую степень отличия от первых двух родов.

Hinñ—таксопринт. Принципиально сходный с предыдущим результат был получен при использовании рестриктазы Hinñ (не представлено). Lacerta valentini и L. portschinskii обладают специфической полосой около 153 п. н., не имеющейся ни у одного другого вида скальных ягцериц. Близкая по положению полоса наблюдается у ещё у двух видов — L. párvulo и L.jvivípara.

Общие видоснецифическне полосы обнаружились у видов группы "зеленых" и L. vivípara. Из группы кавказских скальных ящериц резко выделялась L. caucasíca но наличию яркой двойной полосы в районе ~190 п. п., неимеющейся ни у одного из исследованных видов. Помимо указанных отличий имеются специфические полосы у L. praticola и у L deijugini.

Так же, как и в других случаях, в Hinfi — таксопринтах имеются, во-первых, полосы, общие для всех четырех родов (~-60 п.н.), во —вторых, только для родов Lacerta и Podareis (~80, 128, 173 п. н.) и, наконец, только для Lacerta (~104, 133 п. п.). Виды рода Podareis имеют, кроме того, несколько специфических для них полос (~93, 108, 155 п. н.).

HmcfHI— и EcpRI-f Hmrflil—таксопринты. При использовании крутшоще — пящей рестрикционной эндонуклеазы HindIII (не представлено) действительно, число полос в таксопринте оказалось существенно меньше, однако, именно в этом таксопринте нам удалось обнаружить еще особенности, характерные для морфологически весьма сходных видов L. mixta, L.valentini, L. portschinskii и L rudis fchechenica). Так, можно видеть, что виды L. mixta, а также 2 партеноклона L. armeniaca и L. dahli имеют интенсивную полосу около 160 п. н., не наблюдающуюся у L. portschinskii, L. valentini и других видов, но имеющуюся у L. saxícola (подвида darevskii, но не lindholmi), L. caucasíca, L. praticola и L. deijugini. Со своей стороны L. valentini, L. portschinkii и L. rudis имеют две дополнительные специфические полосы ~80 и 70 п. н,, наблюдающиеся также у партеногенети— ческих видов L. dahli, L armeniaca и L uni—sexualis и более ни в одном другом виде. Виды зеленых ящериц весьма сходны между собой и совершенно отличны от других лацерт и от видов р. Podareis.

Таксопринт с использованием рестрикционной эндонуклеазы Hindlíl был достаточно скуден по набору полос, поэтому был поставлен опыт, в котором дополнительно был введен другой крутшощепящий фермент — EcoRl (рис. 6). Видно, что этот фермент выявляет еще, по крайней мере, две фракции, одна из которых — общая у всех видов р. Lacerta и р. Podareis (~85 п. н.), а вторая — только у видов, относимых к "archaeolacertas" (~215 п. н.). Полоса, специфичная для L. mixta и двух партеноклонов L. armeniaca, L. dahli, а также для L. saxícola (darevskii), L. caucasica, L. praticola и L. derjugini (--155 п. н.) (дор. 6—8, 19—21, 28, 29),

здесь определена точнее вследствие лучшего разрешения при электрофорезе н высокомолекулярной области.

В группе зеленых ящериц (дор. 22—26), имеющих три специфических полосы, общих ддя всех трех видом (~180, 475 и 160 и. н.), сходство L. slrii/ata и L. agilis более выражено, чем их обоих с L. viridis, имеющей по крайней мере, еще три специфические для нее полосы (дор. 23).

HI 3 5 ? э !1 й И,'5 11 !? 1! г» г£ г? г?«

Эй* .

2-6-(и

I'" ь"' 9-

!E5t»

»0 6 „

006

О

—- tí» - -

•0.

Рис. 6. Сравнение таксопринтов всего набора имеющихся видов ящериц. £coRI + Hindlll — таксопрннт. 1 — Р. táurico; 2, 3 — Р. muralis; 4 — L. portschinskii; 5 — L. valentini; 6 — L. mixta; 7 — 1. armeniaca; 8 — L dahli; 9, 10, II — L. raddei (Егегаадзор, Гош, Хосров); 12 — L. nairensis; 13 — L. rostombekovi; 14 — L. unisexualis; 15, 16 — L rudis ¡chechenica, obscura), 17, 18 — L. saxícola (lindholmí); 19, 20 — L. saxícola (darevskii); 21 — L. caacasica (daghestanica); 22 — i. strigata; 23 — L. viridis; 24, 25, 25 — L agilis {agilis, boemica, chersonervsis); 27 — L. vivípara; 28 — L, praticola fpontíca); 29 - L derjugini; 30 - E. velox; 31, 32 - O. elegans.

Виды р. Podareis (дор. 1—3) имеют лишь одну специфическую для семейства

полосу (имеющуюся также, как было показано в другом опыте, у Е. velox) около "85 п. н., в остальных отличаясь от всех видов р. Lacerta и имея отличия между собой.

Результаты других опытов являются иллюстрацией существования значительного сходства ДНК во всей группе исследуемых животных и уровень информации о различиях между ними незначителен, поскольку затрагивает, види — мо, весьма консервативные для всех видев ящериц сем. Lacertidne последова —

тельности ДНК. Видно, что все скальные ящерицы, а также L. praticola и L. der— jugini практически не различаются по основным полосам таксопринта. Исследуемая контрольная группа зеленых ящериц [L. agilis, L.strigata, Lviridis) не отличаются от скальных по этим полосам, но имеют специфические, общие для них полосы в районе 200 п. н. Вид L vivípara не имеет этих двух полос, но имеет также одну специфическую полосу в том же районе.

Филогенетический анализ таксопринтов.

Мы подвергли статистическому анализу сумму полос некоторых таксопринтов, которая составила более сотни. Как уже отмечалось, по существу, при этом анализируют число и распределение мутаций в области повторов ДНК, содержащих сайты рестрикции для используемых рестриктаз.

На рис. 7 приведено древо генетического сходства для исследованных ви — дов и двух контрольных родов ящериц сем. Lacertidae, построенное с использованием программы UPGMA С. К. Семеновой на основе предоставленного нами материала.

Видно, что, действительно, группа видов скальных ящериц образует кластер, и генетические различия между ними весьма невелики. Как отмечалось выше, пара L. raddei и L. nairensis, а также пара L. valentini и L. portschinskii не могут быть различены по этому признаку. Группа "зеленых" образует следующую группу родства с группой "archaeolacertas", а роды Podareis и Eremias локализуются отдельно.

Родительские виды партеногенетических форм скальных шцерид по

данным таксоприкгного анализа.

Практически во всех рассмотренных опытах, наряду с двуполыми видами были иссл«дованы 4 партеногенетических вида — L armeniaca, L. dahli, L. ros— tombekovi, L. unisexualis, — а в некоторых — также пятый вид L. uzzetti.

Опыты показали, что партеногенетические формы действительно обладают характерными признаками предполагаемых родительских видов. Так, I. armeniaca и I. dahJi имеют специфические для "материнского" L. mixta полосы в Asul —, Húuffll— и Hinfl — таксопринтах, а для "отцовского" — в HíndIII—таксопринте. Поскольку, как было показано ранее, пока не найдено различий между L valentini и L. portschinskii ни в одном таксопринте, вопрос, какой из этих двух видов мог бы быть "отцовским" для каждого из партеногенетических не решён.

0.00 I_

Генетическое сходство 0.25 0.50 0.75 _J_I_I_

1.00 -J

г1^

rd*

-CI

mix s. ricir val port 4 rud

6 s. lind

12 prat

10 cauc

11 der

7 rad E

8 rad Г+Х

9 л air

13 agi

14 sir

15 Wr

16 W'VJ

17 mur

18 tau

19 vel

20 ele

Рис. 13. Древо генетического сходства, построенное на основании полученных данных таксопринтного анализа, при использовании рестрикционных эндонуклеаз Taql, Cspb\, Astil, HinlI, HindIII, EcoRl + Hindlll, Mspl. 1 - L. mixta; 2 — L valentini; 3 - port—schinskii; 4 — L. rudis; 5, 6 - L. saxícola (darevskii, lindholmi); 7, S — L raddei (Егегнад— зор, Гош + Хосров); 9 - L. nairensis; 10 - L. caucasica; 11 — L. derjugini; 12 — I. praticola; 13 — L agilís; 14 — L. strigata; 15 — L. viridis; 16 — L. vivípara; 17, 18 — Podareis (muralís, táurico; 19 — E. velox; 20 — O. elegans.

Л. юз^тЬекотл и итвехиаНз обладают отличительными свойствами "материнских" видов I. raddei и I, ¡\airensis в Свр61— (рис. 5) и Taq\~ (рис. 4) так — сопринтах. Характерная для "отцовских" видов I. роПзсЫткИ и I. уа1спИп/ полоса в НтсИН —таксопринте обнаруживается также у £. ишяехиаШ, но не у I. гоэ^тЬекот. I. иггеШ, для которого I. гaddei или I. ла/гея.^ являются "отцовскими" также содержит характерные для этого вида полосы "в Свр6\— таксопринте (рис. 5). В других дискриминирующих таксопринтах I. тгеШ не была, к сожалению, исследована. На основании наших данных можно с уверенностью говорить о присутствии изучаемой части геномной ДНК предполагаемых "материнских" видов в соответствующих им партеноклонах. Это первое прямое дока — зательство на уровне геномной ДНК присутствия характерных черт двуполого вида в геноме однополого, т. е. их несомненного родства. Что касается присут —

ствия черт генома "отцовского" двуполого вида, то здесь очевидно участие L. portschinskii или L. valentini в гибридном происхождении L. armeniaca или L dahli, а также L. unisexualis. Это также первое прямое свидетельство гибридного происхождения партеноклонов. К сожалению, данных по L. uzzelli и L. rostombekovt пока недостаточно, чтобы делать окончательные выводы, однако, маловероятно, чтобы эти родственные партеноклоны могли бы иметь принципиально разные пути происхождения.

Обсуждение.

Как отмечалось в обзоре литературы, некоторые авторы в 80—е годы указывали на факт видовой консервативности паттернов, образуемых при электрофорезе фрагментами гидролизата ДНК какой—либо рестрикционной эндо— нуклеазой (Шубина и Медников, 1986; Elizur et al., 1982; Peacock et al., 1981; Turner et al., 1991), и предлагали использовать это свойство для установления степени генетического родства существующих видов. Однако, ни одной из групп, коснувшихся этого вопроса не было представлено в дальнейшем достаточно ос — новательных данных, которые позволили бы оценить перспективность использо — вания метода, дающего суммарную характеристику высокоповторякяцейся части геномной ДНК.

Предложенный нами подход адекватен поставленным задачам, о чем сви — детельствуют результаты данной работы, в которой показано, что:

1) изучаемый молекулярный признак каким—то образом коррелирует с видообразованием и специфичен для группы особей, объединяемых системати — ками в понятие "вид";

2) этот признак чрезвычайно консервативен и практически идентичен у всех особей популяции, вида;

3) паттерны близкородственных видов обладают большим сходством в числе, положении и интенсивности полос, чем паттерны далеких видов рода и других видов;

4) сравнение репрезентативного набора полос различных таксопринтов (более 100) и построения на их основе древа генетического сходства приводит к результатам вполне разумным и коррелирующим с общими представлениями зоологов о филогенетических связях в данной группе животных (Arnold, (1989)).

Наши данные дают, как нам кажется, возможность высказать точку зрения, что понятие "вид" отражает не только и не столько выделение группы особей по морфологическим признакам с целью построения классификационных ступеней систематики, сколько отражает существование в природе группы особей, объединяемых В1гутри себя одинаковым набором неких консервативных, корневых участков генома, одним из которых является характерный рисунок структуры высокоповторяющихся последовательностей ДНК. Можно высказать предположение, что таких консервативных участков, помимо повторяющихся регионов, достаточно много, включая и некоторые структурные гены, и их сумма определяет постоянство вида и его реальную обособленность.

Следует также сказать, что понятие "подвид" не является строгим без учёта времени существования вида. 4 популяции, имеющие сейчас статус подвида L. saxícola Кавказа не отличаются друг от друга по таксопринтам и, по нашему критерию, соответствуют понятию "популяция". 5 подвидов L. agilis и 2 подвида L. rudis обладают незначительными отличиями.

В заключение можно отметить, что наличие участков геномной ДНК определённых двуполых видов в геноме партеноклонов, сходных с ними морфоло — гически, не вызывает сомнения и может служить веским и прямым аргументом в пользу гибридного происхождения партеноклонов, по крайней мере — трёх из пяти изученных: L. aimeniaca, L. dahli и L. unisexualis.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано в рептилиях родов Lacerta, Podareis, Eremias и Ophisops наличие высокоповторяющихся последовательностей, характеристика которых по наличию тех или иных сайтов рестрикции имеет консервативную и отчетливую видовую специфичность.

2. Разработан и обоснован для применения в филогенетическом анализе метод, основанный на общей характеристике высокоповторяющихся последовательностей ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаэ (рестриктаз) — метод таксопринта — у более чем 20 видов ящериц сем. Lacertidae: таксопринты по каждой из рестрихтаз обладают видовой и родовой специфичностью и могут быть использованы для анализа генетического родства разных видов.

3. Популяции одного вида, как правило, не отличаются друг от друга по всем исследованным таксопринтам; в тех случаях, когда популяция обнаруживает отличительные признаки, она отличается также и по другим независимым признакам и может быть выделена в более высокий систематический ранг (подвид или вид).

4. Крымский подвид L. saxicola lindholmi обнаруживает существенные отличия от кавказских подвидов этого вида и может претендовать, по нашим критериям, на ранг отдельного вида.

5. Построено филогенетическое древо сходства исследованных видов родов Lacerta, Podarcis и Eremias, объединившее в группу наибольшего родства группу "archaeolacertas" Кавказа; род Podarcis проявляет большую генетическую близость к роду Lacerta, чем род Eremias.

6. Показано наличие молекулярных признаков определённых двуполых видов в геноме однополых клонов, что позволяет утверждать гибридное проис — хождение L. armeniaca и L. dahli от L. mixta и L. valentini/L. portschinskii, и L. uni— sexualis от L. raddei/L. nairensis и L. valentini/L portschinskii. В двух партенокло — нах — L. rostombekovi и L. uzzelli — показано наличие генома только одного из родительских двуполых видов — L raddei/L. nairensis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гречко В. В., Рябинин Д. М., Федорова Л. В., Федоров А. Н., Даревский И. С., Рысков А. П. Таксонопринтньш анализ ДНК некоторых видов ящериц семейства Lacertidae. // Мол. биол. 1993. Т. 27. С. 1404-1414.

2. Ryabinin D. M., Grechko V. V., Darevsky L S., Ryskov A. P., Semenova S. K. Comparative study of DNA repetitive sequences by means of restriction endonucleases among populations and subspecies of some lacertid lizards species. // Russian J. Herpetology. 1996. V. 3. P. 178-190.

3. Гречко В. В., Федорова Л. В., Федоров А. Н., Слободянюк С. Я., Рябинин Д. М., Мельникова M. Н., Банникова А. А., Ломов А. А., Шереметьева В. А., Горшков В. А., Севостьянова Г. А., Семенова С. К., Рысков А. П., Медников Б. М., Даревский И. С. Рестриктазное картирование высокоповторяющихся последовательностей ДНК в исследовании генетического родства низших таксонов животных. // Мол.

биол. 1997. Т. 31. С. 256-264.