Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Породоспецифические особенности аллелофонда микросателлитов ДНК лошадей заводских и местных пород
ВАК РФ 06.02.07, Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Породоспецифические особенности аллелофонда микросателлитов ДНК лошадей заводских и местных пород"



/

004607546

На правах рукописи

Зайцева Марина Анатольевна

ПОРОДОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ ДНК ЛОШАДЕЙ ЗАВОДСКИХ И МЕСТНЫХ ПОРОД

06.02.07 — разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

2 6 АВГ 2010

Дивово - 2010

004607546

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства Российской сельскохозяйственной академии

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

доцент

Храброва Людмила Александровна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор

Захаров Виктор Алексеевич

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Халилов Руслан Аметович

Ведущая организация: Российский Государственный аграрный

университет-МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита состоится 29 июня 2010 года в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 006.018.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства Россельхозакадемии

Адрес института: 391105, Рязанская область, Рыбновский район, пос. Дивово, п/о Институт коневодства

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института коневодства Россельхозакадемии

Автореферат разослан « » 2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

Готлиб М.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современные требования к ведению селекционной работы включают различные аспекты применения полиморфных ДНК-маркеров.

На сегодняшний день применение ДНК-маркеров является самым эффективным, информативным и достоверным методом, используемым в фундаментальных и прикладных генетических исследованиях, как на индивидуальном, так и на популяционном уровне.

Выявленные в ходе работы международного проекта «Геном лошади» группы сцепления генов позволяют в ближайшее время приступить к разработке концепции селекции с помощью маркеров (MAS - Marker Assisted Selection) в коневодстве.

В коневодстве в настоящее время использование высокополиморфных ДНК-маркеров актуально в нескольких аспектах. Применение ДНК-анализа для проведения контроля достоверности происхождения племенных лошадей в России с 2001 года является обязательной процедурой для лошадей чистокровной верховой, а начиная с 2009 года - для чистокровной арабской породы. Широкое распространение ДНК-типирования за рубежом и необходимость интеграции отечественного коневодства в мировое сообщество предопределяет приоритетное использование ДНК-технологий при контроле достоверности происхождения лошадей и других отечественных пород.

Еще одним важнейшим аспектом является применение ДНК-технологий для проведения мониторинга с целью предотвращения снижения генетического разнообразия, использование его результатов при создании селекционных программ совершенствования существующих и выведения новых пород и внутрипородных типов лошадей.

В отечественном коневодстве остро стоит проблема оценки и сохранения генетических ресурсов. До настоящего времени подавляющее большинство уникальных, и зачастую крайне малочисленных аборигенных пород Российской Федерации не изучалось с применением ДНК-маркеров.

Благодаря высокой информативности ДНК-маркеров появилась возможность с большей точностью дифференцировать породы и изучать процессы породообразования, определяя генетические дистанции между выборками и выявляя их филогенетические взаимоотношения.

Цель и задачи работы. Целью проводимых исследований являлось изучение породоспецифических особенностей полиморфизма микросателлитных маркеров ДНК лошадей заводских и местных пород и внутрипородных структур.

Исходя из поставленной цели, нами решались следующие задачи:

1. Выявить особенности полиморфизма 17 локусов

микросателлитов ДНК, входящих в стандартную панель контроля происхождения лошадей;

2. Провести сравнительный анализ аллелофонда 4 заводских и 4 местных пород лошадей, определить филогенетические связи между породами;

3. Изучить внутрипородную географическую дифференциацию популяций лошадей чистокровной верховой породы;

4. Оценить внутрипородную генетическую дифференциацию современного поголовья генеалогических структур (линий и семейств) лошадей чистокровной арабской породы.

5. Определить эффективность применения изученных локусов микросателлитов ДНК при контроле достоверности происхождения лошадей.

Научная новизна работы. Впервые на отечественном поголовье изучены особенности полиморфизма 17 микросателлитов .ДНК, оценена их информативность. Идентифицировано 4 ранее не описанных аллеля 2 локусов у ахалтекинской и местных пород. Оценена межпородная генетическая дифференциация восьми исследованных пород. Впервые изучен полиморфизм микросателлитных ДНК-маркеров отечественных популяций четырех заводских (включая чистокровную верховую, чистокровную арабскую, ахалтекинскую, тракененскую), а также четырех местных пород лошадей (бурятская, забайкальская, тувинская, хакасская). Показана эффективность применения кластерного анализа с использованием полиморфизма микросателлитов ДНК для комплексного изучения меж- и внугрипородной дифференциации. Впервые проведена молекулярно-генетическая паспортизация лошадей местных пород на индивидуальном и популяционном уровнях, определены характерные особенности генетической структуры изученных пород с использованием локусов микросателлитов ДНК. Получены данные о географической внугрипородной дифференциации чистокровной верховой породы. Изучена генеалогическая внутрипородная дифференциация лошадей чистокровной арабской породы, выявлены генетические особенности и связи между линиями и семействами. Оценена эффективность применения микросателлитов при контроле достоверности происхождения лошадей различных пород.

Теоретическая и практическая значимость работы. С использованием локусов микросателлитов ДНК проведено сравнительное изучение породоспецифических особенностей генетической структуры четырех заводских и четырех местных пород лошадей отечественной селекции, показавшее наличие меж- и внугрипородной генетической дифференциации. Оценена эффективность применения отдельных микросателлитных ДНК-маркеров, а также полной панели маркеров (17 локусов) в исследовании популяционно-генетических характеристик пород и внутрипородных групп лошадей. Определена эффективность использования ДНК-маркеров при контроле достоверности происхождения племенных лошадей.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной научно-практической конференции молодых ученых и

специалистов "Вклад молодых ученых в развитие аграрной науки 21 века" (Рязань, 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Искусственное осеменение в коневодстве - истоки биотехнологии в животноводстве», к 100-летию Скаткина П.Н. (Рязань, 2004 г.); ежегодной конференции АТК и спортивного коневодства (ВНИИ коневодства, 2005 г.); конференции «Научное обеспечение конкурентоспособности племенного, спортивного и продуктивного коневодства в России и странах СНГ» (ВНИИ коневодства, 2007 г.). По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, четырех глав, включая обзор литературы, материал и методика исследований, результаты собственных исследований (включая их обсуждение), выводы и практические предложения и приложение. Общий объем работы -141 страница компьютерного текста. Результаты исследований приведены в 14 таблицах. Работа иллюстрирована 32 рисунками, включая графики и диаграммы. Список литературы содержит 200 литературных источников, в том числе 152 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследования послужили пробы крови и волос 942 лошадей заводских пород: чистокровной верховой (п=443), чистокровной арабской (п=319), ахалтекинской (п=109), тракененской (п=27) и четырех местных пород - бурятской (п=11), забайкальской (п=11), тувинской (п=11), хакасской (n=l 1).

Кровь для анализов забирали из яремной вены по стандартной методике в количестве 10-15 мл. Для выделения была взята как цельная кровь, так и суспензия лейкоцитов, собираемая после отстаивания пробы на границе раздела сывороточной и эритроцитарной фаз. Волосяные луковицы брали в количестве 20-25 штук от животного, для хранения до момента выделения ДНК были использованы бумажные пакеты. ДНК выделялась из проб крови (суспензия лейкоцитов) и волосяных луковиц с использованием наборов Diatom DNA и Extra Gene DNA Prep.(000 «Лаборатория Изоген», Россия). После выделения в пробах была определена конечная концентрация ДНК.

Для анализа был использован набор праймеров, включающий 17 локусов микросателлитов, рекомендованный Международным обществом по изучению генетики животных. Выделенную ДНК амплифицировали на термоциклере 2720 Thermal Cycler Gene Amp PCR («Applied Biosystems», США) с набором праймеров «Stock Marks for Horses» согласно рекомендациям производителя. Электрофорез продуктов амплификации осуществлялся на автоматическом 4-капилярном генетическом анализаторе «3130 DNA Analyzer» («Applied Biosystems», США). Расшифровка и документирование полученных графических результатов осуществлялась с помощью программного обеспечения автоматической расшифровки результатов фрагментного анализа Genotyper® и GeneMapper™.

Рис. 1 Общая схема проведения исследования

Интерпретацию графических изображений полученных индивидуальных генетических профилей и определение генотипов животных проводили с учетом контрольной пробы и результатов участия в Международных сравнительных испытаниях (World Horse Comparison Test).

Внутрипородную географическую дифференциацию чистокровной верховой породы изучали на примере трех популяций лошадей: США (п=71), Англии (п=77) и России (п=42). С целью унификации данных анализ был проведен с использованием 9 локусов микросателлитов, общих для лабораторий трех стран.

Внутрипородную генеалогическую дифференциацию чистокровной арабской породы изучали по линиям и семействам. В исследование вошли следующие семь линий: Амурата (п=23), Латифа (п=45), Корея (п=52), Кохейлана 1 (п=78), Крыжика (п=10), Мансура (п=27), Насима (п=38). Были изучены генетические особенности восьми маточных семейств: Дафины (п=16), Дзивы (п=12), Коалиции (п=24), Маммоны (п=111), Ридаа (п=47), Сапини (п=10), Тактики (п=50), Таращи (п=15).

Генетико-статистический анализ проводился по стандартным методикам (Е.К. Меркурьева, 1977; Ч. Ли, 1978; Л.А. Храброва, A.M. Зайцев, 2005).Быпи рассчитаны следующие показатели: частоты аллелей, наблюдаемая (Но) и ожидаемая (Не) гетерозиготность; эффективное число аллелей (уровень полиморфности, Ае); число аллелей в локусе (Na); индекс фиксации Fis; выявлены специфические для определенной популяции аллели - «приватные» аллели (Ра); генетические дистанции и уровень генетического сходства; эффективность контроля происхождения для отдельных локусов и в целом по выборке. Статистический анализ полученных данных проводили по компьютерной программе Statistica for Windows, Version 6.0.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика полиморфизма изученных локусов микросателлитов ДНК

В каждом из 17 изученных микросателлитных локусов было идентифицировано от 6 до 15 аллелей. При этом в локусах АНТ4 и ASB23 обнаружены ранее не описанные аллели: AHT4F - исключительно в ахалтекинской, ASB23G и ASB23H в тувинской, ASB23T в тувинской, забайкальской и хакасской породах. На рис. 2 показано число идентифицированных аллелей в сравнении с доступными литературными данными.

В ходе анализа аллелофонда исследованных пород лошадей по 17 микросателлитным локусам ДНК были получены данные, характеризующие полиморфизм каждого из маркеров (таблица 1).

ЛЗЗ'.Г Н1Л7, ДМ5 НМКЗ НТ6А НМ52 ДЗЕЙ НМ5* НТС35 НТШО АКТ4 С-«В УН1.29 1£ХЗ

£СЛ1) ШСА2) £ЕСДЗг <ЕСА41 ¡ЕСА-1) (ЕСА8) (ЕСМЯ (ЕСДЗ) (£СД10) (ЕСА1$) ¡€ГД151 (ЕСА15) (ЕСА21) (ЕСАЗЛ? (6С»?) аЕСМО) ¡ЕСАХ)

—Число известных аллелей по литературным данным

Число аллелей типированных в изученных породах лошадей отечественной селекции

Рис.2. Максимальное число идентифицированных аллелей 17 изученных локусов микросателлитов

Средний показатель уровня полиморфности, рассчитанный на один локус для всей исследованной выборки, составил 3,77. Исходя из этого, локусы были разделены на две группы. Первую группу составили локусы, имеющие значение уровня полиморфности ниже среднего уровня - НТС4, НТС7, НМБб, НМБ1, НТС6, НТС4, СА425. Во вторую группу входили локусы, для которых значение уровня полиморфности превышает средние показатели: А8В2, А8В17, А8В23, НТО О, ЬЕХЗ, УНЬ20. Остальные четыре локуса микросателлитов имели значения показателя уровня полиморфности, близкие к среднему.

Таблица 1 - Характеристика полиморфизма изученных локусов микросателлитов ДНК

Микросателлитный локус Ае Не Но ЫУ

АНТ4 3,651 0,711 0,759 -0,068 6,625

АНТ5 3,980 0,731 0,712 0,026 5,375

А8В17 4,739 0,774 0,777 -0,004 7,625

А8В2 5,131 0,787 0,722 0,083 9,000

А8В23 4,362 0,764 0,765 -0,001 6,750

СА425 3,252 0,646 0,597 0,076 6,143

НМ81 2,990 0,655 0,663 -0,012 4,250

НМ82 3,449 0,688 0,678 0,015 6,125

нмвз 3,867 0,721 0,609 0,155 7,000

ПМ86 2,863 0,628 0,695 -0,107 5,375

НМв7 3,912 0,725 0,755 -0,041 6,250

НТО 10 4,449 0,768 0,806 -0,049 7,000

НТС4 2,609 0,592 0,660 -0,115 5,375

НТСб 2,968 0,642 0,679 -0,058 5,500

НТС7 2,769 0,616 0,693 -0,125 3,875

ЬЕХЗ 4,381 0,765 0,575 0,248 6,750

УНЬ 20 4,740 0,780 0,818 ^-0,049 7,750

В среднем 3,771 0,706 0,704 X 6,281

Учитывая, что уровень полиморфности по сути является показателем эффективно действующих в популяции аллелей, эта величина коррелирует с числом аллелей, выявленных в каждом из исследованных локусов.

Каждый из изученных локусов характеризовался специфическим распределением частот. Было выявлено четыре основных типа распределений, представленных на рисунке 3. Большинство локусов микросателлитов характеризуется полимодальным распределением частот, к ним относятся: НТО О, А8В2, АНТ5, НМБб, А8В23, А8В17, ЬЕХЗ, УНЬ20 (рис. 3, фиг.А). Тримодальное распределение, подобное обнаруженному для НМ87, наблюдается еще в трех изученных локусах: НМЯЗ, АНТ4 и НТС6 (рис. 3, фиг. Б). Бимодальное распределение, как и тримодальное, характерно для четырех локусов - НМ81, НТС7, НТС4 и НМ82. Унимодальное распределение среди 17 изученных локусов встречается только в локусе СА425, причем наблюдается выраженное преимущество в распространении более длинных фрагментов амплификации.

А)-полимодальный; Б)-тримодальный; В)-бимодальный; Г)-унимодальный

Рис. 3 - Характер распределения аллелей в микросателлитных локусах ДНК у изученных пород лошадей

В отношении значений ожидаемого уровня гетерозиготности максимумом характеризовался локус А8В2 (0,787), а минимальное значение отмечено в локусе НТС4 (0,592). Анализ данных показал, что среди 17 изученных локусов только три - НМ81, А8В23, А8В17 отличаются близким к равновесному распределением. Локусов, отличающихся смещением равновесия в сторону недостатка гетерозигот шесть, это СА425, НМ82, НМ83, АНТ5, ЬЕХЗ, А8В2. Во всех остальных случаях наблюдалась различная степень преобладания показателей наблюдаемой гетерозиготности над ожидаемой, максимальная в локусе ШХ37. Обнаруженные особенности позволяют более эффективно использовать отдельные локусы для различных целей генетико-популяционных исследований.

3.2. Межпородная дифференциация по микросателлитам ДНК

При тестировании обследованного поголовья (п=942) было установлено, что лошади заводских и местных пород заметно различаются по наличию и частоте встречаемости аллелей микросателлитных локусов. В таблице 2 приведены обобщенные характеристики.

Таблица 2- Характеристика заводских и местных пород лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК

Порода N N8 Ра* 1ЧУ Ае Не Но №

Чистокровная верховая 443 104 4 6,875 3,519 0,689 0,697 -0,012

Арабская 319 102 2 7,470 3,213 0,656 0,610 0,070

Ахалтекинская 109 140 11 8,235 3,897 0,731 0,696 0,048

Тракененская 27 100 2 5,353 3,861 0,706 0,670 0,051

Бурятская 11 1 5,294 3,609 0,701 0,748 -0,068

Забайкальская И 98 2 5,647 4,045 0,726 0,723 0,004

Тувинская 11 89 1 5,882 4,204 0,748 0,776 -0,037

Хакасская И 93 2 5,820 4,013 0,729 0,765 -0,049

Самый широкий спектр аллелей (140 аллелей по 17 локусам), а также максимальное число приватных аллелей (11) был выявлено у лошадей ахалтекинской породы. Остальные породы характеризуются приблизительно сходными показателями числа аллелей, несколько меньше эти значения у местных пород (минимальное у тувинской - 89). Необходимо отметить, что местные породы в исследовании выполняли роль аут-группы, взятой для сравнения, их выборки значительно меньше, чем выборки лошадей заводских пород. Возможно, этот фактор препятствовал эффективному раскрытию резервов изменчивости местных пород и в дальнейших исследованиях, посвященных им, будут найдены дополнительные аллели локусов микросателлкгов ДНК.

Четыре «приватных» аллеля обнаружено у чистокровной верховой породы (АНТ4 Я, А8В2 и, НМ82 N и НТС4 Я), по 2 отмечено у двух местных (у хакасских - АБВ17 Т, СА425 Р и забайкальских - НМБ2 Р, НМБ6 С>) и двух заводских (чистокровной арабской - НМБЗ Ь, ЬЕХЗ в и тракененской - АНТ5 0 и А8В23 V) пород лошадей, по одному - у бурятских (НМБ7 Р) и тувинских (АБВ23 в) лошадей.

Результаты проведенного кластерного анализа изученных пород лошадей наглядно демонстрирует дендрограмма (рис. 4), показывающая выраженную генетическую дивергенцию двух ветвей, образованных заводскими и местными породами лошадей.

Высокий уровень сходства имеют местные породы лошадей, а также чистокровная верховая и тракененская. Тувинская порода отличается наибольшей генетической дивергенцией от остальных изученных пород лошадей.

Арабская Ахалтекинская Чистокровная верховая Тракененская Забайкальская Хакаская Бурятская Тувинская

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Генетичесига дистанции

Рис. 4 Генетические взаимоотношения между заводскими и местными породами лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК.

Таким образом, сравнительная оценка полиморфизма 17 микросателлитных локусов ДНК у лошадей 8 изученных заводских и местных пород показала, что практически каждая порода имеет свою характерную генетическую структуру с наличием нескольких «приватных» аллелей. Установлен высокий уровень генетического сходства отечественных местных пород лошадей, которые образуют единый кластер. Выявленные генетические особенности лошадей разных пород дают дополнительную информацию для изучения их происхождения и могут быть использованы в программах по сохранению генофонда малочисленных популяций.

3.3. Внутрипородная дифференциация по микросателлитам ДНК

Внутрипородная географическая дифференциация чистокровной верховой

породы

Закономерности распределения частот встречаемости аллелей по 9 локусам микросателлитов хорошо видны на генетических профилях, которые иллюстрируют генетические особенности популяций (рис. 5).

Очень близки генетические профили популяций Англии и США. Популяция чистокровных лошадей России занимает особое положение, хотя общие тенденции распределения аллелей сохраняются и у нее.

1—1 1-1 —

США

„„.^ as

i?.; .. "Ъ. ЩЁ; г : :

£" г, г: %

1 1

"**>!Ssùbi1 ¿¿аЭ*"

Рис. 5. Генетические профили распределения частот микросателлитных локусов у лошадей чистокровной верховой породы популяций разных стран

Сравнительный анализ семи обобщающих показателей, рассчитанных для трех географических популяций чистокровной верховой породы показал, что они отличаются по некоторым параметрам (таблица 3).

Таблица 3 - Характеристика популяций чистокровных верховых лошадей разных стран по 9 локусам микросателитов ДНК _______

Страна N Na Ра NV Ае Но Не Fis

США 71 51 2 5,667 3,62 0,723 0,722 -0,001

Англия 77 47 1 5,222 3,26 0,683 0,659 -0,036

Россия 42 47 2 5,222 3,31 0,706 0,656 -0,076

В среднем - 48,33 1,67 5,370 3,40 0,704 0,679 -0,038

Наибольшим уровнем полиморфности характеризуется популяция США (3,62), лошади России и Англии имеют практически одинаковое значение по этому показателю. Аналогичное распределение наблюдается и по показателям общего числа аллелей (Ма) и среднего числа аллелей на локус(К'У).

0,8

-0,1 ---—*-

США Англия Россия

Рис.6. Ожидаемая (Не), наблюдаемая (Но) гетерозиготность и индекс фиксации (Fis) в популяциях лошадей чистокровной верховой породы разных стран.

Соотношение ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, а также показателя индекса фиксации показано на рисунке 16. По данным показателям выделяется популяция США, которая находится в равновесном состоянии, показатель фиксации равен -0,001. Наибольшее отклонение от равновесного состояния отмечено у лошадей российской популяции, у которых наблюдается избыток гетерозигот.

Расчет генетического сходства между популяциями чистокровных лошадей разной географической принадлежности показал (табл. 4), что наибольшее сходство наблюдается между субпопуляциями США и Англии (0,982). Российские чистокровные лошади находятся практически на равных расстояниях от популяций США и Англии (0,945 и 0,950).

Таблица 4 - Генетические дистанции (под диагональю) и генетическое сходство (над диагональю) между популяциями лошадей чистокровной верховой породы разной географической принадлежности_

Популяция США Англия Россия

США - 0,982 0,945

Англия 0,037 - 0,950

Россия 0,112 0,100 -

Полученные данные иллюстрируют необходимость регулярного обмена генетическим материалом с целью поддержания характерной для породы международного распространения генетической структуры.

Внутрииородиая генеалогическая дифференциация лошадей чистокровной

арабской породы

При изучении генетической структуры семи действующих в настоящее время линий жеребцов чистокровной арабской породы выявлены характерные распределения аллельных частот.

Все линии характеризовались различным набором аллелей микросателлитов ДНК. Совпадение наблюдается только в двух локусах из 17: НТС7 (выявлено три аллеля - К, N и О) и КГОб (аллели - в, I и О). Однако и в этих локусах между линиями существует выраженная дифференциация, проявляющаяся в различном характере распределения частот аллелей.

В линии Латифа, представитель которой жеребец Нугатин был ввезен в Россию из Франции в конце 20-го века, обнаружено 4 специфических аллеля в микросателлитных локусах: АБВ2С, АНТ4Р и НМ821, НМ82К. Лошади этой линии отличались максимальным числом идентифицированных аллелей - 95.

При рассмотрении обобщающих показателей генетической структуры линий получены результаты, показанные в таблице 5.

Таблица 5 - Характеристика линий чистокровной арабской породы по 17 локусам микросателитов ДНК_____

Линия N Na Ра Ае Но Не Fis

Амурата 23 75 0 2,601 0,613 0,583 -0,051

Латифа 45 95 4 3,359 0,693 0,675 -0,027

Корея 52 93 6 2,910 0,590 0,620 0,048

Кохейлаиа1 78 94 4 2,938 0,607 0,620 0,021

Крыжика 10 64 0 2,564 0,544 0,574 0,052

Мансура 27 84 0 2,818 0,554 0,592 0,064

Насима 38 81 1 2,497 0,556 0,558 0,004

Наибольшей полиморфностью характеризуется линия Латифа (3,359), близкие значения отмечены в линиях Кохейлана, Корея и Мансура. Самый низкий уровень полиморфности наблюдался в линии Насима (2,497).

Наблюдаемая степень гетерозиготности варьировала от 0,558 (линия Насима) до 0,675 (линия Латифа). Показатели ожидаемой степени гетерозиготности были выше у представителей линий Амурата и Латифа.

Амурата Латифа Корея Кохейлана! Крыжнка Мансура Насима

Рис. 7. Ожидаемая (Не), наблюдаемая (Но) гетерозиготность и индекс фиксации (Fis) в линиях лошадей чистокровной арабской породы

Проведенный анализ показал, что коэффициент Fis имел отрицательное значение в линиях Амурата, Латифа, Кохейлана и Насима, что указывает на смещение генетического равновесия в данных группах в сторону избытка гетерозигот. Положительное значение говорит о недостатке гетерозигот, что наблюдалось в линиях Мансура и Корея. Это подтверждают и родословные арабских лошадей, в которых часто встречается инбридинг на Асуана, а также на Канкана, Книппеля и Мака.

Кластерный анализ генетических расстояний между линиями позволил построить дендрограмму, демонстрирующую выраженную генетическую дифференциацию отдельных линий (рис.8).

Дендрограмма показывает, что наиболее генетически близки линии Корея, Кохейлана I и Мансура, которые образуют один кластер. На некотором удалении находится линия Насима. Наиболее генетически дифференцированы линии Латифа, Амурата и Крыжика, которые формируют отдельные ветви.

Амурата Корея Кохейлана Мансура Насима Крыжика Латифа

Ь-,

0,00

0,05

0,25

0.30

0,10 0.15 0.20 Генетические дистанции

Рис. 8. Генетические взаимоотношения между линиями лошадей арабской чистокровной породы по 17 локусам микросателлитов ДНК (Complete Linkage по 1-Pearson г)

Материалом для изучения генетической структуры маточных семейств послужили результаты анализа 17 микросателлитов ДНК 285 арабских лошадей, разделенных по принадлежности к семействам.

Расчетные показатели генетического анализа, характеризующие особенности изученных семейств, приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Характеристика семейств чистокровной арабской породы по 17

Семейство N Na Ра Ае Но Не Fis

Дафины 16 56 0 2,349 0,583 0,512 -0,139

Дзивы 12 71 0 2,669 0,591 0,587 -0,007

Коалиции 24 79 0 2,732 0,581 0,592 0,019

Маммоны 111 103 4 3,172 0,616 0,652 0,055

Ридаа 47 91 2 2,909 0,611 0,619 0,013

Сапини 10 72 0 2,930 0,633 0,615 -0,029

Тактики 50 92 3 3,072 0,617 0,646 0,045

Таращи 15 75 3 2,802 0,560 0,602 0,070

В среднем X 79,875 X 2,823 0,599 0,603 X

Как видно из приведенных данных, уровень полиморфности варьировал от 3,172 (семейство Маммоны) до 2,349 (семейство Дафины). Наблюдаемая

степень гетерозиготности варьировала незначительно. Максимальное значение наблюдалось в семействе Сапини (0,633), минимальное - в семействе Таращи (0,560). Ожидаемая гетерозиготность также имеет небольшой разброс значений (0,652-0,512).

Проведенный анализ показал, что коэффициент Fis имел отрицательное значение в семействах Дафины и Сапини, что указывает на смещение генетического равновесия в данных группах в сторону избытка гетерозигот. Положительное значение Fis наблюдалось в семействах Таращи, Маммоны, Тактики. Незначительное отклонение генетического равновесия наблюдается в семействах Дзивы, Ридаа и Коалиции

ДафииЫ Дзивы Маммоны Pwtaa Салики Тактики Таращи

Рис.9 Ожидаемая (Не), наблюдаемая (Но) гетерозиготность и индекс фиксации (Fis) в маточных семействах арабской породы

Кластерный анализ генетических расстояний между семействами позволил построить дендрограмму (рис. 10), демонстрирующую выраженную генетическую дифференциацию отдельных семейств.

Генетические дистанции

Рис. 10. Генетические взаимоотношения между семействами лошадей чистокровной арабской породы по 17 локусам микросателлитов ДНК (Complete Linkage с расчетом дистанций по 1 -Pearson г)

Семейства Маммоны и Ридаа образуют первый кластер, к которому на небольшом удалении присоединяются семейства Тактики, Таращи и Дзивы. Между этими семействами наблюдается наибольшее генетическое сходство по микросателлитным локусам. Несмотря на то, что ветви семейств Коалиции и Сапини не образуют единый кластер, их генетические дистанции с кластером Маммоны, Ридаа, Тактики, Таращи, Дзивы практически равны. Наибольшее отклонение от общей группы наблюдается у лошадей семейства Дафины.

Общая оценка внутрипородной дифференциации чистокровной арабской породы выявила наличие 3-х кластеров (рис.11). Наиболее многочисленный кластер образовали 5 линий и 4 семейства, характеризующиеся наибольшим генетическим сходством. Второй кластер образован линией Латифа и тремя семействами, третий образовали наиболее дифференцированные линия Латифа и семейство Дафины. Возможно, данная дендрограмма характеризует наиболее частые подборы используемые в чистокровной арабской породе.

Амурата Дафины Латифа Сапини Дзивы Таращи Корея Тактики Кохейлана Маммоны Ридаа Мансура Насима Коалиции Крыжика

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Генетические дистанции

Рис.11. Генетические дистанции между линиями и семействами чистокровной арабской породы

Для проверки информативности метода кластерного анализа была построена матрица данных, включающая аллельные частоты исследованных пород, а так же линий и семейств чистокровной арабской породы. Как видно из приведенной на рисунке дендрограммы, характер внутрипородной дифференциации чистокровной арабской породы полностью идентичен, при этом чистокровная арабская порода образовала изолированный кластер, местоположение которого соответствует расположению при межпородной дифференциации (рис.12).

Чистокровная верховая Тракененская Ахалтекинская Амурата Дафина Латифа Сапини Дзива : Таращи Корея Тактики Кохейлана Маммоны Ридаа : Мансура Насима Коалиции и - Крыжика Забайкальская Хакасская Бурятская Тувинская

0.0 0.1 02 0,3 0,4 0.5 0.6 0.7 0,8 Генетические дистанции

Рис.12 Комплексная оценка меж- и внутрипородной генетической дифференциации

Таким образом, можно констатировать эффективность и информативность метода кластерного анализа с использованием микросателлитных локусов при комплексной оценке меж- и внутрипородной дифференциации.

3.4. Использование микросателлитов ДНК в контроле происхождения лошадей

На основании информативности были рассчитаны величины эффективности контроля происхождения для отдельных локусов по Джемисону. В среднем для всех исследованных пород лошадей минимальная эффективность зарегистрирована для локуса HTG4 - 0,353. Наиболее эффективным был локус ASB2 (0,602 в среднем для всех исследованных пород).

В использованной панели можно условно выделить по значению эффективности три группы локусов, в пределах каждой из них значение эффективности плавно повышается. В первую группу входят локусы HTG4, HTG7, HMS1, HMS6 и HTG6 (эффективность от 0,353 до 0,4), во вторую -HMS2, СА425, АНТ4, HMS3, АНТ5 и HMS7 (от 0,462 до 0,505) и в третью -ASB23, LEX3, HTG10, VHL20, ASB17 и ASB2 (от 0,548 до 0,602).

В отношении изученных пород были выявлены специфические особенности отдельных локусов в контроле происхождения (табл. 7).

Для чистокровной верховой породы наибольшая эффективность при контроле происхождения отмечена для локуса А8В2 (0,659). Этот локус также был наиболее эффективен у ахатекинской и тракененской пород (0,711 и 0,702 соответственно), а также у забайкальской породы (0,656). В то же время у хакасской лошади он, хотя и обладал достаточной эффективностью, уже не лидировал по показателю эффективности, в выборках чистокровной арабской, тувинской и особенно бурятской пород демонстрировал средние значения (от 0,516 до 0,491). Наименее эффективен в контроле происхождения лошадей чистокровной верховой породы локус НТС4 (0,243).

Таблица 7 - Эффективность контроля происхождения у исследованных пород лошадей, в долях единиц

Локусы Популяции лошадей заводских пород Популяции лошадей местных пород

Чистокровная арабская \хялтекикскяя Чистокровная верховая* Грякененскяя Забайкальская Тувинская Хакасская Бурятскяя

АНТ4 0,565 0,385 0,477 0,459 0,575 0,599 0,380 0,465

АНТ5 0,385 0,489 0,460 0,551 0,598 0,568 0,553 0,348

А5В17 0,381 0,635 0,530 0,677 0,624 0,559 0,719 0,547

АБВ2 0,505 0,711 0,659 0,702 0,656 0,516 0,579 0,491

А8В23 0,481 0,449 0,578 0,511 0,548 0,635 0,590 0,590

СА425 0,464 0,430 - 0,237 0,520 0,532 0,499 0,606

НМ81 0,385 0,372 0,339 0,316 0,441 0,322 0,391 0,383

НМ52 0,368 0,594 0,329 0,387 0,612 0,493 0,473 0,439

НМБЗ 0,431 0,508 0,444 0,536 0,571 0,618 0,557 0,271

НМЭб 0,262 0,462 0,314 0,351 0,559 0,417 0,355 0,413

НМ87 0,573 0,553 0,580 0,611 0,499 0,437 0,475 0,311

нтвю 0,484 0,442 0,604 0,552 0,600 0,593 0,621 0,628

НТС4 0,412 0,263 0,243 0,335 0,274 0,408 0,335 0,554

НТС6 0,347 0,333 0,336 0,510 0,295 0,558 0,402 0,421

НТ07 0,230 0,257 0,361 0,318 0,484 0,402 0,369 0,455

ЬЕХЗ 0,570 0,654 - 0,571 0,422 0,628 0,544 0,559

УНЬ20 0,527 0,631 0,505 0,500 0,488 0,690 0,663 0,613

По 17 локусам 0,99987 0,99999 0,99991 0,99999 0,99999 0,99999 0,99999 0,99998

+ - по локусам СА425 и ЬЕХЗ данные исключены с целью унификации результатов

У чистокровной арабской породы наиболее эффективными (эффективность не менее 0,55) были локусы НМ87, ЬЕХЗ и АНТ4. Наименьшей эффективностью характеризовался локус НТС7 (0,23).

На втором месте после локуса А8В2 у ахалтекинской породы стоят А8В17, ЬЕХЗ и УНЬ20 (эффективность контроля происхождения выше 0.6). Минимальная эффективность отмечена у локусов НГС4 и НТС7 (менее 0,3).

Для тракененской породы кроме А8В2 наиболее информативны при проведении экспертизы достоверности происхождения локусы А8В17 (0,677),

HMS7 (0,611), LEX3 (0,571), HTG10 (0,552) и AHT5 (0,551), что в значительной степени отличается от характеристик других пород. Хотя локусы HTG4 и HTG7 также отличались небольшой величиной эффективности контроля происхождения, абсолютный минимум зарегистрирован для локуса СА425 (0,237). В отношении местных пород отмечено, что высокой эффективностью контроля происхождения для всех них обладает локус HTG10 (около 0,6 единицы). Локус VHL20 эффективен для хакасской, тувинской и бурятской пород, в то время как у забайкальской породы его эффективность заметно ниже. Максимальная эффективность у этой породы отмечена для локуса ASB2, у тувинской - ASB17, у хакасской - VHL20, у бурятской - HTG10. Также неоднозначна и минимальная эффективность отдельных локусов для изученных местных пород.

В целом при использовании 17 локусов микросателлитов ДНК эффективность контроля происхождения у исследованных пород составила от 99,987% у чистокровной арабской до 99,999% у ахалтекинской, тракененской, забайкальской, хакасской, тувинской пород. Эффективность контроля происхождения бурятской породы составила 99,998%. Наиболее востребован контроль происхождения для чистокровной верховой породы. Для нее эффективность составила 99,991 %.

Полученные данные наглядно демонстрируют преимущества контроля происхождения по микросателлитам ДНК перед традиционными иммуногенетическими и белковыми маркерами.

4. Выводы и практические предложения 4.1. Выводы:

1. Анализ 17-ти локусов микросателлигов ДНК по 4 заводским и 4 местным породам лошадей показал наличие выраженной генетической дифференциации поголовья в сравнительном исследовании пород, линий и маточных семейств.

2. В каждом из 17-ти изученных микросателлитных локусов в среднем по всем породам идентифицировано от 6 до 15 аллелей, при этом в локусах АНТ4 и ASB23 обнаружены ранее не описанные аллели: AHT4f - исключительно в ахалтекинской, ASB230 и ASB23H в тувинской, ASB231 в тувинской, забайкальской и хакасской породах.

3. Среднее значение числа аллелей (NV) составило 6,3 (от 9,0 в локусе ASB2 до 3,88 в локусе HTG4), число эффективно действующих аллелей (Ае) - 3,8 (от 5,13 в локусе ASB2 до 2,61 в локусе HTG4).

4. Самый широкий спектр аллелей (140 аллелей по 17 локусам), а также максимальное число «приватных» аллелей (Ра=11) были выявлены у лошадей ахалтекинской породы. У остальных пород аллелофонд включал в себя около 100 аллелей, в том числе несколько «приватных» аллелей.

5. Выявлена дифференциация заводских и местных пород на два изолированных генетических кластера, различающихся по величине генетических дистанций по изученным локусам.

6. Среди лошадей чистокровной верховой породы разных стран максимальный уровень полиморфности (Ае) выявлен у лошадей, импортированных из США. Отечественная популяция по сравнению с другими характеризуется наибольшим смещением генетического равновесия в стороны избытка гетерозигот (р1$=-0,076).

7. В чистокровной арабской породе установлена высокая степень внутрипородной генетической дифференциации: линии жеребцов Латифа, Амурата и Крыжика формируют отдельные ветви, среди маточных семейств выделяется семейство кобылы Дафины.

8. При контроле происхождения , лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК установлена высокая степень эффективности метода - 99,99 %.

4.2. Практические предложения

1. Для контроля достоверности происхождения племенных лошадей необходимо применять полную панель из 17 локусов микросателлитов, что повышает эффективность контроля практически до 100%.

2. Использовать высокополиморфные микросателлитные локусы ДНК в качестве универсальных генетических маркеров при проведении генетического мониторинга заводских и местных пород, оценке генетического разнообразия популяций и составлении селекционных программ.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Храброва, Л.А. Микросателлитные маркеры ДНК в генетической идентификации и экспертизе достоверности происхождения лошадей.// Проблемы развития коневодства и конного спорта в России /Л.А. Храброва, А.М. Зайцев, М.А. ЗайцеваН Материалы международной научно-практической конференции 16-17 сентября 2003 - Новосибирск, 2003. - С.51-53.

2. Зайцева, М.А. Использование микросателлитных маркеров ДНК в контроле происхождения лошадей.// Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Вклад молодых ученых в развитие аграрной науки 21 в." - Рязань, 2004 - С.105-107.

3. Храброва, Л.А., Характеристика популяций лошадей чистокровной верховой породы по микросателлитам ДНК /Л.А. Храброва, М.А. Зайцева // Актуальные проблемы развития животноводства на современном этапе/Межвузовские научные труды - С.Пб., 2006 - С.46-50.

4. Храброва, Л.А. Анализ генетической структуры по микросателлитам ДНК импортированного в Россию поголовья лошадей чистокровной верховой

породы /Л.А. Храброва, А.М. Зайцев, М.А. Зайцева // Сборник научных трудов ученых Рязанской ГСХА - Рязань, 2006 -С.473-476.

5. Храброва, Л.А. Генетический полиморфизм лошадей чистокровной верховой породы по микросателлитам ДНК /Л.А. Храброва, М.А. Зайцева // Новое в науке о коневодстве: сб. науч. трJ ВНИИ коневодства.- Дивово, 2006. -С.71-73.

6. Храброва, Л.А. Использование ДНК-анализа при контроле происхождения лошадей /Л.А. Храброва, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева // Коневодство и конный спорт. - 2006. - № 3. - С.32-33.

7. Храброва, Л.А. Особенности полиморфизма микросателлитов ДНК в популяциях лошадей чистокровной верховой породы по ДНК-маркерам /Л.А. Храброва, М.А. Зайцева // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии. -М., 2006. - Вып.3. - С.144-148.

8. Храброва, Л.А. Эффективность контроля происхождения лошадей чистокровной верховой породы по ДНК-маркерам /Л.А. Храброва, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева // Соврем, достижения и проблемы биотехнологии с,-х. жив-х: материалы 6-й Международной науч. конференции. - Дубровицы, 2006.— С.198-200.

9. Храброва, Л.А. Полиморфизм микросателлитных локусов у лошадей чистокровной верховой и арабской пород /Л.А. Храброва, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева //Научное обеспечение конкурентноспособности племенного, спортивного и продуктивного коневодства в России и странах СНГ: сб. науч. тр./ВНИИ коневодства.-Дивово, 2007 - 4.2 - С.12-18.

10. Храброва, Л.А. Контроль происхождения лошадей по микросателлитам ДНК /Л.А. Храброва, A.M. Зайцев, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева // Научное обеспечение конкурентноспособности племенного, спортивного и продуктивного коневодства в России и странах СНГ: сб. науч. тр./ ВНИИ коневодства.-Дивово, 2007 - 4.1. - С.98-102.

11. Храброва, Л.А. Генетическая дифференциация чистокровных пород лошадей по локусам микросателлитов ДНК / Л.А. Храброва, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева // С.-х. биология. - 2008. - №2. - С.31-34.

12. Khrabrova, L.A. Polymorphisms of 17 microsatellite loci in Akhal-Teke, Arabian and Thoroughbred horses in Russia / L.A. Khrabrova, A.M. Zaitcev, L.V. Kalinkova, M.A. Zaitceva // Proc/31-st Conf. ISAG. - Amsterdam, 2008. - Poster 2043.

13. Khrabrova, L.A. Genetics characterization of Orlov trotter / L.A. Khrabrova, A.M. Zaitcev, L.V. Kalinkova, M.A. Zaitceva // Proc/31-st Conf. ISAG. -Amsterdam, 2008. - Poster 2072.

14. Зайцева, М.А. Внутрипородная дифференциация по 17 локусам микросаттелитной ДНК лошадей разных линий чистокровной арабской породы

/ М.А.Зайцева, Л.А Храброва., Л.В Калинкова // Коневодство и кон. спорт. -2010. -№1. —С.19-21.

15. Зайцев, A.M. Интенсивность генетической дифференциации при создании новых селекционных форм в коневодстве и возможность маркирования признаков, характеризующих мясную продуктивность лошадей (09-04-13757) / А. М.Зайцев, Л. А. Храброва, Р. В. Иванов И. С.Гавриличева, Н. Ю.Зыкова, М. А.Зайцева // Материалы Всеросс. науч. конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России». - М., 2010. - С.209-212.

Издательская лицензия ИД № 05806 от 10.09.2001 г. Подписано в печать 24.05.10 Формат 60x84 1/16 Печатных листов 1,0. Тираж 70 экз. Заказ № 65 Участок печати ГНУ ВНИИ коневодства Рыбновский район, Рязанская область Тел./факс 8 (4912) 24-02-65; 24-05-39 Е-таП: vniik08@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Зайцева, Марина Анатольевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Явление генетического полиморфизма и его значение в фундаментальной генетике и теории эволюции

1.2. Типы полиморфных последовательностей ДНК

1.2.1. ДНК-маркеры рестрикционного полиморфизма

1.2.2. ДНК-маркеры полимеразной цепной реакции(ПЦР)

1.3. Локализация микросателлитов в геноме и их функциональные особенности '

1.4. Использование сателлитных последовательностей ДНК в молекулярно-генетических исследованиях и в сельскохозяйственной биологии

1.5. Контроль достоверности происхождения

Глава 2. Материал и методика исследований 42 Общая схема проведения исследования ~ 42 2.1 .Характеристика исследованного поголовья лошадей

2.2. Характеристика использованных ДНК-маркеров

2.3. Сбор и хранение биоматериала

2.4. Выделение и определение концентрации ДНК

2.5. Проведение и параметры ПЦР

2.6. Капиллярный электрофорез и расшифровка результатов

2.7. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. Характеристика полиморфизма изученных локусов микросателлитов ДНК

3.2. Межпородная дифференциация по микросателлитам ДНК

3.3. Внутрипородная дифференциация по микросателлитам ДНК

3.3.1. Внутрипородная географическая дифференциация чистокровной верховой породы

3.3.2. Внутрипородная генеалогическая дифференциация чистокровной арабской породы

3.4. Использование микросателлитов ДНК в контроле происхождения лошадей

Глава 4. Выводы и практические предложения

4.1. Выводы

4.2. Практические предложения 102 Список использованной литературы 103 Приложение

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Породоспецифические особенности аллелофонда микросателлитов ДНК лошадей заводских и местных пород"

Актуальность темы. Современные требования к ведению селекционной работы включают различные аспекты применения полиморфных ДНК-маркеров.

На сегодняшний день применение ДНК-маркеров является самым эффективным, информативным и достоверным методом, используемым в фундаментальных и прикладных генетических исследованиях, как на индивидуальном, так и на популяционном уровне.

В ходе работы международного проекта «Геном лошади» на сегодняшний день охарактеризовано более 4000 полиморфных последовательностей ДНК, для которых уже известна хромосомная локализация, что существенно дополняет предыдущие исследования. Выявленные группы сцепления генов позволяют вплотную приступить к разработке концепции селекции с помощью маркеров (MAS — Marker Assisted Selection) в коневодстве.

В коневодстве в настоящее время использование высокополиморфных ДНК маркеров актуально в нескольких аспектах. Применение ДНК-анализа для проведения контроля достоверности происхождения племенных лошадей в России с 2001 года является обязательной процедурой для лошадей чистокровной верховой, а начиная с 2009 года - для чистокровной арабской породы. Широкое распространение ДНК-типирования за рубежом и необходимость интеграции отечественного коневодства в мировое сообщество предопределяет приоритетное использование ДНК-технологий при контроле достоверности происхождения лошадей и других отечественных пород.

Еще одним важнейшим аспектом является применение ДНК-технологий для проведения мониторинга с целью предотвращения снижения генетического разнообразия, использование его результатов при создании селекционных программ совершенствования существующих и выведения новых пород и внутрипородных типов лошадей.

В отечественном коневодстве остро стоит проблема оценки и сохранения генетических ресурсов. До настоящего времени подавляющее большинство уникальных, и зачастую крайне малочисленных аборигенных пород Российской Федерации не изучалось с применением ДНК маркеров.

Благодаря высокой информативности ДНК-маркеров появилась возможность с большей точностью дифференцировать породы и изучать процессы породообразования, определяя генетические дистанции между выборками и выявляя их филогенетические взаимоотношения. Большинство исследований генофонда сельскохозяйственных животных в последние годы ' выполняется исключительно с использованием полиморфизма микросателлитов ДНК.

Цель и задачи работы. Целью проводимых исследований являлось изучение породоспецифических особенностей полиморфизма микросателлитных маркеров ДНК лошадей заводских и местных пород и внутрипородных структур.

Исходя из поставленной цели нами решались следующие задачи:

1. Выявить особенности полиморфизма 17 локусов микросателлитов ДНК, входящих в стандартную панель контроля происхождения лошадей;

2. Провести сравнительный анализ аллелофонда 4 заводских и 4 местных пород лошадей, определить филогенетические связи между породами;

3. Изучить внутрипородную географическую дифференциацию популяций лошадей чистокровной верховой породы;

4. Оценить внутрипородную генетическую дифференциацию современного поголовья генеалогических структур (линий и семейств) лошадей чистокровной арабской породы.

5. Определить эффективность применения изученных локусов микросателлитов ДНК при контроле достоверности происхождения лошадей.

Научная новизна работы. Впервые на отечественном поголовье изучены особенности полиморфизма 17 микросателлитов ДНК, оценена их информативность. Идентифицировано 4 ранее не описанных аллеля 2 локусов у ахалтекинской и местных пород.

Оценена межпородная генетическая дифференциация восьми исследованных пород. Впервые изучен полиморфизм микросателлитных ДНК-маркеров отечественных популяций четырех заводских пород лошадей (включая чистокровную верховую, чистокровную арабскую, ахалтекинскую, тракененскую), а также четырех местных пород лошадей (бурятская, забайкальская, тувинская, хакасская).

Показана эффективность применения кластерного анализа с использованием полиморфизма микросателлитов ДНК для комплексного изучения меж- и внутри пор одной дифференциации.

Впервые проведена молекулярно-генетическая паспортизация лошадей местных пород на индивидуальном и популяционном уровнях, определены характерные особенности генетической структуры изученных пород с использованием локусов микросателлитов ДНК.

Получены данные о географической внутри породной дифференциации чистокровной верховой породы.

Изучена генеалогическая внутрипородная дифференциация лошадей чистокровной арабской породы, выявлены генетические особенности и связи между линиями и семействами.

Оценена эффективность применения микросателлитов при контроле достоверности происхождения лошадей различных пород.

Теоретическая и практическая значимость работы. С использованием локусов микросателлитов ДНК проведено сравнительное изучение породоспецифических особенностей генетической структуры четырех заводских и четырех местных пород лошадей отечественной селекции, показавшее наличие меж- и внутрипородной генетической дифференциации. Оценена эффективность применения отдельных микросателлитных ДНК-маркеров, а также полной панели маркеров (17 локусов) в исследовании популяционно-генетических характеристик пород и внутрипородных групп лошадей. Определена эффективность использования ДНК-маркеров при контроле достоверности происхождения племенных лошадей.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Вклад молодых ученых в развитии аграрной науки 21 века" (Рязань, 2004г.); Всероссийской научно-практической конференции «Искусственное осеменение в коневодстве — истоки биотехнологии в животноводстве», к 100-летию Скаткина П.Н. (Рязань, 2004г.); ежегодной конференции АТК и спортивного коневодства (ВНИИК, 2005г.); конференции «Научное обеспечение конкурентноспособности племенного, спортивного и продуктивного коневодства в России и странах СНГ» (ВНИИК, Дивово, 2007г.). По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных", Зайцева, Марина Анатольевна

4.1. Выводы:

1. Анализ 17-ти локусов микросателлитов ДНК по 4 заводским и 4 местным породам лошадей показал наличие выраженной генетической дифференциации поголовья в сравнительном исследовании пород, линий и маточных семейств.

2. В каждом из 17-ти изученных микросателлитных локусов в среднем по всем' породам идентифицировано от 6 до 15 аллелей, при этом в локусах АНТ4 и ASB23 обнаружены ранее не описанные аллели: АНТ4Р -исключительно в ахалтекинской, ASB230 и ASB23H в тувинской, ASB23T в тувинской, забайкальской и хакасской породах.

3. Среднее значение числа аллелей (NV) составило 6,3 (от 9,0 в локусе ASB2 до 3,88 в локусе HTG4), число эффективно действующих аллелей (Ае) — 3,8 (от 5,13 в локусе ASB2 до 2,61 в локусе HTG4).

4. Самый широкий спектр аллелей (140 аллелей по 17 локусам), а также максимальное число «приватных» аллелей (Ра=11) были выявлены у лошадей ахалтекинской породы. У остальных пород аллелофонд включал в себя около 100 аллелей, в том числе несколько «приватных» аллелей.

5. Выявлена дифференциация заводских и местных пород на два изолированных генетических кластера, различающиеся по величине генетических дистанций по изученным локусам.

6. Среди лошадей чистокровной верховой породы разных стран максимальный уровень полиморфности (Ае) выявлен у лошадей, импортированных из США. Отечественная популяция по сравнению с другими характеризуется наибольшим смещением генетического равновесия в стороны избытка гетерозигот (Fis=-0,076).

7. В чистокровной арабской породе установлена высокая степень внутрипородной генетической дифференциации: линии жеребцов Латифа,

Амурата и Крыжика формируют отдельные ветви, среди маточных семейств выделяется семейство кобылы Дафины. 8. При контроле происхождения лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК установлена высокая степень эффективности метода - 99,99 %.

4.2. Практические предложения

1. Для контроля достоверности происхождения племенных лошадей необходимо применять полную панель из 17 локусов микросателлитов, что повышает эффективность контроля практически до 100%.

2. Использовать высокополиморфные микросателлитные локусы ДНК в качестве универсальных генетических маркеров при проведении генетического мониторинга заводских и местных пород, оценке генетического разнообразия популяций и составлении селекционных программ.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Зайцева, Марина Анатольевна, Дивово

1. Айала, Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику / Ф.Айала. М.: Мир, 1984.- 230 с.

2. Айала, Ф. Современная генетика / Ф.Айала, Дж.Кайгер. М.: Мир, 1989.-Т.3.-335 с.

3. Алтухов, Ю.П. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике / Ю.П.Алтухов, Е.А.Салменкова//Генетика. 2002. - Т. 38, № 9. - С.1173-1195.

4. Балакшин, О.А. Арабская лошадь в СССР / О.А.Балакшин. М.: Колос, 1978.-208 с.

5. Булат, С.А. ДНК полиморфизм фитопатогенного гриба Pyrenophora tritici - repentis (Died.) Drechsler / С.А.Булат, Н.В.Мироненко // Генетика. -1989.- Т.25, №11.- С.2059-2063.

6. Гладырь, Е.А. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец с использованием групп крови и ДНК-микросателлитов / Е.А.Гладырь, М.И.Селионова, Н.А.Зиновьева // Овцы,козы,шерстяное дело. 2007. - N 4. - С. 19-25.

7. Гладырь, Е.А. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец России с использованием ДНК-микросателлитов. / Е.А.Гладырь, М.И.Селионова, Г.Брем // Докл. РАСХН.- 2004.- N 2. С. 26-28.

8. Глазко В.И., Созинов И.А. Генетика изоферментов животных и растений / В.И.Глазко, И.А.Созинов. Киев: Урожай, 1993. - 528 с.

9. Джинчарадзе, А.Г. Геномная «дактилоскопия» / А.Г.Джинчарадзе, П.Л.Иванов, А.П.Рысков // Докл. АН СССР. -1987. -Т.295.- С.230 241.

10. Донченко, А.С. Области ~ применения ДНК-маркеров при инфекционных болезнях животных (обзор) / А.С.Донченко, В.И.Семенихин // Сиб. вестн. с.-х. науки,- 2008.- N 6. С. 71-75.

11. Дубровская, P.M. Методические рекомендации по использованию иммуногенетических маркеров для оценки изменений генетической структуры популяций (пород) лошадей/ P.M. Дубровская, И.М. Стародумов -ВНИИК, 1995.- 34 с.

12. Левонтин, Р. Генетические основы эволюции / Р.Левонтин. М.: Мир, 1978.-352 с.

13. Майр, Э. Популяции, виды и эволюция / Э.Майр. М.: Мир, 1974.465 с.

14. Меркурьева, Е. К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных/ Е. К.Меркурьева.- М.гКолос, 1970.

15. Мюллис, К.Б. Необычайная истрия о том, как родилась полимеразная цепная реакция // В мире науки.- 1990-№6-с.26-34.

16. Потапов, С.Г. Диагностические возможности мультилокусных маркеров ДНК в систематике диких копытных животных / С.Г.Потапов, О.Н.Токарская, С.К.Семенова, А.А.Данилкин, Г.Г.Марков, А.П.Рысков // Генетика. -1997. -Т. 33, №7. -С. 961-966.

17. Потапов, С.Г. Использование таксономического типирования ДНК для анализа геномной вариабельности представителей Bovidae Grey, 1921/ С.Г.Потапов, И.В.Кудрявцев, А.П.Рысков // Генетика.- 1994.- Т.30, N.6.-С.858-860.

18. Рысков, А.П. Повышенная вариабельность (ТСС)П микросателлитных локусов в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky / А.П.Рысков, Н.Г.Кан, И.А.Мартиросян и др. // Генетика. 2000. - Т. 36, № 11. - С. 1501 - 1506.

19. Семенова, С.К. Использование полиморфных маркеров ДНК для дифференциации пород кур различного происхождения / С.К.Семенова, А.Л.Филенко, В.А.Васильев // Генетика. 1996. - Т. 32, №6. - С. 266-273.

20. Сиянова, Е.Ю. Экспансия тринуклеотидных повторов / Е.Ю.Сиянова, С.М.Миркин // Молекуляр. биол. 2001. - Т. 35, №2. - С. 208223.

21. Смарагдов, М.Г. Генетическое картирование локусов, ответственных за качественные показатели молока у крупного рогатого скота J М.Г.Смарагдов // Генетика. 2006. - Т.42, №1. - С. 5-21

22. Сулимова, Г.Е. Возможности применения полиморфных ДНК-маркеров для массового тестирования животных по генам главного комплекса гистосовместимости / Г.Е.Сулимова, С.С.Соколова, Г.О.Шайхаев // Генет. метЬды в селекции с.-х. жив-х. М, 1990. - с. 76-86

23. Сулимова, Г.Е. Возможности использования ДНК-маркеров хозяйственно ценных признаков крупного рогатого скота в селекционных программах / Г.Е.Сулимова // Актуал. проблемы биологии в жив-ве. -Боровск, 1997. С. 283-294.

24. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е.Сулимова // Успехи соврем, биологии. 2004. - Т. 124, N 3. - С. 260-271.

25. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е.Сулимова // Успехи соврем, биологии.- 2004.- Т. 124, N 3. С. 260-271.

26. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в исследованиях генофонда лошади / Г.Е.Сулимова и др. // Наука о коневодстве на рубеже веков: сб. науч. тр. / ВНИИ коневодства. Дивово, 2005. - С. 146-165

27. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры и возможности их использования в генетико-селекционных исследованиях / Г.Е.Сулимова // Молекулярно -генет. маркеры жив-х. Киев, 1996. - С. 20-32.

28. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры локусов количественных признаков устойчивости к лейкозу и продуктивности у крупного рогатого скота / Г.Е.Сулимова // ДНК-технологии в клеточ. инженерии и маркировании признаков с.-х. жив-х. Дубровицы, 2001. - С. 24-28.

29. Щирский, О.Н. Исследование полиморфизма микросателлитных ДНК лошадей по локусу VHL20 / О.Н.Щирский, И.Е.Костецкий, В.И.Глазко // Молекулярно-генет. маркеры жив-х: тез. докл. 2 Междунар. конференции.-Киев, 1996.-С. 43-44.

30. Эрнст, Л.К. Биологические проблемы животноводства в XXI веке / Л.К.Эрнст, Н.А.Зиновьева. М.: РАСХН, 2008. - С.228-288.

31. Эрнст, Л.К. Изучение влияния прилития крови голштинского скота на изменение генофонда крупного рогатого скота отечественных пород с использованием ДНК-микросателлитов / Л.К.Эрнст и др. // Зоотехния. — 2007. -N 12.-С. 2-5.

32. Aharoni, A. Characterization of a multi-subunit human protein which selectively binds single stranded d (GA) n and d (GT) n sequence repeats in DNA/ A.Aharoni, N.Baran, H.Manor // Nucleic Acids Research.- 1993. -V. 21. -P. 52215228.

33. Alderson, G.L.H. Use of DNA markers to assist with product traceability and pedigree analysis and their role in breed conservation/ G.L.H.Alderson, G.S. Plastow//Animal genetic resources information. Rome, 2005. - N 35. - P. 1-7.

34. Aurich, C. Semen parameters and level of microsatellite heterozygoity in Noriker draught horse stallions / C.Aurich, R.Achmann, J.E.Aurich // Elsevier Science.- 2003.- V.60. P.371-378.

35. Avise, J.C. Molecular markers, natural history and evolution / J.C.Avise. Chapman: An International Thomson Publishing Company, 1994.- 122 p.

36. Awadalla, P. Microsatellite variation and evolution in the Mimulus guttatus species complex with contrasting mating systems / P.Awadalla, K. Ritland // Mol. Biol.-1997.-V. 14,N. 10.-P. 1023-34.

37. Bachtrog, D. Distribution of dinucleotide microsatellites in the Drosophila melanogaster genome / D.Bachtrog et al.// Mol. Biol, and Evolutionary.- 1999.-V. 16.-P. 602-610. ^

38. Bailey, E. Comparison of thoroughbred and Arabian horses using RAPD markers / E.Bailey, T.L. Lear // Anim Genet.- 1994. -V.25, N.l.- P. 105-108.

39. Bailey, E. Linkage of the gene for equine combined immunodeficiency disease to microsatellite markers HTG8 and HTG4; Synteny and FISH mapping to ЕСА9/ E. Bailey et al. // Anim. Genet.- 1997.-V.28.-P.268-273.

40. Baldi, P. Sequence analysis by additive scale: DNA structure for sequences and repeats of all lengths / P.Baldi, P.F.Basnee // Bioinformatics.-2000.- V.16.-P. 865-889.

41. Barrera, G.P. Evaluation de la variabilidad genetica en ganado Criollo Colombiano mediante 12 marcadores microsatelites / G.P.Barrera et al. // Animal genetic resources information. 2006.- N 38. - P. 35-45.

42. Bernoco, D. Frequency of the SCID gene among Arabian horses in the USA / D.Bernoco, E.Bailey // Animal Genetics.- 1998.-V.67.-P. 145-146.

43. Bertoni, F. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers/ Bertoni F. et al. // Genes Chromosomes Cancer. -1999.-V. 26.-P. 176-180.

44. Biet, F. Characterization of pFRI8, a small cryptic plasmid from Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides FR52, and its use as a food grade vector / F.Biet, Y.Cenatiempo, C.Fremaux // FEMS microbiology letters.- 1999-V. 179,N.2.-P.375-83.

45. Binns, M.M. The identification of polymorphic microsatellite loci in the horse (HMB1-6) and their use in thoroughbred parentage testing / M.M.Binns, N.G.Holmes, A.Holliman, A.M.Scott//British Veter. J.-1995.-V.151.-P.9-15.

46. Blott, S. C. Discriminating among cattle breeds using ge- netic markers / S. C.Blott, J. L.Williams, C. S.Hdley // Heredity.-1999.-V.82.-P.613-619.

47. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D.Botstein, R.L.White, M.Skolnick, R.W.Davis // Am. J. Hum. Genet.- 1980.-V.32, N.3.-P.314-331.

48. Boveiniene, B. Microsatellites DNA loci poiimorphism of Zemaitukai horses / B.Boveiniene, R.Juras, V.Jatkauskiene // Proc. of the 6th Baltic animal breeding conference.-Tartu, 1998. —P. 19-23.

49. Bowcock, A.M. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites / A.M.Bowcock et al. // Nature. -1994.-V. 368.- P. 455-457.

50. Bowling, A.T. Blood group and protein polymorphism gene frequencies for seven breeds of horses in the United States / A.T. Bowling, R.S. Clark // Animal Blood Groups and Biochemical Genetics.-1985.-V.16.-P.93-108.

51. Bowling, A.T. Horse genetics / A.T.Bowling.- Walingford, 1996.- 200 p.

52. Bowling, A.T. Likade mapping using equine half-sib families / A.T.Bowling, L.V.Millon, M. L.Eggeleston-Stott // Animal Genetics. -1996.-V.27.- P.73.

53. Bowling, A.T. The genetics of the horse / A.T.Bowling, A.Ruyinsky. -Wallington, 2000. 203 p.

54. Breen, M. Genetical and physical assignments of equine microsatellites -first integration of anchored markers in horse genome mapping / M.Breen et al. // Mammalian Genome.- 1997.-V. 8.- P. 267-273.

55. Breen, M. Six equine dinucleotide repeats: MPZ002, 3, 4, 5, 6 and 7 / M.Breen, P.Downs, Z.Irvin, K.Bell // Animal Genetics.- 1994.-V.25.-P. 124.

56. Brock, G.J. Cis-acting modifiers of expanded CAG/CTG triplet repeat expandability: association with flanking GG content and proximity to- CpG islands/ G.J.Brock, N.H.Anderson, D.G.Monckton // Human Molecular Genetics.- 1999. -V. 8.-P. 1061-1067. ^

57. Buard, J. Complex recombination events at the hypermutable mini satellite CEB1 (D2S90) / J.Buard, G.Vergnaud // EMBO J.-1994.-V.13.-P. 3203-3210.

58. Buchanan, F.C. Determination of evolutionary relationships among sheep breeds using microsatellites / F.C.Buchanan et al. // Genomics.- 1994.-V.22, N.2.-P.397-403.

59. Buntjer, J.B. Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting/ J.B.Buntjeret al. // Heredity.-2002. -V.88, N.I.- P.46-51.

60. Caetano-Anolles, G. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers / G.Caetano-Anolles, В J.Bassam, P.M.Gresshoff // Biotechnology.- 1991.- V.9, N.6.- P.553-557.

61. Canon, J. The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data / J.Canon et al. //Animal Genetics.-2000.-V. 31, № 1.-P.39-48.

62. Catasti, P. DNA repeats in the human genome / P.Catasti et al. // Genetica.- 1999.-V. 106, N. 1 -2.-P. 15-36.

63. Cavalli-Sforza, L. L. The Genetics of Human Populations / L. L.Cavalli-Sforza, W. F.Bodmer. San Francisco: W.H. Freeman, 1971.-. 965 p.

64. Chacraborty, R. Relative mutation rates at di-, tri- and tetranucleotide microsatellite loci / R.Chacraborty et al. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1997.- V. 94-P. 1041-1046.

65. Chang-Claude, J. Risk estimation as a decision-making tool for genetic analysis of the breast cancer susceptibility genes / J.Chang-Claude et al. // Demonstration Project on Familial Breast Cancer, disease markers.- 1999.-V.15,1. N.1-3.-P.53-65. :

66. Codegoni, A.M. Microsatellite instability and frameshift mutations in genes involved in cell cycle progression or apoptosis in ovarian cancer / A.M.Codegoni et al. // Oncol Res.- 1999.-V.11.-P.297-301.

67. Coogle, L. Equine dinucleotide repeat polimorphisms at loci LEX002, -003, -004, -005, -007, -008, 009, -010, -011, -013 and -014 / L.Coogle, E.Bailey, R.Reid, M.Russ//Animal Genetics.- 1996.-V.27, N.2.-P. 126.

68. Cox, J.H. Episodic weakness caused by hyperkalemic periodic paralysis in horses / J.H.Cox, R.M. De Bowes // Comp Cont Educ Pract Vet (Equine).-1990.-V.12.-P.83-89.

69. Deka, R. Population genetics of dinucleotide (dC-dA)n. (dG-dT)n polymorphisms in world populations / R.Deka et al.// Am J Hum Genet.- 1995.-V.56.-P.461-474.

70. Dib, C. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites / C.Dib et al. //Nature.- 1996.-V. 380, N.6570.-P.152-154.

71. Dietrich, W. A comprehensive genetic map of the mouse genome / W.Dietrich et al. // Nature.-1996.-V.3 80.-P. 149-152.

72. Dimsoski, P. Development of a 17-plex Microsatellite Polymerase chain Reaction Kit for Genotyping Horses / P.Dimsoski // Forensic Sciences.-2003.-V.44, N.3.- P. 332-335.

73. Djian, P. Evolution of simple repeats in DNA and their relation to human disease / P. Djian // Cell. -1998. -V. 94,- P. 155-160.

74. Dobzhansky, T. Genetics of Natural Populations. Xxiv. Developmental Homeostasis in Natural Populations of Drosophila Pseudoobscura / T.Dobzhansky, H.Levene // Genetics.- 1955.- V.40.N.6.-P.797-808.

75. Dutreix, M. (GT)n repetitive tracts affect several stages of RecA-promoted recombination / M.Dutreix // J. of molecular biology.- 1997.-V.273, N.1.-P.105-130.

76. Eggeleston-Stott, M. L. Four equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ5, UCDEQ14, UCDEQ46, UCDEQ62 / M. L.Eggleston-Stott et al. // Animal Genetics.- 1996.-V.30, N.2.-P.129.

77. Eggleston-Stott, M. L. Nine equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ136, UCDEQ405, UCDEQ412, UCDEQ425, UCDEQ437, UCDEQ467, UCDEQ487, UCDEQ502 and UCDEQ505 / M. L.Eggleston-Stott et al. //Animal Genetics.- 1999.-V.30.-P.69.

78. Eggleston-Stott, M.L. Four equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ5, UCDEQ14, UCDEQ46 and UCDEQ62 / M.L.Eggleston-Stott et al. // Anim Genet.- 1996.-V.27.-P. 129.

79. Eichler, K. Entwicklung der indirekten Gendiagnose am Polled-Locus beim Rind: diss.- Hannover.- 1999. 165 p.

80. Eisen, J.A. Mechanistic basis for microsatellite instability / J.A. Eisen // Microsatellites: Evolution and Applications -1999.- P. 34-48.

81. Ellegren, H. Cloning of highly polymorphic microsatellites in the horse / H.Ellegren, MJohansson, K.Sandberg, L.Andersson // Animal Genetics.- 1992.-V.23.-P.133-142.

82. Ellegren, H. Microsatellite mutations in germline: implications for evolutionary inference / H.Ellegren // Trends in Genetic.- 2000.- V.16.- P.551-558.

83. Fang, D.Q. A high resolution linkage map of the citrus tristeza virus gene region in Poncirus trifoiata (L.) af./ D.Q.Fang, C.T.Federici, M.L.Roose // Genetics.-V.150.-P.883-890.

84. Field, D. Long, polymorphic microsatellite in simple .organisms / D.Field, C.Wills // Proc. of Royal Society of London В Biological Sciences.- 1996. -V. 263.-P. 209-215.

85. Ford, E.B. Polymorphism/ E.B.Ford // Biol.Rev.-1945.-V.20a.-P.73-88.

86. Gebhardt, F. Modulation'of EGFR gene transcription by a polymorphic : repetitive sequence a link between genetics and epigenetics / F.Gebhardt, -H.Burger, B.Brandt // Intern. J. of Biological Markers. -2000. -V. 15. -P. 105-110.

87. Gebhardt, F. Modulation of epidermal growth factor receptor gene transcription by a polymorphic dinucleotide repeat in intron 1 / F.Gebhardt, K.S. Zanker, B.Brandt// J. of Biological Chemistry. -1999. -V. 274. -P. 13176-13180.

88. Gralak, B. Genetic polymorphism of 12 microsatellite markers in Polish Primitive horse / B.Gralak, C.Niemczewski, Z.Jaworski // Anim. Sc. Papers Rep. -2001. Vol.19, N 4. - P. 277-283.

89. Guerin, G. Characterization of seven new horse microsatellites, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, and HMS8 / G.Guerin, M.Bertaud, Y.Amigues // Animal Genetics.- 1994.-V.25.-P.62.

90. Guerin, G. Report of the International Equine Gene Mapping Workshop: Male Linkage Map / G.Guerin et al. // Animal Genetics.- 1999.-V.30.-P.341-354.

91. Guerin, G. Report of the International Equine Gene Mapping Workshop: male linkage map / G.Guerin et. al. // Animal Genetics.- 1999.-V.30.-P.341-354.

92. Gupta, M. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of SSRs / M.Gupta et al. // Appl. Genet.- 1994.-V.89.-P.998-1006.

93. Harris, H. Enzyme Polymorphisms in Man / H.Harris // Proc. R. Soc. -London, 1966. -V. 164. — P.298-310.

94. Irzikovska, L. Identification of blood cell chimerism in bovine heterosexual twins./ L.Irzikovska, B.Wolko, W.K.Swiecicki // Pisum Genetics. -2001. -V.33, N.l. -P.13.

95. Jakabova, D. Effectiveness of six highly polymorphic microsatellite markers in resolving paternity cases in Thoroughbred horses in Slovakia / D.Jakabova // Anim. Sci.- 2002 V.47, N. 12.-P.497-501.

96. Jeffreys, A.J. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA/ A.J.Jeffreys, V.Wilson, S.L.Thein//Nature. -1985. -V.314, N.6.- P.67-73.

97. Johannsdottir, J.T. The effect of mismatch repair deficiency on tumourigenesis; microsatellite instability affecting genes containing short repeated sequences / J.T.Johannsdottir et al.// Intern. J. of Oncology.- 2000. -V. 16.- P. 133139.

98. Kakoi, H. DNA Typing with 17 Microsatellites for Parentage Verification of Racehorses in Japan / H.Kakoi, S.Nagata, M.Kurosawa // Anim. Sci. -2001.- V.72, N.6.—P.453-460.

99. Kakoi, H. Genetic polymorphism of equine microsatelite loci: TKY16, TKY19 and TKY21 / H.Kakoi et al. // Animal Genetics.- 1999.-V.30.-P.68-81.

100. Kakoi, H. Ten equine microsatelite loci: TKY25, TKY26, TKY27, TKY28, TKY29, TKY267, TKY268, TKY269, TKY270 and TKY271 / H.Kakoi et al. // Animal Genetics.- 2000.-V.31, N.1.-P.68.

101. Karlin, S. Comparative DNA analysis across diverse genomes / S.Karlin, A.M.Campbell, J.Mrazek // Annu Rev Genet. -1998.-V.32.-P. 185-225.

102. Kimura, M. The neutral theory of molecular evolution and polymorphism / M. Kimura // Scientia (Rome).-1977.-V.l 12.-P.687-707.

103. Lafyatis, R. Sequence specific protein binding to and activation of the TGF-beta3 promoter through a repeated TCCC motif / R.Lafyatis et al. // Nucleic Acids Research.- 1991.- V. 19.- P. 6419-6425.

104. Lang, J.W. Individualization and estimation of relatedness in crocodilians by DNA fingerprinting with a Bkm-derived probe / J.W.Lang, R.K.Addarwal, K.C.Majumdar, L.Singh // Moi. Gen. Genet. -1993. -V. 238.- P.49-58.

105. Lindgren, G. Five equine dinucleotide -microsatellite loci HTG17, HTG20, HTG21, HTG28 and HTG31 / G.Lindgren, H.Persson, H.Ellegren // Animal Genetics.- 1999.- V.30.-P.70-88.

106. Litt, M. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene / M.Litt, J.A.Luty // Am. J. hum. Genet.-1989.-V.44.-P.397-401.

107. Liu, Z. Transcribed dinucleotide microsatellites and their associated genes from channel catfish Ictalums punctatus.il Biochemical and Biophysical / Z.Liu, G.Tan, P.Li, R.A. Dunham // Research Communication. -1999. -V. 259. -P. 190-194.

108. MacHugh, D.E. Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers / D.E.MacHugh, R.T.Loftus, P.Cunningham, D.G.Bradley // Animal Genetics.-1998.- 29.-P. 333-340.

109. Ml.Majewski, J. GT repeats are associated with recombination on human chromosome 22 / J.Majewski, J.Ott // Genome Research. -2000.- V. 10. -P. 11081114.

110. Marklund, S. Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites / S.Marklund et al. //Animal Genetics.-1994.-V.25 .-P. 19-23.

111. Meloni, R. A tetranucleotide polymorphic microsatellite, located in the first intron of the tyrosine hydroxylase gene, acts as a transcription regulatory element in vitro / R.Meloni .et al. // Human Molecular Genetics. -1998. -V- 7.- P. 423-428.

112. Menz, M.A. Mutation rate varies among alleles at a microsatellite locus / M.A.Menz // Plant Mol Biol. 2002. - V, 48, N.5-6. - P.483-491.

113. Muller, H.J. Our load of mutation / H.J.Muller // Am. J. Hum. Genet. -1950.-V. 2.-P. 111-176.

114. Murphy, T.D. Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome / T.D.Murphy, G.H.Karpen // Cell. -1995. -V. 82. -P. 599-609.

115. Nadir, E. Microsatellite spreading in the human genome: Evolutionary mechanisms and structural implications / E.Nadir, H.Hargalit, T.Gallily, S.A.Ben-Sasson // Proc. of the National Academy of Sciences USA.- 1996. -V. 93. -P. 6470-6475.

116. Naqvi, N.I. Development of a sequence-characterized amplified region (SCAR) based indirect selection method for a dominant blast resistance gene in rice / N.I.Naqvi, B.B.Chattoo // Genome.-1996.-V.39.-P.26-30.

117. Naylor, J.M. Familial incidence of hyperkalemic periodic paralysis in Quarter Horses / J.M.Naylor, J.A.Robinson, J.Bertone // J Am Vet Med Assoc. -1992.-V.3.-P.340-343.

118. Nei, M. Genetic distance between populations / M.Nei // Amer. Naturalist.-1972.-№106.-P.723-765.

119. Nei, M. Matematical models of speciation and genetic distance / M.Nei //Proc. Intern. Conf. Population Genetics and Ecology. 1975.-N.-Y., 1976.-P.723-765.

120. Neve, G. Selection and genetic polymorphism: Introductory remarks /

121. G.Neve, E.Meglecz// Trends Ecol. Evol.- 2000. -V.15. N.9.- P.376-388.

122. Paran, I. Development-of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce / I.Paran, R.W.Michelmore // Theoretical and Applied Genetics.-1993V.85 .-P.985-993.

123. Pauling, L. Sickle Cell Anemia, a Molecular Disease / L.Pauling,

124. H.Itano, S. J. Singer, W.Ibert// Science. 1949. - №11. - P.15-21.

125. Pickar, J.G. Altered ionic permeability in skeletal muscle from horse with hyperkalemic periodic paralysis / J.G.Pickar et al.// Am J Physiol. (Cell Physiol). 1991 .-V.260.-P.926-933.

126. Pikula, R. The use of RAPD metod for genetic structure comparison of different horse breeds / R.Pikula, M.Gajewska, K. Tomaszewska-Guszkiewicz // Молекулярно-генетические маркеры животных.-Киев, 1999.-C.42-43.

127. Ramshaw, J. A. M. The Sensitivity of gel electrophoresis as a detector of genetic variation / J.A.M.Ramshaw, J.A.Coyne, R.C.Lewontin // Genetics.-1979.- V.93, N.4.-P.1019-1037.

128. Ron, M. .Unequivocal of sire allele origin for multiallelic microsatelites when only sire and progeny are genotyped / M.Ron, M.Band, A.Wyler, J.Weller // Animal. Genetics.-1993-V.4.-P. 171-175.

129. Roques, S. Potential of microsatellites for individual assignment : the North Atlantic redfish (genus Sebastes) species complex as a case study / S.Roques, P.Duchesne, L.Bernatchez // Molecular Ecology.- 1999.-V.8.-P. 17031717.

130. Rudolf, J.A. Linkage of hyperkalemic periodic paralysis in Quarter Horses to the horse adult skeletal muscle sodium channel gene / J.A.Rudolf, S.J.Spier, G.Byms, E.P.Hoffman // Animal Genetics.- 1992.-V.23.-P.241-250.

131. Rudolf, J.A. Periodic paralysis in Quarter Horses: a sodium channel mutation disseminated by selective breeding / J.A.Rudolf et al. // Nature Genetics.-1992.-V.2.-P. 114-147.

132. Sandaltzopoulos, R. Dual regulation of the Drosophila hsp26 promoter in vitro / R.Sandaltzopouloset al. // Nucleic Acids Research.- 1995.- V. 23.- P. 2479-2487.

133. Schafer, R. DNA fingerprinting using non-radioactive oligonucleotide probes specific for simple repeats / R.Schafer, H.Zischler, J.T.Epplen 7/Nucl. Acid Res. -1988.- V.16, №11. -P.5196-5209.

134. Schlotterer, C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA / C.Schlotterer // Chromosoma. -2000.-V.109.-P.365-371.

135. Schlotterer, C. Microsatellites, a neutral marker to infer selective sweeps/ C.Schlotterer, T.Wiehe // Microsatellites: Evolution and Applications. -Oxford, 1999. P. 238-247.

136. Schlotterrer, C. Evolutionary dynamics of microsatellite / C.Schlotterer // Nature Rev. Genet.- 2004. -V.5, N.l.- P.65.

137. Shin, E.K. Evaluation of a test for identification of Arabian horses heterozygous for the severe combined immunodeficiency trait / E.K.Shin, L.E.Perryman, K. Meek //JAVMA.- 1997.- V.211, N.10.-P. 1268-1270.

138. Shiue, Y-L. A synteny of horse genome comprised of 240 microsatelite and RAPD markers / Y-L.Shiue et al. // Animal Genetics.- 1999.- V.30. -P.l-9.

139. Spier, S.J. Hyperkalemic periodic paralysis in certain registered Quarter Horses / S.J.Spier, G.P.Carlson // The Quarter Horse Journal.- 1992.-V.120.-P.68-69.

140. Spier, S.J. Hyperkalemic periodic paralysis in horses / S.J.Spier et al.// J. Am. Vet. Med. Assoc. -1990.-V.197.-P.1009-1017.

141. Steiss, J.E. Episodic muscle tremors in a Quarter Horse: Resemblance to hyperkalemic periodic paralysis / J.E. Steiss, J.M.Naylor // Can. Vet. J.-1986.-V.27.-P.332-335.

142. Tachida H., Iizuka M. Persistence of repeated sequences that evolve by replication slippage// Genetics. 1992. V. 131. P. 471-478.

143. Tautz, D. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation AD.Tautz, M.Trick, G.A.Dover//Nature.- 1986.-V.322, N.6080. -P.652-656.

144. Tautz, D. Hypervariability of simple sequences- as a general source for polymorphic DNA markers / D.Tautz // Nucl. Acids Res. -1989.- V.17, N.16.-P.6463.

145. Templeton, A.R. Recombinational and mutational hot spots within the human lipoprotein lipase gene / A.R.Templeton, A.G.Clark, K.M.Weiss, D.A.Nickerson, E.Boerwinkle, C.F.Sing // Amer. J. of Human Genetics.- 2000. -V. 66. -P. 69-83.

146. Terje, Raudsepp. Cytogenet / Terje, Raudsepp et al. // Genome Res.-2008.-V.122, N.1.-P.28-36.

147. Thomas, C.M. Molecular interactions between tomato and the leaf mold pathogen Gladosporium fulvum / C.M.Thomas et al. // Plant Journal. 1995.- V.8, N.5. - P.785-796.

148. Tokarskaya, O.N. Molecular structure of allelic variants of microsatellite loci Du281 and Du47 in unisexual and bisexual lizard species of the genus Darevskia / O.N.Tokarskaya et al. // Biology Bulletin. 2009. - Vol. 36, Issue 2.-P. 159-166.

149. Toth, G. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis / G.Toth, Z.Gaspari, J.Jurka // Genome Research.- 2000.- V.10.- P. 967981.

150. Tozaki, K. Sequence analysis of trinucleotide repeat microsatellites from an enrichment library of the equine genome / K.Tozaki et al. // Genome.-2000.-V.43.-P.354-365.

151. Usdin, K. Genome evolution driven by a novel type IV secretion system and genomic island transfer / K.Usdin //Nucleic Acids Research.- 1998. -V. 26. -P. 4078-4085. : •

152. Van Haeringen, H. A highly polimorphic horse microsatellite locus: VHL20 / H.Van Haeringen, et al. // Animal Genetics.-1994.-V.25.-P.215-228.

153. Vassart, G. Chromosome translocations and human cancer / G.Vassart 1 et al. // Science. 1987. - V.235. - N.4789. - P.:683-694.

154. Vorlickova, M. Dimerization of the guanine-adenine repeat strands of DNA / M.Vorlickova, I.Kejenovska, J.Kovanda, J.Kyrp // Nucleic AcidsJtes. -1999. -V. 27.-P. 581-586.

155. Wahls, W.P. Homologous recombination enhancement conferred by the Z-DNA motif d(TG)3o is abrogated by simian virus 40 T antigen binding to adjacent DNA sequences / W.P.Wahls, P.D.Moore // Molecular and Cellular Biology. -1990.- V. 10.- P. 794-800.

156. Wallace, R. B. DNA recombinant technology / R. B.Wallace. Boca Raton (Fla.), 1983.-212 p.

157. Waugh R. Using RAPD markers for crop improvement / R.Waugh, W.Powell // Trends Biotechnol.- 1992.- V.10.- P. 186-191.

158. Weber, J.L. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction / J.L.Weber, P.E.May // Am. J. hum. Genet.-1989.-V.44.-P.3 88-396.

159. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J.Welsh, M.Mc Clelland // Nucleic Acids Research.- 1990.-V.19.-P.303-306.

160. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K.Williams et al. // Nucleic Acids Research.-1990.-V.18.-P.6531-6535.

161. Wong, Z. Cloning a selected fragment from a human DNA 'fingerprint': isolation of an extremely polymorphic minisatellite / Z. Wong, V.Wilson, A.J.Jeffreys, S.L.Thein // Nucleic Acids Res. 1986. - V.14, №11. - P.4605-4616.

162. Xu, A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent mphocytosis caused by bovine leukemia virus / A.Xu et al. // J. Immunol. -1993. -V. 151,N.12. -P. 6977-6985.

163. Xu, G. GA CT repeat in the promoter of the chicken malic enzyme gene is essential for function at an- alternative transcription start site / G.Xu,-A.Goodridge // Archives of biochehiistry and biophysics.- 1998.-V.358, N.1.-P.83-91.

164. Zabarovsky, E.R. Gene' synthesis / Zabarovsky E.R. et al. // Nucleic" Acids Res.- 2003. -V.15. -V.31, N.16.- P.95-110.

165. Zhu, K.Y. Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles / K.Y.Zhu, J.M.Clark // Biotechniques. -1996.-V.21, N.4.- P.586.

166. Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification / E.Zietkiewicz, A.Rafalski, D.Labuda // Genomics. -1994. V.20. -P. 176-183

167. Zurkowski, M. Rozwoj badan z zakresu polimorfizmu mikrosatelitanych sekwencji DNA w hodowli koni / M.Zurkowski, B.Gralak, C.Niemczewski // Prezeglad Hodowlany.- 2000.-V.8.-P.20-22.