Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поражение печени и почек при геморрагическом шоке: роль митохондрий и защитный эффект препаратов тетрациклинового ряда

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Поражение печени и почек при геморрагическом шоке: роль митохондрий и защитный эффект препаратов тетрациклинового ряда"

На правах рукописи

Холмухамедов Андалеб Ильхомович

ПОРАЖЕНИЕ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ШОКЕ: РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ И ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ ПРЕПАРАТОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОГО

РЯДА

03.01.02 - Биологическая Физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 АПР 2015

МОСКВА 2015

1

005567383

Работа выполнена в лаборатории департамента Фармацевтических и Биомедицинских Наук, Медицинского Университета Южной Каролины, а также в лаборатории Биофизики и Физиологии Клетки ЦТПФХФ РАН

Научный руководитель: Атауллаханов Фазоил Иноятович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Зинченко Валерий Петрович

доктор биологических наук, профессор Институт Биофизики Клетки РАН

Миронова Галина Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Ведущая организация: НИИ Физико-Химической Биологии

им. А.Н. Белозерского

Защита диссертации состится «22» апреля 2015 года в 12:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.252.01 при «Центре Теоретических Проблем Физико-Химической Фармакологии» РАН по адресу: г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1

С диссеретацией можно ознакомиться в библиотеке «Центра Теоретических Проблем Физико-Химической Фармакологии» РАН.

Афтореферат разослан «1» апреля 2015 года. Ученый секретарь диссеретационного совета,

доктор медицинских наук Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Печень и почки поражаются в результате профузных кровотечений [Heckbert S.R. et al. 1998]. Поэтому необходимы мероприятия, для предотвращения гибели клеток печени и почек после геморрагического шока. Несмотря на восстановление гемодинамики (реперфузия) при инфузионной терапии после профузного кровотечения, многие органы могут подвергнуться прогрессивной вазоконстрикции и гипоперфузии. Геморрагический шок приводит как к некротической гибели клеток, так и к апоптозу печени [Paxian M et al. 2003]. Последние исследования показали, что и некротическая, и апоптозная гибель клеток может быть связана с нарушением функции митохондрий, вызванным пермеабилизацией внутренней мембраны, то есть открыванием митохондральной поры неспецифической проницаемости в качестве главного осложнения реперфузии [Lemasters J.J. et al. 2009]. Пациенты, перенесшие геморрагический шок и последующую инфузионную терапию, подвержены риску развития синдрома системной воспалительной реакции, который связан с повреждением органов и нарушением их функций. Этот синдром полиорганной недостаточности ассоциируется с летальностью в 30% случаев [Visser T. et al. 2008].

Миноциклин и доксициклин, антибиотики из группы тетрациклинов, оказывают защитное действие на печень, почки, мозг и другие органы в различных моделях гипоксического, ишемического и окислительного стресса [Burggraf D et al. 2007, Kelly KJ et al. 2004, Roach DM et al. 2002, Smith JR et al. 1995], однако механизм действия этих антибиотиков остается не выясненным.

Цели и задачи диссертационной работы.

Целью настоящей работы является изучение механизма гибели клеток печени и почек после геморрагического шока, а также возможность защиты печени и почек после геморрагического шока при помощи препаратов тетрациклинового ряда, в частности миноциклина и доксициклина.

Задачи исследования:

1. Определить степень поражения печени и почек после геморрагического шока

2. Определить возможность защиты печени и почек после геморрагического шока при помощи миноциклина

3 ГуО

и

3. Определить возможность защиты печени и почек после геморрагического шока при помощи доксициклина

4. Определить наличие феномена открытия неспецифической митохондральной поры в печени после геморрагического шока, и возможность предотвратить ее открытие при помощи миноциклина и доксициклина

Научная новизна работы. Впервые показано, что в основе повреждений печени и почек при геморрагическом шоке лежит образование/открывание неспецифической митохондральной поры, что приводит к потере митохондриями жизненно-важных функций (таких как синтез АТР) и развитию некротической и апоптозной гибели клеток печени, а также апоптозу клеток почек. Экспериментально показано, что доксициклин и миноциклин являются эффективными фармакологическими препаратами, которые могут применяться в терапии, для уменьшения повреждения печени и почек после геморрагического шока.

Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты углубляют наши представления о механизмах повреждающего действия геморрагического шока на функции печени и почек. Молекулярный механизм такого повреждения заключается в активации и открывании митохондральной поры неспецифической проницаемости, которые приводят к потере основных функций митохондрий вследствие геморрагического шока. Эти препараты (доксициклин и миноциклин) могут быть использованы для лечения пациентов, перенесших геморрагический шок. Кроме того, данные полученные в настоящей работе имеют самостоятельное значение для исследований в области клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что митохондральная пора вовлечена в индукцию ряда патофизиологических явлений, таких как некроз, апоптоз, ишемия и реперфузия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Миноциклин и доксициклин оказывают защитный эффект на печень и почки после геморрагического шока.

2. Миноциклин и доксициклин снижают смертность у экспериментальных животных после геморрагического шока.

3. Миноциклин и доксициклин оказывают защитный эффект на печень после геморрагического шока посредством предотвращения образования неспецифической митохондральной поры.

Апробация работы состоялась 18 апреля 2014 года на заседании межлабораторного семинара «Центра Теоретических Проблем Физико-Химической Фармакологии» Российской Академии Наук.

Материалы диссертации были представлены на «South Eastern Society of Toxicology Meeting» (Athens, Georgia, USA, 2010); на «61st Meeting American Association for the Study of Liver Diseases» (Boston, Massachusetts, USA, 2010); «Society of Toxicology 50th Anniversary Meeting and Tox Expo» (Washington, DC, USA, 2011); на «Society of Toxicology 51st Annual Meeting and Tox Expo» (San Francisco, California, USA, 2012); на «7th Congress of the International Federation of Shock Societies and 35th Annual Conference on Shock » (Miami, Florida, USA 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 52 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, главы 3 -результатов исследования, главы 4 - обсуждения результатов), приложения, выводов и библиографического указателя, включающего 121 источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность темы исследования, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 обзор литературы состит из 3 частей. Приведены основные сведения о геморрагическом шоке, поражении печени и почек при нем. Описана роль митохондрий в патофизиологии ишемии и реперфузии. А также обсуждаются препараты тетрациклинового ряда и их влияние на различные органы.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе. Детальное описание методов изложено в диссертационной работе, здесь же приведено их краткое описание В диссертации приведен подробное описание специфических методов, использующихся в работе, приведены все реактивы, применяемые при проведении экспериментов, методика выделения митохондрий из печени экспериментальных животных с помощью центрифугирования, методики гистологических, иммуногистохимических и биохимических анализов тканей печени

и почек. Описаны принципы и экспериментальные детали модели геморрагического шока.

Модель геморрагического шока на мышах. Мыши (C57BL6) были получены из лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). Все мыши были мужского пола, 8-10 недельного возраста и 26-28 граммов в весе. Протоколы были одобрены комитетом по «Уходу за животными и их использованию» Медицинского Университета Южной Каролины (Charleston, SC). В качестве анестетика использовался пентобарбитал натрия. В дозе 50 мг/кг массы тела пентобарбитал натрия вводился интрапери-тонеально (в брюшную полость). Также мышам вводился бупренорфин (полусинтетический опиоид, являющийся мощным обезболивающим, с расчетом дозы 0,1 мг/кг массы тела) в качестве анальгетика. Необходимая глубина наркоза определялась наличием рефлексов на внешние стимулы, в частности ответной реакции на пощипывание пальцев задних конечностей. Было произведено два разреза в обеих паховых областях для доступа к бедренным артериям. Прилегающие ткани были отсечены тупой диссекцией, при помощи пинцетов Дюпонта. Обе бедренные артерии были отделены от прилегающих тканей, нервов и сосудов. Полиэтиленовые катетеры вводили в бедренные артерии. Один катетер подключался через преобразователь к анализатору давления. Забор крови производился через второй катетер в гепаринизированный шприц в течение 5 минут до тех пор, пока среднее артериальное давление на падало до 30 мм.рт.ст. Это давление поддерживалось в течение 3 часов для си-муляции геморрагического шока. После 3 часов геморрагического шока, мыши были реанимированы введением забранной крови (в течение 20 минут), а также раствора лактата Рингера, соответствующей 50% от объема забранной крови (в течение 10 минут). Тетрациклин (10 мг/кг массы тела), миноцикпин (10 мг/кг) и доксициклин (5 мг/кг) вводились будучи растворены в растворе лактата Рингера. В некоторых экспериментах миноцикпин и доксициклин вводились дважды, за 1 час до геморрагического шока и сразу же после реанимации кровью как описывалось выше. Адекватность реанимации была определена восстановлением среднего артериального давления. На рисунке 1 показано, что среднее артериальное давление было полностью восстановлено после реперфузии, а также то, что среднее артериальное давление до кровотечения и после не

и 100 ÜOO

Время (мин) Рисунок 1. Среднее артериальное давление до, но время и после геморрагического шока.

разнилось. После этого катетеры были удалены, сосуды были перевязаны, и разрезы в паховой области были зашиты при помощи нейлоновых нитей (Nylon 6-0, Ethicon). Контрольные мыши подвергались тем же хирургическим манипуляциям и катетеризацией бедренных артерий, но без утилизации кровотечения. В течение хирургических манипуляций смертности среди животных не наблюдалось. Через 6 часов после реанимации, для определения поражений печени и почек индуцируемых геморрагическим шоком, животные были обескровлены под глубоким наркозом (пентобарбитал, 150 мг/кг). Пробы крови для измерения аланин аминотрансферазы (АЛТ), креатинина и мочевины были собраны из нижней полой вены. От каждой мыши две доли печени были заморожены в жидком азоте. Остальные доли печени были перфузированы 4%-ным параформальдегидом через воротную вену и парафинированы для последующего гистологического, а также иммуогистохимического анализа.

Для экспериментов с определением смертности период геморрагического шока был увеличен до 4,5 часов. Лечение миноцикпином, тетрациклином и доксициклином, а также плацебо было произведено в рандомизированном порядке. Мыши наблюдались дважды в день в течение 7 дней после ГШ/Р.

в крови

РЕЗУЛЬТАТЫ

Защитный эффект миноцикпина и доксициклина на печень после геморрагического шока. В данном разделе показано: во-первых, с применением миноциклина и доксициклина уровень АЛТ значительно снизился с уровня в 1988 после плацебо до 857 и 863 МЕ/Л, соответственно (рис. 2); во вторых, миноцикпин и доксициклин значительно снизили количество гепатоцитов погибших по механизму некроза (рис. 4); и в третьих, миноциклин и доксициклин значительно снизили апоптозную гибель

Рисунок 2. Уровень АЛТ в крови 6 часов после ГШ/Р с применением препаратов только после реперфузии (ГШ/Р после).

Рисунок 3. Уровень АЛТ а крови 6 часов после ГШ/Р с применением препаратов за 1 час до геморрагического шока и после реперфузии (ГШ/Р до и после).

гепатоцитов (рис. 5 и 6) и активность каспазы-3 (рис. 7) в ткани печени. Параллельно выполнялись эксперименты производились эксперименты,

когда препараты тетрациклинового ряда вводились дважды, за 1 час до геморрагического шока и сразу же после реперфузии кровью. Интересно, что введение миноцикпина и доксициклина дважды (рис. 3), не улучшило результаты по уровню АЛТ в крови от тех, что получили миноциклин и доксициклин только единожды (рис. 2). Такая же картина наблюдалась и при гистологическом (рис. 4) и иммуногистохимическом (рис. 5 и 6) анализе ткани печени. Эти эксперименты являются подтверждением того, что большая часть поражения печени при геморрагическом шоке происходит не во время самого шока, а после реперфузии. Заключение

Рисунок 5. TUNEL положительные паренхиматозные клетки (количество клеток/ВПЗ).

Рисунок 6. TUNEL положительные непаренхиматозные клетки (количество клеток/ВПЗ}.

Рисунок 7. Активность каспазы-3 в ткани печени после геморрагического шока и реперфузии.

данной главы дает суммарную оценку всех явлении.

Защитный эффект миноцикпина и доксициклина на почки после геморрагического шока. В данном разделе показан защитный эффект миноцикпина и доксициклина на поражение почек при геморрагическом шоке. Показано, что мино-циклин и доксицик-лин значительно

снижают уровень креатинина в крови после геморрагического шока

Рисунок 8. Уровень креатинина в крови в часов после геморрагического шока.

ш

Рисунок 10. Уровень мочевины в крови 6 часов после геморрагического шока.

i\

у

//У/У

Рисунок 11. TUNEL положительные тубу-лярные клетки почек.

////

Рисунок 12. Активность каспа?ы-3 в ткани почек после геморрагического шока.

(рис. 8). Доксицикпин, но не миноциклин, также значи-тельно снижает уровень мочевины в крови после геморрагичексого шока (рис. 10). Почки, в отличии от печени, не поверглись

Рисунок Э. Уровень

некротичексий гибели как было мочевины в крови 6

часов после геморрагического шока.

обнаружено на гистологичеких срезах (не показано). Иммуногистохими-ческий анализ ткани почек после геморрагического шока выявил апоптозную гибель клеток тубулярного эпителия. Миноцилин и доксицикпин снижают апоптозную гибель клеток тубулярного эпителия после геморрагического шока (рис. 11), также как и активность каспазы-3 в ткани почек, как показано на биохимическом анализе (рис. 12).

Смертность после геморрагического шока. Как

описывалось раннее для экспериментов определения смертности после геморрагического шока период геморрагического шока был увеличен до 4 с половиной часов. Лечение препаратами производилось в случайном порядке. Мыши

наблюдались 7 дней после операции. Смертность после геморраги-ческого шока была около 62%. Миноциклин и доксициклин снизили смертность до 31 и 34%, соответственно (рис. 13).

Прижизненная мультифотонная микроскопия. Последствия геморрагического шока на митохон-дральную функцию печени. Через 4 часа после геморрагического шока у контрольных мышей, прижизненная мультифотонная микроскопия выявила яркую флуоресценцию родамина 123 практически во всех гепатоцитах, точечный рисунок которой означает нормальную поляризацию отдельных митохондрий и их нормальное функционирование (рис. 14). В отли-

-

? [ --П.. .

¡i ♦ Г|. . . Г * 9 W

J i ÜI

2 4«« Зреин (дни)

Рисунок 13. Семндневням

пмжнпаемосп. после гемор-

pai ическою шока.

чие от этого через 4 часа после геморрагического шока и реперфузии с плацебо, флуоресценция родамина 123 стала диффузной и тусклой во многих гепатоцитах, что свидетельствует о митохон-дральной деполяризации и нарушением ее функции. Реперфузия с миноцикпином после геморрагического шока предотвратила деполяризацию в большинстве митохондрий, тогда как картина митохондральной деполяризации после геморрагического шока и реперфузией с тетрациклином практически не отличалась от той, что была при плацебо (рис.

Миноциклин и доксицикпин предотвращают пермеабилизацию внутренней митохондральной мембраны гепатоцитов (рис. 15). Как показано на рисунке 15, у контрольных мышей, красная флуоресценция ТМРМ была точечной во всех гепатоцитах, что указывает на нормальную митохондральную поляризацию. Кальцеин, молекула

размером около 623 Да, содержащая пять полярных концов, непроницаема для

митохондрий в нормальных условиях. Поэтому в норме зеленая флуоресценция кальцеина выделяет митохондрии в виде темных областей, которые колокализируются с точечной флуорес-ценцией ТМРМ. Кальцеин может попасть в митохондрии только при индукции неспецифической проницаемости

митохондральной мембраны, когда митохондрии становятся проницаемы для молекул <1500 Да. Через 4 часа после ГШ/Р+плацебо, у некоторых митохондрий было выявлено отсутствие флуоресценции ТМРМ, что свидетельствует о митохондральной деполяризации. А также темные области кальцеина исчезли, показывая полную диффузную флуоресценцию кальцеина, что свидетельствует об индукции неспецифической проницаемости митохондральной мембраны. Миноциклин и доксициклин предотвратили эти изменения (рис. 15).

Рисунок 14. При-

жн шеиннм микроскопия печени мышеи чире! 4 часа после Г1Н/Р.

14).

ж ш £

ш

□ и

■ -С

Рисунок 15. Прижизненная микроскопия печени мышей через 4 часа после ГШ/Р.

Ингибирование накопления ионов кальция в митохондриях при помощи миноцикпина и доксициклина (рис. 16). В данном разделе сравнены эффекты тетрациклина, миноцикпина и доксициклина на ингибирование накопления ионов кальция в митохондриях при использовании Fluo-5N, как флуоресцентного индикатора экстрамитохонд-ральных свободных ионов кальция. В качестве положительного контроля мы использовали Ruthenium 360, который является ингибитором кальциевого унипортера на внутренней митохон-риальной мембране. Флуо-ресценция Fluo-5N возрас-тает при связывании ионов кальция (рис. 16). В контроле (диметилсульфоксид) флуоресценция Fluo-5N не возрастала, что свидетельствует о быстром накоплении кальция в митохондриях. При использовании Ruthenium360 практически полностью ингибирует накопление ионов кальция в митохондриях. В присутствии миноциклина и доксициклина мы наблюдали ингибирование накопления кальция. Однако в присутствии тетрациклина картина накопления кальция в митохондриях была практически, как и при контроле (диметилсульфоксид, рис. 16).

В приложении рассказано о разработке In Vivo метода исследования неспецифической проницаемости митохондральной мембраны. Печень является одним из важнейших органов поддерживающих гомеостаз, включая такие необходимые процессы как регуляция кислотно-щелочного состояния, поддержание глюкозы в крови, биосинтез белков; биотрансформация фармацевтических препаратов и токсинов, синтез холестерина, желчных кислот и факторов свертывания крови, а также как и другие функции. Лечение заболеваний печени часто включает в себя хирургические методы, при которых приток крови к печени может быть нарушен (при резекции печени, трансплантация, геморрагический шок и сепсис), что приводит к ишемии/реперфузии.

При патологических процессах, как например ишемия/реперфузия, митохондрии участвуют в формировании различных процессов, которые могут привести как к некротической так и к апоптозной гибели. Нарушение митохондральной функции часто включает в себя открывание неспецифической поры на внутренней мембране митохондрий, что приводит к митохондральной деполяризации, разобщению

Рисунок 16. Нш.шни'пие ионов кальцин митохондриями.

окислительного фосфорилирования, большой амплитуде набухания митохондрий и может в итоге привести либо к некрозу из-за истощения запасов АТФ либо к апоптозу после митохондрального освобождения цитохрома С. Эта индукция неспецифической митохондральной проницаемости (МРТ) является предпоследним событием, ведущих к смерти гепатоцитов после ишемии/реперфузии.

Кроме того, нарушение микроциркуляции, может привести к повреждению паренхиматозных клеток печени, к некрозу и апоптозу гепатоцитов. Поэтому исследование функции митохондрий, а также микроциркуляции печени, имеет важное значение для понимания механизмов гибели клеток после ишемии/реперфузии.

Микроциркуляцию печени исследовали десятилетиями [Aharinejad S. et al. 1997, Farrell G.C. et al. 2008, Lee S.H. et al. 2008, McCuscey R.S. et al. 1979, McCuscey R.S. et al. 1990, McCuscey R.S. et al. 2000, McCuscey R.S. et al. 2008, Paxian M. et al. 2004]. Однако прижизненная функция печени исследовалась не так детально. Визуализация микроциркуляции печени с помощью флуоресцентной микроскопии и обработки изображений клеточных органелл гепатоцитов требует внутривенного введения флуоресцентных красителей и визуализации органов-мишеней.

Конфокальная и многофотонная флуоресцентная микроскопия увеличивает разрешение по сравнению с широкопольной микроскопией. Это произвело переворот в области клеточной биологии и прижизненной конфокальной и многофотонной микроскопии. Мультифотонная микроскопия обладает большей проникающей способностью, что делает ее незаменимым инструментом для исследования и документирования изменений в клетках, и даже отдельных органеллах в целых органах живых организмов. Прижизненная мультифотонная микроскопия позволяет исследовать различные процессы, которые наиболее приближены к реальным клеточным событиям, но в свою очередь является более трудоемким и технически сложным с точки зрения необходимого оборудования и навыков.

Также в приложениии описываются обе, хирургическая и микроскопическая части процедуры, что позволяет исследовать клеточные и субклеточные изменения, такие как функции митохондрий и жизнеспособность клеток у живых экспериментальных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на восстановление гемодинамики при инфузионной терапии после кровотечения, многие органы могут подвергнуться прогрессивной вазоконстрикции и гипоперфузии. Некоторые пациенты, перенесшие геморрагический шок и последующую реперфузию в последующем проявляют симптомы синдрома полиорганной недостаточности, который в свою очередь приводит к смертельному исходу в -30% случаев (Visser T. et al. 2008). Почки и печень - это органы наиболее чувствительные к геморрагическому шоку и реперфузии. Поэтому исследования направленные на предотвращение поражения печени и почек при ГШ/Р очень важны для создания новых, более эффективных мероприятий предотвращающих летальный исход после ГШ/Р.

Многочисленные исследования, сделанные в области ишемии и реперфузии, показали, что органы подвергаются стрессу не только во время ишемии, но во время реперфузии. В свою очередь исследования механизмов гибели клеток при ишемии/реперфузии позволили выявить две формы этого процесса - некроз и апоптоз. Каждая из форм имеет свои особенности и характерные признаки. Как демонстрируется в настоящей работе, ГШ/Р может привести как к некротической гибели клеток, так и к программируемой (апоптозу). Последние исследования показывают, что некроз и апоптоз клеток может быть вызван нарушением митохондральной функции, вызванной индукцией неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны. Далее мы обсуждаем механизм образования неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны и роль Са2+ в ее образовании. Общепринятым названием неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны в научном мире, включая Российскую Федерацию, является открытие митохондральной поры неспецифической проницаемости.

Ионы кальция (Са2+) являются ключевым фактором передачи сигналов в клетках. В возбудимых тканях, деполяризация мембраны вызывает вход Са2+ через потенциал зависимые Са2+ каналы. Повышенный уровень Са2+ в цитоплазме гепатоцитов приводит к накоплению Са2+ в митохондриях, что в свою очередь приводит к активации окислительного фосфорилирования (Kim J.S. et al. 2003). Большинство клеток в организме, помимо клеток мышечной ткани, поддерживают уровень Са2+ в цитоплазме не превосходящий в 200 нмоль/П. Чрезмерное накопление Са2+ в митохондриях может приводить к феномену неспецифической проницаемости митохондральной мембраны, когда на митохондральной мембране

13

образуются поры, так называемые «МРТ поры». Несколько предыдущих работ продемонстрировали, что при отсутствии внеклеточного Са2+ клетки менее подвержены стрессу к различным токсичным препаратам (Farber J.L. et al. 1982). Поскольку перенос Ca2* через мебраны клеток является АТФ-зависимым, состояния приводящие к понижению содержания АТФ в клетках, такие как геморрагический шок, могут привести к нарушению кальциевого гомеостаза и как результат, к необратимым последствиям. Поступление Ca2* в митохондрии происходит посредством кальциевого унипортера. Это было экспериментально доказано, так как Ruthenium 360 (специфический ингибитор кальциевого унипортера) ингибирует заброс Са2+ и блокирует МРТ.

МРТ поры неспецифически проницаемы для любых веществ с молекулярной массой до 1,5 килодальтон (32). Повышенное накопление Са2+ в митохондриях, а также многочисленные препараты и химические вещества могут вызывать этот феномен, тогда как циклоспорин предотвращает его, посредством связывания с циклофиллином Д. Как следствие образования этой поры, происходит деполяризация митохондральной мембраны, разобщение окислительного фосфорилирования и коллоидное набухание митохондрий, что может привести к разрыву внешней мембраны и восвобождению цитохрома С из межмембранного пространства, что в свою очередь запускает клеточную гибель по механизму апоптоза.

Строение МРТ пор до сих остается загадкой. В нескольких публикациях предлагалась модель строения МРТ поры состоящая из потенциал-зависимого анионного канала (voltage dependent anion channel, VDAC), переносчика адениновых нуклеотидов (adenine nucleotide transporter, ANT) а также циклофилин Д. Однако последующие экспериментальные данные с генетически модифицированными мышами показали, что образование МРТ-пор по прежнему происходит у мышей с генетическим дефицитом VDAC или ANT. Но что остается неизменным и доказанным фактом, так это бесспорное участие циклофиллина Д в феномене МРТ. Хотя до сих пор точно не установлено явлется ли циклофилин Д составной частью МРТ поры или же просто сигналом к ее образованию.

Многие химические вещества и радикалы способствуют образованию МРТ пор. Обычно эффект таких индукторов МРТ заключается в том, чтобы уменьшить пороговый уровень Са2+ необходимый, чтобы вызвать открытие МРТ пор. В

патологических процессах, где МРТ способствует гибели клеток, Са2+ может иметь несколько ролей. Во-первых, увеличение Са2* в цитоплазме и накопления его в митохондриях может привести к образованию МРТ пор. Во-вторых, другие факторы стресса клеток могут снизить порог чувствительности для Са2+ индуцированного образования МРТ пор. И наконец, синергизм факторов стресса снижающие порог чувствительности и увеличение накопления Са2+ в митохондриях может вызвать МРТ.

Гипотеза о том, что МРТ и гибель клеток может возникать из-за перегрузки Са2+ подтверждена экспериментами с веществом А23187, являющееся Са2+ ионофором, при использовании которого наблюдается транспорт Са2+ в цитоплазму клеток. В культуре гепатоцитов крыс было показано, что А23187 вызывает очень быструю деполяризацию митохондральной мембраны, как было продемонстрировано используя флуоресценцию ТМРМ и кальцеина при помощи конфокальной микроскопии. Кальцеин, флуорофор с молекулярной массой в 623 дальтон, в норме не проницаем для внутренней мембраны митохондрий и проникновение кальцеина в митохондральный матрикс возможно только при образовании неспецифической проницаемости митохондральной мембраны, то есть МРТ поры.

Как было описано выше, МРТ может привести к гибели клеток как по типу апоптоза, так и по типу некроза. Некротическая гибель клеток происходит из за полного истощения АТФ. Однако присутствие альтернативного источника АТФ (как в случае гликолиза) и феномена МРТ приводит к коллоидному набуханию митохондрий и разрыву внешней мембраны, что в свою очередь приводит к высвобождению цитохрома С в цитоплазаму из межмембранного пространства. Цитохром С приводит к активации каспазо-зависимой программируемой гибели клеток. Другим доказательством вышеописанного механизма является факт того, что циклоспорин (ингибитор циклофилина Д) предотвращает как некротичекую, так и программируемую (апоптозную) гибель клеток. Аналогично, при МРТ-зависимом поражение клеток при геморрагическом шоке/реперфузии определяющим фактором гибели клеток будет являться присутствие или отсутствие АТФ в клетках. В этом случае применим сравнительно новый термин «некроапоптоз». Некроапоптоз включает в себя случаи когда и некротическая и програмируемая гибель клеток начинаются с одного сигнала, МРТ в нашем случае.

Независимо от механизма, лежащего в ее основе, индукция неспецифической

проницаемости митохондральной мембраны является ключевым событием гибели клетки по механизму, как некроза, так и апоптоза. Нарушение барьерных свойств мембраны и, как следствие, падение мембранного потенциала приводит к тому, что митохондрии не только утрачивают способность производить АТФ, но, более того, начинают активно гидролизовать его. Это приводит к деэнергизации клетки и, в конечном итоге, к некрозу. Индукция неспецифической проницаемости митохондральной мембраны также вызывает набухание митохондрий, что в свою очередь может вызвать разрыв внешней митохондральной мембраны, что сопровождается выходом цитохрома С из межмембранного пространства. Необходимость цитохрома С для апоптоза стала очевидной, когда было показано, что после выхода из митохондрий цитохром с связывается с белком АраМ, с!АТР и про-каспазой-9, образуя так называемый апоптосомный комплекс. Это, в конечном итоге, приводит к активации ключевых ферментов апоптоза - каспаз (в том числе и каспаза-3), ответственных за ряд биохимических и морфологических изменений в клетке.

Как было описано выше, геморрагический шок приводит к летальному исходу в -30% случаев. Поэтому определение и введение новых методов для улучшения выживаемости после геморрагического шока чрезвычайно важно. Миноциклин и доксициклин, производные тетрациклина, используются широко в медицине как антибактериальные средства. В последние годы было показано, что миноциклин и доксициклин защищают многие органы от стресса при ишемии и реперфузии. Поэтому в настоящей работе было решено протестировать защитные свойства этих препаратов тетрациклинового ряда на модели геморрагического шока.

В нашей работе было показано, что печень и почки подвергаются сильному стрессу после геморрагического шока с последующей реперфузией, как это было показано на повышении уровня АПТ, креатинина и мочевины крови, а также на гистологии печени и иммуногистохимии печени и почек. АЛТ является белком, в частности ферментом, который в нормальных условиях можно обнаружить в цитоплазме гепатоцитов, но не в крови. Единственным путем попадания АЛТ из цитоплазмы гепатоцитов в кровь является разрыв цитоплазматической мембраны гепатоцитов, что в свою очередь является прямым характерным признаком некротической гибели клеток. Возросший уровень АЛТ в крови после геморрагического шока/реперфузии говорит о том, что клетки печени подвергаются некрозу. Миноциклин и доксициклин значительно снизили уровень АЛТ в крови

16

после геморрагического шока/реперфузии. В другой группе экспериментов мы вводили миноциклин и доксициклин дважды, за 1 час до геморрагического шока и повторно после реперфузии кровью. Введение миноцикпина и доксициклина за 1 час до геморрагического шока не улучшило результаты по уровню AJ1T в крови, указывая на то, что преимущественная часть гибели клеток проходится на период реперфузии. Та же картина наблюдалась и при гистологическом анализе печени. Некротическая гибель гепатоцитов возросла после геморрагического шока/реперфузии, а миноциклин и доксициклин снизили ее. Введение препаратов до геморрагического шока опять же не улучшило результаты гистологического анализа печени.

Также как было описано выше, печень мышей после геморрагического шока и реперфузии была подвергнута иммуногистохимическому анализу. TUNEL окрашивание проводилось на срезах печени для оценки двухцепочечных разрывов ДНК, характерные для апоптоза. После геморрагического шока/реперфузии количество TUNEL-положительных паренхиматозных и непаренхиматозных клеток в не некротических участках увеличилось. Применение миноцикпина и доксициклина значительно снизило количество TUNEL положительных паренхиматозных и непаренхиматозных клеток. Введение миноцикпина и доксициклина до геморрагического шока и повторно после реперфузии не улучшило результаты иммуногистохимического анализа ткани печени, от результатов введения миноцикпина и доксициклина один раз после реперфузии кровью, что указывает на то, что преимущественная часть апоптоза гепатоцитов приходится на период реперфузии. Для дальнейшего подтверждения иммуногистохимии мы провели биохимический анализ ткани печени на активность каспазы-3. Биохимический анализ показал, что активация каспазы-3 имеет место после геморрагического шока и реперфузии. Активность каспазы-3 у мышей, получивших миноциклин и доксициклин, была значительно снижена от таковых полученных плацебо. И опять же пред-введение миноцикпина и доксициклина не улучшило результаты биохимического анализа ткани печени, указывая на то, что большая часть апоптоза происходит после реперфузии.

Креатинин является конечным продуктом обмена белков, который образуется в мышцах и затем выделяется в кровь. Единственным путем выведения креатинина из крови является фильтрация его почками. Креатинин имеет особенность только фильтроваться, не подвергаясь секреции или реабсорбции, что делает его особенно

17

полезным для оценки перфузии почек, что является одним из важнейших функциональных особенностей. Возросший уровень креатинина в крови после геморрагического шока/реперфузии указывает на сниженную функциональную способность почек. Миноциклин и доксициклин значительно снизили уровень креатинина в крови после геморрагического шока/реперфузии. В другой группе экспериментов миноциклин и доксициклин введенные дважды, сначала за 1 час до геморрагического шока и затем повторно после реперфузии кровью, не улучшило результаты по уровню креатинина в крови.

Мочевина является конечным продуктом метаболизма белков, которая образуется в печени, затем выделяется в кровь и выводится почками. Уровень мочевины в крови после геморрагического шока/реперфузии значительно повысился по сравнению с контролем. Миноциклин и тетрациклин не снизили уровень мочевины в крови после геморрагического шока и реперфузии. Доксициклин значительно снизил уровень мочевины в крови после геморрагического шока/реперфузии. Доксициклин, введенный дважды, сначала за 1 час до геморрагического шока и затем повторно после реперфузии кровью, также значительно снизил уровень мочевины в крови после геморрагического шока и реперфузии с плацебо. Также, почки мышей после геморрагического шока и реперфузии были подвергнуты иммуногистохимическому анализу. TUNEL окрашивание после геморрагического шока/реперфузии показало, что количество TUNEL положительных тубулярных клеток значительно увеличилось. Применение миноциклина и доксициклина значительно снизило количество TUNEL положительных клеток, указывая на то, что миноциклин и доксициклин обладают защитным эффектом от апоптоза клеток почек после геморрагического шока, что было подтверждено в дальнейшем степенью активности каспазы-3 в тканях почек. Таким образом, миноциклин и доксициклин снижают обе вариации гибели клеток печени и почек, некроз и апоптоз, после геморрагического шока и реперфузии у мышей. Как было описано выше в разделе материалов и методов, для экспериментов определения смертности после геморрагического шока и последующей реперфузии, период геморрагического шока был увеличен до 4.5 часов для симуляции тяжелых случаев геморрагического шока. Лечение миноцикпином, тетрациклином и доксициклином, а также плацебо было произведено в рандомизированном порядке. Мыши наблюдались 7 дней после операции. Смертность при геморрагическом шоке в 4.5 часа составила 62%.

Тетрациклин не снизил смертность после геморрагического шока, тогда как миноциклин и доксициклин снизили ее до 31 и 34%, соответственно.

Одно из предположений в виду защитных свойств препаратов тетрациклинового ряда является то, что они могут вызывать митохондральную деполяризацию, что уменьшает формирование активных форм кислорода, препятствуя образованию МРТ. Однако концентрации миноциклина и доксициклина, использованные в данной работе не вызывают деполяризации митохондральной мембраны. Другое объяснение защитным свойствам миноциклина и доксициклина было предложено в 2009 году. Эта работа предлагает, что защитные свойства этих препаратов опосредованы их способностью связывать Са2+. Но мы наблюдали ингибирование митохондрального накопления Са2+ в концентрациях (300 мкмоль/Л) намного превышающие концентрации миноциклина или доксициклина (20 и 10 мкмоль/Л, соответственно). То есть соотношения миноциклина и доксициклина к Са2+ в данной работе были пятнадцать и тридцать к одному, соответственно. Когда как экспериментально показано, что препараты тетрациклинового ряда стехиометрически связывают ионы металлов один к одному. Таким образом, ингибирование кальциевого унипортера было прямым, а не косвенным эффектом миноциклина и доксициклина на предотвращение накопления Са2+ в митохондриях. Кроме того, тетрациклин наряду с миноциклином и доксициклинов является хелатирующим веществом Са2+, но в нашей работе не ингибировал кальциевый унипортер и не продемонстрировал защитный эффект на печень и почки при геморрагическом шоке.

Ингибирование матриксных металлопротеиназ было также предложено, как основной защитный механизм миноциклина и доксициклина. Тем не менее, другие хорошо охарактеризованные ингибиторы матриксных металлопротеиназ не продемонстрировали защитный эффект при гипоксии при рабочих концентрациях. Миноциклин и доксициклин, но не тетрациклин, оказали защитный эффект на печень и почки, а также значительно снизили смертность при геморрагическом шоке. Хотя миноциклин и доксициклин могут вызывать деполяризацию митохондральной мембраны при высоких концентрациях, а также хелатировать ионы металлов, эти эффекты не являлись основным механизмом защитного эффекта. Ингибирование кальциевого унипортера, что предотвращает накопление кальция в митохондриях, что в свою очередь предотвращает образование МРТ является главным механизмом защитного эффекта миноциклина и доксициклина.

19

В заключении, мы хотели бы рекомендовать использование миноциклина и доксициклина для защиты от пражений печени и почек при геморрагическом шоке в клинической практике.

ВЫВОДЫ

1. Миноциклин и доксициклин уменьшают количество гепатоцитов, погибших по мехнизму апоптоза и некроза после геморрагического шока.

2. Миноциклин и доксициклин уменьшают количество клеток в почках, погибших по мехнизму апоптоза после геморрагического шока.

3. Миноциклин и доксициклин предотвращают индукцию неспецифической проницаемости митохондральной мембраны в печени после геморрагического шока.

4. Миноциклин и доксициклин ингибируют наколение кальция в митохондриях, возможно посредством ингибирования кальциевого унипортера на внутренней митохондральной мембране.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kholmukhamedov A, Czerny С, Hu J, Schwartz J, Zhong Z, Lemasters JJ. Minocycline and doxycycline, but not tetracycline, mitigate liver and kidney injury after hemorrhagic shock/resuscitation. Shock. 2014 Sep;42(3):256-63.

2. Kholmukhamedov A Lemasters JJ. Hemorrhage/Resuscitation-induced liver injury: Protection by Iron Chelation. Shock 2013. 39 (Suppl. 1), 100.

3. Czemy C, Kholmukhamedov A, Theruvath T, Maldonado E, Ramshesh V, Lehnert M, Marzi I, Zhong Z, Lemasters JJ. Minocycline Decreases Liver Injury after Hemorrhagic Shock and Resuscitation in Mice. HPB Surg. 2012; 2012:259512.

4. Kholmukhamedov A, Czerny C, Lemasters JJ. Liver injury following hemorrhagic shock/resuscitation: Mechanisms and targeted therapy with minocycline. Shock 2012. 37 (Suppl. 1), 77.

5. Kholmukhamedov A, Zhang X, Schwartz J, Lemasters JJ. Lysosomal iron release promotes hemorrhage/resuscitation-induced liver injury. Toxicol. Sei. 2012.126 (Suppl. 1), 80-81.

6. Kholmukhamedov A, Czerny С, Hu J, Schwartz J, Zhong Z, Lemasters JJ. Minocycline and doxycycline, but not tetracycline, decrease liver and kidney injury after hemorrhagic shock and resuscitation in mice. Toxicol. Sei 2011.120 (Suppl. 2), 354-355.

7. Kholmukhamedov A, Czerny C, Hu J, Schwartz J, Lemasters JJ. Minocycline and doxycycline decrease liver and kidney injury after hemorrhagic shock/resuscitation in mice. Hepatology 2010. 52 (Suppl.), 588A.

8. Kholmukhamedov A, Czerny C, Hu J, Schwartz J, Zhong Z, Lemasters JJ. Minocycline decreases liver and kidney injury after hemorrhagic shock and resuscitation in mice: comparison of minocycline pre- and post-treatment. In Program Book and Abstracts: Southeastern Society of Toxicology Fall Meeting, Athens, GA, October 11 -12, 2010.