Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris"

На правах рукописи

БОБИК ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ Р'юМа рахЮт.

03.00.23 - биотехнология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

0 9 / п ?

Москва - 2009

003466537

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

академик РАН, доктор химических наук, профессор Мирошников А. И. кандидат биологических наук Пономаренко Н. А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Сергиев П. В.

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев С. М.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится « 2$ » Ш^рСАЖ. 2009 года, в часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзи-мологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

и ^ и к Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема борьбы с массивными кровопотерями является актуальной в современной травматологии и гематологии. Лечебные мероприятия в этих случаях требуют замещения кровопотери, сопровождаются введением в организм больного либо цельной донорской крови, либо препаратов из ее отдельных форменных элементов, либо ее основных белковых компонентов. Белковый состав крови в наибольшей степени представлен человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), а введение этого белка после массивной кровопотери является важной составной частью неотложной терапии. Препарат альбумина используют в случаях травматического и послеоперационного шока, ожогов, сопровождающихся дегидратацией и концентрацией крови, гипопротеинемии и гипо-альбуминемии, нефротических синдромов, цирроза печени, гемолитической болезни новорожденных, отека мозга и др. Препарат ЧСА также находит все большее и большее применение в качестве стабилизирующего агента различных лекарственных препаратов и вакцин, его широко внедряют в дерматологическую и косметологическую практику, используют в системе искусственного кровообращения. В настоящее время препарат ЧСА, получаемый фракционированием плазмы донорской крови, не может вырабатываться в неограниченных количествах ввиду дефицитности донорской крови. Кроме того, данный способ получения неизбежно включает опасность контаминации инфекционными агентами, такими как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека и т.д. Мировая практика последнего десятилетия демонстрирует тенденцию отказа от препаратов, получаемых из донорской крови, из-за значительного увеличения их себестоимости, вызванного необходимостью применения дорогостоящих тест-систем и использования способов глубокой очистки цельной донорской крови и ее отдельных компонентов. В этой связи экономически оправданными оказываются белковые препараты факторов крови, полученные с привлечением современных методов генетической и белковой инженерии.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание отечественной технологии получения рЧСА, аналога таковому плазмы крови, как альтернативы производству лекарственных препаратов, получаемых путем фракционирования плазмы донорской крови.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Создание генно-инженерного штамма метилотрофных дрожжей Р'юЫа раШт, секретирующего рЧСА в культуральную среду.

2. Оптимизация условий культивирования для увеличения уровня экспрессии рЧСА.

3. Подбор условий для оптимальной очистки целевого белка.

4. Исследование структурно-функциональных характеристик полученного препарата рЧСА.

5. Исследования биологической активности препарата на модельных животных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из донорской крови, на их рекомбинантные аналоги. Такие прототипы, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня находятся на разных стадиях завоевания мирового рынка. Способы получения препарата рЧСА были запатентованы в разных странах и характеризуются различными способами клонирования и экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовы-ми и видовыми характеристиками продуцирующих культур, способами очистки и качеством самого препарата. В то же время до настоящего момента в России препарат рЧСА не производился. Впервые на территории Российской Федерации был разработан высокоэффективный процесс получения рЧСА, неотличимого по своим структурно-функциональным свойствам от природного ЧСА, выделяемого из плазмы крови. Данная работа поддержана грантами Минобрнауки и МО РФ и является составной частью программы правительства Российской Федерации, при-

званной сократить существующее технологическое отставание России в области производства современных лекарственных средств.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, получен 1 патент. Результаты диссертации были представлены на 2 российских конференциях: XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2006, Москва, Российская Федерация); научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова» (2006, Москва, Российская Федерация).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 119 страницах и содержит 16 рисунков и 11 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Создание штамма GS115/4CA.

Генетическая конструкция, содержащая кДНК гена ЧСА, была получена на основе вектора pPIC9 (Invitrogen). В состав этого вектора включены следующие элементы генома дрожжей Pichia pastoris дикого типа: нуклеотидная последовательность промотора, нативного терминатора и сигнала полиаденилирования АОХ1 гена алкогольгидрогеназы I, нуклеотидная последовательность гена HIS4 гистидиниолдегидрогеназы и фрагмент нуклеотидной последовательности 3' не-транслируемой области АОХ1 гена, служащий для интеграции в АОХ1 локус. Вектор рР1С9 позволяет клонировать нуклеотидную последовательность целевого белка вместе с собственной сигнальной последовательностью (для секреции экс-прессируемых продуктов), а также способен комплементировать ауксотрофность по гистидину у трансформированных им клеток за счет продукта гена HIS4.

Поли (А)+ РНК, выделенная из образцов биопсии клеток печени доноров, была использована в качестве матрицы для реакции обратной транскрипции с олиго^Ти) праймером. Нуклеотидная последовательность проЧСА была ампли-

фицирована методом ПЦР с полученной кДНК с использованием специфических олигонуклеотидов, комплементарных 5'- и З'-концам последовательности проЧСА, соответственно, и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и Notl. ПЦР-продукт, содержащий последовательность проЧСА, был обработан эн-донуклеазами рестрикции BamHI и Notl и, после очистки из агарозного геля, был объединен в реакции лигирования с аналогично рестрицированным вектором рР1С9. Полученной лигазной смесью трансформировали электрокомпетентные клетки штамма Е. coli DH5a. Первичный скрининг трансформантов проводили при помощи ПЦР с колоний с использованием специфических олигонуклеотидов. Плазмидные ДНК отобранных положительных клонов, были проанализированы с

ын

5'АОХ

чел

Тз'АОХ(ТТ)К

V

рР1С9/ЧСА

_ _ ыш_ _

•j Amp I—¡pBR32|>— 3'AOX H H'S4

. A

j 5'AOX [Ç] ЧСД

помощью рестрикцион-ного анализа. Нуклеотид-ная последовательность, кодирующая альбумин (У00495), была определена в составе конструкции рР1С9/ЧСА секвенирова-нием по методу Сенгера. ДНК плазмиды

рР1С9/ЧСА была линеаризована по сайтам BglII, и полученным набором фрагментов ДНК были 3'АОХ(ТТ)[-|Н154[-|3'АОХ}- трансформированы клет-

Рис. 1. Схема получения штамма GS115/ЧСА. (А) ки R Pastoris штамма Рекомбинация между линеаризованной плазмидной GS155 (Invitrogen, США). ДНК рР1С9/ЧСА и хромосомной ДНК P. pastoris (В)

Интегрирование нуклеотидной последовательности, Схема получения штамма кодирующей человеческий сывороточный альбумин в АОХI локус хромосомной ДНК P. pastoris.

2000 п.о.—

GS115/ЧСА представлена на рисунке Î.

В данном случае интеграция нуклеотидной последовательности рЧСА в АОХ 1 локус хромосомной ДНК P. pastoris происходит за счет гомологичной рекомбинации, приводящей к разрушению АОХ1 гена. Хотя последовательность оставшегося интактным АОХ2 гена более чем на 97% гомологична последовательности гена АОХ1, клетки с разрушенным AOXJ геном растут на метанол-содержащих средах значительно более медленно, чем клетки исходного щтамма. Для них приняты обозначения Muts (имеет слабо выраженный рост на метанолсодержащей среде) и Mut+ (имеет фенотип дикого типа).

В результате визуального контроля по росту на чашках со средой, содержащей метанол или глюкозу (ММ- и MD-arap) среди полученных трансформантов Б j 2 з 4 было отобрано несколько клонов

ж* «—2322 п.о.

«—2027п.о. с0 слабо выраженным ростом на ММ-агаре. (Mut5 фенотип). Наличие нуклеотидной последователь-—564 П0 ности проЧСА в дрожжевом гено-

_ _ _ . ме было проанализировано при

Рис. 2. Электрофореграмма (А) в 1%

агарозном геле продуктов ПЦР полученных помощи метода ПЦР с использова-

при амплификации со специфических оли- ,

r ^ нием специфических олигонуклео-

гонуклеотидов, соответствующих 5 - и 3 -

концам последовательности проЧСА: (2) - тидов. При использовании в каче-геномной ДНК штамма GS115 P. pastoris; (3) - плазмидной ДНК рР1С9/ЧСА; (4) - геномной ДНК рекомбинантного клона; (1) - комбинантных клонов и плазмид-маркер молекулярных масс (п.о., Fermentas); .

Авторадиограмма (Б) гибридизации по блюдали амплификацию фрагмен-Саузерну радиоактивно меченого фрагмента проЧСА, с геномной ДНК клеток штамма GS115 P. pastoris (1) и рекомбинантного довательности проЧСА (рис.2А). В клона (2), обработанной эндонуклеазами рестрикции BamHI и NotI\ (3) - с плазмидной ДНК рР1С9/ЧСА обработанной эндо- GS115 появление фрагмента не на-нуклеазами рестрикции BamHI и Notl; (4) -геномная ДНК фага X, обработанная эндо-нуклеазой рестрикции Hindlll.

стве матрицы геномной ДНК ре-комбинантных клонов и плазмидной ДНК вектора рР1С9/ЧСА наблюдали амплификацию фрагментов ДНК, соответствующих последовательности проЧСА (рис.2А). В случае геномной ДНК штамма

блюдалось. Интеграция последовательности, кодирующей проЧСА, в геном Р. pastoris была также подтверждена методом гибридизации по Саузерну. Обработанная эндонуклеазами рестрикции BamHI и Noll геномная ДНК рекомбинантных клонов была разделена в агарозном геле, перенесена на мембрану и прогибриди-зована с радиоактивно меченым фрагментом проЧСА. На полученной авторадиограмме наблюдали появление фрагмента, соответствующего интегрированной в геном последовательности проЧСА (рис, 2Б). В случае геномной ДНК нетранс-формированных клеток штамма GS115 Р. pastoris этот фрагмент отсутствовал.

Подбор оптимальных условий аналитической экспрессии.

Для аналитической экспрессии было отобрано несколько трансформантов. Электрофорегический анализ суммарных белков культуральной среды после завершения 96 часов экспрессии показал появление секреторного белка имеющего подвижность сходную с таковой ЧСА (М-66.5 кДа), в то время как содержание других белков было незначительно (рис. 3).

По результатам денситометрического анализа для дальнейшей работы был выбран клон GS115/4CA_5 с наибольшим уровнем экспрессии целевого белка ц. 1 0 (15 мг/л). Для повышения выхода целевого продук-

та оптимизацию экспрессии проводили по следующим параметрам: подбор состава культуральной среды, и количество индуктора (метанола), вноси-

Рис. 3. Электрофореграм- мого в среду на протяжении экспрессии (0.5%, 1%, ма в 8% ПААГ суммарных

белков секретируемых 1-5%). Выращивание и экспрессию клеток клона

клетками штамма GS 115 Р. GS115/4CAJ5 Р. pastoris проводили либо на «бо-pastoris, трансформированными вектором рР1С9/ЧСА гатой» сРеде (BMGY, BMMY) либо на «бедной»

(1, 2), (К) - препарат ЧСА (BMG, ВММ), соответственно. «Богатые» среды промышленного производства (Bayer) помимо всех компонентов «бедных» сред содержали 1% дрожжевой экстракт и 2% пептон. Метанол добавлялся до выбранного количества каждые 24 часа.

В ходе данных экспериментов было установлено, что максимальный (40 мг/л) уровень экспрессии ЧСА достигается в случае использования среды BMMY (1 % дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ фосфат калия рН 6, 1.34% дрожжевая азотной основа, 1.6 мкМ биотин) и при внесении 1% метанола каждые 24 часа.

Оптимизация экспрессии рЧСА в условиях культивирования в фермен-

Дальнейшее увеличение уровня секреции рЧСА клетками клона GS115/4CA_5 с фенотипом Muts было исследовано при культивировании в ферментере. При использовании стандартной методики культивирования дрожжей P.pastoris, уровень продукции белка составил 120 мг/л. Экспрессия проводилась в течение 96 часов с момента индукции, аликво-ты экспрессионной культуры отбирались каждые 24 часа и анализировались с помощью денатурирующего электрофореза в 8% ПААГе (рис. 4) с последующей денситометрией геля и Вестерн-блот анализом (данные не приводятся). Вестерн-блот анализ проводился с использованием антител кролика на альбумин человека. Детекцию осуществляли с использованием антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Анализ полученных данных выявил закономерность между накоплением секреторного рЧСА и увеличением доли его высокомолекулярных агрегатов и протеолитических фрагментов процессе культивирования. Также было установлено, что, как и в случае аналитической экспрессии, так и в условиях культивирования в ферментере, максимальный уровень экспрессии достигался на третьи сутки после индукции, а после 96 часов с момента индукции количество рЧСА в культуральной среде резко уменьшалось. Как показано ранее, протеолитическая деградация различных секретируемых ре-комбинантных белков зависит от концентрации в ней ионов аммония (Kobayashí

1 2 3 4 5 6 7

mm - — —"*>

Рис. 4. Электрофореграмма в 8% ПААГ суммарных белков, секретируемых клетками штамма GS 115 Р. pastoris, трансформированными вектором рР1С9/ЧСА, через 18, 24, 36, 48, 56 и 72 часа с момента индукции (2-7), (1) -препарат ЧСА промышленного производства (Bayer).

et all., 2000) и от значения рН среды в процессе культивирования (Whittaker et all., 2000). Использование «модифицированной» культуральной среды, содержащей на начальный момент культивирования 0,6 M ионов NH4+, и поддержание рН среды в процессе культивирования на уровне 5.8 ± 0.2, позволило нам значительно снизить протеолиз рЧСА и получить 360 мг/л целевого белка через 190 часов после момента индукции (рис.5). Ранее установлено (Ramon et all., 2007), что на уровень экспрессии рекомбинантного белка клетками Muts фенотипа оказывает влияние введение углеводной компоненты в культураль-ную среду в процессе культиви-

„ _ рования, после индукции экс-

Рис. 5. Зависимость количества секрети-

рующегося альбумина штаммами GS115/4CA и прессии. В качестве углеводной

GS115/4CA2 от времени культивирования в ^ с

, г j г компоненты нами был выбран

ферментере при различных условиях.

GS115/ЧСА - экспрессия рЧСА клетками штам- сорбитол. Экспрессия проводима GS115/4CA при использовании стандартной

^с. 1 г /тш а /х гт » + лась в культуральной среде, со-методики культивирования; GS115/4CA/NH4 -

экспрессия рЧСА клетками штамма GS115/ЧСА держащей в начальный момент

с «модифицированной» культуральной средой; п , ,,

, „„. F культивирования 0,6 M ионов

GS115/ЧСА/СР - экспрессия рЧСА клетками

штамма GS115/ЧСА в ферментере с «модифи- NH4+, с поддержанием рН среды

цированной» средой и введением сорбитола в на овне 5 g ± g 2 Водный ас

качестве углеводной компоненты в процессе На УРовне • • • одиыи Рас

роста после индукции; GS115/ЧСА2/СР - экс- твор сорбитола начинали пода-

прессия штамма GS115/4CA2 в ферментере с

г , „ „ вать в культуральную среду по-

«модифицированнои» средой и введением сорбитола в качестве углеводной компоненты в еле первых шести часов с мо-

процессе роста после индукции. r г мента начала подачи метанола с

постоянной скоростью 0,5 г/л/час. Экспрессия проводилась в течение 190 часов,

аликвоты культуральной жидкости отбирались каждые сутки и анализировались с

помощью денатурирующего электрофореза в 8% ПААГе. Денситометрический

анализ полученной электрофореграммы показал, что уровень экспрессии рЧСА составил 1 г/л (рис.5).

Создание штамма GS115/4CA2.

Ранее было показано, что увеличение уровня экспрессии может быть достигнуто путем введения в геном P. pastoris дополнительных копий гена рекомби-нантного белка (Huang et all., 2006). Для создания штамма, содержащего две копии кДНК гена альбумина в геноме, была получена генетическая конструкция pPICZaA/4CA на основе вектора pPICZaA (Invitrogen). Этот вектор содержит следующие элементы: промотор АОХ1 гена, нативный терминатор и сигнал поли-аденилирования АОХ1 гена дрожжей Píchia pastoris дикого типа, последовательность гена Sh ble, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к зеоцину. Также, этот вектор позволяет клонировать нуклеотидную последовательность целевого белка вместе с собственной сигнальной последовательностью (для секреции экспрессируемых продуктов).

Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность проЧСА, был амплифицирован методом ПЦР с полученной ранее генетической конструкции рР1С9/ЧСА с использованием специфических олигонуклеотидов, содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции Hindill и Notl, соответственно. ПЦР-продукт, соответствующий нуклеотидной последовательности проЧСА, был обработан эн-донуклеазами рестрикции HindlH и Notl и после очистки из агарозного геля был объединен в реакции лигирования с аналогично рестрицированным вектором pPICZaA. Полученной лигазной смесью трансформировали электрокомпетентные клетки штамма Е. coli DH5a. Отбор и анализ клонов проводили, как описано выше для рР1С9/ЧСА. ДНК плазмиды pPICZaA/4CA была линеаризована по сайту Sad, и полученным набором ДНК-фрагментов были трансформированы клетки штамма GS155/4CA_5 P. pastoris. Схема получения штамма GS115/4CA2 представлена на рис. 6.

C|pLCo^-)cyclTTl Sh Ыа [(fc^^j--.

pPICZaA /ЧСА iS'AOXljS'AOxRj ЧСЛ |3'АОХГПГ

-j S' AOX Q^J ЧСА I УАОХСПда^Н 3'AOX|-

B

-|S'AOXQj ЧСА laAOX^jp^^Sliblebc'TTl^ï^S'AOxQ^ ЧСА |3'AOX(TT)|-HIS4|]3'AOXt-

Рис. 6. Схема создания штамма GS115/ЧСА2. (А). Рекомбинация между линеаризованным вектором pPICZaA/4CA и хромосомной ДНК P. pastoris. (В). Интегрирование второй копии нуклеотидной последовательности, кодирующей ЧСА, в АОХ1 локус хромосомной ДНК P. pastoris.

Полученные трансформанты были тестированы на Mut+ или Mut5 фенотип, и среди них были отобраны клоны со слабо выраженным ростом на метанолсодер-жащей среде с зеоцином.

Встраивание второй копии нуклеотидной последовательности проЧСА в дрожжевой геном было проанализировано при помощи метода ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов (рис. 7а). В результате ПЦР с геномной ДНК рекомбинантных клонов и вектора pPICZaA /ЧСА образовывались фрагменты ДНК размером около 3500 п. о., отсутствующие в случае использования в качестве матрицы геномной ДНК штамма GS115/ЧСА. (рис. 76).

Количество интегрированных копий кДНК гена ЧСА было оценено с помощью ПЦР в режиме реального времени. Частично фрагментированная геномная ДНК рекомбинантных клонов, клеток штаммов GS155/4CA и GS155 P. pastoris была использована в качестве матрицы в ПЦР в режиме реального времени со специфическими олигонуклеотидами к последовательности кДНК гена ЧСА. В качестве внутреннего контроля была выбрана нуклеотидная последовательность гена аргининосукцинатлиазы ARG4 генома P. pastoris.

а

-у ЛОХtij чса |3'aoxpt)}[%m^jiw)|sh blefcyc |УЛОХ(ТТ^[ш53^'АОХ|

■»-Р5

ПЦР с праймеров Р4 и Р5

3500 п.о.

M 1 2 3 4

4000 п.о. » 3000 п.о. »

Рис. 7. Анализ интеграции второй копии гена ЧСА при помощи ПЦР: а - участок ДНК дрожжевого генома рекомбинантных клонов, амплифицирующийся в результате ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов Р4 и Р5; б -электрофореграмма в 0.8 % агарозном геле продуктов ПЦР полученных при амплификации со специфических олигонуклеотидов, соответствующих 3'- и 5'-концам последовательности ЧСА: (1) - плазмидной ДНК pPICZaA/4CA; (2, 3) -геномной ДНК рекомбинантных клонов; (4) - геномной ДНК штамма GS115/ЧСА P. pastoris; (M) - маркер молекулярных масс (п.о., Fermentas).

Для расчета эффективности образования ПЦР-продукта для каждой пары специфических олигонуклеотидов EHSA и EARg4 определяли значение порогового цикла С(Т) в серии ПЦР с последовательным разведением субстрата (Р0 - 16, 8, 4, 2 и 1 нг). Эффективность составила Ен$а = 1.9 и EARq4 = 1.8. Количество копий кДНК гена ЧСА в рекомбинантных клонах было рассчитано относительно количества копий в геноме клеток штамма GS155/4CA P. pastoris как R = 2 *ЕС<Т)1 -С(Т)п, где C(T)¡ и С(Т)„ - это средние значения пороговых циклов для ПЦР с геномной ДНК клеток штамма GS155/4CA и рекомбинантных клонов соответственно. Отрицательным контролем служила геномная ДНК клеток штамма GS155 P. pastoris. Согласно полученным данным рекомбинантные клоны содержат в своем геноме 3 или 4 интегрированные копии кДНК гена ЧСА в расчете на диплоидный геном, в то время как исходный штамм GS115/ЧСА - две. Количество

копий гена АЯС4 было одинаково во всех образцах и составляло две единицы в расчете на диплоидный геном.

Для аналитической экспрессии было отобрано несколько клонов. По результатам денситометрического анализа результатов аналитической экспрессии для дальнейшей работы был выбран клон 08115/ЧСА2_3 с наибольшим уровнем экспрессии целевого белка (60 мг/л). В условиях культивирования в ферментере при использовании «модифицированного» протокола экспрессии (содержание 0,6 М ионов ИН4+ в начальный период культивирования, поддержание рН среды на уровне 5.8 и введение в качестве углеводной компоненты сорбитола в культу-ральную среду после индукции экспрессии) уровень экспрессии целевого белка составил 1.4 г/л (рис. 5).

Разработка схемы очистки рЧСА из культуральной жидкости. Схема многостадийной очистки получаемого препарата рЧСА представлена в таблице 1. Указанная последовательность стадий была выбрана как наиболее короткая по времени и, одновременно с этим, обеспечивающая наилучшую чистоту белка при максимальном выходе. Данная методика позволяет получать рЧСА, не содержащий детектируемых ДСН-ПААГ посторонних примесей, с выходом около 39%. По данным хроматографического анализа (ВЭЖХ) получаемый таким образом рЧСА содержит не более 15% димерной и не более 0.8% полимерной формы рЧСА. Определение суммарного содержания углеводов в препарате показало, что исследуемый препарат практически не содержит примесей гликозилированной формы рЧСА (<0,1 %).

Также были опробованы следующие последовательности стадий: •«термокоагуляция - обработка кислотой - ультрафильтрация - катионооб-менная хроматография - анионообменная хроматография - гидрофобная хроматография - ультрафильтрация - добавление стабилизаторов",

•«ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой - катионооб-менная хроматография - гидрофобная хроматография - осаждение в изоточке -

Табл. 1. Схема очистки препарата рЧСА.

Стадия очистки Доля мономера рЧСА по вэжх, % Выход стадии по ВЭЖХ, % Углеводы мкг на мг рЧСА Цель проведения стадии очистки

Ультрафильтрация на мембранах 300 и 30 кДа, диафильтрация 97,5* 1500 Удаление крупных агрегатов посторонних белков, удаление компонентов ростовой среды,концентрирование раствора, обессоливание.

Нагревание, обработка кислотой, центрифугирование 78* 910 Коагуляция посторонних примесей при тепловой и кислотной денатурации.

Катионообменная хроматография, обработка тетраборатом натрия 73 79 30 Отделение остаточных посторонних примесей, диссоциация мультимеров рЧСА, образовавшихся при нагревании и обработке кислотой, путем инкубации в слабощелочной среде.

Гидрофобная хроматография 81 88 5,8 Удаление гликозилированной формы рЧСА, не связывающейся с колонкой.

Анионообменная хроматография, высаливание 86 96 5,3 Удаление мультимеров и части димера рЧСА, связывающихся с аниообменным сорбентом, и последующее концентрирование раствора высаливанием.

Финальное концентрирование и диафильтрация, добавление стабилизаторов. 86 77 5,0 Дальнейшее концентрирование очищенного рЧСА удаление солей, введение стабилизаторов для долговременного хранения стерилизованного раствора.

Примечание: * - определение количества рЧСА проводили по денситометрии электрофо-

реграммы.

•«ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой - катионооб-менная хроматография - гидрофобная хроматография - осаждение в изоточке -

•«ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой - анионообменная хроматография - катионообменная хроматография - гидрофобная хроматография - осаждение в изоточке - ультрафильтрация - добавление стабилизаторов",

•«ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой - анионообменная хроматография - катионообменная хроматография - осаждение в изоточке - гидрофобная хроматография - ультрафильтрация - добавление стабилизаторов".

Все вышеперечисленные способы построения процесса очистки приводили к получению рЧСА приблизительно сходной чистоты, но с существенно более высоким содержанием димера и мультимеров.

Структурно-функциональные исследования рЧСА.

Данные, полученные при определении И-концевой аминокислотной последовательности рЧСА (БАНКБЕУ...) позволяют утверждать, что в процессе секреции происходит корректное отщепление сигнальной последовательности.

Для подтверждения идентичности первичной структуры полученный реком-бинантный белок и его триптический гидролизат были охарактеризованы масс-спектрометрически. Молекулярная масса белка определенная методом ТОР-МАЬЭ1 составила 66572.6 Да (теоретически рассчитанная - 66504.27 Да). Масс-спектрометрический анализ набора триптических пептидов для исследуемого белка позволил определить 15 пептидов, принадлежащих ЧСА. Пептидов, не принадлежащих последовательности ЧСА, при анализе обнаружено не было. Таким образом, исследованная часть аминокислотной последовательности анализируемого белка полностью идентична ЧСА. Известно, что идентичность вторичных структур рекомбинантного белка и его природного аналога является одним из критериев функциональной активности биотехнологического продукта.

Для подтверждения того, что выделенный рекомбинант-ный аналог находится в нативной конформации, был проведен сравнительный анализ спектров кругового дихроизма рекомби-нантного белка и альбумина, вы-

Длина волны [нм]

Рис. 8. Спектры КД природного (1) и дленного из сыворотки донор-рекомбинантного препаратов (2) в области ской крови. Полученные резуль-250-190 нм. Концентрация белков состав- ,

ляла 1.03 мг/мл в 25 мМ фосфатном буфе- таты позволяют Утверждать, что

ре (рН 7.4). вторичная структура рекомби-

наитного альбумина идентична таковой альбумину плазмы крови человека (рис. 8).

Содержание а- и ("i-структур в рекомбинантном альбумине, рассчитанное с помощью программ CONTINLL, CDSSTR и SELCON3 составило 58,9±1,9% а-спиралей, 4,5±0,5% (3-слоев и 13±1,2% р-изгибов, что согласуется с результатами полученными ранее другими исследователями для природного препарата альбумина (Wetzel et all., 1980).

ЧСА содержит в своей аминокислотной последовательности 35 остатков цис-теина, 34 из которых замкнуты в 17 дисульфидных связей, стабилизирующих третичную структуру альбумина. Свободная тиоловая группа цистеина (34Cys) обеспечивает около 80% восстановительного потенциала плазмы крови и доступна для ацилирования, нитрозилирования и образования смешанных дисульфидов. В норме в плазме крови лишь около 60% ЧСА находится в восстановленной форме, называемой меркаптоальбумином. Нами было определено процентное соотношение меркаптоальбумина в препарате ЧСА плазмы крови "Плазмальбумин" (Baxter, США) и полученного рекомбинантного альбумина (табл. 2). Полученные результаты показали сходное содержание меркаптоальбумина в анализируемых препаратах. Несколько пониженное содержание меркаптоальбумина в обоих препара-

тах может быть связано с образованием дисульфидных связей между альбумином и тиолсодержащими соединениями, используемыми в процессе выделения и очистки альбумина.

Табл. 2. Процентное содержание меркаптоальбумина в препарате ЧСА плаз-

Препарат ЧСА Меркаптоальбумин, %

"Плазмальбумин" 40,5 ±2,4

рЧСА 46,7 ± 3,1

Катализ является одной из наиболее эволюционно совершенных функций белковой молекулы. Соответствие каталитических характеристик рекомбинантно-го белка и его природного аналога является прекрасным свидетельством в пользу адекватного фолдинга и других функциональных свойств биотехнологического продукта. Ранее было показано, что ЧСА обладает слабой эстеролитической активностью (Kurono et all., 1996). Для подтверждения корректности третичной структуры рекомбинантного ЧСА была определены константы псевдо-первого порядка скорости гидролиза пара-нитрофенилацетата (Кна6.), катализируемых рЧСА и ЧСА, выделенного из донорской крови. Численные значения Кнаб. составили (5,55±0,9)х10'3 сек"1 и (6,03±0,7)х10'3 сек "', соответственно. Полученные

данные указывают на соответствие третичных структур исследуемых

белков, выраженное в идентичности формирования их каталитических центров.

Важной характеристикой биологической активности рЧСА с точки зрения его транспортных функций является определение констан-

Рис. 9. Зависимость сигнала флуоресценции от количества добавленного билирубина. Я - отношение концентраций били- ты связывания белка с билируби рубина и альбумина, М^ - отношение сиг нала флуоресценции в присутствии билиру бина к сигналу в его отсутствии.

ном. Чтобы охарактеризовать параметры связывания рЧСА с билиру-

бином фиксированное количество белка (1 мкМ) титровали возрастающими количествами билирубина (рис. 9). Полученная изотерма связывания (у = -0,55х +

0,9578, R2 = 0,98) была линеаризована в координатах Скэтчарда (рис. 10).

Значение Ка, рассчитанное по тангенсу угла наклона прямой в координатах Скэтчарда, составило (4,7 ± 0,7)* 107 М'1,

что соответствует данным, по-

Рис. 10. Изотерма связывания, линеаризованная в координатах Скэтчарда. Q - расчет- лученным для альбумина, вы-ная величина, равная (F„-F)/(F0-F,), где F0 - деленного из плазмы сигнал флуоресценции в отсутствии билирубина, Fj - сигнал флуоресценции при R = 1, В - (Mateen et all., 2002). концентрация несвязанного билирубина.

Исследования биологической активности препарата рЧСА.

Для апробации полученного препарата рЧСА была избрана модель острой кровопотери на крысах. Основным критерием терапевтической активности препарата рЧСА в сравнении с препаратом ЧСА, полученным из донорской крови, являлась комплексная оценка состояния подопытных животных по гематологическим и биохимическим характеристикам. Замещение кровопотери проводили 10 % раствором донорского альбумина в сочетании с физиологическим раствором в соотношении 1:3 (контрольная группа) и 10 % раствором рЧСА в сочетании с физиологическим раствором в соотношении 1:3 (опытная группа). Определение гематологических показателей у подопытных животных после замещения острой массивной кровопотери свидетельствует о том, что тенденции восстановления функций крови в обеих группах были идентичны (табл. 3). После кровопотери при сниженном количестве гемоглобина развивается компенсаторная реакция организма, направленная на увеличение переноса количества

газов единицей объема крови. Эта реакция выражалась в увеличении насыщения эритроцитов гемоглобином и увеличении среднего объема эритроцита и проявлялась в той или иной степени у всех групп животных обеих групп (табл. 3). Анализ исследования красных клеток крови крыс после замещения острой массивной кровопотери рЧСА свидетельствует о способности препарата стимулировать компенсаторные системы организма на восстановление таких важных показателей крови, как количество эритроцитов и гемоглобин. Анализ представленных данных свидетельствует об отсутствии достоверных изменений между контрольной и опытной группами и указывает на наличие лечебной эффективности рЧСА.

Табл. 3. Гематологические показатели крови крыс после замещения острой массивной кровопотери в контрольной и опытной группах животных.

Показатели До кровопотери После трансфузии

через 2 часа через сутки

Гематокрит, % контрольная группа 6±0,47 36,0±0,65 31,6±1,05

опытная группа 33,1±1,64 29,2±1,58

Содержание гемоглобина, г/л контрольная группа 149,7±1,16 107,3±1,57 100,5±1,76

опытная группа 119,0±3,54 117,1 ±4,06

Количество эритроцитов, х10|2/л контрольная группа б,42±0,071 4,52±0,188 4,25±0,273

опытная группа 4,54±0,222 • 4,56±0,068

Концентрация гемоглобина в эритроците, % контрольная группа 32,9±0,45 32,9±1,25 38,3±1,17

опытная группа 29,85±0,54 31,8±0,91

Средний объём эритроцита, мкм3 контрольная группа 72,4±0,89 74,6±3,29 67,6±3,85

опытная группа 80,3±2,09 76,0±4,64

Число наблюдений, п 29 6 6

Биохимические исследования имеют диагностическое значение в случае испытания нового препарата, особенно белкового происхождения. Полученные данные по изучению биохимических показателей сыворотки крови крыс указывают на то, что рЧСА способен восстанавливать белковый баланс организма в течение 24 часов наблюдения (табл. 4).

Общеклинические исследования мочи крыс, перенесших замещение массивной кровопотери, характеризуют функциональную способность почек и со-

стояние внутренних органов. Показатели деятельности почек крыс после замещения кровопотери также были схожи в обеих исследуемых группах (табл. 5).

Табл. 4. Биохимические показатели сыворотки крови крыс после замещения

Показатель До кровопотери Через сутки после кровопотери

контрольная группа опытная группа

Мочевина, ммоль/л 4,6+0,329 6,62+0,991 5,3±0,41

Креатинин, ммоль/л 0,034±0,0026 0,045+0,008 0,056+0,0032

Глюкоза, ммоль/л 6,64±0,428 7,45+ 0,969 8,18±0,774

Натрий, ммоль/л 140,5±1,09 140,2+1,48 140,4+0,95

Кальций, ммоль/л 1,263±0,0274 1,255+0,0456 1,262+0,0169

Общий белок, г/л 74,05± 1,766 77,2+2,72 72,55+0,919

Число наблюдений, п 18 6 6

Табл. 5. Показатели функции почек крыс после замещения острой массивной кровопотери.

Показатель До кровопотери Через сутки после кровопотери

контрольная группа опытная группа

Билирубин, ммоль/л 7,5+1,11 7,5+1,45 6+5,8

Удельный вес, г/л 1,022+0,0011 1,024+0,024 1,026+0,016

РН 7,5+0,15 7,0+0,32 7,1+0,24

Белок, г/л 0,546+0,0744 0,983+0,274 0,611+0,161

Лейкоциты, \¥ВС/л 16,6+5,58 3,05+1,21 3,3+2,8

Суточный диурез, мл 6,06+1,042 8,32+1,807 6,5+1,08

Число наблюдений, п 15 6 6

Таким образом, представленный материал подтверждает способность рЧСА восстанавливать гемодинамические нарушения организма, активно участвовать в восстановлении белкового обмена, способствовать нормализации гематологических характеристик. В результате проведенных экспериментальных исследований по изучению специфической активности рЧСА подтверждена возможность применения его в качестве трансфузионного фармакологического препарата с целью ликвидации патологических нарушений, связанных с острой массивной кровопотерей.

выводы

1. Создан штамм метилотрофных дрожжей Р1сЫа раяШ'и секретирующий человеческий сывороточный альбумин в культуральную среду.

2. Подобраны оптимальные условия экспрессии ЧСА в условиях культивирования в ферментере, позволяющие достигнуть уровня экспрессии целевого белка 1.4 г/л.

3. Разработана схема многостадийной очистки препарата рЧСА, которая позволяет получать рЧСА с выходом около 39%, содержащего не более 15% димерной и не более 0.8% полимерной формы рЧСА.

4. Показано, что по своим структурным характеристикам, каталитической активности и лиганд-связывающим свойствам получаемый препарат рЧСА неотличим от природного ЧСА, выделяемого из плазмы крови.

5. В результате проведенных экспериментальных исследований по изучению восстановлению функций крови после замещения острой массивной кро-вопотери у крыс подтверждена возможность применения полученного препарата рЧСА в качестве трансфузионного фармакологического препарата.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Козырь A.B., Бобик Т.В., Игнатова А.Н., Колесников A.B. (2004). Продукция Fab-фрагмента ДНК-гидролизующего антитела BV04-01b ме-тилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Молекулярная биология, 38(6), 1067-75.

2. Бобик Т.В., Воробьев И.И., Пономаренко H.A., Габибов А.Г., Мирош-ников А.И. (2008). Экспрессия человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris и его структурно-функциональный анализ. Биоорган, химия, 34,56-62.

3. Бобик Т.В., Воробьев И.И., Пономаренко H.A., Габибов А.Г., Мирош-ников А.И. (2008). Высокоэффективный процесс получения рекомби-нантного человеческого сывороточного альбумина и его структурно-функциональный анализ. Биотехнология, 4,43-54.

4. Воробьев А.И., Мирошников А.И., Габибов А.Г., Воробьев И.И., Костро-мина Т.И., Пономаренко H.A., Бобик Т.В., Ажигирова М.А., Карякин A.B., Коротаев Г.К. Патент RU 2337966 С2 Российская Федерация, 07.08.2006.

5. Бобик Т.В., Пономаренко H.A., Мирошников. Получение рекомбинант-ного человеческого сывороточного альбумина в эукариотической системе. Доклад. XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 7-10 февраля (2006), Москва, Российская Федерация. Сборник тезисов, с. 23.

Заказ № 147/03/09 Подписано в печать 24.03.2009 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,25

^Vn ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 iC^Vj www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Бобик, Татьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Синтез и структура человеческого сывороточного альбумина.

Свойства и функции ЧСА.

Связывание лигандов.ю

Антгюксидантные свойства ЧСА.

Энзгтатические свойства ЧСА.

Области и стратегии применения препарата ЧСА.

Получение рекомбинантного ЧСА в различных системах экспрессии.

ЭкспрессиярЧСА в прокариотических системах Escherichia coli и Bacillus subtilis.

Экспрессия рЧСА в дрожэ/сах Saccharomyces cerevisiae.

Экспрессия рЧСА в дрожэ/сах Kluyveromyces lactis.

Экспрессия рЧСА в метилотрофных дролслсах Hansenula polymorpha (Pichia angusta).

Система экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах Pichia pastor is.

Преимущества системы экспрессии P. pastoris.

Генетические основы экспрессии белков дрожэ/сами P. pastoris.

Экспрессия рекомбинантного ЧСА в дрожэ/сах P. pastoris.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Создание экспрессионного штамма GS115/ЧСА.

Подбор оптимальных условий аналитической экспрессии.

Оптимизация экспрессии целевого белка в условиях культивирования в ферментере.;.

Создание экспрессионного штамма GS115/ЧСА2.

Очистка рЧСА из культуральной среды.

Структурно-функциональные исследования рЧСА.

Исследования биологической активности препарата рЧСА.

ВЫВОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Химические реактивы и сопутствующие материалы.

Методы работы с бактериями Esherichia coli.

Методы работы с дрожжами Pichia pastoris.

Работа с нуклеиновыми кислотами.

Хроматографические процедуры.

Работа с белками.

Масс-спектрометрический анализ.юз

Эксперименты с участием лабораторных животных.Ю

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Бобик, Татьяна Владимировна, Москва

1. Peters T., J., All about Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. 1996, San Diego: Academic Press.

2. Sjoholm, I. and I. Ljungstedt, Studies on the tiyptophan and drug-binding properties of human serum albumin fragments by affinity chromatography and circular dichroism measurements. J Biol Chem, 1973. 248(24): p. 843441.

3. Peters T., J., Serum albumin. In Advances in Protein Chemistry., ed. J.T.E. C. B. Anfinsen, F. Richards. 1985, New York: Academic Press.

4. Eckenhoff, R.G., et al., Inhaled anesthetic binding sites in human serum albumin. J Biol Chem, 2000. 275(39): p. 30439-44.

5. Droge, W., Aging-related changes in the thiol/disidfide redox state: implications for the use of thiol antioxidants. Exp Gerontol, 2002. 37(12): p. 1333-45.

6. Nicholson, J.P., M.R. Wolmarans, and G.R. Park, The role of albumin in critical illness. Br J Anaesth, 2000. 85(4): p. 599-610.

7. Beeken, W.L., et al., Studies of I-131-albumin catabolism and distribution in normal young male adults. J Clin Invest, 1962. 41: p. 1312-33.

8. Peters, T., Jr., Intracellular precursor forms of plasma proteins: their functions and possible occurrence in plasma. Clin Chem, 1987. 33(8): p. 1317-25.

9. Judah, J.D. and P.S. Quinn, Calcium ion-dependent vesicle fusion in the conversion ofproalbumin to albumin. Nature, 1978. 271(5643): p. 384-5.

10. Hawkins, J.W. and A. Dugaiczyk, The human serum albumin gene: structure of a unique locus. Gene, 1982. 19(1): p. 55-8.

11. Minghetti, P.P., et al., Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within qll-22 of chromosome 4. J Biol Chem, 1986. 261(15): p. 6747-57.

12. Schell, L.M., et al., Distribution of albumin variants Naskapi amd Mexico among Aleuts, Frobisher Bay Eskimos, and Micmac, Naskapi, Mohawk, Omaha, and Apache Indians. Am J Phys Anthropol, 1978. 49(1): p. 111-7.

13. Arai, K., et al., Point substitutions in albumin genetic variants from Asia. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(1): p. 497-501.

14. Galliano, M., et al., Structural characterization of a chain termination mutant of human serum albumin. J Biol Chem, 1986. 261(9): p. 4283-7.

15. Minchiotti, L., et al., The molecidar defect in a COOH-terminal-modified and shortened mutant of human serum albumin. J Biol Chem, 1989. 264(6): p. 3385-9.

16. Brennan, S.O. and R.W. Carrell, A circulating variant of human proalbumin. Nature, 1978. 274(5674): p. 908-9.

17. Takahashi, N., et al., Amino acid substitutions in genetic variants of human serum albumin and in sequences inferred from molecular cloning. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(13): p. 4413-7.

18. Galliano, M., et al., A new proalbumin variant: albumin Jaffna (-1 Arg— Leu). FEBS Lett, 1989. 255(2): p. 295-9.

19. Abdo, Y., J. Rousseaux, and M. Dautrevaux, Proalbumin Lille, a new variant of human serum albumin. FEBS Lett, 1981. 131(2): p. 286-8.

20. Brennan, S.O., Propeptide cleavage: evidence from human proalbumins. Mol Biol Med, 1989. 6(1): p. 87-92.

21. Brennan, S.O., et al., Albumin Redhill (-1 Arg, 320 Ala—Thr): a glycoprotein variant of human serum albumin whose precursor has an aberrant signal peptidase cleavage site. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(1): p. 26-30.

22. Weil, M.H., R.J. Henning, and V.K. Puri, Colloid oncotic pressure: clinical significance. Crit Care Med, 1979. 7(3): p. 113-6.

23. Воробьев, А.И., Проблемы гематол. и перелив, крови., 1999(2): р. 5.

24. Городецкий, В.М., Гематол. и трансфузиол. , 1994(3): р. 25.

25. Sudlow, G., D.J. Birkett, and D.N. Wade, The characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin. Mol Pharmacol, 1975. 11(6): p. 824-32.

26. Yamasaki, K., et al., Characterization of site I on human serum albumin: concept about the sti-ucture of a drug binding site. Biochim Biophys Acta, 1996.1295(2): p. 147-57.

27. Kragh-Hansen, U., Octanoate binding to the indole- and benzodiazepine-binding region of human serum albumin. Biochem J, 1991. 273 ( Pt 3): p. 641-4.

28. Kragh-Hansen, U., Evidence for a large and flexible region of human serum albumin possessing high affinity binding sites for salicylate, warfarin, and other ligands. Mol Pharmacol, 1988. 34(2): p. 160-71.

29. Rahman, M.H., et al., Characterization of high affinity binding sites of nonsteroidal anti-inflammatoiy drugs with respect to site-specific probes on human serum albumin. Biol Pharm Bull, 1993. 16(11): p. 1169-74.

30. Meisner, H. and K. Neet, Competitive binding of long-chain free fatty acids, octanoate, arid chlorophenoxyisobutyrate to albumin. Mol Pharmacol, 1978. 14(2): p. 337-46.

31. Kragh-Hansen, U., Molecular aspects of ligand binding to serum albumin. Pharmacol Rev, 1981. 33(1): p. 17-53.

32. Montero, M.T., et al., On the binding of cinmetacin and indomethacin to human serum albumin. J Pharm Pharmacol, 1986. 38(12): p. 925-7.

33. Otagiri, M., et al., Binding of pirprofen to human serum albumin studied by dialysis and spectroscopy techniques. Biochem Pharmacol, 1989. 38(1): p. 17.

34. Valiner, J.J., Binding of drugs by albumin and plasma protein. J Pharm Sei, 1977. 66(4): p. 447-65.

35. Bischer, A., et al., Stereoselective binding properties of naproxen glucuronide diastereomers to proteins. J Pharmacokinet Biopharm, 1995. 23(4): p. 37995.

36. Bertucci, C., et al., Chemical modification of human albumin at cys34 by ethacrynic acid: structural characterisation and binding properties. J Pharm Biomed Anal, 1998.18(1-2): p. 127-36.

37. Otagiri, M., et al., Characterization of binding sites for sidfadimethoxine and its major metabolite, N4-acetylsulfadimethoxine, on human and rabbit serum albumin. Chem Pharm Bull (Tokyo), 1989. 37(2): p. 498-501.

38. Yamasaki, K., et al., Circular dichroism simidation shows a site-II-to-site-I displacement of human serum albumin-bound diclofenac by Ibuprofen. AAPS PharmSciTech, 2000.1(2): p. E12.

39. Takamura, N., et al., Interaction of benzothiadiazides with human serum albumin studied by dialysis and spectroscopic methods. Pharm Res, 1994. 11(10): p. 1452-7.

40. Takamura, N., et al., Mode of interaction of loop diuretics with human serum albumin and characterization of binding site. Pharm Res, 1996. 13(7): p. 1015-9.

41. Mignot, I., et al., Albumin binding sites for etodolac enantiomers. Chirality, 1996. 8(3): p. 271-80.

42. Boulton, D.W., U.K. Walle, and T. Walle, Extensive binding of the bioflavonoid quercetin to human plasma proteins. J Pharm Pharmacol, 1998. 50(2): p. 243-9.

43. Rahman, M.H., et al., Study of interaction of carprofen and its enantiomers with human serum albumin—II. Stereoselective site-to-site displacement of carprofen by Ibuprofen. Biochem Pharmacol, 1993. 46(10): p. 1733-40.

44. Bree, F., et al., Nimesulide binding to components within blood. Drugs, 1993. 46 Suppl 1: p. 83-90.

45. Sueyasu, M., et al., Protein binding and the metabolism of thiamylal enantiomers in vitro. Anesth Analg, 2000. 91(3): p. 736-40.

46. Sugio, S., et al., Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution. Protein Eng, 1999. 12(6): p. 439-46.

47. He, X.M. and D.C. Carter, Atomic structure and chemistiy of human serum albumin. Nature, 1992. 358(6383): p. 209-15.

48. Petitpas, I., et al., Crystal structure analysis of warfarin binding to human serum albumin: anatomy of drug site I. J Biol Chem, 2001. 276(25): p. 22804-9.4950,5152,53,54.55,56