Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА
ГУДКОВ ДЕНИС АНДРЕЕВИЧ
ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ БЕЛКОВ С АКТИВНОСТЬЮ ОРГАНОФОСФАТГИДРОЛАЗЫ
03.00.23 - биотехнология 02.00.15 - катализ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Химический факультет
Москва - 2009
003467019
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова
Научные руководители:
член-корреспондент РАН, профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич
кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник Ефременко Елена Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович
доктор химических наук, профессор Кильдеева Наталья Рустемовна
Ведущая организация:
Федеральное государственное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт министерства обороны Российской Федерации» (ФГУ 48 ЦНИИ МО РФ), г. Киров.
Защита состоится « ^^ » апреля 2009 года в 16°° час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан « » марта 2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В современном мире большое распространение получили фосфорорганические соединения (ФОС), к числу которых относятся широко применяемые в сельском хозяйстве пестициды.
Помимо пестицидов к ФОС относятся и фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) - зарин, зоман, Vx, суммарные запасы которых на территории РФ достигают 32,3 тыс. т. Согласно Международным обязательствам России данные вещества должны быть полностью уничтожены к 2012 г.
При уничтожении ФОВ по методу гидролизной детоксикации (ГД), принятому к применению в РФ, получаются, так называемые, реакционные массы (РМ-ГД), остаточные концентрации ФОВ в которых достигают 1 г/л. Поскольку ФОВ обладают крайне высокой токсичностью, очевидно, что РМ-ГД нуждаются в дополнительной обработке. Ожидается, что в результате уничтожения ФОВ объем РМ-ГД будет увеличиваться к 2012 г и может достигнуть 100 тыс. т. Очевидно, что должен быть разработан эффективный и экологичный способ их детоксикации.
Задачи обнаружения и разложения ФОС можно решить с помощью биологических катализаторов, в частности, ферментов. Фермент органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующий гидролиз Р-О, P-S и P-F связей в производных фосфорной и фосфоновой кислот и обладающий широкой субстратной специфичностью, а также высокими константами эффективности действия, может быть использован для решения разного рода задач.
Ранее на Химическом факультете МГУ имени М. В. Ломоносова была создана новая высокоэффективная система для синтеза ОРН в клетках Е. coli, изучены свойства полученного фермента (Ефременко Е., 2005; Вотчицева Ю., 2006). Также были созданы генетические конструкции, кодирующие синтез рекомбинантных ферментов, содержащих гексагистидиновые последовательности на N-конце (His6-OPH) и С-конце молекулы ОРН (Гудков Д., 2006). Наличие таких последовательностей на N- или С-конце молекулы белка позволило не только упростить процедуру его выделения и очистки с использованием металл-хелатирующих хроматографических носителей, но и улучшило константы эффективности действия фермента по ряду субстратов (пестицидов и ФОВ) в сравнении с ОРН. Так в реакции гидролиза Vx каталитическая эффективность действия фермента His6-OPH увеличилась в 2 раза, а в реакции гидролиза зарина - в 10 раз. Эти характеристики фермента HiSö-OPH позволили считать целесообразным его использование для гидролиза остаточных концентраций ФОВ в составе РМ-ГД. Применение His6-OPH в системах обнаружения и разложения ФОС должно быть обеспечено возможностью его получения в необходимых количествах в растворимой активной форме.
Для получения высокого выхода растворимой активной формы белка могут быть использованы различные приемы. Во-первых, возможна реализация подхода, основанного на получении растворимой формы фермента в составе гибридных белков. В этом случае гибридный партнер, белок, связанный с целевым белком спейсером из нескольких аминокислотных остатков, локализованный на N-конце целевого белка, синтезируется раньше него, проходит процедуру фолдинга и удерживает целевой белок в растворенном состоянии. В последнее время в качестве гибридного партнера, позволяющего увеличить выход растворимой формы целевого белка, приобрел популярность зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), который позволяет придать целевым белкам дополнительные (флуоресцентные) свойства. В данной работе в качестве гибридного партнера ОРН был использован флуоресцентный белок deGFP4 - аналог GFP, обратимо изменяющий флуоресцентные свойства в зависимости от изменения рН среды. deGFP4 интересно было использовать в качестве партнера ОРН по гибридному белку, поскольку в процессе ферментативного гидролиза ФОС рН реакционной среды меняется из-за образования кислых продуктов. Таким образом, помимо увеличения выхода растворимой формы фермента, целью создания таких гибридных белков было объединение в их составе функций органофосфатгидролазы и «свидетеля» процесса гидролиза ФОС под действием ОРН.
Во-вторых, применение процедуры рефолдинга фермента из телец включения (ТВ) параллельно с выделением активной растворимой формы белка позволяет увеличить суммарный выход целевого продукта в активной форме из биомассы клеток. Следует отметить, что ранее рефолдинг белков His6-OPH и ОРН никем не проводился, тогда как существующие системы их синтеза на основе клеток Е. coli обеспечивают до 50% выхода этих ферментов в виде ТВ.
В-третьих, применение биотехнологической оптимизации условий культивирования штамма-продуцента может привести к снижению агрегации белка внутри клеток и увеличению выхода растворимой формы фермента.
Целью данной работы являлось получение фермента His6-OPH в растворимой активной форме с использованием различных подходов, а именно, генно-инженерного (создание гибридных белков), биохимического (проведение рефолдинга из телец включения) и биотехнологического (оптимизация условий культивирования штамма-продуцента His6-OPH), для практического применения в системе разложения ФОС.
Для достижения основной цели в работе необходимо было решить ряд основных задач:
- разработать генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков, состоящих из молекул deGFP4 и ОРН, соединенных аминокислотными последовательностями (спейсерами) различного состава, для увеличения выхода растворимой активной формы ОРН в клетках Е. coli;
оптимизировать условия синтеза генетически модифицированных аналогов ОРН (гибридных белков и белка Шз6-ОРН) в клетках Е. соИ для получения максимально высоких выходов белков в растворимой форме, выделить полученные гибридные белки и исследовать их свойства;
- осуществить рефолдинг фермента Швб-ОРН из ТВ с использованием макропористых металл-хелатирующих носителей на основе криогеля полиакриламида (крио-ПААГ);
- разработать защитные самодегазирующиеся материалы длительного действия на основе препарата фермента ШБб-ОРН и показать возможность применения фермента Н156-ОРН для детоксикации остаточных количеств вещества Ух в составе РМ-ГД, полученных после химического уничтожения ФОВ.
Научная новизна работы. Разработаны новые генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков, обладающих свойствами ОРН и флуоресцентными характеристиками белка с!еСРР4, Н1з6-с1еСРР4-(11А)5-ОРН и Изб-с1еОРР4-(А8)5-ОРН. Установлено влияние различных параметров культивирования клеток-продуцентов этих белков на их выход в растворимой активной форме. Показано, что наличие гибридного партнера, такого как (1еОРР4, оказывает влияние на параметры биосинтеза гибридных белков (длительность и уровни синтеза белков).
Установлено, что ОРН в составе гибридных белков обладает характеристиками, отличными от таких характеристик нативного фермента, как рН-оптимум, термостабильность, субстратная специфичность и каталитическая эффективность действия. Показано, что флуоресценция белка с!еОРР4, находящегося в составе гибридных белков, как и у индивидуального белка с!еСРР4, зависит от рН среды, причем вид ее зависимости соответствует установленной для индивидуального белка. Установлено, что свойства гибридных белков зависят от аминокислотного состава спейсеров, соединяющих молекулы белков-партнеров с!еСРР4 и ОРН в химерной структуре.
Впервые было проведено моделирование структуры димера ОРН методами молекулярного моделирования. Сравнительный анализ конформаций активных центров ОРН, полученных в результате компьютерной оптимизации молекулы фермента в составе димера и мономера, показал, что в состоянии мономера активный центр и центр связывания субстрата ОРН изменяются таким образом, что специфичность действия фермента увеличивается в пользу субстратов с более объемными заместителями у фосфорного центра. Расчеты энтальпии димеризации полученных в работе гибридных белков (ДН°06Р.), проведенные в вакууме, показали, что образование димеров данных белков невозможно.
Впервые была показана принципиальная возможность проведения рефолдинга фермента №з6-ОРН из ТВ. Впервые для проведения рефолдинга
Hise-белка использовались макропористые металл-хелатирующие носители, полученные на основе крио-ПААГ. Суммарный выход растворимой формы фермента His6-OPH из клеток, содержащих растворимую форму и ТВ, был увеличен до 60%.
Впервые показана эффективность применения режима культивирования штамма-продуцента фермента HÍS6-OPH на богатой питательной среде с дробным введением субстратных подпиток и индуктора синтеза белка в среду культивирования для получения высоких выходов растворимой активной формы фермента.
Практическая значимость работы. Установлены условия культивирования штаммов-продуцентов новых гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH, обеспечивающие увеличение выхода растворимой формы гибридных белков в клетках на 50% по сравнению с выходом растворимой активной формы фермента His6-OPH. При данных условиях выход растворимой активной формы белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH оказался выше описанного в литературе (Cha Н., 2000) выхода активной формы похожего гибридного белка в клетках Е. coli более, чем в 25 раз.
Моделирование структуры ОРН позволило сделать предположение о том, что стабильность фермента при нейтральных значениях pH выше, чем при щелочных значениях, что было подтверждено экспериментально при исследовании условий хранения фермента His6-OPH и термоинактивации гибридных белков.
Показано, что разработанные гибридные белки могут одновременно катализировать гидролиз ФОС и выполнять роль свидетелей этого процесса за счет pH-чувствительной флуоресценции, которой они обладают.
Установлены условия для эффективного рефолдинга His6-OPH из ТВ, при которых выход белка His6-OPH из ТВ составил 20%.
Изучено влияние различных факторов (концентрация и стадия роста клеток, во время которой осуществлялось внесение индуктора в среду культивирования; температура; режим культивирования) на биотехнологические параметры культивирования штамма-продуцента His6-OPH (удельная скорость роста клеток (ji), максимальный выход биомассы клеток и общая органофосфатгидролазная активность, получаемая с 1 л среды), а также установлены условия получения максимального выхода растворимой активной формы белка. Впервые реализованное в работе культивирование клеток, синтезирующих данный фермент, методом дробного введения субстрата и индуктора в среду культивирования позволило увеличить выход растворимой активной формы His6-OPH в 10 раз, по сравнению с ранее известным уровнем (Вотчицева Ю.А., 2006).
По разработанной методике биотехнологического получения His6-OPH в клетках Е. coli был наработан высокоактивный препарат фермента (20 л), который впервые был использован для разработки самодегазирующегося
защитного материала от токсичного действия ФОВ. Разработанный защитный материал превосходит по длительности своего действия принятые к применению аналоги более, чем в 4 раза, и гарантирует отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала на протяжении не менее 96 ч. Кроме того, препарат His6-OPH был впервые успешно использован для проведения гидролиза остаточных количеств ФОВ в составе РМ-ГД, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx гидролизным методом в РФ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Intern. Symposium on Biomolecular Chemistry - ISBOC-7, University of Sheffield (UK, 2004); Международной конференции "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, Россия, 2005); VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Перьмь-Казань-Пермь, Россия, 2005); International Conference "Environmental Biocatalysis: From remediation with enzymes to novel green processes" (Córdoba, Spain, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино, Россия,
2006); International Workshop "New technologies in medicine and experimental biology" (Pattaya - Bangkok, Thailand, 2007); Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007); Международной конференции «Биокатализ -2007: структура, функции, применение» (Москва - Санкт-Петербург, Россия,
2007); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, Россия, 2007); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия,
2008); 9-й, 10-й, 12-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология. Наука XXI века» (Пущино, Россия, 2005, 2006, 2008).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей, 1 патент РФ, 1 заявка на получение патента РФ и 13 тезисов докладов на международных конференциях, конгрессах и симпозиумах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 160 страниц печатного текста, 49 рисунков, 17 таблиц, 227 ссылок.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экспериментальная часть
Объекты исследования. В работе использовались следующие штаммы бактерий Е. coli: XLl-blue, DH5a, SG13009[pREP4], культивирование которых проводили на богатых питательных средах, содержащих дрожжевой экстракт, бактотриптон (Difco, США) и хлорид натрия (Химмед, Россия).
Методы исследования. Все генно-инженерные манипуляции проводили согласно рекомендациям Маниатис и др. (1984) и Гловер (1988). Олигонуклеотиды были синтезированы фосфитамидным методом на приборе Applied Biosystems DNA Synthesizer (США). Выделение плазмидных ДНК проводили с использованием специального набора для выделения ДНК «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, Латвия), согласно инструкции, прилагающейся к набору.
Очистку белка His6-deGFP4-(AS)5-OPH, синтезированного в клетках Е. coli, проводили по стандартной методике, включающей ультразвуковую дезинтеграцию клеток (BraunSonic, Германия), осаждение балластных белков сульфатом аммония (45% от насыщения), диализ, катионобменную хроматографию на носителе SP-сефароза (Pharmacia, Швеция), анионообменную хроматографию на носителе ДЕАЕ-сефароза (Pharmacia, Швеция).
Очистку белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-OPH проводили с использованием металл-хелатирующих макропористых носителей, полученных при низкотемпературном режиме полимеризации акриламидных гелей (крио-ПААГ), модифицированных иминодиуксусной кислотой (IDA) и заряженных ионами Со2+ (Protista, Швеция). Методика выделения включала ультразвуковую дезинтеграцию клеток, отделение осадка клеточного дебриса центрифугированием (Beckman, США), нанесение супернатанта на хроматографический носитель, отмывку и элюирование белка в градиенте имидазола (Efremenko Е. N., 2006).
Органофосфатгидролазную активность белков определяли спектрофотометрически (Agilent UV-853, Германия) по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (е=18000 моль'см"1, рН 10,5, X = 405 нм). Для определения ОРН-активности белков использовали 0,1 М буферы: фосфатный (рН 7,0 - 8,0; 11,0 - 12,0), CHES (2-[Ы-циклогексиламино]этансульфоновая кислота, рКа 9,3) (рН 8,5 - 10,0), карбонатный (рН 10,0 - 11,0). В качестве запасного раствора субстрата использовали 10 мМ водный раствор параоксона. За единицу ферментативной активности принимали концентрацию фермента, осуществляющую гидролиз 1 мкмоля субстрата в минуту при 25°С. При изучении рН оптимума действия гибридных белков определяли их ОРН-активность в 0,1 М буферах с перекрывающимися значениями рН. При исследовании термостабильности образец гибридного белка в 0,1 М буфере с рН 7,5 или 10,5 (0,5 мл) помещали в термостат при различных температурах и через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 10 мкл и определяли в них ОРН-активность. Определение флуоресценции гибридных белков проводили на микроскопе Биомед-бЛ (Россия) и спектрофлуориметре Shimadzu (Япония).
Солюбилизацию ТВ, содержащих фермент Hise-OPH, проводили в растворах мочевины (Химмед, Россия) (0-8 М) в 0,05 М фосфатном буфере (рН
7,5), содержащем 0,3 М NaCl при 30° или 37°С в течение различного времени (от 2 до 36 ч). Рефолдинг His6-OPH из ТВ проводили с использованием хроматографического носителя Co2+-IDA -крио-ПААГ.
Моделирование структур ОРН проводили с использованием пакета программ GROMACS 3.2.1 и силового поля OPLS-AA.
Защитный материал формировали из нескольких слоев, выполняющих различные функции. Испытания материала проводили в 27 НЦ МО РФ (Москва). Анализ концентрации Vx проводили методом Элмана.
Ферментативную обработку реакционных масс (РМ-ГД), полученных в результате гидролизной детоксикации вещества типа Vx, проводили на пилотной установке, разработанной при участии ИБХФ РАН и Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, установленной на территории ГосНИИОХТ (Москва). Концентрацию ФОВ измеряли при помощи газового хроматографа HP 5890 II Series с масс-селективным детектором HP 5972 А MSD с энергией ионизации 70 эВ.
Результаты и их обсуждение 1. Реализация генно-инженерного подхода к получению растворимой формы белка
1.1. Разработка и экспрессия в клетках Е. coli генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков, содержащих молекулу белка deGFP4 в качестве гибрндного партнера ОРН
В качестве экспрессионного вектора была использована ранее разработанная плазмида pTES-His6-OPH (Патент РФ № 2255975,2005), в состав которой генно-инженерными методами были введены нуклеотидные последовательности, кодирующие синтез белка deGFP4 и различных по составу межбелковых спейсеров (-(ArgAla)5- [ -(RA)5- ] или -(AlaSer)5- [-(AS)5-]).
Для исследования уровней экспрессии полученных генетических конструкций pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH (I) и pTES-His6-deGFP4-(AS)s-OPH (II) были использованы клетки Е. coli DH5a. Было установлено, что увеличение концентрации индуктора изопропил-Р-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в среде культивирования проводит к увеличению доли гибридных белков в общем количестве синтезируемых внутриклеточных белков (рис. 1). Однако, параллельно с этим наблюдалось снижение содержания в клетках растворимой формы данных белков. Максимальная внутриклеточная ОРН-активность накапливалась к 10-му ч роста клеток. Таким образом, оптимальные условия максимального выхода активной формы гибридных белков были следующими: 28°С, 0,1 мМ ИПТГ, 10 ч роста после индукции.
При данных условиях культивирования выход растворимой формы гибридного белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH был в ~2 раза выше выхода исходного белка His6-OPH (табл. 1). Таким образом, цель, поставленная в данной работе (увеличение выхода растворимой формы), была достигнута.
0,10 0,25 0,50 0,75 ИПТГ, мМ
75
о о
Œ V « 10
2 к 50
о sl
Ml Z+-
я IQ CL 5
25
0,10 0,25 0,50 0,75 ИПТГ, мМ
Рис. I. Уровень синтеза гибридных белков Hist,-deGFP4-(RA)i-OPH и Hisr-.-deüFPi-fAS)^-ОРН в клетках Е. coli DH5ct, достигаемый к Ю-му часу роста клеток при различных концентрациях ИПТГ в среде культивирования (2£"С).
Таблица 1. Оптимальные условия для накопления органофосфатгидролазмой активности в клетках Е.соИ, трансформированных плазмидами рТЕЗ-Швбчк'ЖЧ^ЕА^-ОРН, рТЕЗ-ЬПг,,-аеСРР4-(Л8)з-ОР1Г и рТЕЯ-Нк(,-ОРН.
Параметры His6-dcGFP4-(RA)j-OPH His6-deCFP4-(AS)ç-OPH Hiss-OPH Hist-GFP-EK-OPH*
Конечная концентрация ИПТГ, мМ 0,1 0,05 0,20 0,75
Максимальная удельная активность, сд/г клеток 76 101 62 100
Доля, % от суммарного клеточного белка 5,5 2,1 12,6 0,4
Содержание растворимой формы, % от общего количества целевого белка 92 22 50 46
*H. Cha, Ch.-F, Wu, j. Valdcs, G. Rao, W, Bentley. Observations of green fluorescent protein as a fusion partner in genetically engineered Escherichia çoti: monitoring protein expression and solubility. Biolechnol. Bioeng., 2000, V. 67(5), p. 565-574.
Следует отметить, что доля белка Н15б-с1еОРР4-(КА);;-ОРН (5,5%) в общем количестве внутриклеточных белков, оказалась в -13 раз больше данного показателя, характерного для гибридного аналога ОРН, описанного в литературе (0,4%) (табл. 1). С учетом того, что выход растворимой формы разработанного гибридного белка (92%) был выше выхода растворимой формы известного из литературы белка Н]5б-СРР-А$р4-Ьу5-ОРН в 2 раза, общий выход растворимой формы созданного гибридного белка в -25 раз превысил выход ранее известного гибридного белка.
Полученные гибридные белки были выделены и очищены до гомогенного состояния. При проведении нативного электрофореза очищенного препарата белка Н15,;,-с]еСРР4-(РЛ)5-ОРН было показано, что 85% гибридного белка находится в мономерном состоянии и лишь 15% в димерном (рис.2).
При исследовании каталитических характеристик полученных гибридных белков было установлено, что оптимумы их ОРН-активности очень близки к оптимуму действии ОРН (рис. 3).
130 — тШ1 72 ма
55 -
кДа
М 1
Р не. 2. Эле ктроф ореграмма, отражающая белковый состав о ч ншенного препарата белка Н|8г,-йеОЙ?4-(ЕАИ5РН (I) а
неденатурврующих условиях, М -маркеры молекулярного веса.
рН
Рис. 3. рН-зависимость реакции гидролиза параоксона, катализируемой ферментами Шз<-<1еСРР4-{КА)5-ОРН —, Н]5,-,ч1еПРР4-(А8)5-ОРН —•—, ОРН —А—.
При исследовании флуоресцентных свойств гибридного белка Шз6-с!еСРР4-(Р1А)5-ОРН было показано, что белок с)еОРР4, присутствующий в его составе, имеет максимум поглощения при длине волны 1=400 нм и два максимума флуоресценции при длинах волн 1=461 нм и 1=515 нм, что соответствует характеристикам свободного белка (ЗеСРР4. При исследовании влияния рН среды на интенсивность флуоресценции гибридного белка было показано (рис, 4), что максимум флуоресценции при длине волны 1=515 нм находится при рН 8,5, что всего на 0,5 ед. ниже, чем характерно для индивидуального белка с1еОРР4.
Было показано, что в процессе гидролиза 4,0-Ю"5 М параоксона гибридным белком Н1зс,-с)еСРР4-(ЯА),-ОРН в 1 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) с добавлением 100 мМ МаС! происходит снижение рН раствора на -0,2 ед. Кроме того, было показано, что гидролиз данной концентрации параоксона приводит к хорошо регистрируемому изменению интенсивности флуоресценции белка при длине волны эмиссии 1=515 нм на ~ 15%.
Таким образом, белковая молекула (1еСРР4 может быть внутренним «свидетелем» гидролиза ФОС под действием молекулы ОРН. Полученная в данной работе растворимая форма Н136-йеСРР4-(КА)5-ОРН может быть
предложена для использования при проведении исследований по гидролизу ФОС ш vivo на культурах тканей (Tuovinen К. et all, 1996).
100 80
^ 60 &
20
0j-,-,-,---,---,---,---,
6 7 8 9 10 11
рН
Рис. 4. рН-зависимость интенсивности флуоресценции белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH — ▲— и deGFP4 —О— при длинах волн возбуждения Х=400 нм и эмиссии Х=515 нм.
Было проведено определение кинетических параметров реакции ферментативного гидролиза пестицида параоксона, катализируемого гибридными белками His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH, при значениях рН реакционной среды, соответствующих оптимумам их ОРН-активности (табл. 2). Для гибридных белков наблюдалось увеличение констант Михаэлиса (Кт) в 8 - 12
раз по сравнению со значением Кт, характерным для ОРН, что свидететельствовало о значительном снижении сродства ферментов к параоксону, по-видимому, вызванном конформационными изменениями в субстрат-связывающем центре ОРН-субъединицы гибридного белка. Снижение значений Vmax в 1,5-3 раза, в свою очередь, свидетельствовало об изменениях в каталитическом центре ОРН-субъединицы гибридного белка.
Таблица 2. Свойства гибридных белков и ОРН в реакции гидролиза параоксона при рН 10,5.
Каталитические His6-deGFP4- HisÉ-deGFP4-
параметры (RA)s-OPH (AS)s-OPH
К„„ мМ 0,13 0,20 0,02
Утях, М-С"1 2,5-10'' 5,6-Ю"7 8,5-10''
Снижение эффективности действия гибридных белков по отношению к такому субстрату как параоксон, очевидно, было связано с изменением пространственной конфигурации белковой глобулы ОРН, вызванным взаимным влиянием партнеров друг на друга в составе гибридного белка.
Для гибридного белка №зб^еОРР4-(]1А)5-ОРН были определены константы его инактивации при различных температурах (рис. 5, табл. 3) и
/
зависимость его остаточной каталитической активности от температуры его экспонирования в течение 15 мин (рис. 6).
0,0 -0,5
> -1,0
: -1,5 -2,0
25°С
36°С
55 С
\ 60иС
10 15 20 25 30 35
Время, мин
100 80 0х 60 40
£
20 0
20 30 40 50 60
Температура, °С
70
Рис. 5. Кинетика температурной инактивации белка Н1эб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН при 35° (--•-), 55° (-А-) и 60°С (-▼-) в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,5) в полулогарифмических координатах, где у0 -скорость реакции в начальный момент времени, V - скорость реакции в момент времени I. Сбелка= 0,5 мг/мл.
Рис. 6. Остаточная активность белков ОРН в 0,1М Тиб-НО буфере с рН 8,5 с!еОРР4-(КА)5-ОРН в 0ДМ карбонатном буфере с рН 10,5 (•) и в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,5) (■), после их экспонирования при различных температурах в течение 15 мин.
Таблица 3. Константы термоинактивации белка Ш56-с1еОРР4-(ЯА)5-ОРН в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,5).
Температура, иС к с"1 Л1111. } **
25 2,27-10"5
36 8,9-Ю"5
55 4,8-Ю"4
60 3,3-Ю--1
При увеличении температуры в интервале 40° - 52°С при рН 10,5 происходило резкое падение ОРН-активности исследуемого гибридного белка, и при 50°С его активность составляла менее 20% от исходной (рис. 6). При данном значении рН раствора термостабильность гибридного аналога ОРН оказалась ниже, чем термостабильность нативного фермента. Однако, при снижении рН буфера до 7,5 при 50°С гибридный белок сохранял 70% исходной ОРН-активности. Таким образом, при нейтральных значениях рН раствора гибридный белок может быть успешно использован для гидролиза ФОС при повышенной температуре.
Линейный характер кинетики инактивации белка Н156-с1еОРР4-(11А)5-ОРН при рН 7,5 и различных температурах (рис. 5) наблюдался в интервале концентраций белка 0,1 - 1 мг/мл и свидетельствовал об отсутствии изменений в структуре молекулы белка, вызванных образованием или диссоциацией олигомерных структур. Это подтверждалось и формой зависимости остаточной
активности гибридного белка от температуры при рН 7,5 (рис. 6). Такие зависимости характерны для мономерных белков или белков, образующих стабильные олигомеры, не диссициирующие даже при повышенных температурах. Поскольку нативная ОРН образует чрезвычайно стабильный гомодимер (АС°обР ~ 40 ккал/моль), нельзя было исключить такую возможность и в случае гибридного белка. Кроме того, при рН 10,5 в интервале температур 20° - 37°С происходила активация ферментного препарата, связанная с диссоциацией олигомерных форм гибридного белка, образование которых могло происходить не только за счет димеризации ОРН-субъединиц, но и посредством взаимодействия между собой молекул гибридного партнера ОРН, с!еСРР4, (вИР, как известно, может образовывать олигомеры) или межбелковых спейсеров.
Для выявления особенностей строения гибридных белков было проведено моделирование их структуры методами молекулярной динамики.
1.2. Исследование структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования
Предполагалось проведение моделирования в несколько этапов (рис. 7). Первоначально требовалась релаксация димера ОРН, взятого из банка данных белковых структур, в водной ячейке (стадия №1), выделение из его состава мономера ОРН, проведение моделирования его структуры (стадия №2). Далее к полученной оптимизированной структуре мономера ОРН планировали добавить необходимые элементы, присутствующие в составе гибридных белков: гексагистидиновую последовательность, белок с1еОРР4, спейсер (-(11А)5- или -(АБ)5-), а затем провести моделирование полученных молекул белков в составе мономера (стадия №3) и димера (стадия №4) по ОРН и сравнить модели, полученные в результате оптимизации структур ОРН в составе димера, мономера и гибридных белков между собой.
Активный центр (АЦ) ОРН представляет собой сложный комплекс, состоящий из двух ионов металла (Ме), несущих эффективный заряд +2,0 или +1,5, соединенных мостиковым лигандом гидроксид-ионом (рис. 8). Кроме того, в зависимости от рН среды возможно протонирование мостикового гидроксид-иона или кислорода аминокислотного остатка Аэрзо]. Все шесть возможных моделей АЦ ОРН, учитывающих различные эффективные заряды ионов Ме (+2,0 и +1,5), тип мостикового лиганда (ОН" или Н20) и возможность протонирования остатка Аэрзоь в составе димера были исследованы в данной работе.
В результате моделирования были выявлены конфигурации димеров ОРН, строение АЦ которых наиболее точно соответствовало рентгено-структурным данным: АЦ-1: ОН", гп*'5+; АЦ-2: Аврз^Н, ОН", 7п2,0+. Помимо этого была отмечена конфигурация АЦ-3: Н20, Хп2,0+, которая отличалась от вышеуказанных конфигураций АЦ увеличенным расстоянием между ионами
Ме (А ~ 1,1 А), связанным с переходом мостиковой молекулы воды в координационную сферу р-иона Ме в оптимизированной структуре. Данные модели были использованы на следующей стадии молекулярно динамического моделирования структуры мономера ОРН (рис. 7).
Рис. 7. Схема плана проведения моделирования структуры ОРН и гибридных белков методами молекулярной динамики.
Нв55
Аф301
.лор — ''Ж«*
.-¿а** 'Ч-'ХА N ин
-О >ог°'ш ^
Т НН НВ201
Рис. 8. Строение активного центра ОРН, образованного при участии ионов Ме2+ а и (3 (о).
Оптимизация структуры мономера ОРН с АЦ-1 привела к разрыву координационных связей ионов Ме с тремя из четырех остатков гистидина (Н1з55, Шэго! и Н1б2зо), с АЦ-2 - к разрыву лишь связи 2па-Н1555. Оптимизированные конфигурации молекулы ОРН с АЦ-3, находящиеся в составе мономера и димера, практически не отличались.
Последнее обстоятельство свидетельствовало о том, что ОРН с таким АЦ, который может существовать при нейтральных или кислых значениях рН, хоть и имеет низкую эффективность действия в отношении ФОС, очевидно, более стабилен. Таким образом, выводы, сделанные при сравнении
экспериментальных данных ло термостабильности гибридного белка при рН 7,5 и 10,5 (рис. 6) подтверждались результатами моделирования.
Пространственная структура молекулы ОРН в мономерном состоянии, полученная в результате проведения молекулярного моделирования, отличалась от оптимизированной структуры белковой глобулы ОРН, находящейся в составе димера. Было показано, что происходит сильное раскрытие гидрофобных карманов, образующих центр связывания субстрата (рис, 9), что, очевидно, отражается на значениях К,„ фермента. Таким образом, молекула ОРН в мономерном состоянии характеризуется сильно искаженной третичной структурой и, как следствие, должна иметь каталитические характеристики, отличные от характерных для димера ОРН.
Рис. 9. Модель (а) и схема (б) связывающего домена ОРН К1, К2 и КЗ - гидрофобные карманы, образованные аминокислотными остатками. К1 - Изз«, Ьеизи, РЬези; и М«ут; К2 - Тгр,31, 11е1(к, Ьеизм, РЬемю Н^я, 01ум; КЗ - Тф|31, РЬеш, Ьеи27[, РНеж> и Тугзм, Светлым тоном (а) или сплошными линиями (б) изображена конфирмация белковой глобулы ОРН, оптимизированной в составе димера, темным тоном (а) или пунктирными линиями (б) - мономера. • - ионы металла в активном центре димера и мономера ОРН. 1, 2 - заместители у фосфорного центра, 3 - уходящая группа.
Моделирование структуры гибридных белков с АЦ-1 - 3 (стадия №3, рис. 7) не выявило различий в конфигурациях молекулы ОРН в составе мономера или гибридного белка. При этом колоссальные положительные значения энтальпии образования димеров [МГобр) гибридных белков (стадия №4, рис. 7), свидетельствовали о невозможности их димеризации по молекуле ОРН. На основании полученных данных (теоретических и экспериментальных) было выдвинуто предположение о мономерном состоянии гибридных белков. В связи с этим, изменение каталитических характеристик гибридных белков по сравнению с нативной ОРН могло быть вызвано невозможностью образования ими димерной формы по молекуле ОРН.
Сильное раскрытие гидрофобных карманов, образующих центр связывания субстрата (рис. 9), у молекулы ОРН, находящейся в мономерном
состоянии, выявленное в результате моделирования ее структуры, а также невозможность димеризации по ОРН-субъединице гибридных белков, позволили предположить повышенное сродство у данных белков к субстратам с более объемными заместителями у фосфорного центра, чем у параоксона, например, к диизопропилфторфосфату (ДФФ). Последующие эксперименты доказали данное предположение. Было показано, что значение Кт белка Н]$6-с1еСРР4-(11А)5-ОРН для ДФФ оказалась ниже в ~2 раза значения Кт, известного для реакции гидролиза ДФФ под действием нативной ОРН, и составило 0,5 мМ. Было установлено, что Утах реакции гидролиза ДФФ гибридным белком снизилось в ~2 раза, по сравнению со значением Упшх реакции гидролиза ДФФ нативной ОРН и составило 10"8М-с"'. Низкое значение Утах может свидетельствовать о протекании каталитического акта гидролиза ДФФ с участием одного иона металла вместо двух.
2. Рефолдинг гексагнстидинсодержащей органофосфатгидролазы
Расчет ЛН"„ар димера белка Н^-ОРН и сравнение полученной величины с характерной для нативной ОРН позволило сделать вывод о возможности проведения рефолдинга данного фермента из ТВ. Следует отметить, что ранее предпринимались попытки осуществить рефолдинг нативной ОРН, но они были безуспешны. Вместе с этим, научный и практический интерес к возможности реализации данного процесса крайне высокий. В связи с этим на данном этапе работы ему было уделено особое внимание.
Согласно литературным данным, на эффективность проведения рефолдинга белков из ТВ оказывают влияние процессы солюбилизации ТВ и, собственно, рефолдинга белка из полученного раствора. Предварительные эксперименты показали, что эффективность растворения ТВ, в основном, зависит от следующих факторов: температура проведения процесса, время экспонирования белка в растворе солюбилизирующего агента, концентрация хаотропного агента.
В данной работе в качестве хаотропного агента использовалась только мочевина, поскольку известно, что использование гуанидиния гидрохлорида для денатурации нативной ОРН приводит к необратимым изменениям во вторичной структуре фермента (Оп!ш1еу I., 1997).
Согласно литературным данным, вторичная структура нативной ОРН в значительной степени зависит от рН раствора. Показано, что рН 7,5 является наиболее благоприятным для формирования ферментом третичной структуры. В данной работе процессы денатурации и рефолдинга проводились при данном значении рН.
При исследовании процесса солюбилизации ТВ первоначально определяли концентрацию мочевины, обеспечивающую максимальный переход белка из осадка ТВ в раствор, процесс проводили при 37°С. Было установлено, что целесообразно использовать концентрацию мочевины 6М, поскольку ее
дальнейшее увеличение не приводит к- увеличению количества белка, переходящего в растворимую форму из осадка ТВ (рис. 10).
Далее было показано, что не только концентрация мочевины, но и температура процесса солюбилизации ТВ влияет на количество белка, переходящего в растворимую форму. При этом оказалось, что экспонирования ТВ в течение 2 ч достаточно для полного их растворения в выбранном объеме солюбилизирующего раствора (рис. ] 1),
1 2 3 4 М кДа 1 2 3 4 5 б 7 М кДа
ПМ ' V 66,2 I ' ' Г " *66'2
45,0
45.0
31,0 -31,0
21,5 — 21,5
* I
14,4 —14,4
Рис. ¡0. Электрофореграмма, отражающая уровень растворения ТВ в зависимости от концентрации мочевины в 0,05 М фосфатно-еолевом буфере с 0,3 М ШС1 (рН 7,4): I - 2М; 2 - 4М; 3 - 6М; 4 - 8М; М - Маркеры молекулярного веса.
Рве 11. Электрофореграмма, отражающая эффективность растворения ТВ в -1а виси мости от используемой концентрации мочевины в 0,05 М фосфатно-со левом буфере с 0,3 М N301 (рН 7,5), температуры и временя инкубирования: 1 - 2М, 30°С, 2 ч; 2 - 2М, 30°С, 14 ч; 3 - 4М, 30"С, 2 ч; 4 -4М, 30['С, 36 ч; 5 - 4М, 37°С, 2 ч; 6 - 6М, 37"С, 2 ч; 7 - 6М, 37°С, 10 ч; М - Маркеры молекулярного веса.
Таким образом, подобранные условия солюбилизации ТВ были следующими: 6 М мочевина, 37°С, время экспонирования 2 ч.
Рефолдинг белка из раствора ТВ в 6М мочевине впервые проводили с использованием металл-хедатирующего носителя, представляющего собой криогель полиакриламида, модифицированный остатками иминодиуксусной кислоты и заряженный ионами Со"1" ('СоаМРА-крио-ПААГ. Рго1пя1е. Швеция), Использование данного носителя было продиктовано большим объемом пор матрицы, что способствовало улучшенному пространственному разделению связьгеающихся с носителем белков, Ранее данный носитель никогда не использовался для проведения рефолдинга белков. Условия проведения рефолдинга были следующими: 4°С, рН 7,5, скорость градиента мочевины (6 -0 М) - 0,15 М/ч (рис. 12),
Поскольку известно, что ОРН является металл о ферментом с двумя ионами Со-"1 в АЦ, координированными карбам и л про ва н н ы м остатком (рис. 8), то после рефолдинга проводилась активация фермента Н^-ОРН
(концентрация фермента составляла путем добавления к его
раствору карбонатного буфера (до конечной концентрации 0,05 М) и ионов Со2+ (до 10"5 М).
Было показано, что в присутствии 0,05 М карбонат-ионов и ионов 10"5М Со2+ в буферах с рН 10,5 и 9,0 активность рефолдированного фермента 1-Ш6-ОРН достигала максимума в течение 24 ч при 4°С.
Рис. 12. Хроматографический профиль, отражающий нанесение раствора ТВ, солюбилизированных в 6М мочевине, на хроматографический носитель Co2+-IDA-криоПААГ, рефолдинг белка и его элюирование. Буфер 1: 50 мМ фосфатно-солевой буфер с 300 мМ NaCl (pH 7,6), линейный градиент мочевины 6-ОМ (—). Буфер 2: 300 50 мМ фосфатно-солевой буфер с 300 мМ NaCl (pH 7,6). Буфер 3: 50 мМ фосфатно-солевой буфер с 300 мМ NaCl (pH 7,6), градиент имидазола 0-400 мМ (----).
Выход His6-OPH из ТВ при проведении рефолдинга составил - 20%, что согласно литературным данным является незаурядным результатом для рефолдинга димерных белков из ТВ. Рефолдинг позволил увеличить суммарный выход растворимой формы фермента His6-OPH на 10% и достичь 60% от общего количества этого белка, синтезируемого в клетках.
3. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных плазмидой pTES-His^-OPH, с целью получения высокого выхода растворимой активной Формы фермента His^-OPH
Следующим исследованным подходом к увеличению выхода
растворимой активной формы фермента His6-OPH из клеток в данной работе был биотехнологический, направленный на оптимизацию условий культивирования клеток-продуцентов данного фермента. Известно, что основными факторами, влияющими на выход активной формы белка, являются: концентрация и время внесения индуктора, температура культивирования, режим культивирования (периодический или режим с внесением субстратных подпиток).
Согласно литературным данным, оптимальным является введение индуктора синтеза целевого белка (ИПТГ) в среду культивирования в 2-е стадии. В процессе исследований, проведенных в данной работе, оказалось, что для получения максимального выхода активной формы белка в клетках важно не столько время внесения ИПТГ в среду культивирования, сколько фаза роста клеток, на которой осуществляется введение индуктора.
Было показано, что при внесении одинаковых концентраций ИПТГ (0,2 мМ) в среду культивирования (1-ая стадия-) в середине (OD540 ~ 0,5 - 0,7 опт. ед.) или в конце лаг-фазы (OD54o ~ 0,7 - 0,8 опт. ед.), или в начале экспоненциальной фазы роста клеток (OD540 ~ 0,8 - 1,1 опт. ед.) изменялась величина максимальной ОРН-активности клеток (рис. 13(1)). Согласно представленным данным, максимальный уровень ОРН-активности, накапливающейся в клетках в процессе их роста, наблюдался при введении индуктора в среду культивирования в конце лаг-фазы роста клеток Е. coli
(Склеток~ 0,7 0,8 г/л).
При введении ИПТГ в среду культивирования в начале, середине или конце экспоненциальной фазы роста клеток (2-ая стадия), величина максимальной внутриклеточной ОРН-активности также менялась (рис. 13(2)). Оказалось, что уровень ОРН-активности клеток достигает максимума при внесении ИПТГ в среду культивирования в конце логарифмической фазы роста клеток (С клеток ' 8 г/л).
2) С , г/л
КЛСТ1Ж
4 6 8
40
Время, ч
Рис. 13. Максимальная удельная органофосфатгидролазная активность клеток Е. соИ 8С13009[рКЕР4] в зависимости от фазы роста клеток (концентрации биомассы), при которой осуществлялось введение 0,2 мМ ИПТГ в среду культивирования на 1-ой (■) или 2-ой (•) стадии.
Рис. 14. Рост клеток (•) и изменение удельной органофосфатгидролазной
активности клеток (■) при периодическом режиме культивирования (I) Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных плазмидой pTES-His6-OPH, при 2В°С и с однократным внесением подпиток (II) (стрелками указано время внесения подпиток (1) и ИПТГ (2)).
Таким образом, для накопления максимальной ОРН-активности в клетках необходимо вносить ИПТГ в среду культивирования в два этапа: в конце лаг-
фазы (Склетаг- 0,7 - 0,8 г/л) и в конце логарифмической фазы роста клеток (Склсток ~7 - 8 г/л).
Как было отмечено ранее, к моменту постановки задачи максимальный уровень ОРН-активности в клетках при 30°С составлял 1300 ед/л среды культивирования (табл. 5). Снижение температуры на 2°С и конечной концентрации индуктора в среде культивирования на 20%, а также использование оптимальной фазы роста клеток для введения ИПТГ привело к увеличению выхода ОРН-активности, получаемой из 1 л среды среды культивирования, в 2,5 раза (рис. 14(1), табл. 5). При однократном введении дополнительного количества питательных веществ и дополнительного количества индуктора в среду культивирования в конце логарифмической фазы роста клеток выход ОРН-активности увеличился еще в 4 раза и составил 10000 ед/л (рис. 14(11), табл. 5).
Таблица 5. Характеристики процесса культивирования рекомбинантных клеток Е. coli SG13009[pREP4], синтезирующих Hiss-OPH (где Amax - максимальная активность)
Данные т, °с ИПТГ, мМ /Л •Г1 Amax ß клетках ед/г Время накопления Amax* Ч Склеток При Amax* г/л Amax» ед/л
0,25 0,25 74 17,6 1300
До оптимизации 30 0,5 0,23 67 21 17,4 1170
0,75 0,21 60 16,8 1000
1)Рис. 13(1) 28 0,2 0,12 270 27 11,5 3100
2) Рис. 13(1 и II) 0,4 0,12 950 69 10,5 10000
Таким образом, наилучшим оказался вариант культивирования клеток с однократным введением субстратных подпиток на 26 часу роста биомассы и дробным введением ИПТГ в конце лаг-фазы (Сцлето^ 0,7 - 0,8 г/л) и в конце экспоненциальной фазы (Снеток ~7 - 8 г/л) роста клеток. Выход активности с 1 л культуральной жидкости при этом был увеличен в 7,5 - 10 раз по сравнению с данными, имеющимися перед началом работы (табл. 5).
Условия ультразвуковой дезинтеграции получаемой биомассы клеток были подобраны таким образом, что позволили увеличить активность получаемого клеточного лизата в 10 раз. Активация №з6-ОРН в супернатанте, путем введения в его состав ионов Со2+, необходимых для формирования
активного центра фермента, позволила увеличить активность ферментного препарата еще в 2,5 раза. Таким образом, с 1 л среды культивирования клеток-продуцентов Швб-ОРН было получено 5Т05 ед. органофосфатгидролазной активности.
При исследовании возможности хранения раствора полученного ферментного препарата Швб-ОРН с активностью 5000 ед/мл при разных значениях рН было показано, что при рН 7,5 фермент практически в 2 раза
стабильнее, чем при рН 10,5. В присутствии 15% глицерина при -20°С и рН 7,5 препарат сохранял 98% ОРН-активности в течение, как минимум 115 сут.
4. Применение ферментного препарата в системах разложения ФОС
Полученный высокоактивный стабильный неочищенный препарат фермента ЬПБб-ОРН был использован для создания фильтрующесорбирующего самодегазирующегося защитного материала от действия ФОВ.
Материал включал несколько слоев, выполняющих различные функции (рис. 15). Верхний слой, изолирующий от проникновения отравляющих веществ в виде жидкости, обладал олеофильными свойствами и содержал полиуретановую или фторолеиновую мембранотканевую составляющую. Средний слой являлся сорбирующим и самодегазирующимся и содержал в качестве дегазирующего элемента иммобилизованный ферментный препарат Шэб-ОРН с активностью до 150 ед/см2. Нижний гигиенический слой был выполнен из тканого или нетканого целлюлозосодержащего материала и был предназначен для контакта с кожным покровом и выполняющие функции подложки для вышележащих слоев.
Анализ эффективности действия данного материала проводился в 27 НЦ МО РФ в аналитической лаборатории, имеющей международный сертификат на проведение таких исследований. При нанесении на поверхность защитного материала вещества Ух, зарина или зомана в концентрации 10 г/м2 время самодегазации материала было менее 3 ч (рис. 15). При этом отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала гарантировано регистрировалось на протяжении не менее 96 ч при температуре от 22 до 45°С. По времени защитного действия разработанный материал превосходит в 4 раза применяющиеся на практике защитные материалы, не имеющие свойств самодегазации, а только сорбции, и содержащие в качестве сорбирующего материала мелкодисперсный активированный уголь. Новизна полученного защитного материала и его уникальные защитные характеристики были отмечены Патентом РФ на изобретение №2330717 (2008).
Полученный неочищенный ферментный препарат Ивб-ОРН также был использован для гидролиза остаточных количеств вещества типа Ух в РМ-ГД. В данных РМ содержание воды составляло 1%, в связи с этим они были очень вязкими и приобретали текучесть лишь при их нагреве до 50°С (Капашин В., 2008). Для их ферментативной обработки требовалось предварительное разбавление, которое осуществлялось с помощью 0,2 М карбонатного буфера (рН 10,5) в 50 или 100 раз.
Было показано, что независимо от степени разбавления РМ-ГД вещество типа Ух в его составе полностью гидролизуется в течение 150 ч (рис. 16).
На основании полученных результатов были разработаны технологические регламенты процесса ферментативной детоксикации данных РМ-ГД на лабораторной и пилотной установках. Процесс ферментативного
гидролиза вещества типа Ух в составе РМ-ГД был успешно реализован в реакторе объемом 50 л. Наработка препарата фермента Швб-ОРН для проведения гидролиза ФОВ в составе РМ-ГД на пилотной установке была осуществлена согласно биотехнологическому методу, разработанному в этой работе.
Ух, 10г/м2
изолирующим слой
3 100
к бо
г; х =г >
__слой с Hisf)-OPH jg
-гигиенический слой
20
САМОДЕГАЗАЦИЯ НЕ БОЛЕЕ 3 ч
5 10 Время, ч
15
Рис. 15. Состав защитного материала и кинетика разложения отравляющего вещества Ух в среднем слое защитного материала, содержащем фермент Шзб-ОРН.
50 100
Время, ч
Рис. 16. Изменение концентрации вещества типа Ух в РМ, разбавленных в 50 (•, ■) и 100 раз (Ж), при гидролизе ферментом с активностью 1000 (и, А) и 2000 Ед/мл (•).
Выводы
1. Разработаны новые генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH, обладающих органофосфатгидролазной активностью и свойствами флуоресцентного белка deGFP4. Установлены условия получения максимального выхода гибридных белков в растворимой активной форме: 28°С, 0,10 мМ ИПТГ, 10 ч культивирования после индукции синтеза белков. Достигнутый уровень синтеза белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH в растворимой активной форме оказался в 2 раза выше выхода растворимой формы His6-OPH и в 25 раз выше выхода аналогичного гибридного белка в клетках Е. coli, описанного в литературе.
2. Исследованы каталитические характеристики полученных гибридных белков. На примере белка ШЗб-с1еСРР4-(11А)5-ОРН показана взаимозависимость его флуоресцентных характеристик и ОРН-активности, проявляющейся в реакциях гидролиза ФОС.
3. Моделирование структуры ОРН позволило сделать предположение о том, что стабильность фермента при нейтральных значениях рН выше, чем при щелочных значениях, что было подтверждено экспериментально при исследовании условий хранения фермента Швб-ОРН и термоинактивации гибридных белков. Кроме того, показано, что специфичность действия фермента увеличивается в пользу субстратов с более объемными заместителями у фосфорного центра, что было подтверждено экспериментально: установлено двукратное уменьшение значения Кт для реакции гидролиза ДФФ под действием гибридного белка по сравнению с гидролизом ДФФ нативной ОРН.
4. Впервые был осуществлен рефолдинг фермента ШЭб-ОРН из телец включения. Впервые показана возможность применения для рефолдинга Н1з6-содержащих белков металл-хелатирующего носителя на основе крио-ПААГ. Эффективность рефолдинга Иэй-ОРН из ТВ составила 20%, а суммарный выход белка из клеток в растворимой активной форме был увеличен до 60%.
5. Показано, что культивирование клеток-продуцентов Ш56-ОРН в периодическом режиме с однократным внесением подпиток субстрата и дробным внесением индуктора в питательную среду обеспечивает максимальный выход растворимой активной формы фермента, выраженный в количестве единиц активности, получаемых с 1 л среды. В данной работе выход ОРН-активности был максимально в 7,5-10 раз по сравнению с ранее известным уровнем.
6. Был разработан сомодегазирующийся защитный материал от воздействия ФОВ, содержащий препарат фермента Швв-ОРН в качестве активной каталитической составляющей. Показано, что при нанесении на поверхность такого материала ФОВ в концентрации 10 г/м2 отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала гарантировано на протяжении не менее 96 ч при температуре от 22 до 45°С. Данный показатель полученного материала более, чем в 4 раза превосходит показатели, характерные для защитных материалов, применяемых сегодня на практике. Каталитическая самодегазация материала (разложение ФОВ внутри материала) происходит в течение 3 ч.
7. Препарат фермента Н1б6-0РН впервые был успешно использован для гидролиза ФОВ в составе РМ-ГД, получаемых после химического уничтожения вещества типа Ух с применением щелочного гидролиза, в лабораторных условиях и на пилотной установке (в 50 л реакторе). Показано, что в течение 150 ч вещество типа Ух (20 мг/л) полностью ферментативно гидролизуется в составе РМ-ГД, характеризующихся сложным химическим составом.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Гудков Д.А. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия., 2006,47(1), 15-19.
2. Efremenko Е., Lyagin I., Gudkov Р., Varfolomeyev S. Immobilized biocatalysts for detoxification of neurotoxic organophosphorous compounds. // Biocatal. Biotransfor., 2007, 25(2-4), 359-364.
3. Гудков Д.А.. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы из телец включения. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия., 2007,48(6), 389-394.
4. Lyagin I., Gudkoy Р.. Verkhusha V., Efremenko Е. Genetic construct encoding the biosynthesis of N-His6-e-pHluorins-OPH in E. coli cells. // In book: "Chemical and Biochemical Physics, Kinetics and Thermodynamics: New Perspectives" (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., 2008, p. 83-90.
5. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Votchitseva Yu.V., Gudkov P.A., Peregudov A.A., Aliev Т.К., Varfolomeev S.D. The influence of length and localization of polyhistidine tag in the molecule of organophosphorus hydrolase on the biosynthesis and behavior of fusion protein. // In book: "Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development" (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., 2008, p.87-101.
6. Efremenko E., Lyagin I., Senko O., Gudkov P., Varfolomeev S. Application of gel systems with various biocatalysts detoxifying neurotoxic agents for pollution control, water purification, and self-defense. // In book: "Sol-Gel Methods for Materials Processing.» (Eds. P. Innocenzi, Y. L. Zub, V. G. Kessler), Springer, ND, 2008, p.77-89.
7. Ефременко E.H., Завьялов B.B., Завьялова H.B., Гореленков В.К., Гудков Д.А., Лягин И.В., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Фильтрующесорбирующий сомодегазирующийся материал для средств индивидуальной защиты от воздействия фосфорорганических соединений. Патент РФ на изобретение №2330717, Бюл. №22, 10.08.2008.
8. Ефременко Е.Н., Завьялова Н.В., Лягин И.В., Сенько О.В., Гудков Д.А.. Аксенов А.В., Степанов Н.А., Сироткина М.С., Спиричева О.В., Иванов Р.В., Лозинский В.И., Варфоломеев С.Д., Кондратьев В.Б., Холстов В.И. Способ разложения фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx. Заявка на патент РФ на изобретение №2009104506, приоритет от 10.02.2009 г.
9. Efremenko E.N., Votchitseva Yu.A., Aliev Т.К., Gudkov P.A., Varfolomeev S.D. Fusion organophosphate hydrolase: new features in catalysis. // Intern. Simposium Biomolecular Chemistry - ISBOC-7, Sheffield, UK, 2004, June 27 -July 1, p. 80.
Ю.Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Перегудов А.А., Алиев Т.К., Ефременко Е.Н. Генетическая модификация органофосфатгидролазы: синтез и каталитические свойства. // 9-я Межд. Пущинская школа - конф-ция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2005, Пущино, Россия, 18-22 апреля, с. 16.
П.Лягин И.В., Гудков Д.А.. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. Биокатализаторы на основе генетически модифицированной органофосфатгидролазы для гидролиза фосфорорганических пестицидов в проточных системах. // Межд. конф-ция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». 2005, Саратов, Россия, 14-16 сентября, с. 33-34.
12.Гудков Д.А., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Разработка растворимого и иммобилизованного препаратов органофосфатгидролазы для решения проблем загрязнения окружающей среды фосфорорганическими веществами. // VI Межд. конф-ция «Проблемы загрязнения окружающей среды». 2005, Перьмь-Казань-Пермь, Россия, 20-25 сентября, с. 149.
13.Гудков Д.А., Ефременко Е.Н. Рефолдинг органофосфатгидролазы, содержащей гексагистидиновую последовательность на N-конце, из телец включения. // 10-я Межд. Пущинская школа - конф-ция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2006, Пущино, Россия, 17-21 апреля, с. 365.
14.Efremenko Е., Lyagin I., Gudkov Р.. Peregudov A. Immobilized Biocatalysts for Detoxication of Neurotoxic Organophosphorus Compounds. // Intern. Conf. "Environmental Biocatalysis: From remediation with enzymes to novel green processes". 2006, Cordoba, Spain, April 23-26, p.63.
15.Гудков Д.А.. Лягин И.В., Верхуша В., Ефременко Е.Н. Trends to increase the yield of soluble organophosphorous hydrolase: production of hybrid analogues and protein refolding from inclusion bodies. // Межд. школа - конф-ция «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2006, Москва - Пущино, Россия, 28 ноября - 1 декабря, с. 45.
16.Lyagin I.V., Gudkov D.A.. Verkhusha V.V., Efremenko E.N. Molecular messengers for organophosphorous toxins presence in the body cells. // Intern. Workshop "New technologies in Medicine and Experimental Biology". 2007, Pattaya - Bangkok, Thailand, February 26 - March 8, p. 43-44.
17.Гудков Д.А.. Лягин И.В., Сироткина M.C., Верхуша В., Ефременко Е.Н. Химерные белки на основе органофосфатгидролазы. // Четвертый Московский межд. конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2007, Москва, Россия, 12-16 марта, с. 279.
18.Гудков Д.А.. Лягин И.В., Верхуша В., Ефременко Е.Н. Получение и свойства гибридных белков, содержащих суперэклиптикфлюорин и органофосфатгидролазу. // Межд. конф-ция «Биокатализ - 2007: структура, функции, применение». 2007, Москва - Санкт-Петербург, Россия, 17-22 июня, с. 98-99.
19.Гудков Д.А.. Лягин И.В., Верхуша В., Ефременко E.H. Химерные белки, сочетающие в себе свойства флюоресцентного белка и органофосфатгидролазы. // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 2007, Москва, Россия, 23-28 сентября, с. 2126.
20.Лягин И.В., Гудков Д.А.. Верхуша В.В., Ефременко E.H. Получение и свойства рекомбинантных гибридных белков для детекции нейротоксичных фосфорорганических соединений. // II Международная научная конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». 2008, Ростов-на-Дону, Россия, октябрь 8-10, с. 136.
21 .Гудков Д.А.. Лягин И.В., Верхуша В.В., Ефременко E.H. Свойства органофосфатгидролазы и флуоресцентного белка deGFP4 в составе рекомбинантного гибридного белка. // 12-я Межд. школа - конф-ция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2008, Пущино, Россия, 10-14 ноября, с. 203-204.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
АЦ - активный центр;
ДФФ - диизопропилфторфосфат;
ИПТГ - изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид;
крио-ПААГ - полиакриламидный гель, полученный при полимеризации при -12°С;
МД - молекулярная динамика;
ОП - оптическая плотность;
РМ-ГД - реакционные массы, полученные после химического уничтожения ФОВ методом гидролизной детоксикации;
ТВ - тельца включения;
ФОС - фосфорорганическое соединение;
ФОВ - фосфорорганическое отравляющее вещество;
CHES - 2-[Ы-циклогексиламино]этансульфоиовая кислота,рКа 9,3;
Со2+-ГОА-крио-ПААГ - металл-хелатирующий макропористый носителель для иммобилизации, полученный при низкотемпературном режиме полимеризации акриламидных гелей (крио-ПААГ), модифицированных иминодиуксусной кислотой (IDA) и заряженных ионами Со2+.
deGFP4 - pH-чувствительный генетически-модифицированный аналог GFP;
GFP - зеленый флуоресцентный белок;
His6-OPH - органофосфатгидролаза, содержащая гексагистидиновую последовательность на N-конце молекулы белка;
Me - ион металла;
ОРН - органофосфатгидролаза;
Заказ № 4/03/09 Подписано в печать 02.03.2009 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,5
¿г^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гудков, Денис Андреевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Фермент органофосфатгидролаза.
1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента.
1.1.2. Пространственная структура ОРН.
1.2. Создание гибридных белков.
1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках.21 '
1.2.2. Флуоресцентные белки.
1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок.
1.2.2.2. pH-чувствительные генетически модифицированные аналоги GFP.
1.2.3. ОРН в составе гибридных белков.
1.3. Рефолдинг белков из телец включения.
1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга.
1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков.
1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток Е. coli для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков.
1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме.
1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полупериодическом режиме.
1.4.3. Аэрация среды, использование перфторуглеродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования.
1.4.4. Экспрессия генно-инженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов.
1.5. Применение растворимой формы фермента His6-OPH.
1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОБ.
1.5.2. Фильтрующесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и приборы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Ферменты.
2.1.3. Бактериальные штаммы.
2.1.4. Питательные среды.
2.1.5. Составы растворов.
2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды.
2.1.7. Приборы.
2.2. Методы.
2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН.
2.2.2. Определение pH оптимума действия фермента.
2.2.3. Исследование термостабильности.
2.2.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli.
2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli.
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.
2.2.7. Рестрикция ДНК и выделения фрагментов электрофорезом в агарозном геле.
2.2.8. Цитирование фрагментов ДНК.
2.2.9. Конструирование плазмид pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH.
2.2.10. Определение уровня экспрессии генно-инженерных конструкций pTES-Hisr,-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH и органофосфатгидролазной активности гибридных белков. Изучение кинетики роста клеток Е. coli DH5oc.
2.2.11. Определение растворимости белка.
2.2.12. Выделение и очистка полигистидинсодержащих белков с использованием металл-хелатирующих носителей.
2.2.13. Подготовкакрио-ПААГ носителей.
2.2.14. Очистка белка His6-deGFP4-(AS)5-OPH.
2.2.15. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (ДСН-электрофорез).
2.2.16. Исследование флуоресцентных свойств гибридных белков.
2.2.17. Компьютерное моделирование.
2.2.18. Наработка препарата фермента HIsö-OPH для его применения в экспериментах прикладного характера.
2.2.19. Приготовление фильтрующесорбирующего самодегазирующегося материала.
2.2.20. Дезактивация РМ, полученных в результате химического гидролиза вещества типа Vx с применением рецептуры РД-ГД с использованием препарата фермента His6-OPH.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН.
3.1.1. Выбор межмолекулярных спейсеров.
3.1.2. Создание генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPHH ffis6-deGFP4-(AS)5-OPH.
3.1.3. Экспрессия полученных генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH.
3.1.4. Выделение и очистка новых гибридных белков.
3.1.5. Физико-химические и каталитические характеристики генетически-модифицированных аналогов ОРН.
3.1.6. Исследования структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования.
3.1.6.1. Моделирование структуры димера ОРН.
3.1.6.2. Моделирование структуры мономера ОРН.
3.1.7. Исследование термостабильности белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH.
3.1.8. Исследование флуоресцентных свойств полученных гибридных белков.
3.2. Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы.
3.2.1. Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения процесса.
3.2.2. Проведение рефолдинга Hise-OPH на металл-хелатирующем носителе.
3.2.3. Активация фермента после рефолдинга.
3.3. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, для увеличения выхода растворимой формы фермента Hise-OPH.
3.3.1. Влияние времени введения индуктора в среду культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, на их удельную органофосфатгидролазную активность.
3.3.2. Влияние температуры культивирования на выход удельной органофосфатщцролазной активности в клетках Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hisg-OPH.
3.3.3. Культивирование клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, в периодическом режиме с внесением подпиток.
3.3.4. Влияние перфторуглеводородов на выход активной биомассы клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hisö-OPH.
3.4. Применение ферментного препарата.
3.4.1. Исследование процесса разрушения клеток Е. coli SG13009[pREP4] -продуцентов Hise-OPH ультразвуком.
3.4.2. Длительное хранение ферментного препарата Hise-OPH в различных условиях.
3.4.3. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал, содержащий Hise-OPH, для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.
3.4.3.1. Разработка самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.
3.4.3.2. Испытание самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.
3.4.4. Детоксикация реакционных масс, полученных в результате химического гидролиза ФОВ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы"
На современном этапе развития сельского хозяйства интенсивное применение пестицидов, из которых более 40% составляют фосфорорганические соединения (ФОС), широко вошло в практику по всему миру. Несмотря на то, что применение химических средств защиты растений строго регламентируется ГОСТами (в России 4-6 кг/га) [1], низкая водорастворимость и низкая скорость биодеструкции ФОС приводят к их накоплению в почвах и сточных водах [2]. Кроме того, исследования свидетельствуют о наличии ФОС в различной сельскохозяйственной продукции, например в хлопке, собранном с обработанных пестицидами территорий [3], в мясомолочных продуктах питания, овощах, фруктах и продуктах их переработки [4-5].
Показано, что ФОС обладают сильным кумулятивным эффектом и оказывают мутагенное воздействие на млекопитающих. Так, у жителей территорий, прилегающих к сельскохозяйственным зонам, подвергавшимся когда-либо обработке ФОС, возникают хромосомные аберрации лимфоцитов [6].
Чрезвычайно высокую опасность для окружающей среды представляют складированные некондиционные пестициды. К настоящему времени в России накопилось несколько тысяч тонн таких веществ, причем некоторые места их хранения находятся в аварийном состоянии [7].
Помимо пестицидов к ФОС относятся и высокотоксичные агенты нервно-паралитического действия, фосфорорганические отравляющие вещества (ФОБ) - зарин, зоман, Ух, суммарные запасы которых на территории Российской Федерации, составляют 32,3 тыс. т [8].
Согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия запасы данных веществ должны быть полностью уничтожены к 2012 г. [9-10].
Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОБ [11], остаточные концентрации ФОБ в составе реакционных масс достигают 0,1%, кроме того, продукты разложения ОБ также являются токсичными для человека [12]. Важной составной частью процесса уничтожения химического оружия является обеспечение безопасности персонала, занятого в данном процессе, что предполагает использование средств защиты на объекте уничтожения ФОС [8].
В связи с этим поиск эффективных путей деградации ФОС, исключающих проведение процесса в «жестких» условиях (высокая температура, повышенное давление, сильные окислители), становится чрезвычайно актуальной проблемой. Ее решением может стать разложение ФОС с помощью биологических катализаторов.
Применение биокатализаторов, а именно, ферментов, предполагает использование неагрессивных сред для проведения гидролиза и использование температур в диапазоне 25-37°С, что значительно расширяет спектр возможностей данного метода.
Ключевым ферментом в процессе биодеструкции ФОС является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты [2]. Фермент обладает широкой субстратной специфичностью и высокими каталитическими константами и может быть использован для разработки новых препаратов, непосредственно готовых к применению. С помощью сайт-направленного мутагенеза ОРН была изучена структура активного центра фермента, изменена его субстратная специфичность и увеличено сродство к соединениям, представляющим собой ФОВ [13-14].
Препараты, созданные на основе ОРН, могут быть предназначены для удаления и последующей детоксикации остаточных количеств пестицидов с различных поверхностей, например, сельскохозяйственного и садового оборудования и инвентаря, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты. Кроме того, данный фермент может быть использован в составе препаратов, применяющихся для дегазации различных поверхностей, подвергшихся заражению ФОС [15].
Возможность широкого применения фермента ОРН на практике стимулирует исследования, направленные на создание высокоэффективных систем для его синтеза в рекомбинантных клетках, упрощение процедуры его выделения и очистки. На Химическом факультете МГУ имени М. В. Ломоносова была создана новая высокоэффективная система для синтеза нативного фермента в клетках Е, coli [16], изучены свойства полученной рекомбинантной ОРН. Также были созданы генетические конструкции, кодирующие синтез рекомбинантных ферментов, содержащих гексагистидиновые последовательности на N-конце (Hise-OPH) [17] и С-конце молекулы ОРН [18]. Введение аффинной последовательности в структуру белка было обусловлено тем, что очистка и выделение такого фермента существенно проще в технологическом плане [19]. Наличие таких последовательностей на N- или С-конце молекулы белка позволяет проводить его выделение и очистку с использованием аффинных хроматографических носителей. Кроме того, оказалось, что введение последовательности из шести остатков гистидина на N-конец молекулы белка влияет на свойства фермента [17-18]. Для фермента Hise-OPH были характерны улучшенные константы эффективности действия по ряду субстратов по сравнению с ОРН [17]. Например, константа эффективности гидролиза вещества Ух ферментом Hise-OPH оказалась в 2 раза выше, чем данная величина, характерная для ОРН, а константа эффективности гидролиза зарина — практически в 10 раз [20].
Данный факт делает масштабное использование фермента Hise-OPH для гидролиза ФОВ очень привлекательным. Однако, исследования синтеза His6-OPH в клетках Е. coli показали, что до 50% белка образуется в нерастворимой неактивной форме, в виде телец включения (ТВ), в результате чего его выход оказался сниженным по сравнению с ферментом ОРН более, чем в 2 раза [20].
Для увеличения выхода растворимой активной формы белка могут быть использованы различные методы. Во-первых, использование гибридного партнера, белка, связанного с целевым белком спейсером из нескольких аминокислот. Гибридный партнер синтезируется раньше целевого белка, проходит процедуру фолдинга и удерживает целевой продукт в растворенном состоянии. Кроме того, в данном случае работает принцип ингибирования процесса совместной агрегации белков [21-22]. Во-вторых, применение процедуры рефолдинга активного фермента из ТВ совместно с параллельным выделением активной растворимой формы белка из клеток может существенно увеличить суммарный выход целевого продукта из биомассы клеток. Следует отметить, что ранее рефолдинг белков Hise-OPH и ОРН никем не проводился. В-третьих, применение биотехнологического подхода, оптимизация условий культивирования штамма-продуцента может привести к снижению агрегации белка внутри клетки и увеличению выхода растворимой формы фермента. Кроме того, культивирование рекомбинантных микроорганизмов до высокой плотности биомассы позволит снизить затраты, связанные с обработкой клеток, полученных в процессе ферментации.
Целью данной работы являлось получение фермента Hise-OPH в растворимой активной форме с использованием различных подходов: генно-инженерного (создание гибридных белков), биохимического (проведение рефолдинга из телец включения) и биотехнологического (оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Hise-ОРН).
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гудков, Денис Андреевич
ВЫВОДЫ
1. Разработаны новые генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков №зб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН и Шзб-с1еОРР4-(А8)5-ОРН, обладающих органофосфатгидролазной активностью и свойствами флуоресцентного белка <ЗевРР4. Установлены условия получения максимального выхода гибридных белков в растворимой активной форме: 28°С, 0,10 мМ ИПТГ, 10 ч культивирования после индукции синтеза белков. Достигнутый уровень синтеза белка Н1зб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН в растворимой активной форме оказался в 2 раза выше выхода растворимой формы Шэб-ОРН и в 25 раз выше выхода аналогичного гибридного белка в клетках Е. соИ, описанного в литературе.
2. Исследованы каталитические характеристики полученных гибридных белков. На примере белка Н1Бб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН показана взаимозависимость его флуоресцентных характеристик и ОРН-активности, проявляющейся в реакциях гидролиза ФОС.
3. Моделирование структуры ОРН позволило сделать предположение о том, что стабильность фермента при нейтральных значениях рН выше, чем при щелочных значениях, что было подтверждено экспериментально при исследовании условий хранения фермента ЬШб-ОРН и термоинактивации гибридных белков. Кроме того, показано, что специфичность действия фермента увеличивается в пользу субстратов с более объемными заместителями у фосфорного центра, что было подтверждено экспериментально: установлено двукратное уменьшение значения Кт для реакции гидролиза ДФФ под действием гибридного белка по сравнению с гидролизом ДФФ нативной ОРН.
4. Впервые был осуществлен рефолдинг фермента Ибс-ОРН из телец включения. Впервые показана возможность применения для рефолдинга Кэб-содержащих белков металл-хелатирующего носителя на основе крио-ПААГ. Эффективность рефолдинга Кэб-ОРН из ТВ составила 20%, а суммарный выход белка из клеток в растворимой активной форме был увеличен до 60%.
5. Показано, что культивирование клеток-продуцентов Кэб-ОРН в периодическом режиме с однократным внесением подпиток субстрата и дробным внесением индуктора в питательную среду обеспечивает максимальный выход растворимой активной формы фермента, выраженный в количестве единиц активности, получаемых с 1 л среды. В данной работе выход ОРН-активности был максимально в 7,5-10 раз по сравнению с ранее известным уровнем.
6. Был разработан сомодегазирующийся защитный материал от воздействия ФОВ, содержащий препарат фермента Hise-OPH в качестве активной каталитической составляющей. Показано, что при нанесении на поверхность такого материала ФОВ в концентрации 10 г/м2 отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала гарантировано на протяжении не менее 96 ч при температуре от 22 до 45 °С. Данный показатель полученного материала более, чем в 4 раза превосходит показатели, характерные для защитных материалов, применяемых сегодня на практике. Каталитическая самодегазация материала (разложение ФОВ внутри материала) происходит в течение 3 ч.
7. Препарат фермента Hise-OPH впервые был успешно использован для гидролиза ФОВ в составе РМ-ГД, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx с применением щелочного гидролиза, в лабораторных условиях и на пилотной установке (в 50 л реакторе). Показано, что в течение 150 ч вещество типа Vx (20 мг/л) полностью ферментативно гидролизуется в составе РМ-ГД, характеризующихся сложным химическим составом.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гудков, Денис Андреевич, Москва
1. II. Мельников. Пестициды: Химия, технология, применение. 1987. М.: Химия. 712 с.
2. Е. Ефременко, В. Сергеева. Органофосфатгидролаза фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов. Изв. Акад. Наук. Сер. хим., 2001, 10, 1743-1749.
3. L. Luchini, Т. Peres, M. deAndrea. Monitoring of pesticide residues in a cotton crop soil. J. Environ. Sci. HealB, 2000, 35, 51-59.
4. J. Shah, M. Jan, M. Nafees, S. Noureen, N. Bhatti. Monitoring pesticide residues in fresh fruits marketed in Peshawar, Pakistan. Am. Lab., 2005, Mar., 22-24.
5. Y.-Z. Zheng, W.-S. Lan, C.-L. Qiao, A. Mulchendani, W. Chen. Decontamination of vegetables sprayed with organophosphate pesticides by organophosphorus hydrolase and carboxylesterase (Bl). Appl. Biochem. Biotech., 2007, 136, 233-242.
6. W. Lambert, M. Lasarev, J. Muniz, J. Scherer, J. Rothlein, J. Santana, L. McCauley. Variation in organophosphate pesticide metabolites in urine of children living in agricultural communities. Environ. Health Persp., 2005, 113(4), 504-508.
7. О. Максименко. Пестициды: защита для растений или отрава для окружающей среды. Наука и жизнь, 2003, 3, 54-58.
8. Б. Филатов, Н. Британов, В. Клаучек. Медико-санитарные проблемы уничтожения химического оружия (российский опыт). Хим. Биол. Безопасн., 2004, 1—2, 13-14.
9. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожения (исправленный вариант). 8 августа 1994 г. PTS PC OPCW. 1994. с. 191.
10. Федеральный закон "Об уничтожении химического оружия". Принят Государственной Думой 25 апреля 1997 г. Российская газета. 6 мая 1997. с. 4-5.
11. Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического оружия. Часть II. Фосфорорганические отравляющие вещества. T. I. М.: ФУ "Медбиоэкстрим", 2001, с. 208.
12. N. В. Munro, S. S. Talmage, G. D. Griffin, L. C. Waters, A. P. Watson, J. F. King, V. Hauschild. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products. Environ. Health Persp, 1999, 107(12), 933-974.
13. В. diSioudi, J. Grimsley, К. Lai, J. Wild. Modification of near active site residues in organophosphorus hydrolase reduces metal stoichiometry and alters substrate specificity. Biochemistry, 1999,38(10), 2866-2872.
14. T. Reeves, M. Wales, J. Grimsley, P. Li, D. Cerasoli, J. Wild. Balancing the stability and the catalytic specificities of OP hydrolases with enhanced V-agent activities. Protein Eng. Des. Sel., 2008, 21(6), 405-412.
15. D. Crabb, J. DeFrank, Ch. Penet, J. Warner. Look at opportunities for enzymes for chemical decontamination. Chem.-lnd. London, 2004, Jul., 14.
16. Варфоломеев С.Д., Ефременко E.H., Алиев Т.К., Вотчицева Ю.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-ОРН и продуцент фермента органофосфатгидролазы. Патент РФ на изобретение № 2232807, 2004.
17. Ю. Вотчицева, Е. Ефременко, Т. Алиев, С. Варфоломеев. Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. Биохимия, 2006, 71(2), 216-222.
18. Ю. Вотчицева. Органофосфатгидролаза: получение игенетически-модифицированных аналогов и анализ каталитических характеристик. Дисс. на соиск. степени к.х.н., 2006, 165 с.
19. Ya. Liu, G. Gotte, M. Libonati, D. Eisenberg. A domain-swapped RNase A dimer with implications for amyloid formation. Nat. Struct. Biol., 2001, 8(3), 211-214.
20. F. Rousseau, J. Schymkowitz, H. Wilkinson, L. Itzhaki. Three-dimensional domain swapping in pl3sucl occurs in the unfolded state and is controlled by conserved proline residues. Proc. Natl. Acad. Sci, 2001, 98(10), 5596-5601.
21. E. Ефременко, С. Варфоломеев. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. Успехи биол. Хим., 2004, 44, 307-340.
22. D. Dumas, S. Caldwell, J. Wild, F. Raushela. Purification and properties of the phosphotricsterase from Pseudomonas diminuta. J. Biol. Chem., 1989, 264(33), 19659-19665.
23. W. Donarski, D. Dumas, D. Heitmeyer, V. Lewis, F. Raushel. Structure-activity relationships in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminnta. Biochemistry, 1989, 28, 4650-4655.
24. J. Vanhooke, M. Benning, F. Raushel, H. Holden. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl 4-methylbenzylphosphonate. Biochemistry, 1996, 35(19), 6020-6025.
25. M. Benning, J. Kuo, F. Raushel, II. Holden. Three-dimensional structure of phosphotriesterase: an enzyme capable of detoxifying organophosphate nerve agents. Biochemistry, 1994,33(50), 15001-15007.
26. M. Benning, J. Kuo, F. Raushel, H. Holden. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of phosphotriesterase. Biochemistry, 1995, 34(25), 7973-7978.
27. M. Benning, H. Shim, Fr. Raushel, H. Holden. High resolution X-ray structures of different metal-substituted forms of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry, 2001, 40, 2712-2722.
28. H. Shim, F. Raushel. Self-assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase. Biochemistry, 2000, 39, 7357-7364.
29. S.-B. Hong, J. Kuo, L. Mullins, F. Raushel. CO2 is required for the assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase. J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 7580-7581.
30. M. Krauss. Ab initio structure of the active site of phosphotriesterase. J. Chem. Inf. Comput. Sci., 2001, 41, 8-17.
31. M. Krauss, L. Olsen, J. Antony, L. Hemmingsen. Coordination Geometries of Zn(II) and Cd(II) in phosphotriesterase: influence of water molecules in the active site. J. Phys. Chem. B, 2002,106, 9446-9453.
32. Ch.-G. Zhan,F. Zheng. First computational evidence for a catalytic bridging hydroxide ion in a phosphodiesterase active site. J. Am. Chem. Soc., 2001, 123(12), 2835-2838.
33. J. Koca, Ch.-G. Zhan, R. Rittenhouse, R. Ornstein. Mobility of the active site bound paraoxon and sarin in zinc-phosphotriesterase by molecular dynamics simulation and quantum chemical calculation. J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 817-826.
34. Sh.-L. Chen, W.-H. Fang, F. Himo. Theoretical study of the phosphotriesterase reaction mechanism. J. Phys. Chem. B, 2007,111(6), 1253-1255.
35. J. Коса, Ch.-G. Zhan, R. Rittenhouse, R. Ornstein. Coordination number of zinc ions in the phosphotriesterase active site by molecular dynamics and quantum mechanics. J. Comput. Chem., 2003, 24(3), 368-378.
36. C. Samples, T. Howard, F. Raushcl, V. DeRose. Protonation of the binuclear metal centcr within the active site of phosphotriesterase. Biochemistry, 2005, 44(33), 11005-11013.
37. Г. Казанков. Реакции координированных нуклеофилов. Ж. Орг. Хим., 1993, 29(6), 1239-1267.
38. A. Russell, М. Erbeldinger, J. DeFrank, J. Kaar, G. Drevon. Catalitic buffers enable positive-response inhibition-based sensing of nerve agents. Biotechnol. Bioeng., 2002, 77(2), 352-357.
39. Большой энциклопедический справочник. Под ред. К. Люцис., М.: Рус. энциклопед. тов., 2003, 576 с.
40. F. Raushel. Bacterial detoxification of organophosphate nerve agents. Curr. Opin. Microbiol., 2002, 5, 288-295.
41. M. Ortiz-Hernandez, R. Quintero-Ramirez, A. Nava-Ocampo, A. Bello-Ramirez. Study of the mechanism of Flavobacterium sp. for hydrolyzing organophosphate pesticides. Fund. Clin. Pharmacol., 2003, 17, 717-723.
42. C. Samples, F. Raushel, V. DeRose. Activation of the binuclear metal center through formation of phosphotriesterase-inhibitor complexes. Biochemistry, 2007, 46, 3435-3442.
43. M. Benning, S.-B. Hong, F. Raushel, H. Holden. The Binding of substrate analogs to phosphotriesterase. J. Biol. Chem., 2000, 275(39), 30556-30560.
44. C. Jackson, J.-W. Liu, M. Coote, D. Ollis. The effects of substrate orientation on the mechanism of a phosphotriesterase. Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 4343^1350.
45. V. Lewis, W. Donarski, J. Wild, and F. Raushel. Mechanism and stereochemical course at phosphorus of the reaction catalyzed by a bacterial phosphotriesterase. Biochemistry, 1988, 27(5), 1591-1597.
46. S. Caldwell, F. Raushel. Transition-state structures for enzymatic and alkaline phosphotricster hydrolysis. Biochemistry, 1991, 30(30), 7444-7450.
47. S.-B. Hong, F. Raushel. Stereochemical constraints on the substrate specificity of phosphotriesterase. Biochemistry, 1999,38(4), 1159-1165.
48. Органикум. 1992. В 2-х т. T.l: Пер. с нем.-М.: Мир, 587 с.
49. S. Caldwell, J. Newcomb, K. Schlecht, F. Raushel. Limits of diffusion in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry, 1991,30(30), 7438-7444.
50. G. Omburo, J. Kuo, L. Mullins, F. Raushel. Characterization of the zinc binding site of bacterial phosphotriesterase. J. Biol. Chem., 1992, 67(19), 13278-13283.
51. G. Omburo, L. Mullins, F. Raushel. Structural characterization of the divalent cation sites of bacterial phosphotriesterase by 13Cd NMR spectroscopy. Biochemistry, 1993, 32(15), 9148-9155.
52. W.-S. Li, K. Lum, M. Chen-Goodspeed, M. Sogorb, F. Raushel. Stereoselective detoxification of chiral sarin and soman analogues by phosphotriesterase. Bioorgan. Med. Chem., 2001, 9, 2083-2091.
53. G. Mei, A. Venere, N. Rosato, A. Finazzi-Agro. The importance of being dimeric. FEBSJ., 2005, 272, 16-27.
54. A. Veselovsky, Yu. Ivanov, A. Ivanov, A. Archakov, P. Lewi, P. Janssen. Proteinprotein interactions: mechanisms and modification by drugs. J. Mol. Recognit., 2002, 15, 405422.
55. T. Topping, D. Hoch, L. Gloss. Folding mechanism of FIS, the intertwined, dimeric factor for inversion stimulation. J. Mol. Biol., 2004, 335, 1065-1081.
56. K. Neet, D. Timm. Conformational stability of dimeric proteins: quantitative studies by equilibrium denaturation. Protein Sci., 1994, 3, 2167-2174.
57. S. Hobart, S. Ilin, D. Moriarty, R. Osuna, W. Colyn. Equilibrium denaturation studies of the Escherichia coli factor for inversion stimulation: implications for in vivo function. Protein Sci., 2002,11, 1671-1680.
58. J. Grimsley, J. Scholtz, C. Pace, J. Wild. Organophosphorus hydrolase is a remarkably stable enzyme that unfolds through a homodimeric intermediate. Biochemistry, 1997, 36, 14366-14374.
59. J. Ramstein, N. Hervouet, F. Coste, Ch. Zelwer, J. Oberto, B. Castaing. Evidence of a thermal unfolding dimeric intermediate for the Escherichia coli histone-like HU proteins: thermodynamics and structure. J. Mol. Biol., 2003, 331, 101-121.
60. A. Clark, J. Sinclair, T. Baldwin. Folding of bacterial luciferase involves a non-native heterodimeric intermediate in equilibrium with the native enzyme and the unfolded subunits. J. Biol. Chem., 1993,2(15), 10773-10779.
61. L. Gloss, C. Matthews. Urea and thermal equilibrium denaturation studies on the dimerization domain of Escherichia coli Trp repressor. Biochemistry, 1997, 36(19), 5612-5623.
62. B. Gorovits, P. Horowitz. The molecular chaperonin cpn60 displays local flexibility that is redused after binding with unfolded protein. J. Biol. Chem., 1995, 270(22), 13057-13062.
63. D. Rochu, N. Beaufet, F. Renault, N. Viguie, P. Masson. The wild type bacterial Co2+/Co2^-phosphotriesterase shows a middle-range thermostability. Biochimica et Biophysica Acta, 2002,1594, 207-218.
64. E. Efremenko, I. Lyagin, Yu. Votchitseva, M. Sirotkina, S. Varfolomeev. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties. Biocatal. Biotransfor., 2007,25(1), 103-108.
65. C. Roodveldt, D. Tawfik. Directed evolution of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta for heterologous expression in Escherichia coli results in stabilization of the metal-free state. Protein Eng. Des Sel, 2005, 18(1), 51-58.
66. H. Niwa, S. Inouye, T. Hirano, T. Matsuno, S. Kojima, M. Kubota, M. Ohashi, F. Tsuji. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 13617-13622.
67. D. Gudkov, Yu. Votchitseva, E. Efremenko. Paraoxon hydrolysis catalyzed by organophosphate hydrolase containing the polyhistidine tag at the C-terminus of the protein molecule. Rus. Chem. Bull., 2006, 61(1), 1-7.
68. R. Kapust, D. Waugh. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci., 1999, 8, 1668-1674.
69. J. Fox, K. Routzahn, M. Bucher, D. Waugh. Maltodextrin-binding proteins from diverse bacteria and archaea are potent solubility enhancers. FEBS Lett., 2003, 537, 53-57.
70. J. Fox, R. Kapust, D. Waugh. Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci., 2001, 10, 622-630.
71. K. Routzahn, D. Waugh. Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J. Struct. Func. Genomics, 2002, 2, 83-92.
72. S. Sati, S. Singh, N. Kumar, A. Sharma. Extra terminal residues have a profound effect on the folding and solubility of a Plasmodium falciparum sexual stage-specific protein over-expressed in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 2002, 269, 5259-5263.
73. R. Kern, A. Malki, A. Holmgren, G. Richarme. Chaperone properties of Escherichia coli thioredoxin and thioredoxin reductase. Biochem. J., 2003, 371, 965-972.
74. J. Winter, P. Neubauer, R. Glockshuber, R. Rudolph. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. J. Biotechnol., 2000, 84, 175-185.
75. Ya. Arii, H. Yamaguchi, Sh.-I. Fukuoka. Producing of a soluble recombinant prion protein fused to blue fluorescent protein without refolding or detergents in Escherichia coli cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71(10), 2511-2514.
76. R. Tsien. The green fluorescent protein. Annn. Rev. Biochem., 1998, 67, 509-544.
77. N. Shaner, P. Steinbach, R. Tsien. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth., 2005, 2(12), 905-915.
78. M. Ashby, K. Ibaraki, J. Henley. It's Green Outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci., 2004, 27(5), 257-261.
79. V. Verkhusha, K. Lukyanov. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat. Biotechnol., 2004, 22(3), 289-296.
80. H. Зубова, А. Булавина, А. Савицкий. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флюоресцирующих белков. Успехи биолог, хим., 2003, 43, 163-224.
81. В. Верхуша, Н. Аковбян, Е. Ефременко, С. Варфоломеев, П. Вржещ. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флюоресцентного белка DsRed. Биохимия, 2001, 66(12), 1659-1670.
82. М.-А. Elsliger, R. Wachter, G. Hanson, К. Kallio, J. Remington. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry, 1999, 38, 5296-5301.
83. M. Chatroraj, B. King, G. Bublitz, S. Boxer. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 8362-8367.
84. A. Saxena, J. Udgaonkar, G. Krishnamoorthy. Protein dynamics control proton transfer from bulk solvent to protein interior: a case study with a green fluorescent protein. Protein Sei., 2005, 14, 1787-1799.
85. G. Patterson, S. Knobel, W. Sharif, S. Kain, D. Piston. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J., 1997, 73, 27822790.
86. G. Miesenbok, D. De Angelis, J. Rothman. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 1998, 394, 192-195.
87. P. Paroutis, N. Touret, S. Grinstein. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiology, 2004, 19, 207-215.
88. M. Ng, R. Roorda, S. Lima, B. Zemelman, P. Morcillo, G. Miesenböck. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron, 2002, 36(3), 463-474.
89. S. Sankaranarayanan, D. De Angelis, J. Rothman, T. Ryan. The use of pHluorines for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J., 2000, 79, 2199-2208.
90. T. McAnaney, E. Park, G. Hanson, S. Remington, S. Boxer. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 2. Excited-state dynamics. Biochemistry, 2002, 41(52), 15489-15494.
91. H. Зубова, А. Савицкий. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. I. Сенсоры pH, ионов СГ, Са2+, Zn2+, Cu2+. Yen. Биол. Химии, 2005, 45, 391-454.
92. R. Richins, A. Mulchandani, W. Chen. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain organophosphorus hydrolase fusion enzymes. Biotechnol. Bioeng., 2000, 69(6), 591-596.
93. A. Mansee, W. Chen, A. Mulchandani. Detoxification of the organophosphate nerve agent coumaphos using organophosphorus hydrolase immobilized on cellulose materials. J. Ind. Microbiol. Biot., 2005, 32, 554-560.
94. R. Richins, 1. Kaneva, A. Mulshandani, W. Chen. Biodegradation of organophosphate pesticide by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nat. Biotechnol., 1997, 15, 984987.
95. M. Shimazu, A. Nguyen, A. Mulchandani, W. Chen. Cell surface display of organophosphorus hydrolase in Pseudomonas putida using an ice-nucleation protein anchor. Biotechnol. Progr., 2003, 19, 1612-1614.
96. M. Shimazu, A. Mulchandani, W. Chen. Cell surface display of organophosphorus hydrolase using ice nucleation protein. Biotechnol. Progr., 2001, 17, 76-80.
97. W. Chungjatupornchai, S. Fa-aroonsawat. Biodégradation of organophosphate pesticide using recombinant cyanobacteria with surface- and intracellular-expressed organophosphorus hydrolase. J. Microbiol. Biotechn., 2008, 18(5), 946-951.
98. C. Cho, A. Mulchandani, W. Chen. Bacterial cell surface display of organophosphorus hydrolase for selective screening of improved hydrolysis of organophosphate nerve agents. Appl. Environ. Microb., 2002, 68(4), 2026-2030.
99. D. Kang, J. Kim, H. Cha. Enhanced detoxification of organophosphates using recombinant Escherichia coli with co-expression of organophosphorus hydrolase and bacterial hemoglobin. Biotechnol. Lett., 2002, 24, 879-883.
100. Y. Kim, D. Kang, S.-S. Choi, J. Kim, J. Chung, II. Cha. Co-expression of bacterial hemoglobin overrides high glucose-induced repression of foreign protein expression in Escherichia coli W3110. Biotechnol. Lett., 2004, 26, 1173-1178.
101. W. Lan, J. Gu, J. Zhang, B. Shen, H. Jiang, A. Mulchandani, W. Chen, C. Qiao. Coexpression of two detoxifying pesticide-degrading enzymes in a genetically engineered bacterium. Int. Biodeter. Biodegr., 2006, 58, 70-76.
102. M. Shimazu, A. Mulchandani, W. Chen. Thermally triggered purification and immobilization of elastin-OPH fusions. Biotechnol. Bioeng., 2003, 81(1), 74-79.
103. C.-F. Wu, H. Cha, G. Rao, J. Valdes, W. Bentley. A green fluorescent protein fusion strategy for monitoring the expression, cellular location, and separation of biologically active organophosphorus hydrolase. Appl. Microbiol. Biot., 2000, 54, 78-83.
104. H. Cha, Ch.-F. Wu, J. Valdes, G. Rao, W. Bentley. Observations of green fluorescent protein as a fusion partner in genetically engineered Escherichia coli: monitoring protein expression and solubility. Biotechnol. Bioeng., 2000, 67(5), 565-574.
105. Ch.-F. Wu, J. Valdes, W. Bentley. Effects of in situ cobalt ion addition on the activity of a GFP-OPH fusion protein: the fermentation kinetics. Biotechnol. Progr., 2001, 17, 606-611.
106. Ch.-F. WU, J. Valdes, G. Rao, W. Bentley. Enhancement of organophosphorus hydrolase yield in Escherichia coli using multiple gene fusions. Biotechnol. Bioeng., 2001, 75(1), 100-103.
107. Ch. Li, Y. Zhu, I. Benz, M. Schmidt, W. Chen, A. Mulchandani, Ch. Qiao. Presentation of functional organophosphorus hydrolase fusions on the surface of Escherichia coli by the A1DA-I autotransporter pathway. Biotechnol. Bioeng., 2008, 99(2), 485-490.
108. Ch.-F. Wu, H. Cha, J. Valdes, W. Bentley. GFP-visualized immobilized enzymes: degradation of paraoxon via organophosphorous hydrolase in a packed column. Biotechnol. Bioeng, 2002, 77(2), 212-218.
109. К. Маркосян, Б. Курганов. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом. Биохимия, 2004, 69(9), 1196-1212.
110. В. van der Berg, R. Ellis, Ch. Dobson. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation. EMBOJ., 1999,18(24), 6927-6933.
111. M. Silow, Y.-J. Tan, A. Fcrsht, M. Oliveberg. Formation of short-lived protein aggregates directly from the coil in two-state folding. Biochemistry, 1999, 38(40), 13006-13012.
112. А. Вульфсон, P. Тихонов, С. Печенов. Общий подход к ренатурации рекомбинантных белков, продуцируемых в составе тел включения. Доклады А.Н., 2001, 380(3), 400-403.
113. N. Fawzi, V. Chubukov, L. Clark, S. Brown and T. Head-Gordon. Influence of denatured and intermediate states of folding on protein aggregation. Protein Sci., 2005, 14, 9931003.
114. S. Idicula-Thomas, P. Balaji. Protein aggregation: a perspective from amyloid and inclusion-body formation. Curr. Sci., 2007, 92(6), 758-767.
115. V. Uvcrsky, J. Li, P. Souillac, I. Millett, S. Doniach, R. Jakes, M. Goedert, A. Fink. Biophysical properties of the synucleins and their propensities to fibrillate. J. Biol. Chem., 2002, 277(14), 11970-11978.
116. S. Reuveny, Y. Kim, C. Kemp, J. Shiloach. Effect of temperature and oxygen on cell growth and recombinant protein production in insect cell cultures. Appl. Microbiol. Biot., 1993, 38, 619-623.
117. S. Hong, S. Lee. Importance of redox balance on the production of succinic acid by metabolically engineered Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biot., 2002, 58, 286-290.
118. M. Kosinski, U. Rinas, J. Bailey. Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside influences the metabolism of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biot., 1992, 36, 782-784.
119. L.-F. Vallejo, U. Rinas. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb. Cell Fact., 2004, 3, 11-22.
120. P. Тихонов, С. Печенов, А. Гуревич, P. Есипов, В. Швец, А. Вульфсон. Методы получения рекомбинантных белков-цитокинов IV. Ренатурация рекомбинантного человеческого интерлейкина-3. Бгюорг. Хгш., 2001, 27(1), 40-44.
121. A. Middelberg. Preparative protein refolding. TRENDS Biotechnol., 2002, 20(10), 437-443.
122. A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schleg. Folding and refolding of proteins in chromatographic beds. Curr. Opin. Biotech., 2004, 15, 487^94.
123. G. Lemerciera, N. Bakalara, X. Santarelli. On-column refolding of an insoluble histidine tag recombinant exopolyphosphatase from Trypanosoma brucei overexpressed in Escherichia coli. J. Chromatogr. B, 2003, 786, 305-309.
124. K. Glynou, P. Ioannou, Th. Christopoulos. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Protein Exprès. Pari/., 2003, 27, 384-390.
125. V. Lozinsky, I. Galaev, F. Plieva, I. Savina, H. Jungvid, B. Mattiasson. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends Biotechnol., 2003, 21(10), 445-451.
126. D. Riesenberg. High-cell-density cultivation of Escherichia coli. Curr. Opin. Biotech, 1991,2(3), 380-384.
127. H. Markl, C. Zenneck, A. Dubach, J. Ogbonna. Custivation of Escherichia coli to high cell densities in a dialysis reactor. Appl. Microbiol. Biot., 1993, 39, 48-52.
128. S. Lee. High cell-density culture of Escherichia coli. Tibech March, 1996,14, 98-105.
129. Б. Глик, Дж. Пастернак. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. 2002, М: Мир, 128 с.
130. S. Lee, H. Chang. High cell density cultivation of Escherichia coli W using sucrose as a carbone sourse. Biotechnol. Adv., 1993, 15(9), 971-974.
131. J. Lee, S. Lee, S. Park. Fed-batch culture of Escherichia coli W by exponentional feeding of sucrose as a carbon sourse. Biotechnol. Tech., 1997, 11(1), 59-62.
132. D. Korz, U. Rinas, K. Hellmuth, E. Sanders, W.-D. Deckwer. Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. J. Biotechnol., 1995, 39, 59-65.
133. S. Lee, K. Yim, H. Chang, Y. Chang. Construction of plasmids, estimation of plasmid stability, and use of stable plasmids for the production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant of Escherichia coli. J. Biotechnol., 32, 203-211.
134. D. Fan, Y. Luo, Y. Mi, X. Ma, L. Shang. Characteristics of fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA at different specific growth rates. Biotechnol. Lett., 2005, 27, 865-870.
135. S. Kwon, S. Kim, E. Kim. Effects of glycerol on b-lactamase production during high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Progr., 1996, 12(2), 205208.
136. Y.-C. Liu, L.-C. Liao, W.-T. Wu. Cultivation of recombinant Escherichia coli to achieve high cell density with a high level of penicillin G acylase activity. Proc. Natl. Sei. Counc. ROC(B), 2000, 24(4), 156-160.
137. J. Shiloacha, R. Fass. Growing E. coli to high cell density A historical perspective on method development. Biotechnol. Adv., 2005, 23, 345-357.
138. J. Lee, S. Lee, S. Park, A. Middelberg. Control of fed-batch fermentations. Biotechnol. Adv., 1999, 17, 29^8.
139. T. Suzuki, T. Yamane, S. Shimizu. Phcnomenological background and some preliminary trials of automated substrate supply in pH-stat modal fed-batch culture using a setpoint of high limit. J. Ferm. Bioeng., 1990, 69, 292-297.
140. В. Kim, S. Lee, S. Lee, Y. Chang, H. Chang. High cell density fed-batch cultivation of Escherichia coli using exponential feeding combined with pH-stat. Bioprocess. Biosyst. Eng., 2004, 26, 147-150.
141. D. Riesenberg, R. Guthke. High-cell-density cultivation of microorganisms. Appl. Microbiol. Biot., 1999, 51, 422-430.
142. J. Cutayar, D. Poillon. High cell density culture of E. coli in a fed-batch system with dissolved oxygen as substrate feed indicator. Biotechnol. Lett., 1989, 11, 155-160.
143. D. Riesenberg, K. Menzel, V. Schulz, K. Schumann, G. Veith, G. Zuber, W. Knorre. High ccll density fermentation of recombinant Escherichia coli expressing human interferon alpha 1 .Appl. Microbiol. Biot., 1990, 34, 77-82.
144. S. Bauer, J. Shiloach. Maximal exponential growth rate and yield of E. coli obtainable in a bench-scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1974, 16, 933-941.
145. M. Бакулин. "Голубая кровь" нужна микробиологам и биотехнологам. Рос. Биомед. Ж, 2004, 5(81), 240-241.
146. J. Shiloach, S. Bauer. High-yield growth of E. coli at different temperatures in a bench scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1975, 17, 227-239.
147. S. Bauer, E. Ziv. Dense growth of aerobic bacteria in a bench-scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1976, 18, 81-94.
148. K. Lowe, M. Davey, J. Power. Perfluorochemicals: their applications and benefits to cell culture. Trends biotechnol., 1998, 16, 272-277.
149. A. King, B. Mulligan, K. Lowe. Perfluorochemicals and cell culture. Nat. Biotechnol., 1989, 9, 1037-1042.
150. T. Wong, T. Ho. Retained perfluorodecalin after retinal detachment surgery. Int. Ophthalmol., 1997,20,293-294.
151. A. Chernykh, A. Leont'evstii, L. Golovleva. New approaches to increasing the yield of Laccase from Panus tigrinus. Appl. Biochem. Microbiol., 2005, 41(5), 508-511.
152. M. Bakulin, V. Zakharov, E. Chebotarev. Intensification of microbial degradation of crude oil and oil products in the presence of perfluorodecalin. Appl. Biochem. Microbiol., 2004, 40(3), 266-271.
153. M. Bakulin, A. Grudtsyna, A. Pletneva. Biological fixation of nitrogen and growth of bacteria of the genus Azotobacter in liquid media in the presence of perfluorocarbons. Appl. Biochem. Microbiol., 2007, 43(4), 399-402.
154. M. Bakulin, A. Grudtsyna, A. Pletneva, A. Kuchcrenko, A. Lyapustin, I. Malakhov. Effect of perfluorodecalin, carbogal, and perfluoromethyldccalin on growth and ice-forming activity ofbacteria. Microbiology, 2006, 75(3), 312-316.
155. D. Damiano, S. Wang. Novel use of perfluorocarbon for supplying oxygen to aerobic submerged cultures. Biotechnol. Lett., 1985, 7(2), 81-86.
156. D. Chandler, M. Davey, K. Lowe, B. Mulligan. Effects of emulsified perflourchemicals on growth and ultrastructure of microbial cells in culture. Biotechnol. Lett., 1987, 9(3), 195-200.
157. L. Brownlie, J. Stephenson, J. Cole. Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101 (pATl53). J. Gen. Microbiol., 1990, 136, 2471-2480.
158. V. Bugeja, M. Kleinman, P. Stanbury, E. Gingold. The segregation of the 2 mu-based yeast plasmid pJDB248 breaks down under conditions of slow, glucose-limited growth. J. Gen. Microbiol., 1989,135, 2891-2897.
159. C. Keevil, B. Spillane, N. Major. Plasmid stability and antibiotic resistance of Neisseria gonorrhoea during glucose-limited continuous culture. J. Med. Microbiol., 1987, 24, 351-357.
160. U. Horn, M. Krug, J. Sawistowski. Effect of high cell density cultivation on plasmid copy number in recombinant Escherichia coli cells. Biotechnol. Lett., 1990, 12(3), 191-196.
161. В. А. Жданов, В. M. Кошелев, В. К. Новиков, А. А. Шувалов. Методы уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ. Рос.хим.журнал, 1993, 37(3), 22-25.
162. Дегазирующая рецептура и способ ее получения. Патент РФ на изобретение №2288016, 2005.
163. Способ уничтожения боеприпасов, снаряженных фосфорорганическими отравляющими веществами и имеющих в корпусе технологические резьбовые отверстия. Заявка на выдачу патента РФ №2006133269, 2006.
164. К. LeJeune, A. Mesiano, S. Bower, J. Grimsley, J. Wild, A. Russell. Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agent degradation. Biotechnol. Bioeng., 1997, 54(2), 105-114.
165. J. Kolakowski, J. DcFrank, S. Harvey, L. Szafraniee, W. Beaudry, K. Lai, J. Wild. Enzymatic hydrolysis of the chemical warfare agent VX and its neurotoxic analogues by organophosphorus hydrolase. Biocatal. Biotransfor., 1997,15, 297-302.
166. V. Rastogi, J. DeFrank, T.-C. Cheng, J. Wild. Enzymatic hydrolysis of Russian-Vx by organophosphorus hydrolase. Biochem. Bioph. Res. Co., 1997, 241, 294-299.
167. Chemical and/or biochemical decontamination system. Patent WO 01/56380 Al, 2001.
168. Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase. Patent US 5589386, 1996.
169. Способ ферментативного гидролиза фосфоорганических боевых отравляющих веществ. Патент РФ на изобретение №2296164, 2007.
170. V. Sergeeva, E. Efremenko, G. Kazankov, S. Varfolomeev. Double effect of organic amines (activation and inhibition) on the phosphotriesterase. J. Mol. Cat. B-Enzym., 2000, 10, 571-576.
171. S. Hong, S. Lee. Metabolic flux analysis for succinic acid production by recombinant Escherichia coli with amplified malic enzyme activity. Biotechnol. Bioeng., 2001, 74(2), 89-95.
172. S. Lec, H. Chang. Effect of complex nitrogen source on the synthesis and accumulation of Poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli in flask and fed-batch cultures. J. Environ. Polim. Degr., 1994, 2(3), 169-175.
173. И. Логинов, E. Морозова, А. Брильков. Математическое моделирование автоселекции микробных популяций при субстратном ингибировании их роста в непрерывной культуре. Вестник КрасГУ. Серия физ.-мат. науки, 2005, 1, 44-49.
174. А. Шуваев, А. Брильков. Стохастическая модель внутриклеточной динамики многокопийных бактериальных плазмид с учетом контроля репликации. Мат. Биол. Биоинф., 2007, 2(1), 66-72.
175. Active topical skin protectants using combinations of reactive nanoparticles and polyoxometalates or metal salts. Patent US 6410603, 2002.
176. Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds. Patent US№ 6642037, 2003.
177. К. Е. LeJeune, В. С. Dravis, F. Yang, A. D. Hetro, В. P. Doctor, A. J. Russell. Fighting nerve agent chemical weapons with enzyme technology. Annals. NY Acad. Science, 1998,864,153-170
178. К. E. LeJeune, J. R. Wild, A. J. Russel. Nerve agents degraded by enzymatic foams. Nature, 1998,392,27-28
179. P. L. Havens, H. F. Rase. Reusable Immobilized Enzyme/Polyurethane Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. Ind. Eng.Chem. Res., 1993,32 (10), 2254-2258.
180. К. E. LeJeune, A. J. Russell. Biocatalytic nerve agent detoxification in fire fighting foams. Biotechnol.Bioeng., 1999, 62 (6), 659-665.
181. Protective and/or camouflage material. Patent US№4781959, 1988.
182. I. B. Wilson, J. Dayan. The free energy of hydrolysis of phosphoryl-phosphatasa. iochemistry, 1965, 4 (4), 645-649
183. Y. C. Yang, J. A. Baker, J. R. Ward. Decontamination of chemical warfare agents. Chem. Rev., 1992, 92, 1729-1743.
184. R. Ramaseshan, S. Sundarrajan, Y. Liu, R. S. Barhate, N. L. Lala, S. Ramakrishna. Functionalized polymer nanofibre membranes for protection from chemical warfare stimulants. Nanotechnology, 2006, 17, 2947-2953.
185. Клонирование ДНК. Методы. Ред. Д. Гловер. 1988. М.: Мир. 162 с.
186. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование 1984, М.: Мир. 239 с.
187. М. М. Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254.
188. С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. Учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов. М.: Высш. шк„ 1990, 296 с.
189. Ch. Lei, М. Valenta, К. Saripalli, Е. Ackerman. Biosensing paraoxon in simulated environmental samples by immobilized organophosphorus hydrolase in functionalized mesoporous silica. J. Environ. Qual., 2007, 36, 233-238.
190. D. Curiel, J. Engler. Ligands added to adenovirus fiber. US Patent №6683170B2, 2004.
191. D. Borhani, D. Rogers, J. Engler, C. Brouillette. Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 12291-12296.
192. L. Roberts, M. Ray, T.-W. Shih, E. Hayden, M. Reader, C. Brouillette. Structural analysis of apolipoprotein A-I: limited proteolysis of methionine-reduced and -oxidized lipid-frec and lipid-bound human apo A-I. Biochemistry, 1997, 36(24), 7615-7624.
193. Основы общей биологии. Ред. Э. Либберт. М.: Мир. 1982. 422 с.
194. E. Efremenko, Yu. Votchitseva, T. Aliev, S. Varfolomeyev. Expression of recombinant organophosphorus hydrolase in active form. 2004. In: Biocatalytic Technology and Nanotoxicology (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers, Inc., 65-71.
195. Y. Zhang, R. Autcnrieth, J. Bonner, S. Harvey, J. Wild. Biodégradation of neutralized sarin. Biotechnol. Bioeng., 1999, 64(2), 221-231.
196. S. Gaberlein, F. Spencr, C. Zaborosch. Microbial and cytoplasmic membrane-based potentiometric biosensors for direct determination of orgdnophosphorus instcticides. Appl. Microbiol. Biot., 2001, 54, 652-658.
197. D. Spoel, E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. Mark, H. Berendsen. GROMACS: fast, flexible, and free. J. Comput. Chem., 2005, 26(16), 1701-1718.
198. A. E. Любарев, Б. И. Курганов. Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биол. Хим., 2000, 40, 43-84.
199. W. D. Kumler, J. J. Eiler. The ultraviolet absorption spectra and resonance in benzene derivatives-sulfanilamide, metanilamide, p-aminobenzoic acid, benzenesulfonamide, benzoic acid and aniline. J. Am. Chem. Soc. 1943, 65(12), 2355-2361.
200. В. В. Шелковников. Расчеты ионных равновесий в химии: Учеб.-мет. пособие. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006, 70 с.
201. J. Pandey, P. Gorla, В. Manavathi, D. Siddavattam. mRNA secondary structure modulates the translation of organophosphate hydrolase (OPH) in E. coli. Mol. Biol. Rep., 2007, DOI 10.1007/sl 1033-007-9200-5.
202. M. Li, Z.-G. Su, J.-С. Janson. In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Exprès. Purif., 2004, 33, 1-10.
203. H. Wong, Y. Kim, S. Lee, H. Chang. Effect of post-induction nutrient feeding strategies on the production of bioadhesive protein in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 1998, 60(3), 271-276.
204. В. К. Гореленков, В. Я. Онойко, Ю. П. Соболев, С. JI. Шашков. Пути создания материалов для перспективной боевой экипировки мирного и военного времени военнослужащих общевойсковых подразделений Российской Армии. М.: ВУ РХБЗ, 2001, 166 с.
205. Г. Я. Легин, Н. М. Шехтман, В. М. Андреев. Консервация косметических изделий и эффективные современные консерванты. 1983, Вып. 3, с. 1-36.
-
Гудков, Денис Андреевич
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.23
- Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства
- Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты
- Лектиноподобные белки хлорофилл-белковых комплексов Dunaliella salina
- Компьютерный анализ взаимосвязи структура-активность/ свойство в семействах родственных и мутантных белков
- Растворимая гаунилатциклаза тромбоцитов. Роль гема в функционировании фермента
