Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение мутантных вариантов гамма интерферона человека и исследование их свойств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение мутантных вариантов гамма интерферона человека и исследование их свойств"

ОД

3 ЛПР 19Г5 на правах рукописи

СМИРНОВА Ольга Юрьевна

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ГАММА ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой^. степени кандитата биологических наук

Кольцово-1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструкторско-технологическом институте биологически , активных веществ Государственного научного центра ■ вирусологии и,-биотехнологии "Вектор". . . .

кандидат химических наук Татьков С.И. • ' . кандидат биологических наук. Ильичев ¿.А:

доктор химических наук профессор'Малыгин Б.Г. доктор биологических наук профессор Вагребельный С.Н.

Новосибирский' институт биоорганической химии. СО РАН ■ '

Защита состоится 2995 'г. в _д_ часов

. на заседании диссертационного совета К 098.03.01. ■ в НИИ молекулярной биологии (633159, п.Кольцово Новосибирского р-на Новосибирской обл.) :

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке • НИИ молекулярной биологии Государственного центра -вирусологии и биотехнологии "Вектор".

■ Автореферат разослан с^Ц^7* 1995 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь* диссертационного совета кандидат химических наук

- / / / • 1 Сл ¿У/-' Шубина. Т.Н.

Г.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблзмз.

Рексмбйнонтнкй гамма-интерферон человека являет:я перспективным препаратом для лечения ряда заболевания. В последнее время получены обнадеживающие результата при использовании гамма-интерферона в терапии онкологических заболеваний, ревматоидного артрита, висцерального лейшманиоза и т.д. Однако как лекарственное средство, белок имеет существенный недостаток, связанный с его еысокой лабильностью: он быстро теряет активность под влиянием денатурирующих'факторов, б частности, температуры, низких значений рН, легко подвергается протзолпзу в крови организма человека, нестабилен при хранении. Все это делает достаточно актуальной -зздачу конструирования генно-инженерных аналогов рекомбшантного гамма-антерфзронз; облада-шх . большей стабильностью. Стабильность молекула 7-интерферона можно попытаться повысить за счет усиления взаимодействия между суОь'единицаки его димарнай молекулы путем введения аминокислотных ' замен, способствующих образованию дополнительных связей. '".'Протеолихическу®.' нестабильность 7-интйрферона вероятно возможно . снизить, модифицируя наибо-'лее.чувствительные к действию'Протеаз'участки молекулы.- Получение подобных аналогов 7-интерферона макет привести к создании препаратов с улучшенными медико- .'биологическим:!- и технологическими характеристиками. '

■ - Цель работы'. -. ••-.'.-- . .Цель настоящей работа. ■ заключалась. а . получении методом олигонуклеотидпапразлениого мутагенеза »одафашровзхтяых вариантов иммунного интерферона человека, потенциально обладающих большей стабильностью.

■ Научная новизна и практическая ценность работа.

Получен мутан'тный вариант 7-интерферона человека, содержащий аминокислотную замену Ser5l на Азр51локализованную в структурообразующей области молекулы (мутант S5I). Епоугаз ■показано, что мутация в данной области молекулы гаммз-■.интерферона на нарушает, пространственную структуру ' белка к

приводит ic повышению в десять раз удельной антивирусной активности бежа.

Получен ряд мутантнь-х 7-иЕтерфбронзв человека, солеркшс аганокислотше зареви к делении б С- концевой области молекулы, коте pue приводят к изменению сайтов лретеелкзе к уменьшения es оологжтельного заряда. Показано, что все С-коше бы; варианты сохранили слизкий к исходному уровень антивирусной активности. При ото:,», аналоги -р-внтерф?рона, таеяекв изменение в сайтах протоолнза (В24, ЕЗВ, ДЮ), характеризуются бол*-г вцсскюл уровнем хфотбожтйчезкэб устоЯчивостя к тришжюподое-кш протеазам и протеззе Е. coll ûmpF. Установлено также, что уменьшение положительного заряда С-ьхчщзвоД области •}-кзтерЗ>5рэна вследствие Еведония мутаивй способствует переходу белков е растворимую наткшую форму. Впервые получены мутз-птнне варианты гакма-инуврфзрона человека tB38 и ДЮ), соче-такта? пра сохранении исходного уровня биологической активности повышенную кротеолктическук стабильность с раствор.г.нотко в бактериальных клетках.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены ка I Всесоюзной конкуренции Тензк человека" (Шреяславль-Ззлосскяй, 19ЭСГ ) ; на Всесоюзной кокфзpéкник "Современные аспекты применения интер-фероноз и яруги*. имлунокодуллторов",(Киев, 19Ыг>; на Международное си:лтозпуке "Ksiiical Biîteotoc-loçy, Ireunlzatioa and AIL'S", (Ленинград,^! 1. По материала;,: диссертации! опубликован). Г. статьи, I заявка, к тезисы 2 докладов.

ооьс'м к структуре дяссстгеацс:.

.Диссертация изложена на страницах „-а^шописпого Tî.k: -та, вклйчая 25 рисунков и z таблицы, и состоит и" вводите, обзора литературы, описания материалов к методов, результат:.', и обсуждений, вкводов и списка цитируете!; литературы наименований).

П.СОДЕРлАКŒ РАВОТН.

Для проведения олигонуклеотидноггрЕвлс-ш-юг'с мутагенеза ген гаж'.а-интзр+срона Сил клонирован из пла-гдадь' piiN-f-tri^

(БтсгсИсу е!;.а1.,! 337) в'ДНК фага зпзтрз пз сайгзм ЗсоНХ Р&ЪТ. Полученную од?;оаз1:оч8'Еую й:.К м! 3 7- »юподьаоЕазз,!

для мутагенеза по Золлзру и Сг.сту. Структуры ожгснухлзо грхсв-мугагеш-в, испалазснааних хяя пслучагзпл мутаций, приведена па рис.I.

вариант структура о„ъ1гснук,лзо7и.г.а

351 5' ~ л а^г аааазх ста'аз I гл^

3! 3-5 5 '-с§азаса2са^с5о1о?со

338 5' -еЪ^ао tocт;ggзtc:•ottc:oo Б3~

Гис.1. Структура слагокук.таотдаов-.'.тггогзЕоз, пспо^ьзсв-ита::

Лрй ПСЛУЧ-ЭНП? ЕНЭДОГСЗ

Отбор мутантных Фагса осуаестазялг гисрккззия1»:! о.-итгсау-клвоткда-мутаггка с фаговой дек и с атмаяхеД зетроагглягэьиэгэ фдотря при псстепе-шсм локекпйд ??.мгг-#рагуры раствора, клонов, дзксзк более сидышЯ птесйлязашснпкй ситная. опсзс-нв-рзвояк ко метолу Сенгера.

Длл окс1греос;т2 мутант:ш:с голссв • сзотзв-гсггуга:;? гнин зсзврздали е плзэдшхя вектор рхгп-т-^грз. ■ еактор^зл'гй-кс-лонет, сол5рх;за1м плаажды с чутзптъкм гоном ¡штерфероня, зклв-лялп рв'лрккшсшшч энздг.зсч я гиЗрютзацязЗ с радктс-акгкв -нам ;-о пег: саслантах ссруазур-: муза-

:пчгу:з г- кзъ саг-ьок^ааажтом 13к ггл-зс^ида

мз т згу " ака а - Г 'длс-о р т -з.

3. "уга^гпь'Я -кктзрессснз - зо'^р.зн> • „а"'-1''

чзниз- .г ."Г-^с^ОиСГЗ.

Зз анализа дитерат/шсс са;ш;«:: .*»'-.":, ч?а а м-з.Т':уу.ча-"■а^а-^чгзрЗарача ''чаз":::-; 33-"' , з :••"! з ас-юг."::--:

. за ''ьлгал-: з ''а!-^'}, н~ н-"':Ос~ад-зтззннс 5 Г:.:

:;п::; а з\а-т\г'.млаттзза^. 3 згруутур-гыз да'зказ

Иск ег.а1. ,1991 ] свидетельствуют о том,.что эта область расположена внутри белковой глобулы, причем а - спирали С обеих

Рис. 2 Схема ра&кмедгйсгеми сльфа-сиарапей г дккс&е регом;;нни«1ы?[й гамма ннгср'фероня чепозска.

Аяьфя-стфвпк «звйрвжсны еругкмк (черными огмечены М-К01К1Ы. GcJlUMH - С-гаНЦЫ Cr?i;; ftr»C!*:j. стхн Аимкрз. рзсполажеккык над плогжпыья рисукка. пвю-. заиы cnnojjsiLiMM линиями. рвелзяежганыг под пяэскостыо - прерывистыми. Штрнхем огмгчеку алыра-е/жрггда отпрей суЬьедиккцы лямера. '

субьедияиц сближены а пространстве, следовательно, взаимодейс твие их играет, определённую роль в образовании и- поддержании'-, структуры диме'ра (рис.2). Введение в данную' область, мутации, вызывающей образование дополнительных связей;.мокет способствовать стабилизации дамерного состояния молекулы.

Теоретический анализ по выбору аминокислотных'- замен пока- . вал,- что'-в' альфа-спирали С возможен ряд замен, которые потен- -" цпально могут способствовать стабилизации гамма - интерферона. В частности, заслуживают внимания аминокислотные остатки Gin- .

"-б, SeriT, Gin-t8, 5er51 з связи с их оптимальным положением а

____D Н К I М Q S Q I 7 S F Y F К L ? К N ? К----

45 55

Рие.З. Амизскислотная последовательность ríu-r-If;«T з ссласта

ааК'з-спирали С (41-61 амжокяслс гкне остатки). Отмечена лс.тс-

•кггг.пыю заряженные зинскисдсты.

центр-э алъОз-спирали С. Замена какого-либо из них на стрпцо."-э-льнс ззрджетше аминокислоты ¡аспарагиксвую или глутзминозукЯ, чсхсТ гривестп к зоззаановвниа доталнктедьйзх сслевих мостик; з за счет ззаимедэйствая с подежгг-элъно заряженным агангк^сдсг-нштк остатками на íí-л С-кснцах спирали ;p:ic.3),

3 ззстсящей работе с целью стабз-гизаипи дамерз хктеэ&госка осуществлена замена Ззг51 на Asp. Ссстзетствулг:.*.

50

7-Ш Из tGltíertlíiIisValSSEPheTyrPheLyale'JrheLysAsr.

ЛГЗСАСАСССАААГТС"СТССТ™ГТАСХ1'САААСТТТТТАААААС

3'- ggtttaacasGTgaaaatgaag »*

55 i aetGlnSerGlnXieValASPFhelyrPhelorsIsuSheLysAa:

AíuCAGAGCCAAATTGTCgacTTTTACT-GMACÍiTTTAAAAAO i **~* i Salí

íüc.4. Схема получения мутации .351. Приведены: ípamear пукле-этиднеа и аминокислотная последовательности гамма- интерферон" з области мутадга £51, олигенуклеотид - мутаген. Подчеркнута изменяемые колонн л аминокислоты. Неспзренпке сснсззкил д структура олигскуклеотидз отмечены езездечкзмк. Отмечен везчн-K'j^Tjiít при му^аг-незе С2йт рестрикции Sail.

мутантп^Я гон гучал:: о использованием c.r.'.vv.z"^.-'':г ддз с'-rsafStaaaajgtci:».:taítí^e- "-1 рисункэ 4 пргмдгпз :"лукн:..-; м-;п:з« ЗЫ. Зчтем мутенппгй ген 351 роклекирзвип з ;-к:псгО--и:-::.':-. . IFH-?-'.rp¿. Усоп-кь э:<спр?:сйя чутзягного " н> изменился в сроьнонгг;: с гкспсо ?-:¡<e¡5 и по-

суш,«.арного клеточного

дногс интерферона и составлял 15-20% от белка в E.ooli мн-1.

Мутантнкй белок БЬКэоферсн) был очщен до гомогенного

состояния. Антивирусная активность белка в результате введения

мутации не только не снизилась, напротив, составила 2*М8

Мэ/мг, т.е. была в Ю раз выше, чем у рвкомбинантного гамма-

интерферона. Повышенная биологическая активность эсферона

побудила нас более подробно исследовать его' физико-лимкческие свойства.

Исследование пространственной структуры мутантного 7-интерферона проводили методами КД-спектрофотометрии и флуоресцентной спектроскопии-. Спектры кругового дихроизма эсферона оказались идентичными спектрам исходного рекомбинантного 7-интерферона, что свидетельствует об отсутствии существенных изменений в нативной структуре белка (рис. 5).

Рис.5. Спектры кругового дихроизма очищенных белков Hu-7-IFN; В - эсферон.

А -

Косвенное•подтверждение сохранения третичной структуры молекулы эсферона было получено также при определении экспони-рованности остатков тирозина и триптофана по тушению их флуоресценции в присутствии йодистого калия. Как.видно из рисунка

6, тушение флуоресценции триптофана происходит с одинаковой скоростью для 7-1Ш и эсферона. В тех же условиях эффективность тушения, флуоресценции тирозина выше для эсферона. В молекуле 7-Ш1 содерлштся единственный остаток триптофана в 36 положении и 4 остатка тирозина в позициях 4, 14, 53 и 98. Поскольку один из тирозиновых остатков расположен в непосредственной близости к месту мутации (Туг53), увеличение эффективности тушения для тирозина скорее всего означает некоторое локальное изменение конформашш вблизи мутации, связанное с усилением экспонированности именно данного остатка тирозина. В целом жэ конформация мутантного белка не претерпела значительных .изменений, поскольку экспонированность триптофанэв в молекулах мутантного и исходного интерфероноз совпадает.

Рис.6. Зависимость интенсивности флуоресценции рзствора эсферона от концентрации йодистого калия (KI). Незаполненными знаками отмечено тушение • флуоресценции тирозиноЕых остатков йодистым калием; заполненными - тушение флуоресценции трипто-фановых остатков ( Q - рекомбинантный гамма интерферон, Л-мутантный аналог эсфорон). Штамм S - эсферон.

Таким, образом, замена GertI на Asp в С-спирали RuiFN- г привела, по-видимому, к незначительному локальному изменению конформации и одновременно к существенному, (в 10 раз), псбы-гаешно антивирусной активности молекулы. Известно, что биологи-

чески активными являются исключительно джерные молекулы гам-ыа-интерферона. Вероятно, введенная мутация стаовлигкруе? димернэе состояние и сдвигает равновесие в сторону образования димероь, т.е. активной формы рекомбинанткого ^-интерферона, г результате чего прсязходит повышение удельнсй биологической активности есф-арона б сравнении с исходным гамма-интерФероно!/:.

'¿. Муташа: О-концеьоД области 7-интерферсна, их получение г, исследование свойств мутантам., бедгоБ.

Млккула гзкма-гнтерфгf?нь человека содержат ьескслена сгйтоь узд&веюм трисиьопс-доониш! прот^азжи, два из которые: 'КШг и E?.; ps'jno^citóHS на с-юнце и наиболее достугав протва-га-г. Известно,что гияролиг молекул! интерферона по сайту щр, прпвадит к резкому падешь ее биологической актигности Ura->awa ег.а1.,19»6]. Вероятна, уотоСчивосп молекулы гамма-пнтерферояа к гаактивации тритгизоподоОнымк ерэтеаздки удалось Си супестьенно повысить, сделав уото&члшгя! к гидролизу прежде acero kker я sr сайты. Однако существует некоторые ограничения на гш&ш г- этих участках, поскольку, например, полная замена рапастера КНКР. на ssss привала к значительному- аадеяи» Оизлотк-4¿ской активности интерферона [De Каза et.ai., 1937). Видимо, не следует стремиться к их полной ликвидшяа, но провеете частичную замов?- яолскитеяьно заряженных амкнгжи&вс.тшх осты-ко-: в даннкЕ кластерах прелстааляется иолзссоорагна*. паск:ль-ку в атом случае кспаэ овдать суЕ-зетв'клогэ- скакения скорсстп гидролога молекулы триленноподобныгл;: гтретеайемк и в токе apeas-, сохранения ы- биологической активности.. ¡¿змены в кластерах ¿XSP. 7. КГ. secryx такке повисит: устойчивость реком.-инантнаг: 7-кнте[>ф?рсна z а лкзатах s.ocli, поскольку имеьиаяс« ь протеаза expi, ассоцшфоьеккзь с ба;:терг.альноС щ-мбрзнсС, при разрушении бактериальны?- í^otcic гидролкзует квтерфероь кмгяьс го st¡;n: сайты.'., кнактивкруя егс íSiJglxurá at.&i.,l9Bf.',.

Рекомбкнапт.чые ск-лкк, акспрессированные в бактериях, часта образую? "'ельце е.члкчрккя, т.е сивтрзируютсд. í. нер.'гтв.'-рккой и неактивней jopee. Освободить е^лкк из телец ге^апсеагя могло -только воздействием сильных хаотролних ризт'ектоь и поо-ледуцее корректное восстановление их натиенэй коифоркзиа»; составляет одну из проблем современной биотехнологии. Рекомбг-

: хед.вечеек;:?. гамма - интерферон иск биосинтез^ е- £.

:а;л:е находится в виде нерастворимых телец включений к колуч-ние еги кутанных вариантов, находящихся в клетках пгз?/-мов-грсдупснтов в растворенном (нативном; состоянии. достаточно актуально. Поскольку положительно ззрлкешш? кластера к-. 0-кснке "¡-интерферона могут играть Еаныую роль в образовании тел-ц включения tWetcel et.&i., 1 3, замена аминокислот;.: остатков в них на отрицательно с зрякенные или нейтральны-кохкт способствовать биосинтезу мутантного интерферона » егл*--. бидизнрсванцой форме.

Исходя из этих соображений, был получен ряд мутантных "»-интерферснов человека, содержащих а;лшоклслотн;;е гзкеш и делеции в С- концевой области молекулы, которые приводят к изменении сайтов протеолиза и ук>.»нызего:ю ее поло^тельнот: заряда, а также исследованы свойства мутантных белков.

3.1.Получение мутаций С-концевой области.

Схема получения мутантов была сплакяровшз таким образок, что позволяла, используя три елпгонуклеотида, получить пять мугентных вариантов, их структура представлено на ркс.7. При мутагенезе вариантов В24 к В38 появляются сайты рестрикции Hamííl, что позволяет получить дополнительно аналог ¿¡с путем гидролиза ДК двойного мутанта рестркктазой banáil и по злел ьгго лпгирэвания реакционной смеси. Уровень экспрессии аналогов в плазмидном векторе существенно не отличался от зкспрес-сии рекомбтгнантного интерферона и составлял I5-2C? от гу:л::.г-котс белка.

2-2. исследование биологически;, и ¿изпко-хпмнчески: •

■>конце вых 2§гты1Т-ов.

Антивирусная активность очизгенных мутавткке г была

одинакова в гггеделзх экспержентальной сех'ки и отставляло ::.3-l .9,-JÜ' '¿Е/мг, т.е. была cpot-irnvo о активн.л-':: pL-r.ov:o-контяогс гамма-интерферона Утагл..' 4.

Так как мутации E3S и bZi изменяет кластере ПНУУ и yj. а в варианте Д10 данные класт-ры частично удалены, нсе.';е девали устойчивость этих мутантних белков к гидролизу трипсином и протеазой OtripF. Было показано, что дл» мутанта Б24 характер;]:

130 .но

1РЫ-7 ЬузАг§ЬузАг§3егС1пМе 1; ЬеиРЬе Аг£С1уАг^Аг§А1аЗеК! 1п ААСССАААААССАСТСАСАТССТСТТТССАСОТССААСАСОАТСССАСг .

В24 LysAгgLysAгgЗeгGlriMetLeuPheAгg(JlyglJгЗeгAlaSeгGln ААСССАААААССАаТСАСАТаСТСТТТССАаСТвСА1ссаСАТСССАС

ЕашН1

ВЗЗ L:y-sglySeгAгg5eгGlrЛetLeuPh.eAгgGlyAr•gAгgAlaSeгGln AAGgGAtccAGGAGTOAGATGCIGTlTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAG ВагаН1

В92 I^ysglyssгArgSer,GlnMetLeuPheAгgGlyglyseГAlaSeгGln

ААСвСАгссАССАСТСАаАТССТСТТТ0САСет§СА1ссаСАТСССАС

ВашЫ1 ВашН!

ДЮ X^ysglyзeгAlaSeгGln AAGgGAtCcGCATGCCAG

ВашН!

4133 IlУsAгgI^yзAгgSeгgluMetLeuPheAгgGlyAгgAгgAlaSeг,Glп ААСССАААААССАОТвАСАТССТСТТТССАааТССААСАССАТСССАО -

Рис.7. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность С-концевой области НаШ?~7 и мутантных вариантов.Выделены строчными буквами нуклеотидные и аминокислотные. замены. Отмечены возникающие при мутагенезе сайты рестрикции.

отсутствие гидролиза ОтрР по сайту НН, В38 - не расщепляется протеазой по кластеру ШЖН, тогда как аналог ДЮ устойчив к ггротеазе СшрР по обоим сайтам. Кроме того, показана устойчивость к трипсзиу мутантов В23 и ДЮ в условиях ограниченного

протооллза (риг.З).

¡кмс-нение сайтов гидролиза для бактериальной протеазы у мутантов БЗЗ и ДЮ оОеспэчивает устойчивость к ее действию и со с дзот определенны-; гфоимущостза при выделении их из клеток 2..:. 11, Еолшзл устойчивость к трипсину означает, скорее все-

Таблица I.

Антивирусная активность мутантных гамма-интерферонов, содержащих мутации в С-концевой области.

вариант антивирусная активность 'мг

. 7-XPN 1 .9 + 0.8 х ю7

Б24 1 .7 + 0.4 х ю7

Б38 1.9 + 0.6 х ю7

AI0 1.3 + 0.5 х ю7

Q133 1.5 + 0.7 х ю7

го, пролонгированность действия соответствующих препаратов аналогов гамматинтерферона при их терапевтическом применении, так как основной вклад в Инактивацию интерферона в крови дают трипсиноподобные протеазы [Dobell et.al.,1988].

Поскольку литературные данные свидетельствуют о возможном изменении внутриклеточной локализации, мутантных белков в бактериальных клетках [Slodowski et.al.,19913, было исследовано, б. каких клеточных фракциях находятся полученные нами аналоги. Мутантные белки отличались по способности образовывать тельца включения в-клетках штамма - продуцента. Содержание белка в растворимой форме (в цитоплазме) при приблизительно равном уровне экспрессии возрастает в ряду 7-IFN, В24, Q133, В38, А10. Наиболее выраженный эффзкт введенных мутаций отмечен для варианта AIO, этот белок на 90-95% находится в растворимом состоянии (рис 9 и табл.2).

Известно, что при понижении температуры - культивирования содержание рекомбинантщх бе.яков в растворимой ферме повышается [Schein and Notebom, 19683. При культивировании штаммов-продуцентов интерферонов при 30°С вместо 37^С мы также наблюдали во всех случаях повышение содержагаш рекомбинантного белка в цитоплазме (см. рис.9 и табл.2). Наиболее сильное влияние температуры культивирования на биосинтез рекембинант-кого белка было обнаружено для мутантного интерферона QI33, у которого введен отрицательно заряженный остаток (Е) на С-конец

m

«wu» <

= . fasc-зло мутзкгногз интерферона (аарианг БЗЗ) с ро:;оы-.';:HSH7Hcro г-акт-грферона экстрактом В.осИ зли трипсином. I -7-л:«торфорен; 2 - 7-интерфзрон, шкубировзнннй с экстрактом З.гс-Ji; С - мутантшй интер^роя 5.23; 4 - ыутантный бвлок Вое. жсубпрованный с экстрактам в.coli; 5 - 7-интерферон; >-• -7-катарфгрск, инкубкрованнни .с трияегокж; 7 - мутантный <5>?.чок 538; ö - белок F38, инкубированный с трипсином. Стрелками отмечена натизная и протсолитически деградированная фермы интерферона.

I 2 3 4 5 6 ? 8 9 ¡0 .11 12 '13 4 4 15 т6 17 18 19 СО

Г i.

s * 1 «г-1

! -i:..; г

"5-f .- а t

: Ч - V*--»

г»:

f J — SS « /С?

Ei

. — у : . * ~ *- - .

^ _ j

r) JJ 'S ? * 2

if ® — M

«n — , Ш

SS Ti c?f

SJ «* «li

.1 «P

молекулы. Понижение температуры роста штсша-продуцента до 20°0 привело к переходу в цитоплазму до Э0% етого белка вместо 10% при 37^0. В остальных случаях аффект снижения ■ температура роста на растворимость белка имеет менее выраженный характер, наименее значим он для варианта Л10.

Таблица 2

Влияние С-концезих мутаций и температуры культивирования на растворимость мутантнкх кнтерферонов.

вариант • содержание белка ( % ) в растворимой фракции* . 37°С 30°С

7-1РН 0-5 ' 10-20

В24- 5-10 . 30-40

В38 . 20-30 . 50-00

¿10 90-95 '90-95'

0133 - 10-15 , 80-90

* - указано содержание белка в процентах от общего колкче-. стза гамма-интерферона в клетке. '

Таким образом, нами получены- варианты 7-интерферэнз с изменениями, в С-концевсй области, ■ которые сводятся либо к замене положительно заряженных■аминокислот -на 'нейтральные б кластерах, наиболее чувствительных к действию протэаз (мутанты Б24 и В38), или к частичному удалению' этих - кластеров (мутант Д1.0), либо к введению отрицательно " заряженной аминокислоты вместо нейтральной (мутант .0133). В ходе исследований выявлены некоторые интересные - эффекты введенных мутаций. Во-первых, все полученные С- концевые, аналоги сохранили близкий к исходному уровень антивирусной активности.' . Это согласуется с данными Ветсела и Ландела .ЕЯГегге! е1-..а1, '1990; ЬшкЗеП et.al., 1.991] б важности сохранения какого-то . минимального■ положительного заряда в С-концевой области для проявления, биологической зкти-

¿..-i':-"::: гмллал:Н[ч.р;грола. :тл"л, б.ллолл, лолло.. .]-;--riir-: з еаУтах лротеолизч, .лхеол r; :io:,¡-тел с елол..о! уг.:з;--

i.'i¡'-;r.ii устойчивости к трллоглол j;;c jx.:; лр^телл-.. :-". ;л:л..кл ¡:-:p.p? . Н-тп'. л:ко.лл:о, что уленвлелле л:,лаллт-ла-

о.г: оарлдз С-концетсбластл у-интерл-рона вследствие Ваеде-лю;оСот:;:т переходу белков з рос:ле:л;,'у;о на гит --...'" 1 .ум/, ч:о л:г„юоулгся о дапнвух ÍLyneo 1 -олi3 о

.....сулул ел: кг злултенвл:: лазе кислот но " л'. '■".; г уогкглвл- тол ¡-.л;:.":":-:.- лолихснчл то'тл во :уоа о лле'.лачхел'с, бедка в реете г: ;о•ой ел-оме,

;ЗИ0:: Г -'Г- !

лзност ь:с и

при с :хра-

ПоВ'Ла "'ННаЛ

О.'.О, .—р рОГуЛО^ЗТО ПрОДе.. ЛОЗ _ Л рЛ_31Ы ^ЛЛУЧе:

: • : .. . л"лл-в р.-:.л;;з. лз ¡по: два аналога, ла лап .: до: . т л-слд'лдхл гпз-акт::ч:-có'uíi иктерге: ; лороолч;, ОбЛаДЗКХЛЙ поеыленной антивирусной vl\. = • рл.-ят 61,"j Ртальта^лрон), для которого характерьл ьл.чж: голодного уронил биологической активности ;. .ллДчпьость к трипсанопопротэззйм и нахождение в клет-кол E.ool4 В нз'пгвном (растворимом) состоянии в отличие от p--'K'...V.';;:e/:;;JT£0r-0 ГаМЛО-ИНТер^ерОНа, ПрИСуТСТВуКХеГО' Б КЛ 'ТКТЛ -пр0Д.'.-ц!.-нт05 в д-Цатуочровапном состоянии v. ьидо 'Телец i клвч л-ля. Сочгтаниа ¡тозалогсной протаолл7пчеоко;? стабильности о р io:boov3,:oo'"i.K в бактарлчлы&гх клетках делает аналог дельта-v-рл; олеблл:о перспективном длл практического применения.

'. вв-озл: показано, что аминокислотная замена £ог£1 —»-.SjO;:, л:кализ л,энная з структурообрззукмйей области молекула, не :-.!"•/.ti на его лс'Тнзнуь1 кои^'.-ркйциг"., приводит к повклгнию ко карл уи уд- л::;.' алтко/руен:й активности глтка.

2. "-/.л • ; л .\Hiepóe;iУгл, c.'.e'i C-S ,н,:с!> >•:. oí. :а.' г.* С- "0:- : .е • л.:

пгруснлй слллкнлстл.

сm:ллголлла, ллгсхтгp.::глтол солее ллл-лл у;:л'-;,* л .-

телл;:тпчеоклл уетс^ллоел; г лл::ло:7еллл:Лл:л глг-елл.....

upoiv£?r Е.л:11 Олл i.

ГЫгасано, i/o y!-.v:';:Mii0'.c:0 лсллллтельллл :ллдде нопиеьс-й oïxdcït. воледзегле вгллнлли лутлв-: сллсллг'! у переходу Оелгс.г: из телец влло'лккл и р:лт;л „глтлллл

Основное содержание днееертатс.п лллл нл :: едллллдл: расстил :

1. Смирнова G.D., Татвков СЛ'., 1'льи A.A., Петреллл Ь.А Получение мутзлллкд гплмалтергерокоз с кллпелплм с - ьовце.гл и ¡v: свойства. /V 1 £Лсдсг;лля конуре"J'г-ном челглел.:;-

7еВ, ДСКЛ. M. ,-IÍ-f!0. -СЛЗб-мЗ".

2. Смирнова О.У.. 1атькоЕ С. Il., ;Слн"лв A.A., Г.глр'лпл. í.a получение :лутин:нк галмз-ллтер^лглчсЕ с ¡лллнлллл' о- гл;цл:,-

Ял ebeneres. /■' Оовремлнгдл' длвллл лгллекелля лл

п других к^гупгм:>луляторгл. "г. -лучн. глул ллл-л"л~

гнл н v:n;pocиологш: им. J л.лл^лл-Лл-!^ Л . .

Ул1 eeev A.A. y.b,lsxv--;t.:.j V.l. Iii. f. г.-л;'.;: jл л. - - Л. Тле ;л"-лл:-.л' cî глро ai-in о г-лл~ л^л-ллл л. л'.-: ;лглЛ.Л\ .л ■ л!: pr:-.-jriier. ci ллел: лллл- Лл :: л л . . .U ".

Л: СЛГЛ Лл-ХОЛУ. ÍKTAUi'j ВЗ t iCTi 'Л... All .л ЛЛ . -' 'ЛЛ i ." "л:Л'Л .■■ •■Tri. р.г.:.

ллтвлег С.Л.. лллл л л „.:'., Ллллл. . ;лл Г.а.

я'Л-йТ^г лев 3:;Л. лолирлллв.:; :лл."л:лл;,л . л-,,

гь'Ж;-гя?:-рф?р.на л лсв^-кв, р-л-л м'нн'.нтная . лл : лл;л. л'.лл о'лесеыгилллая :-;лгпр'-сс:пл гена ЗлА л г.слП и дгллл к. -прог.уц>*-нт п'.-лиг.епткда, оСллтг^ллвс ïbtbbhoctï то гаг.::;;! ■ гллу-■í'^pOK'; ч:ло/•' Заявки на патг-кт Г лгол^ево;* 1лЛ'':рал;"1: •- i-i

5067304 от 20.08.32. - Иоло5ШГиД&пс-<г реиешк от 28.07.94. ••

5. О.Ю.Смирнова, С.М.Татькоз, В.А.Петренко, А.А.Ильичев, Л.С. СапдахчиоЕ. Кутантше' гокма интерфербны человека с измененным С-концсм и их свойства. // Докл. РАН - 1994.- т.337. N 3. с.405- 406.

6. С.К.Татысов, О.Ю. Смирнова; Р.Ю.Цквковский, А.А¿Ильичев. Мутанткие гамма интерферона человека с измененным С- концом и ,

свойства. // В печати. Молекул, биология -1995. -

¿2/

НИКМ5 3.175 т.100 1995г.