Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к Mn2+-зависимой ДНКазе хроматина печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к Mn2+-зависимой ДНКазе хроматина печени крыс"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. У ЛЬ Я ИЭ В А-ЛЕ НИ НА

На правах рукописи

ХАММАДЕ Фадийа Мухаммед

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К Мги2+-ЗАВИСИМОЙ ДНКазе ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ КРЫС

03. 00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

КАЗАНЬ - 1991

Работа выполнена в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им.В.И.Ульянова-Ленина.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Винтер В.Г.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Юсупов Р.Х. кандидат биологических наук, ст.научн.сотр.Вершинин A.A.

Ведущее учреждение: Казанский медицинский институт.

, Защита состоится ",// " ff. 1991 г. в /Р_часов

-на заседании Специализированного ученого Совета К 053.29.19. по присулдению ученой степени кандидата биологических наук в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им.В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ии.Н.И.Лэбачевского Казанского государственного университета иы.В.И;Ульянова-Ленина.

Реферат разослан » ^ " //___1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,

кандадат биологических наук О.А.Гиматутдинов

• • - ■ -[ ВВЕДЕНИЕ

j;jCCI

' ""'¿iifyoiьность_про блемн. Первые сообщения о ыоноклональных антителах появились в 1975 г. (Köhler , Milstein , 1975). С тех пор.моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве универсального инструмента исследований в молекулярной биологии, биохиши, энзимологии. Использование моноклона ль иых антител в энзимологии позволяет решить многие вопросы механизме ферментативного кятзлиза, взаимодействия ферментов с ингибиторами, их .лояекулярную генетику и эволюционную биологию.

Способность .¿онотслональных антител распознавать ферменты с высокой степенью специфичности позволяет использовать их для изучения .„олекулярннх основ различий родственных ферментов.

Настояшря работа посвящена получению ыоноклональных антител к нейтральной Мп^-зависимой ДННазе белков хроматина клеток печени крыс, Дезоксирибонуклеазы (К.Ф.3.1.4.Э - многочисленная группг ферментов, которые играют важную роль в поддержании структуры хроматина и регуляции его генетических функций. Для выяснения .».ехэнизглов регуляции работы генетического аппарата клеток очень существенный являются решения вопросов: какие ДККазы участвуют в тех или иных превращениях ДНК и могут ли одни ДНКазы завещать в функциональном отношении другие? Имеющиеся в литературе данные (Ким, 1S89) свидетельствуют о том, что для указанных выше вопросов могут быть использованы моноклональные антитела. Однако нужно учитывать, что большинство ферментов по сравнению с другими белками структурно очень консервативны и многие из них являются слабыми идыуногенами, поэтому получение моноклзнальных антител для каждого фермента является вполне самостоятельной и, к сожалению, очень часто трудновыполнимой задачей.

Цель и .задачи исследования. Целью настоящей работы было получение шноклональных антител к нейтральной Мп -зависимой ДНКэзе хроматина печени крыс и использование их для изучения нуклезз различных организмов. В соответствии с поставленной целью были определены задачи:

1) выделение и очистка препаратов нейтральной Мп^+-зависимой ДНКазы хроматина печени крыс;

2) получение гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к нейтральной Ьк^зависимой ДНКазе;

- 3 -

3) отбор гибридом, синтезирующих монАТ, ингибирующие активность фермента;

• 4) изучение динамики накопления моноклональных антител в культур ельной жидкости;' о) получение асцитнюс препаратов моноклональных антител;

6) очистка моноклональных антител;

7) применение ыонАТ для изучения иммунохшических свойств нук-леаз различных организмов.

Научная новизна. Впервые методом соматической гибридизации В-лимфоцитов ишунизиров.анных мышей с клетками шеломы по. лучены гибридомы, синтезирующие ыоноклональные антитела к нейтральной Мп.^+-зависшой ДЕЖазе хроматина печени крыс, обладающие способностью ингибировать фермент в условиях in vitro.

Методом иммуноферментного анализа с помощью моноклональных антител обнаружено сходство в эпитопах нуклеаз различных организмов с разной специфичностью к субстрату: Мп-зависимой 'ДНКазы хроматина печени крыс, Са, Mg-зависимой ДНКазы ядер эмбрионов морского ежа, ДНКазы ядер эмбрионов вьюна и РНКазы Вас. intermedius,.

Научно-практическая значимость. Разработан метод получения моноклональных антител к Мп"*+-зааисиыой ДНКазе хроматина печени крыс. Моноклональные антитела могут быть использованы для проведения исследований, связанных с определением содержания ДНКазы в клетке при развитии организма и в процессе пролиферации, изучения антигенных детерминант на молекуле фермента, а также для прикладных задач очистки фермента методом иымуно-аффинной хроматографии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (г.Гродно, 1990), на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 1988-1990), Всесоюзной конференции "Нуклеазь микроорганизшв" (г.Казань, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы.

Структура и объем работы. Диссертация, изложенная на НО страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора ли тературы, описания материалов и методов, изложения собственны? результатов, юс обсуждения и выводов. Работа содержит II Ta6j

и 13 рис. Библиография включает 186 источников,из которых 45 отечественных и 141 зарубежный.

мшда ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводили на белых, беспородных крысах-самцах весом 150-180 г и мышах-самках линии Ва1в/с.

Культуры шеломы S?2/0-Ag4.I и ИЗ /I-Ag4.I были получены из Института цитологии Академии наук СССР (г.Ленинград).

Препараты нуклеаз любезно предоставлены сотрудниками Казанского университета.

Ядра из печени крыс выделяли по методу Даунса и Ицковича (Bounce, iclcowich, 1969). Препараты нейтральной Мп -зависимой ДНКазы получали экстракцией хроматина Ю-кратным1 объемом 0,4 М иаС1 в 0,01 М трис-HCI буфере, pH 7,2 с Ю-4 М ЭДТА (Зоткина и др., 1990). ДНКазу очищали в дальнейшем хроматографией на оксиапатите, высаливанием сульфатом аммония, препаративным изоэлектрофокусированием. ДНКазную активность определяли по количеству образовавшихся при гидролизе ДНК кислотораст-воримых продуктов (Kunitz, 1948).

Клетки миелом и гибридом выращивали в среде RTMI -1640 с добавлением ь-глутамина, пирувата натрия, 2-меркаптоэтанола, эмбриональной телячьей сыворотки. Селективная среда включала следующие компоненты: гипоксантин Ю-^ М, аминоптерин U, тимидин 1,6*10"^ М.

Слияние клеток для получения гибридом проводили по методу Келера и Мильстейна (Kohler, Milstein, 1975). Скрининг гибридом проводили методом иммуноферменгного анализа (Лефковитс, Пернис, 1983). Клонирование гибридом осуществляли методом предельных разведений (Новохатский, 1985).

Очистку антител проводили высаливанием сульфатом аммония и аффинной хроматографией (Руослахти, 1979).

Специфичность монокдональных антител определяли методом ЙФА и по способности ингибировать активность фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ

О ,

I. Получение препаратов нейтральной Мп -з_ависимой_ДНКазы хроматина печени кшс.

В качестве антигена для получения гибридом, синтезирующих

- 5 -

монАГ к Мп -зависимой ДНКазе хроматина печени использовали препараты фермента с удельной активность» 600 ед/мг. Для отбора гибридом применяли высокоочигценные препараты фермента с уделъ ной активностью 2358 ёд/мг белка (табл.1), полученные нами хроматографией белков фракции 0,4 нэ оксиапатите и препаративным иэоэлектрофокусированием в градиенте рН 3,5-10.

Чистый антиген необходим для отбора гибридом, продуцирующих антитела к ДНКазе, а не к примесям, которые могли присутствовать в менее очищенных препаратах ДНКаз для иммунизации. Из литературы известно, что получение моноклоняльных антител к заданным антигенным детерминантам возможно при использовании не полностью очищенного антигена, что приобретает особое значение при работе с труднодоступными препаратами, очистка которых связана с техническими сложностями {Новохатский, 1983), необходимо только иметь чистый антиген на этапе тестирования специфичности по антигену гибридоыных клеток.

2. Получение и характеристика моноклональных антител к ' "мп -зависимой ДНКазе .хроматина печени крыс. Первой стадией в получении гибридом является активирование иммунных В-лимфоцитов у мышей, служащих донорами В-ливлфоцитов для слияния с клетками миеломы. Шло показано, что после иммунизации животных.in vivo число гибридов, появляющихся в результате слияния клеток in vitro непосредственно связано с числом свежестиыулированных крупных лимфоцитов в селезенке (stohli е.а., 1980), и поэтому процедуры иммунизации должны быть напраг лены на получение генераций активно делящихся В-лимфоцитов. Учитывая,; что фермент Мв-зависимая ДНКаза, к которому необходимо бъ ло получить антитела, является слабым иммуногеном при иммунизации животных, препараты ДНКазы вводили в составе полного адьюва! та Фрейнда. В литературе нет определенных схем иммунизации, дающих выраженные иммунные реакции, поэтому для каждого конкретного случая необходимо подбирать свой режим иммунизации. Учитывая это, мы проводили иммунизацию ферментов по двум схемам, измена; способ введения антигена. При иммунизации по I схеме, по которо! за три дня до гибридизации фермент вводился внутриселезеночно, в сыворотке иммунной мыши обнаружен более высокий титр антител по сравнению с сыворотками животных, иммунизированных по П схем где фермент перед гибридизацией вводили внутривенно.

_ б -

Л Таблица I

Очистка нейтральной Мп-зависимой ДНКаэы хроматина печени крыс

Объем, Концен- : Общее : Концен- : Удель- : В ы х о Д Степень

Стадии : мл трация Сед/мл) : число : ¡ единиц: трация белка (мг/мл) : ная : :.актив- : : ность : : Сед/мг) ; белок : Смг) ; исходная активность (%) очистки

Исходная фракция 0,4 120 199 23880 8,0 24,84 960 100. I

Хроматография на оксиапатите 86 ' 192 16512 0,95 202,1 81,7 69 8,7

Осаждение ч СнН4)^04 (8055 насыщения) и обессо-ливание на 0-25 28 372 10416 0,8 465 22,4 43,6 18,6

Препаративное ИЭ$ рН 3,5-10 15 253,8 3716 0,1 2358 . 1,5 15,56 94,8

Миеломные клеточные линии для гибридизации должны отвечать 3 требованиям: наличие селективного маркера устойчивости к ингибитору роста клеток,- отсутствие продукции иммуноглобулинов, стабильность формируемых при слиянии гибридов (Reding, 1982). В связи с этим мы использовали для слияния две линии миеломных клеток, дефектных по ферменту ШЕРТ (гипоксантин - гуанин -фосфорибозил - трансферазы: SP2/0 - fe 4.1 и iis/l - Ag 4.1), которые не синтезируют собственный иммуноглобулин. Эти линии клеток поддерживали путем прививок мышам Ва1в/с.

Спонтанное слияние дифференцированных эукариотических клеток в природе явление редкое. Слияние клеток в условиях in vitro может быть индуцировано вирусами, химическими веществами', электрическим полем. Мы проводили слияние клеток в присутствии 50%-ного полиэтиленгликоля с м.в. 1540, ограничив время пребывания клеток в растворе ПЭГ 8 минутами (включая центрифугирование клеток), чтобы .снизить токсическое действие ПЭГ.

Для отбора гибридом использовали селективную среду с ги-поксантином, аыиноптерином и тимидином (среда ГАТ) (bittle-fild, 1964). Мутантные опухолевые клетки, взятые нами для ели яния, лишены ферментов ГИРТ и поэтому не могут расти на среде ГАТ. Нормальные лимфоциты не способны жить в культуре in vitro более нескольких суток. Гибридные клетки, унаследовав от лимфоцитов генетическую программу биосинтеза ферментов, а от опухолевых клеток - способность неограниченнб делиться, отлично росли 8 селективной среде.

Для первичного скрининга гибридом был применен метод двойных антител, который является разновидностью твердофазного иы-ыуноферыентного анализа. Поскольку для иммунизации животных использовали препараты фермента с невысокой удельной активностью (600 ед/мг), то при скрининге очень важно было применять препараты высокой степени чистоты. Для этих целей использовали полученные Н8Ш гомогенные препарата фермента с удельной активностью 2358 ед/мг; Высокая степень очистки фермента и низкая концентрация (5-10 мкг/мл), наносимого на планшет препарата фермек та, обеспечивали целенаправленный отбор.

При* первичном скрининге колоний гибридных клеток.полученных в наших экспериментах после слияния В-лимфоцитов с клет-

ками шеломы liS /I - Ag 4.1, было выявлено 14,7% позитивных гибридом, а при слиянии с клетками миеломы SP2/0 - Ag 4.1 - 22% позитивных гибридом (табл.2). Это достаточно высокий процент выхода гибридом. Из литературы известно, что применительно к растворимым антигенам процент позитивных гибридом не высок: 22% позитивных гибридом получено к нитратредуктазе С Notton , 1985). Другие авторы к растворимым антигенам получали менее 1% позитивных гибридом ( Stähli е.а., IS79.).

Таблица 2

эффективность гибридизации при получении клонов клеток, синтезирующих монАТ к Mn-^ависимой ДНКазе

Отношение сгтленоцитов (В-лиыфоцитов) ' к клеткам миеломы БР2/0 - Аё 4.1 • 10:1

Количество засеянных лунок 176

Количество лунок с позитивными гиб- 22

ридомами {% от засеянных лунок)

Зтношение спленоцитов к клеткам миеломы НБ/1 - Аз 4.1 2:1

количество засеянных лунок 176

количество лунок с позитивными гиб-эидомзми от засеянных лунок) 14,7

После отбора позитивных гибридом 12 культур гибридных клеток были клонированы и реклокированы для выделения одиночных стабильных клонов.

В результате клонирования и рек локирования отобрали II мо-гоклонов, продуцирующих антитела к Независимой ДОКазе хроыати-ia печени крыс, из них 9 клонов (1С, 2В, ЗБ , 4Е, 5А, 7F, 8G, 9Н, .IA) были получены в результате клонирования гибридом, берущих 1ачало от слияния В-лимфоцитов с клетками миеломы Ns/I -'Ag 4.1 ; два клона (2BI и 2DI) - от слияния В-лимфоцитов с клетками иеломы SP2/0 - Ag 4.1.

В культуральных флаконах (с объемом среды 5 ыл) определя-и динамику накопления моноклональных антител в процессе роста

гибридом. Среду во флаконах меняли через неделю (а не через 1-2 дня, как обычно) и каждый день отбирали пробы культурально: жидкости для иммуноферментного анализа. Екло обнаружено, что максимальное количество антител культурэльной жидкости образуется на пятый день культивирования. Следует отметить, что антитела выявлялись только в исходной культурэльной жидкости, или, в лучшем случае, при разведении 1:8.

Поскольку титр моноклональных антител в культурэльной жид кости был не высок, II культур гибридных клеток были размножен и привиты сингенным мышам для получения эсцитных препаратов мо ноклональных антител. 1йбридомы перед введением животным выращивали на полной ростовой среде КЙ11-1640 с добавлением Ъ% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Гибридомные клетки были постепенно адаптированы наш к такой среде, вначале гибридоыы росли на среде, содержащей 20% ЭТС. Для каждой из II гибридоы-нкх культур было использовано по 3 мыши, которых за I неделю до иньекции гибридом прэймировали пристаном. По мере развития опухоли отбирали асцитную жидкость и исследовали ее на наличие специфических моноклональных 'антител методом ША и по способно ти ингибировэть активность Мп^+-эависимой ДНКазы хроматина (табл.3).

Таблица 3

Характеристика асцитных препаратов монАТ

Культура % ингибирования ИЗ?А, обратный титр

1С 18,2 ' 100000

2В 47,0 200000

30 3,2 200000

. 4Е 51,9 200000

5А 40,6 400000

7Р 64,0 200000

89 36,2 200000

да 31,3 . 100000

НА 8,4 100000

2В1 0 160

гт 0 " 80

9 культур гибридных клеток, полученных от слияния сплено-

цитов с клетками миеломы ш/1 - Аэ 4.1, давали асцитные жид- 10 -

кости с высоким титром антител (100000-400000), две культуры (2В1 и 2о1), полученные от слияния спленоцитов с клетками шеломы БР2/0- А 4.1, дали асциты с меньшим титром антител (80160). Наибольшая ингибирующая активность была обнаружена в асцитах гибридом 2В, 4Е, 5А, 7Р. Не обнаружено ингибирующей активности в асцитах гибридом 2В1 и 21)1.

На основании этих экспериментов можно сделать вывод, что при получении гибридом надо иметь несколько линий миеломных клеток, чтобы в последующем отобрать антитела с необходимыми для планируемого применения свойствами. Моноклональные антитела, ингибирующие активность фермента, можно применить не только в иммуно анализ ах, но и для изучения функции и регуляции активности нуклеаз. Поэтому для дальнейшей работы были использованы гибридомные культуры 2В, 4Е, 5А и 7Р. Остальные'культуры были заморожены и хранятся при -170°С.

Для получения препаративных количеств моноклональных антител использованы 178 мышей-самок линии Ва1в/с, которые были разделены на 4 группы,и каждой группе были введены клетки гибридом 2В, 4Е, 5А и 7Р.

Как видно из данных, представленных в табл.4, сроки образования опухоли колебались от 8 до 15 дней, количество асцитной жидкости было в пределах 2 мл. Титры моноклональных антител в асцитных жидкостях колебались от 1-10^ до 8*10^ при определении методом ИФА, что превышало тигры антител в культуральных жидкостях этих гибридом на 4 порядка. Ингибирующую активность асцитных препаратов определяли при добавлении■20 и 40 мкл антител в реакционную смесь для измерения активности фермента. Ингибирующая активность асцитной жидкости гибридомы 4Е составила 50,11+4,42$ при введении в реакционную смесь 20 мкл антител и 82,91+4,26% при введении 40 мкл антител. Антитела асцитной жидкости гибридомы 2В почти так же ингибировали активность фермента. Ингибирующая активность асцитных жидкостей гибридом 5А и 7Р была несколько ниже.

Для очистки асцитных препаратов монАТ и получения иммуно-глобулиновой фракции асцитную жидкость центрифугировали при 18000 в для освобождения от клеток и клеточных обломков и осаждали сульфатом аммония (33& насыщения). Осажденные белки растворяли в минимальном объеме буфера, содержащего 0,01 М трис-НС1,

Таблица 4

Образование асцита и специфичность ыоноклональных антител

' Культуры : Коли: чество ; мышей : Количество ¡введенных клеток : на одну мышь Образование опухолей (дни) Объем : асцита : мл : Ингибирующая активность, % : ИФА, : обратный : ти'гр

2В 57 (5-6)-Ю6 II + 0,5 1,8. + 0,18 20 мкл 48,77 + 3,83 40 мкл 82,17 + 3,29 (1-2Ы05

, 4Е 48 (5-6). Ю6 • 8 + 0,4 2,8 + 0,52 20 мкл 50,11 + 4,42 40 мкл 82,91 + 4,26 (2-4)-Ю5

5А 33 (5-6)-10е 13 + 1 1,5 + 0,3 20 мкл 44,29 + 5,58 40 мкл 58,31 + 6,26 (4-8)-Ю5

7Р

40 (5-6)-10®

3,15 М наС1, Ю-4 М ЭДГА, рН 7,5. КЭнцентрация белка во всех фракциях гибридом (2В, 4Е, 5А, 7Р) составила 2 мг/мл. В табл.5 1редставлены определения титра моноклональных антител в этих -фракциях. Максимальный титр антител (1:3,2-10^) был у гибридо-

ш 4Е.

Таблица 5

'а введение антител

П р е п а р

гиб|зидома

гибщдома

гибридома 5А

гибридома

5^0

Оптическая плотность Е492

100 0,874 0,951 0,886 0,875

1000 0,861 0,938 0,879 • 0,714«

10000 0,429 0,676 0,416 0,437

20000 0,373 0,588 0,258 0,373

200000 0,307 0,523 0,202 0,305

400000 . 0,254 0,484 0,185 0,258

800000 0,105 0,264 0,165 0,178

1600000 0,057 0,206 0,116 0,075

3200000 0,049 0,116 0,065 0,042

6400000 0,049 0,065 0,048 . 0,040

Асцитная жидкость гибридомы 4Е была использована нами1для :равнения способов очистки монАТ: осаждение сульфатом аммония [ аффинной хроматографией на протеин Асефарозе. При исходной :онцентрации белка 5,6 мг/мл во фракции очищенных антител методом аффинной хроматографии титр антител составил 1:3200, что на

I порядка ниже, чем во фракции гибридомы 4Е,'получены после 'саждения сульфатом аммония. По видимому, сульфат аммония оказы-1ает некоторое защитное влияние на биологическую активность белов СОстерхауз, 1989). В то вреыя, как элшровани е. антител 0,2 М С1 глициновым буфером, рН 2,8 (в аффинной хроматографии) приво-ит к частичной инактивации антител.

Изучая ингибирующую активность моноклональных антител 4-х ибридом, мы не обнаружили 100%-ного ингибирования ни с асцитными репаратами, ни с очищенными антителами. Отсутствие полного ин-ибирования,по-видимому, обусловлено тем, что антитела связыва-

ются с зпитопаыи фермента, не входящими в его активный центр.

3. Использование .моноклональных антител для изучения иымунно-хиыических .свойств нуклеаз в различных организмах. •

Для этих целей использовали препараты ферментов: нейтральной fín-зависимой ДНКазы хроматина печени крыс с удельной активностью 2358 ед/ыл, Са, Mg-зависимой ДНКазы ядер эмбрионов морского ежа с удельной активностью 1276 ер/т, ДНКазы ядер эмбрионов вьюна с удельной активностью 416 ед/ыл, панкреатической ДНКазы крупного рогатого скота с удельной активностью 4200 ед/мл, панкреатической РНКазы с удельной активностью 40 ед/ыл, РНКазы Bao. intermediua с удельной активностью 1,2*10^ ед/мл и нуклеазы Ser. marcescens с удельной активностью 1,5-10^ ед/ыл.

Для изучения взаимодействия моноклональных антител с различными ферментами применяли метод твердофазного ИФА, поскольку этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет в одинаковых условиях провести.анализ сотни проб. В качестве антигена на планшет наносили различные концентрации ферментов, а в качестве антител использовали сульфат аммонийные фракции моноклональных антител в разведении 1:2000 (концентрация I мкг/мл При этом разведении устраняется влияние сопутствующих белков, . которые могут присутствовать во фракциях и в то же время антитела сохраняют высокую активность.

Как видно из рис Л, полученные наш 4 моноклона продуцировали антитела, которые практически с одинаковой эффективностью связывали нейтральную Mn-Зависиыую ДНКазу хроматина печени крыс препараты которой использовались для иммунизации мышей. Монокло нальные' антитела связывал!, хотя и с меньшей эффективностью,нук леазы и других организмов: ДНКазу ядер эмбрионов вьюна, Са, Mg-зависиыую ДНКазу эмбрионов морского ежа и РНКазу Bao. in+eraedii " Моноклональше антитела изученных нами гибридом не связывались панкреатической ДНКазой, панкреатической РНКезой и нуклеазой Se: •marcescens , Проявление перекрестных реакций моноклональных антител с нуклеазами других организмов свидетельствует о сходстве эпитопов .нукяеаз:. Мп-зависимой ДНКазы хроматина печени крыс» Са, Mg-зависимой ДНКазы ядер эмбрионов морского ежа, ДНКазы из. эмбрионов вьюна и РНКазы Bao. interroedius.

¿5 с"

Рис Л. Связывание моноклональных антител гибридом 4Е, 7Р, 2В, 5А с нуклеазами различных организмов.

1 - Мл-зависиыая ДНКаза хроматина печени крыс

2 - Са, Мй-зависимая ДНКаза ядер эмбрионов

морского ежа

3 - ДНКаза ядер эмбрионов вьюна

4 - РНКаза Вас. Ь^мтазахтдп

5 - панкреатическая ДНКаза

6 - панкреатическая РНКаза

7 - контроль (к-ультуральнэя жидкость зшеяомы

га/1 - А,-; 4.1 _ 15 _

выводы

1. Методом соматической гибридизации В-лимфоцитов с клети ыи миелоыы получены гибридомы, продуцирующие моноклональные а* титела к Мп-зависимой ДНКазе хроматина печени крыс. Отобрано А клона, продуцирующих антитела, способные ингибировать активное фермента.

2. Изучена динамика накопления моноклональных антител в культуральной жидкости. Показано, что максимальное накопление антител наблюдается на пятый день после пересева культуры гибридом,

3. Методом иммуноферментного анализа с использованием мои клональных антител обнаружено наличие сходных антигенных детер минант у Мп^зависимой ДНКазы хроматина печени крыс, Са, ¡%-зав сийой ДНКазы ядер эмбрионов морского ежа, ДНКазы из эмбрионов вьюна и РНКазы Вас. л.гЛегтес1:шз.

СПИСОК РАБЭТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белова М.М., Хаммаде Ф.М. Применение моноклональных ан тител в биологических исследованиях. Материалы итоговой научно конференции Казанского университета за 1988 // Изд-во Казанск го университета,- Казань, 1990.- С.36-43.

2. Белова М.М., Махмутова Л.Я., Хааыаде Ф.М., Котляр Е.Ю. Аскарова А.Н., Хэйралах 0., Винтер В.Г. Использование моноклональных антител к Мгйавиеимой ДНКазе хроматина печени крыс дл, изучения иммунохимических свойств нуклеаз // X Всесоюзный сим» зиуа "Структура и функции клеточного ядра": Тезисы докл. - Гро, но, 1990. - С.75.

3. Котляр Е.Ю., Абрамова З.И., Белова М.М., Хаашэде £>.М., Винтер В.Г. Распределение Са, ¡^-зависимой ДНКазы эмбрионов мо; ского ежа при фракционизировэнии хроматина клеток, синтезируюи? ДНК // X Всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра": Тезисы докл. - Гродно. 1990. - С.98.