Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков родов Unio и Anodonta, обитающих в реках Подмосковья
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков родов Unio и Anodonta, обитающих в реках Подмосковья"

лйЛ ,

003448306 На правах рукописи

I/

КОВТУН НАДЕЖДА ЕВГЕНЬЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК МАНТИИ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ РОДОВ иШО И ANODONTA, ОБИТАЮЩИХ В РЕКАХ ПОДМОСКОВЬЯ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

МОСКВА - 2008

003448306

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и технологий медико-биологического факультета и в медицинском центре Российского государственного медицинского университета.

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН,

доктор биологических наук, профессор ЯРЫГИН Константин Никитич

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

СЕИД-ГУСЕЙНОВ Алексей Асадович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

СКАЛЕЦКИЙ Николай Николаевич

кандидат биологических наук ЭЛЬДАРОВ Михаил Анатольевич

Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный

центр РАМН

Защита диссертации состоится « » и^О2008 г. в /ч - часов на заседании диссертационного совета Д 212503.08 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан у>сес*Се0> 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук О.Б. Саврова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы разработке методов искусственного получения перламутра, с использованием мантийной ткани двустворчатых моллюсков посвящено множество работ. Работы по использованию культуры ткани мантии проводятся на пресноводных и преимущественно на морских моллюсках (Barik S.K., et al., 2004).

В России имеются огромные запасы пресноводных перламутробразукяцих раковин, в основном, двух родов, Anodonta и Unió. Они распространены в реках, практически по всей территории России, от Европейской части до Дальнего Востока. Anodonta и Unió образуют хороший перламутровый слой, что допускает возможность получения его при помощи культуры ткани мантии.

Перламутр является сложным биоорганическим комплексом, основу минеральной части которого составляет арагонит - разновидность карбоната кальция. Белковая часть, представлена структурными и энзиматическими белками, составляющими органический белковый матрикс.

Перламутр, на сегодняшний день, является одним из наиболее перспективных материалов, для реконструктивной медицины и ортопедии. Свойства перламутра в целом и отдельных его белковых и минеральных компонентов исследуются не только in vitro (Moutahir-Belqasmi F., et al., 2001), но и на животных моделях. На основании экспериментальных данных были сделаны заключения, о способности перламутра двустворчатых моллюсков и его частных компонентов способствовать регенерации костной ткани (Lamghari М., et al., 1999).

Натуральные раковины моллюсков, являются идеальной основой для тканевой инженерии с целью обеспечения структурного микроокружения, аналогичного кости, обладающей необходимой архитектоникой для инвазии клеток кости, васкуляризации и ангиогенеза. Перламутр может применяться как ортопедический наполнитель (Delattre О., et al., 1997), обладая остеоиндуктивным потенциалом, связанным с его структурными свойствами (Green D., et al, 2002).

Перламутр способен не только инициировать образование новой костной ткани, но и направлять клеточную дифференцировку по заданному пути. К такому выводу пришли, изучив превращение адипогенного (преадипоциты) в остеогенный (остеобласты) клеточный фенотип, используя трехмерную биоматрицу с СаСОз, морских губок (Porites lutea). Была показана дифференцировка клеточной линии преадиподитов (3T3F442A) в клетки, способные формировать кость, растущие на биоматриксе, без добавления каких либо индукторов морфогенеза кости. Это указывает на то, что кристаллическая биоматрица частично обладает трехмерной топологией или поверхностными параметрами, обеспечивающими быструю клеточную адгезию, пролиферацию и дифференцировку преадипоцитов по остеогенному фенотипу (Ruth Z. Birk, et al., 2006).

Таким образом, актуальным представляется изучение в рамках одной работы вопросов, связанных как с получением культуры ткани мантии, так и с проблемой образования полноценного перламутра in vitro. Подобное исследование может не только углубить теоретическое представление о процессе формирования перламутра, но и будет способствовать получению перламутра в комплексе с функционально активными белковыми компонентами, как материала обладающего остеоиндуктивными свойствами с целью реконструкции костной ткани.

Целью настоящей работы явилось получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков с сохранением их секреторной активности.

Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Получить функционально активную культура ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков родов Anodonta и Unió.

2. Оптимизировать качественный состав питательной среды для обеспечения успешного процесса кристаллизации перламутра и его основного структурного компонента арагонита.

3. Индуцировать и форсировать процесс кристаллизации арагонита, в культуре ткани и эпителиальных клеток мантии.

4. Изучить этапы процесса образования перламутра in vitro.

5. Изучить типы кристаллизации арагонита in vitro.

6. При помощи рентгеноструктурного и рентгеноспектрального анализов подтвердить получение в культуре ткани мантии моллюска арагонита и перламутра, идентичного природному.

Научная новизна. Впервые в России разработана отечественная технология культивирования ткани мантии моллюсков, позволяющая получать перламутр.

Впервые в мировой практике были использованы моллюски двух родов Unió и Anodonta, для культивирования перламутра in vitro.

Оптимизированы методики подготовки и культивирования тканей мантии непосредственно для пресноводных моллюсков, с целью получения длительной культуры ткани.

Питательная среда дополнена компонентами, позволяющими не только сохранять жизнеспособность ткани мантии, но и инициировать процесс образования арагонита, как основного минерального компонента перламутра.

Разработана уникальная методика приготовления белковых мембран из экстрапаллиальной жидкости моллюсков, позволяющая интенсифицировать процесс образования арагонита и перламутра в культуре ткани мантии.

Получены данные об этапах образования многослойного перламутра in vitro. При этом получены сведения о возможности побочной кристаллизации арагонита в виде игольчатой или альвеолярной форм.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют большое значение для понимания механизма кристаллизации арагонита в культуре ткани мантии пресноводных моллюсков.

Результаты исследований, показывающие, что в культуре ткани возможно получение перламутра, идентичного природному, имеют практическое значение для идентификации и получения белков органического матрикса перламутра, обладающих регуляторными и остеоиндуктивными свойствами.

Данные о форсировании образования арагонита и перламутра за счет применения уникальных белковых мембран на основе экстрапаллиальной жидкости моллюсков, помогут эффективнее получать культуру ткани мантии моллюсков.

Представляется особенно перспективным применение перламутра или его водорастворимой белковой фракции, для изучения воздействия на культуры клеток, в частности, остеобластов и остеоцитов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры клеточной биологии и технологий медико-биологического факультета и Медицинского центра Российского государственного медицинского университета в 2008 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы в отечественных изданиях, поданы две патентные заявки.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 122 источника (11 отечественных, 111 зарубежных). Работа иллюстрирована 42 рисунками и 4 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Подготовка животных для получения тканевых эксплантатов.

Моллюски родов Anodonta и Unió, добывали в реках Подмосковья в летнее и зимнее время года. В течение двух часов животные были доставлены в лабораторию и помещены в аквариумы с пресной водой, в состав которых входили фильтры для отчистки воды, компрессор для аэрации и ультрафиолетовая лампа (БУВ-15,200-280 нм). Температура воды в аквариумах составляла 18-22°С. Моллюски (в количестве 400 штук) были использованы для получения эксплантатов ткани мантии. До начала опытов по культуре ткани, моллюсков помещали в сосуд с раствором хлорамфеникола (100 мг/л) на 24

4

часа с принудительной аэрацией воды. Перед началом эксперимента моллюски были несколько раз отмыты стерильной водой, и поверхность раковин была обработана 70% этанолом.

Культура ткани и эпителиальных клеток мантии моллюска.

Раковины моллюсков вскрывали перерезыванием заднего и переднего аддукторов. От каждой створки отделяли ткань мантии в виде целого эксплантата и переносили в 50 мл флакон со стерильным раствором Хэнкса. Далее, все манипуляции с тканями моллюска проводились в ламинарном боксе (Hera Safe HS 12; «Heraeus», Germany). Ткань мантии переносили в чашку Петри («Nunc», 60 мм) на льду с охлаждённым раствором Хенкса с добавлением антибиотиков (пенициллин 1000 мкг/мл, стрептомицин 1000 мкг/мл, канамицина сульфат 250 мкг/мл, гентамицин 120 мкг/мл, амфотерицин В 100 мкг/мл) и отмывали три раза, в течение 15-20 минут. После, эксплантаты переносили на чашки Петри и давали им прикрепиться в течение 5-7 минут. Затем, добавляли среду DMEM/F-12 (1:1), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), дополнительно 1-кратные заменимые и незаменимые аминокислоты, раствор глицина 0,88 мг/мл, раствор аланина 0,52 мг/мл, антибиотики: стрептомицин 500 мкг/мл, пенициллин 500 мкг/мл, канамицина сульфат 50 мкг/мл, гентамицин 40 мкг/мл и Микосист ® в концентрации 120 мкг/мл. Образцы культивировали при комнатной температуре (20-22°С) в эксикаторах или при 37°С в 5% С02 в С02 -инкубаторе («Sanyo»; МСО-17 AIC, Japan). Смену питательной среды проводилась каждый три дня.

Приготовление модифицированной питательной среды.

Для культивирования эксплантатов ткани мантии и эпителиальных клеток моллюска использовали стандартную питательную среду DMEM/Ham's F-12 Medium (1:1) («ПанЭко», Россия). Питательная среда была дополнена 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Perbio, «HyClon», USA). Также был добавлен ряд антибиотиков: стрептомицин 500 мкг/мл, пенициллин 500 мкг/мл, канамицина сульфат 50 мкг/мл, гентамицин 40 мкг/мл. Для сохранения полноценной функциональной активности тканей мантии и эпителиальных

5

клеток необходимо высокое содержание аминокислот в питательной среде. Поэтому среда DMEM/ F-12 была дополнена: аминокислотами заменимыми 50-кратный стерильный раствор («ПанЭко», Россия) и незаменимыми 100-кратный стерильный раствор («ПанЭко», Россия). Для эффективной секреторной деятельности клеток эпителия мантии и как результат образование арагонита и перламутра повысили концентрацию двух аминокислот аланина (0,52 мг/мл) и глицина (0,88 мг/мл)(«Рапгеас», PRS, Spain). Гистологическое исследование ткани мантии.

Для изучения структуры ткани мантии моллюсков было проведено гистологическое исследование его ткани, а именно краевой (паллиальной) зоны мантии. В момент забора ткани мантии, от цельного лоскута отрезали фрагмент края мантии (длина - 1 см, ширина - 0.5 см) и переносили в жидкий азот. После, приступали к получению срезов ткани мантии, толщиной 20 мкм, при помощи микротома («Shandon SA», Cryotome AS 620, France). Срезы переносили на предметные стекла и проводили окраску гематоксилин - эозином согласно стандартной методике.

Микроскопическое исследование ткани и эпителиальных клеток мантии.

Для изучения гистологических препаратов использовали световую микроскопию. Для изучения культур ткани и эпителиальных клеток мантии использовали микроскопию в проходящем и отраженном свете, а так же фазовоконтрастную микроскопию («ZEISS», Axiovert 200М, Axiovert 40 CFL, Germany). Для получения фотоснимков использовалась камера («ZEISS», Axio Cam MRc, Germany) с программным обеспечением (Axiovision ACRel. 4.1.). Обработка поверхности чашек Петри поли-Ь-лизином гидробромидом с М.В. 150 - 300 тыс. Для обработки поверхности чашек Петри с целью усиления адгезии клеток мантии был использован раствор поли-L-лизина гидробромида с молекулярным весом 150 - 300 тысяч. Раствор поли-Ь-лизина гидробромида концентрацией 0,1 мг/мл («Sigma») приготавливали из лиофилизированного порошка и наносили на дно чашек Петри по 0.3 мл. Выдерживали ночь при комнатной температуре, удаляли раствор поли-Ь-лизина гидробромида и отмывали чашки Петри 3 раза стерильной водой.

Приготовление белковых мембран из экстрапаллиальной жидкости моллюсков с помощью формальдегида.

Для приготовления белковых мембран из экстрапаллиальной жидкости моллюсков использовали формальдегид. С тканей одного экспериментального животного получали 2-3 мл экстрапаллиальной жидкости (ЭПЖ). Собранную жидкость центрифугировали при 5 ООО грш 15 минут при температуре 4°С. На поверхность чашек Петри («Nunc», 6 см, Denmark), наносили по 500 мкл и равномерно распределяли. Чашки Петри оставляли под ламинарным потоком для полимеризации. После высыхания слоя ЭПЖ, чашки ополаскивали 4% формальдегидом. Поверхность образовавшихся мембран промывали 3-5 раз стерильной водой («Millipore», Milli-Q Advantage AlO, USA). Приготовление белковых мембран из экстрапаллиальной жидкости с помощью глютарового альдегида.

Для приготовления белковых мембран из ЭПЖ использовали глютаровый альдегид. Собранную слизь центрифугировали при 5 ООО rpm 15 минут при температуре 4°С и добавляли глютаровый альдегид до конечной концентрации 4%, быстро смешивали и наносили на поверхность чашек Петри. Не менее 10 часов чашки выдерживали при комнатной температуре. Затем, чашки Петри отмывали стерильным 0.1 М водным раствором глицина в течение 15-30 минут. Раствор глицина удаляли и в течение 1 часа чашки отмывали водой («Millipore», Milli-Q Advantage А10, USA). Рентгеноструктурный анализ.

Исследование кристаллической структуры перламутра проводилось с помощью метода рентгеновской дифрактометрии на аппарате «ДРОН-2» (Россия). Рентгеноспектральный анализ.

Исследование элементного состава образцов перламутра проводили методом растровой электронной микроскопии с рентгеноспектральным микроанализатором (РЭМ-РСМА) на микроскопе JSM-6360LV фирмы «Jeol» (Япония) с микрозондовым анализатором INCA фирмы «Oxford Instruments» (Великобритания) по стандартным методикам. Ускоряющее напряжение - 20 кВ. Диапазон регистрируемых элементов - от бора до урана.

7

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гистологическое исследование ткани мантии моллюска. Культивирование ткани и эпителиальных клеток мангни в стандартных условиях.

Для гистологического исследования было взято 5 образцов краевой части мантии. Исследование края мантий показало наличие продольной борозды. На дне ее находился краевой валик, состоящий из многослойного эпителия (рис.1), который выделяет конхиолиновый слой раковины.

На основании, изучения гистологических препаратов, пришли к выводу, о том, что для получения культуры эпителиальных клеток мантии, образующих перламутр и арагонит, необходимо чтобы эксплантат для культивирования, имел в своем составе краевой валик.

Рис. 1. Эпителиальный валик краевой Рис. 2. Миграция эпителиальных части мантии моллюска. клеток мантии моллюска.

Культивирование ткани и эпителиальных клеток мантии в стандартных условиях.

Для культивирования ткани мантии и эпителиальных клеток в стандартных условиях, использовали среду DMEM\F-12 (1:1), дополненную 10% ЭТС и антибиотиками (стрептомицин 250 мкг/мл, пенициллин 250 мкг/мл).

Через 24 часа после инициации культуры ткани отметили интенсивную миграцию клеток (рис.2) нескольких типов: фибробластоподобные клетки, крупные клетки Лейдига, клетки гемолимфы, и преимущественно эпителиальные клетки. Соотношение этих клеток в каждом конкретном эксперименте было не одинаковым, но процент эпителиальных клеток был всегда не менее 60% (табл.1).

Таблица 1. Соотношение разных типов клеток, мигрировавших из эксплантата

мантии.

Эпителиальные Клетки Лейдига Фибробластоподобные Гемолимфы

65% 25% 5% 5%

Миграция клеток проходила интенсивно, особенно в первую неделю культивирования. Затем, интенсивность падала, начиная с 12-14 суток культивирования. При систематической смене среды БМЕМ/Р-П, большая часть эпителиальных клеток откреплялась. Оставшиеся клетки не были активно пролиферирующими и оставались прикрепленными еще в течение 10-20 дней, затем численность клеточной популяции, продолжала сокращаться и к 20-30 суткам истощалась.

При культивировании ткани и эпителиальных клеток мантии, в стандартных условиях, полностью отсутствовал процесс кристаллизации арагонита и образования перламутра.

На основании проведенных экспериментов было сделано заключение: что для обеспечения процесса биоминерализации в целом, и кристаллизации арагонита в частности, необходимо модифицировать ростовую среду БМЕМ/Р-12 и усилить адгезивные свойства ткани и эпителиальных клеток мантии.

Культивирование ткани мантии в оптимизированной питательной среде и на посуде, обработанной субстратами.

Для культивирования тканей мантии моллюсков применяют самые разнообразные стандартные ростовые среды, такие как: DMEM [Barik S.K., Jena J.K., 2004], L-15 [Chen S.N., Wen C.M., 1999], F-12 [Gardner D. В., Turner F. S., 1991]. Такие стандартные ростовые среды содержат в своем составе все вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности и функционирования клеток. Взяв за основу ростовую среду DMEM/F-12 (1:1), мы провели ряд экспериментов, и пришли к выводу о необходимости введения в стандартный питательный раствор добавок. Такая модификация среды была вызвана отсутствием процесса кристаллизации перламутра при культивировании в стандартной DMEM/F-12.

Моллюски могут синтезировать большинство аминокислот, но для ускорения роста клеток и образования перламутра, желательно обеспечить их аминокислотами, которые способствуют этим процессам. Для идентификации и определения концентрации аминокислот, связанных с процессом образования перламутра, Досун Ли с соавторами (1989) провели аминокислотный анализ, который показал, что практический интерес среди индивидуальных аминокислот представляют собой аланин и глицин. Они находятся в самых высоких концентрациях в тканях, но могут варьировать по количеству, в зависимости от родовой принадлежности моллюска. Поэтому аланин и глицин были добавлены в ростовую среду в необходимых концентрациях для обеспечения процесса биоминерализации.

В этом случае, для культивирования ткани мантии и эпителиальных клеток использовали оптимизированную ростовую среду DMEM\F-12 (1:1), дополненную 10% инактивированной ЭТС, 1-кратными заменимыми и незаменимыми растворами аминокислот, раствором глицина (0,88 мг/мл), раствором аланина 0,52 мг/мл, антибиотиками: стрептомицин 500 мкг/мл, пенициллин 500 мкг/мл, канамицина сульфат 50 мкг/мл, гентамицин 40 мкг/мл; препаратом Микосист ® в концентрации 120 мкг/мл.

Во многих зарубежных работах было заявлено, что кристаллизация арагонита в культуре ткани мантии происходит на поверхности чашек Петри или стеклах, предварительно не обработанных никакими субстратами (Nadu Т., 1991). К примеру, в работе индийских ученых [Barik S.K., Jena J.K., 2004], было показано, что одиночные кристаллы арагонита появляются в культуре эпителиальных клеток на 20- 40 день. После проведения ряда экспериментов по культивирования ткани мантии моллюска на чашках Петри не покрытых никакими субстратами, мы не получили аналогичной кристаллизации в заданный срок и адгезия эпителиальных клеток была крайне низкой. Стало ясно, существует необходимость усиления адгезии эпителиальных клеток и собственно эксплантата ткани мантии к поверхности дна чашек Петри, для обеспечения нормального функционирования ткани и для кристаллизации арагонита. Нами был использован поли-Ь-лизин гидробромид и белковые мембраны на основе экстрапаллиальной жидкости моллюсков.

Поверхность чашек Петри обрабатывали:

1. поли- L- лизином гидробромидом с М.В. 150-300 тыс.

2. белковыми мембранами на основе модифицированной экстрапаллиальной жидкостьи (ЭПЖ).

Субстрат поли- L- лизин гидробромид.

После инициации культуры ткани мантии, через 24 часа, происходила интенсивная миграция клеток, преимущественно эпителиальных. С третьих по седьмые сутки фронт мигрирующих клеток, удалялся от края мантии, клетки проявляли хорошие адгезивные свойства и были заметны редкие митозы. Эпителиальные клетки выглядели достаточно мелкими, и их размер составлял в среднем 5 мкм. Часть клеток была неправильной формы, округлой, а часть более вытянутой - эллипсовидной (рис.3).

На десятые и последующие сутки миграция клеток из ткани мантии, прекратилась. Клеточные потери при смене питательной среды были не значительными, порядка 1 % от общего числа клеток. Митозы в данной культуре эпителиальных клеток, были редкими. Вероятно, отсутствие каких-

либо факторов, имитирующих тканевую среду мантии моллюска, привело к утрате культурой эпителиальных клеток способности к самообновлению.

На 20 сутки, количество прикрепленных эпителиальных клеток, составляло около 50% от монослоя, наблюдаемого в первые пять суток.

На 30 сутки культивирования, эксплантаты ткани мантии извлекали из чашек Петри и анализировали поверхность, находящуюся под ними. Под тканью мантии, были обнаружены островки эпителиальных клеток, между которыми четко просматривался белковый или органический матрикс (рис.4), что являлось предпосылкой для возникновения процесса биоминерализациии.

Под эксплантатами ткани мантии были обнаружены кристаллы различных типов: игольчатые, альвеолярные, многослойные и однослойные пластинчатые и гексагональные.

Игольчатая и альвеолярная типы кристаллизации арагонита - побочные виды кристаллизации, не входящие в состав структуры перламутра.

Игольчата кристаллизация была представлена, кристаллами арагонита, принявшими форму иглы (от 2 до 15-20 мкм в длину и 1-2 мкм в ширину) (рис. 5). На рисунке 6 показана альвеолярная кристаллизация арагонита в виде

Рис. 3. Культура эпителиальных клеток мантии.

Рис 4. Эпителиальные клетки мантии. Стрелкой показан органический матрикс.

одиночных кристаллов разбросанных по поверхности чашки Петри, сходная с кристаллизацией у индийского исследователя Nadu Т.( 1994).

Так же под тканью мантии была обнаружена пластинчатая кристаллизация (многослойная и однослойная). Мелкие, пластинчатые кристаллы образовывались на белковом матриксе.

Именно на его поверхности, в составе специфических белков, находятся центры кристаллизации арагонита. Образовываясь на органическом матриксе, мелкие пластинчатые кристаллы арагонита трансформировались в многослойный перламутр (рис.7).

Многослойная структура перламутра складывается из множества пластинчатых кристаллов арагонита, которые в свою очередь имеют различную ориентацию. Перламутр находился преимущественно в зоне краевого валика мантии (рис.8), но отдельные участки перламутра встречались и под всей толщей ткани.

На основании данных полученных из серии экспериментов сделали следующие выводы:

1. Покрытие поверхности чашек Петри поли-Ь-лизином, усилило адгезию клеток и тканей мантии моллюска, вследствие чего, культура эпителиальных клеток

Рис. 5. Игольчатая кристаллизация арагонита.

Рис. 6. Кристаллизация арагонита в форме альвеол.

мантии смогла просуществовать не менее 45 дней, был инициирован процесс кристаллизации арагонита.

2. Применение оптимизированной питательной среды ОМЕМЯМ2 привело к увеличению времени существования культуры эпителиальных клеток и тканей мантии моллюска. Так же оптимизированная питательная среда способствовала процессу кристаллизации арагонита.

Рис. 7. Многослойный перламутр. Рис. 8. Многослойная пластинчатая

кристаллизация арагонита в зоне краевого валика мантии.

Использование в качестве субстрата белковых мембран.

В состав ЭПЖ, основы белковых мембран, входил комплекс, структурных белков и ферментов моллюсков. Такие белки необходимы для образования арагонита и перламутра и являются не только индукторами процесса биоминерализации, но и регуляторами этого процесса. Поэтому, применение белковых мембран для культивирования ткани мантии, обеспечило успешный процесс кристаллизации арагонита и перламутра.

В качестве субстрата для усиления адгезии и инициации кристаллизации арагонита, использовали белковые мембраны, приготовленные на основе модифицированной эксграпаллиальной жидкости (ЭПЖ). Для предотвращения

вымывания белков матрикса, в процессе культивирования тканей мантии, мембрану фиксировали либо формалином, либо глютаровым альдегидом.

Белковая мембрана на основе ЭПЖ, фиксированная формалином, после приготовления и высушивания, становилась видимой в микроскоп (рис. 9). Она представляет собой тонкую, прозрачную пленку. Такая мембрана сохраняла свои функциональные свойства, в частности, ферментативную активность и центры кристаллизации арагонита.

Белковая мембрана на основе ЭПЖ, которая фиксировалась глютаровым альдегидом, не была видима в микроскоп и способствовала формированию арагонита и перламутровых слоев, в меньшей степени.

На белковых мембранах, после культивирования тканей мантии, была обнаружена кристаллизация арагонита и перламутра. В основном, кристаллизация характеризовалась образованием многослойного перламутра, а одиночные кристаллы арагонита, были характерны лишь для краевых участков тканей мантии.

Были получены все формы кристаллизации арагонита: игольчатая, альвеолярная, однослойная пластинчатая и многослойная перламутровая, гекса-и/или полигональная.

Любой тип кристаллизации начинался с формирования кристалла на основе центра кристаллизации, в составе органического матрикса мембраны ЭПЖ. Игольчатая и альвеолярная кристаллизации были идентичны полученным в предыдущих экспериментах.

Следующим типом кристаллизации на основе ЭПЖ, являлись мелкие пластинки арагонита, расположенные в один слой. Размер таких пластинок около 0,5-1 мкм. Пластинки начинали свой рост в центре кристаллизации на органическом матриксе и образовывали однослойные перламутр. Затем, образовывались следующие слои, и выстраивалась трехмерная, структура перламутра (рис. 10).

Рис 9. Белковая мембрана. Рис. 10. Многослойный перламутр.

Стрелками показаны края мембраны. Стрелками показаны однослойный

(светлый) и многослойный (темный) перламутр.

При использовании белковых мембран как основ для культивирования и кристаллизации, процесс образования арагонита, по сравнению с культивированием тканей мантии без мембран, заметно интенсифицировался и первые мелкие пластинки арагонита, образовывались на поверхности белковых мембраны, уже на 3 сутки культивирования.

После образования нескольких слоев перламутра, на их основе начинали группироваться следующие полигональные структуры (рис.11). Возможно, эти полигональные структуры представляют описанные в литературе, арагонитные таблетки, упакованные в виде «стопки монет» (Blank S., et al., 2003).

При рассмотрении природного перламутра, обнаружили наличие полигональных структур в составе перламутра раковины моллюска (рис. 12 А). Подобные структуры были обнаружены и при культивировании ткани мантии на мембране на основе ЭПЖ. В начале, гексагональные пластины были очень тонкие и практически прозрачные (рис. 12 Б), но по мере формирования многослойного перламутра, пластины росли и образовывали многослойную структуру.

т

f

]

Рис. 11. Полигональные кристаллы арагонита в виде «стопки монет».

А. Арагонитовые таблетки, вид сбоку (Blank S., et al., 2003); Б. Арагонитовые таблетки, образованные в культуре ткани мантии, вид

сверху.

Рис. 12. Гексагональные пластины арагонита. А-природный перламутр раковины моллюска; Б- тонкие гексагональные кристаллы арагонита, окруженные органическим матриксом, полученные в культуре ткани

мантии.

При культивирования ткани мантии на белковых мембранах, образовывался достаточно крупный и плотный слой перламутра, видимый и не вооруженным глазом (рис. 13). По размеру перламутровые слои были от 1 мм и до 1-3 см.

Рис. 13. Многослойный перламутр.

В природных условиях во время роста раковины моллюсков происходит формирование слоев перламутра, и арагонит формирует в нем структуры различного типа (Сребродский Б.И., 1985). В процессе кристаллизации арагонита в культуре ткани мантии были выявлены его различные формы: игольчатая, альвеолярная, пластинчатая, полигональная. Все перечисленные формы кристаллов арагонита и многослойный перламутр образовывались при культивировании ткани мантии на мембранах на основе ЭПЖ. Кристаллизация арагонита в виде игл или альвеол является побочной, т.к. в структуру перламутра такие формы кристаллов не входят. Натуральный перламутр, состоит из кристаллов арагонита в виде пластин, различного уровня организации, или псевдогексагональных кристаллов арагонита (Тгессаш ег а1., 2003).

Просуммировав полученные результаты, сделали следующие вывод: белковые мембраны усиливали адгезию и интенсифицировали процесс образования и роста кристаллов арагонита и перламутра, в культуре ткани мантии моллюска, и первые кристаллы арагонита образовывались уже на 3 сутки. При отсутствии мембран, начальный процесс кристаллизации арагонита начинался в среднем с 10-14 суток.

Таким образом, на основе проведенных исследований, по осиОепьоаям кристаллизации перламутра в культуре ткани мантии моллюска, было показано, что для эффективного процесса образования перламутра и его интенсификации, необходимо присутствие следующих компонентов: модифицированной питательной среды, белковых мембран на основе ЭПЖ. Интенсификация процесса биоминерализации, за счет применения белковых мембран или других субстратов, необходима с целью дальнейшего применения перламутра, как материала для реконструкции костной ткани.

Рентгеноструктурный и рентгеноспектральный анализы перламутра. Рентгеноструктурный анализ.

Кристаллы арагонита обладают строгой периодичностью строения и представляют собой дифракционную решетку для рентгеновских лучей. Рентгеновская дифрактометрия природного образца перламутра раковины моллюска подтвердила наличие в нем арагонита, как основного компонента. Небольшая примесь кальцита в составе перламутрового слоя раковины является нормой.

Рис. 14. Дифрактограмма перламутра, полученного в культуре ткани мантии. Арагонит, ромбоэдрическая структура Рпта, Со Ка - излучение, период решетки измеряется в ангстремах - а -5,74, в - 4,96, с - 7,97 по АБТМ.

Рентгеноспектральный анализ.

Рентгеновская спектроскопия подтвердила наличие изоморфа карбоната кальция, арагонита, как основного составляющего компонента перламутра, полученного in vitro. Так же, был установлен качественный и количественный состав арагонита, на основании анализа положения и интенсивности линий характеристических спектров рентгеноспектрального анализа.

На рисунке 15 отображен характеристический спектр опытного образца перламутра раковины двустворчатого моллюска, полученного при культивировании ткани мантии. Характерные пики по атомам Са, С, и О, указывают на наличие данных атомов, а также на их соотношение в образце.

В таблице 2 показано соотношение элементарного состава опытного образца перламутра, с указанием входящих в состав атомов. Из соотношения доли атомов видно, что образец состоит преимущественно из трех типов атомов Са, С, О, составляющих карбонат кальция - основу арагонита. Небольшая примесь атомов натрия не меняет общего соотношения атомов карбоната кальция и не отражается на структуре арагонита.

а

в

«

то

и

м

1« я

MV

Рис. 15. Характеристический спектр образца перламутра, полученного in vitro.

Таблица 2. Элементарный состав перламутра, полученного in vitro.

Элемент Величина сигнала Весовая доля % 8 отклонения Доля атомов %

С 27.23 42.42 0.63 50.02

О 20.38 55.59 0.64 49.21

Na 0.11 0.27 0.10 0.16

Ca 0.96 1.72 0.08 0.61

Всего 100

Известно много зарубежных работ по получению культур ткани мантии моллюсков, образующих в природе перламутр [Bank S.K., Jena J.K., 2004]. Принципиально новый подход в данном направлении - это исследование процесса образования перламутра у моллюсков не образующих в природе жемчуг.

Мы разработали отечественную технологию культивирования ткани мантии моллюсков, позволяющую получать перламутр. Впервые в мировой практике были использованы моллюски родов Unió и Anodonta для культивирования перламутра in vitro.

На основании проведенных нами исследований и полученных результатов можно сказать, что впервые доказана принципиальная возможность, использования культуры ткани мантии пресноводных моллюсков, родов Unió и Anodonta, для образования перламутра.

выводы

1. Получена функционально-активная культура ткани мантии и эпителиальных клеток пресноводных моллюсков родов Unió и Anodonta, способная существовать 50 дней и более.

2. Оптимизирована стандартная ростовая среда DMEM/F-12 (1:1) для обеспечения успешного процесса кристаллизации арагонита и образования многослойного перламутра in vitro.

3. Показано, что культивирование ткани и эпителиальных клеток мантии на поли-Ь-лизине и в особенности на белковых мембранах, на основе экстрапаллиальной жидкости, индуцирует и поддерживает процесс эффективной кристаллизации арагонита.

4. Установлено, что кристаллы арагонита in vitro, могут принимать различную форму: альвеолярную, игольчатую, полигональную и преимущественно пластинчатую.

5. На основании полученных данных, процесс образования перламутра in vitro, можно подразделить на три основных этапа:

¡.кристаллизацию мелких пластин арагонита на основе органического матрикса мембран из экстрапалиальной жидкости, начиная с 3 суток культивирования ткани мантии.

¡¡.образование однослойного перламутра на 8-10 сутки культивирования мантии на мембранах из экстрапаллиальной жидкости.

¡¡¡.образование крупных полигональных пластин арагонита, на основе подлежащих слоев перламутра, начиная с 14 суток культивирования ткани мантии моллюска.

6. Арагонит и перламутр, полученные в культуре ткани мантии моллюска, идентичны природным, что подтверждено рентгеноструктурным и рентгеноспектральным анализами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковтун Н.Е., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Ярыгин Н.В., Черкашин C.B., Бурнашова Е.Ю., Сеид-Гусейнов A.A. Разработка модели биокристаллизации для изучения процессов ускоренного остеогенеза с использованием культуры ткани мантии моллюска // Хирург.- 2007.-№12,- с.3-6

2. Ковтун Н.Е., Ярыгин К.Н., Ярыгин Н.В., Черкашин C.B., Порай-Кошиц A.M., Бурнашова Е.Ю., Сеид-Гусейнов A.A. Экспериментальная модель биокристализации арагонита в культуре ткани мантии моллюска// Медицина критических состояний- 2008.-№2.- с. 36-38

3. Сеид-Гусейнов A.A., Ковтун Н.Е., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Ярыгин Н.В. Перспективы применения биотехнологии на основе перламутра и его белковых компонентов с целью восстановлению костной ткани// Вестник трансплантологии и искусственных органов.- 2008.-№4. -

с. 61-63

Подписано в печать 25.09.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 825 Тираж: 100 экз.

Типография «11-Й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковтун, Надежда Евгеньевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Анатомия и физиология двустворчатых моллюсков

1.2. Минерально-органическая система перламутрового слоя раковины

1.2.1. Строение раковины

1.2.2. Представление о процессах биоминерализации в 70-80х годах прошлого столетия

1.2.3. Комплекс протеинов как основа кристаллизации арагонита в перламутровом слое. Новые представления о процессах биоминерализации

1.2.4. Карбоангидраза перламутрового слоя жемчужниц

1.2.5. Характеристика новых белков, входящих в состав минерально-органической системы раковин моллюсков

1.3. Остеоиндуктивные свойства перламутра и его компонентов

1.4. Получение культуры ткани мантии моллюсков и эпителиальных клеток. Ростовые среды

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Подготовка животных для получения тканевых эксплантатов

2.2. Культура ткани мантии и эпителиальных клеток мантии моллюска

2.3. Приготовление модифицированной ростовой среды

2.4. Гистологическое и микроскопическое исследование ткани мантии и эпителиальных клеток мантии моллюска

Обработка дна чашек Петри различными типами субстратов и мембран

Рентгеноспектральный и рентгеноструктурный анализы

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Культивирование ткани мантии и эпителиальных клеток в стандартных условиях. Гистологическое исследование ткани мантии моллюска

3.2. Культивирование ткани мантии в модифицированной ростовой среде и на чашках Петри, обработанных различными субстратами.

3.2.1. Субстрат поли-L-лизин гидробромид

3.2.2. Использование в качестве субстрата белковых мембран на основе ЭПЖ

3.3. Рентгеноструктурный и рентгеноспектральный анализы перламутра

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков родов Unio и Anodonta, обитающих в реках Подмосковья"

В последние годы разработке методов искусственного получения перламутра, с использованием мантийной ткани двустворчатых моллюсков посвящено множество работ. Работы по использованию культуры ткани мантии проводятся на пресноводных и преимущественно морских моллюсках (Barik, et al., 2004). Мировые запасы природных жемчужниц уменьшаются с каждым годом, а разведение таких раковин процесс дорогостоящий и трудоёмкий.

В России имеются огромные запасы пресноводных перламутробразующих раковин, в основном, двух родов, Anodonta и Unio. Они распространены в реках, практически по всей территории России, от Европейской части до Дальнего Востока. Anodonta и Unio образуют хороший перламутровый слой, что допускает возможность получения перламутра по средствам культуры ткани мантии.

Перламутр, на сегодняшний день, является одним из наиболее исследуемых материалов, стоящих на вооружении реконструктивной медицины и ортопедии. Свойства перламутра в целом и отдельных его белковых или минеральных компонентов исследуются не только in vitro, но и на животных моделях. На основании экспериментальных данных были сделаны заключения, о способности перламутра двустворчатых моллюсков и его частных компонентов стимулировать клеточную дифференциацию и способствовать регенерации костной ткани.

Натуральные раковины моллюсков, являются идеальной основой для тканевой инженерии с целью обеспечения структурного микроокружения, аналогичного кости, подразумевающего необходимую архитектонику для васкуляризации, инвазии клеток кости и ангиогенеза. Перламутр может применяться как ортопедический наполнитель, обладая остеоиндуктивным потенциалом, связанным с его структурными свойствами (Green, at al., 2002).

Таким образом, актуальным представляется изучение в рамках одной работы вопросов, связанных как с получением культуры ткани мантии, так и с проблемой образования полноценного перламутра in vitro. Подобное исследование может не только углубить теоретическое представление о процессе формирования перламутра, но и будет способствовать получению модели, образующей перламутр в комплексе с функционально активными белковыми компонентами, обладающими остеоиндуктивными свойствами.

Целью настоящей работы явилось получение культуры ткани и эпителиальных клеток мантии пресноводных моллюсков с сохранением их секреторной активности.

Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Получить функционально активную культура ткани мантии и эпителиальных клеток пресноводных моллюсков родов Unio и Anodonta.

2. Оптимизировать качественный состав питательной среды для обеспечения успешного процесса кристаллизации перламутра и его основного структурного компонента арагонита.

3. Индуцировать и форсировать процесс кристаллизации арагонита, в культуре ткани и эпителиальных клеток мантии.

4. Изучить этапы процесса образования перламутра in vitro.

5. Изучить типы кристаллизации арагонита in vitro.

6. Рентгеноструктурным и рентгеноспектральным анализами подтвердить получение в культуре ткани мантии моллюска арагонита и перламутра, идентичного природному.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ковтун, Надежда Евгеньевна

Выводы

1. Получена функционально-активная культура ткани мантии и эпителиальных клеток пресноводных моллюсков родов Unio и Anodonta, способная существовать 50 дней и более.

2. Оптимизирована стандартная ростовая среда DMEM/F-12 (1:1) для обеспечения успешного процесса кристаллизации арагонита и образования многослойного перламутра in vitro.

3. Показано, что культивирование ткани и эпителиальных клеток мантии на поли-Ь-лизине и в особенности на белковых мембранах на основе ЭПЖ, индуцирует и поддерживает процесс эффективной кристаллизации арагонита.

4. Установлено, что кристаллы арагонита in vitro, могут принимать различную форму: альвеолярную, игольчатую, полигональную и преимущественно пластинчатую.

5. На основании полученных данных, процесс образования перламутра in vitro, можно подразделить на три основных этапа:

• кристаллизацию мелких пластин арагонита на основе органического матрикса мембран ЭПЖ, начиная с 3 суток культивирования ткани мантии.

• образование однослойного перламутра на 8-10 сутки культивирования мантии на мембранах из ЭПЖ.

• образование крупных полигональных пластин арагонита, на основе подлежащих слоев перламутра, начиная с 14 суток культивирования ткани мантии моллюска.

6. Арагонит и перламутр, полученные в культуре ткани мантии моллюска, идентичны природным, что подтверждено рентгеноструктурным и рентгеноспектральным анализами.

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю члену-корреспонденту РАМН, доктору биологических наук, профессору К.Н. Ярыгину и научному консультанту доктору медицинских наук, профессору А.А. Сеид-Гусейнову за помощь и ценные советы.

Автор также выражает искреннюю признательность: В.Н. Ярыгину, Н.В. Ярыгину, А.Ю. Лупотову, О.Ю. Абакумовой, В.Н. Орлову, Е.Е. Егорову, С.В. Черкашину, Е.Ю. Бурнашовой, В.Л. Калихману, В.П. Свиридову за помощь в выполнении экспериментальной части диссертации.

Автор благодарит всех сотрудников кафедры Клеточной биологии и технологий РГМУ, а так же все сотрудников лаборатории клеточной биологии института биомедицинской химии РАМН за проявленный интерес к работе и за обсуждение результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковтун, Надежда Евгеньевна, Москва

1. Голубев С.Н. Реальные кристаллы в скелетах кокколитофорид / М.: Наука, 1981, С. 164.

2. Григорьев Д.П. Минерал как организм / В кн.: Проблемы генетической информации в минералогии. Сыктывкар, 1976, С. 6-7.

3. Досун Ли. Патент, номер международной заявки WO 89/02919, 1989.

4. Козлова Л.Е., Краснов Е. В., Глебовская Е. А. и др. Сравнительное изучение скелетного состава ископаемых и современных кораллов / В кн.: Палеобиогеохимия морских беспозвоночных. Новосибирск: Наука, 1980, С. 3-23.

5. Нгуэн Тинь. Кальций в тканях и полостных жидкостях некоторых пресноводных моллюсков семейства Unionidae // Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МГУ, 1973, С. 29.

6. Пастернак Р.К. Моллюски / В кн.: Жизнь животных. М.: Просвещение, 1988, С.447.

7. Полянский Ю. И. Двустворчатые моллюски/ В кн.: Зоология беспозвоночных. М: Высшая школа, 1981, стр. 81-101

8. Попов С.В. Микроструктура раковины и систематика кардиид / М.: Наука, 1977, С. 123.

9. Сребродский Б.И. Жемчуг.- М.: Наука, 1985, с. 31-42, 46-56.

10. Фрешни Р., Конки Д., Эрба Э., и др. Культура животных клеток. Методы / М.: Мир, 1989, с. 27-44.

11. Шнюков Е.Ф., Деменко Д.П. Жемчуг Черного моря / В кн.: Геологияшельфа УССР. Твердые полезные ископаемые. Киев: Наук. Думка, 1983, С. 173-179.

12. Addadi, L., Weiner, S. Interactions between acidic proteins and crystals: stereochemical requirements in biomineralisation // Protc. Natl Acad. Sci. USA, 1985, V. 82, P. 4110-4114.

13. Addadi L., Berman A., Oldak J.M., Weiner S. Structural and stereochemical relations between acidic macromolecules of organic matrices and crystals // Connect Tissue Res., 1989, v. 21, P.127-135.

14. Addadi L., Moradian J., Shay E., Maroudas N. G., and Weiner S. A Chemical Model for the Cooperation of Sulfates and Carboxylates in Calcite Crystal Nucleation: Relevance to Biomineralization// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, P. 2732-2736.

15. Auzoux S., Domart-Coulon I., Doumenc D. Gill cell cultures of the butterfish clam Ruditapes decussateus II J. Mar. BiotechnoL, 1993; v.l, P. 79-81.

16. Blank S., Arnoldi M., Khoshavaz S., Treccani L., Kuntz M., Grathwohl G. and Fritz M. The nacre protein perlucin nucleates growth of calcium carbonate crystals //Jour. Of Microscopy, 2003, v.212, P.280-291.

17. Barik S.K., Jena J.K., and Janaki Ram. CaC03 crystallization in primary culture of mantle epithelial cells of freshwater pearl mussel // Science, 2004, v. 86, #5, P.730-733.

18. Beedham G.E., and Owen G. The mantle cavity of shell of Solemya parkinsoni II Proc. Zool Soc., 1965, V. 145, P. 405-430.

19. Belcher, A.M., Wu X.H., Christensen, R.J., Hansma, P.K., Stucky, G.D. and Morse, D.E. Control of crystal phase switching and orientation by soluble mollusc-shell proteins // Nature, 1996, v. 381, P.56-58.

20. Belcher A. M. Spatial and temporal resolution of interfaces, phase transition and isolation of three families of proteins in calcium carbonat-basedbiocomposite materials // Ph.D. thesis, University of California, Santa Barbara, CA, 1996.

21. Berman A., Hanson J., Leiserowitz L., Koetzle T.F., Weiner S. & Addadi L. Biological control of crystal texture: a widespread strategy for adapting crystal properties to function // Science, 1993, v. 259, P.776-779.

22. Bevelander G., Nakahara H. Structure and amino acid composition of pearl exposed to sea water for four hundred years // Earth Sci., 1975, v. 29, #2, P. 87-91.

23. Boutin J.A. Myristoylation // Cell Signal, 1997, v. 9, P. 15-35.

24. Bowen C.E., and Tang H. Conchiolin-protein in aragonite shells of mollusks // Сотр. Biochem. Physiol., 1996, v. 115, P. 269-275.

25. Boskey A.L. Mineral-matrix interactions in bone and cartilage// Clin Orthop Relat Res,. 1992, v.281, P. 244-274.

26. Borbas J.E., Wheeler A.P. and Sikes C.S. Molluscan shell matrix phosphoproteins: correlation of degree of phosphorylation to shell mineral microstructure and to in vitro regulation of mineralization // J.Exp. ZooL, 1991, v. 258, P. 1-13.

27. Brunet P.C. Sclerotins // Endeavor, 1967, v. 26, P. 68-74.

28. Cariolou M.A. and Morse D.E. Purification and characterization of calcium-binding conchiolin shell peptides from the mollusc, Haliotis rufescens, as a function of development// J. Сотр. Physiol. В., 1988, v. 157, P. 717-729.

29. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding // Methods Cell Sci., 1999; v. 21, P. 183-192.

30. Crenshaw M.A. The soluble matrix from Mercenaria mercenaria shell // Biomineralisation, 1972, v. 6, P. 6-11.

31. Crenshaw M.A. and Ristedt H. Histochemical and structural study of nautiloid septal nacre // Biomineralization, 1975, v.8, P. 1-8.

32. Davis J.G, Oberholtzer J.C, Burns F.R, Greene M.I. Molecular cloning and characterization of an inner ear-specific structural protein // Science, 1995, Feb 17, v. 267, P. 1031-1034.

33. Delattre O., Catonne Y., Berland S., Borzeix S. and Lopez E. Use of mother of pearl as a bone substitute Experimental study in sheep // European Jour. Of Orthopaedic Surgery & Traumatology, 1997, v. 7, #2, P. 143-147.

34. Duplat D., Chabadel A., Gallet M., Berland S., Bedouet L. The in vitro osteoclastic degradation of nacre // Biomaterials, 2005, v. 26, # 15, P. 2767-2773.

35. Endon M., Hasegawa Y. Culture of mantle epithelial cells expressing shell matrix proteins from scallop Patinopecten yessoensis II Fisheries Science, 2006, v. 72, P. 1277-1285.

36. Falini G., Albeck S., Weiner S., and Addadi L. Control of aragonite or of calcite polymorphism by mollusk shell macromolecules // Science, 1996, v. 271, P. 67-69.

37. Fersht A. Structure and Mechanism in Protein // Science, New York, N.Y.: W.H. Freeman and Company, 1999, chap 5, sect G2, 186, and chap 7, sect D, P. 242.

38. Fritz M. and Morse D.E. The formation of highly organized biogenic polymer/ceramic composite materials: the high-performance microaluminate of molluscan nacre // См/т. Opin., Cell Biol,. 1998, v. 3, P. 55-62.

39. Garcia-Gasca A., Isabel R., Baez O., Betancourt M. Microscopic anatomy of the mantle of the pearl oyster Pinctada mazatlanica (Hanley, 1856) // J. Shellfish Res., 1994, v. 13, P. 85-91.

40. Gardner D. В., Turner F. S., Myers J. M., Dietz Т. H. and Silverman H. Long-term culture of freshwater mussel gill strips: use of serotonin to affect aseptic condition//Biol. Bull., 1991, v. 181, p. 175-180.

41. Grand R.J.A. Acylation of viral and eukaryotic proteins // Biochem J., 1989, v. 258, P. 625-638.

42. Gordon J. and Carriker M.R. Sclerotized protein in the shell matrix of a bivalve mollusk//Mar. Biol., 1980, v. 57, P. 251-260.

43. Gorski J.P. Acidic phosphoproteins from bone matrix: a structural rationalization of their role in biomineralization // Calcif Tissue Int., 1992 , v. 50 (5), P. 391-396.

44. Green D., Howard D., Yang X., Partridg K. Human osteoprogenitors attachment, growth and differentiation on marine invertebrate skeletons // European Cells and Materials, 2002, V. 4, P. 133-134.

45. Greenfield E.M., Wilson D.C. and Grenshaw M.A. Ionotropic nucleation of calcium carbonate by molluscan matrix // Am. Zool., 1984, v. 24, P. 925-932.

46. Hare P.E. Amino acid in the proteins from aragonite and calcite in the shell of Mytillus californianus//Science, 1963, v. 139, P. 216-217.

47. Hare P.E. and Abelson P.H. Amino acid composition of some calcified proteins // Carnegie Inst Washington Yearbk, 1965, V. 64, P. 223-232.

48. Hattan S., Thomas M. and Chasteen D. Purification and characterization of a novel calcium-binding protein from the extrapallial fluid of the mollusc, Mytilus edulis II J.Biol.Chem., 2001, v. 276, P.4461-4468.

49. Hauschka P.V, Carr S.A. Calcium-dependent alpha-helical structure in osteocalcin // Biochemistry, 1982, v. 21 (10), P.2538-2547.

50. Hetrick F.M, Stephens E., Lomax N., Lutrell K. Attempts to develop a marine molluscan cell line // University of Maryland, Sea Grant College Program Technical Report UM-SG-TS-81-06, College Park, 1981.

51. Iwata K. Ultrastructure of the conchiolin matrices in molluscan nacreous layers II J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., 1975, v. 17, P. 173-229.

52. Jabbour-Zahab R., Chagot D., Blanc F., Grizel H. Mantle histology, histochemistry and ultrastructure of the pearl oyster Pinctada margaritifera (L.) // Aquat. Living Resour., 1992, v. 5, P. 287-298.

53. Janaki Ram K., Barik S. K. and Jena J. K. In vitro explant culture of mantle epithelium of freshwater pearl-producing mussel, Lamellidens marginalis II The Sixth Indian Fisheries Forum, Mumbai, 2002, P. 270.

54. Kitano Y. The behavior of various inorganic ions in the separation of calcium carbonate from a bicarbonate solution // Bull Chem. Soc. Jpn., 1962, V. 35, P.1973-1980.

55. Kitano Y., and Hood D.W. Calcium carbonate crystal forms formed from sea water by inorganic processes // J. Ocean Soc. Jpn., 1962, V.18, P.35-39.

56. Kitano Y. and Hood D.W.T. The influence of organic material on the polymorphic crystallization of calcium carbonate // Geochim. Cosmochim. Acta., 1965, V. 29, P. 29-41.

57. Kitano Y. and Kanamori N. Synthesis of magnesian calcite at low temperatures and pressures // Geochem. J., 1966, v. 1, P. 1-10.

58. Kitano Y. Geochemical study on the formation of carbonate sediment: lecture by the member awarded the Oceanographical Society of Japan prize for 1986 // J. Ocean Soc. Jpn., 1986, v. 42, P. 402-420.

59. Krampitz G., Drolshagen H., Hausle J. and Hof-Irmscher K. Organic matrices of mollusc shell. In: Biomineralization and Biological Metal Accumulation, Westbroek, P., and deJong, E.W // Dordrecht, Holland: D. Reidel Publ. Co., 1983, P. 231-247.

60. Lamghari M., Almeida M., Berland S., Huet H., Laurent A., Milet C., Lopez E. Stimulation of bone marrow cells and bone formation by nacre: in vivo and in vitro studies //Bone, 1999, v.25, Suppl.2, P. 91-94.

61. Lopez E., Vidal В., Berland S., Camprasse S., Camprasse G., Silve C. Demonstration of capacity of nacre to induce bone formation by human osteoblasts maintained in vitro // Tissue Cells, 1992, v.24, P.667-679.

62. Lowenstam H.A. Minerals formed by organisms // Science , 1981, v. 211, P. 1126-1131.

63. Lowenstam H.A., and Weiner S. Biomineralization // New York, N.Y.: Oxford University Press, 1989, P. 324.

64. Mann S. Moleculer recognition in biomineralization // Nature, 1988, v. 332, P. 119-124.

65. Matsushiro A., Miyashita Т., Miyamoto H., MorimotoK., Tonomura Bl., Tanaka A., and Sato K. Presence of Protein Complex is Prerequisite for Aragonite Crystallization in the Nacreous Layer // Mar. Biotechnol. 2003, v. 5, P. 37-44.

66. Meenakshi V.R., Hare P.E. and Wilbur K.M. Amino acid of organic matrix of neogastropod shells //Сотр. Biochem. Physiol 1971, P. 1037-1043.

67. Miyamoto H., Miyashita Т., Okushima M., Nakano S., Morita T. and Matsushiro A. A carbonic anhydrase from the nacreous layer in oyster pearls // Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1996, V. 93, P. 9657-9660.

68. Miyamoto H., Miyashita Т., Okushima M., Nakano S., Morita T. and Matsushiro A. A carbonic anhydrase from the nacreous layer in oyster pearls // Proc. Nat. Acad. Sci. USA ,1996, V. 93, P. 9657-9660.

69. Moradian-Oldak J., Frolow F., Addadi L. & Weiner S. Interactions between acidic matrix macromolecules and calcium phosphate ester crystals: relevance to carbonate apatite formation in biomineralization // Proc. R. Soc. Lond. B, 1992, V. 247, P. 47-55.

70. Morse D.E., Cariolou M.A., Stucky G.D., Zaremba C.M. and Hansma P.K. Genetic coding in biomineralization of microlaminate composites // Mat. Res. Soc. Symp. Proc., 1993, V. 292, P. 59-67.

71. Mothersill C., Mulfold A. L. and Austin B. Basic methods and media. In Aquatic Invertebrate Cell Culture (eds Mothersill, C. and Austin, B.) // Springer-Praxis, UK, 2000, P. 9-14.

72. Nadu Т. Turicon Research Center, Central Marine Fisheries Research Institute.

73. Odintosova N.A, Ermak A.V, Tsal L.G. Substrate selection for long-term cultivation of marine invertebrate cells // Сотр. Biochem. Physiol., 1994; v. 107A, P. 613-619.

74. Nakahara H., Bevelander G. and Kakei M. Electron microscopic and amino acid studies on the outer and inner shell layers of Haliotis rufescens // Venus, 1982, v. 41, P. 33-46.

75. Ruth Z. Birk, Abramovitch-Gottlib L., Margalit I., Aviv M., Forty E. Conversion of adipogenic to osteogenic phenotype using crystalline porous biomatrices of marine origin // Tissue Engineering, 2006, v. 12, #1, P. 21-31.

76. Saleuddin A.S.M. and Chan W. Shell regeneration in Helix: shell matrix composition and crystal formation // Can.J.Zool. 1969, v. 47, P. 1107-1111.

77. Samata Т., Hayashi N., Kono K., Hasegawa K., Horita C., and Akera S. A new matrix protein family related to the nacreous layer formation of Pinctada fucata // FEBS Lett. 1999, V. 462, P. 225-229.

78. Shen X., Belcher A.M., Hansma P.K., Stucky G.D., and Morse D.E. Molecular cloning and characterization of Lustrin A, a matrix protein from shell and pearl nacre of Haliotis rufescens // J. Biol. Chem. 1997, v. 272, P. 3247232481.

79. Simkiss K., Wada K. Cultured pearl commercialized biomineralisation // Endeavour, 1980, v. 4, # 1, P. 32-37.

80. Sottile J., Hocking D . and Swiatek P. Fibronectin matrix assembly enhances adhesion-dependent cell growth // J. of Cell Science, 1998, v.lll, P. 2933-2943.

81. Stephens E.B., Hetrick F.M. Cultivation of granular amoebocytes from the American oyster // University of Maryland, Department of Microbiology College Park; TCA Manual, 1979, V. 5. #1.

82. Su N-C., Yamamoto G., Kimura Y., Xu Y., Yoshitake K. Can decalcified nacre induce new bone formation? // Jour. Of Shiga University of Medical Science. 2001, v. 16, P. 27-32.

83. Sudo S., Kujikawa Т., Nagakura Т., Okudo Т., Shaguchi К., Tanaka M., Nakashima K., and Tanakashi T. Structure of mollusc shell framework proteins // Nature, 1997, v. 387, P. 563-564.

84. Sud D, Doumenc D, Lopez E, Milet C. Role of water-soluble matrix fraction, extracted from the nacre of Pinctada maxima, in the regulation of cell activity in abalone mantle cell culture (Haliotis tuberculata) II Tissue Cell, 2000, v. 33, P. 154-160.

85. Suzuki M., Murayama E., Inoue H., Ozaki N., Tohse H. Characterization of Prismalin-14, a novel matrix protein from the prismatic layer of the shell Pinctada jucata// Biochem.J., 2004, v. 382, P. 205-213.

86. Takita Т., Akita E., Inouye K., and Tonomura B. Lysylt RNA synthetase from Bacillus stearothermophilus: stopped-flow kinetic analysis of enzyme-lysyladenylate formation // J. Biochem, 1998, v. 124, P. 45-50.

87. Tohill M.,. Mantovani C, McGrouther D.A., Wiberg M. and Terenghi G. Extracellular Matrix Macromolecules Enhance Schwann Cell Growth and

88. Peripheral Nerve Regeneration Through Bio-engineered Conduits // European Cells and Materials, 2003, v. 6., p. 54.

89. Towler D.A., Gordon J.I., Adams S.P., and Glaser L. The biology and enzymology of eukaryotic protein acylation // Annu. Rev. Biochem. 1988, v. 57, P. 69-99.

90. Wada K. Initiation of mineralization in bivalve mollusks // The Mechanisms of Biomineralization in animals and plants, Tokai Univ/ press, P. 7992.

91. Walters D.A., Smith B. L., Belcher A. M., Paloczi G. Т., Stucky G. D., Morse D. E., and Hansma P. K. Modification of calcite crystal growth by abalone shell proteins: an atomic force microscope study // Biophis. J. 1997, v. 72, P. 14251433.

92. Watabe N. Shell. In: Biology of the Integument, Invertebrates, Bereiterhahn J., Matolsty A. G., and Richards K. S. // Berlin: Springer-Velag, 1984, P. 448-485.

93. Weiner S., and Traub W. X-ray diffraction study of the insoluble organic matrix of mollusc shell. FEBS Lett., 1980, v. Ill, P. 311-316.

94. Weiner S. Organization of extracellularly mineralized tissues: A comparative study of biological crystal growth // Crit. Rev. Biochem 1986, v. 20, P. 365-408.

95. Weiner S. Aspartic acid-rich proteins: Major components of the soluble organic matrix of mollusc shells // Calcif. Tissue Int., 1979, v. 29, P.163-167.

96. Weiner S. Mollusc shell formation: Isolation of two organic matrix proteins associated with calcite deposition in the bivalve Mytillus californianus II Biochemistry, 1983, v. 22, P. 4139-4145.

97. Weiner S, Hood L. Soluble protein of the organic matrix of mollusk shells: a potential template for shell formation // Science, 1975, v. 190 (4218), P. 987-989.

98. Weiner S., and Traub W. Phil. Trans. R. Soc. Lond. // B, Biol. Sci. 1984, v. 304, P. 425-434.

99. Weiner, S. and Traub, W. X-ray diffraction study of the insoluble organic matrix of mollusk shells // FEBS Lett. 1980, v. Ill, P. 311-316.

100. Weiss I.M., Kaufmann S., Mann K., and Fritz M. Purification and identification of perlucin and, two new protein from the shell of the mollusc Haliotis laevigata II Biophys. BiochemRes. Commun. 2000, v. 267, P. 17-21.

101. Weiss I.M., Renner C., Strigl M.G. and Fritz M. A simple and reliable method for the determination and localization of chitin in abalone nacre // Chem. Mat., 2002, v. 14, P. 3252-3259.

102. Wen C-M, Kou G-H, Chen S-N Cultivation of cells from the heart of the heart clam, Meretrix lusoria (Roding) // J. Tiss. Cult. Meth. ,1993, v. 15, P. 123130.

103. Wheller A.P., Rusenko K. W., and Sikes C.S. In Chemical Aspects of regulation of Mineralization // University of South Alabama Publication Service, 1988, P. 9-13.

104. Wheeler A.P. Phosphoproteins of oyster (Crassostrea virginica) shell organic matrix. In: Hard Tissue Mineralization and Demineralization, Suga S., and Watabe N. (eds.) // Tokyo: Spring-Verlag, 1992, P. 171-187.

105. Wheeler A.P., Rusenko K.W., Swift D.M., and Sikes C.S. Regulation of in vitro CaC03 crystallization by fractions of oyster shell organic matrix // Mar. Biol. 1988, v. 98, P. 71-80.

106. Whitbread, L. A.;Gregg, K.; Rogers, G. E. The structure and expression of a gene encoding chick claw keratin // Gene, 1991, v. 101, P. 223-229.

107. Wiley-VCH-Verlag , Wada K. Amino acid composition of the organic matrices in the cultured pearls and shell: Profiles of Japanese science and scientists // Tokyo, 1970, P. 227.

108. Zhang Cen, Li Shuo, Ma Zhuojun. A novel matrix protein plO from the nacre of pearl oyster (Pinctada fucata) and its effects on both СаСОз crystal formation and mineralogenic cells // Marine Biotechnology, 2006, v. 8, # 6, P. 624-633.

109. Zaremba C.M., Belcher A.M., Fritz M., Li Y., Mann S., Hansma P.K., Morse D.E., Speck J.S., and Stucky G.D. Critical transitions in the biofabrication of abalone shells and flat pearls // Chem. Mater., 1996, v. 8, P. 679-690.