Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и применение фактора роста фибробластов при бессывороточном культивировании клеток-продуцентов урокиназы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и применение фактора роста фибробластов при бессывороточном культивировании клеток-продуцентов урокиназы"

ВСЕСОВЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК км. 1.И.ШШ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИЯ

На права* рукрписи

КИЗШ СВЕТЛАНА МИХАИНОВНЛ

ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ФАКТОРА РОСТА ФКВРОБ1АСТОВ ПРИ БЕГСЫВОРОТОНЮН КУЛЬТИВИРОВАИИИ КЛЕТОК - ПРОДУШГГОВ • УКЖОТМЫ

оо.23 - бмотехиохогяя

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации т соискание ученой степени канхяжат* биогогических тух

Иос*ва 1аэ1

Ь'аоота вшюянена в Научи о •щ^.нзводсгиь.чшом цел гее иски цинслой Оиотехнологии Нмнэдрава ССС1-.

Научный руководитель:

кандидат химических наук АФанасенко Г.А-

Офнциальиие ошиненги:

доктор биологических наук Народицкии Б.С.

доктор биологических наук Терских ВВ.

Ведущая организация; Всесогшши научнии центр молекулярной

Завита диссертации состоится "—" -------------- 19У1 г. в -

час. на заседании Специализированно!о Совета Д.оги.ю.т. ВШ1И се«1.,:кохоэяыственнои биотехнологии ВАСШ1* (г. Москва).

Адрес: 12725:), Москва, уд. Псковская, д. 12, корпус 4, вШШ.'Б, Специализированный совет.

С диссертации« можно оэнлкоиип-сн в библиотеке ВНИИ сель схокоэяйствешшв биотехнологии.

Автореферат ра.юсяан " ■ 1уьм г.

диагностики и лечения ИЗ СССР

/

ОБПАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Перспективны* направлением биотехнологии является получение биологически активных вешеств из культур клеток эукасиог. Необходимость использования свйоротк* крупного рогатого скота при крупномасштабном культивировании этих клеток резхо ограничивает возможности кетода и усложняет очистку препаратов вследствие нестабильности биологических свояств сыворотки, а также иэ-эа возможности попадания сывороточных белков в получаете препараты. Наличие в сыворотке ингибиторов различных биологически активных веяеста не позволяет производить их эффективную наработку культурами клеток. Это определяет актуальность проблемы создания бессывороточных син-тети еских сред (БСС) дгя культивирования зухадоотических клеток.

В настояиее время > отечественной биотехнологии используется ряд эухариотическхх линия: ян-ра - продуцент урокинаэы, сио - клетки, используемые при создании различных генно-кнхе-керных продуцентов, линия Vero, применяемая при производстве вакцин и другие. .

Ряд компонентов БСС являются обеими для культивирования зукариотических клеток, в то время как другие,, и в первуп оче<-редь, стимулируювие синтез необходимых биологически активных вешеств, - специфические для данной линии.

Наиболее ра спрос граненным компонентом БСС, разработанных за рубежом, является Факторы роста (ФР) - гормоноподобные по- -хипептиды с низкими аеаствушими концентрациями (ю-гооо mcr / мл). Помимо использования их в бессьшороточном хультивкрова-нии, «акторы роста могут найти также вирохое применение 9 ме-кицинскоя практике при заживлении ран различной этиологии. ЗследстЕме чего получение и выявление дополнительных девевыя

источников ФР. является актуальным. о

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоявеи работы является исследование влияния эхэо- и эндогенных Факторов роста на про-лифератнвную активность эукариотических клеток, в первую очередь линии клеток mi-га - продуцента урокинази, создание на основе ФР бессывороточнои ростовой среди, которая иояат быть использована в технологии получения этого тромболитика, а также при культивировании других важных для биотехнологии клеточных линий. При выполнении работы ставились следующие задачи;

1. Получение препаратов факторов роста фибробластов (ФРФ) из мозга, гипофиза КРС и поиск альтернативных источников.

2. Исследование влияния ФР различной степени очистки на пролиферативную активность культуры клеток нн-ра и других культур.

3. Подбор компонентов бессывороточнои среды для культивирования клеток линии кн-*а в бессывсроточнои среде в стационарных условиях и на микроносителе Cytode-.v-з и проведение 3*q-периментов по длительному культивированию в этой среде.

4. Испытание БСС для культивирования других линия клеток.

6. Подбор компонентов БСС для повышения продукции уАП

клетками линии rh-pa. ' '

6. Получание препаратов ФРФ-подобньк факторов роста, из лиэата и- среды кондиционирования клеток линии ан-РА и изучение их Физико-химических и биологических свойств.

НАУЧНАЯ-НОВИЗНА РАБОТЫ. Для ряда клеточных линии в литературе списан состав бессьшорогочных' сред для культивирования зукариогических клеток. В настоящей работе впервые в . навей crj aiie разработан ¿остаи ¡¡ессывороточной синтетической среды с использованием факторов роста, обеспечивающий повышенную продукции i'k kiihj -ы - хорошо известного эффективного . троиболити-

ка, клетками линии рл-гл и создавший возможность их длительного культивирования в стационарных условиях и на микроносителях. Показана эффективность использования разработанной БСС для длительного культивирования клеток других линий •- сно, Vero, мн-зтз, СПЭВ, используемых в биотехнологии получения биологически активных веиеств и вапшн для здравоохранения и ветеринарии. Выделены и охарактеризованы физико-химические и бислогнеские свойства кислого и основного ФРФ из различных источников животного происхождения и установлен ил стимулирую-вия э4®ект на продукт«) уАП. ССнарутены. выделена и охарактеризованы гепарин-связьваемье Факторы роста из лизата и среды ■кондиционирования клеток линии rh-p\ - прояуиекта урокиназы. Показано, что по хроматографичесгому поведению, молекулярнойу ,8«су « биологическим свойствам полученные Факторы идентичны основному и кислому ФРФ жив.'тного происхождения. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Практическая ценность заключается в повышении эффективности технологии получения тромболити-чесхого Фермента - урокиназы из культуры клеток rh-га. Разработанный в данной работе состав многокомпонентной БСС.и схема ее использования позволяет повысить содержание уАП 'в среде кондиционирования за счет ускорения выброса Фермента в среду и повышения суммарного уровня его активности. Сокращение стадии регенерации клеточного материала на среде, содержащей сыворотку, а также значительное снижение уровня вносимого белка позволяет получать въсокоочииенные препараты уАП не внося изменений в ранее разработанную схему очистки Фермента. Компоненты предложенной среды легкодоступны, дешевы. Показана также возможность их равноценной замены на препараты, полученные из отходов производств. Эффективность использования разработанной БСС для длительного культивирования ряда клеточных линий поэ-

волит упростить схему и снизить стоимость наработки биологически активных вевеств. продуцентами которых они являются.

Создан лабораторный регламент на производство «акторов роста либробластов из гипофиза крупного рогатого скота (утвержден на заседании Ученого Совета НИИ Биомедицкнской технологии ИЗ СССР 16.11.8» г., протокол N 18).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования были доложены на Всесоюзной научной конференции "Новые направления биотехнологии" /Пулино, 1986/; на III Всесоюзной научно-технической конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических препаратов" /Москва, 1987/; на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" Ленинград, 1987/; на Всесоюзной конференции " Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии" /Махачкала, 1988/; на ю-оа конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединения" /Рига, 19вв/; на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" /Ленинград, 1989/; на III Всесоюзном совещании " Культивирование клеток животных и человека " / Пуиино,

1990 /.

Основные материалы диссертации опубликованы в и печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзор! литература, описания материалов и методов исследования, собственных экспериментальных данных и их обсуждения, основных выводов и списка литературы-

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит п таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает 125 источников, из них 16 отечественных и 109 зарубежных.

с

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА ФАКТОРОВ РОСТА ФИЬРОБЛАСТОВ (ФРФ) ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ (МОЗГ ■ ГИПОФИЗ КРС И ДР.).

Основной задачей этой части работы было получение ФРФ из гозга и гипоеиэа крупного рогатого скота, а также поиск других tcT04HHK0B ФРФ. Известно, что в экстрактах мозга и гипофиза IPC содержится фактор роста фибробластов'(ФРФ>. В работе пройдено выделение ФРФ иэ мозга и гипофиза КРС по ранеее разра-«этанкои схеме (Lobh, Felt, 19841, вклвчаовея сульфат-аммокий-ое осаждение, ионообменную хроматограои» на КМ-Сефадексе С-50 аффинную хроматографию на гепарин-Сефарозе.

Ступенчатой элсциея в присутствии хлорида натрия (1 и 2М) а гепарин-Севароэе получена два препарата ФРФ (кислый и ос-эвной): 1-е молекулярной массой 16 кЛа. примерно 80« чисто-«, II- с молекулярной массся 18 кДа -эяектрофоретически гомо-гнныя (рис ль

Полученные результаты по хроматограсическому разделению >Ф полностью согласуются с описанными в литературе

Jospodarowicz et.al., 1984; ЬоЬЬ, Felt, 1984).

Было показано также, что одна иэ побочных фракций образуйся в процессе технологического получения лекарственной iPMb АКТГ-адипозина иэ гипофиза КРС на Московском эндокринном воде содержит митоген, который в традиционной схеме дальней-й очистки IKM-Сефадехс С-50, гепарин-Сефароэа - 4В) имеет рактеристики ФРФ (хроматографическое разделение, мол.вес, ектровгаретическая подвижность).

Наиболее часто при получении ФРФ из козга и гипофиза КРС пользуют аффинную хроматографию на гепарин-Сефарозе - 4В ospodarowicz et al.1984; Lobb, Felt, 1984 ). В нашей работе

было предложено использование механически более урочного твес докаркасного (на основе макропористых стекол) полимерно-моди Фиикрованного отечественного носителя гепарин - МПС-ПА. Срав нение очистки на гепарин-ИПС-ПА и геяарин-Сефароэе показало что предлагаемые сорбент позволяет получать препараты ФРФ характеристиками аналогичными для препаратов с гепарин-СеФаро эы -»В-.

1 ii iii iv v

94 хДа -67 кДа -43 кДа -зо кДа -¿о кДа -14,4 кДа -

Рис. 1. Электрофореграмма кислого <и) и основного (III ФРФ (смесь стандартных белков -Ни ФРФ-подобных ФР, получен них из лмзата (IV) к среды кондиционирования (V) клеток лини КН-РА.

Получеи гилофизарный экстракт (ГЭ), который является источником не только ФР, но и собственно гормонов, присутстви которых в разрабатываемых БСС является необходимым и испытан его биологические свойства (Таблица 1).

В таблице 1 приведены данные по очистке и биологической ктивности препаратов ФРФ из гипофиза, аблица 1.

Результаты очистки препаратов ФРФ из гипоеиза КРС <loo г).

Фракция Концентрация препарата, мг/мл Объем Фракции, мл С 50* мкг'мл * PI пах

Гкпосизарныя

экстракт 6 6 оо 10-30 0.2

Ш-Сефадекс-

;-5о -фракция ,0.2 100 5-20 0,36

'епарин-Се®а-

>оза- 0,6 М

аС1 ЗЛЮЗТ 0,1 100 0,025 0,02

Н í.aCJ-ПИК 0,070 10,0 0,020 0,35

'епарин-Сефа-

ю зы

2Н SaCl-ПИК 0,048 8,0 0,002- 0,65

епарин-СеФа- - 0,01

озы

* с 60% * концентрация препарата, обеспечивающая митоген-нып эффект, равный бох от максимального, вызываемого 5« эмбриональной сывороткой. Тест - система - клетки линии мн-зтз". ** - Р1 - максимальный индекс пролиферации, вызываемый исследуемым препаратом. Выход кислого и основного ФРФ на юог гипофиза составил ответственно о,7 и 0,4 мг.

Еатнепшеп биологической характеристикой ростовых факторов яяется аго способность стимулировать митоз. Для определения

митогенного эффекта ростовых факторов (ФРФ,. инсулина, СКРС) нами было проведено сравнение в-ти методов: подсчет клеток в камере Горяева; определение суммарного клеточного белка с помощью красителя Гимэа; определение числа клеток по активности маркерного фермента - кислой фосфатаэы; измерение скорости синтеза ДНК по включению 3Н-тимидина; использование красителей Кумасси к-^50 и Кумасси с-250 для измерения суммарного клеточного белка. Была определена чувствительность каждого метода. Проведено сравнение указанных методов по следующим параметрам: время анализа, ошибка измерения, возможность .одновременного анализа большого количества проб, учет эффекта гиперплазии, учет жизнеспособности клеток. Анализ полученных результатов показал, что для решения данной конкретной задачи, - создания и оптимизации состава БСС наиболее предпочтительным, является метод определения числа клеток по активности хислои фосфатаэы. Этот выбор был обусловлен также возможностью использования одинаковых приспособлений для культивирования клеток и анализа (плата, многоканальные пипетки и др.), а также возможностью автоматизации анализа при использовании многоканального спек-торофотометра типа митясап. _ Данный метод определения числа клеток, как впрочем и другие, требует контроля адекватности его использования для данной линии клеток, т.е. построения калибровочных кривых и постановки контрольных экспериментов.

II. СОЗДАНИЕ БСС НА ОСНОВЕ ФАКТОРОВ РОСТА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Ш1-РА.

В качестве воможных компонентов разрабатываемой среды бы ло испытано более 35 различных биологически активных веществ.

Необходимым условием жизнедеятельности субстрат-зависимых культур является фаза прикрепления и распластывания клеток,, в прлнБн^м случае невозможна пролиферация и образование клеточ-

ного монослоя. При бессьвороточном (б/с) культивировании в стационарных условиях и особенно в динамике, на микроносителях, становится необходимым внесение в среду Факторов адгезии.

• Были испытаны препараты Фибронектина (ФН) из плазмы быка, гликопротеины. из морских беспозвоночных, а также пептил •Агц-«1у-А$р являюшипся частью домена ФН, связывающегося с клетками. Показано, что действующие концентрации препарата ФН полученного из СьчьеЯ плазмы составили 1-100 мкг/ мл (С 50х = з мкг/мл) для клеток линия чн-гд и мн-зтз. Проведен сравнительный анализ адгезивных свойств коммерческого ФН (Эеггя, ФРГ), препарата ФН, полученного в нашей лаборатории из плазмы быха и трипептида Ап?-а1>-Д5г и показано, что действующие концентрации обоих препаратов ФН - 0,002-0,02 мкМ, а трипептида ■ .1,3-65 мкМ (С 50* = 2,6-5,2. мкМ). С 50* Для коммерческого ФН составила 4 нН (линия гш-га) и 8 нН (линия мн -ЗТЗ), а С 50* для нашего препарата ФН - 6 нМ (линия ин-ра) и 12 нН (линия МН-ЗТЗ).

ФН является одним из самых дорогостоящих компонентов ЕСС,

поэтому был проведен поиск альтернативных более дешевых факто-

^ -

ров адгезии. В качестве возможных Факторов адгезии бйл проведен скрининг лрепаратов гликопротеидов и 824-833) из морских беспозвоночных представленных ТИБОХ ДАН СССР. Для всех препаратов показано наличие и адгезивных, и митогенного эффектов, а также усиление эффекта гликопротеидов хлоридом кальция (4 мМ) на клетках линии )?н-РА. Использование предоставленных-нам пре-' паратов гликопротеидов в настоящее время в крупномасштабных исследованиях имеет ряд ограничения, которые связаны с вариабельностью свойств различных партий препаратов.

Необходимость включения в БСС связывавших белков заключается в том, что данные белки помимо их участия в детоксика-

шш среды, шжтс! míe пг^еяссшамя ЯЕЗШЕшаш uusiooie-кулягных штарив тепавав, тшжв;. Б качестве связывавши (транспорты!i Севков Cuxu испытаны альЗумяа ■ транссев-

ДльСдога ■ трансфертна являются ваябслее «сто встречавшийся CensBiia кжояшаш БСС- В работе Cuso сзаэш>, что аяьбуйяи обшает хороним "китогекньы" э»«пои на uem хинах ен-Н. Определен шнаэок деяствувдях концентрация - яяя БСА - С iia = ti. i кг/на, ляж траасеерряиа - в шшэие. 1-го мкг/мх. ш> вешана эфаежта вызываемого у шп» ши нн-рл неэиачятельна ii-l -0.271, что содтверхдается жаянжя. ахаява-С1 в ше^туре iBarnes. <buui, 19» i. Полученнме результаты ш тестированию препарата траияещш на иетш шш! явит. а таххе дашше о гэм. что нехэтерце пш onуюхевьх кяе-тох могут культявярзватъся в отсутствий тсансвег^снл i в jare. 1987) позволяла в дальяэазём сграначнхь ваюдьзогаше этою белка при круянояаавтабазд кугьтивярсваних.

В работе Сшш исследованы такие распространенные в БСС средах гормоны и гормоноисдасаыг вевества, ках инсухта. гкдро-хортязон, дехсахетазоа, Э»Р аз подчетветннх кедез мывеа я уро-гастроа. Для хлетох линла кн-РА бмхи установлены кэкиентрацл-"оиныа оптимума возмохных «¡ггогешид эффектов, состав гид яг: ш гхдрохертязояа - 2-5 иг/ кл {Pl=o, 11, ш дехсаыетазоааo.i • - о, 5 Mir/мл ipi= o.ii. lu es су хана - o,l-o,4 Ед/ ыл i = 5-it ыхг/мл; rx=o.2i, для препарата ЭФР - 1-Ю иг/ил IP1 ках=0.3), ~а ял* урогастрсаа -о,оо2-го ыхг/мл С pi шах=о,4).

Инсулин, евлягзсяйся наиболее вдлкъы гормоном для обеспечения роста сочтя всех типов ххетох, достаточно бистро кнактя-вяруется в среда. Изучена возмохаость замени кнеулзша ва препарат проЕолгщ-ованвого действия - гп-хнеухга в сохазаяо. чте

препарат Zn-mcyima врх равных гсясгзкзмп вылезет ихто-геявыа зогект в з.з раза бокее сккшя.

Звегенке а сг^гу в качестве актгЕяых гомкгвентсв гегсгке-таэова и гягрсксртизска в гагьнеггея рзСсте было ограничено. т.е. известно, что гзекогзртпгзкм гвачстс« гягЕСктарами синтеза К! п не не гут згезстгви «CEßreiTbci зрг гутьтигирова-пл лияяи и-п - ¡scaiam АП- Еспегъэсезвиа пя ттахяво-табвом гугьткгнссвавш! гнвд кн-гл препаратов Э»Р к урогаст-рона Сию ограничено их не»остаостю в бшш количествах. Вскежствта этого в вахьнехля згегетпетш эти- гсрм~ неподобны» вехества ве впаетажъ.

Бкзэ пссхеховако вгятаие прегаратов различной степени очпетгя на гтро.тггегаюто клеток мшвя rü-рд и получены кон-пеятраспЕзкЕые завкевмзети патогенного эеаекга «рис.2).

Показано, что избавление в "Зессивороточную среду частично очденного препарата W но ккг/ка); прквохит к уснееяхао ии-тогеввого заоекта альбумина и CEFC в 1.5 раза, и как следствие. C03B0UST снизить количество вяоепюго в epesy sosesn-тельного бехка. .

Проведен сгриввнг наиболее часто встречахтяхса ххэпяоп-хулхрянх компонентов БСС. Показано, что вхтаижв А в диапазоне ю_5-10"8 я не вызывает митогенного змеи», глета за 11-50 кгг /мз! »сеет >1*лх=о.з. юпятжвоваа кислота 12-200 ихгЛм) Р1жах=0.1. Cad о tO.5-7.OxMl - Pîa*x°0.45. TOSOj 15-50 iodf) -Pieax-o.14. гепарин «p.l-гоо игла) не вкатает китогеяного ответа у клеток ^"т»* вя-рл. Jtuera ве все кпшше вхзхомо-яекумвнье препараты шевяв в стимуляции прзлнферашгн клеток еииии ез-рд, однако известно участие отшшк иэ ша (клорид. калыгя* . resapcBi в ехтявзлш сны газа ж продукта АП icbon.

1373; Eappoporl. 1988). COTOPtS ЗШПСШ1 В ШЬВеШ№ ЭК-

Рис. 2.Концентрационные зависимости патогенных эффектов препаратов ФРФ различной степени очистки 11-прег.арат о-*РФ после гепарин-Сефарози, 2 - экстракт гипофиза, з- КН-ФРакци*1.

В качестве основы БСС для культивирования клеток линии ян -РА- продуцента урокиназы нами была взята богатая аминокислотами, витаминами ; и минеральными солями среда 199. Предвзви-•тельными экспериментами было показано, что данная культура клеток мохет эффективно культивироваться до 2-х недель в б/с среде 199 со сменой через каждые 4-5 дней- Затем происходит открепление и гибель клеток (посев в среде, , содержащей 5-7Х сКРС ). Прикрепление же клеток нн-ра в среде , не содержащей СКРС, происходит с очень большой потерей посевного материада и одно- двухкрагная смена среды приводит к их полному откреплению и гибели. С цьльр преодоления этих затруднений и на основании пробедьнн х экспериментов среда 1ма была дополнена ком-

пснентами являющимися наиболее эффективными для пролиферации данной культуры Iтаблица 2>.

Таблица 2.

Оптимальные концентрации компонентов БСС <ЕСС-1) для культивирования клеток линии кн-ил.

nn Иктоген Концентрация

1. БСА o.s мг/мл

2. Инсулин о,г Ед/мл

3. «ибронектин 2 мкг/мл

4. ГЭ 10-30 мкг/мл

ФРФ(КИ-Фракиия) 10 мкг/мя

Полученные концентрационные оптимумы были использованы при проведении экспериментов по кратковременному 148 часов) культивированию клеток нн-ра в средах с различным сочетанием компонентов.

Показано, что наиболее эффективным стимулятором роста клеток данной- линии является смесь следующего состава: БСА, инсулин, ГЭ.

Традиционная схема наработки кондиционированной среды клеток RH-PA , содержащей уАП состоит из 2-х стадий: а) культивирование клеток на 199 среде, содержащей 5-ю* СКРС до 80*

заросга и 61 стадия наработки уАП: перевод клеток на среду 199 »

где и идет накопление в течение 7-ю дней в среде уАП. После 2Х-ЗХ кратной смены среды оставшиеся Клетки отбрасывают-л.

ы

Данная сг.екл имеет си суиественшж недостатков - это ■ необходимость иараиивания Содыюго количества биомассы для поддержания технологического процесса, к слаба« ззаегтявность бессывсроточных стадия (длительность наработки, повторные сливы среды имеют значительно более ниэг.уо активность уЮ к т.д.).

Предварительными экспериментами нами была показана возможность длительной наработки уМ1 с "подкормкой" в течение 1-2 дней средой . сояержааей зх СКРС. и послелусзея заменой ва среду не содержащую СКРС, что позволяло частично избежать недостатков традиционной схемы накопления фермента.

Следуюапм этапом работы была замена стадии иакоогенвя сер-мента в среде, не содержагеп СКРС. на более эссектиЕнуо еля культивирования хлетох линии нн-гд.

С целью предотвращения инактивации и истоевккя в среде вносимых Препаратов инсулина и ФР® нами было предложено вс-польэоваиие циклов со сиеной среды каждые 4 дня. Такая схема хоро'ао согласовалась с тем фактом, что вносвмш в среду «Р* приводил к ускорению максимального выброса у АЛ на з - 4 лехь культивирования, вместо т-ю -го, что позволяло культшвровать клетки без значительной потеря биомассы в течения э-д-х толе ль.

Известные в насто идее время БСС аяя культивирования различных типов клетох содержат некоторое количество опорота (0,1- 1 .ох) (Х1есгг1см«1*. 19«Т). Для штелыюго (2-з месявэ) высокопродуктивного культивирования клеток лннжх ия-ра оказалось вполне достаточным добавление в среду О.гх СЕК (БСС-51.

Известно, что наиболее техяологачнш является метод псев-яосуспенэионного культивирования клеток-продуцентов ка микроносителях. Вами был» проведены «жоштаняя созданной БСС оря

культивирован«* клеток линии ки-рл на iwnep4ecx;ix »ш;роноси-телях типа Cytö4ex-3. В условиях псевдосусг.ен эконного бессыво соточного культивирования часто происходит нарушение роста кхетрж. а затем к значительное их открепление. С целью г.озыяс-. иая ааггэиакых своаств даннса культура в создаваемую БСС были введены гэкпэкеиты. всалохие на адгезию клетсх -3)1 (2 мхг.'мл» (мхи триг.аатка ащ-с'.:.-asj.. мл глихопротеидт.

Разработаны»« состав среды, позволяет прсвсдить длитель нов хультиварс-ванпе кгетэк линии ИИ-pa как в стационарных условиях. так я яа микроносителях с сохранением их нормального ©еяотяаа ib БСС белее 3-х месяцев, в условиях бессиворотки (б/ ei - 1^-18 днеВ1.

- Состав разработанной БСС был испытан при культивировании хяетох еяе »-х л;яйП; СПЭВ lклетки почки свиньи, язляюпиеся также E03toxHiam продуцентами yAIli, nih-ЗТЗ ишакные Фиброб-Л ласты традиционная клеточная тест-культура), lera (линия кле-тох зегенса иартызки. используемая при производстве вакцин), СЮ (используемая при создании различных генно-ин»енерных продуцентов». Показано, что предлагаемая нами рецептура БСС поэ-валяет также увеличить продолжительность стадия нзработки различных биологически активных веиесгв и следовательно, их эо-вегтаность (в среднем примерно в.2 саза) при-культивировании клеток некоторых других линия ikih-зтз, vero, cao, СПЭВ). Окончательная рецептура БСС длд указанных линия, вероятно, .потребует.введения дополнительных специфических компонентов, в ли res ил ва продукцию-требуемых биологически активных вешеств.

iii. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ БСС НА ПРОДУКЦИИ УРОКЙНАЗН (КЛЕТКАМИ rh-pa.

В иастоядеи работе использовалась перевиваемая линия клеток м-ра, которая, как уже указывалось, является продуцентом

уАП. Ранее было описано получение этой линии (Калина, ЮЯ7), ррзультаты ее хариоло^ичвсхого анализа (Калина и лр., 1989) ц изучено влияние условии культивирования на накопление в среде уАП урокинаэного типа (Лягинсмя, и др.,1989).

На этом, з-fane работъ была изучена возможность повышения продуктивности данной линии клеток. Показано, что через 48 часов после добавления ГЭ (зо мкг/мл) повьгаает уровень уАП в 1,5 -г раза. о-ФРФ io,oi нг/мл) в з раза. ФРФ (КН-оракция к,о мхг/ мл) в г раза, гепарин юо нкг/ил) в 2,5-з,о раза, Tween-80 -поверхностно-активное вешество, препятствующее сорбции уАП на поверхности стекла, увеличивает уровень уАП в хультураяьной среде в 3-5 раз, причем концентрация о,oí* является оптимальной для данной линии клеток и не меняет ее фенотип.

Известно, что гепарин оказывает влияние на пролиферацию клеток ряда линий и на продукцию ими активаторов плазминогена. Нами было показано, что гепарин не стимулируя пролиферацию клеток линии rh-pa, ускоряет секрецию уАП в среду. Через í2-15 дней культивирования суммарный уровень секретированного уАН остается таким же, как в БСС, не содержащей гепарин. Наблюдаемый эффект может быть обусловлен не стимуляцией синтеза уАЛ de novo, а снижением уровня уАИ-ингибирушей активности, высвобождением резервного количества ФРФ из ниэкоаофинных участков связывания и ухе опосредованно, через ФРФ. стимулияииеп выброса уАП и продлением и усилением взаимодействия ФРФ с рецепторами, а тах?е стабилизацией структуры ФРФ ISchreiber et al.., 1985; Moscatelll, 1987; Rappoport, 19881. При длительном КУЛЬтивировании клеток, линии rh-pa было показано, . .что среда БСС, содержащая все компоненты - БСС-Т 10.2ХСКРС, инсулин,. БСА, Фибронектин, ГЭ, гепарин, Tween-80) не имеет преимущества по параметру активности Фермента по уравнению с БСС, не содержащей

гепарин 1БСС-6) НЕ/ил 400

200

10 20 30 40 ьо во дни

Рис. з. Продукция уАП клетками линии кн-ра в стационарных условиях при культивировании на среде БСС (со сменой среды каждые з-4 дня»11- 199 среда, не содержащая дсбавок; 2- БСС-5 (ГЭ+инсулин+БСА+ФибронектиН'Ю.г* СКРС1! 3 - БСС-7 <ГЭ+инсулин+ БСА+фибронектин»0,2хСКРС*Тиееп-80»гепарин); 4 - БСС-в (ГЭ*ин-сулин+БСА+Фибронектин+0,2% СКРС +Тневп-во 1.

высокопродуктивное культивирование , а также первоначальное прикрепление обеспечивалось средоя следующего состава: ги-пофиэарный экстракт, инсулин, альбумин, СКРС, Ткееп-80. При смене среды каждые 3-4 дня высокий уровень уАП ( более 4оо ед/ мл) обеспечивался более зх месяцев и в стационарных условиях и на микроносителе су^йех-з (рис. з). Для культивирования клеток на микроносителе Су^аех-з требуется добавление .ФН и мкг/* мл).

Активность уАП в среде разработанного состава в 7-8 раз вьгае контрольном, причем со сливами и сменой среды каждые з-4 дня.

Таким образом, для культивирования эухариотичесхих линий (и в первую очередь линии кн-ра - продуцента уАП) в стационарных условиях предлагается использовать БСС содержащую БСА 10,5 мг/мя), инсулин (0,2 Ед/мл), гипоэиэарныа экстракт !ю-зо мкг/ мл), о.пхСКРС, а при культивировании на микроносителях вводить в БСС Фибронектин (2 мкг/мл).

Для линии нн-г\ предлагается состав ЕСС 1БСА-0.5 мг.'мл; инсулин-о,2 Ед/мл; гипооиэарнып экстракт-ю-зо мкг/мл; о,2% С КРС; Гкг-сп -»о-п.о)*,!, увеличивавший уровень уАП з среде кондиционирования в .1-4 раза.

iv. ФРФ - ПОДОБНЫЙ ФАКТОР РОСТА ИЗ КУЛЬТУРЫ р.к-гд.

Известно, что в технологии культивирования различных линии клеток к свежея ростовой среде добавляют некоторое количество среды кондиционирования. В ходе проведенных экспериментов 'было показано также, что кондиционированная среда при добавлении к свежей среде в объеме 10* обладает митогеннки эффектом по отношению к клеткам ьн-Г.\ и мн-зТЗ. Данная линия клеток проявляет способность к росту в полужидком агаре (Лели-кова и др.,1986), что характерно и для других трансформированных линия, а пролиферация слабо зависит от концентрации СКРС. Все это косвенно указывает на возможную продукцию этими клетками Факторов.роста, т.е. на существование аутокринного механизма регулирования роста клеток этой культуры.

При хроматографии кондиционированной (7-ю дней культивирования) среды клеток нм-гд (3,0-3,5 л) и лнэата этих те клеток |1оо млн.кя) на гепарин-Оевароэе наш: было обнаружено, что вся нитегентя активность элюируогся бу®ога>п:, содержат;!«! !М

1У

и 2И Nací, что соответствует хроматографкчес.кому повединию кислого и основного ФРФ на этом сорбенте. Электрофорез полученных фракция а ПЛАГ в денатурируоаих условиях выявил наличие, в основном, дуолета с молекулярньм весом 16 кДа ipjic.i).

Данные по хроматограФическому разделению кондиционированной среды и лиэата клеток rh-pa приведены в таблице з.

Таблица з.

Характеристика ФР из среды кондиционирования и лиэата клеток культуры ян-ра.

I-1--

; N4; Фракция

Т----г

Объем, мл

1.¡Кондиционированная среда i КС)

2.11 Н NaCl-ПИК КС

2 М Nati - пик КС

Лизат клеток rh-pa

1 М NaCl-пик лиэата

6,12 М NaCl-ПИК лиэата

зооо

6,0

g.5

6,0

8,0,

6,0

-----------r---1

Концентра-|Митогенныя¡ ция препа~|ответ,С50Х| рата,мг/мл| |

-----------).--------------1

0,00

0,01 4

0,02

8,0

0,03

0,02

6 мкг/мл

3,5 нг/мл)

I

2,0 НГ/МЛ1

5,0 ПКГ/МЛ|

I

г нг/мя

Изучение биологических свойств гепарин-свяэываемых факторов роста (ГСФР) из лиэата и средь кондиционирование клеток ни -РА показали, что митогенныи эффект наблюдается ужь при г пкг

4

i-1

/мл, причем его величина при концентрации 20. пкг/ мл составляет 80-1оох от эффекта 5* СКРС. Концентрация митогена, вызывающая 50Х-ше (от максимального, соответствующего СКРС) увеличение пролиферации (С 50Х). составляла 5 пкг/мл. При добавлении митогена в концентрации 50- 60 пкг /мл к среде, содержащей 5Х СКРС, эффект ГСФР возрастает в 2 раза , что указывает на аддитивность действия ГСФР и СКРС.

При добавлении лизата Ю,я мкг/мл), полученного из этих клеток через 4н часов после перевода на бессьвороточную среду происходит значительное (в ю-12 раз) и зависящее от концентрации Факторов возрастание уровня детектируемой активности урокиназы в лиэате клеток без увеличения уровня в культураль-ноЯ среде, что свидетельствует о стимуляции синтеза уАП, вызываемой ГСФР, а не о стимуляции его секреции.

Добавление уАП ■ полученного из культуры клеток rh-pa, к этим хе клеткам на б/с среде приводит к значительному ускорению пролиферации клеток. Митогенный эффект уроккказы монет бытб объяснен как протеолитнческой деградацией белков межклеточного матрикса, увеличивающей подвижность клеток, так и взаимодействием урокиназы с рецепторами этого Фермента на поверхности клеток. Концентрация урокиназы, соответствующая 50%-ному увеличению рролиферации (С 50х> составляет 0,6 мкг/мл., .т.е. величину на порядок меньпую, чем в случае неспецифических про-теаз (трипсин, проназа и т.д.) (Конев, Мажуль, 1977). Величина митогенного эффекта урокиназы составляет 65Х от уровня СКРС.

Добавление 2-5 нг/мл ростового фактора (1 М Naci-пик) приводит к г-з -х кратному увеличению (на 3 сутки) содержания внутриклеточного Фермента и такое же по величине возрастание уровня внеклеточной урокиназы на 7-8 сутки. Концентрация полумаксимальной стимуляции активности урокиназы полученными ГСФР

приблизительно в ю раз вьпе концентрации полумахсимального мигогениого эффекта- Нитогенныя эффект ГГФР при использовании в качестве шшеии клеток культ/pu нн-ра проявляется через чв часов после добавления Фактора, а возрастание уровня урокинаэы - ухе через 18-24 часа, что ухаэывает на то, что стимулирукшия (продухцию yfcfl) эффект ГСФР объясняется не возрастанием числа клеток, а повыиением скорости синтеза фермента.

Аналогичны« эффектом при концентрации и, 1-0,2 мкг/мд обладает к препараты ГСФР иэ мозга и гипофиза КРС, содержании основное к кислые ФР*.

Таким образом, и ФРФ. и уАЛ оказывают митогениыя эффект на культуру клеток ru-pa, ил продуцирующую. Вместе с тем ФРФ, продуцируемые данное культурой, оказывает стимулирующее влияние на продукцию уАП клеткамя этой ле культуры. Наши наблюде-1ия показывают, что повышение содержания урокинаэы в среде вы-ie уровня. 2оо-зоо ИЕ/мд, а по литературным данным - и олжагеназы (Moscateiii d. et аi., 1986,в), по времени совпала-т с увеличением доли открепиввихся клеток в условиях бессыео-оточного культивирования и их .лизиса. Это может быть объясне-о протеолитическим действием этих ферментов на белки ежхлеточного катрикса. По-видимому, оба указанных фактора - и :ФР, и урокинаэа могут являться элементами общего механизма /токринноя регуляции пролиферации клеток перевиваемой линии 1-ра и продукции ими урохиназы. ,

ВЫВОДЫ

Иэ различных источников животного происхождения - мозга, гипофиза крупного рогатого скота получены препараты кислого и основного Факторов роста Фибробластов. Создан лабораторный регламент на получение факторов роста Фибробластов из гипофиза крупного рогатого скота. Показано, что побочная

Фракция технологическое схемы получен** препарата АКТГ (адипоэина) может служить альтернативным источником получения Факторов роста аибробластов.

2. Обнаружены, выделены и охарактеризованы гепарин-связьваекье факторы роста из лиэата и среды кондиционирования клеток пинии кн-га - продуцента урокинаэы. Показано, что По хрома-тографическому поведению, молекулярному весу и биологическим свойствам полученные факторы идентичны основному и кислому Факторов роста Фибробластов животного происхождения.

3. На основе скрининга более 35 биологически активных соединений разработана^ многокомпонентная бессывороточная синтетическая среда (БСС) с использованием препаратов Факторов írac-та, обеспечивашая повышенную продукция урокинаэы клетками rm-pa и возможность их длительного культивирования в стационарных условиях и на микроносителях. .

4. Предложена новая схема культивирования клеток rh-pa с использованием разработанной БСС. Проведены испытания разработанных БСС и схемы культивирования при крупномасатабной наработке урокинаэы.

5. Показана эффективность использования разработанной БСС для длительного культивирования клеток ряда биотехнологически перспективных линий - сно, Vero, nih-зтз, СПЭБ.

е. Установлен стимулирующий эффект факторов роста, полученных из различных источников, в том числе из лиэата и среды кондиционирования клеток линии rh-pa, на продукцию урокинаэы этими же клетками, а также .эффект урокинаэы на' ах пролиферацию. Сделан вывод о возможности существования общего механизма регуляции пролиферации клеток перевиваемой линии рн-ра и продукции иму урокинаэы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. С.Н.Кизюн, А.А.Гаряев, Г.А.Афанасенко. Получение и изучение свойств ®актора роста фибробластов-. Всесоюзная научная конференция "Нсвые направления биотехнологии". Тезисы докладов. ПУВИНО, 1988, с, 152.

2. Е.А.Кирьянова, Г.П.Леликова, И.Г.Ермишина, С.Н.Кизюн, A.B. Лягинский, О.П.Вакулина. Е.В.Попкова, В.А.Радюхин, В.И. Куликов. Оптимизация продукции АЛГ клетками линии почки человека ЛН-Р^ при крупномасштабном культивировании. Всесоюзная научная г.окфенрениия "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пущине, 13вб, с. isj .

3. А.В.Лягинский. С/.М.Кизюн, А.В.Васильев , Г .А.АФанасьнхо. Особенности культивирования клеток-продуцентов активатора плазминогена. Всесоюзная научная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пушино> 1ü86, с. 164.

4. А.А.Гаряев, С.Н.Кизюн, Г.А.Афанасенко, В.И.Климов, Н.В.Дунаева, С.С.Белова.Выделение и частичная характеристика фактора роста фибробластов из отходов, производства гормонального препарата адипозин. ш Всесоюзная научно-техническая конференция "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормонаяь ных и оргакотерапевти-ческих препаратов". Тезисы докладов. Москва, 1987, с. 156.

5. С.М. Киэюн, A.A. Гаряев, Г.А. Афанасенко. Исследований влияния фактора роста фибробластов на пролиферацию кпеюк почки человека. Всесоюзное совещание 'Биология клетки в культуре". Ленинград. Цитология, 1987, t.xxíx, м э, c.iüátí.

6. С.Н. Кизюн, A.A. Гаряев, Г.А. .Афанасенки. Исследование культивирования клеток человека линии вн-гл ь бессывороточной среде. Всесоюзное совещание " Актуальные изпрссы раэра-

ботки преп»ратов медицинской биотехнологии". Тезисы докладов. напачкана, iörr. с.211-212.

1. С.М.Кмэпи. К вопросу о методах тестирования митогенного эффекта биоюгически активных соединений. Ю-я конференция молодых ученых 'Синтез к исследование биологически активных соединений'. Тезиса докладов. Рига, 1989, с.79.

8. С.М.Киэюн, Г-А.АФанасенко. Стимулируший эффект эндогенного •актора роста на продукцию урокинаэы клетками rh-pa. Всесоюзное совещание "Актуальные вопросы клеточное биологии", Ленинград. Цитология, 1989, т. чххх, N 9, с. lios-noe.

9. Е.А. Кирьянова, С.Н. Киэюн, Р.Г. Ововова, В.Е. Глаэкова,

И, Г. Ермишина, Г.А.Афанасенко, B.C.Оводов. Действие угле-водсодерхащих биополимеров /биогликанов/ из морских беспозвоночных на культуру перевиваемых линий клеток эукари-от. in всесоюзное совепание "Культивирование клеток кизотных и человека". Тезисы докладов. Пущино, 1990, с. 10J-104.

10. а'.Е. Иванов, М.А. Грин, В.8. Жильцов, С.Н. Кмэен, Г.А.Афанасенко, В.П. Зубов. Полимерно-модифицированные твердокар-хасньк носители для аффинной хроматографии. Прикладная биохимия N микробиология. 1990, N "в , С. 840-847.

lt. С.Н. Киэюн, О.А, Полетаева, Г.А. Афанасенко. Гвпаркн-свя-зывагмые «акторы роста, продуцируемые перевиваемо! линией клеток RH-РА, Цитология 1991, Т.33, N 5, с.48-53.

i

Подаиоаао s аъя&тг 14,05.91г. Заказ 579 Формат 60x90/16 Тирак 100

Москва. Типография ВЛСХШ