Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование искусственного белка с заданной пространственной структурой

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование искусственного белка с заданной пространственной структурой"

Р Г Б ОЛ

о т

На правах рукописи

Чемерис Виолетта Витальевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННОГО БЕЛО С ЗАДАННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРОЙ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУШКНО-1995 Г.

Работа выполнена в Институте белка РАН.

I

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор О. Б. Птицьш, кандидат биологических наук, А.Н.Федоров

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Митии Ю. В.

доктор физико-математических наук, профессор Иванов В.И.

Ведущая организация:

филиал Института биоорганической химии им, К.К. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Пущино

Защита состоится " / " Ц*■{) (-{и' 1995 г. в /1.3 часов на заседании диссертационного совета Я 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 1422Э2 г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ.

Автореферат разослан "_" _ 1993 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ' /

кандидат биологических наук / { ^^{/-(¿СС-с ^ П. А. Нелипович

Общая характеристика диссертации

Актуальность темы. Наилучшей проверкой нашего понимания принципов структурной организации белков является конструирование такой аминокислотной последовательности искусственного белка, которая сформирует заранее заданую пространственную структуру. Основная часть работ в этом направлении делается на основании повторения структурных мотивов природных белков, при этом часто используются фрагменты натуральных аминокислотных последовательностей. С нашей точки зрения, более интересная задача - синтез искусственного белка с последовательностью, не гомологичной последовательностям природных белков, и с типом пространственной укладки, который не противоречит известным принципам структурной организации белков, но в природных белках не обнаружен.

Модель такого белка (с таким типом укладки) была предложена в 1988 г. в лаборатории физики белка на основании молекулярной теории вторичной структуры и укладки белковых цепей. Это небольшой полипептид с последовательностью из 73 аминокислотных остатков. Его молекулярный вес 7. б62кЯа. Это белок со структурой типа "бутерброд", включающий (З-лист из четырех антипараллельных нитей, одна сторона которого прикрыта парой а-спиралей. Такая укладка состоит из дважды повторяющегося арр фрагмента, поэтому белок был назван "альбебетин". Предложенная структура отвечает всем известным принципам формирования структуры глобулярных белков. Похожий тип укладки позднее был обнаружен в доменах некоторых природных белков. Это говорит о том, что выбранный тип укладки не только не противоречит известным принципам структурной организации белков, но и используется в природе.

В настоящее время конструирование и исследование искусственных белков (белков de novo) находятся в центре внимания большого количества исследовательских коллективов, а конструирование жесткой третичной структуры или расшифровка реальной пространственной структуры этих белков являются лишь перспективной задачей. Поэтому, данная работа, безусловно, является актуальной.

Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось получение и исследование альбебетина - искусственного белка с заданной пространственной структурой. В процессе работы было принято решение получить две модификации альбебетина и провести сравнительное изучение их структурных свойств.

Научная новизна.

В настоящей работе разработан новый подход к исследованию

искусственных белков, позволяющий обойти трудности, возникающие при экспрессии чужеродных и мутантных белков в клетках Е. coli. Этот подход состоит из синтеза в бесклеточной системе трансляции радиоактивномеченного белка с последующим исследованием, без предварительной очистки, методами, чувствительными к радиоактивной метке, такими как гельфильтрация, электрофорез в горизонтальном градиенте мочевины, ограниченный протеолиз. Эти методы дают информацию о компактности и стабильности белка. В результате удается довольно быстро ответить на вопрос, является ли данный искусственный белок компактным и стоит ли пытаться получить его в препаративных количествах для стуктурных исследований. В противном случае надо улучшать первоначальный дизайн и повторить процесс тестирования

Этот подход был применен к белку de novo, названному <альбебетин». Было показано, что он почти столь же компактен, как и природные белки, что он кооперативно разворачивается в больших концентрациях мочевины и имеет, по крайней мере, некоторые черты пространственной структуры, согласующейся с теоретически сконструированной.

В дальнейшем по этой методике были исследованы еще два белка de novo, модификации альбебетина, - альбебетин с фрагментом интерферона и половинка альбебетина. Было показано, что оба полипептида компактны и их размеры соответствуют размерам природных белков аналогичного молекулярного веса, и что альбебетин с фрагментом интерферона биологически активен.

Практическая ценность.

Разработанный в данной работе подход представляет очень эффективный метод предварительного исследования как искусственных, так и мутантных белков, поскольку он позволяет достаточно быстрс получить ответ на вопросы, имеют ли эти белки компактную структуру, насколько они стабильны к действию протеаз и денатурантов и нужно ли пытаться синтезировать их в препаративных количествах или же надо улучшать первоначальный дизайн. Этот подход примени« при создании искусственных и мутантных белков для выбора лучшегс варианта последовательности, дающей компактный стабильный белок.

Эта работа дала толчек к продолжению исследования альбебетина. После долгих попыток была найдена система для экспрессии ь клетках Е. coli и в настоящий момент ведется исследование третичной структуры альбебетина методом двумерного ЯМР.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались ил>

были представлены на:

международной школе-семинаре "Modern Problems of Physical Chemistry of Hacromolecules" в г. Пущино (1991 г.),

симпозиуме серии "keystone" по молекулярной и клеточной биологии "Protein Folding, Structure and Funktion" (Jörn. Cell. Biochem. 1991, 15G, Suppl., 207),

международной конференции "Protein Biosynthesis", в г. Пушино (1991 г. ),

первом международном симпозиуме CAPE "Prediction and Experiment. Three-Dimensional structures of Homologous Proteins", в Германии, (Брауншвейг 1991 г. ),

5-й конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии", в г. Пущино (1992 г.),

зимнем сикпозиуме "Advances in Gene Technology: Molecular Biology and Human Disease" в Майами (Protein Engin., 1993, б, Suppl, 122)

пятой международной летней школе по биофизике в Хорватии (Ровинь, 1994 г.).

Основное содержание работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на 113 страницах, содержит 17 рисунков и 2 таблицы. Библиография включает 147 наименований.

Первая глава - обзор литературы - посвящена основным проблемам конструирования, получения и исследования искусственных белков. Описаны основные подходы, которые используются при создании белков de novo. Изложены проблемы, встречающиеся при получне-нии и исследовании искусственных белков, а также кратко описаны основные результаты исследования различных белков de novo.

Конструирование белков de novo в настоящее время представляет собой выбор аминокислотной последовательности, которая по каким-либо соображениям должна свернуться в желаемую пространственную структуру. Часто такое конструирование проводится чисто эмпирически: отбираются короткие пептиды, способные образовывать элементы вторичной структуры и ассоциировать между собой, а затем эти пептиды каким-либо образом связываются. Встречаются также работы, в которых дизайн проводится с использованием алгоритмов предсказания вторичной структуры.

Практически во всех работах при конструировании искусственного белка за основу берется какой-либо распространенный тип

укладки природных белков. При создании аминокислотной последовательности часто используются фрагменты последовательностей природных белков, формирующие определенные, необходимые авторам элементы вторичной структуры, или гомологичные последовательности. Хотя в ряде работ сконструированная последовательность не гомологична природным.

Однако еще в 1988 г. в лаборатории физики белка была сконструирована модель искусственного белка с типом пространственной укладки, не обнаруженным в природе. Эта укладка была разработана с учетом известных принципов структурной организации белков. Предложенная пространственная структура (см. рис. 1) состоит из четырехнитевого 0-листа, прикрытого с одной из сторон двумя а-спиралями. Затем была сконструирована аминокислотная последовательность, которая может сформировать данную структуру, и соответствующая нуклеотидная последовательность гена (рис."' 2). Впоследствии этот белок был назван "альбебетин".

Рис. 1 Предсказанная пространственная структура аль-бебетина Стрелками указаны положения аргининовых остатков.

Получение и исследование искусственных белков, разумеется, представляет очень большой интерес, особенно расшифровка действительной пространственной структуры и сравнение с изначально заданной. Следует заметить, что получение жесткой структуры и расшифровка реальной третичной структуры какого-либо искусственного белка остается лишь перспективной задачей.

В настоящее время белки для исследования можно получать двумя способами, методом химического синтеза или с помощью экспрессии в клетках Е. coli. Оба этих метода имеют свои достоинства и недостатки. Химический синтез - надежный, хотя и дорогостоящий способ, однако он позволяет получать лишь небольшие белки, не более ЮкДа. Тем не менее, большинство искусственных белков было получено именно этим способом. Экспрессия в клетках Е.coli более доступна, она позволяет получать белки большого размера, хотя она

CIA OAT CCG CGC GAC CCA CAA TCC CT« CAO CAS ere CTG CGT CCC LH GCC GGT T^'7 OTA CAA OTT CAA ОТО ACT OCT GOT ACC СТА CAC OTT CAA CTC ТСГ CCS CAA OAT CGC TAC АЛО CTG CU Acp Ho Gly CU ~ i» с 1ч Gln '-.»■. > 4 'i 4 l'alGly Cly*5«r fru Glu Val illu Val Gly GlyjThr VI Ш1 У. I Glu ViTlfr no Glu Aap Arg <>••

1-w^Trr. ' 1-i ---1 1-fttttt;-1

Рис. 2 Аминокислотная последовательность альбебетина и соответствующая нуклеотидная последовательность гена белка. Выделены предсказанные положения а и (З-участков. Указаны сайты рестрикции.

осложнена проблемами деградации и образования телец включения. Однако даже в случае природных белков не всегда удается добиться экспрессии. В случае же искусственных белков, которые могут и не обладать компактной структурой, мы никогда не знаем причин неудачи с экспрессией.

В то же время, исследование белков cíe novo, синтезированных химически, показывает, что получить компактную структуру удается далеко не с первой попытки, при этом иногда приходится вводить непредусмотренную в начале S-S связь. И даже в этом случае ряд искусственных белков ведет себя скорее как "расплавленная глобула", а не как природный нативный белок, хотя в ряде случаев этот вопрос не был достаточно детально исследован.

Вторая глава содержит описание материалов и методов, использованных в работе.

Третья глава посвящена полученным результатам.

В Институте молекулярной биологии РАН из химически синтезированных Шульгой А.А. олигонуклеотидов. Долгих Д. А. сконструировал плазмиду, содержащую ген альбебетина. Там же были проведены несколько неудачных попыток экспрессировать в клетках E.colí как просто альбебетин, так и альбебетин в составе фьюжин-белка с гормоном роста. В дальнейшем ген альбебетина был переклонирован в pSPT19/АРАЗ, затем эта плазмида была передана в лабораторию физики белка.

Чтобы избежать многочисленных трудностей, возникающие при экспрессии чужеродных генов в E.coli (особенно генов мутантных и искусственных белков) и ускорить этот достаточно медленный этап, был разработан новый подход к первоначальному изучению структурных свойств белка. Этот подход позволяет использовать лишь нано-граммные количества исследуемого полипептида без его предварительной очистки для быстрого тестирования его компактности и стабильности.

Этот подход включает в себя биосинтез радиоактивно меченого

белка в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы с последующим анализом его компактности и стабильности без предварительной очистки методами гель-фильтрации, электрофореза в горизонтальном градиенте мочевины и ограниченого протеолиза.

В нашем подходе радиоактивная метка используется не только для проверки наличия белка de novo, но и для тестирования структурных характеристик белка некоторыми методами, не требующими отделения исследуемого белка от других белков, присутствующих в системе трансляции. Это дает очень эффективный метод предварительного исследования как искусственных, так и мутантных белков, позволяя получить ответ на вопросы, имеют ли эти белки компактную структуру, насколько они стабильны к действию протеаз и денатурантов и нужно ли пытаться синтезировать их в препаративных количествах.

Если полученные таким образом данные свидетельствуют об отсутствии у исследуемого белка компактной стабильной структуры (что вполне вероятно при конструировании искуственных белков), то в первичную структуру белка могут быть введены замены, и процесс тестирования можно легко и быстро повторить. В том же случае, когда результаты говорят о наличии компактной и достаточно стабильной структуры, можно пытаться экспрессировать белок в клетках Е. coli или другой системе in vivo, чтобы получить достаточные количества для структурных исследований. Разумеется, детальное соответствие реальной структуры с желаемой может быть подтверждено только такими методами, как рентгеноструктурный анализ или ЯМР.

Получение и исследование искусственных белков

мРНК транскрибировали в системе с РНК-полимеразой фага SP6. После этого проводили трансляцию в мРНК-зависимой бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Электрофорез продуктов трансляции в присутствии додецилсульфата натрия (рис.3 - вставка) показал, что в системе синтезируется радиоактивно меченный гомогенный полипептид с молекулярной массой приблизительно 8000 Да, что близко к расчетной молекулярной массе альбебетина 7. 662 кДа.

На первом этапе работы проводилась оптимизация системы трансляции для данной мРНК. Было установлено, что достатачное время инкубации составляет 40 мин, а оптимальная концентрация мРНК. (см. рис. 3) - порядка Зг/сист. Вся дальнейшая работа проводилась в этих условиях.

исследование альбебетина

Для изучения структурных характеристик альбебетина были

RNA concentrate

1 (ю)

Рис. 3 Синтез альбебетина, меченого [3Н]лейцином, в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы при разных концентрациях мРНК. Система инкубировалась 1 час при 24°С. Эффективность синтеза оценивалась по интенсивности включившейся метки (кривая) и по БОБ-электрофорезу (вставка).

mRNA concentration |дд)

использованы электрофорез с горизонтальным градиентом мочевины, ограниченный протеолиз и гельфильтрация.

Одним из наиболее наглядных методов, демонстрирующих коопе-ративность денатурационного перехода, индуцированного мочевиной, является метод электрофореза в горизонтальном градиенте мочевины, разработанный Крейтоном.

При изучении разворачивания альбебетина этим методом (рис. 4 а) наблюдался кооперативный переход начиная с ЗМ мочевины. Видно, что переход полностью не завершен при 8М мочевины. Поэтому точку полуперехода можно оценить лишь приблизительно, она находится в районе 5. 5 М мочевины. Наличие кооперативного перехода говорит о том, что альбебетин имеет стабильную компактную структуру. В работах Крейтона было показано, что такой тип кривой свидетельству-(а) native (b) unfolded

С

О

п)

L.

0

1 J.

--О-

Urea concentration

** 8

Рис. 4 Радиоавтограф электрофореза продуктов трансляции в горизонтальном градиенте мочевины. На гель наносилось бомкл системы, содержащей порядка 12 нг синтезированного радиоактивно меченного полипептида (ЮООООсрт). Электрофорез велся 4 часа при 4°С при напряжении 400\Л (а) Денатурация. (Ь) Ренатурация.

О

ет о быстром обмене между свернутым и развернутым состояниями белка.

Изучение сворачивания альбебетина проводилось после инкубации образца в 9.5М мочевины. Результаты этого эксперимента, представленные на рис. 4Ь, показывают наличие двух полос. Такое поведение свидетельствует о медленном сворачивании и обычно воспринимается как доказательство существования двух медленно обменивающихся конформеров. Однако, в нашем случае мы не можем исключить, что подобный результат мог бы получиться и в результате взаимодействия полностью или частично развернутого альбебетина с некоторыми компонентами трансляционной смеси.

Хорошим тестом на компактность белковой молекулы является гель-фильтрацкя в натквных и денатурирующих условиях. На рис. 5 представлены результаты гель-фильтрации альбебетина в ОМ и в 8М мочевины. Видно, что в 8М ночевины альбебетин обладает значительно большими размерами, чем в нативных условиях. При этом без мочевины размеры альбебетина сравнимы с размерами природных нативных белков близких молекулярных весов (см. также экспериментальные и вычисленные значения гидродинамических размеров альбебетина в таблице 1). Эти результаты свидетельствуют о компактности альбебетина. Однако, на основании результатов всех этих исследований мы не можем сказать, обладает ли альбебетин жесткой структурой, характерной для природных нативных белков, или же он находится в состоянии типа "расплавленная глобула".

Рис. 5 Гель-фильтрация продуктов трансляции бесклеточной системы в натквных (200мй ацетата калия, 20мМ HEPES, рН 7. 6) и денатурирующих (8М •мочевины в том же буфере) условиях при 24°С. На колонку наносилось 10 мкл системы, содержащей порядка 2нг синтезированного меченного полипептида (100000 срт). Указано положение реперных белков (CAB - коровья карбоангидраза В, Мд - миоглобин кашалота, LA - а-лактальбумин человека, BPTI - трипсиновый ингибитор из поджелудочной железы коровы) .

Fraction number

(а)

without urea

~ 29 ■

■С

a j, . % 12.5 ■ Ь в S ■

-ir. 16' i' а' Ю'го-ло' -tr.te* f 3' to' 20* 40' digestion time

Рис. 6 Исследование альбебетина методой ограниченного протеолиза

(a) Сравнение стабильности альбебетина к воздействию трипсина в нативных (ЮОмМ ацетата калия, ЮмМ НЕРЕЭ, рН 7.6) и частично денатурирующих (4М мочевины в том же буфере) условиях.

(b) Результаты сканирования радиоавтографа.

Еще одним хорошим тестом на компактность является устойчивость к воздействию протеаз. Для того, чтобы можно было исследовать белок методом ограниченного протеолиза при конструировании аминокислотной последовательности альбебетина были специально предусмотрены два аргкниновых тандема (14-15 и 49-50) - см. рис. 1. Мы сравнили кинетики трипсинолиза альбебетина в нативных условиях и в 4М мочевине (рис.6). Хорошо видно, что в присутствии мочевины альбебетин расщепляется трипсином существенно быстрее, нежели без нее, несмотря на то, что в 4М мочевине активность трипсина снижена вдвое, а альбебетин еще далек от полного разворачивания, поскольку середина денатурационного перехода находится в районе 5,5 И мочевины (см. рис. 4). Это еще раз подтверждает наличие у альбебетина пространственной структуры и говорит об определенной ее стабильности.

Дополнительную информацию можно получить из анализа кинетики глубокого трипсинолиза альбебетина и его фрагментов в нативных условиях (рис.7). Первое расщепление трипсином должно привести к появлению фрагментов 16-73, 1-48, 51-73 и 1-13 (в порядке убывания молекулярного веса), как показано на схеме'(рис. 7Ь). Второе расщепление больших фрагментов 16-73 и 1-48 должно привести н возникновению общего фрагмента 16-48 и уже присутствующих коротких фрагментов 1-48 и 51-73. Все эти фрагменты появляются уже после 1 мин трипсинолиза (рис.7а). Видно, что большие фрагменты 1-48 и 16-73 появляются в близких количествах, но кинетики их деградации заметно отличаются: фрагмент 16-73 более чувствителен к трипсину, чем 1-48. Так как химическая последовательность в области аргининовых тандемов идентична, различие кинетик деградации

(а) Residues 12 3 4 5 (Ъ)

I - i3-:__

I г ю го 4о

Time (min)

Рис. 7 Глубокий трипсинолиз альбебетина. (а) Радиоавтограф продуктов расщепления. (Ь) Схема появления фрагментов в процессе трипсинолиза.

может объясняться только различной доступностью этих тандемов для протеазы. Это согласуется с различным окружением аргининовых тандемов в предложенной пространственной структуре, поскольку согласно модели фрагмент 1-48 содержит две а-спирали с тандемом 14-15, углубленным между ними, тогда как фрагмент 16-73 содержит только одну а-спираль, и тандем 49-50 расположен с ее внешней стороны. Эти результаты подтверждают наличие пространственной структуры у альбебетина и позволяют предположить, что компактной структурой могут обладать не только альбебетин, но даже его достаточно большие фрагменты.

исследование модификаций альбебетина

Поскольку в процессе исследования альбебетина возникло предположение, что и половинка альбебетина может обладать компактной структурой, было решено проверить этот вывод, используя предложенный в этой работе метод быстрого тестирования.

Кроме того, было интересно ввести в альбебетин какие-либо группы, несущие функциональную активность. Для простоты решили включить в состав альбебетина линейную функционально активную последовательность. При ее выборе учитывались следующие критерии: существование простого теста на данную активность, не требующего значительного количества белка и его предварительной очистки (чтобы можно было непосредственно использовать продукт трансляции) ; достаточно малые размеры последовательности (чтобы не нарушить общую структуру альбебетина); поскольку альбебетин является кислым белком, предпочтение отдавалось щелочным фрагментам.

Привить линейный функционально активный центр к молекуле с заданной структурой можно двумя способами, либо проводя мутации в участке с близкой гомологией, либо встраивая дополнительный фрагмент в экспонированные участки исходной молекулы. В первом случае

необходимо найти в последовательности белка участок, гомологичный выбранной последовательности или, хотя бы, похожий по расположению гидрофобных и гидрофильных остатков. Чем больше гомология, тем больше вероятность получения белка с желаемой активностью и структурой. Во втором случае активный фрагмент встраивается в экспонированные участки молекулы, петлевые или концевые. При этом можно ожидать, что изменения в таких участках не повлияют на общую структуру исходного белка, а сам активный фрагмент примет конформацию, необходимую для выполнения его функциональной активности. Последовательность альбебетина сравнили с базой данных из более чем 150 функционально значимых линейных фрагментов белков (Gabrielian А.Е. ее aJ., in Proc. 2nd Russian-Israel Symposium on Peptides S Proteins, 1992, p.37) однако какой-либо значительной гомологии с альбебетином обнаружено не было. В результате, единственным пригодным способом оставалось включение активного фрагмента в экспонированную часть молекулы альбебетина.

Для этого был выбран октапептид LKEKKYSP, соответствующий фрагменту 131-138 последовательности человеческого интерферона а^ (см рис. 2). Как было показано ранее, этот октапептид эффективно связывается с рецепторами тимоцитов мыши и активирует бласт-трансформацию тимоцитов при концентрациях порядка Ю_11М. Этот октапептид удовлетворяет всем перечисленным выше требованиям: его связывание с рецепторами легко тестировать благодаря высокой афинности к рецепторам и чувствительности метода. Он имеет щелочной характер, достаточно короток и гидрофилен, поэтому он не должен препятствовать образованию исходной пространственной структуры белка. Было известно, что связывание этого пептида с рецепторами ухудшается при добавлении цистеина на его С-конец и почти полностью исчезает при введении нескольких добавочных аминокислот на его N-конец, а сам октапептид имеет значительно большую константу связывания с рецепторами, чем фрагмент интерферона 131-138, расположенный в петлевом участке. Поэтому этот активный фрагмент решили встроить в N-конец молекулы альбебетина сразу же после инициаторного метионина.

Плазмиды, содержащие ген половинки альбебетина и альбебетина с фрагментом интерферона были сконструированы и любезно предос-

Sca I

5' СТС A AG GAA AAG A AG ТАС ТСТ ССА 3'

Leu Lys Glu Lys Lys Thr Ser Pro

Рис. 8 Аминокислотная последовательность фрагмента 131-138 интерферона а человека и соответствующая нуклеотидная последовательность его гена.

«S о

¿с 43

.5? 29

I 18

Js э 14.3

о w 6.2

о s 3

1 2 3

_ Рис. 9 Синтез в бесклеточно системе трансляции альбебетин

— и его модификаций. Дорожки 1

_ 2, 3, - альбебетин с фрагменто

^^ интерферона, половинка альбебс

~ «вц тина и альбебетин, соответ

~ ственно.

тавлены Долгих Д. А.

Исследование половинки альбебетина и альбебетина с фрагмен том интерферона проводилось по предложенной в данной работе схе ме. Матричную РНК получали в системе с. SP6 полимеразой. Трансля цию проводили в бесклеточной системе из зародышей пшеницы в уело виях, найденных для мРНК альбебетина. Результаты синтеза в бес клеточной системе трансляции альбебетина с фрагментом, половинк альбебетина к альбебетина (рис. 9) показывают, что в системе син тезируются гомогенные полипептиды ожидаемого молекулярного веса.

Поскольку половинка альбебетина имеет очень небольшой моле кулярный вес, убедительные данные удалось получить лишь исследу. его методом гель-фильтрации, тогда как альбебетин с фрагменто; интерферона удалось исследовать более полно.

Для изучения компактности модификаций альбебетина в нативны: и денатурирующих условиях использовали гель-фильтрацию с использованием оборудования FPLC.

На рис. 10 представлены профили элюции альбебетина с фрагментом интерферона, половинки альбебетина и, для сравнения, альбебетина в нативных условиях и в 8 М мочевины. В денатурирующиз условиях все три белка обладают меньшим объемом элюции, чем i нативных. Это отражает увеличение размеров всех трех белков npi денатурации и свидетельствует о большей компактности альбебетинг и его модификаций в нативных условиях.

Чтобы определить гидродинамические размеры искусственные белков, колонка была откалибрована в величинах радиусов Стоксе

(R ), как было предложено В.Н. Уверским (Uversky, V.N. Bios

chemistry, 1993, 32, 13288). Для этого использовался набор белко! с известными Я . Величина R связана с объемом элюции Vе'

S S

следующим соотношением:

1000/Ке! - 52.1

R =

0.725

Отсюда по объему элюции У°1 вычислялись значения альбебетина * его модификаций (см. таблицу 1).

со О

Е о.

о >

>

о со о

•о со ЕС

я"- 1е.г А

1/2 Albebetin 7"- 11.6 А

Fraction number

В то же время, можно связать между собой величины радиусов Стокса и молекулярного веса (Mw) - см. цитированную работу Уверского В.Н. (1993). Для природных белков в натив-ном и денатурированном состояниях зависимость Log R^ от Log Mw хорошо аппроксимируется двумя различными прямыми (рис. 11). Данные, полученные для альбебетина и его модификаций хорошо ложатся на эти прямые. Пользуясь зависимостью Log от Log Mw, можно вычислить размеры, которыми должны обладать природные белки соответствующего молекулярного веса. Вычисленные величины радиусов Стокса Rest для альбебетина и его

S

производных, представленные в таблице 1, близки к значениям, полученым экспериментально. Таким образом, можно утверждать, что альбебетин и его модификации в нативных условиях обладают размерами, близкими к размерам нативных природных белков соответствующих молекулярных весов.

Таким образом, подтвердилось

Рис.10 Гель-фильтрация альбебетина и его кодификаций, на колонке FPLC в нативных (200 мМ ацетата калия, 20мМ HEPES, рН7.б) и денатурирующих (SM мочевины в той же буфере) условиях. ' Представлены профили элюции альбебетина (а), альбебетина с фрагментом (Ь) и половинки альбебетина (с).

наше предположение о компактности половинки альбебетина, сделанное на основании исследования альбебетина. Что касается альбебетина с фрагментом интерферона, можно было бы ожидать, что с увеличением молекулярного веса размеры молекулы возрастут. Однако размеры альбебетина с фрагментом интерферона сравнимы с размерами исходного полипептида, что свидетельствует о том, что он столь же компактен что и альбебетин.

Как упоминалось выше, одним из тестов на компактность белка является ограниченный протеолиз. Этим методом удалось исследовать

half-albebetin albebctin

1.5-

Рис. 11 Сравнение компакт ности альбебетина и его моди фикаций с компактностью при родных белков (см. описание тексте).

3 4 5 6

Log ÍM )

10 W

Таблица 1 Гидродинамические размеры альбебетина и его модификаци

конформационное состояние

нативное раз верн. нативное раз вернутое

альбебетин (7662 Да) 17. 3 23. 7 15. 1 24. 2

альбебетин с фрагментом интерферона (8636 Да) 16.7 24.8 15.9 25 .9

половинка альбебетина (3976 Да) 11. 6 16.5 11.7 17. 0

экспериментальные вычисленные

только альбебетин с фрагментом интерферона (рис. 12). Результат ограниченного трипсинолиза альбебетина с фрагментом интерферона нативных условиях и в 4М мочевины показывают, что в нативнь: условиях белок деградирует медленнее. Большая стабильность воздействию трипсина в отсуствии мочевины свидетельствует компактности белка в нативных условиях.

При исследовании альбебетина с фрагментом интерферона наи больший интерес представляет проверка его биологической активное ти. Поскольку октапептид LKEKKYSP отвечает за связывание интерфе

urea without urea

- -- Рис. 12 Сравнение сгабильност

а альбебетина с фрагментом hf

— га — терферона к воздействию триг £ 21 — сина в нативных (ЮОмК ацетат ? 12.5 _ __ калия, 10 MM HEPES, рН 7. 6)

* e.í — "" ~ частично денатурирующих (4

® мочевины в том же буфере

о условиях, а

-tr ie* 1- 3- Ю'20Ч0" -tr 1в' 1 3' 10 ?0 Л0

2t digestion t ime

Рис. 13 Конкурентное инги-бирование альбебетином с фрагментом интерферона специфического связывания ок-тапептида с мышиными тимо-цитами.

ю ю ю

Protein concentration (М)

рона с рецепторами на поверхности гикоцитов и активирует реакцию бласт-трансформации тимоцитов, в случае альбебетина с фрагментом интерферона были проверены именно эти две активности. Изучение биологической активности проводилось совместно с Наволоцкой Е.В. (Институт имунологии, Москва).

Ингибирующий эффект альбебетина с фрагментом интерферона на

135

связывание с рецепторами радиоактивно меченного ( I) октапепти-да показан на рис. 13. В этом эксперименте концентрация искусственного белка изменялась от 10~12 до 10~7М. Легко заметить, что искусственный белок эффективно конкурирует с октапептидом за связывание с рецепторами тимоцитов. Из этих данных графически определяется величина 1С5о (концентрация, при которой происходит 50% ингибирования) и вычисляется константа ингибирования по

следующей формуле:

1С

К

1 + К {[L]

где [I,] - концентрация меченного лиганда, в данном случае окта-пептида (4.4 х 10"11 М), а К - константа равновесного связывания

а

таблица 2 Параметры связывания с рецепторами тимоцитов

объект Kd(M) ICso<M> К(М)

альбебетин с фрагментом интерферона не определялось 1.6 X Ю"10 1.4 X 10"П

интерферон оГ человека 2.5 X Ю"10 9.9 X Ю'9 8. б X Ю"10

фрагмент 131-138 интерферона а2 - 1 2 4.2 X 10 - -

10 10 10 Protein concentration (M)

Рис. 14 Активация бласт-трансформации тимоцитов

альбебетином с фрагментом интерферона. Контроль соответствует бласт-трансформации тимоцитов без добавления белка, в качестве ми-тогена использован конкова-лин А (2.5 мкг/мл). Прерывистой линией показаны данные для интерферона а^ че-

ловека, туры.

взятые из литера-

с тимоцитами.

в данном случае К для альбебетина с фрагментом d

интерферона не определялась и было использовано значение К для октапептида (4.2 х 10~12 М).

Сравнительные данные по параметрам связывания приведены в таблице 2. Из них следует, что альбебетин с фрагментом интерферона обладает высоким сродством к рецепторам тимоцитов мыши и связывается с ними даже более эффективно, чем сам интерферон.

Исследование бласт-трансформирующей активности альбебетина с фрагментом интерферона (рис. 14) демонстрирует его высокий биологический эффект на реакцию бласт-трансформации тимоцитов. Альбебетин, несущий фрагмент интерферона, индуцирует бласт-трансформацию тимоцитов (рис. 14) при концентрациях порядка 10 Сравнение с данными для интерферона, взятыми из литературы, показывают, что активация бласт-трансформации происходит более эффективно, чем в случае с интерфероном и при меньших концентрациях (рис.14).

Полученные данные, конечно, не достаточны для анализа структуры альбебетина с фрагментом интерферона и его биологической активности во всех деталях, но они позволяют надеяться, что мы получили белок de novo с заранее заданной структурой и биологической активностью. Получение и исследование альбебетина с фрагментом интерферона продемонстрировало возможность переноса биологической функции, осуществляемой коротким линейным фрагментом, на белок de novo - альбебетин. В принципе, белки de novo могут быть использованы как носители различных биологических активностей.

выводы

1. В настоящей работе разработан новый подход к исследованию искусственных белков, позволяющий обойти трудности, возникающие при экспрессии чужеродных и мутантных белков в клетках Е. coli. Этот подход состоит из синтеза в бесклеточной системе трансляции

радиоактивномеченного белка с последующим исследованием без предварительной очистки методами, чувствительными к радиоактивной метке, которые дают информацию о компактности и стабильности белка. Этог подход позволяет довольно быстро получить■ответ, является ли данный искусственный белок компактным и стоит ли пытаться получить его в препаративных количествах для. стуктурных исследований или же надо улучшать первоначальный дизайн.

2. Предложенный подход был применен к получению и исследованию белка de novo, названного <альбебетин», теоретически сконструированному ранее в лаборатории физики белка. Это позволило провести изучение его структуры без предварительной очистки с использованием всего нескольких десятков нанограмм белка. Проведенные исследования показали, что этот сконструированный de novo белок в нативных условиях почти столь же компактен, как и природные белки, что он кооперативно разворачивается в больших концентрациях мочевины и имеет, по крайней мере, некоторые черты пространственной структуры, согласующейся с предсказанной.

3. В дальнейшем по этой методике были исследованы еще два белка de novo - альбебетин с фрагментом интерферона и половинка альбебетина. Было показано, что в нативных условиях оба полипептида компактны и их размеры соответствуют размерам природных белков аналогичного молекулярного веса, и что альбебетин с фрагментом интерферона биологически активен.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах-.

1. Долгих Д. А. , Федоров А.Н. , Чемерис В. В., Чернов Б.К. , Финкельштейн А.В., Шульга А.А. , Алахов Ю.А., Кирпичников М. П. , Птицын О.Б. Получение и исследование альбебетина, искусственного белка с заданной пространственной структурой. Докл. АН СССР, 1991, 320, 5, 1266- 1269.

2. Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. De novo Design, Synthesys and Study of Albebetin, a Polypeptide with a Predetermined Three-Dimensional Structure. Probing the Structure at the Nanogram Level. J. Mol. Biol., 1992, 225, 927-931.

3. Долгих Д. A. , Кирпичников H.П., Птицын О.Б., Федоров А. К. , Финкельштейн А.В., Чемерис В.В. Белок de novo с заданной пространственной структурой: новые подходы к конструированию и анализу. Молекулярная биология, 1992, 26, 6, 758-767.

4. Долгих Д.А., Федоров А. Н. , Чемерис В.В., Финкельштейн A.B., Шульга A.A., Габриэлян А.Э., Птицын O.E., Кирпичников И.П. Искусственный белок с заданной пространственной структурой: дизайн, получение и исследование. Биотехнология, 1992, 5, 18-21.

5. Долгих Д.А. , Габриэлян А.Е., Наволотская Е. В. , Чемерис В.В. , Кирпичников М.П. Искусственный белок с заданной пространственной структурой и биологической активностью. Биофизика, 1993, 1, 67-74

6. Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V. , Kirpichnikov M.P., Uversky V.N. and Ptitsyn O.B. A new approach to artificial and modified proteins: theory-based design, synthesis in a cgII—free system and fast testing of structural properties by radiolabels. Prot. Engineering, 1994, 7, 1041-1052.

7. Dolgikh D.A., Uversky V.N., Gabrielian A.E., Chemeris V.V. , Fedorov A.N., Navolotskaya E.V., Zav'alov V.P and Kirpichnikov M.P. The de novo Protein with Grafted Biological Function: Transferring of Interferon Blast-Transforming Activity to Albebetin. Prot. Engineering, 1995 - принята в печать.