Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и использование моноклональных антител к вирусу Инко (Bunyaviridae, Bunyavirus)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение и использование моноклональных антител к вирусу Инко (Bunyaviridae, Bunyavirus)"

На п рах-ах рукописи

ОД

ЛАРИЧЕВ Виктор Филиппович

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНКО (ВШУАУИгтАЕ, ВШУАУ1ШЗ)

03.00.05 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - J S93

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте вирусологии и.".. Д.И. Ивановского Рассийской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

до.-:тоо биологических наук, профессор, член-корреспондент РАЕН Ä.M. Бутенко

кандидат биологических наук С.Н. Атаиадзе

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕН JI. В. Урываев

доктор биологических наук A.B. Тимофеев

Ведущее научное учреждение - Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича

Защита диссертации состоится " СС^О1998 г. _" часов на заседании Специализированного Ученого Совета

(Д.001.20.02) в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разо<

;лан ' 1Ъ » uU^A.— 19Э8 г

в

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук Н.П. Косякова

Актуальность проблемы

Вирусы серогруппы калифорнийского энцефалита (КСГ) широко распространены в Северной и Южной Америке, Европе, Азии и Африке. В различных районах Российской Федерации установлена активная циркуляция вирусов Инко, Тягиня и зайца беляка, а также отличных от них антигенных вариантов. С 1986 по 1992 гг. в стране было диагностировано около 300 случаев заболеваний, вызванных вирусами Тягиня, Инко, зайца беляка и недифференцированными вирусами КСГ. Причем, значительная доля заболеваемости, особенно в лесной зоне страны, связана с вирусом Инко.

В классификации вирусов КСГ, предложенной Ч. Калишером в 1983 году, и основанной на данных серологических реакций, вирус Инко входит в комплекс (относится к типу) калифорнийского энцефалита. В течение последних лет были получены новые данные (М.С. Недялкова и С.Д. Лебедева) по антигенной характеристике типов, вариантов и штаммов, а американскими авторами С1ппа, ЗИоре и др. (1996) проведено секвенирование части сегментов вирусов КСГ. Результаты этих более поздних исследований указывают на близость вируса Инко к вирусам комплекса Мелао.

Значительный прогресс в изучении вирусов КСГ был обусловлен применением моноклональных антител (МКА) к вирусам Ла Кросс, Тягиня и Джеймстаун Каньон: установлено антигенное строение гликопротеина вируса Ла Кросс, выяснена биологическая роль поверхностных гликопротеинов Б1 и 62, показана антигенная неоднородность исследованных штаммов.

Актуальность темы диссертации определяется серьезным, но далеко не полностью изученным значением КСГ в патологии человека, их широким распространением, выраженной антигенной вари-

о

~ £. -

абельностью и необходимостью совершенствования их классификации, методов дифференциации и специфической диагностики, вызываемых ими инфекций.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в получении гибридом, продуцируюшлх моноклональные антитела к вирусу Инко, изучении свойств МКА и определении их способности дифференцировать вирусы КСГ.

Конкретные задачи исследования предусматривали:

- получение гибридом продуцирующих МКА к вирусу Инко;

- изучение сеойств, полученных МКА, включая их активность в серологических реакциях;

- изучение взаимодействия МКА с вирусами КСГ;

- изучение взаимодействия МКА с. Инко-подобными штаммами;

- анализ полученных результатов и их интерпретация в сравнении в данными литературы.

Научная новизна работы

Впервые получена панель МКА к вирусу Инко. Все типы МКА охарактеризованы в отношении класса иммуноглобулинов, направленности к вирусным белкам, активности в серологических реакциях и эффективности использования для дифференциации вирусов КСГ и Инко-подобных штаммов.

На основании этих данных установлен критерий дифференциации вируса Инко от других вирусов КСГ и принадлежности идентифицируемых штаммов к вирусу Инко.

В результате использования МКА Инк1, 2, 3, 4 и 5 в реакциях иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунофлюоресценции

(МФА) была установлена следующая последовательность, . отражающая антигенную близость изученных вирусов КСГ и вируса Инко: Джеймстаун Каньон, Лумбо, Калифорнийского энцефалита, Ла Кросс, Кейстон, Тягиня и зайца беляка.

При изучении в серологических реакциях с. МКА 12-ти Ин-ко-подобных штаммов из различных регионов России, 8 из них были идентифицировании как штаммы вируса Инко, а 4 - как значительно отличающиеся штаммы. В первой из этих групп наблюдалась антигенная штаммовая вариабельность.

Практическая ценность работы

На основе полученных МКА к вирусу Инко созданы экспериментальные тест-системы для выявления специфического антигена и быстрой идентификации штаммов и вирусов КСГ методами МФА и ИФА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые получена панель МКА к вирусу Инко.

2. Все типы МКА всесторонне охарактеризованы по следующим параметрам: класс секретируемых иммуноглобулинов, направленность к специфическим вирусным белкам, активность в серологических реакциях.

3. При помощи МКА Инк1, 2, 3, 4 и 5 в МФА возможна четкая дифференциация вирусов Калифорнийского энцефалита, Ла Кросс, зайца беляка, Тривиттатус, а при помощи МКА в ИФА удается дифференцировать вирусы зайца беляка, Тягиня, Лумбо, Кейстон и Тривиттатус. В реакции нейтрализации МКА Инк4 качественно дифференцируют вирус Инко от остальных представителей КСГ.

4. При серологической Идентификации 12 Инко-подобных

штаммов при помощи панели МКА к вирусу Инко установлено, что 8 из них являются штаммами вируса Инко. а 4 - своеобразными представителями КСГ.

5. Сравнительное изучение вирусов КСГ и Инко-подоОных штаммов с помощью МКА позволило предложить цифровые критерии, отражающие степень принадлежности исследуемых штаммов к вирусу Инко.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на заседании Совета предварительной экспертизы диссертационных работ по медицинской вирусологии и эпидемиологии при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 23 апреля 1998 г.

Публикации.

Материалы диссертации отражены в трех печатных работах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 196 работ, из них 183 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц и 7 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

В работе было использовано девять известных вирусов КСГ из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского: Тягиня (штамм 92),

Лумбо (SAAr 1881), ЛаКросс (оригинальный штамм), зайца беляка (оригинальный штамм), Калифорнийского энцефалита (BF3-233), Инко (KN-3641), Джеймстаун Каньон (61V-2235), Кейстон (В64-5587) и Тривиттатус (7941). 13 штаммов были любезно предоставлены Д. К.Львовым и В.Л.Громашевским: 11 из них выделены в лаборатории экологии вирусов из комаров, собранных в Новгородской (LEIV 12636), Тверской (LEI V 12812), Архангельской (LEIV 12954), Рязанской (LEIV 15389) областях, Республике Коми (LEIV 15852), Мордовии (LEIV 17241), Якутии (LEIV 18106), Тюменской области (LEIV 22981, 22788, 24017), в Алтайском крае (LEIV 25603). а два штамма (LEIV 27044 и LEIV 27063) из крови больных людей, госпитализированных в 1-ю инфекционную больницу г. Москвы.

Суспензионные мозговые антигены штаммов и вирусов КСГ готовили из мозговой ткани инфицированных новорожденных белых мышей на физиологическом растворе. В качестве культуральных антигенов использовали культуральную жидкость (КЖ) инфицированной клеточной культуры ВНК-21.

Иммуноглобудлины выделяли по методу, предложенному фирмой Sigma (США), на сефарозе-протеин А.

Для субтипирования МКА и определения типа легких цепей в составе иммуноглобулинов использовали ИФА с набором Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit ("Boehringer Mannheim").

Для получения гибридом самок линии Balb/c иммунизировали четырехкратно с интервалом 1 неделя, вводя внутрибрюшинно по 0.1 мл мозговой суспензией инфицированных сосунков беспородных белых мышей (с титром вируса 7,0 lg LDso/O.Uui!) в смеси с полным адьювантом Фрейнда. За 4 дня до взятия селезенок (35 день после начала иммунизации) делали пятую инъекцию, внутривенно

- б -

вводили 0.1 мл мозговой суспензии в физ. растворе. Гибридиз, цимю клеток селезенки иммуных мышей и мышиной миеломы N5 проводили е соответствии с описанием, приведенном в стат: Kohler G. и Milstein С. (1975). Для выявления гибридом, прод цирующих МКА к вирусу Инко, применяли непрямой МФА.

Для получения асцитных жидкостей (АЖ), содержащих МК самкам мышей линии Balb/c, получившим внутрибрюшинно инъекц пристала (фирмы "Sigma"), внутрибрюшинно вводили по 2-10 мл гибридных клеток, суспензированных в 0.5 мл бессывороточн культуральной среды.

Направленность МКА, продуцируемых полученными гибридом ми, к специфическим белкам вируса Инко определяли методом и муноблоттинга (Towbin Н. и др., 1979) и радиоиммунопреципит ции (Laemly U.K., 1970).

Для изучения иммунохимических и биологических свойств п лученных МКА и взаимодействия их с вирусами КСГ и Инко-подо ными штаммами использовали метод флюоресцирующих антит (К®А), иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию нейтрализап (РН), реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцию се зывания комплемента (РСК).

Метод флюоресцирующих антител выполняли в соответствие описанием Liu С.,(1970); реакцию нейтрализации ставили микр методом (Seawringht 6.L. и др., 1974); реакция торможения г магглютинации проводилась согласно Clarke D.H., Casals J (1958); реакцию связывания комплемента выполняли по стандар ной методике (Мельникова М.С., 1986).

ИФА (Voller А. и др., 1980) проводился в двух варианте В первом - лунки планшета сенсибилизировали антигеном вир?, Инко (вирус Инко очищенный в градиенте сахарозы), далее внос

ли исследуемые КЖ или АЖ, содержащие МКА. После инкубации вносили антимышиные козьи антитела, меченные пероксидазой хрена фирмы Sigma. Во Етором варианте лунки сенсибилизировали МКА в виде иммуноглобулинов. Затем вносили мозговые или культураль-ные антигены, а после инкубации - мышиные поликлональные антитела против вируса Инко, меченные пероксидазой хрена. Положительной считали реакцию, когда оптическая плотность исследуемого образца превышала оптическую плотность контроля более чем в 2.1 раза.

Для получения гипериммунной асцитной жидкости (ИАЖ) самок белых беспородных мышей иммунизировали вируссодержащей мозговой суспензии с равным объемом адьюванта Фрейнда. Иммунизацию проводили пятикратно с интервалом 1 неделя. Через сутки после последней инъекции иммунным мышам вводили внутрибрюшинно клетки саркомы 180/TG (1-10 млн клеток). Количество накапливающейся асцитной жидкости варьировало от 5 до 12 мл на одну мышь (Гайдамович С.Я. и др., i960).

Данные реакций со всеми пятью типами МКА (в перечисленных серологических и иммунохимических экспериментах) представляют результаты не менее трех независимых экспериментов.

Результаты и обсуждение

В результате слияния клеток селезенок мышей, иммунизированных вирусом Инко, с клетками миеломы NS-0, было получено 5 гибридом, стабильных по способности к росту и продукции специфических моноклональных антител. Все они после двукратного клонирования были введены мышам для получения асцитных жидкостей.

Полученные моноклональныё антитела (Инк1, 2. 3. 4 и 5)

были исследованы в отношении типа специфических иммуноглобулинов, их направленности к вирусным белкам, активности в серологических реакциях с известными вирусами КСГ и малоизученными Инко-подобными штаммами.

С помощью иммуноферментного анализа с использованием суб-типирующей тест-системы было установлено, что гибридомы Инк1, 2 и 3 секретируют иммуноглобулины класса 61, Инк4 - 62Ь, ИнкЕ - 63. Анализ легкой цепи показал, что МКА Инк1, 2, 3, 4 и Е имеют каппа тип легкой цепи (Табл. 1).

Специфичность МКА к белкам вируса Инко изучали при помощи иымуноблоттинга. Было установлено, что МКА Инк! и 2 взаимодействуют с белком молекулярной массой 25 кДа, МКА ИнкЗ реагировали с белком молекулярной массой 41 кДа, Инк5 - с белков массой 15 кДа. МКА Инк4 с антигенами вируса Инко в реакции им-муноблоттинга не реагировали. Результат с МКА Инк5 оказался противоречивым , так как он указывал на направленность антитез к неструктурному белку ИБш, хотя установленная нами активность МКА Инк5 в РТГА свидетельствовала об их направленности к поверхностному гликопротеину. Методом радиоиммунопреципитацад было установлено, что МКА Инк4 взаимодействует с белком массой 105 кДа, а Инк5 - с белками массой 33 кДа и 15 кДа. На основании этих результатов, сопоставленных с литературными данными, можно заключить, что МКА Инк1 и 2 направлены против внутреннего белка N вируса Инко, МКА ИнкЗ и Инк5 - против поверхностного гликопротеина 62, а МКА Инк4 - против поверхностного гли-копротеина 61 (Таблица 1).

В реакции радиоиммунопреципитаиии МКА Инк5 взаимодействовали с двумя белками: массой 33 кДа (область Б2) и 15 кДг (ИЗт). Это явление трудно объяснить гетерогенностью гибридомь

Таблица l.

Свойства МКА (№<«1,2,3,4,5), взаимодействующих с вирусом Инко

клон Суб-тйпы IgG Специфич. к вирусн. белкам Обратная величина титров МКА в Титр антигена в ИФА вариант 2*

МФА РН РТГА ИФА

АЖ КЖ АЖ АЖ вариант 1 мозговой культур.

Инк1 Gl N 6400 100 < 40 - * # 1600 ОС

ИНК2 Gl N 9600 100 < 40 к к 640000 # * *

ИнкЗ Gl G2 6400 100 с 40 - - - -

Инк4 G2B G1 6400 100 800000 640 - - 4

Инкб G3 G2 6400 100 < 40 1230 - - 8

ИАЖ Инко 640 2560 320 320 3200 о О ОС-

* - вариант 1 - сенсибилизация лунок специфическим антигеном

вариант 2 - сенсибилизация лунок иммуноглобулинами (МКА) ** - отрицательный результат при разведении МКА в 10 раз. *** - отрицательный результат реакции с нативным культуральным антигеном и мозговым антигеном в разведении 1:10.

Инк5, которая неоднократно клонировалась и долго перевивалась in vitro, что должно было привести к сохранению только одного продуцирующего клона. Наличие, в случае МКА Инк5, двух полос взаимодействия, скорее всего, указывает на реакцию этих антител как с основным белком, так и с продуктами его распада или процессинга. Не исключено, что МКА Инк5 взаимодействует со схожими зпитопами на белке G2 и на неструктурном белке NSm. Как известно, белки Gl, G2 и NSm экспрессируются в виде общего предшественника, который затем нарезается. Роль белка NSm до сих пор не определена. Наличие на NSm эпитопа, похожего на ге-магглютинирующий эпитоп белка G2, вероятно, указывает на взаимосвязь этих белков в процессе формирования вириона и выхода его из клетки через мембрану эндоплазмагической сети и аппарата Гольджи.

- iu -

Отрицательный результат тестирования МКА Инк4 методом им-муноблоттинга говорит, повидимому, об их направленности к кон-фармационной детерминанте, легко разрушающейся под действие»/ агрессивных факторов растворов CSDS, ПЭГ). Нагревание белка 61, к которому направлены МКА Инк4, до 100°С привело к уменьшению его массы. Это, очевидно, указывает на димерное строение молекулы белка Gl, в котором мономеры связаны дисульфидньш • связями (Gonzalez-Scarano F., Pekosz А., 1996).

При изучении активности МКА Инк1, 2, 3, 4 и 5 в серологических реакциях было установлено, что в ИФА при сенсибилизацот лунок антигеном вируса Инко реагировали только МКА Инк2 (с титром 1:640000). В том случае, когда ИФА использовали для обнаружения специфических антигенов, с антигеном Еируса Инке взаимодействовали МКА (в виде иммуноглобулинов) Инк1, 4 и 5. Причем, МКА Инк1 реагировали как с мозговым, так и культуралъ-ным антигеном, а МКА Инк4 и 5 - только с культуральным.

В МФА наибольшей специфической активностью (1:9600) обладали АЖ, содержащие МКА Инк2, а титры МКА Инк1, 3, 4, и 5 составляли 1:6400. Титры МКА, присутствующих в поддерживающее среде всех пяти культивируемых гибридом были одинаково низкими (1:100) (Таблица 1).

В реакции нейтрализации МКА Инк1, 2, 3 и 5 в разведенш 1:40 не обладали нейтрализующим действием против 100 ЦПЦ50 вируса Инко, тогда как титр Инк4 составлял 1:800000 (Таблица 1).

В РТГА с антигеном вируса Инко реагировали МКА Инк4 и ï (в виде АЖ) в титрах 1:640 и 1:1280 соответственно, а МКУ Инк1,2 и 3 оказались неактивными даже при разведении АЖ 1:1С (Табл. 1).

Отрицательный результат РОК с антигеном вируса Инко и MKJ Инк1, 2 и 3 объясняется тем, эти типы антител являются имму-

ноглобулинами класса Б1, которые не фиксируют комплемент (Вогбоб Т., 1971). МКА Инк4 и 5 (иммуноглобулины 62Ь и 63 соответственно) не реагировали в РСК, по причине разрушения специфических зпитопов на белках и Б2 вируса Инко в процессе приготовления мозговых сахарозо-ацетоновых антигенов.

Взаимодействие моноклональных антител к вирусу Инко с известными вирусами КСГ определяли в опытах ША, ИФА и реакции нейтрализации.

МКА Инк1. 2, 3, 4 и 5 (в виде АЖ) не реагировали в МФА с антигенами вируса зайца беляка и Тривиттатус. МКА Инк1 взаимодействовали с антигенами вирусов калифорнийского энцефалита, Лумбо, Джеймстаун Каньон и Кейстон; Инк2 - с антигенами вирусов Тягиня, Лумбо, Джеймстаун Каньон, Кейстон; ИнкЗ - с антигеном вируса Ла Кросс; Инк4 - с антигеном вируса Лумбо, а Инк5 - с антигенами вирусов Лумбо и Джеймстаун Каньон (Табл.2).

Таблица 2.

Взаимодействие МКА с вирусами КСГ в МФА

Антигены вирусов МКА к вирусу Инко (АЖ) ИАЖ Инко

Инк1 Инк2 ИнкЗ ИНК4 Инк5

Калифор.энцеф. 200* - - - - 80

Ля Кросс - - 200 - - 80

заяца беляка - - - - - 80

Тягиня - 4000 - - - 80

Лумбо 4000 4000 - 2000 2000 80

Джемс.Каньон 4000 4000 - - 1000 40

Кейстон 200 4000 - - 160

Инко 6400 9600 6400 6400 6400 640

Тривиттатус - - - - 80

* - обратная величина титра антител.

Данные МФА с МКА Инк1 и 2, направленными к N белку, подтверждают представление о наибольшей консервативности эпитопов нуклеопротеина. Они не выявляли различий между вирусами Инко и Джеймстаун Каньон, что находится в полном соответствии с данными Стпа, 5йоре (1996), обнаружившими 97,77. гомологии в аминокислотной последовательности N белков этих вирусов.

МКА ИнкЗ, 4 и 5, к поверхностным гликопротеинам, выявляли слабую гомологию эпитопов вирусов Инко и других вирусов КСГ, что, как известно, отражает большую изменчивость М-сегмента РНК, кодирующего белки 61 и 62.

Резюмируя этот раздел исследований можно сказать, что применение в реакции МФА любых из пяти полученных нами МКА позволяет четко дифференцировать вирусы Инко и Тягиня от вируса зайца беляка. С помощью МКА Инк1, 3, 4 и 5 можно установить разницу между вирусами Инко и Тягиня; МКА Инк1, 4 и 5 дифференцируют близкородственные вирусы Тягиня и Лумбо, а МКА Инк5 - вирусы Джеймстаун Каньон и Кейстон, относящиеся к антигенному типу Мелао. МКА ИнкЗ, обладающие наиболее выраженной специфичностью (в разведении 1/200), очевидно способны определять принадлежность изолированных штаммов к вирусу Инко, исключая другие возможные варианты идентификации.

В реакции ИФА МКА Инк1, 4 и 5 не взаимодействовали с вирусами зайца беляка, Тягиня, Кейстон и Тривиттатус. МКА Инк1 выявляли наличие общего зпитопа у вируса Инко и вирусов калифорнийского энцефалита, Ла Кросс и Джеймстаун Каньон. МКА Инк4 взаимодействовали только с вирусом калифорнийского энцефалита, а МКА Инк5 - с вирусами калифорнийского энцефалита и Лумбо (Табл. 3).

Взаимодействие МКА Инк1, 4 и 5 с вирусами КСГ в ИФА

Антигены вирусов МКА (1^) (1 мкг белка/лунку) ИАЖ Инко (1мкг белг с мозг, антигеном :а/лунку) с КУЛЬТ антигеном

Инк1 * Инк4*к Инк5**

Калифор.энцеф. 800 о И * * |С 4 3200 128

Ля Кросс 1600 - 3200 оо О«-

заяца беляка - - 1 1600 16

Тягиня - - - 3200 32

Лумбо - - 1 1600 32

Джеймс.Каньон 1600 - - 3200 64

Кейстон - - - 1600 4

Инко 1600 4 8 3200 32

Триьиттатус - - - 800 4

* - ИФА с антигенами штаммов из мозга нбм

** - ИФА с культуральными антигенами штаммов (нативнач культу-

ральная жидкость инфицированных клеток ВНК-21) *** - разведение нативной культуральной жидкости инфицированных меток ВНК-21

**** - отрицательный результат ИФА с мозговыми антигенами в разведении 1/10 или культуральными антигенами в виде нативной культуральной жидкости от клеток ВНК-21

При сравнении данных опытов МФА и ИФА было установлено, что МКА Инк1 и 2 направлены к разным эпитопам нуклеопротеина вируса Инко, а ИнкЗ и 5 - к разным эпитопам гликопротеина 02.

В реакции нейтрализации МКА Инк4 (единственные из пяти МКА, обладающие нейтрализующей активностью) проявляли абсолютную специфичность: при гомологичном титре антител 1:800000 они не вступали в реакцию (в разведении АЖ 1:40) с другими исполь-зовнными в работе вирусами КСГ (калифорнийского энцефалита, Ла Кросс, зайца беляка, Тягиня, Лумбо, Джеймстаун Каньон, Кейстон и ТрнЕИТтатус). ,

Анализ суммарных данных, полученных нами с помощью МФА.

ИФА и РН, показал, что вирус Тривиттатус не взаимодействует ни с одним типом МКА, и он является наиболее удаленным от вируса Инко, как и от других представителей КСГ. Это согласуется с данными Ба^ег, Нашоп (1967) и СаНБЬег (1981). При изучении нуклеотидных последовательностей вирусных геномов эта обособленность вируса Тривиттатус также была очевидной С1ппа, Зйоре (1996).

С1ппа и Згюре установили близкую (98,2%) гомологию белков Б2 вирусов Инко и Джеймстаун Каньон. В наших экспериментах, МКА Инк5, направленные к белку 62, выявляли общий эпитоп у вирусов Инко и Джеймстаун Каньон, тогда как МКА ИнкЗ (также направленные к белку Б2) взаимодействуют только с вирусом Инко. Отсутствие аналогичного эпитопа белка 62 у вируса Джеймстаун Каньон, свидетельствует либо о попадании МКА ИнкЗ на 2-х процентную разницу в аминокислотных последовательностях белков 62, либо о различном гликозилировании белка 62 у вирусов Инко и Джеймстаун Каньон.

В 1994 году С.Д. Лебедева применила метод лантонидной им-мунофлюоресценции (ЛИФА) для антигенной классификации вирусов КСГ. В отличии от классификации, предложенной Ч.Калишером (1983), автор предложил рассматривать вирусы Лумбо и зайца беляка в качестве самостоятельных вирусов, а не вариантов соответственно вирусов Тягиня и Ла Кросс; вирус Ла Кросс по ее мнению занимает, возможно, промежуточное положение между комплексами вирусов Калифорнийского энцефалита и Мелао; вирус Инко относится к типу Мелао, а не калифорнийского энцефалита. По нашим данным, вирус Лумбо также значительно отличается от вируса Тягиня (всего один общий эпитоп на ЬЬбелке); вирус Ла Кросс имеет общие эпитопы с вирусом Инко на М-белке и 62 белке (что подтверждает положение о промежуточном положении вируса

Ла Кросс). Нами обнаружены антигенные мостики, выявляемые МКА Инк! и 2 (направлены к нуклеокапсидному белку), между вирусом Инко и вирусами Джеймстаун Каньон, Кейстон и Лумбо, и выявляемые МКА Инк4 и 5 (направлены к поверхностным белкам) между вирусом Инко и вирусами Лумбо и калифорнийского энцефалита.

Определенная противоречивость литературных и наших данных по антигенной классификации вирусов КСГ объясняется неадекватностью возможностей используемых серологических реакций (РСК, РТГА, РН, ИФА, МФА, ЛИФА), а также недостаточным количеством применяемых типов МКА, которые не охватывают все многообразие вирусных антигенных эпитопов.

С помощью пяти типое МКА в МФА, ИФА и РН были изучены 12 штаммов из различных регионов России, которые были выделены и предварительно идентифицированы в лаборатории экологии вирусов Института вирусологии как Инко-подобные штаммы.

Судя по результатам опытов МФА, у всех этих 12 штаммов имеется эпитоп нуклеокапсидного белка N, выявляемый МКА Инк2. МКА Инк1 (также направленные к N белку) реагировали со всеми штаммами за исключением LEIV 15389, 15852 и 27044. МКА ИнкЗ, направленные к гликопротеину G2, в разной степени взаимодействовали с антигенами семи штаммов: LEIV 12636, '15389, 15852, 17241, 18106, 22788 и 22981; МКА Инк4, направленные к белку G1, не реагировали с антигенами штаммов LEIV 15852, 18106 и 27044, а МКА Инк5, направленные к белку G2, - с антигенами штаммов LEIV 18106, 27044 и 27063. Четыре штамма (LEIV 12636, 17241, 22788 и 22981) взаимодействовали в МФА со всеми пятью типами МКА, три штамма (LE1V 15389, 24017 и 25903) - с четырьмя. Наибольшее отличие от этой группы имел штамм 27044, реагирующий только с МКА Инк2 (Табл. 4).

Таблиц

Взаимодействие Инко-подобных штаммов с МКА Инк1, 2, 3, 4, 5 в

штаммы (антигены) МКА (АЖ)

Инк1 Инк2 ИнкЗ Инк4 Инк5

к" Б2* 61" 02*

ЬЕIV 12636 6000х * 200 1000 6000 6000

ЬЕ1У 12954 6000 6000 * * * - 6000

ЬЕП 15389 - 6000 6000 6000 6000

ЬЕ1У 15852 - 200 200 - 200

1Е1У 17241 6000 6000 400 400 400

ЬЕ1У 18106 4000 200 200 - -

1Е1У 22788 6000 200 6000 6000 6000

ЬЕIV 22981 6000 6000 400 6000 6000

ЬЕ1V 24017 6000 6000 - 4000 400

ЬЕ1У 25603 4000 6000 - 6000 6000

ЬЕ1У 27044 - 6000 - - -

ЬЕ1У 27063 4000 6000 - 4000 -

Инко КМ-3641 6000 6000 6000 6000 6000

контрольный антиген - - - - -

* - направленность МКА к вирусным белкам

** - обратные значения титра антител

*** - отрицательный результат при разведении МКА 1/10

Б ИФА мозговые антигены штаммов 12636, 12954, 17241, 18106, 22788, 22981, 25603 и 27063 реагировали с МКА Инк1 в титрах от 1/200 до 1/3200, при отрицательных результатах ИФА с антигенами штаммов 15852, 15389 и 17044. МКА Инк4 и 5 в ИФА не взаимодействовали с мозговыми антигенами всех 12 штаммов, хотя культуральные антигены (в виде нативной культуральной жидкости инфицированных клеток ВНК-21) штаммов 12954, 17241 и 22981 были активными с МКА Инк4, а МКА Инк5 реагировали с культураль-

ными антигенами штаммов 12636, 12954, 15952, 17241, 22981 и 24017 (Табл. 5).

Таблица 5.

Взаимодействие антигенов Инко-подобных штаммов с МКА Инк1, 4 и 5 в ИФА

Штаммы (антигены) МКА (Ig) (1 мкг белка/лунку) ИАЖ Инко (1мкг бе: с мозг, антиген. ¡ка/лунку с культ, антиген.

Инк1 * ИНК4** Инк5**

LEIV 12636 1600 Н * * 1 1600 8

LEIV 12954 800 1 1 1600 8

LEIV 15389 * * * - - 3200 и

LEIV 15852 - - 1 800 8

LEIV 17241 800 1 1 6400 О

LEIV 18106 800 - - 1600 16

LEIV 22788 200 - - 6400 16

LEIV 22981 3200 1 1 6400 8

LEIV 24017 1600 - 1 6400 8

LEIV 25603 800 - - 1600 8

LEIV 27044 - - - 800 о С

LEIV 27063 1600 - - 1600 . 8

Инко KN-3641 3200 1 1 6400 16

контрольный антиген - - - - -

* - ИФА с антигенами штаммов из мозга нбм

** - ИФА с культуральными антигенами штаммов (нативная культу-

ральная жидкость инфицированных клеток ВНК-21)

*** - отрицательный результат ИФА с мозговыми антигенами в разведении 1/10 или культуральными антигенами в виде нативной культуральной жидкости от клеток ВНК-21

Нейтрализующей активностью в отношении вируса Инко (КН-3641) обладали только МКА Инк4, в равной степени (1/6400) реагирующие со штаммами ЬЕIV 18106, 22788, 22981, и значительно слабее - со штаммами ЬЕЛУ 12954, * 17241 (1/1600) и 12636 (1/200) (Табл. 6).

Взаимодействие Инко-подобных вирусов с МКА Инк4 в реакции нейтрализации.

Штаммы Обратная величина титра МКА Инк4 (АЖ) против 100 ЦПД50 Обратная величина титра ИАЖ Инко против 100 ЦПД50

LEIV 12636 200 320

LEIV 12954 1600 320

LEIV 15389 * 80

LEIV 15852 - 160

LEIV 17241 1600 320

LEIV 18106 >6400 320

LEIV 22788 >6400 320

LEIV 22981 >6400 320

LEIV 24017 - 160

LEIV 25603 200 320

LEIV 27044 - 320

LEIV 27063 - 320

ИНКО KN-3641 >6400 320

^ - отрицательный результат реакции при разведении АЖ 1/40

На основании полученных данных, указывающих на выраженную вариабельность изученных Инко-подобных штаммов, мы предприняли попытку определения цифрового критерия их принадлежности к вирусу Инко. При этом учитывалась специфическая активность каждого штамма в МФА с пятью МКА, в ИФА с МКА Инк1, 4, 5 и в РН -с МКА Инк4. Реактивность МКА с прототипным штаммом KN-3641 принимали за единицу. Для примера приводится расчет этого критерия для штамма LEIV 12954 (Табл. 7).

Степень родства исследованных штаммов к вирусу Инко выра-

Пример расчета показателя степени родстваштамма ЬЕ1У 12954 вирусу Инко.

Активность МКА в реакциях

Штаммы Инк1 Инк2 ИнкЗ Инк4 Инк5 Сумма отношений титро

МФА ИФА МФА МФА МФА ИФА РН МФА ИФА

ЬЕ1У 12954 6000* 800 6000 - - 1 1600 6000 1

Инко КМ-3641 6000 3200 6000 6000 6000 1 >6400 6000 1

отношения титров для ЬЕ1V 12954 1 0,25 1 0 0 1 0,25 1 1 5,5

отношения титров для Инко КМ-3641 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9

* - обратная величина титра "-" - отрицательный результат в реакции

зилаоь следующим образом: ЬЕ1У 22981 (Тюмень) - 8.1 (при максимально возможном показателе 9), 12954 (Архангельск) - 5.5, 22788 (Тюмень) - 5.1, 17241 (Мордовия) - 4.7, 12636 (Новгород) - 4.7, 24017 (Тюмень) - 4.3, 15389 (Рязань) - 4.0, 25603 (Алтай) - 4.0, 27063 (Москва) - 2.9, 18106 (Якутия) - 2.2-, 15852 (Коми) - 1.1, 27044 (Москва) - 1.0 (Рис. 1).

Аналогичным способом была расчитана степень родства к вирусу Инко вирусов Джеймстаун Каньон (2.6), Лумбо (2.2), калифорнийского энцефалита (1.5), ЛаКросс (1.0), Кейстон (0.73), Тягиня (0.7), зайца беляка (0.13) и Тривиттатус (0.0). Как видно, степень родстЕа в этом случае не превышала 2.6 (Рис. 2).

Таким образом, принадлежность штаммов к вирусу Инко, по-видимому, может быть определена показателями 3 и выше. По этому критерию 8 из 12 исследованных штаммов относятся к виру-• су Инко (иг Тюменской, Архангельской, Новгородской, Рязанской

Икко 22981 12954 22788 17241 12836 24017 15389 25603 270СЗ 18106 16352 27044

Рис.1. Степень антигенной связи Инко-подобных штаммов с вирусом Инко, определенная по результатам серологических реакций с МКА Инк1 - 5.

Инко Дх.К. Лумбо Кал-экц. Л&Кросс Кейстон Тягиня

Трив.

Рис.2. Степень антигенного родства вируса Инко и других вирусов КСГ, определенная по результатам серологических реакций с МКА Инк1 - 5.

Новгород 126:«; (4.7)*

Москва

27063(2.9) 27044Д.0)

МОРДОВИЯ 17241

(4.7)

Дрхэмгелу 12954

5.5),

Коми 15852

(Ч)

Пкутя 18106 (2.2)

Тюмень 22?01(&1) 22708(5.1) 24017(4.3)

Дл!ай 15383(4.0)

РИС.3. Географическое распределение 12 исследованных Инко-подобных штаммов.

* - в скобках указаны цифровые показатели, отражающие степень антигенной'связи штаммов с вирусом инко.

областей, Мордовии и Алтайского края), а четыре (из Московской области (LEIV 27063, 27044), Якутии (LEIV 18106) и Республики Коми (15852)) являются своеобразными представителями КСГ, существенно отличающимися от штамма KN-3641. Мы проанализировали связь между географическим происхождением штаммов и степенью антигенной близости к вирусу Инко (то есть числом выявляемых МКА Инк1 - 5 антигенных эпитопов). Данные свидетельствуют об отсутствии заметной корреляции между этими факторами (Рис.3), хотя можно отметить, что все четыре штамма из южных регионов Западной Сибири (Тюменская область и Алтайский край) оказались в группе наиболее близких штамму KN-3641.

Выводы

1. Получено 5 гибридомных клонов, стабильно продуцирующих моноклональные антитела (МКА) (Инк1, 2, 3, 4 и 5), которые обладают высокой активностью взаимодействия с антигенами вируса Инко.

2. Методами иммуноблоттинга и радиоиммунопреципитации установлена специфичность МКА в отношении белков Бируса Инко: Инк1 и Инк2 направлены к нуклеокапсидному белку N. ИккЗ и Инк5 - к поверхностному гликопротеину Б2, а Инк4 - к поверхностному гликопротеину 61.

3. Все типы полученных МКА активно взаимодействию? с антигеном Еируса Инко в МФА. В ИФА при разных варианта>: постановки реакции активными оказались МКА Инк1, 2, 4, и 5; антиге-магглютинирующей активностью обладают МКА Инк4 и 5, а нейтрализующей активностью - Инк4.

4. В результате использования МКА Инк1, 2, 3, 4 и 5 в реакциях ИФА и МФА установлена следующая последовательность, отражающая антигенную близость вирусов КСГ и вируса Инко: Джеймстаун Каньон, Лумбо, Калифорнийского энцефалита, Ла Кросс, Кейстон, Тягиня и зайца беляка. Вирус Тривиттатус в этих реакциях не взаимодействует ни с одним из пяти МКА. В реакции нейтрализации МКА Инк4 проявляют абсолютную специфичность к вирусу Инко.

5. Двеннадцать Инко-подобных штаммов из различных регионов России типированы с использованием МКА в серологических реакциях. Восемь штаммов оказались штаммами вируса Инко, а четыре - значительно отличающимися штаммами.

5. На основании изучения перекрестных реакций вирусов КСГ и Инко-подобных штаммов с помощью МКА предложены цифровые кри-

терии, отражающие принадлежность исследуемых штаммов к вирусу Инко.

7. На основании использования МКА разработаны тест-системы для идентификации вирусов КСГ. В МФА и ИФА возможна качественная дифференциация эндемичных для территории России вирусов Инко, Тягиня и зайца беляка.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Ларичев В.Ф., Лебедева С.Д. Применение моноклональных антител для изучения вирусов калифорнийской серогруппы. /Вопр. вирусол. 6, 1996, с.242-244.

2. Ларичев В.Ф., Атанадзе С.Н.,Кущ A.A., Бутенко A.M. /Получение моноклональных антител к вирусу Инко (Bunyavi-ridae, Bunyavirus) и их использование для дифференциации вирусов калифорнийской серогруппы./ Вопр. вирусол. 4, 1998, в печати.

3. Ларичев В.Ф., Бутенко A.M., Громашевский В.Л., Морозова Т.Н., Скворцова Т.М., Атанадзе С.Н., Кущ A.A., Львов Д.К. /Идентификация штаммов вирусов калифорнийской серогруппы (Bunyaviridae, Bunyavirus) с использованием моноклональных антител к вирусу Инко. Вопр. вирусол. 6, 1998, в печати.