Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека

Карамышева, Татьяна Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека"

На правах рукописи УДК(576.316.352:575.224):595.773.4

РГ5 ОД

Я 3 пкт '

КАРАМЫШЕВА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОДИССЕКЦИОННЫХ ДНК-БИБЛИОТЕК ПРИ АНАЛИЗЕ ХРОМОСОМНЫХ ПАТОЛОГИЙ ЧЕЛОВЕКА.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2000

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Н.Б. Рубцов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

П.М.Бородин

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск,

доктор биологических наук, профессор С.А. Назаренко

Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра Российской акдемии медицинских наук.

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии РАН, Москва

Защита диссертации состоится 2, j ьсОЙОр® 2000г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, просп. Лаврентьева, 10; факс 8-3832-331278; emai': dissov@bionet.tisc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_

2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

В 2У/, О

f 41, "I - V

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Практика анализа хромосомных аномалий человека показала, что методы дифференциального окрашивания хромосом позволяют надежно идентифицировать материал лишь части аномальных хромосом человека. Возможности цитогенетического анализа значительно расширились благодаря появлению и развитию методов флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). В связи с этим развитие новых систем получения и эффективного использования ДНК-зондов превратилось в одну из самых актуальных проблем современной молекулярной цитогенетики.

В настоящее время имеется огромный набор коммерчески доступных ДНК-зондов, обеспечивающих идентификацию отдельных хромосомных районов, пэйнтинг проб хромосом человека и некоторых других видов. Тем не менее, прямое получение ДНК-библиотеки аномальной хромосомы, либо интересующего хромосомного района, и сегодня остается наиболее эффективным подходом при определении входящего в его состав материала.

Одним из самых быстрых и дешевых способов получения таких ДНК-библиотек является микродиссекция метафазных хромосом с последующей амплификацией их ДНК в полимеразной цепной реакции. В отличие от длительных исследований, необходимых для получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек с помощью монохромосомных гибридных клеточных линий, или дорогостоящего хромосомного соргинга, микродиссекция метафазных хромосом с последующим DOP-PCR позволяет получать специфичные ДНК-библиотеки в течение суток. Причем ДНК-библиотеки аномальных хромосом могут быть получены даже при их наличии в очень небольшом проценте клеток.

Уже более шести лет этот подход используется в медицинской диагностике. Тем не менее, разработка надежного метода, обеспечивающего получение ДНК-зонда из одной копии хромосомы или хромосомного района, а также ДНК-библиотек с высокой представительностью, которые могут быть эффективно использованы для многоцветной in situ гибридизации, остается актуальной проблемой до настоящего времени.

Основными проблемами использования микродиссекции хромосом для получения специфических ДНК-библиотек оставались ее недостаточно высокая воспроизводимость и недостаточно высокая эффективность амплификации ДНК дифференциально окрашенных хромосом.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было выявление и устранение причин, обуславливающих низкий уровень воспроизводимости при получении ДНК-библиотек методом микродиссекции метафазных хромосом и последующей амплификации ДНК диссектированного мате-

риала, а также последующая разработка новой дешевой и надежной модификации этого метода, свободной от перечисленных выше недостатков. Настоящее исследование предполагало также апробацию данного метода при проведении молекулярно-цитогенетической диагностики врожденных хромосомных патологий и при анализе реорганизации генома в случаях злокачественной трансформации клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии.

Для достижения этой цели необходимо было решить ряд задач:

1. Выяснить причины снижения эффективности амплификации ДНК после фиксации хромосом и приготовления хромосомных препаратов.

2. Повысить эффективность амплификации диссекгарованного хромосомного материала путем оптимизации приготовления цитологических препаратов хромосом, используемых для микродиссекции.

3. Повысить эффективность системы ферментативной универсальной амплификации ДНК.

4. Разработать протокол создания хромосомо- и районспецифичных ДНК-библиотек, использование которого позволило бы получать качественные ДНК-зонды из одной копии диссектированного хромосомного фрагмента.

5. Получить набор хромосомоспецифичных ДНК-библиотек всех хромосом человека, пригодных для использования в 24-цветной FISH.

6. Получить наборы районспецифичных ДНК-библиотек, пригодные для получения многоцветного бэндинга хромосомы 3 и 18 человека.

7. Апробировать предложенный метод в диагностике врожденных хромосомных патологий и хромосомных перестроек в малигнизированных клетках.

Научная новюна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований выявлен ряд факторов, влияющих на эффективность создания хромосомо- и районспецифичных ДНК-библиотек путем микродиссекции метафазных хромосом и последующего DOP-PCR, оптимизированы условия DOP-PCR с термофильной полимеразой, используемой для амплификации диссектированного хромосомного материала. Разработан новый протокол получения ДНК-библиотек микродиссекцией метафазных хромосом, характеризующийся высокой эффективностью и воспроизводимостью результатов, позволяющий получать качественные ДНК-зонды из одной копии диссектированного материала.

Практическая значимость предложенного метода была продемонстрирована на примере анализа хромосомных аномалий как врожденных, так и возникших при злокачественной трансформации клеток. Проведенные исследования позволили во всех случаях с высоким уровнем разрешения идентифицировать материал маркерных хромосом. Для детального анализа одной из маркерных хромосом впервые в мире был получен набор последовательных

ДНК-библиотек путем микродиссекции одной копии маркерной хромосомы.

В работе получены: комплект хромосомоспецяфичных ДНК-библиотек, обеспечивающий проведение 24-цветной in situ гибридизации, а также наборы районспецифичных ДНК-библиотек для получения многоцветного бэндинга хромосом 3 и 18 человека.

Практика использования разработанного метода показала его высокую эффективность, что позволяет рекомендовать его для широкого использования в медико-генетической диагностике, а также ставит вопрос об изменении существующей стратегии анализа сложных хромосомных патологий, принятой в настоящее время медико-генетической службой Российской Федерации.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на следующих конференциях и съездах: 12-й Ежегодный Конгресс Немецкого общества генетики человека, проводимый совместно с Австрийским обществом генетики человека и Швейцарским обществом медицинской генетики (Любек, 22-25, Март, 2000 года); Всемирный Конгресс по клеточной и молекулярной биологии (8-13 Октября, 2000, Йена, Германия); Конференция, посвященная десятилетию Новосибирского Областного диагностического центра (Новосибирск, ноябрь, 1999 года), семинар общества медицинских генетиков г. Новосибирска (сентябрь, 1999 года).

Вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, посвященных разработке новой версии метода получения специфических ДНК-библиотек, получению хромосо-мо- и районспецифических ДНК-библиотек человека, анализу врожденных хромосомных аномалий и хромосомных перестроек в малигнизированных клетках.

Публикации. Основные материалы опубликованы в 4-х печатных работах в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 229 ссылок. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и содержит 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Суспензии ФГА стимулированных лейкоцитов периферической крови человека были любезно предоставлены нам к.б.н. В.Г. Матвеевой (Новосибирский областной диагностический Центр), C.B. Сосницкой (Муниципальный Центр планирования семьи и репродукции г. Новосибирска) и профессором У. Клауссеном (Институт генетики человека и антропологии Университета им.

Фридриха Шиллера, г. Йена, ФРГ). Суспензии фиксированных клеток костного мозга были любезно предоставлены д.м.н. М.М. Дегтяревой (Новосибирская медицинская Академия) и к.б.н. О.В Саблиной. (лаборатория цитогенети-ки человека и животных ИЦиГ СО РАН).

Меченые микродиссекционных ДНК-библиотек проводили в 17-ти дополнительных циклах DOP-PCR в присутствии biotin-16-dUTP или digoxigenin-11 -dUTP.

Супрессионную in situ гибридизацию проводили согласно стандартным протоколам.

Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа AXIOSCOP 2, для регистрации и обработки сигнала использовали CCD-камеру и программное обеспечение «ISIS» фирмы METASYSTEMS GmbH (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Разработка новой версии метода получения хромосоме- и районспецифич-

ных ДНК-библиотек Выбор системы универсальной амплификации ДНК

Проведено сравнение эффективности трех систем универсальной амплификации ДНК: SIA - sequence-independent DNA amplification (Bohlander ct al, 1992); DOP-Shuttle-PCR (Yokoyama and Sakuragawa, 1995) и DOP-PCR (Telenius et al., 1992; Rubtsov et al., 1996). Выбор DOP-PCR был обусловлен следующими причинами:

1. Полученные результаты указывают, что SIA и DOP-Shuttle-PCR не имели значительных преимуществ перед DOP-PCR в отношении наработки материала из малого количества исходной матрицы, но при этом требовали проведение большего числа высокотемпературных циклов.

2. Для проведения DOP-PCR требуется один DOP-праймер, т.е. 6MW (5'-CCGACTCGAG-NNNNNNATGTGG-3'), а для SIA и для DOP-Shuttle-PCR необходим синтез двух праймеров, что приводит к повышению стоимости получения окончательного продукта.

3. Увеличение длины праймера приводит к снижению не специфичности отжига в низкотемпературных циклах ПЦР, а, следовательно, и к уменьшению представительности получаемых ДНК-библиотек.

4. Праймер, используемый при низкотемпературных циклах SIA, имеет меньший по размеру вырожденный район, чем DOP-Shuttle-PCR и DOP- PCR

5. Большой размер праймеров, используемых при низкотемпературных циклах SIA и DOP-PCR, создает угрозу возникновения в низкотемпературных

циклах большего количества праймер-опосредованных артефактов.

6. Наличие Xhol сайта на 5 -конце DOP-праймера упрощает клонирование фрагментов ДНК-библиотек.

7. 6MW праймер уже был использован в DOP-PCR для получения ДНК-зондов из единичных копий микродиссектированных хромосом (Guan et al., 1993, Viersbach et al., 1994, Rubtsov et al., 1996, Weimer et al., 1999).

Оптимизация условий универсальной амплификации ДНК Особенностью DOP-PCR является наличие двух типов циклов: низкотемпературных, предназначенных для генерации фрагментов ДНК, фланкированных DOP-праймером; и высокотемпературных, предназначенных для размножения созданных в низкотемпературных циклах амплифицируемых фрагментов ДНК. С этим связан набор требований, предъявляемых к используемым ДНК полимеразам. Сравнение Ampli Taq полимераз, проведенное в нашем исследовании, определило выбор в качестве основной полимеразы Ampli Taq, Stoffel Fragment ДНК полимеразы фирмы Perkin Elmer, которая может быть использована либо и в низкотемпературных и высокотемпературных циклах, либо в комбинации с Sequenase Version 2.0 ДНК полимеразой только в высокотемпературных циклах. Оптимизация как профиля PCR, так и концентраций всех компонентов реакционной смеси, изучение влияния на PCR компонентов коллекционной капли позволило в 10-20 раз повысить эффективность низкотемпературных циклов при проведении PCR по следующему протоколу, включающему инактивацию протеиназы К, проводимой в 4,5мкл раствора (ЮмМ Трис HCl, ЮмМ KCl, 200мкМ каждого из дНТФ, 5 мкМ DOP-праймера (6-MW), 5мМ MgCl2, 0.1% Б CA, pH 8,3) 5 минут при 96°С, добавление 2 ед. AmpliTaq, Stoffel Fragment ДНК полимеразы (Boehringer Mannheim),разбавленной в 0,5 мкл lxStoffel Fragment буффера при 4°С. Создание фрагментов ДНК, фланкированных 6MW, осуществляли в 10 низкотемпературных циклах (94°С-1 мин.; 25°С - 1,5 мин.; переход к 72°С путём повышения температуры на 0,23°С в секунду; 72°С - 2 мин.). Для амплификации ДНК добавляли 50 мкл раствора (lxStoffel буфер, 200 мкМ дНТФ, 1мкМ DOP-праймера, 5мМ MgClj и 5 ед. AmpliTaq, Stoffel Fragment ДНК полимеразы) и проводили 24 высокотемпературных цикла (94°С - 1 мин; 56°С - 1,5 мин.; 72°С - 2 мин.) с последующей инкубацией при 72°С в течение 8 минут. При использовании для генерации фрагментов ДНК, фланкированных 6MW, Sequenase Ver.2/0 низкотемпературные циклы проводили согласно стандартному протоколу (Rubtsov et al., 1996).

Анализ факторов, влияющих на эффективность амплификации диссек-тированного материала Проведён анализ таких факторов, влияющих на эффективность амплификации ДНК диссекгированного материала, как фиксация митотических кле-

ток, распластывание метафазных хромосом на стекле, окраска хромосом, хранение препаратов, микродиссекция и перенос хромосомного материала в коллекционную микрокаплю, протеиназная обработка диссекгированного материала в микрокапле. Было обнаружено, что на амплифицируемость диссекгированного материала влияет способ фиксации, отмывки препарата от метафазных хромосом от уксусной кислоты, температура промывочных и окрашивающих растворов, изменение объема микрокапли в процессе депротеиниза-ции. Показано, что даже небольшое варьирование перечисленных факторов в ряде случаев приводило к десятикратному ухудшению качества ДНК-библиотек, а в отдельных случаях являлось причиной невозможности получения специфичного ДНК-зонда.

Оценка эффективности предложенной версии метода получения специфичных ДНК-зондов.

Для оценки эффективности предложенной версии метода были проведены эксперименты по получению хромосомоспецифичной ДНК-библисггеки из различного числа копий диссектированных хромосом и последующей in situ гибридизации этих ДНК-библиотек на метафазные хромосомы человека. При анализе в агарозном геле материал ДНК-библиотеки, полученной из одной копии метафазной хромосомы, представлял собой набор амплифицированных фрагментов ДНК размером от 200 до 900 пар оснований, формирующих гомогенное облако (рис. 1). ДНК-зонды, созданные на базе таких ДНК-библиотек, полученных из одной копии хромосомы, давали при FISH надежный и специфичный сигнал на соответствующей хромосоме человека (рис. 2а).

Получение хромосоме- ирайонспецифических ДНК-библиотек Оптимизированный протокол метода микродиссекции и DOP-PCR был использован для получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек всех 22 аутосом и половых хромосом человека (рис. 26). В лаборатории молекулярной цитогенетики урологической клиники Иенского университета они были использованы для 24-цветной FISH.

Созданы полные комплекты ДНК-библиотек для многоцветного бэн-динга (МСВ) хромосомы 3 и хромосомы 18. Данные комплекты представляют собой перекрывающиеся районспецифические ДНК-библиотеки (10-дяя хромосомы 3 и 4-для хромосомы 18) с заданным профилем интенсивности сигнала по длине хромосомы (рис.3). Одновременная in situ гибридизация ДНК-зондов, полученных в результате мечения ДНК-библиотек различными флуо-рохромами, позволяет при использовании оборудования и программного обеспечения фирмы MetaSystems GmbH идентифицировать на данных хромосомах от 15 (хромосома18) до 25 районов. МСВ с использованием данных зондов получен доктором К.Юнкер (лаборатория молекулярной цитогенетики Урологической клиники Йенского Университета). Планируется их дальнейшее

использование в совместных исследованиях по анализу хромосомных перестроек в интерфазных ядрах карцином почки.

Часть районспецифичных ДНК-библиотек была получена методом мик-родиссекции с последующей амплификацией собранного материала, либо с помощью DOP-PCR с Sequenase Ver. 2.0 ДНК полимеразой. Следует заметить, что использование Sequenase Ver. 2.0 ДНК полимеразы в низкотемпературных циклах позволяет получать ДНК-зонды, пригодные для МСВ из меньшего числа копий (15). Тогда как, при использовании в низкотемпературных циклах Ampli Taq DNA Polymerase, Stoffel Fragment требуется около 20 копий.

Анализ врожденных хромосомных патологий Эффективность предложенной версии метода получения ДНК-библиотек была опробована при анализе врождённых хромосомных патологий.

Несбалансированные транслокации хромосом В результате цитогенетического анализа хромосом пациента, проведённого в Новосибирском областном диагностическом Центре, его кариотип был описан как mos 46,XY,der(3)t(3;?)(3p25;?)[69]/46,XY[31].

Методом микродиссекции с последующим DOP-PCR был получен ДНК-зонд аномальной хромосомы. Полученный der(3) ДНК-зонд был использован для in situ гибридизации на метафазные хромосомы пациента и здорового донора. На хромосомах пациента сигнал был выявлен на всей хромосоме der(3), а также на нормальной хромосоме 3, за исключением терминальной части бэнда 3pter->p25, и в районе q24.3—>qter хромосомы 10 (рис.4а).

На хромосомах здорового индивида сигнал был выявлен на хромосомах 3, за исключением части бэнда р25, и в районе q24.3—>qter хромосомы 10 (рис.4б). Полученные результаты были подтверждены гибридизацией на хромосомы пациента ДНК-зондов 3-ей и 10-й хромосом. В результате проведенного молекулярно-цитогенетического анализа кариотип пациента был описан как mos 46,XY,der(3)t(3;10)(3p25;q24.3)[69]/46,XY[31].

Выявленный мозаицизм и отсутствие каких-либо хромосомных патологий у родителей носителя "Зр+" позволяют с уверенностью говорить о возникновении данной хромосомной перестройки de novo. Приведённый случай является первым примером частичной трисомии lOq и частичной моносомии Зр, возникшими de novo. Наблюдаемая клиническая картина пациента соответствовала признакам, наблюдаемым при частичной трисомии lOq и частичной моносомии Зр районов.

Результаты детального клинического и цитогенетического анализа, проведенные в данной работе, имеют важное значение для определения роли дисбаланса хромосомных районов короткого плеча хромосомы 3, длинного плеча

хромосомы 10 и их комбинации в развитии нарушений онтогенеза.

1 2 3 4 Рис. 1. Электрофорез продукта ООР-РСЯ одной копии хромосомы 3 человека.

1-0,25 мкг маркёра молекулярного веса

2- негативный контроль ПОР-РСЯ

■ З-ООР-РСИ одной копии хромосомы 3 чело....... . века.

4-ВОР-РСЯ 15 копий хромосомы 3 человека.

1И4п.о.

147п.о.

tss

§1 I

% & " я

■%,. Ш

л »

Рис. 2. FISH хромосо-моспецифичных ДНК библиотек на метафаз-ные хромосомы человека.

а)HSA3 специфичная ДНК-библиотека,

б) HSA8 специфичная ДНК-библиотека

Рис. 3. FISH районспецифичных ДНК-библиотек хромосомы 18 и профили интенсивностей их сигнала подлине хромосомы.

а) ДНК-библиотека «18-1», б) ДНК-библиотека «18-2»,в) ДНК-библиотека «18-3», г) ДНК-библиотека «18-4»

Рис. 4. FISH "Зр+ специфичной ДНК-библиотеки" на метафазные хромосомы (фрагменты метафазных пластинок)

а) пациента; б) здорового донора. ■=> -указывают на сигнал "Зр+" специфичной ДНК-библиотеки на хромосоме Зр+ и хромосоме 10. -»-указывают на часть района р25 хромосомы 3, не-выявляемого

"Зр+специфичной ДНК-библиотекой".

FISH

Днссек'иня маркерной хромосомы

FISH

-'S!

Рис. 5. Микродис-секция маркерной хромосомы ¡(18)(р10) (Пояснения в тексте)

Рис. 6. FISH пэйнтинг проб маркерных хромосом 1 (а) и 2 (б) на хромосомы здорового индивида.

. V к»

20->*>s-

«МГЦ

/• ' I

¡м\

а - локализация сигнала в 2я12—11.2—к}14^24.2—^ег;18р11.2—К]21 2(^13.2—^ег районах.

б - локализация сигнала в 1 я 11 —1.1; 5я15; 8р23—12; 20р1ег—>р11.2

При выявлении в будущем подобных хромосомных аномалий они могут быть использованы для составления клинического прогноза.

Сбалансированные транслокации хромосом В результате цитогенетического анализа кариотип пациента Новосибирского областного диагностического Центра был описан как 46,Х У,с1с1(5)(?). Из

одной копии аномальной хромосомы была получена ДНК-библиотека, которая после мечения была использована для in situ гибридизации на хромосомы пациента и здорового индивида. На хромосомах пациента сигнал был выявлен на всей аномальной хромосоме, в районе pter—>q31.1 нормальной хромосомы 5 и в районе qll.2—»qter хромосомы 20. При FISH на хромосомы здорового донора сигнал был выявлен в районах 5pter-»q31.1 и 20ql 1,2->qter.

Данные результаты позволяют описать аномальную хромосому, как der(5)t(5;20)(q3I.l;qll.2) и указывают на наличие в кариотипе пациента хромосомы der(20)t(5;20)(q31.1;qll.2). Для подтверждения данного заключения на хромосомы пациента была проведена одновременная FISH ДНК-зондов, специфичных хромосомам 5 и 20, которые были мечены biotin-16-dUTP и digoxigenin-11-dUTP, соответственно. Они однозначно показали, что кариотип пациента представляет собой 46,XY,t(5;20)(q31.1;ql 1.2).

Анализ малых сверхчисленных хромосом

Анализ сверхчисленных маркерных хромосом неизвестного происхождения у пациентов Новосибирского муниципального Центра планирования семьи и репродукции и Новосибирского областного диагностического Центра проводили путем создания ДНК-библиотек маркерных хромосом и последующей in situ гибридизацией на хромосомы пациентов и здоровых доноров.

В результате проведенных исследований был определен состав маркерных хромосом и кариотипы пациентов описаны как mos

46,X,+der(X)(pl 1. l(ql 1)[74]/45,Х[26], mos

47,XY,+der(4)(pl l(ql 1)[76]/46,XY[24], 47,XX,+i(18)(pI0).

В последнем случае маркерная хромосома представляла собой маленький метацентрик. Для подтверждения, что оба его плеча являются I Spter—>р 10, было создано две ДНК библиотеки, специфичные ее разным плечам. Так как не представлялось возможным различить плечи маркерной хромосомы, одна ДНК библиотека была получена из одного плеча, а вторая из оставшейся части той же хромосомы, представляющей собой второе плечо. Обе ДНК библиотеки при гибридизации на хромосомы здорового донора выявили район pter—>р 10 хромосомы 18. Таким образом, проведенное исследование позволило сделать однозначный вывод, что маркерная хромосома представляет собой ¡(18)(р10), а кариотип пациентки представляет собой 47,XX,+i(18)(plO). Проведенное нами исследование представляет собой первый в мировой практике случай определения состава маркерной хромосомы ее последовательной микродиссекцией (рис. 5).

Анализ делеций хромосомных районов.

Кариотип пациента Новосибирского муниципального Центра планирования семьи и репродукции был описан как mos 46,X,+del(Y)(?)/45,X[15]. В результате получения del(Y) специфичного ДНК-зонда и in situ гибридизации

на хромосомы пациента и здорового донора аномальная хромосома была описана как del(Y)(pl 1.2р10), а кариотип пациента - как mos

46,X,+del(Y)(pl 1.2р10)/45,Х[15].

Хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки при проверке результатов рутинного цитогенетического анализа

Анализ сложных хромосомных перестроек методами дифференциального окрашивания нередко приводит к ошибочной идентификации хромосомных районов. При хромосомном анализе в случаях гематологических заболеваний эти методы позволяют правильно описать только около трети хромосомных перестроек, в солидных опухолях их процент падает до 15. В настоящем исследовании мы использовали полученные нами ДНК-зонды для контроля точности идентификации хромосом и хромосомных районов, проведенной с использованием методов GTG-дифференциального окрашивания хромосом.

In situ гибридизацией с хромосомоспецифичными ДНК-зондами проведен анализ хромосом пациентов Новосибирского муниципального Центра планирования семьи и репродукции и Новосибирского областного диагностического Центра, кариотипы которых первоначально были описаны как mos

47,ХХ,+18[15]/45,Х[14]/46,ХХ,[4] и mos 45,X[95]/46X,+der(X)[5]. Если в первом случае диагноз был подтвержден, то во втором было показано, что предполагаемая «der(X)» хромосома не содержит материала X хромосомы. Для определения ее происхождения необходимо проведение дальнейших исследований.

Анализ хромосомных аномалий в малигнизированных клетках Сравнительный анализ метода микродиссекции метафазных хромосом,

MCBuSKY

Эффективность использования разработанной нами модификации метода получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек аномальных хромосом и последующей обратной in situ гибридизации была оценена нами в исследованиях, посвященных анализу двух маркерных хромосом, присутствующих в клетках больного острой миелоидной лейкемией.

В результате цитогенетического анализа пациента Новосибирской медицинской Академии, проведенного к.б.н. Саблиной О.В., в части клеток пациента были выявлены хромосомные перестройки, затрагивающие хромосомы 1 и 2. Эти перестройки привели к формированию двух маркерных хромосом (marl и mar2). Для идентификации материала маркерных хромосом были созданы их ДНК-библиотеки. FISH меченой ДНК этих библиотек на хромосомы пациента и здорового донора позволила установить, что в состав marl входят пять хромосомных районов: 2ql2->q37.2, 5ql 1.2—>qI4, 8q24.2-»qter; 18pl 1.2—>q21; 20ql3.2->qter, a mar2 состоит из lqll->qter, 5ql 1.1, 5ql5,

8р23—И)12 и 20pter—>р 11.2 (рис.6).

Для сравнения разрешающей способности предложенной нами версии метода с возможностями спектрального кариотипирования (SKY) и многоцветного бэндинга (МСВ) хромосомы данного пациента нашими коллегами из Швеции и Германии были проведены дополнительные исследования. SKY кроме исследованных нами маркерных хромосом выявило в клетках пациента еще ряд хромосомных перестроек: del(2), t(6;3), t(5;18), t(9;17;15), t(10;3), del(17), t(18;20;l). Следует отметить, что согласно результатам SKY marl состоит из материала хромосом 16, 18, 2, 20, a mar2 - из материала хромосом 20, 8, 1. Результаты анализа организации mar2, полученные нами и при SKY, отличались тем, что нами были определены конкретные хромосомные районы, входящие в состав mar2, без информации о их размещении в нём, a SKY предоставило информацию о хромосомной принадлежности материала разных районов mar2. Нами было показано, что таг2, кроме материала хромосом 1, 8 и 20, содержит районы 5ql 1.1 и 5ql5, в то время как материал хромосомы 5 не был детектирован в mar2 при использовании SKY. Причиной этого являются, по-видимому, небольшие размеры районов хромосомы 5, вовлечённых в перестройку. Результаты, полученные нами в CISS гибридизации, подтверждаются данными МСВ для таг2. В экспериментах, выполненных нашими коллегами из Института генетики человека Йенского университета ФРГ, очень слабый сигнал на mar2 был получен при гибридизации с ДНК-библиотекой перекрывающей области 5ql 1.1 и 5ql5. Полученные ими результаты МСВ позволили определить порядок и ориентацию хромосомных районов, за исключением районов 5ql 1.1 и 5ql5, входящих в состав mar2. В результате mar2 был описан как:

der(8)t(20;8;5;5;l)(20pter(pl 1.2::8p23(ql 1.2::5qll.l::5ql5::lqll(qter) или der(8)t(20;8;5;5;l) (20pter(pl 1.2::8p23(ql 1.2::5ql5::5ql l.l::lql l(qter)

Больше противоречий было обнаружено при сравнении данных по организации marl, полученных нами в результате CISS гибридизации хромосомо специфичной ДНК-библиотеки и SKY. По нашим данным marl содержит следующие районы хромосом: 2ql2-»q37.2; 5ql 1.2—»ql4; 8q24.2-»qter; 18pl 1.2—>q21; 20ql3.2->qter, в то время как результаты SKY свидетельствуют о наличие в составе marl материала хромосом 2, 16, 18 и 20. Разрешить это противоречие позволили результаты МСВ, полученные Анитой Хеллер (Институт генетики человека Йенского университета, ФРГ). Они полностью согласуются с нашими данными и позволяют определить порядок и ориентацию всех хромосомных районов в составе marl:

der(18)t(8;18;5;2;20)(8qter->q24.2::18pll.2->q21.2::5qll.2->q21.2::2q37.2->ql2: :20ql3.2—>qter). Как свидетельствуют наши результаты и данные МСВ, SKY привело к ошибочной идентификации материала хромосомы 8, как материала

хромосомы 16, кроме того, детекции избежал достаточно крупный район 5ql 1.2—к}21.2. Причиной этого может быть неблагоприятные комбинации ме-ченья соседствующих хромосомных районов: 8qter—»q24.2 и 18pl 1.2—>q21.2, а так же района 5qll.2->q21.2 и 18pl 1.2-»q21.2, или 2q37.2->ql2.

Следует отметить закономерность, выявленную при сравнении наших результатов и результатов МСВ: размер районов, определяемых с помощью МСВ, всегда незначительно превосходил размеры, определяемые обратной гибридизацией хромосомоспецифических ДНК-библиотек. Так как для in situ гибридизации характерно некоторое распространение сигнала на прилежащие районы, мы полагаем, что определение точек разрывов с помощью МСВ, вероятно, приводит к незначительному (до полубэнда) сдвигу точки разрыва за пределы анализируемого района.

Рассмотренный нами случай анализа хромосомных перестроек при острой миелоидной лейкемии на сегодняшний день представляет собой первый пример комплексного исследования хромосомных аномалий, выполненного с использованием этих методов молекулярной цитогенетики. Он интересен не только как детальное описание реорганизации хромосом при канцерогенезе, но является также наглядной демонстрацией разрешающей способности каждого из трёх использованных методов хромосомного анализа: SKY, МСВ и микродиссекции метафазных хромосом последующей обратной FISH. Сравнение этих методов показало, что наряду с впечатляющими достоинствами, связанными с возможностями одновременного анализа всех хромосом человека, спектральное кариотипирование продемонстрировало значительно меньшую чувствительность при детекции небольших по размеру районов хромосом. Более того, было выявлено два случая ошибочного определения происхождения достаточно крупных хромосомных районов 8qter-»q24.2 и 5qll.2->q21.2. Возможно, данные ошибки идентификации хромосомного материала обусловлены как неудачным вариантом комбинаторного мечения соседствующих районов, так и недостаточным их размером. Максимальная чувствительность в выявлении хромосомных районов и точность в локализации точек разрывов была достигнута при создании хромосомоспецифичных ДНК-библиотек мар-кёрных хромосом и последующей обратной FISH. Если SKY может быть использовано для определения локализации точек разрывов только путем анализа DAPI бэндинга анализируемых хромосом, то МСВ позволяет определять точки разрывов, причём имеет тенденцию к небольшому расширению анализируемого района на маркерной хромосоме. Следует также отметить, что МСВ бэндинг столкнулся с проблемами идентификации очень малых районов, таких как 5ql 1.1 и 5ql 5. Эти районы были выявлены МСВ в marl, но определить их границы точнее, чем 5ql l.l->5ql5 оказалось невозможным. Однако следует отметить, МСВ в отличие от других использованных методов позволяет по-

лучить информацию не только о локализации точек разрывов (микродиссек-ция с последующей обратной CISS гибридизацией) и порядке расположения хромосомных районов в маркерных хромосомах (SKY), но и определить ориентацию этих хромосомных районов. Естественно, что наиболее полная информация может быть получена при комплексном использовании SKY, МСВ и микродиссекции с последующей обратной FISH.

Использование хромосомоспецифичиых ДНК-библиотек для детекции ожидаемых транслокаций хромосом

Согласно литературным данным для острого миелоидного лейкоза типа М2 характерна транслокация, затрагивающая хромосомы 8 и 21. В целях выявления такой транслокации у трех пациентов с острым миелоидным лейкозом была проведена FISH HSA8 хромосомоспецифичной ДНК-библиотеки, меченной биотин-16-дУТФ и HSA21 хромосомоспецифичной ДНК-библиотеки, меченной дигоксигенин-11-дУТФ, на метафазные хромосомы пациентов.

Результаты CISS гибридизации позволяли во всех исследованных клетках надежно идентифицировать материал хромосом 8 и 21. Был проведен анализ 100 клеток каждого из пациентов, однако, транслокации хромосом 8 и 21 обнаружено не было. Тем не менее, результаты проведенных FISH продемонстрировали высокий уровень чувствительности и надежности идентификации материала данных хромосом при использовании полученных нами хромосомоспецифичиых ДНК-библиотек. Они позволяют рассчитывать, что использование таких ДНК-библиотек позволит проводить детекцию хромосомных транслокаций не менее эффективно, чем с коммерчески доступными хромосо-моспецифическими ДНК-библиотеками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Получение или приобретение необходимого комплекта ДНК-зондов является серьезной проблемой цитогенетических исследований, проводимых не только в России. Эта проблема, может быть достаточно просто решена, если исследования ограничены относительно небольшим числом анализируемых хромосомных районов. Однако, полным набором ДНК-зондов "на все случаи жизни" не обладает ни одна из известных нам лабораторий мира. Создание необходимых ДНК-зондов методом микродиссекции метафазных хромосом может решить многие из этих проблем либо путём создания ДНК-библиотеки аномальной хромосомы, либо - ДНК-зонда, специфичного соответствующему хромосомному району. При наличии необходимых, материалов и оборудования для создания такой ДНК-библиотеки достаточно одного дня.

В ходе таких исследований создаются ДНК-зонды, которые могут быть использованы при последующей молекулярно цитогенетической диагностике. Главным препятствием широкого внедрения микродиссекции метафазных

хромосом в рутинную цитогенетическую диагностику являлась невысокая воспроизводимость этого метода в большинстве цитогенетических лабораторий. Детальный анализ факторов, влияющих на эффективность создания мик-родиссекционных ДНК-библиотек, позволил нам добиться значительного повышения не только качества, получаемых ДНК-зондов, но и надежности этого метода, выражающейся в высокой воспроизводимости результатов. Это позволило получить ДНК-библиотеки даже при последовательной диссекции районов хромосомы. Такой подход был впервые реализован нами в ходе анализа малой сверхчисленнной хромосомы, описанной в результате проведенных исследований как i(18)(pl0).

Помимо непосредственного использования микродиссекции метафаз-ных хромосом для анализа хромосомных перестроек, с его помощью могут быть получены хромосомо- и райоцспецифичные ДНК-библиотеки, на базе которых возможно создание ДНК-зондов, пригодных как для традиционной FISH, так и для различных вариантов многоцветной FISH.

Микродиссекция метафазных хромосом опробована нами также в ходе анализа хромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Сравнение полученных нами результатов с данными МСВ и SKY показали преимущество метода микродиссекции метафазных хромосом в определении границ хромосомных районов, входящих в состав сложноперестроенных хромосом, а также в детекции входящих в их состав небольших хромосомных районов.

Результаты FISH полученных нами хромосомоспецифических ДНК-библиотек указывают на возможность создания специальных комплектов ДНК-зондов для детекции хромосомных перестроек, имеющих диагностическое и прогностическое значение, при различных типах неоплазий, таких как: t(15;17), t(8;21) и inv(16) при острых миелоидных лейкемиях, Ph хромосомы и разнообразных перестройках при острых лимфобластоидных лейкемиях.

Наш опыт использования микродиссекции метафазных хромосом указывает, на то, что эта технология может быть успешно применена для создания целого комплекса цитогенетических диагностиков и широко использоваться для анализа врожденных хромосомных аномалий и реорганизации генома как при клеточной малигнизации, так и дальнейшей опухолевой прогрессии.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый протокол получения ДНК-библиотек методом микродиссекции метафазных хромосом и последующей DOP-PCR, позволяющий нейтрализовать негативное влияние факторов, которые, в свою очередь, влияют на эффективность амплификации диссектированного материала, а также создавать ДНК-зонды из одного диссектированного фрагмента метафазной

хромосомы и комплекты районспецифичных ДНК-библиотек последовательной диссекцией одной копии метафазной хромосомы.

2. Получен комплект хромосомоспецифичных ДНК-библиотек всех хромосом человека, которые могут быть использованы как для рутинной, так и для для 24-цветной FISH, комплекты районспецифичных ДНК-библиотек для многоцветного бэндинга хромосом 3 и 18 человека. Получены ДНК-зонды для выявления прицентромерных районов хромосом 4 и X, материала короткого плеча хромосомы 18.

3. Показана высокая эффективность предложенной версии микродиссекции метафазных хромосом с последующей DOP-PCR и обратной in situ гибридизацией при анализе таких врожденных хромосомных патологий как сбалансированные и несбалансированные транслокации хромосом, малые сверхчисленн-ные хромосомы, численные аномалии хромосом, а также при анализе сложно-перестроенных хромосом малигнизированных клеток.

4. Предложенная версия микродиссекции метафазных хромосом с последующей DOP-PCR и обратной in situ гибридизацией является более чувствительным, надежным и точным методом описания сложных хромосомных перестроек, чем многоцветный бэндинг и спектральное кариотипирование.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В. Многоцветие современной цитогенетики, или multicolor FISH today. // Вестник ВОГиС. 2000. С.11-15.

2. Rubtsov N, Karamysheva T, Babochkina T, Zhdanova N, Trifonov V, Starke H, Heller A, Junker K, Liehr T, Ciaussen U. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, Multi-color banding (MCB), ZOO-FISH and in clinical diagnostics. Medgen 2000a, V.12, 65.

3. Rubtsov N., Karamisheva Т., Astakhova N., Liehr Т., Ciaussen U., Zhdanova N. Zoo-FISH with region-specific paints for the mink chromosome 5q: deliniation of inter- and intrachromosomal rearrangements in man, pig, fox, and Iberian shrew. // Cytogenet Cell Genet. 2000b.V.90.

4. Trifonov V., Matveeva V.G., Karamisheva T.V., Liehr Т., Ciaussen U., Rubtsov N.B. Molecular cytogenetical characterisation of a derivative human chromosome 3. // Medgen. 2000. V.12. P.93.

Подписано к печати 26.09.2000г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 118.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карамышева, Татьяна Витальевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хромосомные патологии человека.

1.1.1. Врожденные хромосомные аномалии.

1.1.2. Реорганизация хромосом при онкологических заболеваниях.

1.2. Методы цитогенетического анализа.

1.2.1. Развитие цитогенетических методов исследования.

1.2.2. Методы цитологического анализа хромосом.

1.2.3. In situ гибридизация в современной цитогенетике.

1.2.3.1. ДНК-зонды, используемые в in situ гибридизации.

1.2.3.1.1. Клонированные последовательности.

1.2.3.1.2. ДНК-библиотеки индивидуальных хромосом и хромосомных районовЗО

1.2.3.1.3. Системы универсальной амплификации ДНК.

1.2.3.1.4. Микродиссекция, как метод получения хромосомо- и районспецифических ДНК-библиотек.

1.2.3.1.5. Способы мечения и детекции ДНК-зондов.

1.2.3.2. Детекция хромосомных перестроек с помощью in situ гибридизации.

1.2.3.3. Многоцветная in situ гибридизация.

1.2.3.3.1. M-FISH.

1.2.3.3.1.1. 24-цветная FISH.

1.2.3.3.1.2. RXFISH.

1.2.3.3.1.3. Многоцветный бэндинг хромосом (Multi Color Banding МСВ).

1.2.3.3.1.4. Спектральное кариотипирование (spektral karyotyping SKY).

1.2.3.4. Сравнительная геномная гибридизация (Comparative genomic hybridization (CGH)).

1.3. Анализ хромосомных аберраций.

1.3.1. Пренатальная хромосомная диагностика.,.

1.3.2. Анализ врожденных хромосомных патологий.'„.

1.3.3.1. Анализ хромосомных перестроек при онкологических заболеваниях.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Суспензии ФГА стимулированных лейкоцитов периферической крови человека.

2.1.1. Культивирование лейкоцитов периферической крови.

2.1.2. Фиксация митотических клеток.

2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH.

2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для микродиссекции.

2.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом человека из пункции костного мозга.

2.3. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.4. Подготовка микропипеток и игл для микродиссекции.

2.4.1. Микродиссекция метафазных хромосом.

2.5. ПЦР с частично вырожденным праймером.

2.5.1. DOP-PCR с AmpliTaq, Stoffel Fragment ДНК полимеразой.

2.5.2. DOP-PCR с Sequenase Т7 (Version 2.0) ДНК полимеразой.

2.6. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек.

2.7. Получение C0t-2 ДНК из плаценты человека.

2.8. Супрессионная in situ гибридизация.

2.9. Детекция на цитологических препаратах меченого ДНК-зонда.

2.9.1. Детекция на цитологических препаратах биотин-16-дУТФ меченого ДНК-зонда.

2.9.2. Выявление фрагментов ДНК, меченых дигоксигенин-11-дУТФ.

2.9.3. Совместное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб на одном препарате.

2.10. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка новой версии метода получения хромосомо- и районспецифичных ДНК-библиотек микродиссекцией метафазных хромосом и последующей универсальной амплификацией ДНК.

3.1.1. Оптимизация условий универсальной амплификации ДНК.

3.1.1.1. Выбор системы универсальной амплификации и праймеров.

3.1.1.2. Выбор ДНК полимеразы для универсальной амплификации ДНК.

3.1.1.3. Влияние концентрации ионов Mg2+ на эффективность DOP-PCR.

3.1.1.4. Влияние концентрации DOP-праймера на эффективность DOP-PCR.

3.1.1.5. Влияние других компонентов на эффективность амплификации.

3.1.2. Оптимизация условий универсальной амплификации диссекционного материала.

3.1.3. Анализ факторов, влияющих на эффективность амплификации диссектированного материала.

3.1.4. Оценка эффективности микродиссекции хромосом и последующей DOP-PCR для получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек.

3.2. Получение хромосомоспецифичных ДНК-библиотек человека.

3.2.1. Получение районспецифичных ДНК-библиотек для многоцветного бэндинга хромосом (МСВ).

3.3. Анализ врождённых хромосомных патологий.

3.3.1. Анализ хромосомных транслокаций.

3.3.1.1. Несбалансированные транслокации хромосом.

3.3.1.2. Сбалансированные транслокации хромосом.

3.3.2. Анализ малых сверхчисленных хромосом методом получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек аномальных хромосом и обратной in situ гибридизацией.

3.3.3. Анализ делеций хромосомных районов.

3.3.4. Использование хромосомоспецифичных ДНК-библиотек для проверки результатов рутинного хромосомного анализа.

3.4. Анализ хромосомных аномалий в малигнизированных клетках.

3.4.1. Сравнительный анализ метода микродиссекции метафазных хромосом, МСВ и SKY.

3.4.2. Использование хромосомоспецифичных ДНК-библиотек, полученных с помощью новой версии метода микродиссекции метафазных хромосом, для детекции ожидаемых транслокаций хромосом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека"

Актуальность проблемы. Практика анализа хромосомных аномалий человека показала, что методы дифференциального окрашивания хромосом позволяют надежно идентифицировать материал лишь части аномальных хромосом человека. В солидных опухолях доля правильно идентифицированных и описанных хромосомных перестроек не превышает 15%. Материал малых сверхчисленных маркерных хромосом при врожденных патологиях также практически не поддается идентификации методами классической цитогенетики. Решение этих задач оказалось возможным благодаря использованию флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). В связи с этим развитие новых систем получения и эффективного использования разнообразных ДНК-зондов превратилось в одну из самых актуальных проблем современной молекулярной цитогенетики.

В настоящее время имеется огромный набор коммерчески доступных ДНК-зондов, обеспечивающих идентификацию центромерных районов любой из хромосом человека, большого числа хромосомных районов, а также пэйнтинг проб всех хромосом человека и некоторых других видов. Тем не менее, прямое получение ДНК-библиотеки аномальной хромосомы, либо интересующего хромосомного района и сегодня остается наиболее эффективным подходом при проведении хромосомного анализа.

Одним из самых быстрых и дешевых способов получения хромосомо- и районспецифичных ДНК-библиотек в настоящее время является микродиссекция метафазных хромосом с последующей амплификацией их ДНК в полимеразной цепной реакции. В отличие от длительных исследований, необходимых для получения хромосомоспецифичных ДНК-библиотек с помощью монохромосомных гибридных клеточных линий, или дорогостоящего хромосомного сортинга, микродиссекция метафазных хромосом с последующим DOP-PCR позволяет получать такие ДНК-библиотеки в течение суток. Причем ДНК-библиотеки аномальных хромосом могут быть получены даже при их наличии в очень небольшом проценте клеток.

Микродиссекция метафазных хромосом уже более шести лет используется в медицинской диагностике для создания ДНК-библиотек аномальных хромосом. Тем не менее, до настоящего времени остается актуальным разработка надежного метода, обеспечивающего получение ДНК-зонда из одной копии хромосомы или хромосомного района, а также ДНК-библиотек с высокой представительностью, которые могут быть эффективно использованы для многоцветной in situ гибридизации.

До последнего времени основными проблемами получения район- и хромосомоспецифичных библиотек методом микродиссекции оставались его недостаточно высокая воспроизводимость и низкая эффективность амплификации ДНК фиксированных, распластанных на стекле и дифференциально окрашенных хромосом.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было выявление и устранение причин, обуславливающих низкий уровень воспроизводимости при получении ДНК-библиотек методом микродиссекции метафазных хромосом и последующей амплификации ДНК диссектированного материала, а также последующая разработка новой дешевой и надежной модификации этого метода, свободной от перечисленных выше недостатков. Настоящее исследование предполагало также апробацию данного метода при проведении молекулярно-цитогенетической диагностики врожденных хромосомных патологий и при анализе реорганизации генома в случаях злокачественной трансформации клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии. Для достижения этой цели необходимо было решить ряд задач:

2. Повысить эффективность амплификации диссектированного хромосомного материала путем оптимизации приготовления цитологических препаратов хромосом, используемых для микродиссекции.

3. Повысить эффективность системы ферментативной универсальной амплификации ДНК.

Научная новизна и практическая ценность. В результате проведенных исследований выявлен ряд факторов, влияющих на эффективность создания хромосомо- и районспецифичных ДНК-библиотек путем микродиссекции метафазных хромосом и последующего DOP-PCR, оптимизированы условия DOP-PCR с термофильной полимеразой, используемой для амплификации диссектированного хромосомного материала. Разработан новый протокол получения ДНК-библиотек микродиссекцией метафазных хромосом, характеризующийся высокой эффективностью и воспроизводимостью результатов, позволяющий получать качественные ДНК-зонды из одной копии диссектированного материала.

Практическая значимость предложенного метода была продемонстрирована на примере анализа хромосомных аномалий как врожденных, так и возникших при злокачественной трансформации клеток. Проведенные исследования позволили во j всех случаях с высоким уровнем разрешения идентифицировать материал маркерных хромосом. Для детального анализа одной из маркерных хромосом впервые в мире был получен набор последовательных ДНК-библиотек путем микродиссекции одной копии маркерной хромосомы.

В работе получены: комплект хромосомоспецифичных ДНК-библиотек, обеспечивающий проведение 24-цветной in situ гибридизации, а также комплекты районспецифичных ДНК-библиотек для получения многоцветного бэндинга хромосом 3 и 18 человека.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на следующих конференциях и съездах:

12-й Ежегодный Конгресс Немецкого общества генетики человека, проводимый совместно с Австрийским обществом генетики человека и Швейцарским обществом медицинской генетики ("Jahrestagung, der Deutschen Gesellschaft fuer Humangenetik, gemeinsam mit der Oesterreichischen Gesellschaft fuer Humangenetik und der Schweizerischen Gesellschaft fuer Medizinische Genetic" (Luebeck, 22-25, Maerz, 2000)).

Всемирный Конгресс по клеточной и молекулярной биологии ("World Congress on Cellular and Molecular Biology" (8-13 Oct 2000, Jena, Germany).

Конференция, посвященная 10-летию Новосибирского Областного диагностического центра (Новосибирск, ноябрь, 1999 года).

Семинар общества медицинских генетиков г. Новосибирска (сентябрь, 1999).

Основные материалы опубликованы в 4-х печатных работах в отечественных и зарубежных журналах.

Вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, посвященных разработке новой версии метода получения специфических ДНК-библиотек, получению хромосомо- и районспецифических ДНК-библиотек человека, анализу врождённых хромосомных аномалий и хромосомных перестроек в малигнизированных клетках.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Карамышева, Татьяна Витальевна

выводы

3. Показана высокая эффективность предложенной версии микродиссекции метафазных хромосом с последующей DOP-PCR и обратной in situ гибридизацией при анализе таких врожденных хромосомных патологий как сбалансированные и несбалансированные транслокации хромосом, малые сверхчисленнные хромосомы, численные аномалии хромосом, а также при аналйзе сложноперестроенных хромосом малигнизированных клеток.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие молекулярной цитогенетики в 90-е годы привело к настоящей революции, как в технологии хромосомного анализа, так и в наших представлениях о структурно функциональной организации хромосом. Большинство современных исследований в этой области в настоящее время находятся в почти полной зависимости от наличия необходимых для их проведения ДНК-зондов. Теоретически, при их помощи любая хромосомная патология может быть детально описана. С этой точки зрения основным вопросом является оптимизация организации, методической и приборной базы проводимых исследований. Так можно рассматривать разработку многочисленных вариантов многоцветной in situ гибридизации. 24-цветная FISH в одном эксперименте позволяет определить круг хромосом, детальный анализ которых потребуется в дальнейшем. Набор ДНК-зондов из различных районов этих хромосом позволяет провести описание сначала на уровне цитологически идентифицируемых структур, а затем, при необходимости, уточнить локализацию точек разрывов и воссоединений с точностью до десятков тысяч пар оснований. Несмотря на огромную трудоемкость, этот путь уже пройден в ряде исследований. Микродиссекция метафазных хромосом может значительно облегчить и ускорить проведение таких исследований. Например, создание хромосомоспецифичных ДНК-библиотек позволяет в большинстве случаев выявлять точки хромосомных перестроек с точностью максимальной для цитологического анализа. Такое исследование либо предоставит уже всю необходимую информацию, либо позволит перейти к анализу на уровне физической карты хромосомы.

Получение или приобретение необходимого комплекта ДНК-зондов является серьезной проблемой цитогенетических исследований, проводимых в России. Эта проблема, вероятно, может быть решена, если исследования ограничены относительно небольшим числом анализируемых хромосомных районов. Однако, полным набором ДНК-зондов «на все случаи жизни» не обладает ни одна лаборатория мира. В настоящее время при наличии необходимых финансовых ресурсов приобретение таких зондов требует от двух до четырех недель. К сожалению, иногда и этот относительно небольшой срок оказывается слишком велик. В ряде случаев пренатальной диагностики или хромосомной диагностики при онкологических заболеваниях в распоряжении цитогенетика имеется максимум несколько дней. Создание необходимых ДНК-зондов методом микродиссекции метафазных хромосом может решить многие из этих проблем либо созданием ДНК-библиотеки аномальной хромосомы, либо ДНК-зонда, специфичного соответствующему хромосомному району. При наличии необходимых материалов и оборудования для создания такой ДНК-библиотеки достаточно одного дня.

Технология хромосомного анализа, базирующаяся на создании ДНК-библиотек микродиссекцией метафазных хромосом, в отличие от большинства других методов современной молекулярной цитогенетики не требует для проведения исследований каких-либо предварительно изготовленных ДНК-зондов. Более того, в ходе таких исследований создаются ДНК-зонды, которые могут быть использованы при последующей молекулярно цитогенетической диагностике. Даже в ходе проведения диагностики небольшого числа случаев, рассмотренных в настоящей диссертации, было получено несколько таких зондов: ДНК-зонды, специфичные прицентромерным районам хромосомы 4 и X, короткому плечу хромосомы 18, району р11.2—>р10 хромосомы Y, а также хромосомам 3, 5, 8, 10, 18, 20, 21 и X. Полный комплект ДНК-зондов всех хромосом человека был получен в результате дополнительного цикла работ. Так как для получения удовлетворительного ДНК-зонда, при использовании разработанной нами модификации метода, достаточно сбора одной копии хромосомы, вполне реально получение в течение дня 20-30 хромосомоспецифичных ДНК-библиотек, что многократно превосходит потребности российской медико-генетической службы. К сожалению, данный подход не используется ни в одном из семи Федеральных медико-генетических Центров. Мы полагаем, что его внедрение в практику медико-генетического консультирования позволит не только повысить ее эффективность в полноте описания хромосомных патологий, но также значительно удешевит проведение хромосомной диагностики в результате исчезновения потребности в закупке большей части используемых в настоящее время ДНК-зондов. Несмотря на разрабатываемые подходы по оптимизации использования коммерческих диагностических систем (Назаренко и др., 1998), в хромосомной диагностике для описания маркерной хромосомы в среднем требуется 6-7 ДНК-зондов (Назаренко и др., 1998). Главным препятствием широкого внедрения микродиссекции метафазных хромосом в рутинную цитогенетическую диагностику являлась невысокая воспроизводимость этого метода в большинстве цитогенетических лабораторий. Детальный анализ факторов, влияющих на эффективность создания микродиссекционных ДНК-библиотек, позволил нам добиться значительного повышения не только качества, получаемых ДНК-зондов, но и надежности метода, выражающейся в высокой воспроизводимости результатов. Это позволило получать наборы ДНК-библиотек при последовательной диссекции районов хромосомы. Такой подход был реализован в ходе анализа малой сверхчисленной хромосомы, описанной в результате проведенных исследований как i(18)(pl0).

Помимо непосредственного использования микродиссекции метафазных хромосом для анализа хромосомных перестроек, с его помощью могут быть получены хромосомо- и районспецифичные ДНК-библитотеки, на базе которых возможно создание ДНК-зондов, пригодных как для традиционной CISS гибридизации, так и для различных вариантов многоцветной FISH. В настоящей работе, кроме набора ДНК-зондов для всех хромосом человека, были получены зонды для МСВ хромосом 3 и 18. Мы полагаем, что для дальнейшего использования и описания сверхчисленных хромосом большое значение имеет получение комплектов ДНК-зондов прицентромерных и теломерных районов хромосом. Такие комплекты, состоящие из двух ДНК-зондов с соответствующим профилем сигнала, обеспечат МСВ хромосомных районов, наиболее часто задействованных в хромосомные перестройки.

Микродиссекция метафазных хромосом опробована нами также в ходе анализа хромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Сравнение полученных результатов с данными МСВ и SKY показали её преимущество в определении границ хромосомных районов, входящих в состав

109 сложноперестроенных хромосом, а также в детекции входящих в их состав небольших хромосомных районов.

Результаты СКЭ гибридизации полученных нами хромосомоспецифических ДНК-библиотек указывают на возможность создания специальных комплектов ДНК-зондов для детекции хромосомных перестроек, имеющих диагностическое и прогностическое значение, при различных типах неоплазий, таких как: 1(15; 17), 1(8 ;21) и 1пу(16) при острых миелоидных лейкемиях, РЬ хромосомы и разнообразных перестройках при острых лимфобластоидных лейкемиях.

Наш опыт использования микродиссекции метафазных хромосом указывает, что эта технология может быть успешно применена для создания целого комплекса цитогенетических диагностиков и широко использоваться для анализа врожденных хромосомных аномалий и реорганизации генома как при клеточной малигнизации, так и дальнейшей опухолевой прогрессии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карамышева, Татьяна Витальевна, Новосибирск

1. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьёв И.В., // Восьмая итоговая конференция Геном человека-98. 1998. С.70

2. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. // СПб. Специальная Литература. 1997.С.1-286.

3. Греннер Д. Технология рекомбинантных ДНК. // Биохимия человека. Изд. «Мир». 1993. С.35-52.

4. Дейвис К. Полимеразная цепная реакция. // Анализ генома. Методы. Изд-во «Мир«. 1990.

5. Доклад научной группы ВОЗ. Борьба с наследственными болезнями. // Женева. 1997.С.1-129.

6. Лейси А. Световая микроскопия в биологии. // М. «Мир». 1992.С.1-445.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. // Москва «Мир». 1984. С. 1-479.

8. Пузырёв В.П. Генетика человека и патология. // Томск. 1997. С. 1-299. Ю.Рубцов Н.Б., Алексеенко A.A., Беляева Е.С., Волкова Е.И., Кокоза Е.Б.,

9. Макунин И.В., Мошкин Ю.М., Шестопал С.А., Жимулев И.Ф. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Dr. melanogaster. Генетика 1999, т.35 , № 1, 55-61.

10. Рубцов Н.Б., Протопопов А.И., Матвеева В.Г., Рубцова Н.В., Нестерова Т.Б., Закиян С.М. Быстрое кариотипирование клеток млекопитающих. // Генетика. 1994.Т. 30, с.66-71

11. Самнер А.Т. Дифференциальное окрашивание хромосом. // Световая микроскопия в биологии. Методы. М. 1992. С.395-436.

12. Стикланд Ю.Е. Получение зондов и их мечение. // Молекулярная клиническая диагностика. Методы. 1999. С.329-372.

13. Фёдорова Л.И., Амосова А.В., Шир Е.Р. и др. Локализация на хромосомах человека близко расположенных клонированных генов и анонимных ДНК с помощью высокоразрешающей FISH. // VIII Итоговая конференция «Геном человека 98». 1998. С.32.

14. Фогель Ф. Мотульски А. Генетика человека. // Изд. «Мир» 1989. С.97-103.

15. Херрингтон С., Магки Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. // «Мир». 1999. С. 1-558.

16. Хопман Антон Х.Н., Поддиге Пино и др. Выявление генетических нарушений в опухолевых клетках. // Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М. 1999. С.173-199.

17. Abeliovich D.,Dagan J, Levy A, Steinberg A, Ziotogora J. Isochromosome 18p in a mother and her child. // Am J Med Genet. 1993. Junl. V.46. N.4. P392-393.

18. Arrighi F.E., Hsu Т.Е. Localization of heterochromatin in human chromosomes. // Cytogenetics. 1971. V.10. P.81-86.

19. Baldini A., Rocchi M, Archidiácono N., Miler o.J., Miller DA. Ahuman alpha satellite DNA subset specific for chromosome 12. // Am.J.Hum.Genet. 1990. V.46 P.784-788.

20. Baranov V.S. Peculiarities of organisation and present state of prenatal diagnosis service in Russia. // E.C.A. News Letter. 1999. N.3 P.9-10.

21. Bates G.P, Wainwright B.J, Williamson R, Brown S.D.M. Microdissectionof and microcloning from the short arm of human chromosomes 2. // Mol Cell Biol. 1986. V.6. P.3826-3830.

22. Best RG, Diamond D, Crawford E, Grass FS, Janish C, Lear TL, Soenksen D, Szalay AA, Moore CM. Baboon/human homologies examined by spectral karyotyping (SKY): a visual comparison. // Cytogenet Cell Genet. 1998. V.82. P.83-87.

23. Bishop D.T., Williamson J.A. and Skolnick M.H. A model for restriction fragment length distributions. //Am. J. Hum. Genet. 1983. V.35. P.795-815.

24. Bittman R. Studies of the binding of etidium bromide to transfer ribonucleic acid: Absorption, fluorescence, ultracentrifugation and kinetic investigations. // J.Mol.Biol. 1969. V.46.P.251-268.

25. Blennow E., Telenius H., Larsson C., de Voos D., Bajalica S., Ponder BAJ, Nordenskjold M. Complete characterization of a large marker chromosome by reverse and forward chromosome painting. // Hum Genet 1992. V.90. P.371-374.

26. Bohlander S.K., Rafael Espinosa III, Michelle M., Le Beau, Rowley J.D., Diaz M.O. A method for the rapid sequence-independent amplification of microdissected chromosomal material. //Genomics. 1992. V. 13. P. 1322-1324.

27. Bolzer A. Craig J.M., Cremer T., Speicher M.R. A complete set of repeat-depleted, PCR-amplifiable, human chromosome-specific painting probes. // Cytogenet Cell genet. 1999. V.84. P.233-240.

28. Boue A., Boue J., Gropp A. Cytogenetics of pregnancy wastage. // Adv. Hum. Genet. 1985. V.14. P.l-57.

29. Boveri T, Zur Frage der Entstehung maligner Tumoren. // Verlag von GustavFischer, Jena. 1914.

30. Boyle AL, Lichter P, Ward DC. Rapid analysis of mouse-hamster hybrid cell lines by in situ hybridization. // Genomics. 1990. V.7. N1. P. 127-130.

31. Breen M., Thomas R., Binns M.M. et al., Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human. // Chrom. Res. 1999. V.61. P.145-155.

32. Brooks-Wilson A.R., Goodfellow P.N.,Povey S., Nevanlinna H.A., De-Jong P.J. and Goodfellow P.J. Rapid cloning and characterization of new chromosome 10 DNA markers by Alu element-mediated PCR. // Genomics. 1990. V.7. P.614-620.

33. Bryndorf T, Kirchholf M, Rose H et al. Comparative genomic hybridization in clinical cytogenetics. //Am. J. Hum. Genet. 1995. V.57. P.1211-1220.

34. Buckle V.J., Kearney L. Untwirling dirvish. // Nature Genetics. 1993. V.5. P.4-5.

35. Callen D.F., Freemantle C.J., et al., The isochromosome 18p syndrome: conformation of cytogenetic diagnosis in nine cases by in situ hybridization. // Am. J. Hum. Genet. 1990.V.47. P.493-498.

36. Camargo M, Cervenka J. Pattern of chromosomal replication in synchronized lymphocytes. 1. Evaluation and application of methotrexate block. // Hum. Genet. 1980. V.54.P.47-53.

37. Carter N.P., Ferguson-Smith M.A., Perryman M .T., Telenius h., Pelmear A.PI.,et al. Reverse chromosome painting; a method for rapid analysis of aberrant chromosomes in clinical cytogenesics. // J. Med. Genet. 1992. V.29. P.299-307.

38. Caspersson T, Zech L, Johansson C, Modest EJ. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents. // Chromosoma. 1970. V.30. P.215-227.

39. Caspersson T., Farber S., Foley G.D.,et al., Chemical differentiation along metaphase chromosomes. // Exp. Cell Res. 1968. V. 49. P.219-222.

40. Caspersson T., Lomakka G., Zech L. The 24 fluorescence patterns of human metaphase chromosomes distinguishing characters and variability. // Hereditas. 1971. V.67.P.89-102.

41. Chaudhary R, Raudsepp T, Guan et al. Zoo-FISH with microdissected arm specific paints for HSA2, 5,6,16, and 19 refines known homology with pig and horse chromosomes. // Mammalian Genome. 1998. V.9. P.44-49.

42. Chicago Conference. Standartization in Human Cytogenetics. Birth Defects: Original Article Series. // The Nethional Foundation, New York. 1966. V.2 N.2.

43. Christian A., McNiel E., Robinson J., Drabek R. Et al., A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes // Cytogenet Cell Genet 1998 V.82 P. 172

44. Chudoba I., Plesch A., Loerch T., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosmes. // Cytogenet Cell Genet. 1999a. V.84. P.156-160.

45. Chudoba I., Rubtsov N., Senger G. et al., Improved detection of chromosome 16 rearrangements in acute myeloid leukemias using 16p and 16q specific microdissection DNA libraries. // Oncology reports. 1996. N.3. P.829-832.

46. Chudoba I., Senger G., Plesch A., Claussen U. New developments in clinical cytogenetics. // E.C.AS. News Letter. 1999b. N.3. P.3-6.

47. Claussen U, Mazur A, Rubtsov N. Chromosomes are higly elastic and can be stretched. // Cytogenet Cell Genet. 1994. V.66. P. 120-125.

48. Claussen U., Ludecke H.-J., Spielvogel H. et al. Microdissection of GTG-banded chromosomes and PCR-mediated cloning. // Chromosomes Today. 1993. V.l 1. P. 183189.

49. Comings DE, Avelino E, Okada T, Wyandi HE. The mechanism of C-and G-banding of chromosomes. // Exp Cell Res. 1973. V.77 P.469-493.

50. Comings DE, Kavacs BW, Avelino E, Harris DC. Mechanisms of chromosome banding. V. Quinacrine banding. // Chromosoma. 1975. V.50. P.115-145.

51. Comings DE. Mechanisms of chromosome banding and implications for chromosome structure. Ann. Rev. Genet. 1978. V.12. P.25-46.

52. Cremer M., Heintzmann R., Brero A., et al. Chromosome territories of small and large chromosomes are differently distributed in human lymphocyte nuclei. // Medgen. 2000. N.12. P.95.

53. Cremer T., Lichter P., Borden J., et al. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. // Hum Genet. 1988. V.80. P.235-246.

54. De Brackeleer M, Keushnig M, Lin C. A high resoluion C-banding technique. // Canadian. J. Gene. Cytol. 1986. V.28. P.317-322.

55. Deaven L.L., Van Dilla M.A., Bartholdi M.F., Carrano A.V., Cram L.S. et.al. Costruction of human chromosome-specific DNA libraries from flow-sorted chromosomes // Cold spring Harbor Laboratory. 1986. V.LI. P. 159-167.

56. Denver Conference. A proposed standard system of nomenclature of human mitotic chromosomes. // Lancet i. 1960. P. 1063-1065.

57. DGS. SKYtmvs. M-FISH comparison. // 1998. rev 13-Nov. P. 18-88.

58. Dieffenbach C.W., Dveksler G.S. PCR primer. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory. Press. 1995. P.l-714.

59. Drumheller T., McGillivray BC., Behrner D. Precise localisation of 3p25 breakpoints in four patients with the 3p-syndrome. // J. Med. Genet. 1996. Oct.33. V.10. P.842-847.

60. Eils R., Uhrig S., Saracoglu K., Saetzler K., et al. An optimized, fully automated system for fast and accurate identification of chromosomal rearrangements by multiplex-FISH (M-FISH). // Cytogenet Cell Genet. 1998. V.82. P.160-171.

61. Engelen JJM, Albrechts JCM, Guus JHH, Geraedts JPM. A simple and efficient method for microdissection and microFISH. // J.Med. Genet. 1998. V.35. P.265-268.

62. Ferguson-Smith M.A. Genetic analysis by chromosome sorting and painting: Phylogenetic and diagnostic applications. // Eur.J. Flum. Genet. 1997. V.5. P.253-265.

63. Fisher E.M.C, Cavana J.S, Brown S.D.M, Microdissection and microclonning of the mouse X chromosome. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V.82. P.5846-5849.

64. Ford CE, Hamerton JL. The chromosomes of man. // Nature. 1956. V.178. P. 10201023.

65. Froland A, Holst G, Tersley E. Multiple anomalies associated with an additional small metracentric chromosome. // Cytogenet Cell Genet. 1963. V.2. P.99-106.

66. Gall J. G., Pardue M. L. Molecular hybridisation of radioactive DNA to the DNA of the cytological preparations. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1969. V.64.P.600-604.

67. Ghaddar HM, Pierce S, Reed P, Estey EH. Prognostic value of residual normal metaphases in acute myelogenous leukemia patients presenting with abnormal karyotype. // Leukemia. 1995, V.9. P.779-782.

68. Gillessen-Kaesbach G., Lieh C., Theile U., Florsthemke B. Muscular hypotonia, obesity and mental retardation: Prader-Willi or Angelman syndrome? // Medgen. 1998. V.10. P.98.

69. Goettert E., Klein V., Piontek K., Overmyer K., Zang K.D. and Meese E. Generation of a chromosome -22- specific cDNA library as confirmed by FISH analysis. // Hum.Genet. 1993. V.92 P.623-626.

70. Goetze A., MiBbach D., Beck C., Wieacker P., Stumm M. FISFI on uncultured amniocytes is a highly reliable screening method for aneuploidies. // Medgen. 2000. V.12. P.63.

71. Guan X.-Y., Meitzer P.S., Cao J., Trent J.M. Rapid generation of region-specific genomic clones by chromosome microdissection: isolation of DNA from a region frequently deleted in malignant melanoma. // Genomics. 1992. V. 14.P.680-684.

72. Guan X.-Y., Trent JM,Meitzer P.S. Generation of band-specific painting probes from single microdissected chromosome. // Hum. mol. Genet. 1993. V.2. P.l 117-1121.

73. Hassold T. The origin of human nondisjunction: two hits to trisomy. // MedGen. 2000. N.1.P.40.

74. Heerema N.A., Bray-Ward P., Ward D.C., Henegariu O. Colour-changing karyotyping: an alternative to M-FISH/SKY. // Nature Genetics. 1999. V.23. N.3. P.263-264.

75. Heim S., Mitelman F. Cancer Cytogenetics. 2nd edn. // Wiley-Liss, New York. 1995.

76. Heller A., Starke H., Trivonov V., Rubtsov N. Multicolor banding (MCB) of human chromosomes based on region specific YAC clones and/or microdissection libraries. // Medgen. 2000. V.12. N.l. P. 92.

77. Hliscs R, Muehlig P., Claussen. The nature of G-bands analyzed by chromosome stretching. // Cytogenet Cell Genet. 1997a. V.79. P.162-166.

78. Hliscs R., Muehlig P., Claussen U. The spreading of metaphases is a slow process which leads to a stretching of chromosomes. // Cytogenet Cell Genet. 1997b. V.76. P.167-171.

79. Holmes R, Keating MJ, Cork A, et al. A unique pattern of central nervous system relapse in acute myelomonocytic leukemia associated with inv(16)(pl3q22). // Blood. 1985. V.65. P.1071-1075.

80. Hook EB., Cross P.K. Extra structurally abnormal chromosomes (ESAC) detected at amniocentesis: frequency in approximately 75, 000 prenatal cytogenetic diagnoses and association with maternal and paternal age. // Am.J.Hum.Genet. 1987. V.40. P.83-101.

81. Houseal WT. Dackowski W.R. Landes GM. Klinger K.W. High resolution mapping of overlapping cosmids by FISH. // Cytometry. 1994.V15. P.193-198.

82. Hozier J.C., Scalzi J.M., Clase A.C. et al. Differential destabilization of repetitive sequence hybrids in fluorescence in situ hybridization. // Cytogenet Cell Genet. 1998. V.83. P.60-63.

83. ISCN (1978). An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Birth Defects: Original Article Series. // Cytogenetic Cell Genet. 1978. V.21. P.309-404.

84. ISCN (1981). An International System for Human Cytogenetic Nomenclature.-High Resolution Banding. Birth Defects. // Cytogenet Cell Genet. 1981. V.31. P. 1-23.

85. ISCN (1985). An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Harnden DG, Klinger HP (eds). Birth Defects. Original Article Series. // 1985. V.21. N.l.

86. ISCN (1991). Guidelines for Cancer Cytogenetics, Supplement to An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, F Mitelman (ed), (S Kaeger, Basel 1991).

87. ISCN (1995). An International System for Pluman Cytogenetic Nomenclature. // Cytogenetic and Cell Genetics. 1995 P. 1-111.

88. Jelinek W.R. and Schmid C.W., Repetitive sequences in eukaryotic DNA and thei expression. // Annu. Rev. Biochem. 1982. V.51. P.813-844.

89. John H.A., Birnstiel M., Jones K.W.RNA-DNA hybrids at the cytological level. // Nature (Lond.). 1969. V.223. P.582-587.

90. Kaiser R, Weber J, Grzeschik K.H. et al., Microdissection and cloning of the long arm of human chromosome 7. // Molec. Biol. Rep., 1987. V.12. P.3-6.

91. Kallionemi O-P, Kallioniemi A., Piper J., Isola J., Waldman F.M. et al., Optimizing comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumours. // Genes. Chrom. Cane. 1994. V.10. P.231-243.

92. Kievits T, Devilee P., Wiegant J. et al. Direct nonradioactive in situ hybridization of somatic cell hybrid DNA to human lymphocyte chromosomes. // Cytometry. 1990. V.l 1. P.105-109.

93. Klein G. Multiple phenotypic consequences of the Ig/Myc translocation in B-cell-derived tumors. // Genes Chromosom. Cancer. 1989. V.l. P.3-8.

94. Knight L.A., Yong MTL, Tan M., Ng IS. Del(3)(p25.3) without phenotypic effect. //J.Mol.Genet. 1995. Dec 32. V.12. P.994-995.

95. Knudson A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. // Cancer res. 1985. V.45. P.1437-1443.

96. Knudson A.G. Mutation and cancer: A personal Odyssey. // Adv. Cancer. Res. 1995. V.67. P.l-23.

97. Koller P.C. The Role of Chromosomes in Cancer Biology. // Recent Results in Cancer Research. 1972. Springer Verlag, Berlin. V.38.

98. Kroisel P.M., Ioannou P.A., Jong P.J. PCR probes for chromosome in situ hybridization of large-insert bacterial recombinants. // Cytogenet Cell Genet. 1994. V.65. P.97-100.

99. Kuukasjaervi T., Tanner M., Pennanen S., Karhu R., Visakorpi T, Isola J. Optimizing DOP-PCR for universal amplification of small DNA samples in comparative genomic hybridization. // Genes Chrom Cancer. 1997. V.18. P.94-101.

100. Lampel S., Nessling M, Söder A. et al. Matrix-CGH allows a fully automated analysis of genetic imbalances in B-CLL. // Medgen. 2000. V.12. P.95.

101. Landegent JE, Jansen in de Wal, Baan RA. et al., 2-acetylaminofluorene-modified probes for the indirect hybridocytochemical detection of specific nucleic acid sequences. //Exp. Cell Res. 1984. V.153. P.61-72.

102. Landegent JE., de Jong P.J., Segraves R., Pinkel D. et al. Mapping of yeast artificial chromosomes using fluorescence in situ hybridization. // Am J hum Genet Suppl:A 1988. V. 148.

103. Langer-Safer P.R., Leving M., Ward D.C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytenechromosomes. // Proc. Natn. Acad. Sei. USA 1982 V.79. P.4381-4385.

104. Ledbetter S.A., Nelson D.L., Warren S.T., and Ledbetter D.H., Rapid isolation of DNA probes within specific chromosome regions by interspersed repetitive sequence polymerase chain reaction. // Genomics. 1990a. V.6. P.475-481.

105. Ledbetter SA, Garsia-Heras J, Ledbetter D.H. «PCR-karyotype» of human chromosomes in somatic cell hybrids. // Genomics. 1990b. V.8. P.614-622.

106. Lengauer C., Speicher M.R., Popp S,. Jauch A. Chromosomal bar codes produced by multicolor fluorescence in situ hybridization with multiple YAC clones and whole chromosome painting probes. // Hum Mol Genetics. 1993. V.2. N.5. P.505-512.

107. Levan A. Some current problems of cancer cytogenetics. // Hereditas. 1967. V.57. P.343-355.

108. Lichter P., Boyle L., Cremer T., Ward D. Analysis of genes and chromosomes by nonisotopic in situ hybridization. // GATA. 1991. V.8 N.l. P.24-35.

109. Lichter P., Cremer T., Borden J.,Manuelidis L., Ward D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ supression hybridization using recombinant DNA libraries // Hum Genet. 1988. V.80. P. 224-234.

110. Loh-Chung Yu, John Williams, Boris B.T. Characterization of i( 18p) in prenatal diagnosis by fluorescence in situ hybridization. // Prenatal Diagnosis. 1993. V.13. P.355-361.

111. London Conference on the Normal Human Karyotype. // Cytoqenetics. 1963. V.2. P.264-268.

112. Luedecke H.J., Senger G, Claussen U, Horsthemke B. Construction and characterization of band-specific DNA libraries. // LIum Genet. 1990. V.84.P.512-516.

113. Lucdecke H-J, Senger G, Claussen U, Horsthemke B. . Cloning defined regions of the human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amploifacation. //Nature. 1989. V.338.P.348-350.

114. Macville M., Schroeck E., Padilla-Nash h., et al. Comprehensive and definitive molecular cytogenetic characterization of HeLa cells by spectral karyotiping. // Cancer Res. 1999. V.59. P.141-150.

115. Maniatis T, Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edn). // Cold Spring Harbor Press. 1989.

116. Manuelidis L. Chromosomal location of complex and simple repeated human DNAs. // Chromosoma. 1978. V.66.P.23-32.

117. Marlton P., Claxton DF, Liu P., et al. Molecular characterization of 16p deletions associated with inversion 16 defines the critical fusion for leukemogenesis. // Blood. 1995a. V.85. P.772-779.

118. Marlton P., Keating M, Kantarjian H. et al. Cytogenetic and clinical correlates in AML patients with abnormalities of chromosome 16. // Leukemia. 1995b. V.9 P.965-971.

119. McDermid H.E.,Dunean AMV, Higgins M.J., et al. Isolation and characterization of an a-satellite repeated sequence from human chromosome 22. //Chromosoma. 1986. V.94.P.228-234.

120. McKay RDG. The mechanism of G and C banding in mammalian metaphase chromosome. // Chromosoma. 1973. V.44. P.1-14.

121. McNeil JA. Jonson C.V. Carter K.C. Localizing DNA and RNA within nuclei and chromosomes by fluorescence in situ hybridization. // GATA. 1991. V.8.N.2.P.41-58.

122. Melcher R., Steinlein C. et.al. Spectral karyotyping of the human colon cancer ccll lines SW480 and SW620. // Cytogenet Cell Genet. 2000. V.88. P.145-152.

123. Meltzcr P.S., Guan X.-Y., Burgess A, Trent J.M. Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application. // Nature Genet., 1992. V.l P.24-28.

124. Mewar R., Harrison W.,Overhauser J. Conformation of isochromosome 18p using whole chromosome arm-specific fluorescence in situ hybridization. // Cytogenet Cell Genet. 1993. V.64.P.1-4.

125. Miller OJ. Miller DA, Warburton D. Application of new staining techniques to the study of human chromosomes, in Steinberg AG, Beam A (eds). // Progress in Medical Genetics. Philadelphia, W.B. Saunders. // 1973. V.9. P. 1-47.

126. Mitelman F. Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. // New York, Willey-Liss. 1991.

127. Mitelman F., Mertens F, Johansson B. A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrngements in human neoplasia. // Nature genetics special issue. 1997. P.415-474.

128. Mueller S, O'Brien PC, Ferguson-Smith MA., Wienberg J. Cross-species colour segmentating: a novel tool in human karyotipe analysis. // Cytometry. 1998. V.33. P.445-452.

129. Mueller S, Rocchi M, Ferguson-Smith M., Wienberg J. Toward a multicolor chromosome bar code for the entire human karyotype by fluorescence in situ hybridization. // Hum Genet. 1997. V.100. P.271-278.

130. Mueller S., Stanyon R., Finelli P., Archdiacono N., Wienberg J. Molecular cytogenetic dissection of human chromosomes 3 and 21 evolution. // PNAS. 2000. V.97. P.206-211.

131. Mueller-Navia J, Nebel A, Schleiermacher E. Complete and precise characterization of marker chromosomes by amplification of microdissection in prenatal diagnosis. // Hum Genet. 1995. V.96. P.661-667.

132. Mutirangura A., Jayakumar A., Sutcliffe JS. et al., A complete YAC contig of Prader-Willi/Angelman chromosome region (15qll-ql3) and refined localization of the SNRPN gene. //Genomics. 1993. V.18. P.546-552.

133. Nederlof PM, Robinson D., Abukhesha R., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 1989. V.10. P.20-27.

134. Nothen M.M., Eggermann T., Erdman J. Retrospective study of the parental origin of the extra chromosome in trisomy 18 (Edwards syndrome). // Hum.Genet. 1993. V.92. P.347-349.

135. Nowell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocitic leukemia. // Science. 1960. V.132. P. 1497.

136. O'Brien S.J., Menotti-Raymond M., Murphy W.J., Nash W.G, et al. The promise of comparative genomics in mammals. // Science. 1999. V.286. P.458-481.

137. Ostroverkhova N.V., Nazarenko S.A., Rubtsov N.B. Characterization of a small supernumary ring marker derived from chromosome 2 by forward and reverse chromosome painting. // Am. J. Med. Genetics. 1999. V.87. P.217-220.

138. Paris Conference (1971); Supplement (1975); Standartization in Human Cytogenetics. Birth Defects: Original Article Series, // 1975. Cytogenet Cell Genet V.15. P.201-238.

139. Paris Conference: Standartization in Human Cytogenetics. Birth Defects; Original Article Series. // Cytogenetics. 1972. V. 11. P.313-362.

140. Parra I., Windle B. High resolution visual mapping of streched DNA by fluorescent hybridization. //Nature genetics. 1993. V.5. P. 17-21.

141. Patau K., The identification of individual chromosomes, especially in man. // Am. J. hum Genet 1960. V.12 P.250-276.

142. Philipps ME., Latif F., Prowse A. et al., Molecular genetic anlysis of the 3p" syndrome. //Hum. Mol. Genet. 1994. Jun.3 (6). P.903-908.

143. Pinkel D, Landegent J, Collins C. et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V.85. P.9138-9142.

144. Pinkel D, Straume T, Gray JW. Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivity fluorescence hybridization. // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V.83. P.2934-2938.

145. Piper J., Rutovitz D., Sudar D., Kallioniemi A., Kallioniemi O-P. Computer image analysis of comparative genomic hybridization. // Cytometry. 1995. Y.19. P. 10-26.

146. Potter A.M., Watmore A. Cytogenetics in myeloid leukaemia. // in «Human Cytogenetics: a practical approach.» 1992. V.l 1. P.27-67.

147. Raap A.K., Dirks RW., Jiwa NM, et al. In situ hybridization with hapten-modified DNA probes, in Racz P, Haase AT, Glickman JC. // Modern Pathology of AIDS and Other Retroviral Infections. Basel, S.Karger, 1990b.

148. Raap AK., Nederlof PM., Dirks RW., et al. Use of haptenised nucleic acid probes in FISH, in Harris N, Williams DG. // In Situ Hybridization: Application to Developmantal Biology and Medicine. Cambridge, England, Cambridge University Press. 1990c.

149. Rabbitts TH. Chromosomal translocations in human cancer. // Nature. 1994, V.372. P.143-149.

150. Ramser J., Hildman T., Riesselman L. et al. The complete clone map and gene catalogue of human chromosome 21 open new avenues for molecular medicine- and Down Syndrome research. // MedGen. 2000. N,1, P.91.

151. Rohme D, Fox H, Hermann B, Frischauf A.M, Edstrom J.E, Mains P, Silver L.M, Lehrach H, Molecular clones of the mouse t complex derived from microdissected metaphase chromosomes. // Cell. 1984. Y.36. P.783-788.

152. Rowley J.D. The Philadelphia chromosome translocation. A paradigm for understanding leukemia. // Cancer. 1990. V.65. P.2178-2184.

153. Rowley J.D., Aster J.C., Sklar J. The clinical applications of new DNA diagnostic technology on the management of cancer patients. // Jama. 1993. V.270. P.2331-2337.

154. Rubtsov N, Junker K, von Eggeling F, Michel S, Claussen U. Chromosomal origin and distribution of DNA from the homogeneously staining regions in COLO 320-HSR cells. // Medgen. 1995, V.7. P56.

155. Rubtsov N., Sablina O., Ivanova I., Zhdanova N., Graphodatsky A. Chromosome microdissection is a universal tool for studies of mammalian chromosome rearrangements. Medgen. 1998, 10, p. 149.

156. Saiki, R.K.,Scharf, S„ Faloona, F.A., Mullis, K.B., Horn, G.,T„ Erlich, FI.A. and Arnheim, N., Enzymatic amplification of fl-globin sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Science. 1985. V.230. P.1350-1354.

157. Saitoh Y., Laemli U.K. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich Scaffold. // 1994. V.76. P.609-622.

158. Sandberg A.A. The Chromosomes in Human Cancer and Leukemia, 2nd edn. // Elsevier. New York. 1990.

159. Sawistowski H, Pilavakis P: Vapor-Liquid equilibrium with association in both phases. Multicomponent systems containing acetic acid. // J Chem Eng Data. 1982. V.27. P. 64-71.

160. Scalenghe F, Turco E, Edstroem J-E. et al. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Dr. Melanogaster polytene chromosomes. // Chromosoma. 1981. V.82. P.205-216.

161. Schiffer CA, Lee EJ, Tomiyasu T et al. Prognostic impact of cytogenetic abnormalities in patients with de novo acute nonlymphocytic leukemia. // Blood. 1989. V.73. P.263-270.

162. Schinzel A. Catalogue of unbalanced chromosome aberrations in man. // New-York. 1984. P.604-639.

163. Schoenmakers Eric F.P.M., Mols R., Wanschura S., Patrick F.J. Kools et al. Identification, molecular cloning, and characterization of the chromosome 12breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. // Genes,Chromosomes&Cancer. 1994. V.ll.P.106-118.

164. Schowalter D.B., Sommer S.S. Analyt. Biochem. 1989.V.177. P.90.

165. Schroeck E., Manoir S., Veldman T. et al, Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. // Science 1996. V.273. P.494-497.

166. Selleri L. Hermanson GG, Eubanks JH, Evans GA. Chromosomal in situ hybridization using yeast artifishial chromosomes. // Genet. Analyt. Technol. Appl. 1991. V.8.P.59-66.

167. Senger G. Jones T.A. Fidlerova H. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. // Hum Mol Gen 1994. V.3. N.8.P.1275-1280.

168. Senger G. Luedecke H-J. Horsthemke B, Claussen U. Microdissection of banded human chromosomes. // Hum. Genet. 1990. V. 84. P.507-511.

169. Senger G., Chudoba I., Fredrich U. et al. Prenatal diagnosis of a half-cryptic translocation using chromopsome-microdissection. // Prenat.Diagn. 1997. V.17. P.369-374.

170. Singer TS. Kohn G, Yatziv S. Tetrasomy 18p in a child with trisomy 18 phenotype. //Am J med Genet. 1990. Jun. V.36. P.144-147.

171. Solinas-Toldo S., Lengauer C., Fries R. Comparative genome map of human and cattle. // Genomics. V.27. P.489-496.

172. Speicher M.R., Ballard S.G., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. //Nature Genet. 1996. V.12. P.368-375.

173. Stanbridge E.J. Functional evidence for human tumour supressor genes: Chromosome and molecular genetic studies. // Cancer Surv. 1992. V.12.P.5-24.

174. Suijkerbuijk R.F., Olde Weghuis DEM, van den Berg M, et al. Comparative genomic hybridization as a tool to define two distinct chromosome 12-derived amplification units in well-differentiated liposarcomas. // Genes Chrom Cancer. 1994. V.9. P.292-295.

175. Sumner A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. // Exp Cell Res. 1972. V.75. P.304-306.

176. Takahashi E., Hori T, O'Conell P., Leppert M. White R: R-banding and nonisotopic in situ hybridization: pricize localization of the human type II colagen (COL2A1). // Hum.Genet. 1990.V.86.P.14-16.

177. Takeda K., OkamuraT., Hasegawa T. Sibs with tetrasomy 18p born to a mother with trisomy 18p. // J. Med. Genet. 1989. Mar. V.26. N.3. P. 195-197.

178. Telenius H, Pelmear AHP, Tunnacliffe A. et al. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplification flow sorted chromosomes. // Genes Chrom Cancer. 1992b. V.4. P.257-263.

179. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by single degenerate primer. // Genomics. 1992a. V.13. P.718-725.

180. Thompson MW, Mclnnes RR, Willard HF.Philadelphia. // Genetics in Medicine. 1991.

181. Thomsen P.D., Miller J.R. Pig genome analysis: differential distribution of SINE and LINE sequences is less pronounsed than in the human and mouse genomes. // Mammal. Genome. 1996. V.7. N.l. P.42-46.

182. Thomsen PD., Zhdanova N.S. Reverse painting for identification of pig chromosomes in hybrid cell lines: assignment of the HOXB and the TK1 gene to pig Chromosome 12p. // Mamm.Genome. 1995. V.6. P.670-672.

183. Tjio JH., Levan A The chromosome number of man. // Hereditas 1956.V.42 P. 1-16

184. Trask B., Engh G van den, Pinkel D. et al. FISH to interphase cell nuclei in suspension allows flow cytometric analysis of chromosomes content and microscopic analysis of nuclear organization. // Hum.Genet. 1988. V.78. P.251-259.

185. Trifonov V., Matveeva V.G., Karamisheva T.V., Liehr T., Claussen U., Rubtsov N.B. Molecular cytogenetical characterisation of a derivative human chromosome 3. // Medgen. 2000. V.12.P.93.

186. Van Dilla M.A., Deaven L.L.,et al., Human chromosome-specific DNA libraries: Construction and availability. // Biotechnology. 1986. V.4. P.537-552.

187. Verma Ram S., Arvind Babu. Human chromosomes. Principles and techniques. // New York. 1994. P.72-172.

188. Viersbach R., Schwanitz G., Nothen M.M. Deliniation of marker chromosomes by reverse chromosome painting using only a small number of DOP-PCR amplified microdissected chromosomes. // Hum Genet. 1994. V.93. P. 663-667.

189. Voullaire L., Slater H., Williamson R., Wilton L. Chromosome analysis of blastomers from human embryos by using comparative genomic hybridization. // Hum.Genet. 2000. V.106. P.210-217.

190. Voullaire L., Wilton L., Stater H., Williamson R. Detection of aneuploidy in single cells using comparative genomic hybridization. Prenat. Diagn. 1999. V.19. P.846-851.

191. Weaver DD. Catalogue of prenatally diagnosed conditions. // 2nd ed Baltimore MD. Johns Hopkins University Press. 1992.

192. Weimer J., Kiechle M., Arnold N. FISH-microdissection (FISH-MD) analysis of complex chromosome rearrangements. // Cytogenet Cell Genet. 2000. V.88. P. 114118.

193. Weimer J., Kiechle M., Senger G., Wiedemann U. et al. An easy and reliable procedure of microdissection technique for the analysis of chromosomal breakpoints and marker chromosomes. // Chromosome Research. 1999. V.7. P.355-362.

194. Weinberg R.A. Oncogenes and tumor suppressor genes. // CA Cancer J. Clin. 1994. V.44. P. 160-170.

195. Weisblum B. de haseth PI. Nucleotide specificity of the quinacrine staining reaction for chromosomes. // Chromosomes Today. 1973. V.4 P.35-51.

196. Weith A, Winking H, Brackmann B, Boldyreff B, Trout W. Microclones from a mouse germ line HSR detect amplification and complex rearrahgements of DNA sequences. //EMBO J. 1987. V.6. P.1295-1300.

197. Wesley C.S, Ben, M., Kreitman, M, Hagag, N,et al., Cloning regions of the Drosophila genome by microdissection of polytene chromosome DNA and PCR with non-specific primer. //Nucl. Acids Res. 1990. V.18. P.599-603.

198. Wiegant J, Kalle W, Mullenders L. et al. High-resolution in situ hybridization using DNA halo preparations. // Hum. Mol. Genet. 1992. V.l. P.587-591.

199. Wiegant J. Galjart N.J, Rapp A.K, d'Azzo A. The gene encoding the human 'protective protein' is on chromosome 20. // Genomics. 1991. V.l0. P.345-349.130

200. Winge O. Zytologische untersuchungen uber die natur maligner tumoren. II. Teerkarzinomen bei mausen. // Zeliforsch mikrosk Anat. 1930. V.10. P.683-735.

201. Yang F., O'Brien P.C.M., Milne B.S., Grafodatsky A.S. et al., A complete comparative chromosome map for the dog, red fox, and human and its integration with canine genetic maps. // Genomics. 1999. V.62. P. 189-202.

202. Yerle M., Pinton P., Robic A.,Alfonso A. et al. Construction of a whole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs. // Cytogenet Cell Genet. 1998. V.82. P.182-188.

203. Yokoyama Y, Sakuragawa N. Improved simple generation of GTG-band specific painting probes. // Cytogenetic Cell Genet. 1995. V.71. P.32-36.

204. Yunis JJ. New chromosome techniques in the study of human neoplasia. // Hum Pathol. 1981. V.12. P.540-549.

205. Yunis JJ., Sawyer JR., Ball DW. The characterisation of high resolution G banded chromosomes of man. // Chromosoma. 1978. V.67. P.293-307.

Информация о работе

Карамышева, Татьяна Витальевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2000
ВАК 03.00.15

Диссертация

Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы