Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus

Григорьева, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus"

003494022

На правах рукописи

Григорьева Елена Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРОФОБЛАСТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА МЮЮТШ (АЯУ1СОЬГОАЕ, 1ЮБЕ!ЧТ1А)

Генетика -03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканиеученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

2 5 МАР 2010

003494022

Работа выполнена в лаборатории этшгенетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН. г. Новосибирск-

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Попова Н.К.

Институт цитологии и генетики СО РАН. г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Киселев С.Л.

Институт общей генетики РАН им. Вавилова, г. Москва

Ведущее учреждение: Институт биологии развития РАН. г. Москва

Зашита состоится «gf» о.\*р£ил 2010 г. на}трением заседании Диссертационного совета по зашите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева. 10. Факс: (383) 333-12-78: e-mail: dissov@bionet.nsc.nl.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «-/g» cuajouug 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

\ J V Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Стволовые клетки (СК) представляют собой клетки, способные к интенсивной пролиферации в недифференцированном состоянии, а также к диффсренцировке в зрелые специализированные типы клеток. СК являются экспериментальной моделью in vitro для изучения молекулярных процессов поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки клеток в раннем развитии млекопитающих. Научно-исследовательский интерес многих ученых обращен на проблему получения, характеристики и дальнейшего применения СК различных видов животных и человека. Изучаются возможности широкого применения этих клеток в лечении дегенеративных, в том числе аутоиммунных заболеваний, а также в направленной дифференцировке для образования различных органов и тканей.

Возможность получения из плюрипотентных СК человека большого количества чистых популяций эуплоидных клеток, таких как кардиомиоциты, нейроны, гепатоциты, может обеспечить потенциально безграничный источник клеток для трансплантаций, а также для тестирования лекарственных препаратов. Многие заболевания, такие как болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, цирроз печени, диабет, возникают в результате гибели или дисфункции лишь одного или нескольких типов клеток. При трансплантации в пораженный орган СК, взятых у самого больного, или клеток, полученных при репрограммировании соматических клеток собственно пациента с последующей дифференцировкой в необходимый тип клеток, можно решить важнейшую проблему гистонесовместимости и иммунного отторжения. Поэтому работы но репрограммированию разных типов дифференцированных клеток в шпорипотентные являются революционными как в области фундаментальной науки, так и для клинической и экспериментальной медицины (Maherali et а!., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Okita et al., 2008; Kim et al, 2009). Таким образом, получение и исследование различных гкпов СК позволяет изучать механизмы не только поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки, но и репрограммирования клеток, что поможет лучше понимать эти процессы и позволит управлять ими.

Однако работы по репрограммированию были бы невозможны без предшествующей колоссальной работы многих ученых по изучению СК разного происхождения. Известно, что при культивировании в определенных условиях предымплантационных бластоцист можно получить зри основных типа СК. В зависимости от происхождения их разделяют на эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, которые дают производные всех трех зародышевых листков, образующих собственно эмбрион, трофобластные (ТС) .и экстразмбриональные эндодермальные (XEN) клетки, участвующие в формировании экстраэмбриональных тканей, в том числе и плаценты. Вышеупомянутые тины СК отличаются по способу получения, культивирования, степени дифференцированное™, экспрессии специфичных молекулярных маркеров, вкладу в химерные эмбрионы. Мышь является единегвенным млекопитающим, у которого были получены и детально проанализированы все три типа СК. Надо отметить, что получение видоспецифичных СК является сложным процессом,

зависящим от индивидуальных особенностей эмбриогенеза и требующим разработки оригинальных подходов.

В последнее время много фундаментальных работ посвящено изучению трофобластных стволовых клеток, которые являются производными клеток экстраэмбриональной эктодермы (ЭкЭ). Клетки ЭкЭ играют важную роль в имплантации эмбрионов и дальнейшем развитии эмбриональной части плаценты - первого жизненно важного экстраэмбрионального органа, нарушение формирования или функции которого приводят к гибели эмбрионов. ТС клетки вызывают большой интерес в связи с их применением в качестве модели in vitro для изучения механизмов имплантации и плацентации, а также для исследования сигнальных взаимодействий между эмбриональными и экстраэмбриональными клетками в ранних эмбрионах. Поэтому особенно интересным представляется изучение сигнальных факторов и взаимодействий этого типа у разных видов млекопитающих, выявление общих закономерностей и экстраполяция их, на человека. Ранее было показано, что в экстраэмбриональных тканях мыши и полевки происходит импринтированная инактивация Х-хромосомы отцовского происхождения (Takagi, Sasaki, 1975; Zakian et al., 1991; Mak et a!., 2002), тогда как в эмбриональных тканях инактивация происходит случайным образом. Изучение импринтированной инактивации Х-хромосомы представляет интерес для фундаментальных исследований.

В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН изучают механизмы инактивации Х-хромосом у самок обыкновенных полевок рода Microtus. Интерес к изучению инактивации у обыкновенных полевок вызван феноменом неслучайной инактивации, происходящим у межвидовых гибридов (Zakian et al., 1987). Однако известно, что у мыши и человека в соматических тканях инактивация Х-хромосомы происходит случайным образом. Идеальным инструментом для исследования данного процесса являются плюрипотентиые стволовые клетки, так как инактивация одной из двух родительских Х-хромосом, происходящая при их дифференцировке in vitro, моделирует ситуацию, имеющую место в раннем, эмбриональном развитии самок млекопитающих. Данная работа посвящена получению СК обыкновенных полевок для изучения особенностей инактивации Х-хромосомы у самок этого вида млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было получение и характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения обыкновенных полевок рода Microtus. В конкретные задачи работы входило:

1. Получение стволовых клеток обыкновенных полевок из предымплантационных бластоцист и эмбрионов более поздних стадий развития.

2. Характеристика полученных линий:

■ , фенотипическая характеристика;

■ цитогенетическая характеристика (кариотипирование);

■ оценка степени плюрипотентности (проведение теста на экспрессию эндогенной щелочной фосфатазы, получение эмбриоидных тел, инъекция клеток мышам линии Balb/c-nu и композиционный анализ полученных опухолей);

■ анализ экспрессии специфичных молекулярно-генегических маркеров стволовых клеток, характерных для недифференцированных эмбриональных стволовых клеток (гены Oct4, Nanog, Ssea-1, Еста7), трофобластных стволовых клеток (гены Fgfr2, ErrfJ, Cdx-2. Eomes) и клеток экстраэмбриональной энтодермы (гены Gata4, Gata6, Hnf4, Foxa2, Sall4);

■ исследование статуса Х-хромосом в полученных стволовых клетках самки полевки.

Научная новизна. Впервые получены подобные трофобластным стволовым клеткам мыши линии стволовых клеток обыкновенной полевхи Microtus rossiaemeridionalis. Показано, что, в отличие от трофобластных стволовых клеток мыши, для их выделения и продолжительного культивирования не требуется фактор FGF4. Проведен уникальный сравнительный анализ полученных клеток полевки с трофобластными стволовыми клетками мыши, показавший их сходство по характеру роста, экспрессии молекулярно-генетических маркеров, а также типу дифференцированных производных.

Положения, выносимые на защиту

1. ТС-подобные клетки полевки способны неограниченно пролиферировать в отсутствие фактора роста фибробластов (FGF4) и гепарина, которые являются критичными для получения и поддержания недифференцированного состояния ГС клеток мыши.

2. 'ГС-подобные клетки полевки имеют схожие характеристики с ТС клетками мыши, а именно: морфологию колоний клеток и дифференцированных производных, экспрессию ряда генов, специфичных для экстраэмбриональной эктодермы, импринтированную инактивацию Х-хромосомы отцовского происхождения в клетках самок, образуют опухоли типа гематом.

Практическая значимость. Получение линий трофобластных стволовых клеток позволяет создать новую клеточную систему in vitro для исследования регуляции пролиферации трофобласта и его дифференцировки, изучения генетических механизмов импринтированной инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях. Также трофобластные стволовые клетки могут служить моделью in vitro для изучения процессов образования и функционирования плаценты и помогут в лечении различных патологий беременности, приводящих к аномалиям развития зародыша и спонтанным выкидышам, связанным с нарушением развития плаценты.

Вклад автора. Экспериментальная работа по получению, культивированию, фиксации ТС-подобных клеток, цитогенетический анализ полученных культур, а также тесты по оценке плюрипотентности (гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы, инициация дифференцировки) проводились автором самостоятельно. Анализ экспрессии

генов, специфичных для стволовых клеток в различной степени дифференцированное™, иммунофлуоресцентный анализ, FISH, РНК-ДНК FISH, анализ поздней репликации проводились автором совместно с А.И. Шевченко. ДНК профилирование ядер проводилось автором совместно с Я.Р. Ефремовым.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 117 страницах, содержит 19 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и культивирование стволовых клеток полевки из

предымплантационных бластоцист осуществляли по ранее описанному методу получения и культивирования ЭС клеток мыши (Robertson, 1987). Бластоцисты вымывали на 3,5 день эмбрионального развития из матки полевок M. rossiaemeridionalis, M. arvalis и M. kirgisorum. Кроме того использовали гибридные бластоцисты от скрещиваний этих грех видов. Бластоцисты сажали на митотически инактивированные эмбриональные фибробласты и культивировали в ростовой среде: 40% среды F12 (Invitrogen), 40% среды D-МЕМ (Invitrogen), 20 % FCS (Autogene Bioclear), lx NEAA (Invitrogen), 1 мМ раствор пирувата натрия (Invitrogen), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen), lx нуклеозиды (Sigma), 0,1 мМ ß-меркаптоэтанол (Sigina), LIF полевки 0,1-0,2 мкг/мл (получен группой сотрудников лаборатории). Клонирование кДНК LIF в плазмидном векторе, наращивание биомассы Е. coli, индукцию синтеза LIF, его выделение и очистку проводили, как описано на сайте фирмы New England BioLabs www.neb.com. Разросшиеся ВКМ на 3-6 день культивирования дезагрегировали микрокапиллярами. Отбирали активно растущие компактные прозрачные колонии клеток. На первых этапах колонии клеток пересаживали механически, а после 13 пассажа - с помощью 0,025% раствора трипсина (Sigma).

Гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы в полученных клетках проводили согласно методу, описанному ранее (Pain et al., 1996).

Дифференцировку in vitro стволовых клеток полевки осуществляли при культивировании клеток в отсутствие эмбриональных фибробластов или при получении эмбриоидных тел (ЭТ) суспензионным методом. Для этого суспензию CK полевок высаживали на культуральные чашки Петри без фибробластов на 3 дня. Образовавшиеся колонии сбивали струей среды и переносили в чашки Петри, покрытые 1% агарозой (Sigma). Через 7-21 день ЭТ помещали в чашки Петри без фибробластов, где они распластывались и росли в течение 8-15 дней.

Дифференцмровка CK полевок in vivo. Суспензию клеток (8-9 млн.) инъецировали подкожно в область шеи бестимусным мышам линии Balb/c-nu и изогенной линии полевок M. rossiaemeridionalis. Через 1-3 недели животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и проводили анализ гистологических срезов полученных опухолей.

Иммуногистохимическое выявление поверхностных клеточных антигенов ЕСМА7 и SSEA-1, транскрипционных факторов G AT A4 и GATA6 проводили согласно ранее описанной методике (Baribault, Kemler, 1989).

Для анализа карнотипа полученных стволовых клеток фиксировали их по методу, описанному ранее (Mazurok et al., 1995). После чего проводили окрашивание хромосом (G-окрашивание) с помощью ОТС-Днфферепциально! о метода (Графодатский, Раджабли, 1988). Раскладки хромосом метафазных пластинок полученных линий клеток проводили согласно описанным ранее • (Mazurok et al., 1995).

Выделение РНК проводили с использованием RNAzol В, руководствуясь методикой (Lee et al., 1999). Обработку РНК ДНКазой! проводили согласно рекомендациям (Sambrook et al., 1989). Очистку РНК от ДНКазы! и, разрушившейся ДНК проводили с помощью DNase Inactivation Reagent (Turbo DNA Removal Agent, Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы (ОТ) SuperScriptlII (Invitrogene) и случайных . праймеров Random-Decamer (Ambion), согласно рекомендациям фирм производителей. Для исследования экспрессии генов Xist и Ts ix синтез кДНК проводили с цепь-специфичных праймеров SDx3: 5'-cccagtgctggtgagctaUcc-3' и btdf: 5'-gaaacacctccaccgcactacact-3Y

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Последовательности праймеров и условия реакций, использованные при ПЦР, описаны в статье (Grigor'eva ei al., 2009). Программа для ОТ-ПЦР: денатурация ДНК -5 минуг при 94 °С, далее 35 циклов - 20 секунд при 94 "С, 45 секунд при 52-63 °С, 2 минут ы при 72 °С. "

РНК-ДНК FISH анализ выполняли, руководствуясь методиками (Lawrence et al., 1989; Clerc, Avner 1998). В качестве зондов использовали плазмидный клон, содержащий участок промоторной области, а также участок первого экзона гена Xist полевки M. rossiaemeridionalis (Nesterova et al., 2001 ) и повтор MS4, специфичный для гетерохроматана половых хромосом обыкновенных полевок.

Для анализа асннхронности репликации Х-хромосом, в культуру CK полевок с кариотипом XX за 2 часа до фиксации вводили 5-бромдезоксиурвдин (BrdU) до конечной концентрации в среде 25 мкг/мл. Проводили стандартную гипотоническую обработку и фиксацию культуры. Препараты метафазных хромосом денатурировали в 4N HCl, с последующей детекцией BrdU при помощи анти BrdU-FITC (Abeam).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика CK' эмбрионального происхождения обыкновенной полевки

В результате многочисленных ■ экспериментов по культивированию эмбрионов ранних стадий развития обыкновенных полевок в присутствии гетерологичного цитокина L1F мыши не было получено ни одной линии стволовых клеток. Клетки дифференцировались, останавливалась в росте и погибали. Было предположено, что одной из причин дифференцирован клеток ,

могло быть использование мышиного фактора LIF. В связи с этим был получен функциональный фактор LIF полевки М. rossiaemeridionalis.

При культивировании предымплантационных бластоцист в присутствии цитокина LIF полевки были получены 3 стабильные независимые линии стволовых клеток М. rossiaemeridionalis (Rl, R2 и R3) и 1 линия выделена из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis (TSR-A1). Полученные линии клеток имеют ряд характеристик, свойственных для СК разных видов млекопитающих, а именно интенсивную пролиферацию клеток, стабильный диплоидный кариотип, большое ядерно-цитоплазматическое соотношение. Полученные клетки образуют монослойные эпителиоподобные колонии с четкими границами и плотными межклеточными контактами (рис. 1.А), сходные с ТС клетками мыши.

, Культивирование СК полевки без фибробластов приводило к дифференцировке клеток, тогда как в присутствии 70% кондиционированной фибробластами среды, удалось получить стабильные линии, культивируемые на протяжении, по крайней мере, 35 пассажей. Из этого следует, что фибробласты выделяют ростовые факторы, способные поддерживать СК полевки в недифференцированном состоянии.

Описанные выше характеристики линий полученных клеток, а также способность пролиферироаать более 70 пассажей без фенотипических и морфологических изменений, свидетельствуют об их принадлежности к стволовым клеткам. Далее необходимо было определить к какому типу СК относятся полученные клетки.

2. Анализ активности щелочной фосфатазы в полученных клетках

Экспрессия щелочной фосфатазы является маркером плюрипотентных ЭС клеток мыши, человека и ЭС-подобных клеток многих млекопитающих. Эксперимент по гистохимическому выявлению активности эндогенной щелочной фосфатазы показал, что стабильно пролиферирующие культуры СК полевки не экспрессируют щелочную фосфатазу. Этот факт свидетельствует о том, что полученные СК полевки, по-видимому, не являются эмбриональными стволовыми клетками, а принадлежат к другому типу СК.

3. Дифференцировка полученных линий СК полевки

Спонтанная дифференцировка полученных СК полевки в культуре шла по направлению образования клеток, похожих на производные трофоэктодермы (ТЭ) — гигантских клеток трофобласта (ТГ клеток), что в дальнейшем подтвердилось экспрессией маркера ТГ клеток плацентарного лактогена - Р1-1. Об относительных размерах этих клеток можно судить по рис. 1.Б и рис. 1.В. Аналогичные ТГ клетки образуются при дифференцировке ТС клеток мыши (Tanaka et at, 1998).

Индукция дифференцировки iv vitro показала, что клетки полученных линий образуют "однородные" эмбриоидные тела, тогда как ЭС клетки мыши образуют ЭТ, содержащие все три терминальных слоя. Рост полученных ЭТ происходит без видимого усложнения внутренней структуры. Полученные ЭТ обладают повышенной адгезией, что свойственно для дифференцированных злокачественных (хориокарциномных) клеток трофобласта крысы (линия Rcho-

1) и ТС клеток мыши (Cross et al., 1995; Hughes et al., 2004). Это свойство связано с выполнением предшественниками этих клеток важной функции в эмбриогенезе - имплантации эмбрионов. Полученные результаты говорят о том, что СК полевки, скорее всего, являются ТС клетками.

Одним из важных тестов на плюрипотентность является дифференцировка клеток in vivo, для которой применяется метод инъекции суспензии клеток подкожно бестимусным мышам. Полученные клетки линии R1 были инъецированы 11-и бестимусным мышам линии nude (Balb/c-nu) и 12-и полевкам М. rossiaemeridionalis. В течение 1-2 недель в четырех случаях формировались опухолеподобные кистозные образования (рис. 2.А), имеющие в своей основе заполненную кровью капсулу, сформированную инъецируемыми клетками, что подтверждено ПЦР анализом. Данная способность похожа на ранее описанное свойство хориокарциномных клеток человека (Grummer et al., 1999) и ТС клеток мыши (Kibschull et al., 2004) и говорит в пользу предположения о принадлежности полученных СК полевки к ТС клеткам.

Гистологический анализ стенок капсул показал, что инъецируемые клетки инвазировали ткани реципиента, разрушая кровеносные сосуды, что приводило к формированию заполненных кровью подкожных лакун. На рис. 2.Б показана ранняя фаза инвазии, в процессе которой дифференцированные гигантские клетки (С) окружают кровеносный сосуд (V). Стенки подкожных лакун выстланы дифференцированными гигантскими клетками (рис. 2.В., буква С). Процесс инвазии напоминает образование больших лакун, заполненных кровью, при формировании плаценты у млекопитающих (Зыбина, 1986; Adamson et al., 2002).

4. Кариотипирование полученных СК полевки

Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом показало наличие нормального диплоидного числа аутосом, составляющего 52 аутосомы. Анализ кариотипа выявил наличие единственной Х-хромосомы в линии R1, двух X-хромосом в линии R2, Х- и Y-хромосому в линии R3. В процессе подсчета количества хромосом в индивидуальных пластинках было проанализировано более 50 метафазных пластинок для каждой линии.

Для подтверждения состава половых хромосом в СК М. rossiaemeridionalis был проведен FISH анализ на препаратах метафазных хромосом полученных клеток полевки с повтором MS4 (Elisaphenko et al., 1998), специфичным для блоков гетерохроматина, располагающихся на Х- и Y-хромосомах у обыкновенных полевок рода Microtus (рис. 3). Данный тест подтвердил наличие единственной Х-хромосомы в линии R1 (рис. З.А), двух Х-хромосом в линии R2 (рис. З.Б) и Х- и Y-хромосомы в линии R3 (рис. З.В). Фиксации клеток всех линий проводили на 26-28 пассаже.

Рис. 1. Морфология полученных колоний СК полевки и гигантских клеток, образовавшихся при их спонтанной дифференцировке. А. Плоские монослойные колонии, линия Я2. Увеличение х60. Б. Гигантская клетка с гранулированной цитоплазмой. Увеличение х200. В. Гигантские многоядерные клетки (дифференцированные производные СК полевки), 35 пассаж. Увеличение х60. Фазовый контраст.

А.

Б.

В.

Рис. 2. Внешний вид опухолеподобного кистозного новообразования (А) и гистологические срезы полученной опухоли (Б и В). А. Мышь линии Ва1Ъ/с-пи через 3 недели после инъекции. Б. Срез опухоли через кровеносный сосуд. В. Участок пограничного пласта клеток в кистозном образовании. (А) зона некроза, (V) кровеносный сосуд, (В) пролиферирующие клетки, (С) гигантские клетки, инвазирующие ткани хозяина. Окраска гематоксилин-эозин.

Рис. 3. Флуоресцентная in situ гибридизация гетерохроматин-специфичного повтора MS4 (зеленый и красный сигнал) на метафазные хромосомы полученных клеток полевки М. rossiaemeridionalis. Хромосомы окрашены DAPI. А. Линия клеток Rl, ХО. Б. Линия клеток R2, XX. В. Линия клеток R3, XY.

А. полевка мышь Кол-во пар нуклео- Б.

К1 дШ Б л ЭС ТС ХЕ1Ч сом

+ - + - + - + - + . + - + - тидов ОЛИ ОАТЛ4

ОсЫ - - 631

N{1/1(1% ] - - 156 \ ■ \ • «ОЯ» . *.!

.Чох2 - - - _ _ 392 »

/1-актин - _ _ — - _ _ 523 ОЛР1 ОЛТЛ6

полевка мышь

+ дИ1 Пл Эмбр ЭС ТС XEN сом

РцГг2 - _ _ _ 242 %

САх-2 - — _ 184

Еотея | - - - - - - 316

Егг/1 - - - 543

Р1-1 - _ _ - 383

НапИ - - _ _ - - 4 67

ТрЬр - 214

Нп/4 - - 460

1'пха2 | - 220

Оагаб | _ _ - 788

&аи | - _ _ _ - - - 604

/7-актин | - - - - _ - - _ 523

Рис. 4. Анализ экспрессии генов, специфичных для эмбриональной и экстраэмбриональной эктодермы и экстраэмбриональной энтодермы. А. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов в различных типах клеток и тканей полевки и мыши. Я1 и дШ - полученные ТС-подобные клетки полевки (линия Ш) и их дифференцированные производные. Бл - бластоцисты полевки на 3,5 д.п.о., Пл - плацента полевки на 12,5 д.п.о., Эмбр - эмбрионы полевки на 7,5 д.п.о., сом -соматические клетки мыши. (-) негативный контроль реакции обратной транскрипции. Б. Иммуногистохимическое выявление в линии маркеров экстраэмбриональной энтодермы, генов Сша4 (колонии клеток, увеличение х25) и ймаб (отдельные клетки, увеличение хЮО).

A. R1 flRl R2 aR2 Б.

Пл ХО ХО XX XX ЭФМ

+ -+ -+ -+ - + - + - пн

Рис. 5. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов и Тэгх и анализ асинхронности репликации Х-хромосомы в СК самки полевки М. гои1аетег1сИопаИ5. А. Экспрессия генов .Агуг и Гга в СК полевки. Пл - плацента, Я2 и дШ, дЯ2 -линии ТС-подобных клеток полевки и их дифференцированные производные, ЭФМ - эмбриональные фибробласты мыши. (-) негативный контроль реакции обратной транскрипции. Б. Поздняя репликация в Б фазе одной из Х-хромосом (линия 112, XX). Зеленый сигнал - мышиные моноклональные антитела к ВгсШ. XI - неактивная Х-хромосома, Ха - активная Х-хромосома.

■ fei mL-

red - MS-t W j>

green Xist

M.rossiaemeridionalis M.anuHs XX XV

Fl эмбриональные ткани:

неслучайная инактивация

Х-хромосомы

М. rossiaemeridionalis

Fl экстраэмбриональные ткани:

импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы М. arvalis

Рис. 6. Импринтированная инактивация Х-хромосомы в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях гибридов М. rossiaemeridionalis х М. arvalis. А. Схема импринтированной инактивации. Б. РНК-ДНК FISH анализ паттерна инактивации Х-хромосомы в СК, выделенных из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis. Красный сигнал (Texas Red) гетерохроматин-специфичный повтор MS4, зеленый (FITC) - продукт гена Xist. Увеличение хЮОО. Ядра окрашены DAPI.

5. Молекулярно-генетический анализ профиля экспрессии г енов в полученных клетках полевки

Для определения типа полученных линий СК полевки иммуногистохимическим методом и ОТ-ПЦР был проведен анализ экспрессии некоторых генов, являющихся необходимыми факторами поддержания плюрипотентности ЭС клеток, а также ряда генов, характерных для недифференцированных и дифференцированных ТС и XEN клеток мыши. Поскольку паттерны экспрессии исследуемых генов в трех линиях RI, R2 и R3 были похожи, то результаты ОТ-ПЦР анализа представлены лишь для одной линии R1 (рис. 4).

Исследуемые линии СК полевки не экспрессируют гены, поддерживающие плюрипотентные клетки в недифференцированном состоянии, характерные для ЭС клеток мыши, такие как Oct4, Nanog и маркеры плюрипотентности - поверхностные клеточные антигены SSEA-1, ЕСМА7. В то же время, в них, как и в ЭС и ТС клетках мыши, обнаружен продукт гена Sox2, отсутствующий в соматических клетках. Присутствие в недифференцированных клетках продукта гена Sox2 говорит о стволовых качествах полученных линий клеток (Avilion et al., 2003), так как его экспрессия была обнаружена как в эмбриональных, так и в трофобластных СК мыши. Отсутствие экспрессии генов Oct4 и Nanog в СК полевки подтверждает предположение, что полученные линии клеток не являются плюрипотентными ЭС клетками.

В недифференцированных полученных клетках, аналогично ТС клеткам мыши, на высоком уровне экспрессируются гены, ответственные за развит ие по трофоэктодермальному типу и характерные для ЭкЭ - Cdx-2, Eomes (Nivva et a!., 2005; Strumpf et ai, 2005) и ген Errp, обеспечивающий поддержание недифференцированного состояния и пролиферацию клеток трофобласта (рис. 4) (Luo et al., 1997; Rossant, Cross, 2001). Однако в дифференцированных производных экспрессия этих генов резко уменьшается. Экспрессия маркеров ЭкЭ в недифференцированных СК полевки является наиболее убедительны?/! доказательством их принадлежности к ТС клеткам.

В полученных клетках, как ранее было описано для ТС клеток мыши (Tanaka et al., 1998), был обнаружен транскрипционный фактор ТГ клеток - ген Handl и экспрессия гена Sall4, который детектируется как в ЭС, так и в ТС клетках мыши. Отсутствие в дифференцированных СК гюлевки продукта гена Tpbp, специфичного для спонгиотрофобласта, может являтея особенностью полученных клеток. Тогда как усиливающаяся в процессе дифференцировки полученных клеток экспрессия плацентарного лактогена Р1-1, аналогично ТС клеткам мыши, неопровержимо подтверждает факт их дифференцировки в направлении гигантских клеток трофобласта. Таким образом, экспрессия вышеописанных ТС-специфичных маркеров является одним из наиболее весомых доказательств того, что в процессе данной работы впервые были получении стволовые клетки полевки, относящиеся к ТС клеткам, поэтому далее будем называть их 'ГС-подобными клетками полевки.

Анализ экспрессии маркеров экстраэмбриокалыюй энтодермы и X.EN клеток в ТС-подобных клетках полевки показал небольшое количество продукта генов Gataó, Gata4, Foxa2 и Hnf4 (рис. 4), тогда как продукт гена Hnf4 не был

обнаружен в ТС клетках мыши (Tanaka et al., 1998). Надо заметить, что данные гены экспрессируются на высоком уровне в XEN клетках как мыши (рис. 4, Kunath et al., 2005), так и полевки (Шевченко и др., 2008). Можно сделать заключение, что экспрессия генов, специфичных для XEN клеток, говорит лишь о характерных молекулярно-генетических особенностях полученных ТС-подобных клеток полевки.

В линиях ТС-подобных клеток полевки, в отличие от ТС клеток мыши, не наблюдается экспрессия гена Fgfr2. Продукт гена Fgfr2 - поверхностный рецегггор ростового фактора FGF4, у мыши является необходимым компонентом для запуска сигнального пути, благодаря которому ТС клетки поддерживают недифференцированное состояние и способность к неограниченной пролиферации (Tanaka et al., 1998). Фактор FGF4, связавшись с гепарином, активирует Fgfr2, в связи с чем получение ТС клеток из бластоцист мыши и их культивирование in vitro невозможно без экзогенного FGF4 и гепарина в ростовой среде (Tanaka et al., 1998). Однако полученные в работе результаты свидетельствуют, что для выделения ТС-подобных клеток полевки фактор FGF4 не является обязательным. Более того, несмотря на то, что сигнальный путь FGF4/FGFR2 в них не активирован, они способны пролиферировать и оставаться недифференцированными в процессе культивирования.

6. Альтернативный сигнальный путь

Поддержание недифференцированного состояния и пролиферативного потенциала ТС-подобных клеток полевки, по-видимому, осуществляется за счет активации альтернативного сигнального пути. Полученные данные позволяют предположить, что этот сигнальный путь активируется и реализуется независимо от пути FGF4/FGFR2, и имеет не менее существенную роль. Отсутствие экспрессии гена Fgfr2 в полученных клетках согласуется с данным предположением. Факторы, запускающие и поддерживающие этот путь, продуцируются эмбриональными фибробластами, так как и у мыши (Tanaka et al., 1998), и у полевки (Grigor'eva et al., 2009) присутствие подложки фибробластов или их кондиционной среды является необходимым условием для получения и пролиферации в недифференцированном состоянии ТС клеток. Заметим, что для ТС-подобных клеток полевки не имеет существенной разницы видовая принадлежность фибробластов, так как при использовании эмбриональных фибробластов как мыши, так и полевки или их кондиционной среды ТС-подобные клетки продолжали интенсивно пролиферировать без изменения морфологии. Одним из факторов, выделяемых в культуральную среду фибробластами, может являться фактор NODAL, принадлежащий к суперсемейству TGF(3. Этот фактор запускает альтернативный путь поддержания экспрессии генов Errp, Eomes, Cdx-2 в ЭкЭ клетках у мыши без участия FGF4 (Guzman-Ayala et al., 2004).

Другим потенциальным кандидатом на роль альтернативного участника в FGF-независимом сигнальном пути может являться ген Errp. Ранее было показано, что в плаценте Errp' эмбрионов мыши отсутствует диплоидный трофобласт и клетки хориона трансформируются в ТГ клетки, покрывающие мощным слоем зародыш, что приводит к смерти эмбрионов на 9 д.п.о. (Luo et al.,

1997; Rossant, Cross, 2001). Это свидетельствует о важной роли ERRß сигнального пути в поддержании трофобластных стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Высокий уровень экспрессии гена Errß поддерживает гипотезу о запуске FGF4/FGFR2-He3aBHCHMoro сигнального пути в ТС-подобных клетках полевки.

Надо отметить, что ранее, в отсутствие цитокина LIF полевки, были проделаны многочисленные безрезультатные попытки по получению CK полевки (Мазурок и др., 2003), тогда как при первом же его добавлении в культуральную среду из всех посаженных бластоцист появились первичные колонии CK. Однако стабильные линии способны продолжительное ' время пролиферировать без дифференцировки при культивировании на фибробластах или при добавлении кондиционной среды в отсутствие LIF. Таким образом, это свидетельствует о роли LIF полевки лишь в запуске сигнального пути поддержания недифференцированного состояния на начальных этапах получения ТС-подобных клеток полевки.

7. Инактивация Х-хромосомы в полученных CK полевки

Полученные клетки представляют интерес для изучения инактивации X-хромосомы в экстраэмбриональных клетках обыкновенных полевок рода Microtus и сравнения данного процесса с инактивацией Х-хромосомы у мыши. Известно, что в линиях самочьих ТС : клеток мыши происходит имприитированная инактивация отцовской Х-хромосомы (Мак et al., 2002).

ОТ-ПЦР и РНК FISH анализ на ТС-подобных клетках самки полевки (линия R2), демонстрируют стабильную экспрессию гена Xist, отвечающего за инициацию инактивации Х-хромосомы (Penny et al., 1996), что говорит о неактивном статусе одной из Х-хромосом. В недифференцированных клетках этой линии, также как и в плаценте полевок, на фоне экспрессии гена Xist была обнаружена и РНК гена Ts ix, препятствующая синтезу стабильного Xist, тогда как при дифференцировке клеток экспрессия гена Tsix прекращается (рис. 5.А). Однако для ТС клеток мыши показано отсутствие продукта гена Tsix даже и недифференцированном состоянии, что говорит о законченном процессе инактивации Х-хромосомы, поскольку продукт гена Tsix выявляется лишь на начальных этапах, препятствующих инактивации Х-хромосомы, и не требуется е дальнейшем для поддержания активного состояния этой хромосомы (Мак et al., 2002). Таким образом, у полевки в недифференцированных клетках процесс инактивации еще не закончен, тогда как дифференцировка приводит к его завершению, что свидетельствует о различиях в механизме инактивации между ТС клетками мыши и полевки.

Для того чтобы подтвердить неактивный статус Х-хромосомы в линии клеток R2 был также проанализирован паттерн репликации Х-хромосом. Ранее было описано, что обычно неактивная Х-хромосома позднее реплицируется в S фазе, чем активная Х-хромосома и аутосомы (Gartier, Riggs, 1983; Schmidt, Migeon, 1990; Heard et al., 1997). В недифференцированных ТС-подобных клетках M. rossiaemeridionalis одна Х-хромосома полностью поздно реплицируется в S фазе клеточного цикла, что доказывает ее неактивный статус, тогда как у второй Х-хромосомы только гетерохроматиновая часть

реплицируется поздно, а эухроматиновая - рано, то есть эта Х-хромосома является активной (рис. 5.Б). Таким образом, было доказано, что в ТС-подобных клетках самок полевок одна из Х-хромосом находится в неактивном состоянии.

В эксперименте на ТС-подобных клетках полевки, выделенных из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis (линия TSR-AI), было показано какая инактивация происходит, случайная или импринтированная. В данной линии клеток материнская Х-хромосома унаследована от М. rossiaemeridionalis, а отцовская произошла от М. arvalis. В этом эксперименте было использовано различие морфологии Х-хромосом между двумя этими видами полевок (рис. 6), а именно - Х-хромосома М. rossiaemeridionalis в дистальной части имеет большой блок гетерохроматина (Mazurok et al., 1995), с наличием в его составе повтора MS4 (Elisaphenko et al., 1998). При проведении РНК-ДНК FISH анализа с зондами на РНК гена Xist и повтор MS4 использование гибридизационного зонда, специфично связывающегося с повтором MS4, позволяет недвусмысленно установить, с какой Х-хромосомы транскрибируется ген Xist, отцовской (М. arvalis) или материнской (М. rossiaemeridionalis). На рис. 6 показан результат данного анализа. Зеленый сигнал определяет локализацию РНК гена Xist, а красный - гетерохроматин-специфичный повтор MS4, который был использован как маркер материнской Х-хромосомы М. rossiaemeridionalis. Если бы сигнал гибридизации гена Xist был солокализован с сигналом повтора MS4, то это бы означало преимущественную инактивацию Х-хромосомы М. rossiaemeridionalis. Этот факт говорил бы о происхождении полученных клеток из ВКМ, поскольку ранее было показано, что при скрещивании М. rossiaemeridionalis с М. arvalis в эмбриональных тканях гибридных самок наблюдается преимущественная инактивация Х-хромосомы

М. rossiaemeridionalis (Zakian et al., 1987; 1991). Однако РНК-ДНК FISH анализ показал разобщенную локализацию повтора MS4 и гена Xist, что свидетельствует о преимущественной инактивации отцовской Х-хромосмы М. arvalis (рис. 6). Таким образом, в ТС-подобных клетках полевки, как и в ТС клетках мыши, экстраэмбриональных клетках мыши и полевки, была доказана импринтированая инактивация отцовской Х-хромосомы (Takagi, Sasaki, 1975; Zakian et al., 1991; Make/ al., 2002).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена получению клеточной системы in vitro для изучения процесса инактивации Х-хромосомы у самок обыкновенных полевок М. rossiaemeridionalis. Возможные типы клеток, которые предполагалось получить, были плюрипотентные ЭС и ЭГ клетки полевки.

В данной работе впервые были получены три интенсивно пролиферирующие линии ТС-подобных клеток полевки М. rossiaemeridionalis Rl, R2 и R3 с нормальным набором аутосом и половыми хромосомами ХО, XX и XY, соответственно, а также пиния клеток TSR-AI (XX) из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis. Данные линии клеток растут монослойными колониями эпителиальной морфологии на протяжении продолжительного времени, не меняя фенотипические характеристики. Клетки в

колониях имеют плотные межклеточные контакты и большое ядерно-цитоплазматическое соотношение, что характерно для многих CK.

При спонтанной дифференцировке и при дифференцировке в змбриоидных телах полученные клетки образуют производные ТЭ - ТГ клетки. Инъекция CK полевки бестимусным мышам линии Balb/c-nu и полевкам М. rossiaemeridionalis приводит к формированию опухолеподобных кистозных новообразований, аналогичных опухолям, сформированным ТС клетками мыши и хориокарциномными клетками человека.

Результат получения ТС-подобных клеток обыкновенной полевки является чрезвычайно интересным, вследствие того, что они были выделены в отсутствие экзогенного фактора FGF4 и гепарина. Однако известно, что для получения и поддержания ТС клеток мыши в недифференцированном состоянии FGF4 и гепарин являются критичными, гак как запускают FGF4./FGFR2 сигнальный путь. Было сделано предположение о запуске альтернативного сигнального пути поддержания ТС-подобных клеток полевки в недифференцированном состоянии в результате активации ERRß сигнального пути, либо благодаря участию члена суперсемейства TGFß - фактора NODAL. ■

В полученных ТС-подобных клетках не обнаружены продукты ЭС-снецифичных генов, таких как Oci4, Nanog, Sseal, Ее та? и щелочной фосфатазы, что объясняется их происхождением из клеток ЭкЭ. Однако в полученных клетках полевки были найдены транскрипты генов, характерных для недифференцированных (Cdx-2, Eomes, Errß) и дифференцированных (Pl-l, Handl) ТС клеток мыши, а также гены, характерные как для эпибласта, так и для ЭкЭ-Sox2, Sall4.

Полученные в представленной работе ТС-подобные клетки полевки представляют интерес с точки зрения изучения начавшихся событий инактивации Х-хромосомы, а также с позиции сравнения данных процессов у полевки и мыши. Было показано, что в гибридной линии ТС-подобных клеток полевки (линия TSR-AI), так же как и в ТС клетках мыши и экстраэмбриональных клетках мыши и полевки, наблюдается импринтировэнная инактивация отцовской Х-хромосомы. Одной из особенностей данных недифференцированных ТС-подобных клеток самок полевок является экспрессия гена Ts ix на фоне экспрессии гена Xist, в отличие or ТС клеток мыши, в которых РНК гена Ts ix отсутствует. Такое различие в экспрессии гена Ts ix между ТС клетками мыши и полевки говорит о различии в механизме установления инактивации Х-хромосомы.

Таким образом, в данной работе впервые были получены и охарактеризованы ТС-подобные клетки обыкновенной полевки, которые являются моделью для изучения механизмов инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях полевок и могут служить инструментом in vitro для иследования имплантации и плацентации.

выводы

1. Впервые получены три линии ТС-подобных клеток обыкновенной полевки М. rossiaemeridionalis Rl, R2 и R3 и одна линия ТС-подобкых клеток (TSR-AI), выделенная из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis. Клетки гибридной линии (TSR-AI) и линии R2 имеют половые хромосомы XX, а линий R1 и R3 - ХО и ХУ, соответственно. Полученные линии ТС-подобкых клеток полевки имеют диплоидный набор аутосом.

2. Показано, что для получения линий ТС-подобных клеток полевки не требуется присутствие в среде фактора роста фибробластов (FGF 4), который является необходимым для получения и пролиферации ТС клеток мыши.

3. Обнаружено что, спонтанная дифференцировка полученных клеток в культуре, а также индуцированная дифференцировка в эмбриоидных телах приводит к образованию производных трофоэктодермы - гигантских клеток трофобласта.

4. Показано, что подкожная инъекция бестимусным мышам линии Balb/c-nu и полевкам М. rossiaemeridionalis ТС-подобных клеток полевки приводит к формированию опухолепободных кистозных образований, представляющих собой капсулы, сформированные из ТС-подобных клеток, заполненные кровью.

5. В полученных линиях ТС-подобных клеток полевок обнаружена экспрессия генов, свойственных для недифференцированных (Cdx-2, Errß, Eomes) и дифференцированных (Pl-1, Handl) ТС клеток мыши. Экспрессия маркеров плюрипотентности, специфичных для ЭС клеток мыши (Oct4, Nanog, SSEA1, ЕСМА7, щелочная фосфатаза), в полученных клетках отсутствует.

6. В недифференцированных ТС-подобных клетках полевки, в отличие от ТС клеток мыши, обнаружена экспрессия генов Xist и Ts ix, тогда как при дифференцировке ген Ts ix выключается, что говорит об особенностях инактивации Х-хромосомы в клетках полевки.

7. В гибридных ТС-подобных клетках полевки выявлена импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы, которая характерна для экстраэмбриональных клеток грызунов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Мазурок Н.А., Рубцова Н.В., Григорьева Б.В.. Матвеева Н.М., Железова А.И., Шилов А.Г., Слободянюк С.Я., Закиян С.М. Получение ЭС-подобных линий обыкновенных полевок рода Мкго1т из бластоцист, терминальных клеток и от слияния соматических клеток с эмбриональными стволовыми клетками мыши // Онтогенез, 2003, Т. 34, С. 193-203.

2 Павлова М.Е., Григорьева Е.В.. Слободянюк С.Я., Закиян С.М. Альтернативный сплайсинг транскрипта гена у обыкновенных

полевок (Microtus arvicolidae) II Молекулярная биология. 2004ч Т. 38. №6.

' С. 1017-1019.

3 Grigor'eva E.V.. Shevchenko АЛ., Mazurok N.A., Elisaphenko Е.А.. Zhelezova A.I., Shilov A.G., Dyban P.A., Dyban A.P.. Noniashvili E.M.. Slobodyanyuk S.Ya., Nestereva T.B., Brockdorff N„ Zakian S.M. FGF4 independent derivation of trophoblast stem cells from the common vole // PLoS One. 2009. V. 4. Issue 9. e7161.

4 Григорьева E.B.. Ситникова H.A., Мазурок H.A., Дыбан П.А., Закиян С.М. Морфологическая характеристика тератом, развивающихся из гибридов, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с соматическими клетками полевок // Материалы международного симпозиума "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия''. Санкт-Петербург. 25-27 октября 2004 г., "Цитология'", Т. 46, С. 909.

5 Шилов А.Г., Шевченко А.И.. Григорьева Е.В.. Мазурок H.A.. Железова А.И.. Слободянюк С.Я.. Дыбан П.А.. Закиян С.М. Трофоблаетические стволовые клетки как новая биологическая модель для исследования in vitro клеточных и молекулярных механизмов имплантации и начальных этапов плацентацни // Материалы VI Международной конференции •'Молекулярная генетика соматических клеток". Москва. Звенигород. 2005 г.. С. 106.

6 Mazurok N.A., Grigoreva E.V.. Shevchenko A.I.. Dyban P.A., Dyban A.P.. Zakian S.M. X chromosome inactivation in trophoblast stem cells of common vole M.rossiaemeridionalis (Arvicolidae, Rodentia) И Тезисы второй международной конференции по Х-инактивации, Париж. Франция, 17-22 сентября 2006 г., С. 83.

7 Григорьева Е.В., Шевченко А.И.. Мазурок H.A. Получение трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus в отсутствие фактора FGF4 // Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, 10-12 мая 2007 г., Сборник материалов, С. 61.

8 Григорьева Е.В., Шевченко А.И., Мазурок H.A., Закиян С.М. Характеристика трофобластных стволовых клеток полевок рода Microtus // Пятый Съезд ВОГиС, Москва, 21-28 июня 2009 г., Ч. 2, С. 371.

9 Григорьева Е.В., Шевченко А.И., Мазурок H.A., Закиян С.М. Трофобластные стволовые клетки обыкновенной полевки рода Microtus -модель для изучения импринтированной инактивации Х-хромосомы // Материалы международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009 г., С. 93-94.

10 Васькова Е.А., Шевченко А.И., Павлова C.B., Дементьева Е.В., Григорьева Е.В.. Закиян С.М. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы у обыкновенных полевок //' Материалы международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009 г., С. 94.

Подписано к печати 26.02.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 13.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорьева, Елена Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ.б

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Стволовые клетки и их типы.

1.1.1. Эмбриональные карциномные клетки. Тератомы, тератокарциномы.

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.2.1. Механизмы сохранения плюрипотентности и гены, участвующие в поддержании плюрипотентного статуса линий ЭС клеток.

1.1.2.2. Маркеры, характерные для шнорипотентных клеток.

1.1.3. Эмбриональные терминальные клетки.

1.1.4. Трофобластные стволовые клетки.

1.1.4.1. Постимплантационное развитие эмбрионов, дифференцировка трофобластных клеток in vivo и формирование плаценты.

1.1.4.2. Получение и дифференцировка ТС клеток.

1.1.4.3. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, характерные для ТС клеток мыши и их производных.

1.1.5. Стволовые клетки экстраэмбриональной энтодермы.

1.2. Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих.

Итоги обзора литературы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Растворы, буферы.

2.3. Среды для получения и культивирования клеточных линий.

2.3.1. Ростовая среда для получения и культивирования первичных эмбриональных фибробластов.

2.3.2. Ростовая среда для культивирования ЭС клеток мыши.

2.3.3. Ростовая среда для получения и культивирования СК полевки эмбрионального происхождения.

2.3.4. Приготовление кондиционной среды для культивирования СК полевки без эмбриональных фибробластов.

2.3.5. Ростовая среда для культивирования ТС клеток мыши.

2.3.6. Среда для культивирования эмбриоидных тел.

2.4. Получение культур клеток.

2.4.1. Получение первичных эмбриональных фибробластов.

2.4.2. Получение стволовых клеток полевки из предымплантационных бластоцист.

2.4.3. Получение ЭГ клеток полевки из эмбрионов на стадии 7,5-8,5 д.п.о.

2.5. Культивирование клеток.

2.5.1. Культивирование первичных эмбриональных фибробластов.

2.5.2. Культивирование и селекция СК полевки.

2.5.3. Культивирование ЭС клеток мыши.

2.5.4. Культивирование ТС клеток мыши.

2.6. Замораживание клеток в жидком азоте.

2.7. Размораживание клеток.

2.8. Субклонирование.

2.9 Тесты по оценке плюрипотентности линий полученных клеток.

2.9.1. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы.

2.9.2. Спонтанная дифференцировка in vitro стволовых клеток полевок.

2.9.3. Дифференцировка СК полевок in vivo.

2.9.4. Иммуногистохимическое выявление поверхностных клеточных антигенов ЕСМА7 и SSEA-1, транскрипционных факторов GATA4 и GATA6.

2.10. Анализ кариотипа стволовых клеток.

2.10.1. Фиксация клеток в суспензии.

2.10.2. Фиксация культуры клеток в чашке Петри.

2.10.3. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-окрашивание).

2.10.4. Анализ плоидности линий СК полевок при помощи ДНК профилирования ядер клеток.

2.11. Выделение РНК.

2.11.1. Общие требования.

2.11.2. Выделение РНК с помощью RNAzol В.

2.11.3. Обработка РНК ДНКазой1.

2.12. Синтез кДНК методом обратной транскрипции.

2.13. Полимеразная цепная реакция.

2.14. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.15. Флуоресцентная in situ гибридизация.

2.16. РНК-ДНК флуоресцентная in situ гибридизация.

2.17. Выявление позднореплицирующегося хроматина.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Попытки получения СК полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF мыши.

3.2. Получение СК обыкновенной полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF полевки.

3.3. Фенотипическая характеристика полученных клеток полевки.

3.4. Культивирование полученных клеток полевки.

3.5. Дифференцировка полученных линий СК полевки.

3.5.1. Спонтанная дифференцировка полученных клеток in vitro.

3.5.2. Индуцированная дифференцировка полученных культур клеток.

3.6. Анализ активности щелочной фосфатазы в полученных клетках.

3.7. Кариотипирование полученных СК полевки.

3.8. Молекулярно-генетический анализ профиля экспрессии генов в полученных клетках полевки.

3.9. Инактивация Х-хромосомы в полученных СК полевки.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus"

Актуальность работы

Стволовые клетки (СК) представляют собой клетки, способные к интенсивной пролиферации в недифференцированном состоянии, а также к дифференцировке в зрелые специализированные типы клеток. СК являются экспериментальной моделью in vitro для изучения молекулярных процессов поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки клеток в раннем развитии млекопитающих: Научно-исследовательский интерес многих ученых обращен на проблему получения, характеристики и дальнейшего применения СК различных видов животных и человека. Изучаются возможности широкого применения этих клеток в лечении дегенеративных, в том числе аутоиммунных заболеваний, а также в направленной дифференцировке для образования различных органов и тканей.

Возможность получения из плюрипотентных СК человека большого количества чистых популяций эуплоидных клеток, таких как кардиомиоциты, нейроны, гепатоциты, может обеспечить потенциально безграничный источник клеток для трансплантаций, а также для тестирования лекарственных препаратов. Многие заболевания, такие как болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, цирроз печени, диабет, возникают в результате гибели или дисфункции лишь одного или нескольких типов клеток. При трансплантации в пораженный орган СК, взятых у самого больного, или клеток, полученных при репрограммировании соматических клеток собственно пациента с последующей дифференцировкой в необходимый тип клеток, можно решить важнейшую проблему гистонесовместимости и иммунного отторжения. Поэтому работы по репрограммированию разных типов дифференцированных клеток в плюрипотентные являются революционными как в области фундаментальной науки, так и для клинической и экспериментальной медицины (Maherali et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Okita et al., 2008; Kim et al., 2009). Таким образом, получение и исследование различных типов СК позволяет изучать механизмы не только поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки, но и репрограммирования клеток, что поможет лучше понимать эти процессы и позволит управлять ими.

Однако работы по репрограммированию были бы невозможны без предшествующей колоссальной работы многих ученых по изучению СК разного происхождения. Известно, что при культивировании в определенных условиях предымплантационных бластоцист можно получить три основных типа СК. В зависимости от происхождения их разделяют на эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, которые дают производные всех трех зародышевых листков, образующих собственно эмбрион, трофобластные (ТС) и экстраэмбриональные энтодермальные (XEN) клетки, участвующие в формировании экстраэмбриональных тканей, в том числе и плаценты. Вышеупомянутые типы СК отличаются по способу получения, культивирования, степени дифференцированности, экспрессии специфичных молекулярных маркеров, вкладу в химерные эмбрионы. Мышь является единственным млекопитающим, у которого были получены и детально проанализированы все три типа СК. Надо отметить, что получение видоспецифичных СК является сложным процессом, зависящим от индивидуальных особенностей эмбриогенеза и требующим разработки оригинальных подходов.

В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН изучают механизмы инактивации Х-хромосом у самок обыкновенных полевок рода Microtus. Интерес к изучению инактивации у обыкновенных полевок вызван феноменом неслучайной инактивации, происходящим при скрещивании межвидовых гибридов (Zakian et al., 1987), тогда как у мыши и человека в соматических тканях инактивация Х-хромосомы происходит случайным образом. Идеальным инструментом для исследования данного процесса являются плюрипотентные стволовые клетки, так как инактивация одной из двух родительских Х-хромосом, происходящая при их дифференцировке in vitro, моделирует ситуацию, имеющую место в раннем эмбриональном развитии самок млекопитающих. Таким образом, данная работа посвящена получению СК обыкновенных полевок для изучения особенностей инактивации Х-хромосомы у самок этого вида млекопитающих.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было получение и характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения обыкновенных полевок рода Microtus.

Для достижения поставленной цели необходимо выполнение следующих задач:

2. Характеристика полученных линий: фенотипическая характеристика; цитогенетическая характеристика (кариотипирование); оценка степени плюрипотентности (проведение теста на экспрессию эндогенной щелочной фосфатазы, получение эмбриоидных тел, инъекция клеток мышам линии Balb/c-nu и композиционный анализ полученных опухолей); анализ экспрессии специфичных молекулярно-генетических маркеров стволовых клеток, характерных для недифференцированных эмбриональных стволовых клеток (гены Oct4, Nanog, SSEA-1, ЕСМА7), трофобластных стволовых клеток (гены Fgfr2, Err ft, Cdx-2, Eomes) и клеток экстраэмбриональной энтодермы (гены Gata4, Gata6, Hnf4, Foxa2, Sall4); исследование статуса Х-хромосом в полученных стволовых клетках самки полевки.

Научная новизна

Впервые получены подобные трофобластным стволовым клеткам мыши линии стволовых клеток обыкновенной полевки Microtus rossiaemeridionalis. Показано, что, в отличие от трофобластных стволовых клеток мыши, для их выделения и продолжительного культивирования не требуется фактор FGF4. Проведен уникальный сравнительный анализ полученных клеток полевки с трофобластными стволовыми клетками мыши, показавший их сходство по характеру роста, экспрессии молекулярно-генетических маркеров, а также типу дифференцированных производных.

Практическая значимость

Получение линий трофобластных стволовых клеток позволяет создать новую клеточную систему in vitro для исследования регуляции пролиферации трофобласта и его дифференцировки,изучения генетических механизмов импринтированной инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях. Также трофобластные стволовые клетки могут служить моделью in vitro для изучения процессов образования и функционирования плаценты и помогут в лечении различных патологий беременности, приводящих к аномалиям развития зародыша и спонтанным выкидышам, связанным с нарушением развития плаценты.

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на:

Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004;

VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток", Звенигород, 2005;

Второй международной конференции по Х-инактивации, Франция, 2006;

Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, 2007;

Международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009; семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации

По материалам диссертационной работы автором опубликованы три научные статьи в отечественной и зарубежной печати. j

Вклад автора

Экспериментальная работа по получению, культивированию, фиксации ТС-подобных клеток, цитогенетический анализ полученных культур, а также тесты по оценке плюрипотентности (гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы, инициация дифференцировки) проводились автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов, специфичных для стволовых клеток в различной степени дифференцированности, иммунофлуоресцентный анализ, флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH), РНК-ДНК FISH, анализ поздней репликации проводились автором совместно с А.И. Шевченко. ДНК профилирование ядер проводилось автором совместно с Я.Р. Ефремовым.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 117 страницах, содержит 19 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Григорьева, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены три линии ТС-подобных клеток обыкновенной полевки М. rossiaemeridionalis Rl, R2 и R3 и одна линия ТС-подобных клеток (TSR-A1), выделенная из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis. Клетки гибридной линии (TSR-A1) и линии R2 имеют половые хромосомы XX, а линий R1 и R3 - ХО и XY, соответственно. Полученные линии ТС-подобных клеток полевки имеют диплоидный набор аутосом.

2. Показано, что для получения линий ТС-подобных клеток полевки не требуется присутствие в среде фактора роста фибробластов (FGF) 4, который является необходимым для получения и пролиферации ТС клеток мыши.

5. В полученных линиях ТС-подобных клеток полевок обнаружена экспрессия генов, свойственных для недифференцированных (Cdx-2, ЕггД Eomes) и дифференцированных (JPl-1, Handl) ТС клеток мыши. Экспрессия маркеров плюрипотентности, специфичных для ЭС клеток мыши (Oct4, Nanog, SSEA1, ЕСМА7, щелочная фосфатаза) в полученных клетках отсутствует.

6. В недифференцированных ТС-подобных клетках полевки, в отличие от ТС клеток мыши, обнаружена экспрессия генов Xist и Tsix, тогда как при дифференцировке ген Tsix выключается, что говорит об особенностях инактивации Х-хромосомы в клетках полевки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получение, изучение свойств и особенностей стволовых клеток, а также их практическое применение является одной из важных задач биологии наступившего столетия. Исследование молекулярно-генетических механизмов взаимодействия стволовых клеток в живом организме поможет регулировать данные процессы и корректировать деструктивные программы, вызывающие разрушение тканей, органов или целого организма. СК являются идеальными моделями in vitro для изучения механизмов различных биологических процессов, протекающих в живом организме. В частности, линии ТС клеток представляют интерес в связи с тем, что дифференцированные производные предшественников ТС клеток в эмбриогенезе млекопитающих участвуют в процессе имплантации и в образовании эпителиальной части плаценты. Таким образом, ТС клетки являются системой in vitro, необходимой для понимания механизмов развития трофобластных линий и взаимодействий с эмбриональными тканями.

Основной идеей представленной работы являлось получение клеточной систехмы in vitro для изучения процесса инактивации Х-хромосомы у самок обыкновенных полевок М. rossiaemeridionalis. Для этого была поставлена задача получить и охарактеризовать самочьи стволовые клетки эмбрионального происхождения, поскольку при их дифференцировке происходит инактивация одной из Х-хромосом, что позволяет изучать in vitro все модификации в процессе инактивации на разных стадиях дифференцировки клеток. Одними из возможных типов клеток, которые предполагалось получить, были плюрипотентные ЭС и ЭГ клетки полевки. В результате многочисленных попыток их получения с использованием фактора LIF мыши, а также после анализа литературных данных, было сделано предположение, что причиной спонтанной дифференцировки плюрипотентных клеток могло быть использование гетерологичного фактора LIF.

После использования функционального фактора LIF полевки при культивировании ранних предымплантационных бластоцист, были впервые получены три интенсивно пролиферирующие линии ТС-подобных клеток полевки М. rossiaemeridionalis Rl, R2 и R3 с нормальным набором аутосом и половыми хромосомами ХО, XX и XY, соответственно. Также была получена одна линия ТСподобных клеток из гибридных бластоцист М. rossiaemeridionalis х М. arvalis с двумя половыми Х-хромосомами. Данные линии клеток растут монослойными колониями эпителиальной морфологии на протяжении продолжительного времени, не меняя фенотипические характеристики. Клетки в колониях интенсивно пролиферируют и имеют большое ядерно-цитоплазматическое соотношение, что характерно для многих стволовых клеток.

При спонтанной дифференцировке и при дифференцировке в эмбриоидных телах полученные клетки образуют производные ТЭ - ТГ клетки. Инъекция СК полевки бестимусным мышам линии Balb/c-nu и полевкам М. rossiaemeridionalis приводит к формированию опухолеподобных кистозных новообразований, аналогичных опухолям, сформированным ТС клетками мыши и хориокарциномными клетками человека. Процесс формирования данных новообразований имитирует формирование эмбриональной части плаценты при имплантации бластоцисты в стенку матки, что подтверждает факт получения в данной работе ТС-подобных клеток полевки.

Данный результат является чрезвычайно интересным, вследствие того, что ТС-подобные клетки были получены без добавления экзогенного фактора FGF4 и гепарина. Однако известно, что для получения и поддержания ТС клеток мыши в недифференцированном состоянии FGF4 и гепарин являются критичными, так как запускают FGF4/FGFR2 сигнальный путь. Было сделано предположение о запуске альтернативного сигнального пути поддержания ТС-подобных клеток полевки в недифференцированном состоянии в результате активации ERRp сигнального пути, либо благодаря участию члена суперсемейства TGFp - фактора NODAL.

В полученных клетках не обнаружены продукты ЭС-специфичных генов, таких, как Oct4, Nanog, SSEA1, ЕСМА7 и щелочной фосфатазы, что объясняется их происхождением из клеток ЭкЭ. Однако в ТС-подобных клетках полевки были найдены транскрипты генов, характерных для недифференцированных {Cdx-2, Eomes, Err/3) и дифференцированных (Pl-1, Hand!) ТС клеток мыши, а также гены, характерные как для эпибласта, так и для ЭкЭ - Sox2, Sall4.

Полученные в представленной работе ТС-подобные клетки имеют интерес с точки зрения изучения начавшихся событий инактивации Х-хромосомы, в том числе и связанных с ней модификаций гистонов, а также с позиции сравнения данных процессов у полевки и мыши. Было показано, что в гибридной линии ТС-подобных клеток полевки (линия TSR-A1), также как и в ТС клетках мыши и экстраэмбриональных клетках мыши и полевки, наблюдается импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы. Одной из особенностей данных недифференцированных ТС-подобных клеток самок полевок является экспрессия гена Tsix на фоне экспрессии гена Xist, в отличие от ТС клеток мыши, в которых РНК гена Tsix отсутствует. Такое различие в экспрессии свидетельствует о том, что у полевки в недифференцированных клетках процесс инактивации не закончен, тогда как дифференцировка приводит к его завершению, что говорит о различии в механизме установления инактивации Х-хромосомы между мышью и полевкой.

Таким образом, в данной работе впервые были получены и охарактеризованы трофобластные стволовые клетки обыкновенной полевки, которые являются моделью для изучения механизмов инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях полевок и могут служить инструментом in vitro для иследования имплантации и плацентации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьева, Елена Викторовна, Новосибирск

1. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих // Атлас. Издательство "Наука". Сибирское отделение. 1988. С. 14.

2. Дыбаи А.П. Раннее развитие млекопитающих // Издательство "Наука". Ленинградское отделение. 1988. 288 с.

3. Зыбина Е.В. Цитология трофобласта // Издательство "Наука". Ленинградское отделение. 1986. 192 с.

4. Павлова М.Е., Григорьева Е.В., Слободянюк С.Я., Закиян С.М. Альтернативный сплайсинг транскрипта гена Xist у обыкновенных полевок (Microtus arvicolidae) // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. № 6. С. 1017-1019.

5. Протокол MRC Clinical Science Center. Faculty of Medicine. Imperial College of Science, Technology and Medicine. Hammersmith Hospital Campus. Du Cane Road. London W12 0NN. UK. http://www.csc.mrc.ac.uk

6. Ромейс Б. Микроскопическая техника // Москва. 1953. С. 71.

7. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В., Голубева Д.В., Закиян С.М. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1-10.

8. Adamson S.L., Lu Y., Whiteley K.J., Holmyard D., Hemberger M., Pfarrer C., Cross J.C. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta // Dev. Biol. 2002. V. 250. P. 358-373.

9. Allen B.L., Filla M.S., Rapraeger A.C. Role of heparin sulfate as a tissue-specific regulator of FGF-4 and FGF receptor recognition // J. Cell Biol. 2001. V. 155. № 5. P. 845858.

10. Andrews P.W., Oosterhuis J., Damjanov I. II in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. Robertson E.J. Oxford. UK: IRL Press. 1987. P. 207248.

11. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 126-140.

12. Avner P., Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation // Genetics. 2001. V. 2. P. 59-67.

13. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

14. Beddington R.S.P., Robertson E.J. An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo II Development. 1989. V. 105. P. 733-737.

15. Bird A.P. Imprints on islands. Recent results with paternally imprinted mouse genes suggest that the imprinting mechanism may involve de novo methylation of CpG islands //

16. Curr. Biol. 1993. V. 3. P. 275-277.

17. Boiani M., Eckardt S., Scholer H.R., McLaughlin J. Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 1209-1219.

18. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient gerivation of embryonic stem cells in the mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 5709-5712.

19. Brown C.J., Ballabio A., Rupert J.L., Lafreniere R.G., Grompe M., Tonlorenzi R., Willard H.F. A gene from the region of the human X inactivation center is expressed exclusively from the inactive X chromosome //Nature. 1991. V. 349. P. 38-44.

20. Carney E.W., Prideaux V., Lye S.J., Rossant J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 34. P. 357-368.

21. Chambers I., Colby. D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.

22. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C„ F. Abel

23. Ponce de Leon, Robl J.M. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells //Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 642-646.

24. Ciruna B.G., Rossant J. Expression of the T-box gene Eomesodermin during early mouse development//Mech. Dev. 1999. V. 81. P. 199-203.

25. Clemson C.M., Chow J.C., Brown C.J., Lawrence J.B. Stabilization and localization of Xist RNA are controlled by separate mechanisms and are not sufficient for X inactivation//J. Cell Biol. 1998. V. 142. P. 13-23.

26. Clerc P., Avner P. Role of the region 3" to Xist exon 6 in the counting process of X-chromosome inactivation//Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 249-253.

27. Damjanov I. Teratocarcinoma stem cells // Cancer Surv. 1990. V. 9. P. 303-319.

28. Damjanov /., Damjanov A., Solter D. И in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. Robertson E.J. Oxford. UK: IRL Press. 1987. P. 1-18.

29. Delhaise F., Bralion V., Schuurbiers N., Dessy F. Establisment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos // Eur. J. Morphol. 1996. V. 34. P. 237-243.

30. Doetschman Т., Williams P., Maeda N. Establishment of hamster blastocyst-derived embryonic stem (ES) cells // Dev. Biol. 1988. V. 127. P. 224-227.

31. Elling U., Klasen C., Eisenberger Т., Anlag K, Treier M. Murine inner cell mass-derived lineages depend on Sall4 function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 44. P. 16319-16324.

32. Erlebacher A., Price K.A., Glimcher L.H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin // Dev. Biol. 2004. V. 275. P. 158-169.

33. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292."P. "154-156.

34. Fujikura J., Yamato E., Yonemura S., Hosoda K, Masui S., Nakao K, Miyazaki Ji., Niwa H. Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 784-789.

35. Gardner R.L., Papaioannou V.E., Barton S.C. Origin of the ectoplacental cone and secondary giant cells in mouse blastocysts reconstituted from isolated trophoblast and inner cell mass // J. Embryol. Exp. Morphol. 1973. V. 30. P. 561-572.

36. Gartler S.M., Riggs A.D. Mammalian X-chromosome inactivation // Annu. Rev. Genet. 1983. V. 17. P. 155-190.

37. Gearing D.P., Thut C.J., Vandenbos Т., Gimpel S.D., Delancy P.B., King J., Price V., Cosman D., Beckmann M.P. Leukemia inhibitory factor receptor is structurally related to the IL-6 signal transducer, gpl30 // EMBO J. 1991. V. 10. P. 2839-2848.

38. Gekas C., Dieterlen-Lievre F., Orkin S.H., Mikkola H.K.A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells // Dev. Cell. 2005. V. 8. P. 365-375.

39. Ginis I., Luo Y., Miura Т., Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J., Rao M.S. Differences between human and mouse embryonic stem cells // Dev. Biol. 2004. V. 269. P. 360-380.

40. Ginsburg M., Snow M.H.L., McLaren A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation // Development. 1990. V. 110. P. 521-528.

41. Graves КН., Moreadith R. W. Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 424-433.

42. Grigor 'eva E. V., Shevchenko A.I., Mazurok N.A., Elisaphenko E.A., Zhelezova A.I.,

43. Shilov A.G., Dyban P.A., Dyban A.P., Noniashvili E.M., Slobodyanyuk S.Ya., Nesterova T.B., Brockdorff N., Zakian S.M. FGF4 independent derivation of trophoblast stem cells from the common vole // PLoS One. 2009. V. 4. Issue 9. e7161.

44. Griimmer R., Donner A., Winterhager E. Characteristic growth of human choriocarcinoma xenografts in nude mice // Placenta. 1999. V. 20. P. 547-553.

45. Guzman-Ayala M., Ben-Haim N., Beck S., Constant D.B. Nodal protein processing and fibroblast growth factor 4 synergize to maintain a trophoblast stem cell inicroenvironment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 15656-15660.

46. Hahnel A., Rappolee D., Millan J., Manes Т., Ziomek С A., Theodosiou N.G., Werb Z., Pedersen RA., Schultz GA. Two alkaline phosphatase genes are expressed during early development in the mouse embryo // Development. 1990. V. 110. P. 555-564.

47. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human // Dev. Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187-198.

48. Hay D.C., Sutherland L., Clark J., Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. P. 225-235.

49. Heard E., Clerc P., Avner P. X-chromosome inactivation in mammals // Annu. Rev. Genet. 1997. V. 31. P. 571-610.

50. Hellman A. and Chess A. Gene body specific methylation on the active X chromosome // Science. 2007. V. 315. P. 1141 -1143.

51. Hemberger M, Hughes M., Cross J.C. Trophoblast stem cells differentiate in vitro into invasive trophoblast giant cells // Dev. Biol. 2004. V. 271. P. 362-371.

52. Hibi M„ Murakami M., Saito M., Hirano Т., Taga Т., Kishimoto T. Molecular cloning and expression of an IL-6 signal transducer, gpl30 // Cell. 1990. V. 63. P. 1149— 1157.

53. Himeno E, Tanaka S, Kunath T. Isolation and manipulation of mouse trophoblast stem cells // Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2008. Chapter 1. Unit 1E.4.

54. Hooper M., Hardy K., Handyside A., Hunter S., Monk M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells // Nature. 1987. V. 326. P. 292-295.

55. Ноге Т.А., Koina Е., Wakefield M.J., Graves J.A.M. The region homologous to the X-chromosome inactivation center has been disrupted in marsupial and monotreme mammals // Chromosome Res. 2007. VI. 15. P. 147-161.

56. Iwatsuki K, Shinozaki M., Sun W., Yagi S., Tanaka S., Shiota К A novel secretory protein produced by rat spongiotrophoblast // Biol. Reprod. 2000. V. 62. № 5. P. 13521359.

57. Jakob H., Boon Т., Gaillard J., Nicolas J., Jacob F. Teratocarcinoma of the mouse: isolation, culture and properties of pluripotential cells // Ann. Microbiol. (Paris). 1973. V. 124. P. 269-282.

58. Kay G.F., Penny G.D., Patel D., Ashworth A., BrockdorjfN., Rastan S. Expression of Xist during mouse development suggests a role in the initiation of X chromosome inactivation// Cell. 1993. V. 72. P. 171-182.

59. Kay G.F., Barton S.C., Surani M.A., Rastan S. Imprinting and X chromosome counting mechanisms determine Xist expression in early development // Cell. 1994. V. 77. P. 639-650.

60. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz В., Pesce M, Gentile L., Bioani M., Lomeli H., Nagy A., McLaughlin K.J., Scholer H.R., Tomilin A. Oct4 is required for primordial germ cell survival // EMBO reports. 2004. V. 5. № 11. P. 1078-1083.

61. Kibschull M., Nassiry M., Dunk C., Gellhaus A., Quinn J.A., Rossant J., Lye S.J.,у

62. Winterhager E. Connexin31-deficient trophoblast stem cells: a model to analyze the role of gap junction communication in mouse placental development // Dev. Biol. 2004. V. 273. P. 63-75.

63. Kim J.B., Sebastiano V., Wu G., Arauzo-Bravo M.J., Sasse P., Gentile L., Ко К, Ruau D., Ehrich M., den Boom D., Meyer J., Hiibner К, Bernemann C., Ortmeier C., Zenke

64. M., Fleischmann В.К., Zaehres Н., Scholer H.R. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells//Cell. 2009. V. 136. P. 411-419.

65. KirchhofN., Carnwath J.W., Lemme E., Anastassiadis K., Scholer H., Niemann H. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species // Biol. Reprod. 2000. V. 63. P. 1698-1705.

66. Kleinsmith L.J., Pierce G.B. Multipotentiality of single embryonal carcinoma cells // Cancer Res. 1964. V. 24. P. 1544-1551.

67. Knofler M., Simmons D.G., Lash G.E., Harris L.K., Armant D.R. Regulation of trophoblast invasion a workshop report // Placenta. 2008. Suppl A. S26-S28.

68. Koutsourakis M., Langeveld A., Patient R., Beddington R., Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development // Development. 1999. V. 126. P. 723-732.

69. Kunath Т., Strumpf D., Rossant J. Early trophoblast determination and stem cell maintenance in the mouse a review // Placenta. 2004. V. 25. Suppl A. S32-S38.

70. Kunath Т., Arnaud D., Uy G.D., Okamoto I., Chureau C., Yamanaka Y., Heard E., Gardner R.L., Avner P., Rossant J. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts // Development. 2005. V. 132. P. 1649-1661.

71. Lawrence J.В., Singer R.H., Marselle L.M. Highly localized tracks of specific transcripts within interphase nuclei visualized by in situ hybridization // Cell. 1989. V. 57. P. 493-502.

72. Lawson K.A., Dunn N.R., Roelen B.A., Zeinstra L.M., Davis A.M., Wright С. V., Korving J.P., Hogan B.L. Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 424-436.

73. Lee J.Т., Jaenisch R. The (epi)genetic control of mammalian X-chromosome inactivation // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 274-280.

74. Lee J.T., Davidow L.S., Warshawsky D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation centre //Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 400^104.

75. Lee J. Т., Lu N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation // Cell. 1999. V. 99. P. 47-57.

76. Lee J.T. Disruption of imprinted X inactivation by parent-of-origin effects at Tsix // Cell. 2000. V. 103. P. 17-27.

77. Lescisin K.R., Varmuza S., Rossant J. Isolation and characterization of a novel trophoblastspecific cDNA in the mouse // Genes Dev. 1988. V. 2. № 12A. P. 1639-1646.

78. Levenberg S., Golub J.S., Amit M, Itskovits-Eldor J., Langer R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 7. P. 4391-4396.

79. Luo J., Sladek R., Bader J.A., Matthyssen A., Rossant J., Giguere V. Placental abnormalities in mouse embryos lacking the orphan nuclear receptor ERR-beta // Nature. 1997. V. 388. P. 778-782.

80. Lyon M.F. Gene action in the X chromosome of the mouse // Nature. 1961. V. 190. P. 372-373.

81. Stem Cell. 2007. V. 1. P. 55-70.

82. Мак W., Baxter J., Silva J., Newall A.E., Otte A.P., BrockdorffN. Mitotically stable association of Poly comb group proteins Eed and Enxl with the inactive X chromosome in trophoblast stem cells // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 1016-1020.

83. Мак W., Nesterova T.B., de Napoles M., Appanah R., Yamanaka S., Otte A.P., Brockdorff N. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos // Science. 2004. V. 303. P. 666-669.

84. Manes Т., Glade K., Ziomek C.A., Millan J.L. Genomic structure and comparison of mouse tissue-specific alkaline phosphatase genes // Genomics. 1990. V. 8. P. 541-554.

85. Martin G.R., Evans M.J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. № 4. P. 1441-1445.

86. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

87. Matsuda Т., Nakamura Т., Nakao K., Arai Т., Katsuki M., Heike Т., Yokota T. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells//EMBО J. 1999. V. 18. P. 4261-4269.

88. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential stem cells from murine germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. № 5. P. 841-847.

89. Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. High-resolution G-banding of chromosomes in Microtus subarvalis (Rodentia, Arvicolidae) // Hereditas. 1995. V. 123. P. 47-52.

90. McLaren A. Mammalian germ cells: birth, sex, and immortality // Cell Struct. Funct. 2001. V. 26. P. 119-122.

91. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. P. 631 — 642.

92. Mummery C.L., Feyen A., Freund E., Shen S. Characteristic of embryonic stem cell differentiation: a comparison with two embryonal carcinoma cell lines // Cell Diff.

93. Devel. 1990. V. 30. P. 195-206.

94. Natale D.R., Hemberger M., Hughes M., Cross J.C. Activin promotes differentiation of cultured mouse trophoblast stem cells towards a labyrinth cell fate // Dev. Biol. 2009. Epub ahead of print.

95. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers L, Scholer H.R., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 // Cell. 1998. V. 95. P. 379-391.

96. Niswander L., Martin G.R. Fgf-4 expression during gastrulation, myogenesis, limb and tooth development in the mouse // Development. 1992. V. 114. № 3. P. 755-768.

97. Niwa H., Burdon Т., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotene embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 // Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 20482060.

98. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat. Genet. 2000. V. 24. P. 372-376.

99. Niwa H, Toyooka Y., Shimosato D., Strumpf D., Takahashi K., YagiR., Rossant J. Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation // Cell. 2005. V. 123. P. 917-929.

100. Notarianni E., Laurie S., Moor R.M., Evans M.J. Maintenance and differentiation in culture of pluripotential embryonic cell lines from pig blastocysts // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1990. V. 41. P. 51-56.

101. Notarianni E., Galli C., Laurie S., Moor R.M., Evans M.J. Derivation of pluripotent, embryonic cell lines from the pig and sheep // J. Reprod. Fertil. Ltd. 1991. V. 43. P. 255-260.

102. Oda M, Shiota K, Tanaka S. Trophoblast stem cells // Methods Enzymol. 2006. V. 419. P. 387-400.

103. Okamoto I., Otte A.P., Allis C.D., Reinberg D., Heard E. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development // Science. 2004. V. 303. P. 644649.

104. Okita K., Nakagawa M., Hyenjong II, Ichisaka Т., Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors // Science. 2008. V. 322. № 5903. P. 949-953.

105. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Bone marrow stem cells regenerate infarcted myocardium // Pediatr Transplant. 2003. V. 7. Suppl. 3. P. 86-88.

106. Ottersbach K., Dzierzak E. The murine placenta contains hematopoietic stem cells within the vascular labyrinth region // Dev. Cell. 2005. V. 8. P. 377-387.

107. Ouhibi N., Sullivan N.F., English J., Colledge W.H., Evans M.J., Clarke N.J. Initial culture behaviour of rat blastocysts on selected feeder cell lines // Mol. Reprod. Dev. 1995. V. 40. P. 311-324.

108. Pain В., Clark M.E., Shen M., Nakazawa H., Sakurai M., Samarut J., Etches R.J. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potential //Development. 1996. V. 122. P. 2339-2348.

109. Penny G.D., Kay G.F., Sheardown S.A., Rastan S., BrockdorffN. Requirement for Xist in X chromosome inactivation//Nature. 1996. V. 379. P. 131-137.

110. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development// Stem Cells. 2001. V. 19. P. 271-278.

111. Petersen B.E., Terada N. Stem Cells: A Journey into a New Frontier // J. Amer. Society Nephrol. 2001. V. 12. P. 1773-1780.

112. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment ofpluripotent cell lines from vertebrate species present status and future prospects П Cells Tissues Organs. 1999. Y. 165. P. 220-236.

113. Ralston A, Rossant J. Genetic regulation of stem cell origins in the mouse embryo //

114. Clin. Genet. 2005. V. 68. P. 106-112.

115. Rappolee D.A., Basilico C., Patel Y., Werb Z. Expression and function of FGF-4 in peri-implantation development in mouse embryos // Development. 1994. V. 120. P. 22592269.

116. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

117. Robertson E.J., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector // Nature. 1986. V. 323. P. 445^48.

118. Robertson E.J. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach // Oxford. UK: IRL Press. 1987.

119. Rossant J. Stem cells from the mammalian blastocyst // Stem Cells. 2001. V. 19. P. 477-482.

120. Rossant J. Stem cells and lineage development in the mammalian blastocyst // Reprod., Fertil. Devel. 2007. V. 19. P. 111-118.

121. Rossant J., Cross J.C. Placental development: lessons from mouse mutants // Nature Rev. Genetics. 2001. V. 2. P. 538-548.

122. Rossant J, Ofer L. Properties of extra-embryonic ectoderm isolated from postimplantation mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morphol. 1977. V. 39. P. 183-194.

123. SambrookJ., Fretsch P., Maniatis T. Molecular cloning. 1989. P. 7.8-7.9.

124. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L., Greengard P.,Brivanlou A.H Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor//Nat. Med. 2004. V. 10. P. 55-63.

125. Schmidt M., Migeon B. R. Asynchronous replication of homologous loci on human active and inactive X chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 36853689.

126. Schlessinger J., Plotnikov A.N., Ibrahimi O.A., Eliseenkova A.V., Yeh B.K., Yayon

127. A., Linhardt R.J., Mohammadi M. Crystal structure of a ternary FGF-FGFR-heparin complex reveals a dual role for heparin in FGFR binding and dimerization // Mol. Cell. 2000. V. 6. 743-750.

128. Shi X., Garry D.J. Muscle stem cells in development, regeneration, and disease // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 1692-1708.

129. Simmons D.G., Cross J.C. Determinants of trophoblast lineage and cell subtype specification in the mouse placenta // Dev. Biol. 2005. V. 284. P. 12-24.

130. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides // Nature. 1988. V. 336. P. 688-690.

131. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

132. Smith A.G. The Battlefield of Pluripotency // Cell. 2005. V. 122. P. 261-273.

133. Soares M.J., Chapman B.M., Rasmussen C.A., Dai G., Kamei Т., Orwig K.E. Differentiation of trophoblast endocrine cells // Placenta. 1996. V. 17. P. 277-289.

134. Salter D., Knowles B.B. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 5565-5569.

135. Solter D. From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond: a history of embryonic stem cell research //Nat. Rev. Genet. 2006. V. 7. P. 319-327.

136. Spangrude G.J., Heimfeld S., Weissmann I.L. Purification and characterization of moise hematopoietic stem cells // Science. 1988. V. 241. P. 58-62.

137. Stadtfeld M., Nagaya M., Utikal J., Weir G., Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration // Science. 2008. V. 322. № 5903. P. 945

138. Stevens L.C.Jr, Little C.C. Spontaneous testicular teratomas in an inbred strain of mice//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1954. V. 40. P. 1080-1087.

139. Stewart C.L., Gadi I., Bhatt H. Stem cells from primordial germ cells can reenter the germ line // Dev. Biol. 1994. V. 161. P. 626-628.

140. Stewart T.A., Mintz B. Successive generations of mice produced from an established culture line of euploid teratocarcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 10. P. 6314-6318.

141. Strumpf D., Mao C.-A., Yamanaka Y., Ralston A., Chawengsaksophak K., Beck F., Rossant J. Cdx2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst // Development. 2005. V. 132. P. 2093-2102.

142. Takagi N., Sasaki M. Preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in the extraembryonic membranes of the mouse // Nature. 1975. V. 256. P. 640-642.

143. Takahashi A., Takahashi Y., Matsumoto K., Miyata K. Synergetic effects of insulinlike growth factor II (IGF-II) with leukemia inhibiting factor (LIF) on establishment of rat pluripotential cell lines // J. Vet. Med. Sci. 1995. V. 57. № 3. P. 553-556.

144. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V. 126. P. 663-676.

145. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka Т., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors I I Cell. 2007. V. 131. P. 861-872.

146. Talbot N.C., Rexroad C.E.Jr., Pursel V.G., Powell A.M. Alkaline phosphotase of pig and sheep epiblast cells in culture // Mol. Reprod. Devel. 1993. V. 36. P. 139-147.

147. Tanaka S., Kunath Т., Hadjntonakis A.-K., Nagy A., Rossant J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4 // Science. 1998. V. 282. P. 2072-2075.

148. Tesar P.J., Chenoweth J.G., Brook F.A., Davies T.J., Evans E.P., Mack D.L., Gardner R.L., McKay R.D.G. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells //Nature. 2007. V. 448. P. 196-202.

149. Thomson J A., Kalishman J., Golos T.G., Durning M., Harris C.P., Becker R.A., Hearn J.P. Isolation of a primate embryonic stem cell line // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7844-7848.

150. Thomson JA., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

151. Tremblay G.B., Kunath Т., Berderon D., Lapointe L., Champigny C., Bader J.-A., Rossant J., Giguere V. Diethylstilbestrol regulates trophoblast stem cell differentiation as a ligand of orphan nuclear receptor ERRp // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 833-838.

152. Ullah Z., Kohn M.J., Yagi R., Vassilev L.T., DePamphilis M.L. Differentiation of trophoblast stem cells into giant cells is triggered by p57/Kip2 inhibition of CDK1 activity // Genes Dev. 2008. V. 22. № 21. P. 2908-2913.

153. Vassilieva S., Guan K, Pich U., Wobus A.M. Establishment of SSEA-1 and Oct-4-expressing rat embryonic stem-like cell lines and effects of cytokines of the IL-6 family on clonal growth // Exp. Cell Res. 2000. V. 258. P. 361-373.

154. Wang J., Mager J., Chen Y., Schneider E., Cross J.C., Nagy A., Magnuson T. Imprinted X inactivation maintained by a mouse Poly comb group gene // Nat. Genet. 2001. V. 28. P. 371-375.

155. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink Т., Ku M., Hochedlinger K, Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state //Nature. 2007. V. 448. P. 318-324.

156. Williams R.L., Hilton D.J., Pease S., Willson T.A., Stewart C.L., Gearing D.P.,

157. Wagner E.F., Metcalf D., Nicola N.A., Gough N.M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells // Nature. 1988. V. 336. P. 684-687.

158. Wutz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered using ES cell differentiation // Mol. Cell. 2000. V. 5. P. 695-705.

159. Xin M., Davis C.A., Molkentin J.D., Lien C.-L., Duncan S.A., Richardson J.A., Olson E.N. A threshold of GATA4 and GATA6 expression is required for cardiovascular development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.13. № 30. P. 11189-11194.

160. Yadav P.S., Kues W.A., Herrmann D., Carnwath J.W., Niemann H. Bovine ICM derived cells express the Oct4 ortholog // Mol. Reprod. Dev. 2005. V. 72. № 2. P. 182-190.

161. Yan J., Tanaka S., Oda M., Makino Т., Ohgane J., Shiota K. Retinoic acid promotes differentiation of trophoblast stem cells to a giant cell fate // Dev. Biol. 2001. V. 235. P. 422-432.

162. Zakian S.M., Kulbakina N.A., Meyer M.N., Semenova L.A., Bochkarev M.N., Radjabli S.I., Serov O.L. Non-random inactivation of the X-chromosome in interspecific hybrid voles // Genet. Res. 1987. V. 50. P. 23-27.

163. Zakian S.M., Nesterova T.B., Cheryaukene O.V., Bochkarev M.N. Heterochromatin as a factor affecting X-inactivation in interspecific female vole hybrids (Microtidae, Rodentia) // Genet. Res. 1991. V. 58. P. 105-110.

Информация о работе

Григорьева, Елена Викторовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы