Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины

Шарапова, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины"

На правах рукописи

О03471363

Шарапова Наталья Евгеньевна

Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субьединичной противолептоспирозной вакцины

03.00.07 - микробиология 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ??)пз

Москва-2009

003471363

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ананьина Юлия Васильевна

кандидат биологических наук Лунин Владимир Глебович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мещерякова Ирина Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.^ Энгельгардга РАН

Зашита диссертации состоится июня 2009 года в 11 часов на заседании ди сертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адрес 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамал< РАМН.

Автореферат разослан «Т^Г» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

Е. В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лептоспирозы относятся к числу повсеместно распространенных природно-очаговых инфекций человека и животных. Действующие природные и антропургические очаги этого заболевания расположены во многих странах мира, включая Россию [ВОЗ, 2002].

Для специфической профилактики лептоспирозов в России применяется цельноклеточная инактивированная вакцина, содержащая инактивированные формальдегидом культуры лептоспир четырех основных серогрупп, использование которой обеспечивает развитие напряженного серовароспецифического иммунитета длительностью не более 12 месяцев [Яговкин Э.А. и др. 1990]. Инактивированные вакцины, как правило, характеризуются сравнительно высокой реактогенностью и риском возникновения поствакцинальных осложнений. Кроме того, существует ряд технологических проблем, связанных с использованием крупномасштабного культивирования микроорганизмов при производстве биопрепаратов. В экономически развитых странах (Западная Европа, США) инактивированные вакцины используют только в ветеринарии [Малахов Ю.А. 2002], вакцина для профилактики лептоспирозов человека отсутствует.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования иммунопрофилактики инфекционных заболеваний является разработка новых подходов к созданию профилактических препаратов нового поколения. Среди подобных препаратов особые надежды возлагаются на создание субъединичных генно-инженерных вакцин, содержащих протективные антигены возбудителей болезни. Субъединичные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются низкая реактогенность и возможность создания препарата, обеспечивающего перекрестный (сероваронезависимый) иммунитет [Атоп Е. е! а1. 2003]. Вместе с тем, основные сложности при разработке субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах лептоспир и механизмах развития иммунного ответа макроорганизма [Нааке Б.А. 2000, Ра1ашаррап К.и. й а1. 2007].

Основная роль в формировании невосприимчивости к легстоспирозу отводится гуморальному иммунному ответу. Среди антигенов лептоспир наиболее хорошо изученным является ЛПС, однако характеристики иммунного ответа, вызываемого ЛПС, имеют существенные расхождения среди разных групп исследователей [Sonrier С. et al. 2000, Matsuo К. et al. 2000]. Стратегии идентификации консервативных антигенов разных сероваров лептоспир сводятся, в основном, к изучению белков наружной мембраны (ОМР) [Haake D.A. et al. 2002, Cullen P.A. et al. 2005]. Важнейшим открытием среди ОМР стало обнаружение иммуноглобулиноподобных белков Lig, представляющих семейство нефимбрильных адгезинов лептоспир, что придало огромный импульс исследованиям, направленным на создание кандидат-ных субъединичных препаратов [Palaniappan R.U. et al. 2002, Matsunaga J. et al. 2003]. В настоящее время спектр основных иммуногенных белков патогенных лептоспир окончательно не определен, однако исследователи сходятся во мнении, что из всех известных на сегодняшний день антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладает белок LigA [Palaniappan R.U. et al. 2006, Faisal S.M. et al. 2008].

На этапе получения рекомбинантных антигенов - основных компонентов для разработки субъединичных генно-инженерных препаратов, зачастую возникают различные сложности, связанные с гетерологичной экспрессией, выделением и очисткой рекомбинантных антигенов, а также формулированием инъекционных препаратов.

Таким образом, разработка подхода, направленного на преодоление указанных сложностей экспрессии, очистки и повышения иммуногенности рекомбинантных антигенов лептоспир для получения компонентов кандидатных субъединичных препаратов, представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Цель работы: разработка технологии получения рекомбинантных антигенов лептоспир и получение препаратов рекомбинантных антигенов, иммобилизованных на полисахаридных сорбентах, а также изучение антигенных и иммуногенных свойств полученных препаратов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Создать рекомбинантные плазмиды, кодирующие иммуноглобулино-подобные домены адгезина LigA Leptospira interrogans sensu lato и получить штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых белков.

2. Разработать методику выделения, очистки и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов с использованием разных полисаха-ридных сорбентов.

3. Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков.

4. Изучить иммуногенные свойства полученных препаратов рекомбинантных антигенов и их комплексов с полисахаридными сорбентами.

Научная новизна. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, которые содержат консервативный иммуноглобулиноподоб-ный домен Lig А, соединенный с целлюлозосвязывающим (CBD) либо 1,3-р-глюкансвязывающим (GBD) доменом. На основе полученных плазмид впервые удалось создать эффективные штаммы-продуценты отдельных структурных модулей белка LigA в составе соответствующих химерных белков с высоким уровнем синтеза в клетках Е. coli.

Разработана эффективная система выделения, очистки и формулирования препарата рекомбинантного антигена методом его аффинной иммобилизации на частицах 1,3-Р-глюкана дрожжей, позволяющая получать белково-полисахаридный комплекс, напоминающий по структуре и составу известный иммуностимулирующий препарат зимозан.

Впервые исследованы антигенные свойства рекомбинантных автономных иммуноглобулиноподобных доменов и подтверждено сохранение их антигенной конформации. Кроме того, обнаружена групповая специфичность этих антигенов при исследовании с сыворотками больных лептоспирозами.

Проведено оригинальное сравнительное исследование иммуногенных свойств химерных белков, иммобилизованных на аморфной целлюлозе и частицах 1,3-Р-глюкана, в сравнении с иммунизацией живой культурой и инактивированной

противолептоспирозной вакциной. Изучена динамика синтеза цитокинов in vivo при введении разработанных препаратов и получены цитокиновые профили иммунного ответа крыс, а также определены титры специфических антител к использованным в эксперименте антигенам.

Научно-практическая значимость работы. Предложенный подход, позволяющий получать иммуногенные композиции на основе рекомбинантных антигенов лептоспир и углеводных сорбентов, может быть использован для разработки аналогичных препаратов, содержащие рекомбинантные антигены других микроорганизмов.

Также проведены сравнительные исследования антигенных и иммуногенных свойств полученных белково-полисахаридных комплексов и индивидуальных антигенов. Полученные охарактеризованные препараты рекомбинантных антигенов лептоспир могут быть использованы при разработке новых субъединичных канди-датных препаратов для профилактики лептоспироза, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе ИФА.

На созданные в данной работе рекомбинантные плазмиды и антигены, штаммы-продуценты рекомбинантных белков, а также способ их выделения и очистки оформлены 3 заявки на получение патента.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Ш международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирске, 2007), на Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (3-е место) в рамках Международного форума по нанотехнологиям (Москва, 2008), на конкурсе молодых ученых в рамках IV съезда Общества биотехнологов России в (Пущино, 2006) (3-е место), на П всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007), на заседании Ученого Совета НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН в рамках научного доклада 24 апреля 2008 г., на VI и VII молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2007).

Апробация работы состоялась 19 февраля 2009 г. на совместной научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии, природноочаговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ. По результатам работы оформлены 3 заявки на получение патента.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на 16 отечественных и 208 иностранных источников. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для молекулярного клонирования использовали штамм М15 Escherichia coli [pREP4]: naf st/ rif lac ara~ gar mit F" recA+, uvr+ Ion (Qiagen, США). Источником ДНК для клонирования служила тотальная ДНК, выделенная из штамма М-20 Leptospira interrogans serovar Copenhageni.

В работе использованы коммерческие плазмидные векторы семейства pQE фирмы Qiagen: pQE6 и pQElö [Непсо К., Crowe J. 1992, Karsten H., Joanne C. 1992]. Также были использованы рекомбинантные плазмиды рТТ9 и рТТЮ, кодирующие CBD эндоглюканазы термофильного организма Anaerocellum thermophilum с гли-цин-сериновым спейсером в С- и N-концевом положении соответственно, любезно предоставленные Тихоновой Т.В. (ГНУ ВНИИСБ РАСХН) [Лящук А.М. и др. 2006].

В работе использованы 6 пулов сывороток больных лептоспирозом и 4 пула от здоровых людей из коллекции лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, любезно предоставленные Петровым Е.М. Пулы содержали от четырех до шестидесяти шести индивидуальных сывороток, взятых у клинически здоровых или больных людей, инфицированных различными серогруппами леп-тоспир, на разных сроках болезни, и были предварительно исследованы в РМА БАСА в лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Для исследования цитокиновых профилей иммунного ответа на введение ре-комбинантных препаратов использовали белых беспородных крыс (самцов) массой 200-300 г.

Коммерческий препарат Иммуномакс, представляющий собой кислый пепти-догликан растительного происхождения, а также конъюгат белка D5-GBD с Имму-номаксом любезно предоставлен фирмой Иммафарма.

Чистые культуры лептоспир выращивали в жидкой среде Фервоорта-Вольфа (в модификации С.И. Тарасова) с 10% инактивированной кроличьей сыворотки или в полусинтетической твин-альбуминовой среде EMJH (Difco) при 28°С в течение 7 дней [Ананьин В.В. 1971]. Концентрацию лептоспир в культурах определяли подсчетом в камере Петрова-Хауссера.

Выделение ДНК из штамма М-20 Leptospira interrogans serovar Copenhageni проводили методом фенольно-хлороформной экстракции [Marmur I.A. 1961] с модификациями.

Генно-инженерное конструирование осуществляли по стандартным протоколам, согласно руководству [Маниатис и др. 1989].

Секвенирование фрагментов ДНК проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems/Hitachi) с использованием рекомендуемого набора реактивов для секвенирования.

Фракционирование белков методом электрофореза в ПААГ-ДСН проводили в буферной системе Лэммли [Laemmli U. 1970] с использованием 10%, 12% и 17% разделяющих гелей, для окраски которых использовали раствор Кумасси R-250. Элекгроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану для проведения иммуноб-лоттинга осуществляли в "полусухой" буферной системе [Towbin Н. et al. 1979].

Выращивание штамма-продуцента и индукцию синтеза рекомбинантных белков осуществляли в соответствии с рекомендацией производителя экспрессион-ных векторов - фирмы Qiagen [Karsten Н., Joanne С. 2002].

Выделение и очистку химерных белков, содержащих CBD или GBD, проводили методом аффинной иммобилизации на полисахаридных сорбентах. Сорбент на основе аморфной (волокнистой) целлюлозы готовили медно-аммиачным способом

по методу А.Е. Гурвича [Гурвич А.Е. и др., 1957, 1961] с нашими модификациями. Сорбент на основе 1,3-р-глюкана дрожжей готовили методом ступенчатого щелочного гидролиза дрожжевых клеток горячим 4%-ным раствором гидроксида натрия.

Для получения раствора антигена проводили элюирование белка с сорбента 8 М раствором мочевины и диализ против фосфатно-солевого буферного раствора. Концентрацию белка в полученном препарате определяли спектрофотометрически и рассчитывали по формуле Калькара:

С (мг/мл) = 1,45хА28о - 0,74хАгбо >

где А28о и А26о - значения оптической плотности раствора белка при 280 и 260 нм соответственно.

Определение титров специфических антител в сыворотках проводили методом нИФА.

Для изучения цитокинового профиля иммунного ответа крыс и определения титра специфических антител каждую группу крыс дважды с интервалом в 2 недели иммунизировали препаратами рекомбинантных антигенов подкожно в области спины. Сыворотки готовили общепринятым методом.

Определение концентраций цитокинов в сыворотках крыс проводили методом мультиплексного иммуноанализа с флуоресцентной детекцией в проточной системе BioPlex согласно руководству к прибору и инструкции к набору (Bio-Rad, США). Статистическую обработку результатов анализа проводили с использованием компьютерной программы BioPlex Manager Software 4.1.1. и MicroSoft Excel 2003.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Литературные данные, посвященные молекулярно-генетическим исследованиям лептоспир последних 10-12 лет, свидетельствуют о том, что антигенный состав этих микроорганизмов сложен, и многие его компоненты недостаточно изучены [Nascimento A.L. et al. 2004, Ren S.X. et al. 2003, Picardeau M., Bulach D.M., Bouchier C. 2008]. Однако, по мнению нескольких независимых групп ученых, среди известных в настоящее время антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладают иммуноглобулиноподобные белки (Lig) [Palaniappan R.U. et al.

2002, Matsunaga J. et al. 2003, Koizumi N., Watanabe H. 2004, Croda J., Ramos J.G., Matsunaga J. 2007]. Кроме того, липопротеин LigA обладает также протективными свойствами, и в связи с этим рассматривается, как один из наиболее перспективных компонентов для разработки кандидатных субъединичных вакцин [Palaniappan R.U. et al. 2006, Faisal S.M. et al. 2008]. Липопротеин LigA состоит из автономных структурных единиц - иммуноглобулиноподобных модулей, обладающих консервативной третичной структурой, что позволяет получать отдельные иммуноглобулино-подобные домены размером 90 а.о. с высокой вероятностью сохранения антигенной структуры рекомбинантного белка и, следовательно, его свойств.

Для преодоления таких биотехнологических сложностей, как низкий уровень синтеза, нестабильность синтезируемого белка, мы использовали технологию создания слитных белков (fusion-белков), которая основана на соединении в одной рамке трансляции гена целевого гена и гена белка-носителя. В качестве белков-носителей использовали аффинные домены - CBD и GBD, обеспечивающих одностадийное выделение и очистку рекомбинантных белков за счет аффинной иммобилизации на целлюлозном и глюкановом сорбентах соответственно.

1. Получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка LigA Leptospira interrogans.

Первый этап работы состоял в создании эффективных штаммов-продуцентов рекомбинантных доменов LigA в составе химерных белков. Для этого был создан ряд рекомбинантных плазмид, содержащих мини-гены отдельных доменов из консервативной области LigA - 1, 4 и 5-го. Для амплификации мини-генов, кодирующих домены 1,4 и 5 методом ПЦР на основе нуклеотидной последовательности гена ligA (GenBank, Accession Number AY221109) были спланированы 3 пары олиго-нуклеотидных праймеров, содержащие сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI, Kpn2I, BglII, Xbal (подчеркнуты) для клонирования и имеющие следующий состав:

Al-For 5'-accgttggatccgccattcttaactcaattcaagttacgag-3'

Al-Rev 5'-gagagatccggatctcaaacagatctttcttcagccccttgttttg-3'

A4-For 5'-tttaaaggatcccaagctgcattgacttccatcgaag-3'

A4-Rev 5'-ggattgtctagaatttaagatctaaccgcaggaactacagtaaacc-3'

A5-For 5'-actgtaggatccgcggttctcacttctattcaaatc-3'

A5-Rev 5'-gtgtgatctagatttaaacagatottgcagctgtaacagataacgtag-3'

В качестве ДНК-матрицы использовали тотальную ДНК, выделенную из чистой культуры L. interrogans serovar Copenhageni штамма М-20. Программа амплификации включала следующие этапы: 95°С - 10 мин, (95°С - 30 сек, 67°С - 30 сек, 72°С - 30 сек) х 35 циклов, 72°С - 5 мин. Полученные ПЦР-ампликоны анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле (Рис. 1).

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 1. домен 1,1 образец;

2. домен 1, II образец;

3. домен 1, III образец;

4. маркер молекулярной массы pUC18/MspI;

5. домен 4,1 образец;

6. домен 4, II образец;

7. домен 4, III образец;

,,„ ,,„ 8. маркер молекулярной массы

290 п.н. 310 пл. ЗЮп.н. .

pUC18/MspI;

9. домен 5,1 образец;

♦ * 1____10. домен 5, II образец;

11. домен 5, III образец;

12. отр. контроль 1

13. отр.контроль 4

14. отр. контроль 5

Рисунок !. Анализ продуктов ГТЦР-амшшфикации фрагментов гена LigA. Электрофорез в 2% агарозном геле, окраска раствором бромистого этидия.

После очистки ПЦР-продукты клонировали с помощью вектора pQE16 в клетки Е. coli шт. Ml5. В результате получили три конструкции - pDl, pD4 ,pD5, содержащие мини-гены доменов 1,4 и 5 гена ligA соответственно. Полученные ре-комбинантные плазмиды pDl, pD4 и pD5, проанализированные методом рестрик-ционного картирования и секвенирования клонированных фрагментов, использовали для создания рекомбинантных конструкций, кодирующих химерные (двухком-понентные) белки, которые состоят из иммуноглобулиноподобного домена, соединенного с CBD или GBD. Плазмидный вектор, содержащий GBD из Clostridium thermocellum, был получен в рамках данной работы.

После проведения субклонирования были получены 3 плазмиды - pDl-CBD, pD4-CBD и pD5-CBD, содержащие гибридный ген иммуноглобулиноподобного домена, соединенный с CBD, а также 3 плазмиды - pDl-GBD, pD4-GBD, pD5-GBD,

содержащие гибридный ген иммуноглобулиноподобного домена, соединенный с GBD (Рис. 2).

prT5y| SD

prT5 у

prTSyf SD

тТ5/ SD шт sp GBD

РГТ5 > SD =В4 sp GBD

ргТ5/ SD D5 SP GBD

Рисунок 2. Схемы экспрессионных кассет в плазмидах р01-СВЭ, р04-СЕШ, р05-СВ0 и р01-0В0, р04-0В0, р05-0В0. Обозначения: ргТ5- промотор фага Т5, 80-последовательность Шайна-Дальгарно, Э1, 04, 05 - мини-гены доменов 1, 4 и 5 ер- последовательность кодирующая глицин-сериновый спейсер, СВО - целлюлозосвязывающий домен, вВО - 1,3-Р-глюкансвязывающий домен, Т- терминатор.

Рекомбинантными плазмидами pDl-CBD, pD4-CBD, pD5-CBD и pDl-GBD, pD4-GBD, pD5-GBD трансформировали клетки E. coli штамма M15, отбирали кло-ны-трансформаиты, содержащие целевые плазмиды, после чего изучали экспрессию гибридных генов в клетках-продуцентах Е. coli. При индукции экспрессии (индуктор - 0,1 мМ ИПТГ) гибридных генов Dl-CBD, D4-CBD и D5-CBD в клетках-продуцентах накапливаются соответствующие белки рассчитанной молекулярной массы 31,6 кДа, 32,3 кДа и 32 кДа соответственно (Рис. 3), уровень их экспрессии составил 8-10% от тотального белка клетки.

1. Лизат клеток М15 до индукции

2. Лизат клеток M15, индукция

3. D1-CBD в лизате клеток M15, до индукции

4. D1-CBD в лизате клеток M15, индукция

5. D4-CBD в лизате клеток M15, до индукции

6. D4-CBD в лизате клеток M15, индукция

7. контроль молекулярной массы, 35,8 кДа

8. D5-CBD в лизате клеток M15, до индукции

9. D5-CBD в лизате клеток M15, индукция

Рисунок. 3. Анализ экспрессии рекомбинантных белков Dl-CBD, D4-CBD и D5-CBD в клетках Е. coli штамма M15. Электрофорез в 17%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

При индукции экспрессии (индуктор - 0,1 мМ ИПТГ) гибридных генов D1-GBD, D4-GBD и D5-GBD в клетках-продуцентах накапливаются соответствующие белки рассчитанной молекулярной массы 31,2 кДа, 31,8 кДа и 31,6 кДа соответственно (Рис. 4), уровень их экспрессии составил 10-12% от тотального белка клетки.

1. Лизат клеток M15, до индукции

2. Лизат клеток М15, индукция

3. D1-GBD в лизате клеток М15, до индукции

4. D1-GBD в лизате клеток М15, индукция

5. D4-GBD в лизате клеток М15, до индукции

6. D4-GBD в лизате клеток M15, индукция

7. D5-GBD в лизате клеток М15, до индукции

8. D5-GBD в лизате клеток М15, индукция

9. контроль молекулярной массы 33 кДа

10. контроль молекулярной массы 22 кДа

Рисунок 4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков Dl-GBD, D4-GBD и D5-GBD в клетках Е. coli штамма М15. Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Таким образом, были получены штаммы-продуценты 1-го, 4-го и 5-го рекомбинантных доменов LigA, синтезирующихся в клетках Е. coli в составе химерных белков Dl-CBD, D4-CBD, D5-CBD, а также Dl-GBD, D4-GBD, D5-GBD. Применение технологии создания слитных белков (fusion-белхов) позволило получить штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых продуктов (10-12% от тотального белка), а также стабильность рекомбинантных белков в клетке.

Поскольку домены 1,4 и 5 являются консервативными и имеют похожую структурную организацию, в дальнейших экспериментах мы использовали два химерных белка - D5-CBD и D5-GBD для проведения сравнительных исследований in vivo, как самих антигенов, так и сорбентов (целлюлозы и глюкана). Белки на основе домена 5 были выбраны, поскольку из трех полученных доменов именно D5 расположен наиболее близко к С-концу белка LigA, что обеспечивает более высокую вероятность взаимодействия данного домена во время адгезии при инфекции, чем, например, домена 1, находящегося около наружной мембраны лептоспир.

2. Выделение и очистка рекомбинантных антигенов.

Следующим этапом получения рекомбинантных антигенов являлась их эффективная очистка от клеточных компонентов штамма-продуцента. Введение аф-

финных доменов в состав рекомбинантных антигенов позволяет производить про-

стую и эффективную очистку в одну стадию за счет взаимодействия этих доменов с полисахаридным сорбентом: целлюлозой или глюканом.

12 3 4 5 6 7 8 9

лизат клеток М15, индукция лизат, фр. растворимых белков лизат, фр. нерастворимых белков отток с колонки после сорбции D5-CBD

D5-CBD + целлюлоза, 1 мл D5-CBD + целлюлоза, 5 мл D5-CBD, элюат 1 мл D5-CBD, элюат 5 мл контроль мол. массы 24 кДа 1мг/мл

Рисунок 5. Анализ физико-химических свойств белка D5-CBD и препаратов выделенного белка D5-CBD. Электрофорез в 10%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Как видно из рис. 5, при синтезе в клетках Е. coli белок D5-CBD накапливается преимущественно во фракции растворимых клеточных белков. В результате был получен препарат белка D5-CBD, иммобилизованного на целлюлозе, с концентрацией 3 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5-CBD с концентрацией белка 4 мг/мл.

Выделение и очистку белка D5-GBD проводили аналогичным способом с использованием в качестве сорбента препарата глюкана. При синтезе в клетках Е. coli белок D5-GBD накапливается во фракциях растворимых и нерастворимых клеточных белков примерно поровну (Рис. 6). В результате был получен препарат D5-GBD, иммобилизованного на глюкане, с концентрацией 4 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5-GBD с концентрацией белка 3,5 мг/мл.

лизат клеток М15 до индукции лизат клеток M15, индукция лизат, фр. нерастворимых белков лизат, фр. растворимых белков отток с колонки, после сорбции D5-GBD

белок D5-GBD + глюкан элюат D5-GBD (элюция гуанидина гвдрохлоридом)

элюат D5-GBD (элюция мочевиной) контроль мол. массы 35 кДа

Рисунок 6. Анализ физико-химических свойств белка D5-GBD и препаратов выделенного белка D5-GBD. Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

3. Исследование антигенных свойств рекомбннантных белков.

Полученные антигены Б5-С1Ш и ЭЗ-ОВБ исследовали методом иммуноб-лотхинга с сыворотками больных иктерогеморрагическим лептоспирозом. Для постановки иммуноблотгинга использовали пулы сывороток №1 и №2 от больных, инфицированных лептоспирами серогруппы ЫегоЬаетоггЬа^ае из коллекции лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. В результате (Рис. 7) с антителами сывороток больных взаимодействовали оба антигена, что подтверждает сохранение антигенной структуры рекомбинантного домена ЬщА в составе химерных белков 05-СВВ и В5-ОВБ. Аффинные домены СВО и ОВЭ с антителами сывороток не взаимодействовали (полосы преципитации на уровне 22 кДа на протеи-нограмме отсутствуют).

А Б

1234М М 1 2 3 4

Рисунок 7. Анализ антигенных свойств белков D5-CBD и D5-GBD методом иммуноблотгинга. А - электрофореграмма, 12% ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250. Б - протеинограмма, субстрат - диаминобензидин. 1 - лизат клеток М15, содержащий D5-CBD (32 кДа); 2 - лизат клеток М15, содержащий D5-GBD (31,6 кДа); 3 - лизат клеток М15, содержащий CBD (22 кДа); 4-лизат клеток М15, содержащий GBD (20 кДа).

Рекомбинантный антиген D5-CBD использовали для постановки непрямого иммуноферменгного анализа с пулами сывороток больных лептоспирозом, вызванного разными серогруппами лептоспир: Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Sejroe, a также четырьмя пулами сывороток, полученных от клинически здоровых доноров (коллекция лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН). Как видно из рис. 8, с рекомбинантным антигеном D5-CBD взаимодействовали антитела сывороток больных лептоспирозом серогрупп Icterohaemorrhagiae (пулы 1, 2, 3) и Canicola (пул 7) (ОП45о> 0,250). Сыворотки здоровых доноров (Д, 21, 30 и 50), а также пулы больных, инфицированных серогруп-

■ -11Л lilïa -«ШН

ii —

-35 кДа -

32 кДа --► „ , «м»

25 кДа -

22 кДа HêLi.J

пами Grippotyphosa и Sejroe с антигеном D5-CBD не взаимодействовали (значения OIÏ45o< 0,250).

2,500

—«—2(lctero) —■«—3(lctero) —à—7(Canicola) • •-о-. - i0(Grippotyphosa) •■■»■■■ 12(Sejro)_

-—•ДО

-------21(-)

".*-30O -■■»■■■ 50O

1 (Ictero)

0,000 -1-1-1-1-1-1-1—-—

1:100 1200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 Разведения сывороток

Рисунок 8. Определение титров специфических антител к антигену D5-CBD в сыворотках больных методом непрямого ИФА.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении антигенных свойств рекомбинантных доменов LigA в составе полученных химерных белков. Кроме того, обнаруженная групповая специфичность D5-CBD к антителам серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola отражает близкое антигенное родство этих групп лептоспир, что согласуется с литературными данными [Haake D.A. 2000, Haake D.A. et al. 2004].

Для прореагировавших в нИФА сывороток определяли титр специфических антител. Титром считали величину, обратную последнему разведению, в котором ОП в 2 и более раз превышает ОП в отрицательном контроле. Как видно из таблицы 1, титры специфических антител, определенные методом нИФА с использованием рекомбинантного антигена D5-CBD, во всех случаях, кроме пула №1, коррелируют с титрами антител, определенными в РМА, являющейся «золотым стандартом» диагностики лептоспироза. Полученные результаты подтверждают перспек-

тивность использования рекомбинантного антигена D5-CBD в качестве маркера для разработки диагностических тест-систем на основе нИФА [Guerreiro H. et al. 2001, Koizumi N., Watanabe H. 2004, Croda J., Ramos J.G., Matsunaga J. 2007].

Таблица 1.

Сравнение результатов определения титров специфических антител в сыворотках больных иктерогеморрагическим и каникулезным лептоспирозом методами нИФА и РМА.

Номер пула Серогруппа Титр PMA Титр нИФА

1 Ictcrohacmorrhagiae 800 400

2 Icterohaemorrhagiae 800 800

3 Icterohaemorrhagiae 400 400

7 Canicola 400 400

4. Сравнительное исследование иммуногенных свойств препаратов.

Основными задачами исследования иммуногенных свойств рекомбинантных антигенов Б5-СВВ и Б5-СВО, а также их комплексов с углеводными сорбентами, являлись изучение цитокиновых профилей иммунного ответа, развивающегося при введении животным разработанных препаратов, в сравнении с инфекцией (введением живой культуры лептоспир) и иммунизацией инактивированной вакциной, а также определение титров специфических антител.

Опытным группам животных вводили рекомбинантные антигены Б5-СВБ и В5-СВО, иммобилизованные на целлюлозе и глюкане (группы № 10 и №5), а также растворы этих белков. Контрольные животные получали инъекции инактивированной противолептоспирозной вакцины (группа №11), суспензии живой культуры лептоспир (группа №12), а также физиологического раствора, использованного в качестве разбавителя для всех препаратов (группа №13). Группу №14 иммунизировали конъюгатом Б5-ОВБ+Иммуномакс, группу №15 - препаратом Иммуномакс.

Отбор крови для приготовления сывороток проводили в 1-й (день первой инъекции), 2-й 15-й, 27-й, 29-й и 58-й дни опыта. В полученных сыворотках исследовали концентрации девяти цитокинов: 1Ь-1а, 1Ь-1р, 11.-2, 1Ь-4, 1Ь-6, ОМ-СЭР, 1Шу, ТЫ Ра, а также определяли титры специфических антител. Наибольший интерес вызывало определение концентраций ключевых цитокинов клеточного (1Ь-2,

1Ь-6 и 1ЕМу) и гуморального иммунного ответа (1Ь-4 и 1Ь-10), а также провоспали-тельных цитокинов 1Ь-1а и 1Ь-1р, ЮТа, необходимых для активации, пролиферации и дифференцировки макрофагов и лимфоцитов.

При сравнении цитокиновых профилей ответа крыс на иммунизацию белко-во-полисахаридными комплексами 05-СВ0 на целлюлозе и 05-СВГ) на глюкане (рис. 9) в исследованных сыворотках в первые дни обнаруживались провоспали-тельные интерлейкины 1Ь-1 а и IЬ-1 р примерно в одинаковых высоких концентрациях (1380-1890 пг/мл).

Группа N510. 05-СВ0 + целлюлоза

2000

1800

| 1600

с. 1400 т

| 1200

? 1000

д 800

I 600 е-

5 400 а

5 200 *

о -200

1 |

I \

1 1. 1 ГЕЬ 1/Ъ А г

[ , 2 15 27 29 58

■ II-13

■ ыь □ 1-« □ 11-10

■ ТЫРа

Дни эксперимента

2000 Группа №5. 05-СВ0 + глюкан 1 ■ На □ И-1Ь □ И-4 О 11.-10 ■ тара

1800 -* 1600 -I

М0С | | 1200 -1 рт

£ 1000 -1 | 800 -1 Н II у г ± X

% 600 -Е 400 -1 | 200 | У

-200 - 1 2 15 27 29 58 Дни эксперимента

Рисунок 9. Цитокиновые профили иммунного ответа крыс, иммунизированных препаратами антигенов, иммобилизованных на полисахаридных сорбентах.

Также в сыворотках этих групп животных детектировался ЮТа, уровень синтеза которого был несколько выше в группе, иммунизированной антигеном 05-СЬЮ на глюкане. Эти данные могут свидетельствовать о ранней активации (на 2-5 сутки) В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов. У животных этих групп обнаруживались также в сыворотке 1Ь-4 и 1Ь-10 - ключевые цитокины гуморального ответа, причем концентрации 11.-4 были в 2 и более раза выше в группе, получавшей антиген В5-ОВБ глюкане. Во всех исследованных образцах сывороток интерлейкинов 1Ь-2 и 1Ь-6, а также 1Р№/ не обнаруживались используемым методом. Эти данные свидетельствуют о том, что препарат рекомбинантного антигена В5-ОВБ, иммобилизованного на глюкане, по-видимому, способствует интенсивному развитию гуморального иммунного ответа.

При сравнении иммуностимулирующих свойств глюканового сорбента с коммерческим препаратом Иммуномакс (рис. 10) концентрации практически всех исследованных цитокинов (в особенности 1Ь-4 и 1Ь-10) были в 2 и более раз выше в группе, получавшей антиген, иммобилизованый на глюкане.

Группа №14. Конъюгат С>5-ОЕЮ-Иммуномакс

1600 -

1400 -

£ 1200 -

| 1000 -

I 800 -

| 600 -

| 400 -х

£ 200 -

с *

0 --200 -

15 27

■ 1Ыа

■ 11_-1Ь а1Ь4 □ 11.-10

Дни экспериыекта

Рисунок 10. Цитокиновый профиль иммунного ответа крыс, иммунизированных конъюга-том антигена Б5-ОВО с препаратом Иммуномакс,

Необходимо отметить, что при использовании Иммуномакса в качестве адъ-юванта для приготовления инъекционного препарата требуется дополнительная стадия - химическая конъюгация антигена с Иммуномаксом [Атауллаханов и др.

2005], в то время как введение глюкансвязывающего домена в состав антигена позволяет одновременно выделять и очищать рекомбинантный антиген за счет аффинной иммобилизации на частицах глюкана без дополнительных манипуляций и использования токсичных реагентов.

При введении крысам инактивированной вакцины (рис. 11) у животных развивался типичный гуморальный ответ, о чем свидетельствует наличие в сыворотках 1Ь-4 и 1Ы0.

1600 1100

с;

1200 | 1000 I 800

Е 600

а. 400

I 200

1600 1400

g 1200 | 1000

1 ООО | 600 | 400

| 200

Группа №11. Инактивированная вакцина

lit—Й—fhrfh

1 11 1 2 1 i * 1. 15 27 29 58

Дни эксперимента

Группа №12. Живая культура лептоспир

27 29

■ IL-13

□ IL- ID

□ IL-4

□ IL-10

■ TNFa

IL-13

_ ina IL-1D

lb £ OlL-4

Дни эксперимента

Рисунок. 11. Цитокиновые профили иммунного ответа крыс, иммунизированных инактивированной противолептоспирозной вакциной и живой культурой лептоспир.

В группе получавшей препарат Б5-ОВО на глюкане (Рис. 9), интенсивный ответ развивался уже в 1-2-е сутки, о чем свидетельствуют высокие концентрации

провоспалительных цитокинов по сравнению с инактивированной вакциной, где происходило постепенное нарастание концентраций провоспалительных цитокинов (к 15-27 дням). Кроме того, уровень синтеза 1Ь-4, необходимого для дифференци-ровки Т-хелперов в клетки 2-го типа был в 2 и более раз выше, чем в группе, получавшей вакцину.

При иммунизации крыс живой культурой лептоспир (рис. 11) наблюдалась довольно умеренная иммунная реакция по сравнению концентраций цитокинов с аналогичными показаниями других групп. Это отчасти может объясняться тем, что в природе крысы не болеют лептоспирозом, являясь его переносчиками - резервуарами инфекции. Цитокиновый профиль ответа на введение препарата антигена Б5-ОВО, иммобилизованного на глюкане, наиболее близок по спектру индуцируемых цитокинов к профилю, полученному при иммунизации животных живой культурой. Однако концентрации провоспалительных цитокинов в 3 и более раз выше в первые дни, чем в группе получавшей живую культуру.

Таким образом, разработанный препарат Э5-0ВВ, иммобилизованный на глюкане, стимулирует синтез цитокинов гуморального иммунного ответа. Кроме того, благодаря неспецифическим иммуностимулирующим свойствам глюкана в первые-вторые сутки синтезируется большое количество провоспалительных цитокинов, способствующих активации макрофагов и фагоцитов, а также пролиферации и дифференцировке лимфоцитов.

В образцах сывороток крыс определяли также титры специфических антител нИФА. В качестве антигенов для постановки нИФА использовали соответствующие рекомбинантные антигены, входящие в состав препаратов для иммунизации.

Как можно видеть из таблицы 2, иммобилизация антигенов на углеводном сорбенте, как на целлюлозе, так и на глюкане усиливает антителообразование, аналогичным действием обладает конъюгат белка Б5-0В0 с Иммуномаксом.

При этом наиболее высокие титры специфических антител регистрировались в группе, иммунизированной комплексом ОВБ-глюкан - к 58-му дню титр достигал значений 12800, в то время как в группе, получавшей инъекции раствора белка вВО, максимальный титр антител составил 3200. Аналогично, при введении рас-

твора антигена СЕГО антитела в сыворотках крыс к данному антигену практически отсутствовали, а при иммунизации комплексом С1ГО-целлюлоза титры антител к СЕГО составляли 1600-3200 на 29-й и 58-й дни опыта. Введение животным конъю-гата антигена Б5-СВВ с Иммуномаксом способствовало синтезу антител, максимальные значения титров которых достигали 256.

Таблица 2.

Определение титров специфических антител в сыворотках крыс, иммунизированных рекомбннантными препаратами.

№ группы Препарат Титры специфических антител в сыворотках Примечания

15 день 27 день 29 день 58 день

1 ОБО 400 1600 1600 3200

3 йВО-глюкан 400 800 1600 12800

4 05-0В0 64 128 64 64

128 128 128 64 антитела кБ5

5 05-С1Ш-глюкан 128 256 1600

6 СВЭ 4 отриц отриц отриц

8 СВР-целлюлоза 8 64 3200 1600

9 05-СВ0 4 отриц отриц 4

10 05-СВ0- целлюлоза 8 64 128 256

11 ИнактивироЕаиная вакцина отриц отриц отриц отриц ашитела к 05

12 Живая культура 64 64 128 128 антитела к 05

14 05-СВ0 + Иммуномакс 128 256 256 256

Использование углеводного сорбента на основе частиц 1,3-Р-глюкана в эксперименте способствовал более значительному увеличению титра специфических антител в сыворотках крыс, по сравнению с препаратом волокнистой целлюлозы, особенно в случае белков В5-ОВО и ОВБ.

При введении крысам инактивированной противолептоспирозной вакцины антитела к белку Б5 в сыворотках практически отсутствовали, при этом иммунизация живой культурой приводила к росту титра специфических антител к Б5 до значений 64-128. Таким образом, титр специфических антител к Б5 при иммунизации

рекомбинантным белком сопоставим с титром к D5, наблюдаемым при введении крысам живой культуры лептоспир.

ВЫВОДЫ

1. Созданы эффективные штаммы-продуценты химерных белков, состоящих из иммуноглобулиноподобных доменов адгезина LigA Leptospira interrogans, соединенных с полисахарид-связывающими аффинными доменами.

2. Разработана одностадийная технология выделения, очистки и формулирования препарата рекомбинантных антигенов LigA на целлюлозном и глюкано-вом сорбентах.

3. Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков, состоящих из иммуноглобулиноподобного домена LigA с целлюлозосвязывающим доменом и иммуноглобулиноподобного домена LigA с глюкансвязывающим доменом, подтверждено сохранение антигенных свойств иммуноглобулиноподобных доменов в составе химерных белков.

4. Использование полисахаридных сорбентов для иммобилизации рекомбинантных антигенов способствует повышению их иммуногенности за счет развития неспецифической воспалительной реакции, о чем свидетельствуют высокие уровни синтеза провоспалительных цитокинов в первые дни после инъекции.

5. Препарат рекомбинангаого бежа, состоящего из иммуноглобулиноподобного домена LigA с глюкансвязывающим доменом, иммобилизованного на частицах глюкана, активирует гуморальное звено иммунитета и является перспективным компонентом для разработки субъединичной противолептоспи-розной вакцины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. В.Г. Лунин, Н.Е. Шарапова, Т.В. Тихонова, Н.Н. Полетаева, З.М. Галушкина, Е.И. Аксенова, В.И. Грабко, Г.А. Великодворская, Н.В. Лаврова, Ю.В. Ананьина. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного целлюлозосвязы-вающего домена Anaerocellum thermophilum in vivo. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - № 1. - С. 21-27.

2. Н.Е. Шарапова В.Г. Лунин, Ю.В. Ананьина, Л.В. Верховская. Использование доменов иммуноглобулнноподобного белка LigA в качестве перспективных маркеров для тестирования сывороток больных лептоспирозами. // Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск, 2-8 сентября 2007 г. - С.188.

3. Н.Е. Шарапова, З.М. Галушкина, Н.Н. Полетаева, В.И. Грабко Использование нанотехнологии для создания субъединичных вакцин нового поколения. // Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - Москва, 3-5 декабря 2008 г. - С. 614-616.

4. Шарапова Н.Е. Использование цитокинового профиля для оценки иммунного ответа при разработке кандидатной субъединичной вакцины против лептос-пироза. // Материалы Международного междисциплинарного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». - Судак, Украина, 19-30 сентября 2008 г. - С. 136-138.

5. Лунин В.Г., Шарапова Н.Е., Гинцбург А.Л. Разработка нанобиотехнологиче-ского подхода для создания субъединичных генно-инженерных вакцин нового поколения. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (с международным участием). - Новосибирск, 11-15 мая 2008 г. -С. 308.

6. Шарапова Н.Е. Получение и исследование антигенных свойств рекомби-нантных доменов белка LigA Leptospira interrogans serovar Copenhageni. II Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». - Рязань, 29 мая - 1 июня 2007 г. -С. 138-139.

Заявки на патенты:

1. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. «Рекомбинантная плазмида pDlspGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D1-GBD, рекомбинантный белок D1-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D1-GBD с антителами сыво-

роток больных, способ получения специфических антител к белку D1-GBD» Заявка №2008146597 от 26.11.2008 г.

2. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская JI.B., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. «Рекомбинангаая плазмида pD4spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D4-GBD, рекомбинантный белок D4-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D4-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D4-GBD» Заявка № 2008146598 от 26.11.2008 г.

3. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. «Рекомбинангаая плазмида pD5spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D5-GBD, рекомбинантный белок D5-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D5-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D5-GBD» Заявка № 2008146599 от 26.11.2008 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антитела

БАСА - Байрам-Али слайд агглютинация (макроагглютинация) ИПТГ - изопропил -P-D-тиогалактопиранозид ЛПС - липолисахарид

нИФА - непрямой иммуноферменгный анализ ОП - оптическое поглощение

ПААГ-ДСН - полиакриламидный гель - додецилсульфат натрия (денатурирующие условия)

ПЦР - полимеразная цепная реакция РМА - реакция михроагглютинации CBD - целлюлозосвязывающий домен GBD- 1,3-р-глюкансвязьтающий домен

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор IFN - интерферон IL - интерлейкин

Lig - иммуноглобулиноподобные белки лептоспир (Leptospiral immunoglobulin-like proteins)

ОМР - белки наружной мембраны (outer membrane proteins) TNFa - фактор некроза опухоли

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность научным руководителям В.Г. Лунину и Ю.В. Ананьиной за постоянное внимание, всестороннюю помощь, полученные знания и навыки.

Искренне признательна сотрудникам лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Самсоновой А.П. и Петрову Е.М. за большую помощь, предоставление материалов для исследований, а также прочтение рукописи диссертации. За оказанное содействие и помощь в иммунологической части работы, прочтение рукописи и ценные замечания благодарю ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной биотехнологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Верховскую Л.В. Глубокую признательность выражаю заведующей отделением подопытных животных НИИЭМ им. Н.ф. Гамалеи РАМН Ветковой Л.Г. за решение организационных вопросов и большую помощь в работе с животными.

За оказанную помощь в работе, прочтение рукописи, критические замечания и ценные советы благодарю сотрудников лаборатории биологически активных наноструктур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН: Галушкину З.М., Полетаеву H.H., Халину Т.Е., Снят-кову И.Н, Аксенову Е.И., Котнову А.П., Карягину A.C., Грабко В.И., Лаврову Н.В., Сер-гиенко О.В., Рязанову Е.М., Большакову Т.Н., Добрынину О.Ю., Лящука A.M., Павлову Л.К. Искренне признательна Ворониной О.Л. за многочисленные советы, оказанную помощь и поддержку.

Выражаю глубокую благодарность администрации НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН за предоставленную возможность заниматься научной работой и оказанное содействие в организации и проведении научных исследований.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, д.м.н. профессору Русаковой Е. В. за помощь при подготовке диссертации к защите.

Заказ № 678. Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 140 шт.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шарапова, Наталья Евгеньевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Краткая характеристика Leptospira interrogans.

1.1.1. Классификация и таксономия лептоспир.

1.1.2. Морфология, культуральные и биохимические свойства.

1.1.3. Молекулярно-генетические особенности лептоспир.

1.1.3.1. Анализ секвенированных геномов лептоспир.

1.1.3.2. Основные факторы патогенности и антигенные детерминанты лептоспир.

1.2. Иммунопрофилактика лептоспирозов.

1.2.Г. Традиционные противолептоспирозные вакцины.

1.2.2. Разрабатываемые вакцины для профилактики лептоспирозов.

1.3. Проблемы получения основных компонентов для разработки генно-инженерных субъединичных вакцин (антигенов) и возможные пути их решения.

1.3.1. Проблемы гетерологичной экспрессии, выделения и очистки белков. Аффинные домены в технологии создания химерных белков.

1.3.2.Проблема формулирования инъекционных препаратов и повышения их иммуногенности. Использование аффинной иммобилизации антигенов на полисахаридных сорбентах.

1.3.2.1. Использование 1,3-Р-глюкана в качестве иммуносорбента.

1.3.2.2. Способы получения препарата частиц глюкана из.дрожжей и его свойства.

1.3.2.3: Глкжансвязывающие модули и их применение в качестве аффинных доменов.

Глава 2. Материалы и методы.60 <

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Плазмидные векторы.602.1.3. Олигонуклеотиды.

2.1.4. Ферменты.

2:1.5. Сыворотки.6 Г

2.1.6. Лабораторные животные.

2.1.7. Растворы.

2.1.8. Антибиотики.

2.1.9. Питательные среды.V.V66<

2.1.10: Иммуномакс.

2.1.11. Лабораторное оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Культивирование лептоспир.

2.2.2. Определение концентрации лептоспир в счетной камере Петрова-Хауссера.

2.2.3. Выделение хромосомной ДНК лептоспир.

2.2.4. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.5. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.2.6. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.8. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля

2.2.9. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.10. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.10.1. Приготовление компетентных клеток.

2.2.10.2. Электропорация.

2.2.11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.13. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакри-ламидном геле в денатурирующих условиях

ПААГ-ДСН) и иммуноблоттинг.

2.2.14. Выращивание штамма-продуцента Е. coli и индукция синтеза ре-комбинантных белков.1.

2.2.15. Анализ физико-химического состояния рекомбинантных белков.

2.2.16. Выделение и очистка химерных белков, содержащих целлюло-зосвязывающий или 1,3-р-глюкансвязывающий домен, методом аффинной иммобилизации на полисахаридных сорбентах.

2.2.17. Постановка непрямого иммуноферментного анализа.

2.2.18. Иммунизация лабораторных животных.

2.2.18.1. Иммунизация кроликов.

2.2.18.2. Иммунизация крыс.

2.2.19. Взятие крови и приготовление сывороток.

2.2.20. Определение концентраций цитокинов в сыворотках крыс.

2.2.21. Приготовление препарата частиц глюкана.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка LigA Leptospira interrogans. 81 3.1.1. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих отдельные иммуноглобулиноподобные домены белка LigA.

3.1.1.1. Получение ПЦР-фрагментов гена ligA, кодирующих иммуноглобулиноподобные домены.

3.1.1.2. Клонирование ПЦР-фрагментов с помощью векторов pQE6 и pQE16.

3.1.1.3. Создание штаммов-продуцентов рекомбинантных доменов LigA 86 3.1.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных белков, состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка LigA и целлюлозосвязывающего домена (CBD).

3.1.2.1. Создание экспрессионных конструкций, содержащих мини-гены рекомбинантных доменов белка LigA с целлюлозосвязывающим доменом (CBD).

3.1.2.2. Создание штаммов-продуцентов химерных белков Dl-CBD, D4-CBD, D5-CBD, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподоб-ный домен LigA с целлюлозосвязывающим доменом.

3.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных белков, состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка LigA и 1,3-Р-глюкансвязывающего домена (GBD).

3.2.1. Создание экспрессионной конструкции, кодирующей рекомбинантный 1,3-Р-глюкансвязывающий домен (GBD) Clostridium Ihermocellinn.

3.2.1.1. Клонирование фрагмента гена licA, кодирующего 1,3-J3-глюкансвязывающий домен (GBD).

3.2.1.2. Получение экспрессионной конструкции, кодирующей рекомбинантный 1,3-р-глюкансвязывающий домен (GBD) и глицин-сериновый спейсер.

3.2.2. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих химерные белки Dl-GBD, D4-GBD, D5-GBD, содержащие рекомбинантный имму-ноглобулиноподобный домен белка LigA и 1,3-|3-глюкансвязывающий домен (GBD).

3.2.3. Создание штаммов-продуцентов химерных белков Dl-GBD, D4-GBD, D5-GBD, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподоб-ный домен LigA с 1,3-Р-глюкансвязывающим доменом.

3.3. Выделение и очистка химерных белков с использованием полисаха-ридных сорбентов.

3.3.1. Выделение и очистка белка D5-CBD методом аффинной иммобилизации на аморфной целлюлозе.

3.3.2. Выделение и очистка белка D5-GBD методом аффинной иммобилизации на 1,3-Р-глюкане.

3.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полученных препаратов.

3.4.1. Анализ антигенных свойств рекомбинантных белков с набором сывороток больных лептоспирозом людей.

3.4.1.1. Исследование антигенной-структуры полученных рекомбинантных белков методом иммуноблоттинга с сыворотками больных.

3.4.1.2. Изучение антигенной специфичности рекомбинантного антигена D5-CBD. Определение титров LigA-специфических антител в сыворотках больных с использованием рекомбинантных антигенов.

3.4.2. Исследование антигенных и имуногенных свойств белков D5-CBD, D5-GBD. Получение кроличьих антисывороток к рекомбинантным антигенам D5-CBD, D5-GBD и комплексам В5-СВБ-целлюлоза и D5-GBD-глюкан.

3.4.2.1. Иммунизация кроликов рекомбинантными антигенами D5-CBD и D5-GBD и комплексами В5-СВВ-целлюлоза и DS-GBD-глюкан.

3.4.2.2. Определение титров специфических антител в полученных кроличьих сыворотках.

3.4.3. Сравнительное исследование иммуногенных свойств препаратов в эксперименте на крысах.

3.4.3.1. Исследование сывороточных цитокинов крыс, синтезируемых при иммунизации разработанными препаратами.

3.4.3.1. Определение титров специфических антител в сыворотках иммунизированных крыс.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины"

Для специфической профилактики лептоспирозов в России применяется цельноклеточная инактивированная вакцина, содержащая инактивированные формальдегидом культуры лептоспир четырех основных серогрупп, использование которой обеспечивает развитие напряженного серовароспецифического иммунитета длительностью не более 12 месяцев [29]. Инактивированные вакцины, как правило, характеризуются сравнительно высокой реактогенностью и риском возникновения различных поствакцинальных осложнений. Кроме того, существует ряд технологических проблем, связанных с использованием крупномасштабного культивирования микроорганизмов при производстве биопрепаратов. В экономически развитых странах (Западная Европа, США) инактивированные вакцины используют только в ветеринарии [24], вакцина для профилактики лептоспирозов человека отсутствует.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования иммунопрофилактики инфекционных заболеваний является разработка подходов к созданию профилактических препаратов нового поколения. Особые надежды возлагаются на создание субъединичных генно-инженерных вакцин, содержащих протективные антигены возбудителей болезни. Субъединичные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются низкая реактоген-ность и возможность создания препарата, обеспечивающего перекрестный (се-роваронезависимый) иммунитет [35]. Вместе с тем, основные сложности при разработке субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах лептоспир и механизмах развития иммунного ответа макроорганизма [88, 150].

Основная роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу отводится гуморальному иммунному ответу. Среди антигенов лептоспир наибо8 лее хорошо изученным является ЛПС, однако характеристики иммунного ответа, вызываемого ЛПС, имеют существенные расхождения среди разных групп исследователей [127, 185]. Стратегии идентификации консервативных антигенов разных сероваров лептоспир сводятся, в основном, к изучению белков наружной мембраны (ОМР) [60, 85]. Важнейшим открытием среди ОМР стало обнаружение иммуноглобулиноподобных белков Li g (Leptospiral immunoglobulin-like), представляющих семейство нефимбрильных адгезинов лептоспир, что придало огромный импульс исследованиям, направленным на создание кандидатных субъединичных препаратов [124, 148]. В настоящее время спектр основных иммуногенных белков патогенных лептоспир окончательно не определен, однако исследователи сходятся во мнении, что из всех известных на сегодняшний день антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладает белок LigA [77, 149].

Однако, на этапе получения рекомбинантных антигенов - основных компонентов для разработки субъединичных генно-инженерных препаратов, зачастую возникают различные сложности, связанные с гетерологичной экспрессией, выделением и очисткой рекомбинантных антигенов, а таюке формулированием инъекционных препаратов. Таким образом, разработка подхода, направленного на преодоление указанных сложностей экспрессии, очистки и повышения иммуногенности рекомбинантных антигенов лептоспир для получения компонентов кандидатных субъединичных препаратов, представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Создать рекомбинантные плазмиды, кодирующие иммуноглобулиноподобные домены адгезина LigA Leptospira interrogans sensn 9 lato и получить штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых белков.

2. Разработать методику выделения, очистки и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов с использованием разных по-лисахаридных сорбентов.

3. Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков.

Научная новизна. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, которые содержат консервативный иммуноглобули-ноподобный домен Lig А, соединенный с целлюлозосвязывающим (CBD) либо 1,3-Р-глкжансвязывающим (GBD) доменом-. На основе полученных плазмид впервые удалось создать эффективные штаммы-продуценты отдельных структурных модулей белка LigA в составе соответствующих химерных белков с высоким уровнем синтезам клетках Е. coli.

Впервые исследованы антигенные свойства рекомбинантных автономных иммуноглобулиноподобных доменов и подтверждено сохранение их антигенной конформации. Кроме того, обнаружена групповая специфичность этих антигенов при,исследовании с сыворотками больных лептоспирозами.

10 токинов in vivo при введении разработанных препаратов и получены цитокино-вые профили иммунного ответа крыс, а также определены титры специфических антител к использованным в эксперименте антигенам.

Также проведены сравнительные исследования антигенных и иммуно-генных свойств полученных белково-полисахаридных комплексов и индивидуальных антигенов. Полученные охарактеризованные препараты, рекомбинантных антигенов лептоспир могут быть использованы при разработке новых субъединичных кандидатных препаратов для профилактики лептоспироза, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе ИФА.

На созданные в данной работе рекомбинантные плазмиды и антигены, штаммы-продуценты рекомбинантных белков, а также способ их выделения и очистки оформлены 3 заявки на.получение патента.

Апробация работы. Результаты работы доложены, на третьей международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» в г. Новосибирске 2-8 сентября 2007 г, на Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» в г. Судак (Крым, Украина) 19-30 сентября 2008 г., на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (секция Нано-технологии в медицине) (3-е место) в рамках Международного форума по на-нотехнологиям в г. Москве 3-5 декабря 2008 г., на конкурсе молодых ученых в рамках четвертого съезда Общества биотехнологов России в г. Пущино 17-19 октября 2006 г. (3-е место), на второй всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» в г. Рязани 29 мая - 1 июня 2007 г., на заседании Ученого Совета НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН в рамках научного доклада 24 апреля 2008 г., на седь

11 мой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН 4 апреля 2007 г.

Апробация диссертации состоялась 19 февраля 2009 г. на совместной научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии, природноочаговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шарапова, Наталья Евгеньевна

выводы

1. Созданы пггаммы-продуценты химерных белков, состоящих из иммуног-лобулиноподобных доменов адгезина LigA Leptospira interrogans, соединенных с полисахарид-связывающими аффинными доменами.

2. Разработана одностадийная технология выделения, очистки и формулирования препарата рекомбинантных антигенов LigA на целлюлозном и глюкановом сорбентах.

3. Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков, состоящих из иммуноглобулиноподобного домена LigA с целлюлозосвязывающим доменом и иммуноглобулиноподобного домена LigA с глюкансвязываю-щим доменом, подтверждено сохранение антигенных свойств иммуног-лобулиноподобных доменов в составе химерных белков.

5. Препарат рекомбинантного белка, состоящего из иммуноглобулиноподобного домена LigA с глюкансвязывающим доменом, иммобилизованного на частицах глюкана, активирует гуморальное звено иммунитета и является перспективным компонентом для разработки субъединичной противолептоспирозной вакцины.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность научным руководителям чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Ю.В. Ананьиной и к.б.н. В.Г. Лунину за постоянное внимание, всестороннюю помощь, полученные знания и>навыки.

Искренне признательна сотрудникам лаборатории лептоспирозов НИИ-ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Самсоновой А.П. и Петрову Е.М. за большую помощь, предоставление материалов для исследований, а также прочтение рукописи диссертации. За оказанное содействие и помощь в иммунологической части работы, прочтение рукописи и ценные замечания благодарю в.н.с. лаборатории молекулярной биотехнологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. РАМН Верхов-скую Л.В. Глубокую признательность выражаю заведующей отделением подопытных животных НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН к.б.н: Ветковой Л.Г. за решение организационных вопросов и большую помощь в работе с животными.

За оказанную помощь в работе, прочтение рукописи, критические замечания и ценные советы благодарю сотрудников лаборатории биологически активных наноструктур НИИЭМ им: Н.Ф. Гамалеи РАМН: Галушкину З.М., Полетаеву Н.Н., Халину Т.Е., Сняткову И.Н; Аксенову Е.И., Котнову А.П., Каря-гину А.С., Грабко В.И., Лаврову Н.В., Сергиенко О.В., Рязанову Е.М., Большакову Т.Н., Добрынину О.Ю., Лящука A.M., Павлову Л.К. Искренне признательна с.н.с. лаборатории биологически активных наноструктур к.б.н. Ворониной О.Л. за многочисленные советы, оказанную помощь и поддержку.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, д.м.н. профессору Русаковой Е. В. за помощь при подготовке диссертации к защите.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарапова, Наталья Евгеньевна, Москва

1. Аркадьева Г.Е. Биологическая активность некоторых микробных полисахаридов: Автореф. дисс. докт. биол. наук. Л., 1974. -24 с.

2. Басс-Шадхан Х.Ф. Зимозан: методы получения. Биохимическая характеристика и перспективы применения. Рига.: Зинатне, 1970. - 315 с.

3. Беседнова Н.Н., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н. и др. Иммунотропные свойства 1—>3; 1 —>6-{3-0-глюканов // Антибиотики и химиотерапия. -2000. №2. - С.37-44.

4. Волков И. Ю., Лунина Н. А., Великодворская Г. А. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозилгидролаз (обзор) // Прикладн. Биох. И мик. 2004. - Т. 40. - С. 499-504.

5. Гурвич А.Е. Использование целлюлозных матриц в иммунохимии // Сб. Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. 1986. - С.5-22.

6. Гурвич А.Е., Капнер Р.Б., Незлин Р.С. Выделение чистых антител при помощи фиксированных на целлюлозе антигенов и изучение их свойств // Биохимия. 1959. - Т. 24 - С. 144-156.

7. Гурвич А.Е., Корукова А.А., Эльгорт Д.А. Иммуногенность белково-целлюлозных комплексов // Сб. Молекулярные и клеточные механизмы регуляции иммунитета. 1985. - С. 56-62.

8. Гурвич А.Е., Корукова А.А., Эльгорт Д.А. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице // Сб. Иммуно-модуляторы. 1987. - С. 67-76.

9. Гурвич А.Е., Кузовлева О.Б., Орлов Г.Е. Приготовление иммуносорбен-тов в виде комплекса белковых антигенов с частицами сефадекса // Лаб. дело. 1967. - №12. - С. 732-734.

10. Гурвич А.Е., Кузовлева О.Б., Туманова А.Е. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител // Биохимия. 1961. -Т.26. - С. 934-942.

11. Блинов Н.П. Успехи микробиологии. 1982. Т. 7. - С. 158-177.12.3акенфельд Г.К. Иммунологический- механизм действия полисахаридов дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Рига: - 1990. - 152 с.

12. Калебина, Т.С., Кулаев И.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биологической химии. — 2001.-Т. 41.-С. 105-130.

13. Кашкина М.А. Влияние дрожжевых полисахаридов на иммунологическую реактивность организма: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Л., 1974. 19 с.

14. Корукова А.А., Григорьева О.С., Гурвич А.Е. Использование белково-целлюлозного комплекса для индукции у мышей интенсивного антитело-образования// Бюлл. эксп. мед. и биол. 1985. - Т. 100. - С.44-46.

15. Корукова А.А., Эльгорт Д.А., Гурвич А.Е. Вторичный иммунный ответ у мышей при иммунизации белково-целлюлозным комплексом // Бюлл. экст мед. и биол. 1986. - Т. 102. - С. 736-738.

16. Лебедев В.В., Авдеева М.Г., Шубич М.Г., Ананьина Ю.В., Турьянов М.Х., Лучшев В.И. Иктерогеморрагический лептоспироз. Краснодар:'. Советская Кубань. - 2001. - 208 с.

17. Лептоспирозы людей и животных. Под ред. проф. В.В. Ананьина. М.: Медицина. - 1971.

18. Лунин B.F., Карягина-Жулина А.С., Лящук A.M., Сергиенко О.В., Лаврова Н. В., Родионова Э.В., Кормилицина М:И, Мещерякова И.С., Наро-дицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Патент РФ № 2270249 от 20 февраля 2006.

19. Лунин В.Г., Карягина-Жулина А.С., Тихонова Т.В., Сергиенко О.В., Лаврова Н.В., Лунина Н.А., Зверлов В.В., Великодворская.Г.А. Патент РФ №2278160 от 20 июня 2006 г.

20. Лящук A.M. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной вакцины против туляремии. Дисс. канд.биол.наук. М., 2005. 19 с.

21. Покровский В. И., Онищенко Г. Г., Черкасский Б. Л. Эволюция инфекционных процессов в России в XX веке. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2003.

22. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитиче-ских ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биологической химии. 2000. - Т. 40. - С. 205-266.

23. Скворцов В.Т., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента с ориентированной иммобилизацией Ба^-фрагментов для выделения антигена // Бюлл. эксп. мед. и биол. 1984. - Т.97. - С.179-180.

24. Ada G. Overview of vaccines // Methods Mol Med. 2003. V. 87. - P. 1-17.

25. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages // Annu Rev Immunol. 1999. - Vol. 17. - P. 593-623.

26. Andrades J, Santamaria J, Wu L, Hall F, Nimni M, Becerra J. Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain //Protoplazma. 2001. Vol. 218. - P. 95-103.

27. Arean VM, Sarasin G, Green JH The pathogenesis of leptospirosis: toxin production by Leptospira icterohaemorrhagiae // Am J Vet Res. 1964. - Vol. 25.-P. 836-843.

28. Arnon R, Ben-Yedidia T. Old and new vaccine approaches // Int Immunopharmacol. -2003. Vol. 8. P. 1195-204.

29. Barbosa AS, Abreu PA, Neves FO, et al. A newly identified leptospiral adhesin mediates attachment to laminin // Infect Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 63566364.

30. Barnett Ж, Barnett D, Bolin CA, et al. Expression and distribution of leptospiral outer membrane components during renal infection of hamsters // Infect Immun. 1999. - Vol. 6. -P. 853-861.

31. Barocchi MA, Ко Al, Reis MG, et al. Rapid translocation of polarized MDCK cell monolayers by Leptospira interrogans, an invasive but nonintracellular pathogen // Infect Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 6926-6932.

32. Bergey's manual of systematic bacteriology. Vol. 1.: Williams & Wilkins, Baltimore, Md; In T. Bergan and J. R. Norris (ed.). Methods in Microbiology. - Vol. 11. Academic Press, London, U.K.; Kmety, E., H. Dikken. - 1993.

33. Beutler В. Endotoxin, toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity // Cur. Opin. Microbiol. 2000. - Vol. 3. - P. 23-28.

34. Bonney RJ, Wightman PD, Davies P, Sadowski SJ, Kuehl FAJ, Humes JL: Regulation of prostaglandin synthesis and of the selective release of lysosomal hydrolases by mouse peritoneal macrophages // Biochem J. Vol. 1978. - P. 433-442.

35. Boraston AB, Warren RAJ, Kilburn DG. /?-l,3-Glucan Binding by a Thermostable Carbohydrate-Binding Module from Thermotoga maritima // Biochem. -2001. Vol. 40. - P. 14679-14685.

36. Brendle J, Rogul M, Alexander AD. Deoxyribonucleic acid hybridization among selected leptospiral serotypes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1974. - Vol. 24.-P. 205-214.

37. Brown GD, Gordon S. Immune recognition. A new receptor for beta-glucans // Nature. -2001. Vol. 413. - P. 36-37.

38. Brown GD, Taylor PR, Reid DM, Willment JA, Williams DL, Martinez-Pomares L, Wong SY, Gordon S. Dectin-1 is a major beta-glucan receptor on macrophages // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 196. - P. 407-412.

39. Bulach DM, Kalambaheti T, de la Pena-Moctezuma A, Adler B. Functional analysis of genes in the rfb locus of Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo subtype Hardjobovis // Infect Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 3793-3798.

40. Bulach DM, Kalambaheti T, de la Pena-Moctezuma- A, Adler B. Lipopolysaccharide biosynthesis in Leptospira // J Mol Microbiol Biotechnol.- 2000. Vol. 2. - P. 375-380.

41. Bulach DM, Zuerner RL, Wilson P, et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. - Vol. 103.-P. 14560-14564.

42. Chang Y-F, Chen C-S, Palaniappan RU, He H, McDonough SP, Barr SC, Yan W, Faisal SM, Pan M-J, Chang C-F. Immunogenicity of the recombinant leptospiral putative outer membrane proteins as vaccine candidates // Vaccine.- 2007. Vol.25. - P. 8190-8197.

43. Choy HA, Kelley MM, Chen TL, Moller AK, Matsunaga. J, Haake DA. -Physiological Osmotic Induction of Leptospira interrogans Adhesion: LigA and LigB Bind Extracellular Matrix Proteins and Fibrinogen // Infect Immun. -2007. Vol. 75. - P. 2441-2450.

44. Cinco M, Domenis R, Perticarari S, et al. Interaction of leptospires with murine microglial cells // The new microbiologica. 2006. - Vol. 29. - P. 193-199.

45. Croda J, Ramos JG, Matsunaga J. Leptospira Immunoglobulin-Like Proteins as a Serodiagnostic Marker for Acute Leptospirosis // J Clin Microbiol. 2007. -Vol. 45.-P. 1528-1534.

46. Cullen PA, Cordwell SJ, Bulach DM, et al. Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar Lai // Infect Immun. 2002. -Vol. 70.-P. 2311-2318.

47. Cullen PA, Haake DA, Adler B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes // FEMS Microbiol Rev. 2004. - Vol. 28. - P. 291-318.

48. Cullen PA, Haake DA, Bulach DM, Zuerner RL, Adler B. LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species // Infect Immun. 2003. - Vol. 71. - P. 2414-2421.

49. Cullen PA, Xu X, Matsunaga J, Sanchez Y, Ко AI, Haake DA, Adler B. Surfaceome of Leptospira spp // Infect Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 48534863.

50. Dai B, You Z, Chen Z, Yan H, Fang Z: Protection against leptospirosis by immunization with plasmid DNA encoding 33 kDa endoflagellin of L. interrogans serovar lai // Chin Med Sci J. 2000. - Vol. 15. - P. 14-19.

51. Dertzbaugh MT. Genetically engineered vaccines: an overview // Plasmid. -1998.-Vol. 39.-P. 100-13.

52. Di Carlo F.J., Fiore J.V. On the composition of zymosan // Science. 1958. -Vol. 127.-P. 756-757.

53. Di- Luzio NR, Williams DL, McNamee RB, Edwards BF, Kitahama A. Comparative tumor-inhibitory and anti-bacterial activity of soluble and particulate glucan // Int J Cancer. 1979. - Vol. 24. - P: 773-779.

54. DiLuzio N.R. Springer Semin Immunopathol. 1985. - Vol. 8. - P. 387-400.

55. Dunne, W. M. Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15: - P. 155-166.

56. Einhauer A, Schuster M, Wasserbauer E, Jungbauer A Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion // Protein Expr Purif. 2002. - Vol'. 24. -P: 497-504.

57. Ellinghausen, HC, McCullough WG. Nutrition of Leptospira pomona and growth of 13 other serotypes: fractionation^ of oleic albumin complex- and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. // Am. J. Vet. Res. 1965. -Vol» 26.-P. 45-51.

58. Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product // Mol Cell Biol. 1985. - Vol. 5. - P. 3610-3616.

59. Faine S, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and leptospirosis, 2nd^ed. MedSci, Melbourne, Australia. 1999.

60. Faine S, Stallman ND. Amended descriptions of the genus Leptospira Noguchi 1917 and the species L.interrogans (Stimson 1907) Wenyon 1926 and L. biflexa (Wolbah and Binger 1914) Noguchi 1918 // Int. J. Syst. Bacteriol. -19821 Vol. 32. - Pi 461-463.

61. Faine, S., Adler В., Palit A. Chemical^ serological and biological properties of a serotype-specific polysaccharide antigen in Leptospira II Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1974. - Vol. 52. - P. 311-319.

62. Faisal SM, Yan WW, Chen C-S, Palaniappan RUM, McDonough SP, Chang Y-F. Evaluation of protective immunity of Leptospira immunoglobulin like protein A (LigA) DNA vaccine against challenge in hamsters // Vaccine. -2008. Vol. 26. - P. 277—287.

63. Fitzpatrick FW, DiCarlo FJ. Zymosan // Ann N Y Acad Sci. 1964. - Vol. 118.-P. 233-262.

64. Fletcher MA, Saliou P. Vaccines and infectious disease // EXS. 2000. - Vol. 89.-P. 69-88.

65. Franklin MJ, Ohman DE. Mutant analysis and cellular localization of the Algl, AlgJ, and AlgF proteins required for О acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacterid. 2002. - Vol. 184. - P. 3000-3007.

66. Fuchs KP, Zverlov VV, Velikodvorskaya GA, Lottspeich F, Schwarz WH. Licl6A of Clostridium thermocellum, a non-cellulosomal, highly complex endo-b-l,3-glucanase bound to the outer cell surface // Microbiology. 2003. -Vol. 149.-P. 1021-1031.

67. Guerreiro H, Croda J, Flannery B, Mazel M, Matsunaga J, Reis M, Levett PN, Ко Al; Haake DA. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69.-P. 4958^1968.

68. Gurvich AE, Drizlikh GI. Use of antibodies on an insoluble support for specific detection of radioactive antigens // Nature. 1964. - Vol.203. - P.648-649.

69. Haake DA, Chao G, Zuerner RL, Barnett JK, Barnett D, Mazel M, Matsunaga J, Levett PN, Bolin С A. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection // Infect. Immun. -2000. Vol. 68. - P. 2276-2285.

70. Haake DA, Matsunaga J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins // Infect Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 4936^1945.

71. Haake DA, Mazel MK, McCoy AM, Milward F, Chao G, Matsunaga J. Leptospiral outer membrane proteins OmpLl and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 6572-6582.

72. Haake DA, Suchard MA, Kelley MM, et al. Molecular evolution and mosaicism of leptospiral outer membrane proteins involves horizontal DNA transfer // J Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 2818-2828.

73. Haake DA. Spirochetal lipoproteins and pathogenesis // Microbiology. 2000. -Vol. 146.-P. 1491-1504.

74. Haapala DK, Rogul M, Evans LB, Alexander AD. Deoxyribonucleic acid base composition and homology studies of Leptospira II J. Bacteriol. 1969. - Vol. 98.-P. 421-428.

75. Hamburger ZA, Brown MS, Isberg RR. Bjorkman PJ. Crystal Structure of Invasin: A Bacterial Integrin-Binding Protein // Science. 1999. - Vol 286. -P. 291-295.

76. Han B, Hall F, Nimni M. Refolding of a recombinant collagen-targeted TGF-beta2 fusion protein expressed in Escherichia coli // Protein Expr Purif. 1997. -Vol. 11.-P. 169-178.

77. Hunnicutt DW, Kempf MJ, McBride MJ. Mutations in Flavobacterium johnsoniae gldF and gldG disrupt gliding motility and interfere with membrane localization of GldA // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 2370-2378.

78. Ilan L, Oded S. Cellulose-binding domains. Biotechnological applications // Biotechnology Advances. 2002. - Vol. 20. - P. 191-213.

79. Ito T, Yanagawa R. Leptospiral attachment to extracellular matrix of mouse fibroblast (L929) cells // Vet Microbiol. 1987. - Vol. 15. - P. 89-96.

80. Ito T, Yanagawa R. Leptospiral attachment to four structural components of extracellular matrix // Nippon Juigaku Zasshi. 1987. - Vol. 49. - P. 875-882.

81. Jager W, Rijkers GT. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: A comparison // Methods. 2006. - Vol.38. - P.294-303.

82. Jamas S, Rha C, Sinskey AJ. Glucan compositions and process for preparation thereof. US Patent 4810646. March 7, 1989.

83. Jamas S, Rha C, Sinskey AJ. Glucan compositions and process for preparation thereof. US Patent 5028703. July 2, 1991.

84. Jamas S, Rha C, Sinskey AJ. Glucan compositions and process for preparation thereof. US Patent 5037972. August 6, 1991.

85. Jamas S, Rha CK, Sinskey AJ. Morphology of yeast cell wall as affected by genetic manipulation of P(l—>6) glycosidic linkage. // Biotechnol Bioeng. -1986. Vol. 28. - P. 769-784.

86. Janeway С A, Medzhitov R. Innate immune recognition // Ann. Rev. Immunol. 2002. - Vol.20. - P.197-216.

87. Johnson RC, Faine S. Leptospira. // N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1. Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 1984. P. 62-67.

88. Johnson RC, Harris VG. Differentiation of pathogenic and saprophytic leptospires. 1. Growth at low temperatures // J. Bacteriol. 1967. - Vol. 94. -P. 27-31.

89. Jost BH, Adler B, Faine S. Experimental immunisation of hamsters with lipopolysaccharide antigens of Leptospira interrogans II J Med Microbiol. -1989.-Vol. 29.-P. 115-120.

90. Karpeisky MY, Senchenko VN, Dianova MV, Kanevsky V. Formation and properties of S-protein complex with S-peptide containing fusion protein // FEBS Lett. 1994. - Vol. 339. - P. 209-212.

91. Karsten H, Joanne C. QIAexpress detection and assay handbook // The QIAexpressionist. QIAGEN GmbH, QIAGEN Inc. - 2002.

92. Kelly В A, Carchman RA. The relationship between lysosomal enzyme release and protein phosphorylation in human monocytes stimulated by phorbol esters and opsonized zymosan // J Biol Chem. 1987. - Vol. 262. - P. 17404-17411.

93. Klaasen HL, Molkenboer MJ, Vrijenhoek MP, Kaashoek MJ. Duration of immunity in dogs vaccinated against leptospirosis with a bivalent inactivated vaccine // Vet Microbiol. 2003. - Vol. 95. - P. 121-132.

94. Kmety E., Dikken H. Classification of the species Leptospira interrogans. 1993.

95. Koizumi N, Watanabe H. Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity // Vaccine. 2004. - Vol. 22. - P. 1545-1552.

96. Kraus J, Franz O. Fungal" cell walls and immune response / Ed. J.P. Latge 1991. Berlin; Ser H53. P. 431-444

97. Kulicke WM, Lettau AJ, Thielking H. Correlation between immunological activity, molar mass, and molecular structure of different (1— >3)-beta-D-glucans // Carbohydr Res. 1997. - Vol. 297. - P. 135-143.

98. Kunimoto T, Baba H, Nitta K. Antitumor polysaccharide-induced tumor-regressing factor in the serum of tumor-bearing mice: purification and characterization // J Biol. Response Modif. 1986. - Vol. 5. - P. 225-235.

99. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

100. Lamothe GT, Jolly L, Mollet B, Stingele F. Genetic and biochemical characterization of exopolysaccharide biosynthesis by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. // Arch. Microbiol. 2002. - Vol. 178. - P. 218228.

101. Lee SH, Kim S, Park SC, Kim MJ. Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a pore-forming protein on mammalian cells // Infect Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 315-322.

102. Lee SW, Cooksey DA. Genes expressed in Pseudomonas putida during colonization of a plant-pathogenic fungus // Appl Environ Microbiol. 2000. -Vol. 66.-P. 2764-2772.

103. Letocart M, Boerlin P, Boerlin-Petzold F, Goudet J, Baranton G, Perolat P. Genetic structure of the genus Leptospira by mutlilocus enzyme electrophoresis // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - Vol. 49. - P. 231-238.

104. Levett PN. Leptospirosis // Clin Microbiol Rev. 2001. - Vol. 14. - P. 296-326.

105. Liljeqvist S, Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines // J Biotechnol. 1999. - Vol. 73. - P. 1-33.

106. Matsunaga J, Sanchez Y, Xu X, Haake DA. Osmolarity a key environmental signal controlling expression of leptospiral proteins LigA and LigB and the extracellular release of LigA // Infect Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 70-78.

107. Matsunaga J, Young ТА, Barnett JK, Barnett D, Bolin CA, Haake DA: Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31-kilodaltongrowth-phase-regulated peripheral membrane protein // Infect Immun. 2002. -Vol. 70.-P. 323-334.

108. Matsuo K, Isogai E, Araki Y: Control of immunologically cross-reactive leptospiral infection by administration of lipopolysaccharides from a nonpathogenic strain of Leptospira biflexa II Microbiol Immunol. 2000: -Vol. 44.-P. 887-890.

109. McBride AJ, Athanazio DA, Reis MG, Ко Al. Leptospirosis // Curr Opin Infect Dis. 2005. - Vol. 18. - P. 376-386.

110. McCormick M, Berg J. Purification and S-Tag detection of CBD fusion proteins // innovations. 1997. - Vol. 7. - P. 12-15.

111. Merien F, Baranton G, Perolat P. Invasion of Vero cells and induction of apoptosis in macrophages by pathogenic Leptospira interrogans, are correlated with virulence // Infect Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 729—38!.

112. Merien F, Truccolo J> Baranton1 G, Perolat P. Identification of a 36-kDa fibronectin-binding protein expressed by a virulent variant of Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae // FEMS Microbiol Lett. 2000. -Vol! 185.-P. 17-22.

113. Midwinter, A, Faine S, Adler B: Vaccination of mice with lipopolysaccharide (LPS) and LPS-derived immuno-conjugates from Leptospira interrogans // J Med Microbiol. 1990. - Vol. 33. - P. 199-204.

114. Midwinter A, Vinh T, Faine S, Adler B: Characterization of an antigenic oligosaccharide from Leptospira interrogans serovar pomona and its role in immunity // Infect Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 5477-5482.

115. Miura T, Ohno N, Miura NN, Adachi Y, Shimada S, Yadomae T. Antigen-specific response of murine immune system toward a yeast (3-glucan preparation, zymosan // FEMS Immunol. Med.Microbiol. — 1999. — Vol. 24. — P. 131-139

116. Nahori MA, Fournie-Amazouz E, Que-Gewirth NS, Balloy V, Chignard M, Raetz CR, Saint Girons I, Werts C. Differential TLR recognition ofleptospiral lipid A and lipopolysaccharide in murine and human cells // J Immunol. -2005. Vol. 175. - P. 6022-6031.

117. Naiman BM, Alt D, Bolin CA, Zuerner R, Baldwin CL. Protective killed Leptospira borgpetersenii vaccine induces potent Thl immunity comprising responses by CD4 and gammadelta T lymphocytes // Infect Immun. 2001. -Vol. 69.-P. 7550-7558.

118. Nally JE, Artiushin S, Timoney JF. Molecular characterization of thermoinduced immunogenic proteins Qlp42 and Hspl5 of Leptospira interrogans // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69. - P. 7616-7624.

119. Nally JE, Chow E, Fishbein MC, Blanco DR, Lovett MA. Changes in lipopolysaccharide О antigen distinguish acute versus chronic Leptospira interrogans infections // Infect Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 3251-3260.

120. Nally JE, Whitelegge JP, Bassilian S, Blanco DR, Lovett MA. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75. - P. 766-773.

121. Nascimento AL, Ко Al, Martins EA. L. et al. Comparative Genomics of Two Leptospira interrogans Serovars Reveals Novel Insights into Physiology and Pathogenesis // J Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 2164-2172.

122. Nascimento AL, Verjоvski-Almeida S, Van Sluys MA. et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni // Braz J Med Biol Res. 2004. - Vol. 37. - P. 459-478.

123. Nauseef WM, Root RK, Newman SL, Malech HL: Inhibition of zymosan activation of human neutrophil oxidative metabolism by a mouse monoclonal antibody // Blood. 1983. - Vol. 62. - P. 635-644.

124. Nelson KE, Paulsen IT, Heidelberg JF, Fraser CM. Status of genome projects for nonpathogenic bacteria and archaea // Nat Biotechnol. 2000. -Vol. 18.-P. 1049-1054.

125. Nygren PA, Stahl S, Uhlen M. Engineering proteins to facilitate bioprocessing // Trends Biotechnol. 1994.1- Vol. 2. - P. 184-188.

126. Ozinsky A, Smith KD, Hume D, Underhill DM. Co-operative induction of pro-inflammatory signaling by Toll-like receptors // J Endotoxin Res. -2000. Vol. 6. - P. 393-396.

127. Palaniappan RU, Chang YF, Jusuf SS, et al. Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein» of Leptospira interrogans // Infect Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 5924-5930.

128. Palaniappan RU, Ramanujam S, Chang Y-F. Leptospirosis: pathogenesis, immunity, and diagnosis // Curr Opin Infect Dis. 2007. - Vol. 20.-P. 284-292.

129. Palit A, Haylock LM, Cox JC. Storage of pathogenic leptospires in liquid nitrogen // J. Appl. Bacteriol. 1986. - Vol. 61. - P. 407-411.

130. Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors and acquired immunity. // Semin. Immunol. 2004. - Vol. 16: - P. 23-26.

131. Paster В J, Dewhirst FE, Weisburg WG, Tordoff LA, Fraser GJ, Hespell RB, Stanton ТВ, Zablen L, Mandelco L, Woese CR. Phylogenetic analysis of the spirochetes // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 6101-6109.

132. Patchen ML, D'Alesandro MM, Brook J. et al. // J Leukocyte Biol. -1987,-Vol. 42.-P. 95-105.

133. Patchen ML, MacVitte TJ, Brook J. et al. 10th Intern Congr Reticuloendothelial Soc/ Japan, Sept 2-7. 1984. II J Leukocyte Biol. 1984. -Vol. 36.-P. 228-229.

134. Picardeau M, Bulach DM, Bouchier C, et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis // PLoS One 2008. 3:el607

135. Pillemer L, Ecker EE. Anticomplementary factor in fresh yeast // J: Biol. Chem. 1941. - Vol. 137. - P. 139-142.

136. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation // Nature. 1975. -Vol. 258.-P. 598-599.

137. Postic D, Riquelme-Sertour N, Merien F, Perolat P, Baranton G. Interest of partial 16S rDNA gene sequences to resolve heterogeneities between Leptospira collections: application to L. meyeri // Res. Microbiol. 2000. -Vol. 151.-P. 333-341.

138. Preston A, Parkhill J, Maskell DJ. The bordetellae: lessons from genomics. // Nat Rev Microbiol. 2004. - Vol. 2. - P. 379-390.

139. Priya CG, Bhavani K, Rathinam SR, Muthukkaruppan VR: Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis // J Med Microbiol. 2003. - Vol. 52. - P. 667-673.

140. Rabinovich ML. // Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms. Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. Pushchino. 1984. - P. 31—48.

141. Ramadass PD, Jarvis BD, Corner RJ, Cinco M, Marshall RB. DNA relatedness among strains of Leptospira biflexa II Int. J. Syst. Bacteriol. -1990. Vol. 40. - P. 231-235.

142. Ramadass PB. Jarvis DW, Corner RJ, Penny D, Marshall RB. Genetic characterization of pathogenic Leptospira species by DNA hybridization // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - Vol. 42. - P. 215-219.

143. Ramesh RH, Tharanathan RN. Carbohydrates the renewable raw materials of high biotechnological value // Crit Rev Biotech. - 2003. - Vol. 23. -P. 149-173.

144. Ren SX, Fu G, Jiang XG. et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole genome sequencing // Nature. - 2003. - Vol. 422. - P. 888-893.

145. Roubin R, Mencia Huerta JM, Landes A, Benveniste J. Biosynthesis of platelet-activating factor (PAF-acether). IV. Impairment of acetyl-transferase activity in thioglycollate-elicited mouse macrophages // J Immunol. 1982. -Vol. 129.-P. 809-813.

146. Saier M, Garcia-Lara J. The spirochetes: molecular and cellular biology. Wymondham, UK: Horizon Scientific Press. 2001.

147. Sambrook JE, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1989. lst.2nd,3th v's.

148. Sanguedolce MV, Capo C, Bongrand P, Mege JL. Zymosan-stimulated tumor necrosis factor-a production by human monocytes. Down-modulation by phorbol ester // J Immunol. 1992. - Vol. 148. - P. 2229-2236.

149. Sasaki T, Hohenester E, Gohring W, Timpl R. Crystal structure and mapping by site-directed mutagenesis of the collagen-binding epitope of an activated form of ВМ-40/SPARC/osteonectin // EMBO Journal. 1998. - Vol. 17.-P. 1625-1634.

150. Schmidt TG, Koepke J, Frank R, Skerra A. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, Streptavidin< // J Mol Biol. 1996. - Vol. 255. - P. 753-766.

151. Schmidot TG, Skerra A. The random peptide library assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment // Protein Eng. 1993. - Vol. 6: - P. 109-122.

152. Schroder NW, Eckert J, Stubs G, Schumann RR. Immune responses-induced^ by spirochetal outer membrane lipoproteins and' glycolipids // Immunobiology. 2008. - Vol. 213. - P. 329-340.

153. Seixas FK, da Silva EF, Hartwig DD et al. Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the LipL32 antigen of Leptospira interrogans protects hamsters from challenge // Vaccine. 2007. - Vol. 26. - P. 88—95.

154. Shang ES, Exner MM; Summers ТА, Martinich C, Champion CI, Hancock RE, Haake DA. The rare outer membrane protein, OmpLl, of pathogenic Leptospira species is a heat-modifiable porin // Infect. Immun. -1995.-Vol. 63.-P. 3174-3181.

155. Sietsma JH, Wessels JG. Solubility of (1 leads to 3)-beta-D/(l leads to 6)-beta-D-glucan in fungal walls: importance of presumed' linkage between glucan and chitin // J of Gen Microbiol. 1981'. - Vol. 125. - P. 209-212.

156. Silhavy TJ, ShumanHA, Beckwith.J, Schwartz M. Use of gene fusions to study outer, membrane protein localization in Escherichia coli // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5411-5415.

157. Smith. JC, Derbyshire RB, Cook E, Dunthorne L, Viney J, Brewer SJ; Sassenfeld HM, Bell LD. Chemical'synthesis and cloning of-a poly(arginine)-coding gene fragment designed to aid polypeptide purification //Gene. 1984. -Vol. 32.-P. 321-327.

158. Sonrier C, Branger C, Michel V, Ruvoen-Clouet N, Ganiere JP, Andre-Fontaine G. Evidence of cross-protection wiibm Leptospira interrogans in'an experimental model. // Vaccine. 2000. - Vol: 19. - P: 86-94.

159. Springer T. A. Folding of the N-terminal, ligand-binding region, of integrin alpha-subunits into a beta-propeller domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 65-72.

160. Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JW, Fuerst TR, Niles EG, Moss B: Use of T7 RNA polymerase to direct expression of genes // Methods: Enzymol: Companion Methods. 1990: - Vol. 185. - P. 60-89.

161. Suga T, Maeda YY, UshidaH, Rokutanda M, Chihara G. Macrophage-mediated acute-phase transport protein production induced by lentinan // Int J Immunopharmacol. 1986. - Vol. 8. - P. 691-699.

162. Takagi J, Asai H, Saito Yu. A collagen/gelatin-binding decapeptide derived from bovine propolypeptide of von Willebrand factor // Biochem. -1992. Vol. 31.-P. 8530-8534.

163. Takeda K, Akura S. Toll-like receptors in innate immunity // Int. Immunol. 2005. - Vol. 17. - P. 1-14.

164. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl Microbiol Biotechnol. 2003. Vol. 60. - P. 523-33.

165. Tomme P, Boraston A, McLean B, Kormos J, Creagh AL, Sturch K, Gilkes NR, Haynes CA, Warren RA, Kilburn DG Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains // J Chromatogr B. 1998. - Vol. 715. P. 283-296.

166. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

167. Trueba G, Zapata S, Madrid K, Cullen P, Haake D. Cell aggregation: a mechanism of pathogenic Leptospira to survive in fresh water // Int Microbiol. -2004.-Vol. 7.-P. 35-40.

168. Turner LH. Leptospirosis Ш. Maintenance, isolation and demonstration of leptospires // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1970. - Vol. 64. - P. 623646.

169. Underhill DM, Ozinsky A, Hajjar AM et al. The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens // Nature. 1999. - Vol. 401. - P. 811-815.

170. Underhill DM. Macrophage recognition of zymosan particles // J Endotoxin Res. 2003. - Vol. 9. - P. 176-180.

171. Verma A, Artiushin S, Matsunaga J, et al. LruA and LruB, novel lipoproteins of pathogenic Leptospira interrogans associated with equine recurrent uveitis // Infect Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 7259-7266.

172. Verma A, Hellwage J, Artiushin S, et al. LfhA, a novel factor H-binding protein of Leptospira interrogans // Infect Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 2659-2666.

173. Vernel-Pauillac F, Merien F. Proinflammatory and immunomodulatory cytokine mRNA time course profiles in hamsters infected with a virulent variant of Leptospira interrogans // Infect Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 4172^179.

174. Vinh T, Adler B, Faine S. Ultra structure and chemical composition of lipopolysaccharide extracted from Leptospira interrogans serovar Copenhageni // J GenMicrobiol. 1986. - Vol. 132. - P. 103-109.

175. Vinh TU, Shi MH, Adler B, Faine S. Characterization and taxonomic significance of lipopolysaccharides of Leptospira interrogans serovar hardjo // J Gen Microbiol. 1989. - Vol. 135. - P. 2663-2673.

176. Volman JJ, Ramakers JD, Plat J. Dietary modulation of immune function by (3-glucans // Physiology & Behavior. 2008. - Vol. 94. - P. 276-284.

177. Waitkins S. Maintenance of Leptospira, // In В. E. Kirsop and J. J. S. Snell (ed.), Maintenance of microorganisms. Academic Press, London, U.K. 1984.-P. 57-62.

178. Wang Z, Jin L, W^grzyn A. Leptospirosis vaccines. Review. Microbial Cell Factories 2007, 6:39. BioMed Central. http://www.micr0bialcellfact0ries.c0m/c0ntent/6/l/39

179. Werts C, Tapping RI, Mathison JC, et al. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-dependent mechanism // Nat Immunol. 2001. -Vol. 2.-P. 346-352.

180. Whitfield С, Roberts IS. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. -P. 1307-1319.

181. Williams DL. Overview of (1—»3)-beta-D-glucan immunobiology // Med Inflamm. 1997. - Vol. 6. - P. 247-50.

182. Xu Z, Bae W, Mulchandani A, Mehra RK, Chen W. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose // Biomacromolecules. 2002. Vol. 3. - P. 462-465.

183. Yang CW, Hung CC, Wu MS, et al. Toll-like receptor 2 mediates early inflammation by leptospiral outer membrane proteins in proximal tubule cells // Kidney Int. 2006. - Vol. 69. - P. 815-822.

184. Yang CW, Wu MS, Pan MJ, et al. The Leptospira outer membrane protein LipL32 induces tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression in mouse proximal tubule cells // J Am Soc Nephrol. 2002. - Vol. 13. - P. 2037-2045.

185. Young SH, Ye J, Frazer DG, Shi X, Castranova V. Molecular mechanism of tumor necrosis factor-alpha production in 1—»3-beta-glucan (zymosan)- activated macrophages // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 20781-20787.

Информация о работе

Шарапова, Наталья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы