Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ ПИЩЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ ЦИНКА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ ПИЩЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ ЦИНКА"



И а правах рукописи

МУНХУУ БАЯРЖАРГАЛ

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ ПИЩЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ ЦИНКА

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

Рябо 111 вмнплнени в лаборатории фишоло! ни и бномсинн и ншив»реимя ГУ (I я у ч м<1-псслсд овятел ьс кою Институт» шпаиия Российской! Академия медицинских ияук (руководитель лаборатории - доктор биологических наук, профессор ».К.Маю) и Московском Государственном университете прикладной

ЛцОТСХНОЛО! 11)1

Няучнмй руководитель:

доктор химических наук, профессор

Официальные ошюишы;

локтор химических наук, про (¡»с ссор доктор медицинских наук, профессор

Розан цен Эдуард Григорьевич

Руши Лев Давидович Голу бев Ми\аи.1 Аркадьевич

Веду ищи »рениимиия: Институт биохимической физики Российской Академии наук

ИМ. М.М.Эмми!|>1ДЯ

защита состоится « ни часедании Диссертационного

Сонета Л 001,002,01. в ГУ НИИ питания РАМИ но адресу: 109240, Москва, Устьинский проем, д. 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН А и

\1т>ре<|«рат разослан <</% 2007 г.

УчснмМ секретарь Диссертационного Совета: диктор биологических наук, профессор

В, М, Коленном

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Концепция оптимального питания предполагает в качестве од! toi-о из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма, как макро-, так и м икроиутр не нтам и, в том числе и эссенпнаньными микроэлементами, в частности цинком. Биохимические механизмы действия цинка связаны с участием в построении к функционировании более 200 ферментов, катализирующих различные метаболические процессы, включающие синтез и распад углеводов, жиров, белков и нуклеиновых кислот. Неоптимальная обеспеченность организма данным микроэлементом приводит к задержке роста, развития, полового созревания; снижению иммунитета. репродуктивной функции; нарушениям кроветворения, вкуса и обоняния; ухудшению репарации ран н другим нарушениям.

На основании исследований, проведенных ФАО, установлено, что около 20% населения мира имеют риск неадекватной обеспеченности цинком [Wuehler S,E„ Peerson J.M.. Drown K.H., 2005]. Согласно данным эпидемиологических исследований, проведенным в ряде регионов Российской Федерации, имеет место высокая частота встречаемости недостаточной обеспеченности цинком, особенно у детского населения

[Скальный A.B., 1999; Конь И.Я,, Копытько М.В., Алешко-Ожепский Ю.П., 2001). В связи с этим весьма актуальной является задача профилактики и диетической коррекции недостаточной обес печен мости этим эссенциальным для организма человека микроэлементом путем использования в питании дополнительны* источников ЦННКЦ в составе специализированных пищевых продуктов и биологически актишнях добавок к нише.

Обогащение пищевых продуктов микрону триентамч является серьезным вмешательством в сложившуюся структуру питания человека, н, следовательно, к дополнительным источникам эссен цнальных микроэлементов должны предъявляться по в ы шейные требования, обеспечивающие как их полную безопасность, так it достаточную эффективность.

Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет эссенциальлые микроэлементы, в том числе цинк, ц составе растительных и животных продуктов и. что наличие аминокислот и пептидов, а также белка животного происхождения способствуют лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами цинка, Одним иэ возможных вариантов решения проблемы поиска новых источников) органических форм эссен цнальных катион ных микроэлементов явля пан .комнлщ^^^н^^^^иищшп.шп' структурами, образующимися в результате ферм

ЦНБ имени Н И, Железнова, Фонд научный литературы

J52_JLLHj^ ..

Целью длимой pa Поты ЯЛИЛИСЬ получение новых шгшевых ИСТОЧИ И КО 1) органических форм цинка, их комплексная фпліко-хпм пчес пая, физцодого-биолнмичеекзя характеристика и экспериментальная оценка возможности использования этих пищевых источников для профилактики и диетической коррекции недостаточности данного микроэлемента,

OtiioniiMt inj «а чи іісслцоііяііііі)

1. Оптимизировать условия ферментативного гидролита пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яііна, июлята соевых Сіелков) для дальнейшего нспольмнания ферм емтолі патов при получении новых пише вы х источников цинка.

2. Получить комплексы ферментативных шдролнэатоа вышеперечисленных пищевых белков с пинком, охарактернювать моле кул ярко-массовое распределение пептидным фракций в составе комплексов и определить в них содержание цинка,

3. П исследовании in vitro оценить ami і генные свойства ферментативных гндролтатов лишених белков н их комплексов С ЦИНКОМ.

4. Количественно охарактершшать протекание реакции системной анафилаксии к модельному антигену - о вальСу мину у крыс, получавших с кормом комплексы и инка с ферментативными гндролніатами пищевых белков.

i. Ох а ра кте р і по вать всасывание и ретенцию цинка в форме комплекса с ферментативным підроліиатом белкой корового молока у лабораторних животам* (крыс) в условиях недостаточного потребления этого микроэлемента.

{Ї. Дать сравнительную опенку эффективности потребления лабораторными животными (крысомн). предпарптельно получавшими цин«дефицитный корм, органической формы пинка - комплекса ферментативного гндролизата белков коровьего молока с этим микроэлементом и сульфата цинка.

Научная нощпма

Определены оптимальные условия і ферментативного гид ролі па пнвіевьіх белков (копкентрата белков корош>его молока, белка куриного яйца, толята соевых белков) дія ИХ последующего КОМПЛСІССИрОВаїІНЯ С ЦИНКОМ в целях получения новых пищевых источником 'ЭТОГО микроэлемента.

Охарактеризовано молекулярно-массовое рас и ре деление пептидных фракиніі и соодве комплексов <]>срментатпвіімч гпдролнчатов пищевых белков с цинком к определено фракционное содержанке этого микроэлемента.

II опытах in vitro установлено практически полное отсутствие в составе комплексов ферментативных гндролтатов пишевых белков с цинком антигенных детерминант,

взаимодействующих с антителами к пищевым белкам в сыворотках крови лете П. страдающих пишевой непереносимостью.

В опытах in vivo установлено, что длительный пероральный прием ком апексов пинка с ферментативными гидролшагами пищевых белков не влияет на тяжесть проявлений реакинП системной анафилаксии у лабораторных животных (крыс), многократно сенсибилизированных модельным антигеном (анафилактогеиом) — о пальбу ми ном.

Количественно охарактеризованы всасывание и ретенция органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гид рол шагом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления ими этого микроэлемента.

Дана сравнительная оценка эффективности использования нового пищевого источника органической формы цинка (его комплекса с ферментативным гидроллмтом белков коровьего молока) ti сульфата цинка в «восстановительном» питании крыс, предварительно получавших в течение И дней цнн «дефицитный полу синтетический корм.

Практическая значимость

Предложенные для лабораторных условий схемы проведения процессов фермента'швного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровье™ молока, белка куриного яйца, июлята соевых белков) могут быть использованы дчд разработки схем промышленного получения пищевых ферментативных гидролиза™» перечисленных белков. Полученные таким способом (¡юрмснтативлыс гилролшаты при ко индексировании с цинком представляют co6ofi новые пищевые источники органических форм этого мнкронутриента.

Высокое содержание в составе напученных комплексов цинка и отсутствие сенсибилизирующих и аллергизируюших свойств свидетельствуют о возможных перспективах их использования в целях алиментарноП профилактики случаев недостаточной обеспеченности этими млкронутриентами детского и взрослого населения. На примере органического соединения пинка - его комплекса С ферментативным гнлролнзатом белков коровьего молока предложен и апробирован метод оценки всасывания и ретенции микроэлемента в опытах на лабораторных животных (крысах). Метод может найти свой применение для характеристики биодоступности ртлнчных пишевых источников микро- и макроэлементов.

AitpofiauiiH работы

Основные положения и результаты работы были представлены н обсуждены на XIII международно!! конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и зкологии». Украина. Крым, Ялта-Гурзуф, 2005 г.: на 7-ом Международном Славя и о-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург — Гастро 2005»: па XI Российской гастроэнтерологической неделе, Москва. 2005г.; на VIH Всероссийском конгрессе (і Оптимальное питание — здоровье нации», Москва, 2005г; на 1 Всероссийском еі>озде диетологов и нутрнцнологон «Диетология; проблемы и горизонты», Москва, 2006.

llyfi.l ПК'» IIIIII

По результатам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах и 5 публикаций в сборниках научных ірулов,

О бьем к структура л нее« рта unit

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов н методов исследования, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 33 российских и 108 зарубежных источников. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 9 рисунком,

Материалы н методы ксслелоплиня

11 работе использовали коммерческие пищевые белки: концентрат белков коровьего молока (ЗАО «Компания Нутритек», Россия), белок куриного яііца (выделен из свежих Кориных яин). изолят соевые бемітів («РТІ», Китай); хлорид цинка ZnClj (х.ч.): сульфат ниика /nSOj*7l 1;0 (ч.д.а.), Ферментативный гидролиз указанных белков проводили с использованием коммерческих ферментных препаратов «Флавоэизим» ("Flavourzytne", Novo/ymes. Дакия) н «Панкреатин» < Са н кт-1Ісіербургекм ¡1 мясокомбинат «Самсон», Россия) но одно- или .чвухстадийпой схеме с варьированием фермент-субстратного соотношения. времени гидролиза. изменения pll реакционной среды н последовательности применения ферментных препаратов.

Экспериментальные исследования выполнялись в ГУ НИИ питания РАМН и лаборатории физиологии и биохимии пищеварения (руководитель лаборатории -профессор O.K. Мазо).

Полученные ферментативные пшролизаты подвергали ультрафильтрании на установке «Мин тан» («МіІІіроге», США) с использованием работающих в

тангенциальном потоке мембран (диаметр пор 10 кД). Для получения комплексен с и» и ком использовали низкомолекуляриые фракции (молекулярная масса < 10 кД) ферментативных гидродизатое пишевых белков (ФГПБ): белков коровьего молока, белка куриных яиц, изолята соевых белков, обозначаемых в дальнейшем, соответственно, как ФГБКМ, ФГБКЯ, ФГИСЕ.

Для получения комплексов цинка с ФГБКМ, ФГБКЯ, ФГИСБ была использована схема, направленная на удаление из конечного продукта свободных ионов цинка и выделение собственно связанных с пептидными фракциями ионов тгого микроэлемента (см. раздел «Результаты исследований и и\ обсушен иен). Полученные растворы лнофилыщ высушивали н чагем определяли в них содержание иннка шомно-айсорбционным или инверсиоино-вольтамперометрическим методом.

Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе ФГБКЯ и комплексах Zn-ФГБКЯ оценивали методом зкеклюзионной хроматографии среднего давления на колонке TSK GEL 2000 SWLX (0,8x30 см) фирмы «Toyo Soda» (Япония); для ФГЬК'М н ФГИСБ, а также комплексов Zii-ФГБКМ и Zn-ФГИСБ применялась колонка Superóse 12 (1,6>;50 см), («Pharmacia», Швеция), Оптическую плотность злюирусмого раствора регистрировали, используя проточный ультрафиолетовый детектор с длиной волны 280 нм. В качестве элюента использовали буферный раствор (рН 6,8) 0,05 М К1 hPOj, содержащий 0,15 М NaCl и NaNi или раствор (рН 6,5), содержащий 0,2 М NaCI и NaN,. Скорость элюирования составляла 0,2 мл/мин.

Количественное содержание пептидных фракций в анализируемых ФГЇІБ и комплексах Zn-ФГПБ оценивали интегрированием полученных хроматограмч вееоным методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматограф и ческой колонки. Для определения содержания шинка в отдельных фракциях проводили отбор фракцій) объемом 10 мл, содержание цинка определяли инперсионно-вольтампериметрическим методом.

Хромато графические аналитические исследования получаемые препаратов проведены совместно со старшим научным сотрудником ГУ НИИ питания РЛМИ, кандидатом биологических наук С.НЗориным.

При проведении исследований in vitro по оценке антигенных свойств ФП1Б и комплексов Zn-ФГПБ использовали сыворотки крови" детей, страдающих различными (¡юрмами пищевой непереносимости и демонстрирующих в большом числе случаев высокие титры циркулирующих lgG антител к различным пищевым белкам, В сыворотке крови определяли титры циркулирующих специфических lgG антител против ФГТ1Б и

* Сиворотки крови, полученные Ft \одс Надписанного арачоч |ГЛ имн.к о /і;іГк^-.;г,'г |иіик> пбслсдоьшяия, предоставлены КДЦ «Детское питание» при ЗАО «Компания Нутріггек», г. MotM*a 1 МП л м н. Л.Г.Мачоиовя)

микромементпых п(кмик'сов, содержащих в своем составе комплексы Zn-ФГПБ. методом непрямого твердофашого и м му поферме н тного анализа. Соотношение ЭМ (Zn. Си, Ми. С г) н составе каждого прем икса соотегстновпдо соотношениям при адекватном уровне нофеблення человеком всех четырех 'JM. Компоненты премиксов представляли собой комплексы ЭМ с пептидной фракцией ферментативных гидрат патов пищевых белков (ФГПБ), очищенные методом мембрашюП нанофнльтрации,

fice пм.муноно(|>ерментные определения в диссертационной работе проведены совместно с ведущим научным сотрудником ГУ МНИ пнтания РАМН, доктором биологических наук II.В. Гмошпнскнм,

Для опенки ал лер гнчнру кшшх свойств новых источников цинка в опытах in vivo нагодьтовали модель системной анафилаксии согласно [Stokes C.R. eí al.. 1987] с незначительными модификациями. И селедок:»! не проводили на крыса\-Самцах линии Ппстар. Оценивали влияние рациона, дополненного мнкроэлементнымн премиксами, содержащими комплексы Zn-ФГПБ, на тяжесть анафилактического шока it уровень циркулирующих спеипфнческп.х антител к ои&пьбумцну у крыс, сенсибилизированных* HT1М белком, Жипотиые опытных групп получали с кормом в течение 29 дней дочы микртяемеитпых премиксов, соответствовавших 0,075 мг цинка на одну крысу в сутки. Величину анафилактического индекса рассчитывали согласно [Weigle W„ 19601 как среднее арифметическое балльных оценок тяжести анафилаксии по группе по данным наблюдения черсч 24 часа посте введения разрешающей дочы. Интенсивность гуморального иммунного ответа оцеииваш по концентрации циркулирующих специфических lg.G антител (суммы фракций IgGi и IgGj) с помошыо непрямот твердофачнот иммуноферментного теста (El,ISA) на полистироле. При этом были иенодьюнапы кроличьи антитела к IgGi-j крысы, кот.югнрованные с пероксидаюМ (1Ш1ПМ им. П,Ф.Гамалеи РАМП),

Для оценки биодоступпостн иника и) комплекса Zn-ФГБКМ у лабораторных жппотых (крысы лшиш Вистар) использовали иокачатели по аналогии с применяемыми в балансовых исследованиях ко>фф|шие1ГП>ми усвояемости белка [Высоцкий 11.Г. и др.. 1976]

t-F l-U-F l-U-F

..............ftS„„%--------------ERS,,."i -------------

1 1 (-F

Коэффициент кажушсеоса К.'^Ьнilнгит к.нушЫся Коэффициент гачгушейси эффективной

pCïllLf.EHLHIHH ретенций ретенинн

где 1 - ынглошая лом иин*а; F - вел нчнна суточной экскреийй I.M • |К а с фекдоиямн после fiit'ie»! и а препарата II н h к а. 1-ll:'.| -I IM '1.1 LV1 |V и н . ' С ЧК J и и цинка с чочой (юсле введения прешфата ийНЬ'й

ислк'ишу всасывания tt ретеншш цннка m Zn-ФГБКМ, характеризующих Счтдостут гость, рассчитывали на основании определения цинка, окскретнруемого f>

животными с калом )t мочой в течение суток после и веден ной внутрижслудочно через ЗОНД дозы 270 мкг цинка на крысу. Животные предварительно до этого в течение 11 дней потребляли пол у сн I гтетич ескн (1 корм с пониженным содержанием цинка (1,3 мг/кг).

Для сравнительной оценки -эффективности использования Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс) моделировали у них недостаточное потребление цинка с использованием полу синтетического корма, рекомендованного НИИ питания (приказ МЗ СССР, №) 179 от 10,10,83), в котором белковый компонент (казеин) был заменен на эквивалентное по азоту количество концентрата сывороточных белков' молока, и исключением т рецептуры coneeoff смеси соли цинка. Содержание иинка в базовом полу синтетическом корме составляло 1,3 мг/кг. В эксперименте использовали крыс-самцов линии В »стар с исходной массой тела 140-150 г. Животные группы KjI и №2 в течение 28 дней потребляли. соотвегственно, (шочый иодуеннгетпческнй корм, дополненный 12 mi/кг цинка в форме Zn-ФГБКМ, н бе» его дополнения: животные группы №3 и „Чй в чеченце 14 дней получали корм с пониженным содержанием иинка, а затем и течение 14 днеП 0а юный нолуситетнческиЯ корм дополняли Zn-ФПЖМ и ZnSOj 7НгО соответственно в расисте 12 мг пинка/кг корма. На 29-Й день ж и нотных забивали, собирали кровь ддх определения активности шел очной фосфатачы, определяли массу внутренних органов (тимуса, печени, почек, селезенки, семенников), отбирали правую бедренную кость (oi femoris) для определения содержания цинка. Общую активность шелочной фосфаташ в сыворотке крови определяли с помощью аналитического набора («Ольвекс», Россия).

Содержание шшка в комплексах н биологических образна* (моча, фекатлн, кости) определяли с использованием метода атомно-абсорбиионной спектрометрии совместно с научными сотрудниками лаборатории химии пищевых продуктов ГУ НИИ питания РАМН кандидатом биологических наук Л.В.Шевяковой и Н,Н.Маховой, а также методом MHiiepCHOHHofi вол ьтамперометр кн.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов программ MS EXCEL ХР и SPSS 11.5 для Windows. Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандарты ми ошибками, представленными как М±т. Достоверность различий значений средних уровней исследуемых показателей определяли с использованием двухстороннего t-тсста Стьюдента. Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений рассматриваемых показателей с помощью йена рам епрического рангового критерии Манна-Унгши. Различия признавались за достоверные на уровне значимости Р<0,05,

" Автор благодарит к.т.н, В.И. Кругл и ка, предостаииишего дли нссдсдооанш концентрат сывороточных Оедкон молока

1'еПЛ ЬРЛТМ НСГ. )СЛОШН11М| и их обсу ждение I. II«лучаше ферменгаишных гидролиза гол пищевых белков.

Традиционно используемые п питании белки коровьего молока, куриного яйца н июлят соевых белков (5мли выбраны для проведения ферме! ¡гатив но го пщродиза с (¡елью дальнейшею использования фер ментол изато в для комплекенроаания с цинком. Проведение ||юрмеитатипиого пицххот», являясь щадящим процессом по сравнению с кислотным гидролизом, позволяет пере песта белковый материал в хорошо растворимые пептидно-аминокислотные смеси. что увеличивает возможности связывания микроэлемента с органическим лигакдом. С целью получения гидролизата с максимальным содержанием ншкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать комплексы с цинком, были отработаны оптимальные условия для проведения гидролиза вышеуказанных пищевых белков.

При полукчтн гнлрол шагов белков коровьего молока (БК'М) применяли схему одностадийного гидролиза при значении рИ 7,3 н температуре 5(ГС с использованием <|ирмснтног1> препарата «Панкреатина», В табл. I прнпедено изменение молекулярио-массового распределения пептидных фракций в составе (]>ер мен тол излтов в ходе гидролиза БК'М «Панкреатином» в зависим ости от времени гидролиза и фермент-субстратного соотношения.

Таблица 1

Молекулярно-массовое распределение пептидны?; фракций в составе _гидрол'патов белков коровьего молока_

№ Орем я гидролиза. Диапазон молеку лярных масс. кД Концентрация фермента (% от массы белка)

мни 1.5% 3,0% 6.0% 9.0%

1. 120 более 138 5.5 1.6 и 0,2

138-10,5 17.6 10,8 5.1 5.6

10.5-5.1 17.0 19,9 16.2 19,9

5.1 -2.8 18,9 18.7 18.7 17.9

2.8 - 1.0 21.5 23,9 28,6 25,8

менее 1,0 18.6 25,) 30,1 30,6

2. 240 более 138 1.8 2,6 2.0 0

138-10.5 13,3 7,7 4,2 4,4

10,5-5,1 20.0 19.3 16,3 19,2

5.1 -2.8 17,3 18.1 17.4 19,1

2.К- 1.0 23.9 25.3 28.0 23.3

менее 1,0 I 23.7 27.0 32,1 34.0

Нрткчяниг: исследование иронелело с испо.чыочанисм колонки "5ирегтое 12" (1,6x50 см) Я

И і приведенных результатов видно, при концентрациях фермента 3. 6 и 9% уже через 2 часа практически достигается максимальное содержание низко молекулярных структур. Увеличения времени гидролиза более 4 часов и фермент-субстратного соотношении (до 6%н 9% фермента) не приводит к заметному изменению степени гидролиза.

В отличие от ферментолиза белков коровьего молока, при получении ФГБЮІ использовали двух стадийную схему проведения гидролиза с предварительной термической денатурацией, направленной на снижение содержания ингибитора трипсина и увеличения дос туп пости белка для протеолніа.

Таблица 2

Изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в ходе _двух стали иного гидролиза белков куриного яйна_

ГУ і Я о Содержание фракций (%) в диапазоне молекулярных масс, кД

г- 3. с аг 1 І ££ БКЯ 1 = Н ¡ш со л >112,2 1 12,226.9 26.911.2 11.25,0 5,02,1 2.10,8 <0,8

5.5 3.8 48,0 18.0 8,7 6,7 6,6 8,2

иативный 6.5 10,1 42,9 17,5 7.8 9,0 5.1 7.6

3 7.5 4.7 50,5 17,8 8,1 8,5 2.7 7.7

з 2 денатурированный 5,5 6,5 0 0 0,2 1,8 1,2 3,0 М 8,3 24,4 19,8 28,1} 23,0 37,9 44,1

■ 5.5 7.5 43,8 12.3 6,7 9.4 7.3 13.0

Г: нативный 6.5 8.5 48,5 15,7 6,4 9,3 3.7 7,9

гь 6 7,5 9.0 48,2 12.6 6.4 8.7 3.0 12.1

Ь денатурированный 53 6,5 0 1,2 2,6 9.3 22,1 21,9 42.9

5,5 3.8 22,8 6,4 8.3 21,2 12.1 25,4

катионый 6,5 1.8 37,4 12,2 6.2 14.5 6.9 21,0

с 22 7,5 12.5 37,0 19,7 8.1 8,3 1,7 12,7

денатурированный 5,5 6,5 0 0 0 0 0,2 0,5 4,9 4,2 27,9 19,4 21,7 19,5 45.3 56.4

5,5 3,3 16,4 4,1 5.2 24,6 14.9 31,5

нативный 6,5 2,6 34,3 8,9 4,8 18.1 7.4 23,9

3 7,5 5.5 44.5 9,3 7,1 12.0 3,6 18,0

гч Е? I С ■75 денатурированный 5,5 6,5 о 0 0 0 0,3 0,6 4.4 5.5 30.4 24,9 19,3 16,2 44,5 53,9

нативный 5,5 6,5 4,) 5,4 13,6 25,8 2.9 6.2 5,9 5,8 28.2 23,2 14.5 11.6 30,8 22,0

5 7,5 11.1 36.1 8.9 5.9 12.9 5.0 20,1

денатурированный 5,5 6,5 0 0 0 0 0,3 0 5.5 5,1 30,4 29,4 19,2 13,6 44,6 51,9

Примечание; исследование про&йдено с іюю.".>.лоь:і><г.».'ч колонки Т5К. С Ей ^У^'^Х см >

Нами была проведена предварительная тепловая денатурация 3,3% водного раствора БКЯ при значениях pll 9.6 (рП раствора патминого БКЯ) и рИ 7,6; температуре R0 и <J0 X в течение 15 I! 30 минут, D образцах определяли содержание ингибитора трипсина в условных единицах, ж с и валентных содержанию ИТБС, При проведении тепловой обработки при рН 9.6 в течение 30 мин отмечено наименьшее содержание ингибитора три пси ни при 80 X и 90 "С. Тепловая обработка при pff 7,6 в течение того же времени оказалась менее чффектнвной. так как достигнуто сннженне содержания ингибитора трипсина в 5,9 paria против 26 при рП 9,6,

В дальнейших зкс пери ментах были изучены схемы фер мен тати вного гидролиза ККЯ как со стал ней предварительной термической денатурации, так и без нее; неследонаш зависимость эффектшшостн гидріхлиза от ptt л времени проведения ■жснерп мента. £1 табл. 2 приведены результаты оценки молекулярно-массопого распределения пептидных фракции и составе ФГБКЯ. полученных в ходе гидролиза натиппого и денатуриропашюго е;»илрата. с использованием на первой стадии «Флаволпнма» пріг значениях pit 5,5; 6.5 н 7.5, а на второй-«Панкреатина» при рН 7,5,

Оптимальным оказалось про веление первой стадии гидролиза БКЯ при значении pll 6.5 «Фдавоэизимош при концентрации 5% or массы белка в теченне 22 часов термически денатурированного субстрата (при 80*С в течение 30 мин в водном растворе с pll 9,6). Вторая стадия гидролиза при рМ 7,5 «Панкреатином?) при концентрации 3% от массы белка в течение 5 часов позволяет увеличить выход гидролизата. 13 полученном продукте доля пептидов с молекулярной массой менее 2,1 кД составила более 60%,

В целях оптимизации процесса гидролиза нзолята соевых белков (ИСБ) было апробировано несколько вариантов одно- и двух сталий ного гидролиза. В табл. 3 приветен перечень использованных ферментных систем, <¡>epмент-субстратные соотношения и изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе конечных продуктов ФГИСБ,

Ні .чанных, представленных в таблице, инлно. что при проведении гидролиза в одну стадию использование «Флавоэнзпма» существенно эффективнее по сравнению с «Панкреатином». Так, при одноіі ч той же концентрации фермента (3%от массы белка) шіжомо.'іекуяяримх продуктов реакции (молекулярная масса менее 1.4 кД) образуется в 2 раза больше, чем при гидролизе « Па н к pea і ином».

Таблица 3

Молекул я рно-массовое распределение пептидных фракций в составе конечных продуктов _ферментативного гидролиза изолята соевыч белков_

Концентрация фермента, % от массы белка Диапазон молекулярных масс, кД

Фермент >70,8 70.828.2 28,211,0 11,04,0 4.01.4 <1,4

Содержание фракций при одностадийном гидролизе, %

«Флаво)нзим,1 3.0 5,0 1>,4 2.5 1.У 2.0 5.6 4,6 28.2 22,8 41,4 44,0 22.5 24.1

«Панкреатин)! 1.5 3,0 6.0 9,5 4.9 0.4 5,8 5,3 1.8 13.9 11,4 4,1 41.8 41,7 41,0 21.5 26.9 32.2 7,5 9,8 15,5

Содержание фракций при двух стадий ном гидролизе, %

«Флавоэнзим» «Панкреатин» 5,0 3.0 0 0 2,0 24,6 43.6 29,8

«Панкреатин)! «Флавоэнзим1> 3,0 5.0 0 0,6 4,0 27.1 42,8 25.5

Примечание; исследование проведено с использованием колонки Зчрегозе 12 (1,6*50 см)

ДвухстадийныП ферментативный гидролиз приводит к полной элиминации белковых структур с молекулярными массами более 28 кД, Соответственно, существенно возрастает содержание в конечном продукте низко молекулярных пептидов, В итого пых гидролнзатах ИСБ, полученных по двухстаднйной схеме, доля фракции с молекулярной массой менее 4 кД составила около 70%. Однако, вариант двухстадийного гидролиза с последовательным добавлением к ИСБ «Флавоэнзима», а затем «Панкреатина» оказался более эффективным: в этом случае выход конечного продукта составил более 80% от массы исходного белка, в то время как во втором варианте выход белка составил только 65%, Общая схема получения фермента твныч гндролизатов пищевых белкой и комплексов цинка на их основе представлена на рис. I.

2. Фнзико-хшчическая характеристика комплексов цинка с ферментативными гндролизятами пишевых Сел коп.

Для получения комплекса цинка с фер ме нтатн вн ы м и гидрол татами пищевых белков (БКМ, БКЯ и ИСБ) была предложена схема, включавшая стадии ультрафилцтрацнн тидролизата, инкубации фракции фильтрата с молекулярной массой менее II) кД с 10%-ным раствором гпСЬ (х.ч.) в соотношении 10:1 по массе и последующую ианофильтрацию, направленную на удаление из конечного продукта несвязанных с

пептидами попов цинка. Полученные по данной схеме комплексы гп-ФГПБ характерIповались высоким содержанием микроэлемента н хорошей растворимостью в поле.

Предлагаемая схема получения ФП 1Е> и комплексов 7п-ФГПБ представлена на рис. I.

I

Ул ьтрафнльтрацня в т!1НГеН1Ш<1льном потоке (мембрана 10 кД)

Ул 1>т |>аф н л ьт рят

Водный раствор 7|НЛ-

рН7.1

I [анофнльтрацня 1 - 20"С

Лиофн.гьная сушка __

Комплекс 1111IIкл с фсрмсишиппмм г нл рол шагом и II шгвою белки

Рис. I. Схема получения ферментативных гндролиэатов пищевых белков н комплексов цинка па нх «скове

В табл. 4 представлены данные по содержанию Zn в полученных комплексах /н-ФП 1Б в пересчете на количество рекомендуемых суточных дт иотрсолегтя У.п (согласно «Рекомендуемым уровням потребления пищевых и биологически актнппых веществ. Методические рекомендации МР 2.Х ]. 1915-04.-И.-2004.-С.20-21). удовлетворяемых I г каждого из полученных комплексов.

Таблица 4

Содержание цинка в комплексах пипка с ферментативными _і илролтатам и интспых белков (7.П-ФГПВ)_

Комплексы Содержание мг/г продукта Количество суточных ж>'і 7.п/г про.пкта

2і)-ФГБКМ 72.2±7,0 6.0

7.11-ФГ ВКЯ 7,5

7,и-ФПІСБ 6К.9±6.І 5.7

Как видно из представленных данных, концентрация цинка в составе комплексов в определенной степени зависит от вида используемого гидролиза га. Так, шит в наиболее концентрированном виде присутствует " составе комплексов с ФГБКЯ.

В табл. 5 и 6 сопоставлены молекул ярі ю-массовые распределения пептидных фракций в составе исходных ФГБКМ, ФГБКЯ и ФГМСБ и комплексов цинка на их ос ионе.

Та&шш 5

Молекул я рпо-массо вое распределение пептидных фракций в комплексах 2п-ФГБКМ. 2п-ФГНСБ п исходных гид рол татах (ФГВКМ. ФГИСБ)

Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракции. %

ФГБКМ 2п-ФГККМ ФГИСБ 7П-ФГИСБ

28,2-11,0 и 0,7 1,3 0

II.0-4,0 21,9 14,7 33.7 34,4

4,0-1,4 27.9 36,5 51,7 52,К

<1,4 49,1 48.1 13.3 12.8

При мочаний: данные получены с м-ікі...'. ¡;'к.;ипс^ хрошто графической колонки N111X4: IV-' ' ^ ІІ ,6*50 сч I

Таблица О

Молекулярпо-массовое распределение пептидных фракшні и комплексе гп-ФГБКЯ и исходном гндролнзате (ФГБКЯ)

Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракцпіі. %

ФІ'БКЯ /и-ФГККЯ

26.9-11.2 1.0 1.1

11.2-5.0 5.4 8.7

5.0-2.1 19.7 22.7

2.1-0.8 18.6 20.3

<0.8 55.3 47.2

Примечание: данные получены с исі:'\"и, чл и і іс м хроматограф» ческой колонки ТйК її 1.1 2 Н >0 5№ХХ (0,8*30 см)

Из представленных в таблицах результатов видно, что комплекеообразование ионов цинка с пептидами ФГПВ приводит к некоторым изменениям в молекулярно-массовом распределении пептидных фракций. Взаимодействие Zn с ФГБКМ приводит к заметному снижению содержания фракции с молекулярной массой >4,0 кД и возрастанию фракции 1,4-4,0 кД но сравнению с ФГБКМ, При сравнении молекулярно-массового распределения пептидных фракций ФГИСБ и комплекса с цинком на его основе изменения происходят в незначительной степени. Для комплекса Zn-ФГЬКЯ отмечается снижение содержания фракции с молекулярної) массоП <0.8 кД. Причиной изменений молекулярно-массового распределения могут быть, по-видимому, как преципитация (выпадение в осадок) части фракции относительно крупных пептидов при взаимодействии с нонами металла, так и возникновение «мостиков» или «сшивок» между молекулами коротких пептидов, координирующих центральный атом цинка.

Для характеристики связывания цинка с пептидными структурами ФГПБ было проведено хром aro графическое исследование комплексов Zn-ФГПБ на колонке «Superóse 12». На рис, 2, 3 и 4 представлено распределение цинка по фракциям в составе комплекса с ФГИСБ. ФГБКЯ и ФГБКМ, Из представленных данных видно, что преобладающей формой цинка в составе полученных продуктов являются его комплексы с относительно короткими пептидами. Количество ЭМ, включенного во фракцию свободных аминокислот и не связанных с белком ионов (выходящую в районе Vnci,H колонки) относительно мало. Более 60% и 20% цинка, определяемого в составе комплекса, обнаруживалось в пептидных фракциях с молекулярноіі массой 0.5-1,4 кД н 1,4-4,5 кД соотаетственно.

Ржх 2. Содержание иинка в хроматографическич фракциях комплекса иинка с ферментативным гнлролиизгом н'юлята соевых белков

Рис. 3. Содержание цинка в хроматограф"ческих фракциям комплекса цинка с фермент^мм.чыи гидролизном бедка куриного яйиа

о»

St* 1»?Í4Л2 Hi Ai i* OS 1Л I

uÚnnt

*

I i

Рис. 4. Содержание IN ni xa а v¡x.M-rroi p:ii¡..n'KCMi \ фракчшях комплсксл цгтка с -Y'-'i ^CH .'.гмнщым ГИДрОЛ И1Е1ТОЧ белков коротлго молока

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в инмодеМствпе ФГГ1Б с катионным микроэлементом кийком сопряжено со связыванием иннка с относительно короткими пептидами в диапазоне молекулярных масс менее Ы кД.

3. Оценка in vitro антигенных свойств комплексов ниики с ферм см laniniit.itiii riupaiuwitiiii iiiniicBi.it Itcji^AB.

В работе проведено исследование но выявлению антител к комплексам У.н-ФГПБ в сыворотках крови детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости и демонстрирующих в большом числе случаев высокие титры циркулирующих IgG антител к различным пищевым белкам. У значительного числа больных отмечалась поли вале) miau сенсибилизация с высокими титрами антител к трем и более пищевым продуктам.

В ранее проведенном исследовании лаборатории физиологии и биохимии пищеварения ГУ 1ШН питания PAMÍ) по оценке антигенных н потенциально аллергенных свойств комплекса ферментативного гидролизата сывороточных белков молока с цинком (Zn-ФГСБМ) было показано, что частота выявления антител к данному органическому источнику цинка чрезвычайно низка [Маю В.к",, Зорин СЛ., Гмошинскш) И.В., 200*) J. Поэтому при исследовании комплекса Zn-ФГПБ проводили онределсине lg.G антител в сыворотках крови детей, страдающих пищепоП и с перетки мосты« преимущественно аллергической природы, к мнкртлементному премиксу, содержащему дополнительно Си. Мо и Сг в форме комачексов. с сонтнетствующимн ФП111. Соотношение ОМ в составе премикса примерно соответствовало соотношениям при адекватном уровне погрейлепш человеком нсех чегырех ЭМ,

В там. 7, 8 и 9 представлены результаты исследований по опенке пптшениых CBOÜсто трех мнкро улерентных премиксов, содержащих в своем составе комплексы /л\'

ФГБКМ. 2п-ФГБКЯ и гп-ФГБКМ, В таблицах приведены также результаты определения титров антител к БКМ и ФГБКМ; БКЯ и ФГБКЯ; ИСБ н ФГИСБ.

Таблица 7

Титр антител к прем иксу, содержащему 2п-ФГБКМ, в сыворотках крови летен. страдающих пищевой непереносимостью_

Показатели Антигены

БКМ ФГБКМ Прем икс, содержащий Zn-ФГЕЖМ

Число больных 104 104 104

Антитела в титре >1:100, М (%) 97 (93%) 1 (1%) 0

Антитела в титре >1:1500, N <%) 34 (32%) 0 0

Средний титр М±т, диапазон изменений I200Ü20 (0-8300) 2±1 (0-130) 0±0

Таблица 8

Титр антител к прем иксу, содержащему 2п-ФГБКЯ, в сыворотках крови детей.

страдающих пищевой непереносимостью

Антигены

Показатели ОВА ФГБКЯ Прем икс, содержащий Zn-ФГБКЯ

Число больных 85 85 85

Антитела « титре >1:100. N (%> 52(61%) 1 (1.2%) 0

Антитела в титре >1:1800, N(%) 7 (8%) 0 0

Средний тк'ф М±т, диапазон ичмеиений 590±91 (0-4290) 3±3 (0-250) 0

Таблица 9

Титр антител к прем иксу, содержащему 2п-ФГИСБ, В сыворотках крови детей, _страдающих пищевой непереносимостью_

Показатели Антигены

Соя ФГИСБ Премикс. содержащий 2п-ФГИСБ

Число больных 85 85 85

Антитела в титре >1:100. N (%) 5 (5,9%) 0 0

Антитела в титре >600. N {%) 2 (2.3%) 0 0

Средний титр Mtm, диапазон изменений 79±40 (0-2562) 0 0

Преломил ¿иные результаты свидетельствуют о том, что антитела к комплексам 2п-ФГПБ, иключенным в состав микроалементных премиксов, в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью, практически отсутствуют у больных с пищевой

сенсибилизацией. не мнисимо от вшш иседсдуемого гилроди ¡ата. Поскольку к состав обычных пищевых продуктов, потребляемых больными (мясные, молочные продукты, рыба, овощи (1 др.) ЦИНК входит преимущественно в виде комплексов с белками, то при наличии у таких комплексов сенснбплширугошнх свойств антитела к ним должны Г»ы.Ш бы выявляться, во всяком случае, у больных с поливалентными формами нищенон сенсибилизации.

4, Ил пя и н с лрсинксоп, содержащих комплекты ни ньа с фсрктпшиымп пшролпшямн пшцсвых белков, на о см СП |. сенснбплитацнн и прогсканнс рсакипн анафилаксии у лабораторных животных.

Задачей данного раздела работы явилась оценка плияния корма, обогащенного микроэлементны мн премиксам л, содержащими комплексы цинка, а также дополнительно комплексы меди, марганца, хрома с (ферментативными гпдролшатами пищевых белко». па тяжесть анафилактического шока и уровень циркулирующих специфических антител к овальбумииу куриного яйца у сенсибилизированных атом белком крыс. I) ходе эксперимента крысы опытных группы получали на протяжении 28 дней стандартный рацион вивария (СРВ), обогащенный микроалсментными иремиксами, содержащими Zn-ФГПЬ. В табл. 10, U и 12 представлены результаты опенки тяжести активною анафилактического [пока н ответа антител к овальбумииу у животных, получавших мнкроэдементкые премиксы, содержащие Zií-ФГВКМ, гп-ФГИСЬ н Zn-ФГНКЯ. соответственно.

Таблица 10

Оценка тяжести активного амафилзктмчсского шока н показателей интенсивности гуморального иммунного ответа у сенсибилизированных овальбумниом крыс, получавших микро»ясментиый прем икс, содержащий ?,п-ФГВКМ

Показатели Гру ним Достоверность различия, Р

Прем и кс. содержащий Zn-ФГБКМ CTU

Число животных 23 23

Анафилактический индекс 3,48 3.13 >0.05*

Тяжелые реакции % Я 2,6 65,2 >0,05*

Летальность % К 2.6 65.2 >0.05*

Уровень антител в сыворотке крови мг/мл 5,9±0,4 5,3±СО Х>,05" >0.05***

Десятичный логарифм уровня антител 0,740±0.034 0.705*0.031 >0,05** >0.05***

Примечания; Здесь и іі табл II и 12:

* Согласно двустороннему критерию U (угарного преобразования ФиIдара)

** Согласно t-госту Стыолснта для пески шины* величин

*** Согласно неп ара метрическому рамочному критерию Мана-Уипш

Таблица 11

Оценка тяжести активного анафилактического шока и показателей интенсивности гуморального иммунного ответа у сенсибилизированных овал ьбумн ном крыс, получавших микроыемептиый прем икс, содержащий Zn-ФГИCБ_

Показатели Группы

Премикс, содержащий Zn-ФГИСБ СРВ Достоверность различия, Р

Число животных 25 25

Анафилактический индекс 3,28 3.F2 >0,05*

Тяжелые реакнии % ВО 68 >0.05*

Летальность % 80 68 >0.05*

Уровень антител в сыворотке крови мг/мл 6,3 ±0,5 6,8±0.б >0.05" >0.05***

Десятичный логарифм уровня антител 0.766*0,037 0.794±0.036 >0,05** >0,05'"

Таблица 12

Оценка тяжести активного анафилактического шока и показателей интенсивности гуморального иммунного отеета у сенсибилизированных овальбумнном крыс, получавших микро>лементный премикс, содержащий Zn-ФГБКЯ

1 !оказатсли Группы

Премикс, содержащий Zn-ФГБКЯ СРВ Достоверность различия. Р

Число животных 22 24

Анафилактический индекс 2,18 2,54 >0,05*

Тяжелые реакции % 31.8 37.5 >0.05*

Летальность % 31,8 37.5 >0,05*

Уровень антител о сыворотке кропи мг/мл 5,6±0,7 4,б±0,4 >0,05** >0.05***

Десятичный логарифм уровня антител 0,683±0,053 0,6 И ±0,047 >0,05** >0.05***

У животных, получавших премиксы, содержащие Zn-ФГБКМ к Zn-ФГИСБ (табл. 10 и 11), отмечалось некоторое возрастание тяжести анафилаксии но сравнению с контрольными животными. Однако различия с контролем были статистически недостоверны. Средние уровни циркулирующих антител к ОВА в соответствующих контрольных и опытных группах животных практически не рам и чал и сь. В случае прем икса, содержащего Zh-ФГБКЯ, отмечалось некоторое снижение аллергической реактивности, которое, однако, не достигает уровня статистической достоверности. Ни один из тестируемых продуктов не влиял значимым образом на гуморальный иммунный ответ к модельному антигену.

Таким образом, для всех трех микроэлементпых премиксов, содержащих в своем составе комплексы цинка с ФГБКМ. ФГИС'К и ФГБКЯ. не выявлено достоверное усиления аллергической чувствительности у животных, сенсибилизированных «посторонним» модельным аллергеном - «взльбучп/кш куриного яйца.

Совокупность результатов проведенных исследований даст основание полагать, что изучаемые премиксы, содержащие комплексы цинка с ФГПЬ, безопасны с позиции возможного аллергизнрутошего действия, чт позволяет рекомендовать ич для клинической апробации в составе специализированных лечебных и диетических продуктов питания.

5. Оценка псясывапия и ретенции пинка п составе комплекса цинка с ферментативным г ид рол та тот белков коровьего молока,

В данном эксперименте проводили исследование показателе», характеризующих усвояемость цинка (коэффициенты кажущихся всасывания, ретенции и эффективной ретенции) у лабораторных животных (крыс) с пониженной обеспеченностью ПИНКОМ после однократного введения им Яп-ФГБКМ, Животные получали в течение относительно большого времени (11 суток) цникдефииитпый корм, а затем им однократно пероральио вводили 2п-ФГБКМ, Расчеты про под иди согласно (|н>р мулам, представленным в разделе «Материалы и методы исследования».

Как видно из данных, представленных в табл. 13. показатели, характеризующие всасывание, ретенцию и эффективную ретенцию цинка ст метел ьству ют о том. что бнодоступность цинка в составе комплекса £п-ФГБКМ достаточно высока. Очевидно, что истинное всасывание цинка и его ретенция, определяемые с учетам эндогенной экскреции цинка с фекалиями, а также с мочой, отвечают е(не более высоким значениям.

Таблица 13

Показатели, характеризующие биодоступность цинка и состапе /п-ФГККМ у крыс, получавших цннкдефнпнтный корм

Показатели М±т

Экскреция '¿п с МОЧОЙ, мкг/сут 10,6± 1.4

Экскреция 2п с калом, мкг/сут 65,.Ч±23.8

Показатели усвояемости (кажущиеся) Коэффициент всасывания, 75,8±1>.4

Коэффициент ретенции. ККа„ 7І.9±*.<>

Коэффи ЦИЄ( ІТ зф(|іектн ВІ юй ретенции, ЕЇЇЯ,,, 94.4 ±1,3

Таким образом, в условиях недостаточной обеспечен! гости цинком лабораторных животных (крыс) иннк может Ефективно усваиваться в составе 2п-ФГБКМ,

6. Сравнительна» опенка эффективности использования комплекс» Zn-ФГПКМ и сульфата нннка и «им ста но вн тельном« кормлении лабораторных животных (крыс), нолучашннч предварительно цимкдефннптнын корм.

Предварительно оиеннвалн ростовые показатели, массу внутренних органов, а также обшее содержание цинка в ткани бедренной кости и актииность щелочной фосфатазы сыворотки крови у двух групп животных, одна из которых (группа №1) в течение 28 дней получала полусинтетическнй корм, дополненный 12 мг цинка/кг корма в форме Zn-ФГБКМ, а вторая (группа №2) в течение также 28 дней получала цпнкдефншггный под у синтетический корм. Как представлено в таблицах 13 и 14, потребление животными в течение 4 недель цинкдефицитного полусинтетического корма иызывало помимо отставания животных в росте существенное снижение как содержания miro микроэлемента в ткани бедренной кости, так и активности щелочной (]юсфатазы в сыворотке крови по сравнению с соответствующими показателями, определяемыми для животных, потреблявших в течение 4 недель полусинтетическнй корм с добавками Zn-ФГБКМ.

Последу ющий эксперимент также проводился с двумя группами животных (группы ЛЬ№ 3,4). Животные обеих групп вначале в течение 14 дней получали цинкдефицитный пол у синтетический корм. Затем в течение последующих 14 дней животные группы №3 получали полусинтетический корм, дополненный 12 мг цинка/кг корма в форме Zn-ФГБКМ, а животные группы № 4 полусиктетический корм с добавлением 12 мг иинка/кг корма в форме сульфата цинка.

У крыс, потреблявших цинкдефицитный рацион в течение первых двух недель, и затем получавших две недели полу синтетический рацион с добавкой Zn-ФГБКМ (группа 3). отмечена нормализация прироста массы тела. Крысы (группа №4) также потреблявшие цннкдефшштный рацион в течение первых 14 дней, но затем получавшие пол у синтетический рацион с добавкой ZnSOWHjO, прибавили в массе по сравнению с животными группы №2 (1*<0,05), но их прирост массы тела отставал от групп №№1 и 3 (Р<0,01). , .

Как следует из представленных в таблицах №№ 13, 14 данных, 2-х недельное «восстановительное» введение а корм Zn-ФГБКМ (группа №3) после 2-х недельного потреблен»« животными цинкдефицитного корма приводило к тому, что ростовые показатели и содержание цинка в костной ткани значительно повышались по сравнению с животными, получавшими шшкдефииитный корм в течение 4 недель (группа №2), и достоверно не отличались от соответствующих показателей дзя крыс, получавших корм с добавкой Zn-ФГБКМ в течение 4 недель (группа № I),

Таблица ІЗ

Масса тела н относительная масса внутренних органов крыс, получавших полу синтетические корма с различным содержанием пинка

№№ групп Масса тела Масса органов, % от массы тела М±т

Тимус Печень Почки Селезенка Семснт ІКІІ

1 296±10 0,21 ±0,01 4,46±0,09 0.71 ±0.01 0,59±0,03 1.07±0.Ш

2 243±7* 0.18*0.01 4,ОН ±0.08 0,66±0.01 0,57±0.03 1.01±0.06

3 283±б 0.18*0.02 4,-10±0.15 0.64±0.01 0.65 ±0.0 2 0.91 ±0,05

4 264±4** 0.20±0,02 4.37*0,12 0,74±0,0) 0.67 ±0.07 1,06±0,04

Примечание;

* Различие С группами 1, 3 и 4 достоверно, Р<0,05; ** различие с группами I и 3 достоверно, Р<0.05; непараметрнчсскиіі критерии Мапа-Уитии

Таблица 14

Содержание цинка в ткани бедренной кости и активность шедочноМ фосфатазі,і сыворотки

крови крыс, получавших пол у синтетические корма с различным содержанием пинка

№№ групп Содержание пинка бедренной кости, мг/кг М±п1 Акт ивность щелочной фосфатази п сыворотке крови

имо ль/л/с М±т нмоль/с па 1 г белка М±т

1 143±7 2738±1Ы 31.8*1,8

2 100±5* 1772±92* 21.3±1.0*

3 135±8** 211І±І11** 25,(*Ы.4*»

4 107±7 2705±173 33.2±2,3

Примечание: * Различие с группами 1,3 н 4 достоверно. Р<0.05. "Различие с группами 1; 2 и 4 достоверно. Р<0.05і пепарамет рическиГі критерий Маиа-Унтмп

Активность щелочной <Ік>С([кпаіьі и сыпороткс кропи крыс группы »М'З статист«1чески значимо превышала зтот показатель ял* животных. нодучаншпх ціінкдефинитный корм в течение 4 недель (группа №2 К по не достигала уровня активности 'этого фермента в сыворогкс кроки крыс, получавших корм с добавкой /.п-ФГБКМ (группа №!), Активность іпелочноИ фос<|>ага1ы в сыиорогке кровн животных, получавших в течение двухнедельного «ВОССТОНОИИТелЫЮГОй кормления добавочное количество ішнка в виде неорганической соли - сульфата пипка (группа №4), Пыла значимо выше, чем в группе №3. Однако, по содержанию цинка в костях крысы, получавшие сульфат цинка в течение 14 дне її. существенно и статистически достоверно

отставали от животных, получавших этот микроэлемент на протяжении тех же 14 дней в форме гп-ФГБКМ. Более того, содержание цинка в костях (важнейшего бномаркера обеспеченности этим микроэлементом) у животных группы №4 практически не отличалось от значения этого показателя для животных, получавших в течение всех 28 дней иинкдефииитиый корм. Особенно важно отметить, что при использовании сульфата цинка при «восстановительном я кормлении животные отставали по ростовым показателям не только от животных группы К« 1, но и животных группы № 3.

Таким образом, совокупность полученных в этом разделе работы результатов свидетельствует о большей эффективности использования в питании животных, недостаточно обеспеченных пинком (предварительно получавших в течение 2 недель цинкдефиинтный корм) нового пишевого источника органической формы иинка по сравнению с сульфатом цннка.

Выводы

1. В лабораторных условиях получены новые пищевые источники органических форм эссен цналыюго микроэлемента - цинка. Схема получения включает ([»ерментативный (одно или двухстадийный) гидролиз пищевых белков, мембранную ультрафильтрацию получаемых гидролизатов. их комплекснрованме с этим микроэлементом с последующей нанофнльтраиией и сушкой.

2. Определение моле кул я рно-м весового распределения пептидных фракций и содержания нннка в составе комплексов с ферментативными гидролизатами белков коровьего молока, белка куриного яйца и изолята соевых белков показало, что основная часть цинка прочно связывается с фракцией относительно коротких пептидов в диапазоне молекулярных масс 0,5-1,4 кД.

3. В условиях ¡п \[1го с использованием сыворотки крови детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости, не выявлено наличия антигенных свойств у вышеперечисленных комплексов цинка с ферментативными пцролитатами пищевых белков.

4. Показано отсутствие потенциально аллергиэирующего влияния новых пищевых источников органической формы цинка - комплекса этого микроэлемента с <[>срментолизатами пищевых белков при использовании модели системной анафилаксии в опытах на лабораторных животных (крысах).

5. При 11-ти дневном потреблении крысами цин «дефицитного полу синтетического корма одноразовое пероральное введение им цинка в составе нового пищевого источника - комплекса нинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего

молока характеризуется величиной кажущейся абсорбции - 76%. ретенцией • 72% н эффективной ретенцией - 94%. что свидетельствует о высоко>(|>фектшшом всасывании и усвоении этого микроэлемента.

6. При содержании лабораторных животных (крыс) ira шшкдефпцнтном корме в течение 28 суток имеет место существенное отставание в роете массы тела животных, а также достоверное снижение содержания цинка в костной ткани и активности щелочной фосфатазы « сыворотке крови на 30% и 33% соответственно. После 2-х недельного потребления крысами ипнкдефицитного корма введение в их корм органически связанно» фортка цинка - комплекса этого микроэлемента с ферментативным гидростатом белков коровьего молока иринодит к восстановлению массы тела и уровня цинка в костной ткани значительно более эффективно по сравнению с сульфатом шиша.

Список о ну блик» к и иных работ но теме диссертации

1. Зорин СЛ., Баяржаргая il/, Eypàia H.A.. Majo U.K. Получение и характеристика ферментативного гндролизата изоляга соевых белков. /7 Во пр. питания. - 2006. - Т. 76, - №1. — С. 10-12,

2. Маю В.К., Зорин С.//,, Ваяржаргт М„ Гмотинскии U.R., Вурдю Е.А. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Краткое сообщение 6: Получение и физико-химическая характеристика некоторых иойых нншепых источников цинка, меди, марганца, хрома и селена. //Вопр. детской диетологии. -2005. - Т. 3. - т. - С. 19-21.

3. Зорин СЛ., Баяржаргш А/„ Бурды Е.А., Мазо U.K. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 5: Комплексы цинка, меди, марганца и хрома с ферментативным гндролизагом белка куриного яйца. Л'Ионр. детской диетологии. - 2005. - Т,3 - №4. - С. 5-7.

4. Баяржаргал XI., Роют/ее Э.Г., Зорин С.П., ПурОзп E..-I,, /люмииский И.Ii.. Mm о B.K ДаухетадпиныП ферментативный гидролиз белков ку риного яйца. //Хранение и переработка сель.чозсырья, -2005, - Л1'4, - С, 34-36,

5. Глюишнский H.H.. Мунх\у Я, Мазо /!.К. Микроэлементы в питании человека: биологические индикаторы недостаточности цинка. //Нопр. питания. - 2006. - Т. 76.-№6.-С. 4-М.

6. Д/v/ma' Б.. Зорин С.Н.. Мазо В.К. Ферментативный гидролизат белков куриной) янцаг полу чеши; н физико-химическая характеристика. //Гастроэнтерология Санкт-

Петербурга. - 2005, - №1-2; Материалы 7-го Международного СлавяноБалтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро 2005», ) 1-13 мая 2005 года. - М95,

7, Зорин СЛ.. Баяржаргал .1/,, Зилоеа И.С.. Мазо В.К. Комплексы цинка, меди, марганца н хрома с ферментативными гидролнзатами белка куриного яйца - новые пншевые источники эссенциальных .микроэлементов, //Материалы XIII международной конференции н дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». -Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая * 9 июня 2005 года. - С. 167-168,

8, Зорин СЛ., Баяржпргал М. Физико-химическая характеристика новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов: биохелатные комплексы гндролизата белков куриного яйиа с цинком и медью. //Материалы V1U Всероссийского конгресса «Оптимальное питание - здоровье нации», К 75-летию ГУ 11И И питания РАМИ. - Москва. 26-28 октября 2005 года. - С, 102.

l>. Matu U.K., Зорин СЛ.. Екюржаргал Л/., Гмошинский И.В. Комплексы ферментативных гндролизатсв пищевых белков с эссенциальными ми кроме ментами: получение, комплексная экспериментальная оценка, //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, коло проктологи и. — 2005. -Т. XV - №5 - Приложение 26: Тезисы материалов XI Российской гастроэнтерологической недели. - С, 150.

10. Баяржар?ал Л/., Зорин С.П., Гмошинский If.В., Мазо В.К. Исследование биодоступ иости цинка, находящегося в комплексе с ферментативным гидролизатом Сел ков коровьего молока. Тезисы материалов 1 Всероссийского сьезда диетологов и нутрициологов. - Москва, 4-6 декабря 2006 года, - С. 10-П.

Здклі N" 190/12/ (Xi Подпитию в ііі-ч.і п. 2ft. 12.2(4» Тчр,іж ПІІ -жч. Уст, пл. 1,5

t(> : ООО " Циф^шичок", ic i. (-ІУ5) 797-75-76; (495)778-22-2(1 nnn'c/''е ; c-i)iíii!: <»//> ivcfr. ni