Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и биологические особенности бруцелл в L-форме

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и биологические особенности бруцелл в L-форме"

¿М-.......

На правах рукописи

БАРАННИКОВА Наталья Леонидовна

ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БРУЦЕЛЛ В Ь-ФОРМЕ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2014

005548236

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Балахонов Сергей Владимирович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Киборт Рудольф Вадимович (ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерство здравоохранения РФ, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии)

доктор биологических наук Анганова Елена Витальевна

(ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерство здравоохранения РФ, профессор кафедры эпидемиологии и микробиологии)

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « 3 » а 1-ОМ Л. 2014 г. в «_» часов на заседании

Диссертационного совета ДМ 001.038.01 при ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН по адресу: г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинский наук и на сайте www.nzmedek.ru.

Автореферат разослан «

»

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Кулеш Дмитрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Бруцеллез представляет социально-экономическую проблему для многих стран, в том числе и для России. Интенсивность эпидемиологических проявлений бруцеллеза зависит от активности эпизоотий среди сельскохозяйственных животных (Черкасский Б.Л., Амиреев С.А., Кноп А.Г., 1988; Калиновский А.И., 1997). Предполагается, что одной из причин длительного существования эпизоотических очагов бруцеллеза и низкой эффективности их оздоровления является трансформация возбудителя из S- в R- или L-формы (Триленко П.А., 1976; Гордиенко Л.Н., Гертман О.Г., 1989; Ременцова М.М., Семенцова В.М., Нифантьев В.М. и др., 1989; Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., 2004). Недостаточные знания об условиях образования и свойствах возбудителя в L-форме, отсутствие надежных методов их выявления и идентификации не позволяют в полной мере оценить их роль в эпизоотическом процессе и эпидемических проявлениях. Сложность лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, связана с изменением его биологических свойств, отсутствием соответствующих сертифицированных диагностических препаратов и питательных сред. Действующие нормативно-методические документы не решают полностью данную проблему (Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю. и др., 2005; МУ 3.1.7.1189-03; Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., 2009). До настоящего времени отмечены лишь единичные случаи выделения возбудителя инфекции в L-форме из организма человека и животных (Триленко П. А., 1976; Nelson E.L., Pickett М.J., 1951). Рекомендованные питательные среды для выделения бруцелл в L-форме технологически трудоемки и не сертифицированы (МУ 3.1.7.1189-03). Поэтому конструирование питательных сред для культивирования и выделения бруцелл в L-форме, получение и изучение свойств экспериментальных L-трансформантов и изолятов бруцелл в L-форме, оптимизация лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, актуальны.

Цель работы:

Получить бруцеллы в L-форме и изучить их биологические особенности для совершенствования методов лабораторной диагностики бруцеллеза.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные питательные среды и селекционировать штаммы бруцелл, находящиеся на различных стадиях L-трансформации.

2. Сконструировать питательные среды для получения, выделения и культивирования бруцелл в L-форме.

3. Выявить биологические особенности полученных штаммов бруцелл, находящихся на различных стадиях L-трансформации, а также изолятов из диагностического материала от больных бруцеллезом людей.

4. Получить и охарактеризовать антигенные препараты на основе бруцелл в L-форме и сыворотки, полученные к ним.

Научная новизна

С целью усовершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного воз-будителем в L-форме:

Впервые депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», штамм Brucella abortus И-206 L-форма, которому присвоен номер Brucella abortus KM 4. Штамм находится в стабильной L-форме.

Сконструированы высокочувствительные селективные питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в L-форме.

Изолированы и впервые охарактеризованы штаммы бруцелл в L-форме, длительно персистировавшие в организме больных бруцеллезом людей.

Показана возможность использования штамма бруцелл в стабильной L-форме при создании антигенного диагностикума для выявления специфических антител в сыворотках крови больных людей и животных.

Разработан способ получения растворимого антигенного препарата из бруцелл в L-форме, пригодною для конструирования диагностических тест-систем (защищено патентом «Способ получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме» № 241629, зарегистрированном в Государственном реестре изобретений РФ 20 апреля 2011 г.).

Получена высокоспецифичная и высокоактивная кроличья L-сыворотка для идентификации бруцелл в L-форме.

Практическая значимость

В процессе экспериментальных исследований разработаны питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в L-форме, имеющие преимущества перед рекомендуемыми в действующих методических указаниях (МУ 3.1.7.118903). Питательные среды обладают выраженными селективными свойствами, подавляют полностью рост бруцелл в S-форме, не препятствуют при этом росту L-форм возбудителя. Среды просты в приготовлении, не требуют фильтрации и автоклавирования, могут готовиться в сухом виде, что увеличивает срок хранения, поэтому позволяет использовать их как в лабораторных, и, что особенно важно, в полевых условиях. Питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл на основе рыбного гидролизата прозрачна, что улучшает визуализацию при отборе колоний, подозрительных на бруцеллы. С использованием предлагаемых питательных сред изолированы два штамма бруцелл в L-форме, длительно персистировавшие в организме больных людей с хронической формой заболевания, что позволяет рекомендовать их для совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза. «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл сухая» прошла испытания в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (акт медицинских 4

испытаний от 24.10.2012 г.) и во ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (акт медицинских испытаний от 26.10.2012 г.) и рекомендована для серийного производства.

Разработаны вставки для чашки Петри, применяемые при изучении ростовых свойств питательных сред, позволяющие улучшить визуализацию результатов, сократить количество лабораторной посуды и сэкономить питательные среды (защищено патентом «Вставка для чашки Петри» № 79562, зарегистрированном в Государственном реестре полезных моделей РФ 10 января 2009 г.).

Материалы исследований включены в «Методические рекомендации по выделению бруцелл в Ь-форме», утвержденные директором ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора (протокол № 5 от 28 апреля 2010 г.), Методические указания МУК 4.2.3010-12 «4.2. Методы контроля: биологические и микробиологические факторы. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 29.03.2012 г.

Диссертационная работа выполнена в рамках двух НИР: 010-2-10 «Разработка и совершенствование лабораторных методов выявления неманифестных очагов бруцеллеза» № ГР 01200511207 (2006-2010 гг.) и 010-2-11 «Оптимизация лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в Ь-форме» №ГР 01201068221 (2011-2015 гг.).

Апробация работы

Материалы, посвященные вопросам Ь-трансформации, свойствам бруцелл в Ь-форме, диагностике бруцеллеза, обусловленного возбудителем в Ь-форме, представленные в диссертации, апробированы: на двух международных научных конференциях (Санкт-Петербург, 2008; Ставрополь, 2010), трех всероссийских научных и научно-практических конференциях, конгрессах (Киров, 2008; Обо-ленск, 2010; Москва, 2012), научных конференциях Иркутского противочумного института (2008-2012 гг.). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на научной конференции ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 1 от 10.01.2014 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный способ получения бруцелл в Ь-форме, основанный на постепенном увеличении концентрации антибиотика в питательной среде, позволяет получать бруцеллы на различных стадиях Ь-трансформации, в том числе в стабильной Ь-форме.

2. Печеночный настой и рыбный гидролизат, выбранные в качестве базовых основ питательных сред, позволяют конструировать высокочувствительные и селективные питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в Ь-форме.

3. L-трансформанты бруцелл, полученные экспериментально и выделенные из диагностического материала от больных бруцеллезом людей, по биологическим свойствам, в том числе по культурально-морфологическим, вирулентности, антибиотикочувствительности, существенно отличаются от бруцелл в S-форме.

4. Полученные корпускулярные и водорастворимые антигены бруцелл в L-форме обладают высокой специфичностью и активностью, что определяет возможность конструирования на их основе диагностических тест-систем.

5. Применение двухцикловой схемы иммунизации инактивированным антигеном из штамма В. abortus И-206 в L-форме 12-го пассажа позволяет получать высокоактивную и высокоспецифичную кроличью сыворотку к бруцеллам в L-форме, пригодную для идентификации возбудителя бруцеллеза в L-форме.

Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, два патента на изобретения.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая позиция в научном обосновании исследования, планировании и проведении экспериментов и обобщении полученных результатов. В этапах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена экспериментальная работа, теоретический анализ, обсуждение полученных результатов и представление их в научных докладах и публикациях и внедрение их в практику.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 130 страницах, иллюстрирована 30 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 145 источников, из которых 116 на русском и 29 — на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, методы и объем исследований

В работе использовали 21 штамм бруцелл различных видов и биоваров, полученных из коллекции Музея живых культур ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, а также 59 штаммов, выделенных от северных оленей и 24 экспериментальных L-трансформантов бруцелл, предоставленных Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» Российской академии сельскохозяйственных наук, два изолята бруцелл в L-форме, выделенные от людей автором.

Бруцеллы выращивали на агарах: мясопептонном, эритрит-агаре, триптозном, Альбими, Кристенсена. Питательные среды для получения, выделения и культи-

вирования бруцелл в L-форме готовили из мясной воды, печеночного настоя, трип-тического гидролизата сороги (Rutilas rutilus lacustris, озеро Байкал), гидролизата селезенки КРС, перевара сердечной мышцы. Добавками служили: пептон ферментативный сухой для бактериологических целей (ГОСТ 13805-76), автолизат пекарских дрожжей, аммоний молибденовокислый (ГОСТ 3765-78, ч.д.а.), глицерин (ГОСТ 6259-75, ч.д.а.), глюкоза (ГОСТ 6038-79, ч.д.а.), кристаллический фиолетовый (ТУ 6-09-4119-75), магний сернокислый (ГОСТ 4523-77, х.ч.), натрия гидроокись (ГОСТ 4328-77, х.ч.), натрий лимоннокислый (ТУ 5-09-22-48-77), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, ч.д.а.), калий хлористый (ГОСТ 4234-77), сахароза (ГОСТ 5833-75, ч.д.а.), крахмал, линкомицин, витамин Вр бициллин-3, налидиксовая кислота, нормальная лошадиная сыворотка (НДС), агар микробиологический (ГОСТ 17206-84).

Для проведения серологических исследований использовали диагностикум бруцеллезный жидкий для реакции агглютинации (РА) (ФКУЗ СтавНИПЧИ Ро-спотребнадзора), сыворотку для пробы Кумбса (ГУЗ Нижегородская областная станция переливания крови Центр по изготовлению изосерологических стандартов), бруцеллезную поливалентную и моноспецифические — М-антимелитензис и А-антиабортус (ФКУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора). Для выделения дезок-сирибонуклеиновой кислоты (ДНК), проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа продуктов амплификации использовали «Набор реагентов для выделения ДНК», «Тест-систему для выявления ДНК Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции (ГенБру)», набор реагентов для электрофореза (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора).

Специфичность полученных L-трансформантов проверяли с сыворотками: туляремийной, холерными «OI», «Огава», (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора), кишечноиерсиниозными сероваров 0:3 и 0:9 (СПбНИВС, Санюг-Петербург).

Полученные L-сыворотки исследовали на специфичность с инактивирован-ными антигенами: Francisella tularensis И-205, Vibrio cholerae cholerae 5 (Огава), V. cholerae cholerae 35A3 (Инаба), Yersinia enterocolitica 0:3 и 0:9 (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Для определения чувствительности бруцелл к антибиотикам использовали набор дисков для определения чувствительности к противомикробным препаратам (Научно-исследовательский центр фармакотерапии).

Пробу с фагом проводили фагом «Тб» (ФКУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора).

При получении специфических сывороток к антигенам бруцелл в S- и L-формах использовали кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Изучение вирулентности и патоморфологических изменений в органах, подбор минимальной инфицирующей дозы (МИД), персистенцию возбудителя бруцеллеза, выделение бруцелл из организма зараженных животных и больных людей, получение ревертантов проводили на морских свинках массой 250-300 г. Животных получили из питомника лаборатории подопытных животных (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора). Живот-

ные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животных эвтаназировали, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986 г.).

Бактериологические, серологические исследования и отбор материала проводили согласно МУ 3.1.7.1189-03. Определение чувствительности бруцелл в S- и L-формах к антибиотикам определяли в соответствии с МУК 4.2.2495-09 и инструкцией по применению набора дисков для определения чувствительности к противомикробным препаратам. Организацию работы и проведение ПЦР осуществляли в соответствии с методическими указаниями, рекомендациями и инструкциями по применению.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Microsoft Excel (2007), по В. Монцевичюте-Эрингене (1965), по И.Г1. Ашмарину, A.A. Воробьеву (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование питательных сред для получения,

культивирования и выделения бруцелл в L-форме

Для получения L-трансформантов были отобраны питательные среды на основах: переваров сердечной мышцы, селезенки, печеночного настоя, эритрит-агара. В качестве трансформирующего агента использовали антибиотик с пролонгированным действием - бензилпенициллин-3, который добавляли в нарастающей концентрации от 10 до 13000 ЕД/мл. Стабилизирующими факторами служили хлористые соли натрия, кальция, сернокислый магний, сахароза в различных концентрациях. Для повышения чувствительности в питательную среду добавляли HJIC. L-трансформанты получали из 18 штаммов бруцелл в S- и R-формах пяти видов: Brucella abortus, В. melitensis, В. suis, В. ovis, В. canis.

При получении бруцелл в L-форме наибольшее количество пассажей удалось осуществить на печеночном и эритрит-агаре. L-трансформация быстрее проходила на печеночном агаре, при этом интервал между пассажами составлял в среднем от 8 до 13 суток, на эритрит-агаре - в пределах от 8 до 18 суток. Рост культур на гидролизате селезенки не наблюдали дальше пятого, а на переваре сердечной мышцы дальше третьего пассажа. Образование L-форм некоторых штаммов бруцелл на питательных средах представлено на рисунке 1.

Наиболее глубокий процесс перехода в L-форму зарегистрирован у бруцелл видов melitensis и abortus, где максимальное число пассажей достигало 14, тогда как у остальных он не превышал 8 с дальнейшим прекращением роста. При этом рост на питательной среде на основе перевара сердечной мышцы наблюдали только у представителей бруцелл видов melitensis - 5 штаммов и abortus - 1 штамма.

Для улучшения ростовых свойств апробированы три варианта сред на основе печеночного настоя, селезеночного перевара и эритрит-агара, на которые засевали 8

5 С О

V?'

^ пР *

/ V / ^ -

# Л? .

# г У

л

& & & &

Л'

$ ъ-

^ ф ^ ^

<

/ / -

/

пэритрит-агар □ печеночный агар в перевар сердечной мышцы агидролизат селезенки

Рисунок 1 - Динамика образования Ьформ некоторых штаммов бруцелл на различных питательных средах.

два штамма В. abortus И-206 и В. melitensis 342. В опытные варианты сред вводили различные добавки: пекарские, кормовые дрожжи, пептон ферментативный, магний сернокислый, натрий хлористый, глицерин, сахарозу, глюкозу, молиб-деновокислый аммоний, натрий лимоннокислый в различных концентрациях и комбинациях. При этом учитывали количество проведенных пассажей и время, затраченное на их проведение. Для достижения необходимой прочности агарового студня опытным путем подбирали концентрацию агаров трех отечественных и одного импортного производителей.

Предпочтение получил агар Корсаковского агарового завода Сахалинской области, который в концентрации 1 % обеспечивал оптимальную прочность агарового студня и был более доступен для производства питательных сред.

В результате на основе печеночного настоя сконструирована питательная среда для получения и культивирования бруцелл в L-форме: агар-агар 1,2 (масс.%), натрия хлорид-0,1 (масс.%), магния сульфат-0,05 (масс.%), сахароза -10 (масс.%), HJIC -10 (масс.%), на которой процесс L-трансформации проходил наиболее эффективно.

С целью конструирования селективной питательной среды для культивирования и выделения бруцелл в L-форме, не требующей автоклавирования, использовали питательную среду на основе печеночного настоя. Опытным путем подобрана концентрация бициллина-3, которая полностью ингибировала рост бруцелл в S-форме, не препятствуя росту бруцелл в L-форме. В среду, выпускаемую в сухом виде, в качестве ингибитора роста посторонней микрофлоры добавили 0,25% кристаллический фиолетовый, что позволило исключить этап стерилизации.

Дальнейшая работа по конструированию питательных сред для выделения и культивирования бруцелл в L-форме проводилась путем подбора более дешевого сырья. В базовую основу, содержащую на один литр питательной среды 0,1 г цистеина, 0,005 г витамина В,, 1,0 г глюкозы, 0,3 г крахмала, 0,05 г молибденово-кислого аммония, 0,03 г гиогликолевой кислоты, 0,9 г агар-агара, вносили различные добавки (рыбный гидролизат, рыбнодрожжевой гидролизат, дрожжевой экстракт, сухая желчь). Приготовлено и испытано 13 вариантов питательных сред. Наилучшие результаты получили при использовании сред, в состав которых входили рыбные гидролизаты. На основе экспериментальных рыбных гидролизатов из сороги (Rutilus rutilus lacustris, озеро Байкал) и коммерческого рыбного гидролизата (Махачкала) приготовили четыре серии сред. Рост бруцелл на средах с основой из рыбного гидролизата (Махачкала) регистрировался при посеве массивной дозы петлей не менее 108 микробных клеток (м.к.), на основе рыбного гидролизата из местного сырья (Rutilus rutilus lacustris, Байкальская сорога) - 5х105 м.к., на контрольной печеночной среде - 50 м.к. Питательная среда на основе рыбного гидролизата из сороги обладала достаточной чувствительностью, поэтому ее использовали в дальнейшей работе. Бициллин-3 при добавлении в питательные среды делал их непрозрачными, что затрудняло визуализацию результатов. Налидиксовая кислота, в отличие от бициллина-3, не влияла на прозрачность сред, а в концентрации 0,004 г на 100 мл питательной

среды надежно ингибировала рост бруцелл в S-форме, но не препятствовала росту бруцелл в L-форме. Подобранный состав плотной питательной среды для выделения бруцелл в L-форме содержал: гидролизат рыбы (Rutilus rutilus lacustris, Байкальская сорога) - 12,0-12,5 г; глюкозу - 10,0-10,5 г; цистеин -1,0-1,3 г; хлорид тиамина - 0,05-0,03 г; крахмал - 3,0-3,5 г; сульфат магния - 0,2-0,25 г; налидиксовую кислоту - 0,04—0,05 г; линкомицин - 0,05-0,06 г; агар-агар - 0,9-0,95 г; гидроокись натрия - 0,18-0,2 г; НЛС - 100,0-200,0 мл; воду дистиллированную - до 1 л (среда «М»), Состав полужидкой питательной среды для накопления бруцелл в L-форме отличался более низким содержанием агар-агара (3-3,5 г) на литр среды.

Испытание сконструированной питательной среды в сравнении со средой, рекомендованной ранее для выделения бруцелл в L-форме (МУ 3.1.7.1189-03), показало, что предлагаемая питательная среда обладает селективностью и большей чувствительностью. Так, при посеве 10 и 100 м.к. В abortus И-206 в L-форме на сконструированной питательной среде количество колониеобразующих единиц (КОЕ) было больше в 2 и 1,8 раза, соответственно, чем на среде сравнения. Роста бруцелл в S-форме при высеве 100 м.к. на предлагаемой среде не отмечено, в то время как на среде сравнения зарегистрировано 9 КОЕ. Предлагаемая плотная питательная среда - прозрачна, что улучшает визуализацию результатов, более чувствительна и более технологична в приготовлении, может выпускаться в сухом виде, что увеличивает срок годности, более удобна при транспортировке, что позволяет применять ее в полевых условиях.

Ростовые свойства сконструированных питательных сред для бруцелл в L-форме определяли с использованием 24 экспериментальных L-трансформантов (рисунок 2) и 59 штаммов бруцелл в S- и L-формах, изолированных от северных оленей (рисунок 3).

120

24ч среда "М"

24ч.

печеночная среда ■ ++++ п+++ □++ D-t

72 ч. время в часах

интенсивность роста

Рисунок 2 - Ростовые свойства сконструированных питательных сред для выделения бруцелл в 1_-форме с использованием 24 экспериментальных !_-трансформантов бруцелл.

интенсивность роста а++++ и+++ р++ и + время в часах

Рисунок 3 - Ростовые свойства сконструированных питательных сред для выделения бруцелл в 1_-форме с использованием 59 штаммов, выделенных от северных оленей.

Более быстрый и интенсивный рост отмечен на среде «М», на которой уже через 24 часа экспериментальные и эпизоотические Ь-варианты бруцелл росли на четыре креста в 89,8 ± 3,9 и 100 % случаев. На печеночной среде через 3 суток максимальное количество выросших штаммов с оценкой роста на два-три креста составило 16 (27,1 ± 5,8 %) - 25 (42,4 ± 6,4 %), соответственно.

Разработанные питательные среды для выделения бруцелл в Ь-форме использовали при бактериологическом обследовании больных хроническим бруцеллезом людей. Выделены две гемокультуры бруцелл в стабильной Ь-форме, что свидетельствует о длительной (7 и 42 года от начала заболевания) персистенции возбудителя в Ь-форме.

Таким образом, сконструированы высокочувствительные селективные питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в Ь-форме, пригодные для бактериологической диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в Ь-форме, у людей и животных.

Биологические особенности бруцелл в Ь-форме, полученных экспериментально и выделенных из диагностического материала от больных бруцеллезом людей

Отличительной особенностью получения Ь-трансформантов являлось замедление их роста на питательных средах в среднем до 8-18 суток по сравнению с исходными культурами - 2-3 суток. Характер роста бруцелл, особенно на первых пассажах, наблюдали в виде скудного, голубовато-сероватого в падающем и прозрачного янтарно-желтого цвета налета в проходящем свете, плохо снимающегося петлей. Колонии различались по размеру: от мелких - меньше 0,5 мм до крупных - 5 мм в диаметре. Отмечено наличие колоний с более темным центром и светлыми краями (в виде яичницы). Гемокультуры бруцелл в Ь-форме, выделенные от больных хроническим бруцеллезом людей, по культуральным свойствам были

сходны с экспериментальными L-трансформантами. Все колонии плохо снимались бактериологической петлей, имели крошковатую консистенцию.

Изучение экспериментальных L-трансформантов бруцелл в световом, с фазово-контрастным устройством, (рисунок 4) и в электронном микроскопе свидетельствует о значительном изменении их морфологии в зависимости от стадии L-трансформации, появления выраженного полиморфизма и элементов, характерных для бруцелл в L-форме.

При сравнительном изучении бруцелл на разных стадиях L-трансформации и исходных культур в S-форме в отношении дифференциальных свойств, было выявлено их значительное различие. Так L-субкультуры В abortus И-206 сильно отличаются от исходного штамма: тесты на диссоциацию (в реакциях с трипаф-лавином и термопреципитации) были положительными, не лизировались бруцеллезным бактериофагом ТБ, не образовывали сероводород и росли на средах с тионином, обладали повышенной уреазной активностью, в РА не реагировали с А- и М-моноспецифическими сыворотками, с поливалентной бруцеллезной сывороткой L-субкультуры 5-го и 8-го пассажей в разведении 1:100 образовывали нестойкий тяжистый агглютинат. L-трансформанты В. melitensis 342, в отличие от В. abortus И-206 в L-форме, в тестах на диссоциацию давали отрицательный результат. Обе L-субкультуры В. abortus И-206 и В melitensis 342 12-х пассажей не взаимодействовали с бруцеллезной поливалентной сывороткой (таблица 1).

Изоляты бруцелл в L-форме от людей давали положительную пробу с три-пафлавином и по комплексу отдельных признаков приближались к бруцеллам вида melitensis: не образовывали сероводород, обладали умеренной уреазной активностью, росли на средах с тионином и фуксином, не лизировались специфическим бактериофагом ТБ, не реагировали с А- и М-моноспецифическими бруцеллезными сыворотками (таблица 1).

L-трансформанты бруцелл, полученные экспериментально и изолированные от больных людей, обладали слабой вирулентностью. При введении подкожно морским свинкам бруцелл в L-форме в дозах 108, 109, Юшм.к., культуры удалось выделить только из лимфатических узлов (регионарная форма инфекции). Индекс инфицированности составлял 2,2-5,5, а при контрольном заражении В. abortus И-206 в S-форме - 75-79. При этом в реакции Хеддльсона с корпускулярным бруцеллезным L-диагностикумом антитела к бруцеллам в L-формах выявляли в 75-100 %, а с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА не обнаружены.

После заражения изолятами бруцелл в L-форме от людей высокими дозами (2х Ю10, 4x10'°) у большинства морских свинок на 7-14-е сутки наблюдали некротические изменения, располагающиеся в дерме, отмечался отек подкожной клетчатки и мышечного слоя, а также кровоизлияния и кровенаполнение сосудов. При бактериологическом исследовании патологического материала с использованием питательных сред для выделения бруцелл в L-форме культуры в L-форме выделяли из лимфатических узлов, селезенки и крови, что свидетельствует о генерализованной форме инфекции. Сыворотки крови животных, от которых

и к

Рисунок 4-Морфология клеток штамма Б. abortus И-206 в процессе L-трансформации (увеличение х 400) (фазовый контраст). Примечание: а - исходная форма; б- 2-й пассаж (бициллин-3 в питательной среде 50 ЕД/мл); в - 3-й пассаж (бициллин-3 в питательной среде 500 ЕД/мл); г - 4-й пассаж (бициллин-3 в питательной среде 1000 ЕД/мл); д - 5-й пассаж (бициллин-3 в питательной среде 2000 ЕД/мл); е - 6-й пассаж (бициллин-3 в питательной среде 3000 ЕД/мл); ж - 7-8-й пассажи (бициллин-3 в питательной среде 4000-5000 ЕД/мл); з - 9-14-й пассажи (бициллин-3 в питательной среде 6000-11000 ЕД/мл); и - нитевидные формы; к- веретенообразные формы.

Таблица 1 - Сравнительные результаты исследования дифференциальных свойств бруцелл в S-и L-формах

№ № п/п Штаммы Лизис фагом ТБ Диссоциация Батериостатические свойства Агглютинабельность Продукция сероводорода (мм) Уреазная активность (на среде Кристенсена)

Реакция с трипафлавином Реакция j термопреципитации Тионин Фуксин Сыворотка поливалентная Сыворотки моноспецифические 1 2 3 20 мин 2 часа 5 часов 24 часа

1:25 тыс. 1:50 тыс. 1:100 тыс. 1:50 тыс. 1:100 тыс. А М

1 В. melitensis 16М - - - + + + + + 1:1600 - 1:160 3 3 3 - сл. сл. ++

2 В. abortus 544 + - - - - - + + 1:1600 1:40 - сл. сл. 2 - - - -

3 В. suis 1330 - - - + + + - - 1:1600 1:40 - 6 5 5 + ++ +++ ++++

4 В. abortus И-206 S + - - - - - + + 1:1600 1:80 - 1 сл. сл. - - сл. +++

5 В. abortus И-206 L (5-й пассаж) - + + + + + + + *1:100 - - - - - + ++ +++ ++++

6 В. abortus И-206 L (8-й пассаж) - + + + + + + + •1:100 - - - - - - + ++ +++

7 В. abortus И-206 L (12-й пассаж) - + + + + + + + - - - - - - + ++ +++ ++++

Таблица 1 - Сравнительные результаты исследования дифференциальных свойств бруцелл в 3- и Ь-формах (окончание)

№ № п/п Штаммы Лизис фагом ТБ Диссоциация Батериостатические свойства Агглютинабельность Продукция сероводорода (мм) Уреазная активность (на среде Кристенсена)

Реакция с трипафлавином Реакция термопреципитации Тионин Фуксин Сыворотка поливалентная Сыворотки моноспецифические 1 2 3 20 мин 2 часа 5 часов 24 часа

1:25 тыс. 1:50 тыс. I 1:100 тыс. 1:50 тыс. 1:100 тыс. А М

8 В. melitensis 342 S - - - + + + + + 1:1600 - 1:160 сл. СП. сл. + + +++ +++

9 В. melitensis 342 L (5-й пассаж) - - - + + + + + *1:200 - - - - - + ++ +++

10 В. melitensis 342 L (8-й пассаж) - - - + + + + + •1:100 - - - - - - ± + +++

11 В. melitensis 342 L (12-й пассаж) - - + + + + + - - - - - - - + + +++

12 Brucella (L) от больной «3» - + - + + + + + 1:200 - - - - - - + + +++

13 Brucella (L) от больной «М» - + - + + + + + 1:100 - - - - - - + + +++

Примечание: * - результат взаимодействия не типичный с образованием нестойких тяжей; сл. - следы; (-) - отрицательно.

были выделены культуры, реагировали с бруцеллезным L-антигеном и не взаимодействовали с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА.

При изучении чувствительности к антибиотикам бруцелл в S- и L-формах отмечены существенные различия между ними. Так, все бруцеллы чувствительны к нетилмицину, тетрациклину, левомицетину, а также, за исключением культуры от больной «М», — к сизомицину, тобрамицину. Испытуемые штаммы бруцелл полностью не чувствительны к оксациллину и цефотаксиму. Референтные штаммы и В. abortus И-206 (S) чувствительны к гентамицину, в то время как В. abortus И-206 (L) и культуры от человека проявляли к нему промежуточную устойчивость. Особенный интерес представляет результат по отношению к полимиксину, при котором все бруцеллы в S-форме были устойчивы и высокоустойчивы, а в L-форме - чувствительны или обладали промежуточной устойчивостью, что можно использовать как тест для дифференциации бруцелл в L-форме от бруцелл в S-форме. Экспериментальный L-трансформант штамма В. abortus И-206 по чувствительности к некоторым антибиотикам отличался от бруцелл в L-форме, изолированных от людей. Он был чувствителен к неоми-цину, стрептомицину, канамицину, в то время как культуры от больных были к ним либо не чувствительны, либо промежуточно чувствительны. Отмечено, что к антибиотикам группы цефалоспоринов референтные штаммы проявляли неодинаковую чувствительность, так высокую устойчивость практически ко всем представителям проявлял В. abortus 544, из 7 антибиотиков этой группы В. melitensis 16М был чувствителен к трем (цефалоклор, цефотаксим, цефтри-аксон), а В. suis 1330 - к четырем и к двум - промежуточно устойчив. Бруцеллы в L-форме к цефалоспоринам в целом устойчивы или высокоустойчивы, за исключением культуры от больной «М», которая оказалась чувствительной к цефоперазону.

Результаты изучения бруцелл в L-форме, полученных экспериментально и выделенных от человека, по комплексу признаков (идентификация в ПЦР, как Brucella spp., отсутствие агглютинации с поливалентной бруцеллезной сывороткой, нахождение в стабильной L-форме) позволили выбрать L-субкультуру В. abortus И-206 12-го пассажа как наиболее перспективную для конструирования на ее основе экспериментальных диагностических препаратов.

Характеристика антигенных препаратов, приготовленных на основе L-субкультуры В. abortus И-206 12-го пассажа, и сывороток, полученных к ним

С целью конструирования диагностических препаратов, пригодных для выявления специфических антител к бруцеллам в L-форме в сыворотках крови людей и животных в серологических реакциях, нами приготовлен корпускулярный антиген из L-субкультуры В. abortus И-206 12-го пассажа. Полученный антиген исследовали на активность и специфичность в РА с бруцеллезными L-, S- и некоторыми гетерологичными сыворотками в сравнении с корпускулярным диагностикумом, приготовленным из исходного штамма В. abortus И-206 (таблица 2).

Таблица 2 - Агглютинабельность и специфичность бруцеллезных корпускулярных антигенов из штаммов В. abortus И-206 в L-и S-формах в РА

№№ п/п Сыворотки Антигены

S. abortus И-206 L (12-й пассаж) В. abortus И-206 S

1 Экспериментальная против В. abortus И-206 в S-форме 1:11,7 ±3,4 1:3200 ±929,3

2 Коммерческая поливалентная бруцеллезная 1:11.7 ± 3,4 1:3200 ±929,3

3 Гипериммунная против В. abortus И-206 в L-форме (12-й пассаж) 1:3200 + 929,3 отр.

4 Коммерческая туляремийная отр. 1:40 ± 11,6

5 Коммерческая холерная 01 отр. 1:40 ± 11,6

6 Коммерческая холерная Огава отр. 1:40 ± 11,6

7 Коммерческая кишечноиерсиниозная 0:9 отр. 1:3200 ±929,3

8 Коммерческая кишечноиерсиниозная 0:3 отр. 1:40 ± 11,6

Примечание: отр. - результат отрицательный.

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что бруцеллы в процессе L-трансформации претерпели глубокие изменения, выражающиеся в потере антигенов клеточной стенки, что подтверждается отсутствием или слабовыраженным взаимодействием L-антигенов (1:11,7 ± 3,4) в реакциях РА с бруцеллезными сыворотками (коммерческой поливалентной и против исходного штамма) и перекрестных реакций с гетерологичными сыворотками: туляре-мийной, холерными Ol, Огава, кишечноиерсиниозными 0:3 и 0:9. Антиген из L-субкультуры В. abortus И-206 12-го пассажа проявляет высокую агглютинабельность с гомологичной сывороткой в титре 1:3200 ± 929,3.

Изучена возможность получения из L-субкультуры В. abortus И-206 12-го пассажа водорастворимого антигена - термоэкстракта (ТЭ), пригодного для конструирования на его основе суспензиозных тест-систем для усовершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза. Активность приготовленного ТЭ исследовали путем его двукратных разведений в реакции кольцепреципитации с гипериммунной кроличьей L-бруцеллезной сывороткой, разведенной 1:2. Образование специфического кольца наблюдали до разведения ТЭ 1:160. Специфичность ТЭ из штамма В. abortus И-206 в L-форме 12-го пассажа исследовали в сравнении с ТЭ из исходного штамма в S-форме в реакции кольцепреципитации с диагностическими сыворотками: бруцеллезными (против бруцелл в S- и L-формах) и гетерологичными (туляремийной, холерными Ol, Огава, кишечноиерсиниозными 0:3 и 0:9 сероваров). В результате показано, что L-субкультура В. abortus И-206 содержит водорастворимый антиген - ТЭ, обладающий высокой специфичностью и активностью, о чем свидетельствует положительная реакция кольцепреципитации с гипериммунной кроличьей L-сывороткой и отсутствие таковой с бруцеллезной

поливалентной сывороткой коммерческой против бруцелл в S-форме и с гетеро-логичными сыворотками. ТЭ из штамма В. abortus И-206 в S-форме реагировал с поливалентной бруцеллезной сывороткой, туляремийной, холерной Ol и ки-шечноиерсиниозной 0:9 и не вступал во взаимодействие с сыворотками против бруцелл в L-форме, холерной Огава, кишечноиерсиниозной 0:3.

Таким образом, нами получены корпускулярный и водорастворимый антигены бруцелл в L-форме, обладающие высокой активностью и специфичностью, которые могут быть использованы при конструировании тест-систем для выявления специфических антител в сыворотках крови людей и животных.

С целью определения возможности получения сывороток к бруцеллам в L-форме, пригодных для диагностических целей, кроликам внутривенно однократно вводили живую культуру В. abortus И-206 в L-форме 12-го пассажа в дозе 109 м.к. Полученные иммунные кроличьи сыворотки исследовали на активность и специфичность. Иммунная сыворотка против L-субкультуры 12-го пассажа положительно реагировала с гомологичным антигеном в ускоренной пластинчатой РА на стекле, взаимодействовала в объемной РА в титре антител 1:2560 ± 743,4. При исследовании специфичности иммунной сыворотки в РА отмечено, что она не взаимодействовала с исходной культурой В. abortus И-206 (S-форма), коммерческим бруцеллезным диагностикумом, корпускулярными антигенами: F. tularensis 15 НИИЭГ, V. cholerae cholerae 5 (Огава), V. cholerae cholerae 35 A3 (Инаба), Y. en-terocolitica 0:9. Слабо взаимодействовала с Y. enterocolitica 0:3 в титре 1:50 ± 14,5. Иммунная сыворотка, полученная против исходного штамма В. abortus И-206 в S-форме, в РА давала выраженные реакции с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА, исходным и референтными штаммами: В. abortus 544, В. melitensis 16М, В. suis 1330, В. suis (rangiferi) И-181 в титрах Ат 1:640 ± 185,9 - 1:6400 ± 1858,6 и перекрестно реагировала с F. tularensis 15 НИИЭГ, V. cholerae cholerae 5 (Огава), V. cholerae cholerae 35 A3 (Инаба), Y. enterocolitica 0:3, 0:9 кишечного иерсиниоза корпускулярными антигенами в титрах 1:40 ± 11,6 - 1:2560 ± 743,4.

Таким образом, показано, что при однократном введении кроликам антигена бруцелл в L-форме получена высокоактивная и высокоспецифичная иммунная сыворотка, пригодная для диагностических целей. Однако применение живой культуры при заражении животных, уходе и получении сывороток требует специальных мер защиты персонала. Поэтому была изучена возможность получения диагностической сыворотки с использованием инактивированных антигенов из В. abortus И-206 в S- и L-формах (12-й пассаж). С помощью подобранной двухци-кловой иммунизации получены гипериммунные сыворотки, которые исследовали на активность и специфичность. Установлено, что гипериммунная сыворотка, полученная к В. abortus И-206 в L-форме, давала положительный результат с L-субкультурой в ускоренной пластинчатой РА на стекле и не реагировала с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА и бруцеллами в S- и R-формах. В объемной РА она взаимодействовала с L-трансформантами В. abortus И-206 12-го пассажа, В. melitensis 342 5-го пассажа в титрах антител 1:1600 ± 289,4 -

Таблица 3 - Сравнительная активность и специфичность кроличьих гипериммунных сывороток против бруцелл в Б- и Ь-формах в РА

№ п/п Штаммы микроорганизмов и антигены Гипериммунная сыворотка против В. abortus И-206 в L-форме 12-й пассаж Гипериммунная сыворотка против В. abortus И-206 в S-форме

1 В. abortus И-206 (L) 1:3200 ±929,3 отр.

2 В. abortus И-206 (S) отр. 1:4800 ± 1393,9

3 Диагностикам бруцеллезный цветной для РА отр. 1:3200 ±929,3

4 В. melitensis 342 (L) 1:1600 ± 289,4 отр.

5 В. melitensis 16 М (S) отр. 1:3200 ± 929,3

6 В. abortus 544 (S) отр. 1:3200 ±929,3

7 В. suis 1330 (S) отр. 1:3200 ±929,3

8 В. suis (rangiferi) И-181 (S) отр. 1:3200 ± 929,3

9 В. abortus Tulya (R) отр. н/о

10 Б. melitensis 201 (R) отр. н/о

11 В. abortus 86/8159 (R) отр. н/о

12 V. cholera chollerae 5 (Огава) отр. 1:40 ± 11,6

13 V. cholera chollerae 35-A3 (Инаба) отр. 1:80 ±23,2

14 F. tularensis И-205 отр. 1:80 ±23,2

15 Y. enterocolitica 0:3 1:12,5 ±2,3 1:40 ± 11,6

17 У. enterocolitica 0:9 отр. 1:2560 ± 743,4

Примечание: н/о - не определяли, отр. - отрицательно.

1:3200 ± 929,3, не реагировала с исходным и референтными штаммами бруцелл, а также с В. melitensis 201,5. abortus Tulya, В. abortus 86/8159 в R-форме, диагно-стикумом бруцеллезным цветным для РА, с корпускулярными антигенами F. tu-larensis И-205, V. cholerae cholerae 5 (Огава), V. cholerae cholerae 35 A3 (Инаба), У. enterocolitica 0:9. Отмечено слабое взаимодействие с Y. enterocolitica 0:3 в титре антител 1:12,5 ± 2,3 (таблица 3).

Показано, что разработанный метод иммунизации инактивированными антигенами позволяет получить высокоактивную и высокоспецифичную кроличью L-сыворотку, которая в объемной РА имеет титр специфических антител 1:3200 ± 929,3, а также способен снижать риск биологической опасности при проведении иммунизации, уходе и кровопускании животных.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан оригинальный способ получения бруцелл на различных этапах Ь-трансформации, в том числе и в стабильной Ь-форме на питательных средах с увеличением концентрации бициллина-3.

2. Сконструированы высокочувствительные селективные питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в Ь-форме, пригодные для бактериологической диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в Ь-форме, у людей и животных.

3. В процессе Ь-трансформации бруцеллы существенно изменяют свои биологические свойства, что выражается в отличии культурально-морфологиче-ских, дифференциальных свойств, антибиотико-чувствительности и снижении вирулентности.

4. Получены корпускулярный и водорастворимый антигены, гипериммунные кроличьи сыворотки на основе бруцелл в Ь-форме, обладающие высокой активностью и специфичностью, пригодные для конструирования тест-систем для лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в Ь-форме.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Патоморфологическая и гемолитическая характеристика изменений в организме морских свинок при экспериментальном бруцеллезе, вызванном возбудителем бруцелл в Ь-форме / С. А. Витязева, Т. Г1. Старовойтова, Л. М. Михайлов, Н. Л. Баранникова,

B. И. Дубровина, Т. Т. Шкаруба // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 1 (77), Ч. 1. -

C. 212-216.

2. Актуальные вопросы эпидемиологии и лабораторной диагностики бруцллеза, обусловленного Ь-формой возбудителя / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, С. В. Балахонов, Н. М. Андреевская, В: А. Михайлова, М. Ю. Шестопалов, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов, В. А. Борисов, В. Г. Ощепков, Л. Н. Гордиенко, Е. В. Куликова // Эпидемиология и вакцинопроф илактика. - 2010. - № 2 (51). - С. 23-29.

3. Конструирование питательных сред для бруцелл в Ь-форме / Л. М. Михайлов,

A. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, В. И. Кузнецов, А. Г. Атлас, Н. М. Андреевская,

B. А. Михайлова, О. Г. Татарникова, Л. Н. Гордиенко, Е. В. Куликова, С. В. Балахонов //Проблемы особо опасных инфекций. -2012. -№ 3 (113).-С. 89-94.

4. Михайлов, Л. М. Культурально-морфологические свойства бруцелл на этапах Ь-трансформации / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН.-2012.-№2(84), Ч. 1.-С. 135-138.

5. Особенности лабораторной диагностики экспериментального бруцеллеза, вызванного 8- и Ь- формами возбудителя / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, М. Ю. Шестопалов, Н. М. Андреевская, В. А. Михайлова, В. И. Кузнецов, А. Г. Атлас // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. -№ 2 (84), Ч. 1. - С. 131-134.

В других изданиях

6. Диагностика бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, Н. М. Андреевская, М. Ю. Михайлова, С. В. Балахонов, М. Ю. Шестопалов, И. Ф. Романова, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов, В. А. Борисов, Ф. И. Ходус, Л. Н. Гордиенко, В. Г. Ощепков // Всероссийская научная конференция, посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров, 2008. - С. 94-99.

7. Питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов, М. П. Маевский // Журнал инфекционной патологии. - 2009. - № 3, Т. 16.-С. 150-151.

8. Витязева, С. А. Патоморфологические изменения у морских свинок при экспериментальном бруцеллезе, обусловленном L-формой возбудителя / С. А. Витязева, Н. Л. Баранникова, Л. М. Михайлов // Научно-практическая школа-конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» ФГУНГНЦПМБ. - Оболенск, 2010. - С. 231-233.

9. Свойства бруцелл в L-форме, изолированных от больного человека / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, С. В. Балахонов, М. Ю. Шестопалов, Н. М. Андреевская, В. А. Михайлова, В. А. Борисов, Л. Н. Гордиенко, В. Г. Ощепков // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: материалы X Международной научно-практической конференции государств-участников СНГ / под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В. Кутырева, проф. А.Н. Куличенко. - Ставрополь: Изд-во ООО «Экспо-Медиа», 2010.-С. 210-211.

10. Антитела в сыворотках крови больных людей к возбудителю бруцеллеза в L-форме / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, Н. М. Андреевская,

B. А. Михайлова, С. В. Балахонов, М. Ю. Шестопалов, И. Ф. Романова, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов, В. А. Борисов, Ф. И. Ходус // IV международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера: тезисы докладов. — СПб., 2008. - С. 97.

11. Получение и характеристика антигенного препарата из L-форм бруцелл / К. Ю. Козулина, Е. Ю. Марков, В. Б. Николаев, Ю. О. Попова, Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова //Инфекционные болезни. -2011. -Т. 9, Прил. 1 (Матер. III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Москва, 28—30 марта2011 г.).-С. 173.

Патенты

1. Пат. № 2416429, Российская Федерация. Способ получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова,

C. В. Балахонов, Е. Ю. Марков, В. Б. Николаев, К. Ю. Козулина, М. Ю. Шестопалов, Н. М. Андреевская, В. А. Михайлова, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов; заявитель

и патентообладатель ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора. — № 2009120812 заявл. 01.06.2009; опубл. 20.04.2011.

2. Пат. № 79562, Российская Федерация. Вставка для чашки Петри / Л. М. Михайлов, А. И. Калиновский, Н. Л. Баранникова, О. Г. Татарникова, В. И. Кузнецов, И. А. Шперле; заявитель и патентообладатель ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора. - № 2008127818 заявл. 08.07.2008; опубл. 10.12.2009.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ - колониеобразующие единицы

КРС - крупный рогатый скот

м.к. - микробные клетки

НЛС - нормальная лошадиная сыворотка

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

ТЭ - термоэкстракт

Подписано в печать 25.03.2014. Бумага офсетная. Формат 60х841/16.

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 __Тираж 100 экз. Заказ №016-14.

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1.Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)