Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, детекция и характеристика некультивируемых клеток бактерий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение, детекция и характеристика некультивируемых клеток бактерий"

На правах рукописи

Пахомов Юрий Дмитриевич

ПОЛУЧЕНИЕ, ДЕТЕКЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ

03.02.03 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005537423

7 НОЯ 2013

Москва-2013

005537423

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,

Блинкова Лариса Петровна

Федеральное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией микробиологических

питательных сред доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Стоянова Лидия Григорьевна Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ушакова Нина Александровна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова» Российской академии наук зав. лабораторией инновационных технологий

кандидат биологических наук, Загустина Наталья Алексеевна

Федеральное государственное учреждение науки «Институт биохимии им. А.Н. Баха» Российской академии наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ

Защита состоится «26» ноября 2013 г. в 15-30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1.

Тел. 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «25» октября 2013

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /1——-—-

Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что в неблагоприятных условиях естественной или искусственной среды обитания неспорообразующие микроорганизмы подвергаются стрессу (трофический, температурный, окислительный и другие виды стресса), результатом которого является образование клетками некультивируемых форм (Oliver J.D. 1995; 2010; Эль-Регистан Г.И. и др., 2006, Ganesan В. et al., 2007; Lahtinen S.J. et al., 2008; Романова Ю.М., 2010; Hoefman S. et al., 2012; Ушакова H. A. и др., 2012). При этом возникает необходимость максимального замедления метаболизма для экономии ресурсов, что обеспечивает переживание неблагоприятного периода. Также причиной потери способности к образованию колоний может быть длительное нахождение в олиготрофных условиях, что приводит к замедлению метаболизма и появлению высокоаффинных транспортных белков для лучшего поглощения скудных субстратов (Albertson H.N. et al., 2005). При попадании на богатые среды в такой клетке после индукции метаболизма происходит накопление питательных веществ в концентрациях, которые нарушают жизнедеятельность голодавшего микроорганизма. Это явление описано в литературе под термином «субстрат-ускоренная гибель клеток» (Postgate J.R., Hunter J.R. 1964, Strange R.E., Dark F.A.1965, Mulyukin A.L. et al., 2009). При этом клетки, выходя из пролиферативного цикла, сохраняют потенциальную возможность вернуться к активному росту и размножению. За таким состоянием обратимой потери культивируемости закрепился термин «жизнеспособное, но некультивируемое» (viable but non culturable — VBNC) (Oliver J.D. 1995; 2005; 2010). Выявление микроорганизмов, находящихся в некультивиру-емом состоянии (НС) в окружающей среде, организме человека и животных, в пищевых продуктах и др. является важным направлением микробиологических исследований. Некоторые микроорганизмы образуют некультивируемые формы (НФ) только под воздействием специфического комплекса стрессов. Каждый из них или последовательное их действие обусловливает принципиально другие результаты (Chen S.Y. et al., 2008, Lai C.J. et al., 2009). Некультивируемые клетки (HK) сохраняют низкий уровень метаболизма и АТФ, в них синтезируются белки устойчивости к различным видам стресса. НК приобретают повышенную устойчивость к условиям внешней среды, лекарственным средствам и др. Многие виды в НС сохраняют активность факторов вирулентности. При изучении различных микроорганизмов следует также учитывать, что возможность образования НФ и скорость этого процесса зависят от штамма. Такие данные опубликованы в отношении Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Lac-tococcus lactis и др. (Tholozan J.L. et al., 1999, Asakura H., et al., 2008, Ganesan B. et al., 2007). Например, для E. coli показано, что, в зависимости от условий выделения и культивирования, микроорганизм может приобретать или терять способность к переходу в HC (Asakura H., et al., 2008). Наличие y микроорганизмов HK объясняет трудности при поиске и выделении возбудителей во время вспышек инфекционных заболеваний человека и животных с использованием культуральных методик (del Mar Lleô M. et al., 2000). Аналогичные затруднения возникают при оценке микробной загрязнённости объектов окружающей среды

и пищевых продуктов. Кроме того, изучение условий образования некультиви-руемых форм промышленных микроорганизмов поможет лучше понять процессы созревания ферментированных продуктов питания (Сапеэап В. еГ а1., 2007, ЬаМпеп Б Л. й а1., 2008). Живые, но некультивируемые клетки, могут существенно уменьшать количественные показатели жизнеспособности бактериальных клеток. Поэтому вопрос изучения перехода в НС под действием различных стрессовых факторов патогенных, сапротрофных и пробиотических микроорганизмов в препаратах, активность которых связана с живыми бактериями (вакцины, пробиотики, музейные, заквасочные, посевные культуры, БАДы и др.) является актуальным. Новая информация о НФ имеет также теоретическую значимость.

Цель работы

Целью исследования является выявление особенностей образования, детекции и восстановления некультивируемых клеток, малоизученных и неизученных у микроорганизмов разных таксономических групп.

Задачи исследования

1. Изучение динамики жизнеспособности и образования некультивируемых форм условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов в условиях лимита по азоту и дисбаланса азот/углерод. 2. Получение некультивируемых клеток ЬаМососст 1асйз ввр. \actis и характеристика бактериоцинпродуцирую-щей активности лактококков в условиях трофического стресса. 3. Выявление некультивируемых форм в лиофилизированных препаратах пробиотиков. 4. Поиск факторов для восстановления некультивируемых клеток в вегетативное состояние.

Научная новизна работы

Экспериментально получены некультивируемые формы у выбранных малоизученных и неизученных по формированию некультивируемых клеток условно патогенных, сапротрофных и пробиотических микроорганизмов в условиях трофического стрессами исследована динамика жизнеспособности и колониеобразующей активности культур при длительной инкубации. Показана сукцессионная смена периодов размножения и отмирания с формированием некультивируемых форм в течение одного года инкубации. Впервые показано влияние комплекса метаболитов лактококков, содержащихся в культуральной жидкости, на образование некультивируемых клеток. Впервые проведены исследования по определению содержания бактериоцина в культуральной жидкости лактококков, перешедших в некультивируемое состояние, и оценена продуктивность штаммов, отличающаяся от уровня образования низина в оптимальных условиях. Впервые обнаружены некультивируемые формы в лиофилизированных препаратах пробиотиков. Охарактеризован уровень жизнеспособности клеток в пробиотических препаратах различных производителей с разными сроками годности (до 30 лет после окончания срока годности). Произведён сравнительный анализ оценки жизнеспособности бактерий с использованием люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии, показавший высокую степень корреляции результатов. Осуществлён поиск факторов, способствующих переходу некультивируемых клеток микроорганизмов в вегетатив-

ное состояние, среди которых наиболее эффективным оказался кровезаменитель Аминопептид.

Практическая значимость исследования

Разработана методика получения некультивируемых клеток лактококков в условиях углеводного голодания. На модели лиофилизированных пробиоти-ческих препаратов апробирована методика количественного определения некультивируемых клеток в биологических препаратах, содержащих живые бактерии (вакцины, пробиотики, БАДы, посевные культуры, музейные штаммы), клиническом материале, пищевых продуктах, объектах окружающей среды. Высокий уровень жизнеспособности бактерий, выявленный в препаратах пробиотиков, в том числе, хранившихся с превышением срока годности до 30 лет, которые содержали некультивируемые клетки, может служить основанием для производителей к рассмотрению вопроса об увеличении сроков годности препаратов, содержащих лиофильно высушенные живые бактерии. Сравнение двух экспресс-методов учёта живых и мёртвых клеток микроорганизмов: люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии показало равноценность их применения. Минимальная среда, разработанная для создания форм покоя у АгозртПит ЬгазИете, пригодна для экспериментального получения некультивируемых клеток условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов, а среда Элликера, рекомендуемая для выращивания лактобацилл, может использоваться для выращивания бифидобактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получены некультивируемые формы условно патогенных, сапротрофных бактерий, лактококков, а также охарактеризована динамика их образования. 2. Изучена продуктивность биосинтеза низина клетками лактококков, перешедшими в НК, в условиях трофического стресса. 3. Обнаружены некультивируемые формы микроорганизмов в лиофилизированных препаратах пробиотиков с различными сроками хранения, от разных производителей. Осуществлен сравнительный анализ эффективности использования люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии для оценки жизнеспособности лиофилизированных клеток. 4. Проведен поиск факторов с целью восстановления некультивируемых микроорганизмов в вегетативное состояние. Наиболее эффективным оказался Аминопептид.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Всероссийская научная конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики профилактики актуальных инфекций». Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009г; Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва, 24 декабря 2009г; Международная конференция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва, 15-17 марта 20 Юг; Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010», Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва, 9-10 ноября 2010г; Всероссийский симпозиум с международным уча-

стием «Биологически активные вещества микроорганизмов. Прошлое, настоящее, будущее». Москва, Макс-Пресс, МГУ, 27-29 января 2011г; Международная конференция «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 21-25 марта 2011 г; Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва, 20-22 марта 2012г; IV Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва, 26-28 марта 2012г; X съезд ВНПОЭМП «Итоги и перспективы эпидемиологического благополучия населения РФ». Москва, 12-13 апреля 2012г; Международная конференция «Биология — наука XXI века». Москва, 24 мая 2012г; 3 съезд микологов России. Москва, 9-12 октября 2012г; VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 19-22 марта 2013г; International Yakult Symposium. London, Great Britain, April 22-23, 2013r; Functional Food Conference at Kyoto University. Kyoto, Japan, May 11-12, 2013r; World Forum for Nutrition Research Conference «Mediterranean Foods on Health and Disease». Reus, Spain, May 20-21, 2013r; Proceedings of 5th Congress of European Microbiologists - FEMS, Leipzig, Germany, July 21-25, 2013r

Апробация диссертации состоялась 25 сентября 2013г. на научной конференции отдела микробиологии ФГБУ «НИИВС имени И.И. Мечникова» РАМН Публикации

По результатам работы опубликовано 25 печатные работы, в том числе 8 в рецензируемых, рекомендованных ВАК журналах и в международной печати, а также 17 тезисов в изданиях российских и зарубежных конференций. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 179 источников из которых 58 отечественных и 121 зарубежных. Работа выполнена на 142 страницах машинописного текста и иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалы. В опытах по получению некультивируемых форм микроорганизмов использованы малоизученные по формированию НК бактериальные штаммы из коллекции лаборатории микробиологических питательных сред: Enterobacter aerogenes ГИСК 418; Klebsiella pneumoniae 1954; Proteus vulgaris HX 19222; Alcaligenes faecalis 415 (Блинкова JI.П. и др., 1994), а бактериоцинпро-дуцирующие штаммы Lactococcus lactis ssp. lactis МГУ, 729 и F-116 из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ (Стоянова и др., 2006). Для количественного определения низина использован индикаторный штамм Bacillus coagulans 429 из той же коллекции. При поиске некультивируемых форм в лиофилизированных пробиотических препаратах и сравнении методов проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии использовано 27 коммерческих серий сухих пробиотических препаратов, содержащих Escherichia coli, бифидобактерии, лактобациллы и энтерококки с различными сроками изготовления.

Методы

Получение некультивируемых клеток микроорганизмов. Штаммы условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов выращивали на синтетической среде в течение 24 часов при 37°С. Затем этой культурой инокулиро-вали флаконы с той же средой, имевшей 5-кратное уменьшение источника азота (Mulyukin A.L. et al., 2009). Объём инокулята составлял 10 об%. Популяции инкубировали 24 часа при той же температуре, затем при комнатной температуре в течение 1 года. Некультивируемые формы 3-х штаммов L. lactis ssp. ¡actis получали на минимальной синтетической среде (Ganesan В. et al., 2007), которую засевали 5 об% отмытых или не отмытых физиологическим раствором клеток. Полученные популяции лактококков инкубировали при 30°С в течение года.

Определение количественных характеристик микроорганизмов в изучаемых образцах. Количество КОЕ/мл определяли путём высева десятикратных разведений исходных образцов на плотные и полужидкие питательные среды с последующим подсчётом выросших колоний. Общую численность клеток в 1 мл образца подсчитывали в камерах Горяева или Тома. Соотношение числа живых и мёртвых клеток определяли после окрашивания образцов набором люминесцентных красителей Live/Dead® (Baclight™) на люминесцентном микроскопе Opton (Zeiss, Германия). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре КФК-3 при длине волны 450 или 540 нм и рабочем расстоянии между гранями кювет 3 или 5 мм. Для сравнения использовали метод проточной цитометрии: цитометр Cytomics 500, Coulter Beckman при длинах волн 510550 нм для живых и 603-623 нм для мертвых бактерий (Steen Н.В., 2000).

Определение бактериоцинсинтзирующей активности лактококков. Бактериоцин экстрагировали из культуральной жидкости смесью ацетон: уксусная кислота: вода (4:1:5) при 55°С в течение 90 мин. Затем разводили фосфатным буфером в 10 раз. Планшеты заливали диффузионной средой для титрования низина (бактериоцина) с индикаторным микроорганизмом Bacillus coagulons 429 и пробивали лунки (d=6 мм). В лунки вносили 100±20 мкл полученных растворов проб и разведений стандарта - коммерческого препарата низина «Nisaplin» (фирма «Aplin & Barrett, Ltd», Великобритания). После 24 часов инкубации измеряли диаметр зон задержки роста тест-культуры и рассчитывали концентрацию низина в международных единицах (МЕ/мл).

Восстановление некультивируемых клеток. Для реактивации использовали добавки к плотным, жидким и полужидким средам. Факторы, не разрушающиеся при автоклавировании, вносили в среду при приготовлении. Вещества, которые могли потерять свои свойства при автоклавировании, вносили после стерилизации среды, перед розливом в пробирки или чашки Петри. Условно патогенные и сапротрофные микроорганизмы восстанавливали на питательном агаре, разведённом в 5 раз с добавлением 20 основных аминокислот по 0,05г/л. В качестве добавок для восстановления лактококков использовали кровезаменитель Аминопептид; концентрированную в 10 раз инактивирован-ную кипячением (1 час) суточную биомассу гомологичного штамма лактококка; инактивированную кипячением (1 час) суточную культуру лакто кокка;

набор из 7 аминокислот. Для восстановления пробиотических клеток использовали кровезаменитель Аминопептид.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы Microsoft Excel 2007 с использованием параметрических критериев (t-критерий Фишера-Стьюдента, уровень достоверности р<0,05; предел колебаний средней арифметической М±195) и методов корреляционного анализа различий (коэффициент корреляции г).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение некультивируемых клеток условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов

В качестве основного стрессового воздействия на бактерии нами был выбран трофический фактор: выращивание на безбелковой синтетической среде с лимитированием по содержанию азота, испытанной другими авторами с целью образования цистоподобных покоящихся клеток у Azospirilium brasilense (Mulyukin A.L. et al., 2009). Параметры инкубации культур (температура, аэрация, величина рН и др.), в основном, соответствовали естественным условиям обитания изученных микроорганизмов.

Нами показано, что к седьмому месяцу инкубации уровень жизнеспособности всех культур, кроме A. faecalis 415 (78% живых клеток при общей численности в пределах 1x108 клеток/мл и величине КОЕ/мл 1x103), снизился до уровня, не выявляемого с помощью люминесцентного микроскопа, то есть численность живых клеток составляла не более 1% от их общего числа. Следовательно, количество НК было на уровне 99%.

Что касается колониеобразующих свойств, то Е. aerogenes ГИСК 418 в этот период времени полностью потерял способность образовывать колонии. Для P. vulgaris НХ 19222 и К. pneumoniae 1954 значения КОЕ/мл составили 2,85±0,31х10 и 2,2±0,24х10б. Эти величины соответствовали общему количеству живых клеток в 1 мл культуры.

После 1 года наблюдений (рис. 1, табл.1) жизнеспособность у этих микроорганизмов составила 103 - 106 КОЕ/мл. Общее число клеток, подсчитанное в камере Горяева, составило 107—108 клеток/мл, а численность живых — от 66,4 до 99,6% от общего числа клеток. Наиболее жизнеспособной к этому сроку оказалась культура Е. aerogenes, тогда как A. faecalis имел 68,6% живых клеток. Количество полученных нами некультивируемых клеток к 12 месяцам инкубации составляло от 97,1% для К. pneumoniae 1954, до более чем 99,99% для P. vulgaris НХ 19222 (см. табл. 1). Таким образом, показано, что клетки изученных условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов, находясь длительное время в условиях трофического стресса, переходят в некультивируемое состояние. При этом часть некультивируемых клеток может спонтанно восстанавливать способность к делению, вероятно, за счёт высвобождающихся из разрушенных клеток стимулирующих факторов.

Рисунок 1. Живые (зелёные) и мёртвые (красные) клетки исследованных микроорганизмов после 1 года инкубации, окрашенные набором Live/Dead.

A) Е. aerogenes ГИСК 418, Б) К. pneumoniae 1954,

B) A. faecalis 415,

Г) P. vulgaris НХ 19222.

Следует отметить, что динамика жизнеспособности культур характеризовалась сукцессионной сменой популяций микроорганизмов, выражавшейся в чередующихся периодах отмирания большей части популяции и следовавшего за этим роста. Вероятно, в культуре, находившейся в постстационарной фазе, появлялись клетки, которые в результате мутации или геномной перестройки получали преимущество перед остальными и оказывались способными к активному росту и размножению с использованием отмерших клеток в качестве питательного субстрата, образуя сменяющие друг друга субпопуляции. Подобная динамика подробно описана для Е. coli (Finkel S.E., 2006). Смена периодов размножения и отмирания также может быть связана с появлением в культуре различных диссоциативных вариантов, получающих преимущество в условиях, когда большая часть популяции отмирает (Милько Е.С., Егоров Н.С., 1991).

Таблица 1

Сохранение жизнеспособности изученных микроорганизмов после 1 года инкубации.

Микроорганизм Максимальное значение ЬСОЕ/мл (срок инкубации.) Параметры после 12 месяцев инкубации

КОЕ/мл общее число клеток/мл % живых клеток % клеток, формирующих колонии

Proteus vulgaris НХ 19222 4,77±0,52х108 (2 суток) 2,10±0,23х103 5,80±0,64х107 99,4 0,0036

Klebsiella pneumoniae 1954 3,89±0,26х108 (2 суток) 5,42±0,6х106 2,76±0,3х108 66,4 2,9

Enterobacter aerogenes ГИСК 418 4,9±0,54х108 (7 суток) 2,15±0,24х10б 2,58±0,25х108 99,6 0,84

Alcaligenes faecalis 415 7,1±0,78х10' (1 месяц) 5,09±0,56х105 1,10±0,12х108 68,6 0,67

В экспериментах было подтверждено наше предположение, что среду для получения форм покоя у Azospirillum brasilense можно использовать для перехода других родов микроорганизмов в НС.

Получение некультивируемых форм Lactococcus lactis ssp. lacíis

Для получения НФ лактококков была выбрана среда, создающая при длительной инкубации условия углеводного голодания (Ganesan В., 2007). Отмечены различия между популяциями, полученными из отмытого и не отмытого инокулята. Последние перешли в фазу активного роста и размножения в первые сутки инкубации и увеличили свою численность до 1,45 - 1,55 х 109 клеток/мл (рис. 2). Наибольшая скорость роста и размножения отмечена в первые часы после инокуляции. Такая разница, по-видимому, связана с внесением вместе с неотмытым инокулятом продуктов жизнедеятельности микробных клеток, которые выступают в роли стимуляторов роста. В дальнейшем численность клеток значительно не изменялась. Для популяции лактококка, штамм МГУ, полученной из отмытого инокулята, отмечена фенотипическая диссоциация, выражавшаяся в появлении микроколоний. Микроколониальная субпопуляция перешла в фазу активного роста и размножения и достигла максимума 5,15±0,57х109 клеток/мл (см. рис.2). Клетки популяций, которые прошли стадию роста и размножения на использованной трофически скудной среде, уменьшились в размерах по сравнению с клетками в инокуляте и параллельными популяциями с отсутствием роста. Количество жизнеспособных клеток в популяциях, прошедших стадию активного роста и размножения, снижалось, тогда как те, для которых не отмечено увеличение численности популяции, сохраняли жизнеспособность, выявленную с помощью люминесцентного микроскопа, близкую к 100%, в течение всего эксперимента. Исключение составила популяция гибридного штамма F-116 (неотмытый инокулят). Её жизнеспособность также сохранялась близкой к 100% в течение 10 месяцев (см. рис. 2). Наименьшую сохранность жизнеспособности имела популяция штамма МГУ (отмытый инокулят): доля живых клеток составила к 10 месяцам 38,1%, а к году инкубации — 54,23%. Образование НФ всех штаммов зафиксировано в течение первых суток инкубации. Для популяций, полученных из неотмытого инокулята, этот процесс протекал параллельно росту. Через 24 часа культивирования 60 - 80% клеток не создавали колонии на плотной питательной среде. К 5 дню инкубации в условиях углеводного голодания 82,1 - 99,6% клеток, в зависимости от штамма и условий эксперимента, не формировали колоний. Дальнейшее снижение колониеобразующей активности зависело от штамма и условий эксперимента. Популяции, полученные из неотмытого инокулята, переходили в НС быстрее и в большей степени, чем параллельные культуры. Вероятно, клетки, использовавшие ресурсы среды на рост и размножение, оказались более чувствительны к стрессу углеводного голодания. Микроколониальная субпопуляция L. lactis, штамм МГУ, полностью перешла в НС к 3 месяцам инкубации. В этот период разница между высеваемостью и общей численностью живых клеток составляла 5-6 порядков в зависимости от популяции. В ходе дальнейшего эксперимента значения КОЕ/мл оставались в тех же пределах.

ї

З бо «

І 40 І

20

2

: бо-

3.

100 200 300 Время (діиф

І60"1 5

= 40-1 І 20-

100 200 300 Время { пні)

100 200 300 400 Вречя(дні4

Гн :<

£ 40 к

І

20-

0 100 200 300 400 Время (дюф

і Процент живых клеток в популяции

і 401

0 100 200 300 Время(діяі)

О Опішіи числсниоси. к. і с і ш,'

•л 80

о

и

■1

я 60

2 Ш

5

£ 40

Ї

і

100 200 300 4С Времн(дш4

О Оптическая плотность

Рисунок 2. Характеристика показателей жизнеспособности популяций штаммов Ьаіїососсш \actis ввр. Іасйв. А, Б, В - популяции штаммов МГУ, 729 и Р-116 соответственно, полученные из неотмытого инокулята; Г, Д, Е, - популяции, полученные из отмытого инокулята.

В течение всего срока эксперимента наблюдали снижение оптической плотности популяций, что, вероятно, свидетельствует об уменьшении размеров клеток при переходе в НС. Это наиболее заметно для бактерий штамма 729, полученных из неотмытого инокулята, которые к 7 месяцам инкубации стали плохо различимы при микроскопировании (рис. 3). Кроме того, клетки данной культуры плохо прокрашивались ДНК-тропными люминесцентными красителями, что, по-видимому связано конденсацией нуклеоида.

В 0 б

Я ш 1 _ 1 ■ - • , V » * • г

Рисунок 3. Живые и мёртвые клетки Ьасюсоссш 1асйй яйр. /ас?«, штаммы МГУ, 729 и Р-116, после 10 месяцев инкубации. А, Б, В - популяции, полученные из неотмытого инокулята. Г, Д, Е- из отмытого инокулята.

Низинпродуцирующая активность популяции лактококков в условиях стресса

Эксперименты показали, что бактериоцин синтезировался в первые сутки после инокуляции в каждой из популяций. При этом штаммовых различий в конечных концентрациях бактериоцина в 1 мл культуральной жидкости (2450 -ЗОООМЕ/мл) не выявлено. В дальнейшем его концентрация менялась незначительно (табл. 2 - 4). Активность низина в культуральной жидкости разных популяций была приведена к одному показателю - удельной активности (МЕ/109 клеток/мл). Пересчёт выявил, что популяции, полученные из отмытого инокулята, имеют большую удельную продуктивность, чем популяции, полученные из неотмытого инокулята. Разница показателей в первые сутки составила 20-40 раз, а в дальнейшем уровень различия колебался в пределах от 10 до 78 раз, в зависимости от срока наблюдения и популяции лактококка. Можно предположить, что здесь проявилась разница стратегий выживания двух вариантов по-

пуляций. Те культуры, которые были получены из неотмытого инокулята, использовали ресурсы среды для роста и размножения, а полученные из отмытых клеток оказались более чувствительны к стрессу и перешли в режим переживания неблагоприятных условий.

В этом случае усиленная продукция низина может быть рассмотрена как защитная реакция для сохранения конкурентного преимущества ослабленной популяции, находившейся в некультивируемом состоянии.

Особенностью постепенно затухающего биосинтеза низина в условиях трофического стресса для всех штаммов при использовании отмытого инокулята явилось наличие трёх количественных максимумов удельной активности. Для штамма МГУ - это 2 и 7 сутки, а также 1 год, для штаммов 729 и F-116 - 2 и 10 сутки и 1 год.

Некоторое количество низина, являющегося пептидом, состоящим из 2834 аминокислотных остатков (Hirst А., 1981; Стоянова Л.Г. и др., 2012) может разрушаться в процессе инкубации или потребляться клетками в качестве питательного субстрата. Однако продолжавшийся биосинтез низина поддерживал концентрации на исходном уровне в течение всего срока наблюдения.

Таблица 2

Динамика активности низина в популяциях Lactococcus ¡actis ssp. ¡actis, штамм МГУ, в условиях трофического стресса._

Срок наблюдения Общее количество клеток/мл Активность низина (МЕ/мл) Удельная активность низина (МЕ/109клеток/мл) Кратность различия в удельной активности

штамм МГУ [неотмытый инокулят)

штамм МГУ (отмытый инокулят)

1 сутки 1,45±0,16х109 3000 2069 25,1

4,72±Ö,52x'lÖ7 2450 51906

2 суток 1,5б±0,17х10'' 3250 2083 35,3

3,40±Ö,37x"l07 2500 73529

3 суток 1,43±0,16х109 3000 2097 27,1

4,40±Ö,48*1Ö7 2500 56818

7 суток 1,77±0,19х109 2700 1525 41,7

4,4Ö±0,48x\Ö7 2800 63636

10 суток 2,08±0,23*109 2750 1322 35,1

5,28±Ö,58xlÖ7 2450 46402

3 месяца 3,40±0,37*109 2700 794 1/1,52

5,15±Ö,57x"l0? 2700 524

4,5 месяца 4,17±0,46xl0* 2000 480 1,63

2,90±(),32x"lÖ'5 2270 783

1 год 8,84±0,97xl08 2750 3111 1/2,26

2,00±0,22х10^ 2750 1375

Таблица 3

Динамика активности низина в популяциях ЬасЮсоссш 1асйа ээр. /яс?й, штамм 729, в условиях трофического стресса. __

Срок наблюдения Общее количество клеток/мл Активность низина (МЕ/мл) Удельная активность низина (МЕ/109клеток/мл) Кратность различия в удельной

штамм 729 (неотмытый инокулят)

штамм 729 (отмытый инокулят)

1 сутки 1,55±0,17x10" 2800 1806 21,2

6,60±0,73*10т 2450 38281

2 суток 1,66±0,18x10'' 3250 1626 41,3

злгіо^іхїо7" 2500 67204

3 суток 1,60±0,41х109 2450 1531 26,6

6,60±0,73х1"о"7 2700 40909

7 суток 1,64±0,18хЮ" 2750 1676 22,9

7,04±0,77х107 2700 38352

10 суток 1,97±0,22хЮ" 3000 1523 37,7

4,88±0,54х]07 2800 57377

3 месяца 2,61±0,29хЮ" 1332 510 78,2

6,02±0,66х 107 2400 39867

4,5 месяца 3,76±0,41х10" 985 262 77,1

5,77±0,63х10т" 1166 20207

1 год 4,44±0,49хЮ8 2450 5518 10

4,44±0,49х 107 2450 55180

Таблица 4 Динамика активности низина в популяциях Ьас1ососст 1асШ явр. /ас/и, штамм Б-! 16, в условиях трофического стресса.

Срок наблюдения Общее количество клеток/мл Активность низина (МЕ/мл) Удельная активность низина (МЕ/109клеток/мл) Кратность различия в удельной

штамм К-116 (неотмытый инокулят)

штамм Р-116 (отмытый инокулят)

1 сутки 1,50±0,17x10" 2450 1633 41,8

4,32±0,48* 107 2950 68287

2 суток 1,43±0,15х10" 2450 1713 55,4

3,16±0,35x10у 3000 94936

3 суток 1,07±0,12x10" 3250 3037 28,1

3,28±0,36х10т 2800 85365

7 суток 1,24±0,14x10" 2950 2379 26,7

4,72±0,52х 107 3000 63559

10 суток 1,31±0,14x10" 2450 1870 36,8

3,56±0,39х107 2450 68820

3 месяца 2,98±0,33х10" 2250 755 40,5

7,20±0,79х10т 2200 30556

4,5 месяца 2,62±0,29хЮ" 2080 784 46,6

6,60±0,73хі67 2320 35152

1 год 1,06±0,12x10" 2800 2641 18,9

4,92±0,54хЮ7 2450 49796

Как отмечено ранее, в условиях стресса, вероятно, синтезируется определённая (защитная) концентрация низина. Для природных штаммов лактококка МГУ и 729 активность низина при углеводном голодании была выше, чем при оптимальных условиях роста, а для гибридного высокопродуктивного штамма F-116 - ниже и близка к значениям у природных штаммов.

Изучение жизнеспособности пробиотических бактерий в коммерческих препаратах

Проанализировано 27 образцов лиофильно высушенных пробиотических препаратов от разных производителей и с разными сроками хранения, с превышением срока годности и без него.

Для образцов, содержащих Е. coli, изучение зависимости между сроками хранения после истечения срока годности, количеством жизнеспособных клеток, выявляемых с помощью люминесцентной микроскопии, и количеством НК выявило индивидуальные особенности препаратов. Колибактерин, хранившийся в течение 30 лет после истечения срока годности, содержал 52,2% жизнеспособных клеток, из которых 99,73% не формировали колоний. В то же время препарат, хранившийся 3 года после окончания срока годности, содержал 91,30% живых клеток и 4,13% некультивируемых (табл. 5).

Характерной особенностью бифидобактерий была задержка появления колоний. Нормальные колонии развивались в среде через 4-7 суток. Не отмечено чёткой зависимости между сроками хранения, жизнеспособностью и высева-емостью. Так, препарат Бифиформ (2 года хранения после истечения срока годности) содержал 100% живых клеток, а препарат Бифидумбактерин 563 (1 год до окончания срока годности) — 95,45% живых клеток; при этом оба препарата обнаружили 100% высеваемость (табл. 6).

Таблица 5

Изучение лиофилизированных промышленных препаратов Колибактерина (KB) с различными сроками хранения._

Образец Колибактерина Показатели

общее количество клеток в камере Горяева (клеток/мл) % живых клеток ^^^ ^^^общее число живых клеток/мл КОЕ/мл % живых клеток, не образующих колонии

KB 575-2 11.82 3 дозы 2,11±0,23х10'° 52,2 -— — Гд±0,12хЮ10 2,89±0,32хЮ7 99,73

KB 170/3 06.01 3 дозы 3,11±0,34х10'° 86,7 — .„_-—"~~~""2/7±0,3 х 1010 5.55т.<),6!>-1()" 79,5

KB 40-3 03.08 5 доз 1,21±0,13хЮ10 90,3 ~"~U±0,12xl010 1,58±0,17хЮ9 85,5

KB 240-3 07.09 5 доз; 1,44±0,15хЮ10 88,2 : ___— -"""Гл=.0,! 4'' 101" НОЛ 14 0|п "< 21,3

KB 270-3 07.09 5 доз 1,32±0,14х1010 91,3 ^—'--- __—Тд±о,13х1о10 1,16±0,13хЮ10 4,13

Таблица 6

Изучение лиофилизированных промышленных препаратов пробиотиков, содержащих бифидобактерии (ВВ -Бифидумбактерин, ВБС - Бификол, ВБР - Бифиформ), с разными сроками хранения.

№ п/п Условное обозначение препера-та, срок годности. Общее число клеток в камере Тома (Горяева) КОЕ/мл % ЖИВЫХ клеток в популяции Общая численность живых клеток Оптическая плот ность % живых клеток, не образующих колонии

48 ч 72 ч Макс. КОЕ/мл

(через): 48 ч 72 ч

1 ВЕС 03.08 5,96±0,66х108 1±0,11 х 108 ГВ.ЬШс)ит) 1,25±0,13х107 (Е.соП) Не определяли 1±0,11х109 В. ЫП(1ит 1,25±0,13х107 (Е.соП) 70,3 4,19±0,46х108 0,409 ± 0,000 7 83,22 0

(4 суток)

2 ВЕБ 11.10 4,64±0,51хЮ7 4,4±0,48хЮ7 (В.ЫАёит) 9,2±1,01 х 106 (Е.Гаесшт) 5,4±0,59х107 ГВ.ЫПсШт') 9,6± 1,05x106 (Е.(ассшт) 5,4±0,59хЮ7 (В.ЬШигп) 9,6± 1,05 х106 (Е/аесшт) 100 4,64±0,51хЮ7 - 5,17 0

3 ВВ 735 01.08 6,8±0,75х107 1,31±0,14х10б 3,75±0,41хЮ6 3,75±0,41хЮ6 56,96 3,87±0,43хЮ7 ± 0,000 98,07 94,4 9

4 ВВ 11001 03.08 5,32±0,58хЮ7 1,53±0,17х104 7,39±0,81хЮ4 7,39±0,81*104 98,01 5,21±0,56х107 - 99,97 99,8 6

5 ВВ 442 10.12 2,92±0,32х107 3,41±0,37х10б 7,78±0,86хЮб 1±0,11хЮ7 70,73 2,06±0,23хЮ7 0,951 ± 0,002 83,45 62,2 3

7 суток

6 ВВ 563 01.13 6,76±0,74х107 1,7±0,19х105 2,27±0,25хЮ8 2,27±0,25хЮ8 95,45 6,45±0,71хЮ7 0,42 ± 0,02 99,74 0

Рисунок 4. Живые (зелёные) и мёртвые (красные) клетки лиофилизиро-ванных препаратах. А - Колибактерин; Б - Бифидумбактерин; В - Лактобакте-рин.

Наибольший процент НК отмечен для препаратов, содержащих лактоба-циллы. Содержание НК в них было более 58% вне зависимости от срока годности препарата (в том числе непросроченные образцы) (табл. 7). Однако жизнеспособность большинства препаратов была высокой: более 99% для непросро-ченных препаратов (исключение Аципол - 24,64% живых) и не менее 72% для просроченных (до 6 лет) препаратов (исключение Ацилакт - 24,61% живых клеток).

Наши данные свидетельствуют о том, что важным фактором, влияющим на количество НК, являются особенности технологии производства. Это влияние на сохранность колониеобразующей способности показано для лакто- и бифидобактерий, а также для Е. coli с 30-летним превышением срока годности препарата.

Сравнительный анализ определения жизнеспособности клеток в про-биотических препаратах методами люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии.

При сравнении двух экспресс-методов для оценки численности жизнеспособных клеток выявлена высокая корреляция результатов (г= 0,824). Для большинства образцов разница показателей, полученных разными методами не превышала 5% а для некоторых образцов была в пределах 1-1,5% (р>0,05). Это позволяет рекомендовать оба метода для быстрой и точной оценки жизнеспособности различных образцов (табл. 8).

Таблица 7

Изучение образцов лиофилизированных промышленных препаратов лактобацилл (ЬВ - Лактобактерин, АЬ -Ацилакт, АР - Аципол) с различными сроками хранения.

№ п/п Условное обозначение препарата, (срок годности) Общее число клеток в камере Тома (Горяева) КОЕ/мл % живых клеток в популяции Общая численность живых клеток Оптическая плотность % живых клеток, не образующих колонии

1 ЬВ 493 (01.13) 2,07±0,23х109 4,06±0,44хЮ8 100 2,07±0,23*109 3,60 ± 0,07 80,39

2 ЬВ 531 (03.13) 1,04±0,11х109 3,21±0,35хЮ8 99,9 1,04±0,11хЮ9 3,08 ± 0,02 69,13

3 ЬВ 532 (03.13) 1,38±0,15><109 5,27±0,58хЮ8 92,89 1,28±0,14хЮ9 3,45 ± 0,04 58,83

4 ЬВ 533 (03.13) 1,56±0,17хЮ9 3,95±0,43х108 99,32 1,55±0,17хЮ9 4,70 ± 0,03 74,51

5 ЬВ 04 (08.06) 9,14±1,0><109 8,04±0,88х108 86,88 7,92±0,87хЮ9 8,72 ± 0,02 89,85

6 ЬВ 05 (08,06) 1,2±0,13хЮ10 2,65±0,29х108 72,4 8,69±0,95хЮ9 13,03 ±0,05 96,95

7 ЬВ 800-2 (03.10) 3,33±0,36х109 1,12±0,12хЮ8 92,04 3,06±0,23хЮ9 3,44 ±0,04 96,34

8 АЬ 80(10.06) 4,82±0,53х108 2,34±0,26хЮб 23,76 1,15±0,ЗЗхЮ8 6,11 ±0,02 97,96

9 АР 11 (02.14) 5,3±0,58х107 1,04±0,11хЮ6 24,61 1,3±0,14хЮ7 10,11 ±0,1 92,00

Таблица 8

Сравнительный анализ методов определения количества живых и мертвых клеток в пробиотиках: проточной цитометрии и люминесценции_

№ п/п Препарат Проточная цитометрия Люминесцентная микроскопия

% живых клеток % мертвых клеток % отмирающих клеток бесцветные клетки £% мертвых клеток % ЖИВЫХ клеток % мертвых клеток

1 ВВ 442 86,0 4,4 1,8 7,8 14,0 77,22 22,78

2 ВВ 451 55,0 37,0 5,9 2,1 45,0 53,7 46,3

3 ВВ 563 84,9 4,5 0,8 9,8 15,1 83,33 16,67

4 ВВ 200209 77,8 7,4 1,0 13,8 22,2 82,17 17,83

5 ВВ 552 82,5 3,1 1,7 12,7 17,5 77,35 22,65

6 ВВ 735 79,7 9,7 1,3 9,3 20,3 69,69 30,31

7 LB 50-3 67,7 27,2 1,8 3,3 32,3 67,71 32,29

8 LB 556 65,8 30,6 1,6 2,0 34,2 66,47 33,53

9 LB 493 84,5 13,8 0,2 1,5 15,5 99,99 0,01

10 LB 800 78,9 16,9 0,4 3,8 21,1 92,04 7,96

11 KB 170-2 49,6 37,5 12,4 0,5 50,4 49,52 50,48

12 KB 270-3 88,5 7,0 1,5 3,1 11,6 86,83 13,17

13 KB 575-2 84,8 10,4 4,0 0,8 15,2 77,3 22,7

14 KB 40-3 67,5 27,6 3,8 1,1 32,5 75,9 24,1

15 AL 80 57,9 2,6 7,0 32,5 42,1 22,6 77,4

16 АР 11 33,1 63,5 1,4 2,0 66,9 24,61 75,39

Поиск факторов, способствующих переходу некультивируемых клеток в вегетативное состояние.

Для вывода из НС условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов был использован питательный агар, разведенный в 5 раз, с добавлением 20 основных аминокислот по 0,05 г/л каждой. Данные условия оказались эффективны только для Proteus vulgaris. Его высеваемость увеличилась на 2 порядка с 2,10±0,23х 103 до 2,50±0,28*Ю5 (р<0,05).

При подборе факторов для пробуждения НК Lactococcus lactis ssp. lactis значительного увеличения численности культивируемых клеток добиться не удалось. Однако для популяции штамма МГУ, полученной из отмытого иноку-лята, отмечено увеличение количества КОЕ/мл в 3,75 раза при добавлении к полужидкой среде 0,5% концентрированной инактивированной биомассы того же штамма и в 2,65 раза при добавлении 1% той же биомассы в плотную среду (1/3 в этом случае составляли микроколонии).

Для реактивации НК пробиотиков использован кровезаменитель Амино-пептид в концентрации 10%, который оказался наиболее эффективным. Так для бифидобактерий наблюдали увеличение количества КОЕ/мл в 2,56 раза, а для Е. coli - 6,45 раза.

Помимо этого, для Е. coli наблюдали значительное увеличение количества КОЕ/мл при инкубации десятикратных разведений образцов в физиологическом растворе в течение 24-72 часов. В разведениях, в которых при первич-

ном высеве присутствовали единичные колонии, после инкубации вырастали газонные культуры. Такое увеличение количества культивируемых бактерий невозможно получить с низкими исходными концентрациями КОЕ/мл. Возрастание численности колониеобразующих клеток можно объяснить восстановлением регидратированных НФ после снятия у них осмотического стресса в условиях последовательных разведений физиологическим раствором.

ВЫВОДЫ

1. В условиях лимита по источнику азота и дисбаланса азот/углерод в среде получены некультивируемые клетки условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов.

2. Впервые при углеводном голодании исследованы особенности образования некультивируемых форм Lactococcus lactis ssp. lactis. Показано влияние комплекса метаболитов гомологичного штамма, вносимого в среду инкубации с инокулятом, на выживание популяций лактококков перед длительной инкубацией.

3. Впервые изучена динамика синтеза низина лактококками в некультиви-руемой форме, обнаружены 3 пика его максимальной удельной активности. При стрессе у природных штаммов МГУ и 729 активность низина была выше, чем в оптимальных условиях, а у гибридного штамма F-116 - ниже.

4. Впервые в лиофилизированных пробиотических препаратах, содержащих Е. coli, Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp., выявлены жизнеспособные некультивируемые клетки. Установлен высокий уровень сохранения жизнеспособности бактерий при значительном (до 30 лет) превышении срока годности пробиотика.

5. Проведён поиск факторов, способствующих переходу микроорганизмов из некультивируемого в вегетативное состояние, наиболее эффективным из которых для бифидобактерий и Е. coli оказался кровезаменитель Аминопептид.

6. Показаны новые возможности применения двух сред: минимальной среды для создания некультивируемого состояния Azospirillum brasilense, успешно использованной нами для получения некультивируемых клеток условно патогенных микроорганизмов и сапротрофов, а также среды Элликера, предназначенной для лактобацилл и применённой для выращивания бифидобактерий.

7. Показана высокая степень корреляции (г=0,824) результатов при оценке жизнеспособности микроорганизмов с использованием экспресс-методов: люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Блинкова Л.П. Свойства некультивируемых и покоящихся форм микроорганизмов / Л.П. Блинкова, Ю.Д. Пахомов, Л.Г. Стоянова // Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2010 - № 3 - С. 67-76.

2. Пахомов Ю.Д. Роль некультивируемых форм неспорообразующих микроорганизмов в поддержании гомеостаза популяции / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова // Иммунопатология, аллергология, инфек-тология - 2010 - № 4 - С. 57-66.

3. Pakhomov Yu.D. Experimental approach to the induction of nonculturable state of Lactococcus lactis / Yu.D. Pakhomov, S.K. Belus, L.P. Blinkova, L.G. Stoyanova, E.A. Ustyugova // Biochemistry and Biotechnology: Research and Development. Nova Science Publishers, Inc., New York - 2012 - chapter 7 -P. 45-50.

4. Пахомов Ю.Д. Жизнеспособность условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов в условиях стресса / Ю.Д. Пахомов, Блинкова Л.П., О.В. Никифорова // Вода: химия и экология - 2012 г. -№12 - С. 75-79.

5. Blinkova L.P. Express assessment of cell viability in biological preparations / L.P. Blinkova, Yu.D. Pakhomov, O.V. Nikiforova, M.L. Altshuler // Apple Academic Press. Chemistry and Physics of Modern Materials - 2013 - chapter 34-P. 521-524.

6. Пахомов Ю.Д. Длительный мониторинг жизнеспособности и образования некультивируемых форм Lactococcus lactis / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, О.В. Дмитриева, Л.Г. Стоянова // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии - 2013 - №. 3 - С. 92-96

7. Блинкова Л.П. Обнаружение некультивируемых форм бактерий в лиофи-лизированных препаратах пробиотиков / Ю.Д. Пахомов, О.В. Дмитриева // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии — 2013 — №. 3-С. 83—88

8. Blinkova L.P. Express assessment of cell viability in biological preparations / L.P. Blinkova, Yu.D. Pakhomov, O.V. Nikiforova, M.L. Altshuler // Apple Academic Press. Chemical Process in Liquid and Solid Phases - 2013 - chapter 21 -P. 1-4

9. Пахомов Ю.Д. Значение некультивируемого состояния микроорганизмов для диагностики инфекций / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова // Тезисы Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики профилактики актуальных инфекций» - Санкт-Петербург -19-20 ноября 2009 - С. 106-107.

10. Стоянова Л.Г. Некультивируемые формы микроорганизмов и их значение / Л.Г. Стоянова, Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова // Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии экологии и биотехнологии микроорганизмов» — Москва — Макс-пресс -24 декабря 2009 - С. 177

11. Биологическое значение некультивируемых микроорганизмов / Ю.Д. Па-хомов, Л.Г. Стоянова, Л.П. Блинкова // Международная конференция «Биотехнология: экология крупных городов» - Москва - 15-17 марта 2010-С. 433^34.

12. Пахомов Ю.Д. Поиск стимуляторов для восстановления некультивируемых форм микроорганизмов / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Т.П. Шмы-галёва. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология-2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» -Москва - 9-10 ноября 2010г. - С. 93.

13. Стоянова Л.Г. Антагонистическая и антиоксидантная активность молочнокислых бактерий, выделенных из курунги / Л.Г. Стоянова, О.В. Максимова, A.B. Брюханов, Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов. Прошлое, настоящее, будущее» -Макс-Пресс - Москва, - МГУ - 27-29 января 2011г. - С. 115.

14. Пахомов Ю.Д.Экспериментальный подход к получению некультивируемых клеток L. lactis / Ю.Д. Пахомов, С.К. Белусь, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова, Е.А. Устюгова // Материалы Международной конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - Москва - 21-25 марта 2011 -ч. 2- С.51-52.

15. Блинкова Л.П. Экспресс-метод оценки жизнеспособности в биологических препаратах / Л.П. Блинкова, Ю.Д. Пахомов, О.В. Никифорова, М.Л. Альтшулер и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». — Москва- 20-22 марта 2012 - С. 391-392.

16. Пахомов Ю.Д. Быстрая детекция микроорганизмов в исследуемых образцах / О.В. Никифорова, Л.П. Блинкова // Материалы IV Всероссийского конгресса по инфекционным болезням - Москва - 26-28 марта 2012 -С. 294.

17. Пахомов Ю.Д. Влияние трофического стресса на жизнеспособность бактерий / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, М.Л. Альтшулер, О.В. Никифорова // Материалы X съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы эпидемиологического благополучия населения РФ» - Москва 12-13 апреля 2012 -«Инфекция и иммунитет» - 2012 - т. 2 - № 1-2 - С. 311.

18. Пахомов Ю.Д., Антибиотики и некультивируемые формы бактерий / Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова, М.Л. Альтшулер, Т.П. Шмыгалёва, О.В. Никифорова // Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века» - Москва - 24 мая 2012 - С. 685-686

19. Блинкова Л.П. Бактериоцины клинических штаммов - перспективный источник антибактериальных препаратов / Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова, Е.С. Горбатко, Ю.Д. Пахомов, Е.В. Зайцева, Е.А. Устюгова, О.В. Максимова И Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века» - 24 мая 2012 - С. 333

20. Блинкова Л.П. Взаимодействие некультивируемых форм лактококков-продуцеитов низина и метаболически активных грибов / Л.П. Блинкова, Ю.Д. Пахомов, Л.Г. Стоянова, О.В. Никифорова, М.Л. Альтшулер, Т.П. Шмыгалёва, Е.А Устюгова // Тезисы 3 съезда микологов России - Москва

- 9-12 октября - 2012 - «Современная микология в России» - С. 143.

21. Желанкин Р.В. Сравнительная оценка жизнеспособности клеток пробио-тических штаммов при определении методом люминесценции и проточной цитометрии / Р.В. Желанкин, Л.П. Блинкова, Ю.Д. Пахомов, О.В. Дмитриева, Э.А. Ахматов // Материалы VII Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" -Москва - 19-22 - марта 2013 - часть 2 - С. 81-82.

22. Pakhomov Yu.D. Bacteriocin-synthesizing activity of Lactococcus lactis cells in condition of the trophic stress and in VBNC-form. / Yu.D. Pakhomov, L.P. Blinkova, L.G. Stoyanova, R.V. Zhelankin, О. V. Dmitrieva // Proceedings of International Yakult Symposium - London, Great Britain - April 22-23 2013 -P. 67.

23. Blinkova L.P. Nonculturable Bacteria in Lyophilized Non Spore-Forming Pro-biotics / L.P. Blinkova Yu.D. Pakhomov, O.V. Dmitrieva, M.L. Altshuler // Functional Food Conference at Kyoto University - Kyoto, Japan - May 11-12 2013-P. 79-80.

24. Pakhomov Yu.D. Nonculturable Forms of Lactococcus lactis / Yu.D. Pakhomov, Blinkova L.P., Stoyanova L.G., Dmitrieva O.V. // World Forum for Nutrition Research Conference "Mediterranean Foods on Health and Disease" - Reus, Spain - May 20-21 2013. In "Annals of Nutrition & Metabolsm"

- 2013 - № 62 (suppl 2) - P. 22.

25. Stoyanova L.G. Identification of lactic acid bacteria isolated from kurunga on the base of nucleotide sequence analysis of specific genes / L.G. Stoyanova, T.D. Sultimova, M.V. Napalkova, A.B Svetsov, Yu.D. Pakhomov, L.P. Blinkova, M.B. Nurishev, A.I. Netrusov // Proceedings of 5th Congress of European Microbiologists - FEMS - Leipzig, Germany - July 21-25 2013 - ab-str. 2921.

Заказ № 92-А/10/2013 Подписано в печать 22.10.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пахомов, Юрий Дмитриевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМЕНИ И.И. МЕЧНИКОВА» РАМН МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА, БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ, КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

042013639Б6

ПАХОМОВ Юрий Дмитриевич

ПОЛУЧЕНИЕ, ДЕТЕКЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Блинкова Л.П., доктор биологических наук, с.н.с. Стоянова Л.Г.

Москва 2013

Оглавление

Введение.......................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы...................................................................................11

1.1 Понятие и виды покоя, его роль в жизненном цикле бактериальной клетки......................................................................................................................11

1.2 Общие свойства клеточных форм переживания неблагоприятных условий. ..................................................................................................................................13

1.3 Теории, объясняющие жизнеспособное, но некультивируемое состояние микроорганизмов....................................................................................................14

1.4 Образование и свойства некультивируемых форм микроорганизмов......18

1.5 Специализированные анабиотические покоящиеся формы микроорганизмов....................................................................................................24

1.6 Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий....................................26

1.7 Условия образования и структура цистоподобных покоящихся клеток неспорообразующих микроорганизмов...............................................................30

1.8 Регуляция образования цистоподобных покоящихся клеток аутоиндукторами анабиоза....................................................................................34

1.9 Фенотипическая вариабельность в популяции микроорганизмов и ее роль в поддержании гомеостаза популяции.................................................................38

1.10 Связь покоящегося состояния и фенотипической диссоциации...............40

1.11 Выход микроорганизмов из состояния покоя.............................................41

1.12 Детекция некультивируемых форм микроорганизмов..............................45

Заключение к литературному обзору...................................................................47

Экспериментальная часть.....................................................................................48

Глава 2 Материалы и методы...............................................................................48

2.1 Штаммы, питательные среды, реагенты и биологические препараты......48

2.2 Выращивание микроорганизмов для получения некультивируемых форм ..................................................................................................................................55

2.3 Количественное определение общей численности бактерий, жизнеспособных клеток, колониеобразующих единиц, оптической плотности

суспензий................................................................................................................56

2.4 Определение активности низина....................................................................58

2.5 Процедуры, использованные для реанимации некультивируемых форм микроорганизмов....................................................................................................59

2.6 Статистическая обработка результатов.........................................................60

Глава 3. Получение некультивируемых клеток условно патогенных и

сапротрофных микроорганизмов.........................................................................62

Глава 4. Получение некультивируемых клеток Lactococcus lactis ssp. lactis, характеристика их жизнеспособности и бактериоцинпродуцирующей активности................................................................................................................68

4.1 Получение некультивируемых форм и изучение динамики сохранения жизнеспособности лактококков............................................................................68

4.2 Низинпродуцирующая активность популяции лактококков в условиях стресса.....................................................................................................................85

Глава 5. Обнаружение некультивируемых клеток бактерий в коммерческих пробиотических препаратах.......................................................91

5.1 Изучение жизнеспособности пробиотических бактерий в коммерческих препаратах...............................................................................................................91

5.2 Сравнительный анализ определения жизнеспособности клеток в пробиотических препаратах методами люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии........................................................................................104

Глава 6. Поиск факторов, способствующих переходу некультивируемых

клеток в вегетативное состояние.......................................................................107

Заключение.............................................................................................................114

Выводы....................................................................................................................121

Список использованной литературы.................................................................122

Введение

Актуальность проблемы. Известно, что в неблагоприятных условиях естественной или искусственной среды обитания (исчерпание источников питания и энергии, неоптимальные уровни температурного воздействия, аэрации, влияние химических веществ, токсинов органической природы и т.д.) неспоро-образующие микроорганизмы подвергаются стрессу, результатом которого является образование клетками некультивируемых и покоящихся форм (Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., 1993; Литвин В.Ю. и др., 1998; Oliver J.D. 1995; 2010; Mukamolova G.V. et al., 1998; Бухарин O.B. и др., 2005; Ganesan В. et al., 2007; Lahtinen S.J. et al., 2008; Мулюкин А.Л., 2010b; Романова Ю.М., 2010; Hoefman S. et al., 2012; Ушакова H.A. и др. 2012). При этом, выходя из пролиферативно-го цикла, клетки сохраняют потенциальную возможность вернуться к активному росту и размножению. За таким состоянием обратимой потери культивируемое™ закрепился термин «жизнеспособное, но некультивируемое» (viable but поп culturable - VBNC) (Oliver J.D. 1995; 2005; 2010) (ЖНС). Выявление микроорганизмов, находящихся в некультивируемом состоянии (НС), в окружающей среде, организме человека и животных, в пищевых продуктах и др. является важным направлением микробиологических исследований. Некоторые микроорганизмы образуют некультивируемые формы (НФ) только под воздействием специфического комплекса стрессов. Каждый из них или их последовательное действие обусловливает принципиально другие результаты (Chen S.Y. et al., 2008, Lai С J. et al.,2009).

Некультивируемое состояние разделяют по степени его глубины. Так, при некоторых стрессовых воздействиях метаболизм тормозится, но его можно выявить, или он полностью прекращается. Например, в стационарной фазе в условиях пролиферативного покоя клетка сохраняет метаболическую активность (Бухарин О.В. и др., 2005). При другом виде покоя происходит постепенное торможение обменных процессов (Бухарин О.В. и др., 2005, 2010, Мулюкин А.Л., 20106). При аметаболизме (анабиоз, криптобиоз, абиоз) (Sussman A.S.,

НаКюгеоп Н.О., 1966) обменные процессы в клетке прекращаются. Однако метаболизм при благоприятных условиях может быть восстановлен.

Некультивируемые и покоящиеся клетки обладают повышенной устойчивостью к действию поражающих факторов. Такие клетки не теряют генетических особенностей микроорганизмов, обеспечивая сохранение вида при длительных стрессах. Однако при реверсии покоящихся форм к метаболической активности реализуется только тот клеточный вариант (серотип, клон и т.д.), который оказался наиболее адаптированным к изменившимся условиям его пребывания. Сохранение свойства жизнеспособности и возможность возврата к состоянию активного деления может исчисляться миллионами лет (Бухарин О.В. и др., 2005). Однако существует предположение, что образование некуль-тивируемых форм и потеря способности формировать колонии - это этап отмирания культуры (КуБ^бт Т. 2001). Следует отметить, что клетки, не способные образовать колонии на стандартных питательных средах, часто обнаруживают при микроскопировании структурную целостность.

В зависимости от факторов, индуцирующих переход в состояние покоя, его классифицируют как эндогенный и экзогенный вид покоя (Зшзтап А.8., На1у0ГБ0п Н.О. 1966). Эндогенный покой является частью естественного цикла и обусловлен внутренними механизмами клетки как ответ на стрессовое воздействие факторов среды обитания и является частью естественного цикла развития. К покоящимся клеткам такого типа принадлежат эндо- и экзоспоры бактерий, грибов и др. (ЗшБгпап А.Б., На1уогзоп Н.О. 1966). Экзогенный покой связан с воздействием внешних факторов, таких как: консервирование в растворах осмотически активных веществ (осмобиоз), солей, сахарозы и др., замораживание (криобиоз), обезвоживание (ангидробиоз). По нашему мнению, к этому типу покоя следует отнести лиофильное высушивание, сочетающее криобиоз и ангидробиоз, воздействие низких и высоких температур.

При изучении различных видов микроорганизмов следует также учитывать, что возможность образования некультивируемых форм и скорость этого

процесса зависят от штамма. Такие данные опубликованы в отношении Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Lactococcus lactis и др. (Tholozan J.L. et al., 1999, Asakura H., et al., 2008 ,Ganesan B. et al., 2007). Например, для E. coli показано, что в зависимости от условий выделения и культивирования микроорганизм может приобретать или терять способность к переходу в некультивируе-мое состояние (Asakura Н., et al., 2008). Наличие у микроорганизмов некульти-вируемого состояния объясняет трудности при поиске и выделении возбудителей во время вспышек инфекционных заболеваний человека и животных с использованием культуральных методик (del Mar Lleo М. et al., 2000). Аналогичные затруднения возникают при оценке микробной загрязнённости объектов окружающей среды и пищевых продуктов. Кроме того, изучение условий образования некультивируемых форм промышленных микроорганизмов поможет лучше понять процессы созревания ферментированных продуктов питания (Ganesan В. et al., 2007, Lahtinen S.J. et al., 2008).

Поскольку известно, что колонии микроорганизмов могут формироваться более чем одной клеткой, биологическая активность препаратов, связанная с живыми бактериями (пробиотики, вакцины, БАДы), по количеству колониеоб-разующих единиц (КОЕ/мл) оказывается заниженной. Живые, но некультиви-руемые, клетки могут также существенно уменьшать количественные показатели.

Поэтому вопрос изучения жизнеспособности клеток микроорганизмов, которые могут переходить в некультивируемое состояние под действием различных стрессовых факторов, является актуальным. Новая информация о некультивируемых формах имеет также теоретическую значимость.

Цель работы

Целью исследования является выявление особенностей образования, детекции и восстановления некультивируемых клеток, малоизученных и неизученных у микроорганизмов разных таксономических групп.

Задачи исследования

1. Изучение динамики жизнеспособности и образования некультивируемых форм условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов в условиях лимита по азоту и дисбаланса азот/углерод.

2. Получение некультивируемых клеток ЬаМососст \actis ээр. ЬсШ и характеристика бактериоцинпродуцирующей активности лактококков в условиях трофического стресса.

3. Выявление некультивируемых клеток в лиофилизированных препаратах пробиотиков.

4. Поиск факторов для восстановления некультивируемых клеток в вегетативное состояние.

Научная новизна работы

Экспериментально получены некультивируемые формы у выбранных малоизученных и неизученных по формированию некультивируемых клеток условно патогенных, сапротрофных и пробиотических микроорганизмов в условиях трофического стресса и исследована динамика жизнеспособности и колониеобразующей активности культур при длительной инкубации.

Показана сукцессионная смена периодов размножения и отмирания с формированием некультивируемых форм в течение одного года инкубации. Впервые показано влияние комплекса метаболитов лактококков, содержащихся в культуральной жидкости, на образование некультивируемых клеток.

Впервые проведены исследования по определению содержания бакте-риоцина, низина, в культуральной жидкости лактококков, перешедших в некультивируемое состояние, и оценена продуктивность штаммов, отличающаяся от уровня образования низина в оптимальных условиях. Впервые обнару-

жены некультивируемые формы в лиофилизированных препаратах пробиоти-ков.

Охарактеризован уровень жизнеспособности клеток в пробиотических препаратах различных производителей с разными сроками годности (до 30 лет после окончания срока годности).

Произведён сравнительный анализ оценки жизнеспособности бактерий с использованием люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии, показавший высокую степень корреляции результатов.

Осуществлён поиск факторов, способствующих переходу некультиви-руемых клеток микроорганизмов в вегетативное состояние, среди которых наиболее эффективным оказался кровезаменитель Аминопептид.

Практическая значимость исследования

Разработана методика получения некультивируемых клеток лактококков в условиях углеводного голодания.

На модели лиофилизированных пробиотических препаратов апробирована методика количественного определения некультивируемых клеток в биологических препаратах, содержащих живые бактерии (вакцины, пробиотики, БАДы, посевные культуры, музейные штаммы), клиническом материале, пищевых продуктах, объектах окружающей среды.

Высокий уровень жизнеспособности бактерий, выявленный в препаратах пробиотиков, в том числе, хранившихся с превышением срока годности до 30 лет, которые содержали некультивируемые клетки, может служить основанием для производителей к рассмотрению вопроса об увеличении сроков годности препаратов, содержащих лиофильно высушенные живые бактерии.

Сравнение двух экспресс-методов учёта живых и мёртвых клеток микроорганизмов: люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии показало равноценность их применения.

Минимальная среда, разработанная для создания форм покоя АгоэричИгип ЬгаяИете, пригодна для экспериментального получения некультивируемых

клеток условно патогенных и сапротрофных микроорганизмов, а среда Эллике-ра, рекомендуемая для выращивания лактобацилл, может использоваться для выращивания бифидобактерий. Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. Всероссийская научная конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики профилактики актуальных инфекций. Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009.

2. Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва 14 декабря 2009.

3. Международная конференция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва, 15-17 марта 2010

4. Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва, 9-10 ноября 2010г.

5. Всероссийский симпозиум с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов. Прошлое, настоящее, будущее». Москва, Макс-Пресс, МГУ, 27-29 января 2011г.

6. Международная конференция «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва - 21-25 марта 2011.

7. Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва, 20-22 марта 2012.

В. IV Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва, 26-28 марта 2012.

9. X съезд ВНПОЭМП «Итоги и перспективы эпидемиологического благополучия населения РФ». Москва, 12-13 апреля 2012.

10. Международная конференция «Биология - наука XXI века». Москва, 24 мая 2012.

11. 3 съезд микологов России. Москва, 9-12 октября - 2012 в

12. VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 19-22 - марта 2013.

13. International Yakult Symposium - London, Great Britain, April 22-23 - 2013.

14. Functional Food Conference at Kyoto University, Japan. May 11-12 -2013

15. World Forum for Nutrition Research Conference "Mediterranean Foods on Health and Disease". Reus, Spain. May 20-21, 2013.

16. Proceedings of 5th Congress of European Microbiologists - FEMS. Leipzig, Germany, July 21-25, 2013

Публикации

По результатам работы опубликовано 25 печатных работы, в том числе 8 в рецензируемых, рекомендованных ВАК журналах и в международной печати, а также 17 тезисов в изданиях российских и зарубежных конференций.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Понятие и виды покоя, его роль в жизненном цикле бактериальной клетки.

В цикле развития любого организма период активного роста и размножения сменяется их отсутствием (покоем) с сохранением способности вернуться в активное состояние. Такой цикл развития рассматривается как непременный показатель «живого», обеспечивая гомеостаз организма и популяции в изменяющихся условиях (Бухарин О.В. и др., 2005).

Клетки, которые, оставаясь жизнеспособными (то есть сохранившими способность вернуться к активному росту и размножению), выходят из проли-феративного цикла на неопределенный срок, называют покоящимися. Это определение подходит для организмов любой сложности. В частности, покоящиеся клетки микроорганизмов характеризуются особым физиологическим состоянием, обеспечивающим способность к переживанию условий недостатка питательных веществ и энергии