Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение биологически активных продуктов с применением микробных трансгликозидаз

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение биологически активных продуктов с применением микробных трансгликозидаз"

На правах рукописи

МАРКОСЯН ЛВЕТИК АШОТОВНЧ

ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОДУКТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МИКРОБНЫХ ТРАНСГЛИКОЗИДАЗ

Специальность: 03 00 23 —«Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00344В80а

Уфа-2008

003446888

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории компании «PureCircle Sdn Bhd » (Малайзия)

Научный руководитель

доктор биологических наук Абелян Варужан Амаякович

Официальные оппоненты

кандидат биологических наук, доцент Усанов Николай Глебович

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Аират Радикович

Ведущая организация

Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

Защита состоится 10 октября 2008 года в 14 00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002 136 01 при Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу 450054, г Уфа, пр Октября, д 69 тел (347) 235-53-62, E-mail ib@anrb ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии УНЦ РАН и на официальном сайте http //www anrb mí rabio /dissovet/ index htm

Автореферат разослан 9 сентября 2008 г

Ученый секретарь

Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

N

Уразгильдин Р В

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Биокатализ и биотрансформация составляют одну из перспективных и ключевых направлений современной биотехнологии Биокаталитические процессы обладают рядом преимуществ перед традиционным органическим синтезом и широко внедряются в различные области промышленности для направленного сшпеза различных высокоценных соединений При этом обеспечивается избирательность и стереоспецифичность катализируемых реакций (Березин и др 1976, Скрябин, Головлева, 1976, Atkinson, 1995, Sheldrake et al, 1998, Abelyan, 2005, Hou 2005, Biocat-2004,2006)

Преимущества ферментов как промышленных катализаторов основаны на их способности проведения стерео- и региоселективных превращений без применения химических защитных групп, а также возможности осугцеств тения труднореализируемых процессов с высоким выходом конечного продукта Кроме того, применение биокатализаторов позволяет сократить стадии традиционного химического синтеза, обычно требующего несколько ступеней протекции и депротекции функциональных групп и таким образом существенно снизить экономические издержки В некоторых случаях микробный катализ и трансформация являются единственно возможным подходом создания практически безотходных технологий и экологически чистых производств (Iizuka, Naito, 1981, Anastas, Wilhamson, 1998, Demain et al, 1999, Anastas, Kirchhoff, 2002)

Однако в настоящее время существует определенная нехватка действительно эффективных биокатализаторов, пригодных для использования в промышленном масштабе, что вызывает настоятельную необходимость проведения новых исследований в данном направлении Часто только это является препятствием для получения новых продуктов с новыми более уникальными свойствами

В биокаталитических процессах особое место занимают ферменты с ярко выраженной трансгликозилирующей активностью, достаточно широко применяющиеся для получения различных высокоценных продуктов Так, циклодекстрингликозилтрансфераза (ЦГТаза), /?-фруктофуранозидаза, а-глюкозилтрансфераза (изомальтулозеинтаза), /?-галактозидаза, мальтаза и другие используются для ферментативного синтеза циклодекстринов и их производных, фруктоолигосахаридов, лакгосахарозы, эрлозы, галактоолигосахаридов, изомеров сахарозы и прочих С другой стороны, при подборе соответствующих исходных материалов и определенных условий реакции их можно использовать для получения совершенно новых соединений или улучшения некоторых характеристик известных соединений (Best et al, 1994, Demain et al, 1999, Stanbury et al, 1999)

Таким образом, в настоящее время применение различных биокатализаторов, в частности с трансгликозилирующей активностью, является актуальным направлением работ для получения новых продуктов и модификации различных физиологически активных соединений с целью улучшения их функциональных свойств

Цели и задачи работы. Основной целью являлись выделение и использование ферментов микробного происхождения с трансгликозилирующей активностью для направленной трансформации и модификации витаминов, углеводов, дитерпеновых гликозидов и бензо[Ь]хиназолинов с целью улучшения их характеристик и выработки новых продуктов

Для осуществления указанной цели поставлены следующие задачи

• выделить и охарактеризовать культуры-микробов, в том числе их экстремофильные формы - активных продуцентов ЦГТазы /5-фруктофуранозидазы и а-ппокозилтрансферазы,

• изучить морфо-физиологические и биохимические свойства перспективных продуцентов,

• изучить и оптимизировать условия биосинтеза перспективных микробных ферментов,

• выделить, очистить наиболее перспективные ферменты и изучить их некоторые физико-химические и биохимические свойства,

• разработать эффективные методы трансглюкозилирования Ь-аскорбиновой кислоты, бензоЩхиназолинов и дитерпеновых гликозидов,

• изучить и оптимизировать процесс получения изомальтулозы с применением свободной и иммобилизованной а-глюкозилтрансферазы,

• изучить и осуществить процесс получения фруктоолигосахаридов совместно с палатинозой с применением нативных и иммобилизованных а-глюкозилтрансферазы и /?-фруктофуранозидазы

Научная новизна работы. Из различных типов почв с применением оригинальной методики и направленной селекции выделены микробные штаммы активных продуцентов ЦГТазы, /?-фруктофуранозидазы и а-глюкозилтрансферазы Разработаны методы их очистки и иммобилизации

Показано, что ЦГТазы экстремофильных форм микроорганизмов могут быть эффективными биокатализаторами в реакции трансглюкозилирования Ь-аскорбиновой кислоты и дитерпеновых гликозидов

Впервые осуществлено трансглюкозилирование Ь-аскорбиновой кислоты с применением дрожжевой мальтазы в качестве бпокатализатора

Впервые с применением термофильной ЦГТазы осуществлено трансглюкозилирование бензо[Ь]хиназолинов

Выявлена возможность получения изомальтулозы в проточных условиях С применением двух типов ферментов изучен и осуществлен эффективный процесс получения фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой

Впервые показана возможность совместного получения трансглюкозилпрованных гликозидов стевиола и фруктозо-концевых олигосахаридов

Осуществлен процесс получения высокочистых производных гликозидов Стевии с улучшенными вкусовыми характеристиками

Практическая ценность С использованием термофильной ЦГТазы разработан эффективный метод трансглюкозилирования Ь-аскорбиновой кислоты с получением моноглюкозилированного производного

Предложен экономичный способ получения трансглюкозилпрованных гликозидов стевиола с содержанием функциональных фруктозо-концевых олигосахаридов

Предложен высокоэффективный метод получения высокочистых производных гликозидов Стевии

Предложен эффективный способ непрерывного получения изомальтулозы и фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой с применением иммобилизованных ферментов

Методы получения трансглюкозилированных производных Стевии, изомальтулозы, трегалулозы и трансглюкозилированой L-аскорбиновой кислоты внедрены в производство в компании «PureCircle Sdn Bhd » (Малайзия)

Основные поюжения, выносимые на защиту -из различных типов почв можно выделить культуры микроорганизмов, в том числе их экстремофильные формы - активных продуцентов ЦГТаз, а-глюкозилтрансфераз, ß-фруктофуранозидаз, они являются представителями различных групп микроорганизмов - неспороносных и спороносных бактерий и грибов, -для трансглюкозилирования различных соединений применимы ЦГТазы из определенных продуцентов, которые максимально эффективно могут осуществлять реакцию межмолекулярного трансгликозилирования, -при трансглюкозилировашш бензоЩхиназолилов у-циклодекстрин может служить как эффективным донором, так и комплексообразователем - повышающим водорастворимость и доступность вещества для ферментативной модификации, -выделенные ферменты при выборе эффективного способа иммобилизации могут быть успешно испочьзованы для синтеза различных трансгликозилированных соединений Личный вклад соискателя. выполнение экспериментальных работ и решение основных задач исследований, анализ и обобщение литературы по разрабатываемым вопросам, обобщение полученных результатов и оформление диссертации Постановка основных задач н разработка методолог ий прорабатывались под руководством д б н В А Абеляна

Публикации Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 4-х научных работах

Место выполнения работы. Работа выполнена на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории компании «PureCircle Sdn Bhd » (бывшая «Stevian Biotechnology Corp Sdn Bhd», Малайзия) (2003-2006 гг) Вкусовые характеристики полученных подсластителей определялись на факультете науки и технологии университета «Univeisiti Kebangsaan Malaysia» (Малайзия)

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части из 8 глав, заключения, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, включающего 275 ссылок, и приложений Общий объем диссертации 144 страницы, включая 44 таблицы и 66 рисунков

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

2 1 Культуры микроорганизмов продуцентов ферментов.

В качестве продуцентов ЦГТаз были использованы штаммы аэробных спорообразующих бактерий мезофильные Bacillus maceuins St-39 и Bacillus circulons St-40, термофильные Bacillus stearothermophilus St-88 и В stearothennophilus St-100, галофильные Bacillus halophilus St-60, a также гипертермофильный штамм Thermococciis sp St-1954 В качестве продуцентов мачьтазы использованы штаммы Saccharomyces cerevisiae St-50 St-51 St-52, St-53, St-54 и St-55, а-глюкозилтрансферазы - выделенные нами штаммы неспороносных бактерий Pseudomonas sp St-1372 и Pseudomonas sp St-1391 ß-

фруктофуранозидаз - штаммы микромицетов Aspergillus ntger St-0018 и Aspergillus foetidus St-0194

2 2 Выделение культур-продуцентов. Культуры продуцентов ЦГТаз. Для выделения культур-продуцентов использовали почвенные образцы из различных эколого-географических регионов Малайзии по ранее описанной методике (Абелян, 2001) Thermococcus sp St-1954 получен из коллекции культур «PureCircle Sdn ВЫ » (Малайзия)

Культуры продуцентов мальтаз Saccharomyces cerevisiae получены из коллекции культур компании PureCircle Sdn Bhd » (Малайзия)

Культуры продуцентов а-глюкозилтрансфераз н ^-фруктофуранозидаз выделены из почвенных образцов тропических лесов Малайзии (штаты Сабах, Саравак, Негери Сембилан) Идентификация полученных штаммов проводилась на основе комплекса морфофизиологических и биохимических свойств

Изучение морфо-физиологическнх и биохимических характеристик культур проводили с помощью дифференцирующих тестов, используемых при исследовании аэробных спорообразующих бактерий (Gordon et al, 1973, Bergey's Manual, 1984, 1986) Для определения потребности культур в различных источниках углерода и азота использовали ауксанографический метод (Proom, Knight, 1955)

Выращивание штаммов в глубинных условиях осуществляли на термостатированных качалках типа «Certomat IS» (Германия) и в ферментере «Biostat В» (Германия) на следующих питательных средах

Культуры-продуценты ЦГТаз'

Мезофилы (г/л) Крахмал - 10 0, кукурузный экстракт - 2 5, (NH4)2S04- 5 0 и СаСОз -2 0 (pH 7 0-7 5, 39°С) (Абелян и др, 2002)

Галофилы (г/л) Картофельный крахмал- 20 0, пептон - 10 0, дрожжевой экстракт - 1 0, NaCl - 120 0, KCl - 2 0, MgS04x7H20 - 20 0 (pH 7 0-7 2,37°'С) (Абелян и др , 1995)

Термофилы (г/л) Крахмал - 7 0, кукурузный экстракт - 5 0, NH4CI - 5 3, СаСОз - 2 0 (pH 7 0, 56°С) (Абелян и др , 2002)

Thermococcus sp (г/л) Дрожжевой экстракт — 2 0, NaCl - 20 0, MgS04x2H20 - 3 5, MgCl2x6H20 - 2 75, СаС12х2Н20 - 1 0, КН2Р04 - 0 5, KCl - 0 325, NaBr - 0 05, Н3ВО3 - 0 015, SrCl2x6H20 - 0 0075, (NH4)2Ni(S04)2x2H20 - 0 002, сера - 10 0, Na2Sx9H20 - 0 48(pH 7 0, 85°C) (Tachibana et al, 1999)

Культуры-продуценты мальтаз:

S cerevisiae (г/л) меласса - 140 0, мочевина - 2 5, (NH4)2HP04-0 5 (pH 5 0-5 2, 29°С,

48ч)

Культуры-продуценты а-глюкозилтрансфераз

Pseudomonas sp (г/л) меласса - 50 0, (NH4)2HP04- 0 5 (pH 7 0,30°С, 24ч) Культуры-продуценты /7-фруктофуранозидаз

A niger / A foetidus (г/л) сахароза - 20 0, дрожжевой экстракт - 12 0, карбоксиметилцеллюлоза - 2 0 (pH 5 0, 28°С, 24-48 ч) (Hidaka et al, 1988)

Циклизирующую активность ЦГТаз определяли по (Tilden, Hudson, 1942). деютршшзирующую активность по (Hale, Rawlins,1951), диспропорционирующую и дециклнзирующую активность согласно (Akimaru et al ,1991)

Гомогенность нативных ферментов проверяли методом электрофореза в ПААГ с 2%-ным ДДС-Na (Davis, 1964, Laemmly, 1970) Для определения молекулярных масс в качестве стандартов использовали овальбумин 45 кДа, БСА 66 кДа, фосфорилазу 97 кДа и альдолазу 158 кДа («GE Healthcare», США)

Для опрелстеннн а-глюкозилтрансфердзной активности фермент инкубировали в 20% (в/в) растворе сахарозы при pH 5 5 и температуре 29°С в течение 15 мин За единицу активности принимали количество фермента, которое s условиях эксперимента катализирует образование 1 мкмоля палатинозы за 1 мин

Определение мальтазиой активности проводили согласно (Полыгалина и др, 2003) Определение /У-фруктофурлнозидазной активности проводили модифицированным методом (Sirisansaneeyakul et al, 2000) За единицу /?-фруктофуранозидазной активности принимали количество фермента, которое высвобождало 1 мкмоль глюкозы за 1 мин в условиях эксперимента

Количественное определение ЦД проводили с помощью ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 Senes», (США) на колонке «Zorbax-NIb» (5 мкм, 4 6x250 мм) Применяли подвижную фазу ацетонитрил-вода=70 30 об/об (скорость 2 мл/мин), в качестве детектора используя дифференциальный рефрактометр (Абелян и др , 2002)

Определение аскорбиновой кислоты и ее глюкозилироваиных производных проводили методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 senes» (США) с применением колонки «Zorbax SB С18» (5 мкм, 4 6x150мм) и воды с pH 2 2 (фосфорная кислота) в качестве подвижной фазы Скорость протока 1 мл/мин В качестве детектора использовали УФ-детектор при 245нм

Определение бензо^хиназолннов и их производных проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 senes» (США) в следующих условиях колонка - «Zorbax ODS» (5 мкм, 4 6x250 мм), подвижная фаза - ацетонитрил-вода (50 50, об/об), скорость протока 1 мл/мин, детектор - УФ-детектор при 210 нм

Определение глнкозидов Стевии и их иропзводиых проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 senes» (США) в следующих условиях колонка - «Zorbax NH2» (5 мкм, 4 6 X 250 мм), подвижная фаза - ацетонитрил-вода (70 30, об/об), скорость протока 1 мл/мин, детектор - УФ-детектор при 210 нм

Количественное определение отдельных фруктоолигосахарндов, палатинозы и трегалулозы осуществляли методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 senes» (США) в следующих условиях колонка - «Zorbax nh2» (5 мкм, 4 6 х 250 мм), подвижная фаза -ацетонитрил-вода (70 30, об /об ), скорость протока 2 мл/мин, детектор - дифференциальный рефрактометр

ГЛАВА 3 ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОДУЦЕНТОВ

ФЕРМЕНТОВ

Культуры-продуценты ЦГТаз Изучение штаммов показало, что они имеют в целом близкие морфо-биохимические свойства Галофильный штамм В halophitus St-60 образует кремовые, гладкие, блестящие, округлые с ровными краями колонии Вегетативные клетки палочковидные, однородные Споры средние, сферические, терминального расположения и раздувают клетку

По основным морфо-биохимическим характеристикам термофильные штаммы В stearothermophilus St-88 и St-100 схожи Они ферментируют pnöoiy, маннозу, глюкозу, мальтозу, маннит и глицерин Не ферментируют ксилозу, рамнозу, арабинозу, сахарозу, галактозу, лактозу, раффинозу, инулин, дульцит, сорбит Гидролизуют крахмал, гиппурат, казеии и желатин, не гидролизуют тирозин и эскулин Усваивают цитрат Клетки палочковидные, грамположительные Споры эллипсоидные, терминального и паратерминального расположения На пептон-кукурузном агаре образуют кремовые, влажно-блестящие, плоские, гладкие котонин с волнистыми краями, в среду не врастают

Культуры-продуценты а-глюкозилтрансфераз. По основным морфо-биохимическим характеристикам штаммы Pseudomonas sp St-1372 и St-1391 схожи На питательном агаре через 3 дня инкубирования в термостате при температуре 28°С вырастают круглые, выпуклые колонии с ровными краями и диаметром 1-Змм Поверхность колонии гладкая, опалесцирующая, серо-белого цвета

Культуры-продуценты /?-фруктофуранозидаз. Штаммы А mger St-0018 и А foetidus St-0194 характеризовались по морфо-культуральным признакам (Билай, Коваль, 1988)

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ

Характеристика ЦГТаз. Основные характеристики ЦГТаз приведены в табл 1 Галофильная ЦГТаза синтезирует только /J-ЦЦ и оптимальное значение pH находится несколько выше чем у мезофильных ЦГТаз Термофильные ЦГТазы функционируют при более высоких значениях температуры и в качестве основного ЦЦ образуют преимущественно а-ЦЦ ЦГТаза из Thermococcus sp St-1954 отличается более высокой термостабильностью (110°С) и оптимальной температурой циклизации 90°С Она способна осуществлять трансферазную реакцию в отношении многих соединений, но особенно важна ее высокая трансферазная активность в отношении гликозидов Стевии

Таблица 1

Некоторые характеристики ЦГТаз

Прод>цепт Мол масса, кДа Опт температура, °С Термоста-би чьность, °С Опт pH pH стабщь-ностъ Основной ЦД

В macerans St-39 74 50-55 55 55 5 0-9 0 Р а' У

В circultmvSt-40 88 50-55 55 4 0-4 5 5 0-8 5 ß-a-y

В stearothermophilus St-88 65 60-65 70 6 0-6 5 5 5-8 5 а ß у

В stearothermophilus St-100 68 65-70 70 6 0-6 5 6 0-9 0 а р-у

В halopMus St-60 70 50 50 6 5-7 0 6 0-9 0 ß

Характеристика а-глюкозилтрансфераз Фермент из штамма Pseudomonas sp St-1372 образовывал изомальтулозу с большим выходом, чем фермент Pseudomonas sp St-1391 Оптимальное значение pH у фермента из штамма Pseudomonas sp St-1391 несколько выше чем у а-глюкозилтрансферазы из Pseudomonas sp St-1372

Таблица 2

Некоторые характеристики «-глюкознлтрансфераз Рвешктюпаз¡р

Продуцент [¡Ы\1П, % Опт температура, °С Опт рН Ап, (мМ) (мМ/мин)

Изомаль-тулоза 'Грсга- гулоза

['^ис1от<та\ у) 31-1372 85 8 29 5 5 50 638

[^сиЛогттаз \р 51 1391 78 11 29 60 80 420

Характеристика /?-фруктофуранозидаз. Основные характеристики использованных ферментов приведены в табл 3

Таблица 3

Некоторые характеристики /?-фруктофуранозндаз

Продуцент Мол масса, ьДа Опт температур.!, °С Термоста-бнльность, °С Опт рн рН стабильность Синтез ФОС, %

К 11 ФН

4 тцег 81-0018 90 55 65 5 5 5 0-7 5 21 3 30 8 88

А /оаи/т 81-0194 82 55 65 60 4 5-7 5 34 0 99 -

Примечание К-кестоза Н-нистоза, ФН-фруктозилнисгоза

ГЛАВА 5. ТРАНСГЛЮКОЗНЛ ИРОВАНИЕ Ь-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изучены особенности получения 2-0-а-0-гл10копирапозил-1,-аскорбиновой кислоты (АК-2Г) с применением ЦГТаз различных групп микроорганизмов, а также дрожжевых мальтаз

Среди изученных ЦГТаз наибольшей эффективностью обладают ферменты из термофильных штаммов, при которых кочичество трансферных продуктов достигает 52-57% ЦГТаза из галофилыюго штамма способна только незначительному транепкжолпированшо При этом для всех ферментов наиболее подходящим донором глюкозных единиц является у-ЦЦ Дальнейшие эксперименты проводили с ЦГТазой В НеапхИегтор/пШз 81-88

С увеличением исходной концентрации субстратов до 50% скорость реакции существенно ускоряется и увеличивается количество трансферных продуктов Весовое соотношение АК у-ЦЦ =13 явтяется оптимальным

Влияние количества фермента С увеличением количества фермента до 500 единиц на 1 г АК наблюдалось увеличение скорости реакции и общего выхода трансферных продуктов Дальнейшее увеличение приводило к снижению количества высокомолекулярных производных и общему снижению степени трансформации

Влияние рН и температуры Оптимальный рН находился в пределах 5 5-6 0, что несколько ниже, чем это установлено для реакции циклизации (рН 6 0-6 5) Оптимальная температура транспюкозилирования находилась в пределах 60°С, что является также оптимальным значением процесса получения ЦЦ с применением этого фермента

С увеличением продолжительности реакции повышается степень трансглюкозилирования Типичная ВЭЖХ-грамма трансглкжозилирования АК с помощью ЦГТазы В 51ет оЛегторЫм 81-88 приведена на рис 1

Таким образом, показано, что среди ЦГТаз фермент В^¡еагоЛеггпоркПт 81-88 является наиболее эффективным биокатализатором при трансгликозилировании аскорбиновой кислоты с использованием у-ЦЦ в качестве донора глюкозильных единиц. Следует отметить, что в качестве донора с успехом могут быть использованы также мальтодекстрины. Выявлено, что мальтазы дрожжей также способны осуществлять трансглюкозилирование АК.

Рис.1. Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансглюкозилирования аскорбиновой кислоты

ЦГТазой В^еагоАетюрЬПж 81-88 за 24 ч (А) и 48 ч (В).

С целью осуществления процесса в проточных условиях изучали возможность иммобилизации ЦГТазы В. еагоЛегторЬ'йих 81-88 на различных носителях методами адсорбции, ковалентного связывания и включения (Абелян 1989; 2001) Наилучшие результаты по остаточной активности получены при иммобилизации фермента методом включения в различные природные гели. Удовлетворительные результаты получены также при использовании метода адсорбции на различных ионнообменных смолах. Однако в обоих случаях иммобилизация не обеспечивала высокую жизнеспособность биокатализатора. В этом отношении метод ковалентного связывания ЦГТазы с активированным силикагелем дает возможность осуществлять реакцию трансглюкозилирования в проточных условиях в течение 90 суток.

В оптимальных условиях реакции степень трансглюкозилирования достигает до 65%, что примерно на 10-15% выше, чем у известных технологий. Разработан достаточно эффективный метод очистки и кристаллизации конечного продукта. Процесс успешно внедрен в крупномасштабное производство в компании «РигеС/гск $с1п. В!гс1.» (Малайзия).

ГЛАВА 6. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ ДИТЕРИЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ

Цель наших исследований состояла в изучении возможности повышения эффективности процесса с использованием более высоких температур, улучшении пищевой характеристики продукта превращением остаточных мальтодекстринов в смесь фруктозо-концевых олигосахаридов, а также получении высокочистых производных с наилучшими вкусовыми характеристиками.

В качестве биокатализатора использовании ЦГТазу, продуцируемую культурой Ткегтососсш яр. 81-1954.

Оптимальный рН процесса составляет 5.5. Оптимальная температура процесса находилась в пределах 70-75°С, т.е. несколько ниже, чем для циклизирующей активности (90°С). Увеличение количества вносимого фермента и количества сухих веществ приводит

к ускорению процесса трансгликозилирования. Весовое соотношение гликозидов и крахмала в пределах 1.0 : 2.0 - 1.0 : 0.2 не оказывало существенного влияния па степень трансгликозилирования. Однако, чем выше концентрация крахмала, тем ниже степень сладости получаемого продукта и наоборот. С коммерческой точки зрения соотношение компонентов 1:1 (вес/вес), приводящее к сладости продукта в пределах 160-170, является наиболее приемлемой. При 70°С и соотношении субстратов 1:1, реакция практически заканчивается за 18-20 часов (рис.2).

Время, час

Рис.2. Степень трансформации (А,%) в зависимости от продолжительности реакции.

Образовавшийся продукт содержит значительное количество (15-20%) мальтоолигосахаридов. Для улучшения функциональных и вкусовых свойств продукта было предложено трансформировать образовавшиеся мальтоолигосахариды в фрукгозо-концевые олигосахариды (ФКО). С этой целью после 12 часов процесса трансгликозилирования гликозидов Стевии к реакционной смеси добавляли сахарозу в количестве 60% от расчетного количества мальтоолигосахаридов и продолжали реакцию в течение 6 часов при тех же условиях. Типичная ВЭЖХ-грамма образовавшихся ФКО представлена на рис 3.

Рис.3. Типичная ВЭЖХ-грамма ФКО образовавшихся в результате трансформации остаточных мальтоолигосахаридов под действием ЦГТазы Thermococcus sp. St-1954.

С целью получения продукта с большим содержанием высокоценных моно- и диглюкозилированных производных стевиозида реакционную смесь полученную после трасглюкозилирования подвергали дополнительной обработке /í-амилазой и очищали на специфическом адсорбенте «Diaion НР-20».

Таким образом, показана возможность применения высоких температур для трансглюкозилирования сладких гликозидов Стевии. Разработанный метод позволяет в 2-3 раза сократить время реакции без какого-либо ухудшения качества продукта, что приводит к существенному экономическому эффекту. Также впервые предложено трансформирование остаточных мальтоолигосахаридов в ФКО, что значительно улучшает функциональные и вкусовые свойства полученного продукта. Предложен также метод очистки гликозилированных производных с наилучшими вкусовыми характеристиками, в частности

moho- и диглюкозилированного оевиозида Процессы успешно внедрены в крупномасштабное производство в компании «PureCircle Sdn Bhd » (Малайзия)

ГЛАВА 7 ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАШ1Е БЕНЗО[Н]Х11Н\ЗОЛПНОВ

Изучена возможность трансгликозилирования бензо[Ь]хиназолинов под действием различных ферментов, таких как ЦГТаза, пуллуланаза, /?-амилаза, /5-галактозидаза и /?-фруктофуранозидаза

Бензо[Ь]хиназолины со свободными гидроксильными или кетоновыми группами синтезированы в лаборатории синтеза спирогетероциклических соединений Института тонкой органической химии НАН РА

Трансгликозилирование осуществляли в гетерогенных условиях с использованием соответствующих доноров в водных средах или в двухфазных системах

В условиях эксперимента образование какого либо производного не было идентифицировано в случае пуллуланазы, /?-амилазы, /?-галактозидазы и /3-фруктофуранозидазы С другой стороны ЦГТаза осуществляла трансгликозилирование как в гетерогенных, так и двухфазных системах При этом были использованы ЦГТазы различных групп микроорганизмов из мезофильных В macerans St-39 и В circulans St-40, термофильных В stearothermophilus St-88, В stearothermophilus St-100, а также галофлльного штамма В halophilus St-60 Среди них только ЦГТазы термофильных штаммов проявляли способность к трансглюкозилированию бензо[Ь]хиназолинов Наиболее эффективном была ЦГТаза, продуцируемая В stearothermophilus St-88, а среди бензо[Ь]хинаюлинов наиболее склонными к трансглюкозилированию оказались соединения МА-4215 и МА-4217 В качестве доноров гликозильных единиц применяли крахмал, мальтодекстрин, а также а-, [>- и

7-ЦЦ

Выявлено, что вследствие незначительной водорастворимости во всех случаях степень трансглюкозилирования была очень низкой и находилась в пределах 10-15%

Для более эффективного трансглюкозилирования проводили предварительное комплексообразование с у-ЦД При данном методе наблюдалось увеличение количества трансглюкозилированных производных примерно на 30% Вероятно это связано с тем, что у-ЦЦ образует комплекс с бензо[11]хиназолинами с сравнительно большей растворимостью в воде и одновременно выступает в качестве донора глюкозильных единиц Это создает благоприятные условия для трансглюкозилирования

С увеличением исходной концентрации субстратов до 40% реакция существенно ускоряется и увеличивается количество трансферных продуктов Весовое соотношение бензоВДхиназолик у-ЦЦ = 1 3 является оптимальным

Влияние количества фермента С увеличением количества вносимого фермента до 150 единиц на 1 г бензоЩхиназолинов наблюдалось увеличение скорости реакции и общего выхода трансферных продуктов Дальнейшее увеличение не влияло на эффективность процесса

Влияние рН и температуры Оптимальный рН находился в пределах 5 5-6 0, температура - 60°С, что является также оптимальным значением процесса циклизации для данного фермента С увеличением продолжительности реакции повышается степень

трансглгокозилирования Однако, после 72 ч реакции общее количество трансферных продуктов почти не увеличивалось

Типичные ВЭЖХ-граммы продуктов реакции приведены на рис 4

Рис 4 Типичная ВЭЖХ-грамма прод> ктов трансглюкозилирования соединения МА-4215 ЦГТазой В steaiolhermophtlus St-88 (А) исходная смесь, (В) реакционная смесь после 36ч и (С) 72ч протекания реакции

Таким образом, впервые осуществлен ферментативный синтез глюкозилированных бензо[Ь)хиназолинов Показано, что при правильном подборе соответствующих условий реакция может протекать с достаточной эффективностью Полученные производные водорастворимы, что очень важно при приготовлении лекарственных средств

ГЛАВА 8 ПОЛУЧЕНИЕ ПАЛАТИНОЗЫ (ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ)

Изучены особенности образования палатинозы из сахарозы с использованием свободной и иммобилизованной а-глюкомтгрансферазы вновь выделенных штаммов Pseudomonas sp St-1372 и Pseudomonas sp St-1391 - продуцентов внутриклеточного фермента

Выявлено что трансформация имеет четкую зависимость от pH и достигает своего максимума при pH 5 5-6 0 Оптимальная температура для обоих ферментов находилась около 29°С С увеличение концентрации субстрата вплоть до 60%, увеличивается степень трансформации и, соответственно выходы палатинозы и трегалулозы, в то время как при низких концентрациях образуются значительные количества фруктозы и глюкозы С увеличением количества фермента до 15 ед/г сахарозы повышается степень конверсии в случае с обоими катализаторами Дальнейшее увеличение не приводит к какому-нибудь заметному эффекту С увеличением продолжительности реакции увеличивается степень трансформации и реакция практически заканчивается через 24 часа

Однако, с технологической точки использование очищенных или полу очищенных ферментных препаратов связано с существенно большими затратами, поэтому была изучена возможность применения иммобилизованных целых клеток в качестве бнокагаллзатора

С этой целью иммобилизацию клеток осуществляли методом включения в различные гели, такие как полиакриламид (ПААГ), триацетат целлюлозы, агар, каррагинан и альгинат кальция Для ионного прикрепления и адсорбции клеток на различных носителях, последние смешивали с 0 5 г клеток в 10 мл деионизированной воды и при 4°С перемешивали в течение 18 часов Биокатализатор тщательно промывали деионизированной водой Наилучшие результаты получены при их включении в 2%-ныи гель альгината кальция

Для осутцествчения эффективного синтеза палатинозы с применением пммобгпизованных меток определены оптимальные параметры реакции Установлено, что

аналогично интактным клеткам, иммобилизованные формы проявляют свою наилучшую активность в пределах рН 5 5-6 5 с оптимумом при рН 6 0, т е на 0 5 единиц больше, чем в случае с интакгными клетками Кроме того, после иммобилизации область значений рН для эффективного ведения процесса расширилась Оба биокатализатора проявляли свою максимальную активность при 30°С При более высоких температурах наблюдалось существенное падение ферментативной активности Однако данное падение было более резким для интактных клеток

Непрерывное получение палатинозы осуществляли в условиях 4-х секционного биореактора сплошного заполнения

Для определения оптимальной рабочей температуры, была исследована зависимость между скоростью протока раствора субстрата и образованием палатинозы при различных температурах Наилучшие результаты получены при температурах 30-35°С При более низких температурах, хотя и обеспечивается высокая стабильность, для полного превращения субстрата в продукт требуется слишком много времени

Изучена динамика инактивации биокатализатора в условиях четырехсекционного биореактора Для этого раствор 50%-ной сахарозы (рН 6 0) при 30°С и удельной скорости 0 3 час"1 пропускали через колонки снизу вверх Через определенные отрезки времени определяли количество образовавшейся палатинозы на выходе каждой колонки Выявлено, что иммобилизованные клетки во всех секциях «активизируются» в течение 7-8 суток, а на 24-е сутки их активность выше первоначальной в среднем 1 46-1 70, 1 50-1 74, 1 58-1 78 и 1 66-1 81 раза для первой, второй, третьей и четвертой секций соответственно (табл 4)

Данная «активация» может быть результатом роста клеток или их акклиматизацией к применяемым условиям, а различие между эффективностями начальных и конечных колонок - различной стабильностью иммобилизованных клеток в растворах сахарозы и палатинозы Они более стабильны в растворе продукта, чем субстрата

Таблица 4

Изменение активности иммобилизованных клеток Pseudomonas sp St-1372 (а) и St-1391

Секция, № Относительная активность, % Соотношение активностей

Исходная (а„) через 8 cvt (Л,) через 24 сут (А2) А,/А„ а2/а0

а б а 6 а б а б а б

1 48 41 82 78 70 70 1 70 1 95 1 46 1 70

2 50 43 83 80 75 80 1 66 1 78 1 50 1 74

3 55 49 87 87 87 87 1 58 1 74 1 58 1 78

4 60 55 100 100 100 100 1 66 1 81 1 66 ] 81

Время полужизни катализатора на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp St-1372 и St-1391 составляет около 70 и 65 суток соответственно Процесс с применением иммобилизованных клеток Pseudomonas sp St-1372 внедрен в производство в компании «PureCircle Sdn Bhd »(Малайзия)

ГЛАВА 9. ПОЛУЧЕНИЕ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДОВ СОВМЕСТНО С ПАЛАТИНОЗОЙ

Изучены особенности получения ФОС с применением /?-фруктофуранозидаз A mger St-0018 и A foetidus St-0194 и улучшение диетических свойств полученного продукта трансформацией остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу под действием а-глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp St-1372

Влияние pH и температуры Ферменты сильно ингибировались при щелочных значениях pH реакционной среды Оптимум pH составил 5 5 и 6 0 для ß-фруктозофуранозидаз A mger St-0018 и Л foetidus St-0194, соответственно

Трансферазиая реакция ira 40%-нои сахарозе для обоих ферментов наиболее эффективно протекает в пределах температур 50-65°С с оптимумом при 55°С

Концентрация субстрата При низких концентрациях субстрата наблюдается образование преимущественно глюкозы и фруктозы, те протекает реакция гидролиза Эффективность трансфруктозилироваиия увеличивается с повышением исходной концентрации субстрата Одновременно уменьшается количество моносахаридов и увеличивается выход трансферных продуктов В случае с ферментом A foetidus St-0194 не выявлено образования фруктозил-нистозы (табл 5)

Влияние количества фермента С увеличением количества вносимого фермента наблюдалось определенное ускорение реакции и повышение выхода трансферных продуктов Оптимальным является количество фермента 3-5 ед на 1 г сахарозы при продолжительности реакции около 24 ч

Продолжительность реакции также играет важную роль для эффективного трансфрухтозилирования Для изучения динамики накопления отдельных продуктов реакцию осуществляли при 55°С в течение 24 ч с использованием 55%-ного раствора сахарозы и 2 5 ед фермента на 1 г сахарозы

Таблица 5

Влияние концентрации сахарозы на образование ФОС Д-фруктофуранозидазои

Сахароза, % Трансферные продукты, % Общий выход ФОС, %

Глюкоза Сахароза 1-Кесюза Нистоза Фруетозил-нистоза

А Б А Б А Б А Б А Б А Б

10 40 7 38 5 17 1 33 1 197 25 3 21 0 3 1 1 5 - 42 2 28 4

20 33 6 36 4 162 29 8 20 4 301 25 2 37 46 - 50 2 33 8

40 31 7 31 5 11 7 29 4 23 9 33 0 27 3 61 54 - 56 6 391

50 30 2 30 7 105 26 5 24 6 34 9 28 8 79 59 - 59 3 42 8

60 26 4 28 6 80 25 3 29 2 37 7 29 4 84 68 - 65 6 46 1

Примечание (А)Л ш^егБИМЛв (Б) 4 решки

В случае с ферментом А пщег 8Ю018 в начале реакции происходит образование преимущественно 1-кестозы, концентрация которой достигает своего максимума примерно через 5 ч после начала реакции В дальнейшем ее количество постепенно снижается, в то время как накопление более высокомолекулярных производных продолжается Количество нистозы нарастает вплоть до 14 ч, после чего также постепенно снижается С другой стороны, синтез фруктозил-нистозы начинается после 5 ч реакции и за 24 ч ее содержание в

реакционной смеси достигает 8 0% Однако, оно может быть существенно выше при использовании более высоких концентраций фермента Общее количество ФОС достигает своего максимума через 5 ч реакции и остается практически неизменным вплоть до 14 ч процесса, меняется только соотношение продуктов В дальнейшем содержание кестозы, нистозы и фруктозил-нистозы несколько снижается, в то время как количество сахарозы остается неизменным

Типичные ВЭЖХ-граммы продуктов реакций с применением /?-фруктофуранозидаз А п^ег 8Ю018 иА /оепЛи 84-0194 представлены на рис 5

VA.____„_

Рис 5 Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансфрукгозилирования /?-фруктофуранозидазой А mger St-0018 (А) и А foeüdus St-0194 (В)

Непрерывное получение ФОС Для непрерывного получения ФОС клетки А пщег иммобилизовали методом включения в 2%-ный альгинат кальция Полученный биокатализаторы использовали без дополнительной обработки или после дополнительной сшивки полученных гранул полиэтиленимином, а затем -глутаровьш альдегидом (Kida et al, 1988) Выявлено, что иммобилизация в 2%-ном альгинате приводит к наибольшему сохранению исходной активности Операционная стабильность полученного биокатализатора в непрерывных условиях находится в пределах 180-200 суток

Трансформации остаточной сахарозы в палатииозу и Tpeia.iy.ioij Для превращения остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу использовали иммобилизованные клетки Pseudomonas sp St-1372 Для этого, полученную на выходе биореактора с иммобилизованными клетками с /?-фруктофуранозидазной активностью смесь фруктоолигосахаридов пропускали через вторую колонку, заполненную иммобилизованными клетками Pseudomonas sp (при 29°С) Удельную скорость устанавливали в пределах 0 2-0 3 час 1 В указанных условиях практически вся остаточная сахароза превращалась в палатинозу и трегалулозу

Типичная ВЭЖХ-грамма полученного сиропа представлена на рис 6

I S '

Рис 6 Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансформации остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу иммобилизованными клетками Pseudomonas sp (А), исходная смесь, (В), смесь после трансформации

Таким образом, разработан эффективный метод получения сиропа ФОС с применением свободных и иммобилизованных клеток A niger St-0018 и A foetidus St-0194 с ß-фру ктофу ранозпдазпой активностью Впервые показана воможность превращения остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу, которые существенно улучшают качественные характеристики ФОС и могут расширить области их применения Процесс с применением иммобилизованных клеток A mger St-0018 и Pseudomonas sp St-1372 внедрен в производство в компании «PureCircle Sdn Bhd » (Малайзия)

ВЫВОДЫ

1 В результате микробиологических анализов образцов различных типов почв с применением метода накопительной культуры выделены перспективные кучьтуры микроорганизмов - активных продуцентов ЦГТаз, а-глюкозилтрансфераз и ß-фруктофуранозидаз

2 На основе комплекса микробиологических исследований морфо-физнологлческих и биохимических особенностей культуры активных продуцентов трансфераз идентифицированы как представители родов Bacillus, Pseudomonas и Aspergillus

3 Изучены и оптимизированы условия биосинтеза наиболее перспективных ЦГТаз, а-глюкозилтрансфераз и /?-фруктофуранозидаз, в том числе экстремофильных форм

4 Показано, что реакция межмолекулярного трансглюкозилировашш наиболее выраженно проявляется у ЦГТаз термофильных штаммов

5 Установлено, что при трансглюкозилировашш аскорбиновой кислоты наиболее эффективным донором глюкозных единиц является у-ЦД

6 Выявлено, что трансглюкозюшрование бензо[11]хиназол1шов протекает с наибольшей эффективностью при их предварительном комплексообразовании с у-ЦД

7 Выявлено, что ЦГТаза Thermococcus sp осуществляет эффективное трансглюкозилирование сладких гликозидов Stevia rebaudiana Bertom при высоких температурах в присутствии крахмала в качестве донора глюкозных единиц Разработан эффективный метод получения высокочистых гликозилированных производных стевиозида Остаточные мальтодекстрины могут быть трансформированы в фруктозо-концевые олпгосахариды под действием ЦГТаз

8 Исследованы особенности получения изомальтулозы из высококонцентрированных растворов сахарозы под действием свободной и иммобилизованной форм а-глюкозилтрансфераз Pseudomonas sp Установлено, что степень и эффективность процесса находятся в строгой зависимости как от концентрации субстрата и фермента, так и от внешних факторов pH, температуры и длительности реакции

9 Установлена возможность биокаталитического получения фруктоолигосахаридов под действием свободной и иммобилизованной форм Д-фруктофуранозидаз A mger из концентрированных растворов сахарозы Выявлено, что остаточная сахароза с успехом может быть превращеца в палатинозу под действием а-глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Циклодекстрингликозилтрансферазы высокоактивного штамма Bacillus stearothermophilus St-88 рекомендуются для производства ферментативно модифицированной L-аскорбиновой кислоты в присутствии у-ЦД в качестве донора

2 Метод предварительного комплексообразования с у-ЦД перед трансглюкозилированием рекомендуется для биокаталитической модификации нерастворимых в воде органических соединений со свободными гидроксильными или кетоновыми группами

3 Термофильная циклодекстрингликозилтрансфераза Thermococcus sp St-1954 рекомендуется для организации производства высокочистых трансглюкозшшрованных гликозидов Slevia rebaudiana Bertom и их смеси с фруктозо-концевыми олигосахаридами

4 а-Глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp St-1372 и St-1391 рекомендуются для организации производства изомальтулозы в проточных и непрерывных условиях

5 уЗ-Фруктофуранозидазы, продуцируемые штаммами Aspergillus mger St-0018 и Aspergillus foetidus St-0194 и а-глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp St-1372 рекомендуются для организации производства фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Markosyan A A Transglycosylation of L-ascorbic acid by free and immobilized cyclomaltodextnn glucanotransferases, Electronic Journal of Natural Sciences of National Academy of Sciences of RA, 2005, V 2(5), p 15-19

2 Markosyan A A Synthesis of Palatinose Electronic Journal of Natural Sciences of National Academy of Sciences of RA, 2005, V 2(5), p 20-23

3 Маркосян AA, Абелян JIA, Адамян МО, Акопян ЖИ, Абелян В A Трансгликозилирование L-аекорбпновой кислоты Прикл биохим и микробиол, 2007, т 43, №1, с 42-46

4 Маркосян А А, Абелян J1A, Адамян МО, Экажев ЗД, Акопян ЖИ, Абелян В А Получение фруктоолигосахаридного сиропа из сахарозы совместно с палатинозой и трегалозой Прикл биохим и микробиол, 2007, т43, №4, с 424-431

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г Уфа, ул Комссомольская, 2 Заказ №8, т 100,2008, Формат 60x90 1/16 Уч пл 1,3, уел печ л 1,16 Бумага офсетная Отпечатано методом ризографии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маркосян, Аветик Ашотович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. БИОКАТАЛИЗ: ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБНЫХ

ТРАНСГЛИКОЗИДАЗ (Обзор литературы).

1.1. Микробные источники биокатализаторов.

1.2. Стабилизация биокатализаторов.

1.3. Биокатализаторы с трансгликозидазной активностью.

1.4.1. Трансгликозилирование витаминов.

1.4.2. Гликозилированные антибиотики.

1.4.3. Трансгликозилированные алкалоиды.

1.4.4. Гликозилированные стероиды и терпеноиды.

1.4.5. Гликозилированные полифенольные соединения.

1.4.6. Олигосахариды, синтезированные с применением трансгликозидаз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Культуры микроорганизмов продуцентов ферментов.

2.2. Выделение культур-продуцентов.

2.3. Морфо-физиологические и биохимические особенности культур микроорганизмов.

2.4. Выращивание микроорганизмов.

2.5. Определение ферментативной активности.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ.

3.1. Культуры микроорганизмов продуцентов ЦГТаз.

3.2. Культуры микроорганизмов продуцентов а-глюкозилтрансфераз.

3.3. Культуры-продуценты /?-фруктофуранозидаз.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ.

4.1. Характеристика ЦГТаз.

4.2. Характеристика а-глюкозилтрансфераз.

4.3. Характеристика /?-фруктофуранозидаз.

ГЛАВА 5. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ L-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

5.1. Трансглюкозилирование АК с использованием ЦГТазы.

5.2. Трансглюкозилирование АК с использованием мальтазы дрожжевых штаммов.

5.3. Трансглюкозилирование аскорбиновой кислоты в проточных условиях.

ГЛАВА 6. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ

ГЛАВА 7. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕНЗО[Ь]ХИНАЗОЛИНОВ.

7.1. Трансгликозилирование бензо[Ь]хиназолинов под действием различных микробных ферментов.

7.2. Трансглюкозилирование бензо[Ь]хиназолинов под действием ЦГТаз.

ГЛАВА 8. ПОЛУЧЕНИЕ ПАЛАТИНОЗЫ (ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ).

ГЛАВА 9. ПОЛУЧЕНИЕ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДОВ СОВМЕСТНО С

ПАЛАТИНОЗОЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение биологически активных продуктов с применением микробных трансгликозидаз"

Актуальность работы. Биокатализ и биотрансформация составляют одну из перспективных и ключевых направлений современной биотехнологии. Биокаталитические процессы обладают рядом преимуществ перед традиционным органическим синтезом и широко внедряются в различные области промышленности для направленного синтеза различных высокоценных соединений. При этом обеспечивается избирательность и стереоспецифичность катализируемых реакций (Березин и др. 1976; Скрябин, Головлева, 1976; Atkinson, 1995; Sheldrake et al., 1998; Abelyan, 2005; Hou 2005; Biocat - 2004, 2006).

Преимущества ферментов как промышленных катализаторов основаны на их способности проведения стерео- и региоселективных превращений без применения химических защитных групп, а также возможности осуществления труднореализируемых процессов с высоким выходом конечного продукта. Кроме того, применение биокатализаторов позволяет сократить стадии традиционного химического синтеза, обычно требующего несколько ступеней протекции и депротекции функциональных групп и таким образом существенно снизить экономические издержки. В некоторых случаях микробный катализ и трансформация являются единственно возможным подходом создания практически безотходных технологий и экологически чистых производств (Iizuka, Naito, 1981; Anastas, Williamson, 1998; Demain et al., 1999; Anastas, Kirchhoff, 2002).

Однако в настоящее время существует определенная нехватка действительно эффективных биокатализаторов, пригодных для использования в промышленном масштабе, что вызывает настоятельную необходимость проведения новых исследований в данном направлении. Часто только это является препятствием для получения новых продуктов с новыми более уникальными свойствами.

В биокаталитических процессах особое место занимают ферменты с ярко выраженной трансгликозилирующей активностью, достаточно широко применяющиеся для получения различных высокоценных продуктов. Так, циклодекстрингликозилтрансфераза (ЦГТаза), /?-фруктофуранозидаза, а-глюкозилтрансфераза (изомальтулозсинтаза), /?~галактозидаза, мальтаза и другие используются для ферментативного синтеза циклодекстринов и их производных, фруктоолигосахаридов, лактосахарозы, эрлозы, галактоолигосахаридов, изомеров сахарозы и прочих. С другой стороны, при подборе соответствующих исходных материалов и определенных условий реакции их можно использовать для получения совершенно новых соединений или улучшения некоторых характеристик известных соединений (Best et al., 1994; Demain et al., 1999; Stanbmy et al., 1999).

Таким образом, в настоящее время применение различных биокатализаторов, в частности с трансгликозилирующей активностью, является актуальным направлением работ для получения новых продуктов и модификации различных физиологически активных соединений с целью улучшения их функциональных свойств.

Цели и задачи работы. ■ Основной целью являлись выделение и использование ферментов микробного происхождения с трансгликозилирующей активностью для направленной трансформации и модификации витаминов, углеводов, дитерпеновых гликозидов и бензоЩхиназолинов с целью улучшения их характеристик и выработки новых продуктов.

Для осуществления указанной цели поставлены следующие задачи:

• выделить и охарактеризовать культуры-микробов, в том числе их экстремофильные формы - активных продуцентов ЦГТазы, /?-фруктофуранозидазы и а-глюкозилтрансферазы;

• изучить морфо-физиологические и биохимические свойства перспективных продуцентов;

• изучить и оптимизировать условия биосинтеза перспективных микробных ферментов;

• выделить, очистить наиболее перспективные ферменты и изучить их некоторые физико-химические и биохимические свойства;

• разработать эффективные методы трансглкжозилирования L-аскорбиновой кислоты, бензо[Ь]хиназолинов и дитерпеновых гликозидов;

• изучить и оптимизировать процесс получения изомальтулозы с применением свободной и иммобилизованной а-глюкозилтрансферазы;

• изучить и осуществить процесс получения фруктоолигосахаридов совместно с палатинозой с применением нативных и иммобилизованных а-глюкозилтрансферазы и /?-фруктофуранозидазы.

Научная новизна работы. Из различных типов почв с применением оригинальной методики и направленной селекции выделены микробные штаммы активных продуцентов ЦГТазы, /?-фруктофуранозидазы и а-глюкозилтрансферазы. Разработаны методы их очистки и иммобилизации.

Показано, что ЦГТазы экстремофильных форм микроорганизмов могут быть эффективными биокатализаторами в реакции трансглкжозилирования L-аскорбиновой кислоты и дитерпеновых гликозидов.

Впервые осуществлено трансглюкозилирование L-аскорбиновой кислоты с применением дрожжевой мальтазы в качестве биокатализатора.

Впервые с применением термофильной ЦГТазы осуществлено трансглюкозилирование бензо [Ь]хиназолинов.

Выявлена возможность получения изомальтулозы в проточных условиях. С применением двух типов ферментов изучен и осуществлен эффективный процесс получения фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой.

Впервые показана возможность совместного получения трансглюкозилированных гликозидов стевиола и фруктозо-концевых олигосахаридов.

Осуществлен процесс получения высокочистых производных гликозидов Стевии с улучшенными вкусовыми характеристиками.

Практическая ценность. С использованием термофильной ЦГТазы разработан эффективный метод трансглюкозилирования L-аскорбиновой кислоты с получением моноглюкозилированного производного.

Предложен экономичный способ получения трансглюкозилированных гликозидов стевиола с содержанием функциональных фруктозо-концевых олигосахаридов.

Предложен высокоэффективный метод получения высокочистых производных гликозидов Стевии. г

Предложен эффективный способ непрерывного получения изомальтулозы и фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой с применением иммобилизованных ферментов.

Методы получения трансглюкозилированных производных Стевии, изомальтулозы, трегалулозы и трансглюкозилированой L-аскорбиновой кислоты внедрены в производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).

Основные положения, выносимые на защиту:

- из различных типов почв можно выделить культуры микроорганизмов, в том числе их экстремофильные формы - активных продуцентов ЦГТаз, а-глкжозилтрансфераз, /?-фруктофуранозидаз, они являются представителями различных групп микроорганизмов - неспороносных и спороносных бактерий и грибов;

- для трансглюкозилирования различных соединений применимы ЦГТазы из определенных продуцентов, которые максимально эффективно могут осуществлять реакцию межмолекулярного трансгликозилирования;

- при трансглюкозилировании бензо|Ъ]хиназолинов у-циклодекстрин может служить как эффективным донором, так и комплексообразователем - повышающим водорастворимость и доступность вещества для ферментативной модификации;

- выделенные ферменты при выборе эффективного способа иммобилизации могут быть успешно использованы для синтеза различных трансгликозилированных соединений.

Личный вклад соискателя: выполнение экспериментальных работ и решение основных задач исследований, анализ и обобщение литературы по разрабатываемым вопросам, обобщение полученных результатов и оформление диссертации. Постановка основных задач и разработка методологий прорабатывались под руководством д.б.н. В.А. Абеляна.

Публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 4-х научных работах.

Место выполнения работы. Работа выполнена на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (бывшая «Stevian Biotechnology Corp. Sdn. Bhd.», Малайзия) (2003-2006 гг.). Вкусовые характеристики полученных подсластителей определялись на факультете науки и технологии университета «Universiti Kebangsaan Malaysia» (Малайзия).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части из 8 глав, заключения, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, включающего 275 ссылок, и приложений. Общий объем диссертации 144 страницы, включая 44 таблицы и 66 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Маркосян, Аветик Ашотович

выводы

1. В результате микробиологических анализов образцов различных типов почв с применением метода накопительной культуры выделены перспективные культуры микроорганизмов - активных продуцентов ЦГТаз, а-глюкозилтрансфераз и /?-фруктофуранозидаз.

2. На основе комплекса микробиологических исследований морфо-физиологических и биохимических особенностей культуры активных продуцентов трансфераз идентифицированы как представители родов Bacillus, Pseudomonas и Aspergillus.

3. Изучены и оптимизированы условия биосинтеза наиболее перспективных ЦГТаз, а-глюкозилтрансфераз и /^-фруктофуранозидаз, в том числе экстремофильных форм.

4. Показано, что реакция межмолекулярного трансглюкозилирования наиболее выраженно проявляется у ЦГТаз термофильных штаммов.

5. Установлено, что при трансглюкозилировании аскорбиновой кислоты наиболее эффективным донором глюкозных единиц является у-ЦД.

6. Выявлено, что трансглюкозилирование бензо[Ь]хиназолинов протекает с наибольшей эффективностью при их предварительном комплексообразовании с у-ЦД.

7. Выявлено, что ЦГТаза Thermococcus sp. осуществляет эффективное трансглюкозилирование сладких гликозидов Stevia rebaudiana Bertoni при высоких температурах в присутствии крахмала в качестве донора глюкозных единиц. Разработан эффективный метод получения высокочистых гликозилированных производных стевиозида. Остаточные мальтодекстрины могут быть трансформированы в фруктозо-концевые олигосахариды под действием ЦГТаз.

8. Исследованы особенности получения изомальтулозы из высококонцентрированных растворов сахарозы под действием свободной и иммобилизованной форм а-глюкозилтрансфераз Pseudomonas sp. Установлено, что степень и эффективность процесса находятся в строгой зависимости как от концентрации субстрата и фермента, так и от внешних факторов: рН, температуры и длительности реакции.

9. Установлена возможность биокаталитического получения фруктоолигосахаридов под действием свободной и иммобилизованной форм /^-фруктофуранозидаз A.niger из концентрированных растворов сахарозы. Выявлено, что остаточная сахароза с успехом может быть превращена в палатинозу под действием а-глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Циклодекстрингликозилтрансферазы высокоактивного штамма Bacillus stearothermophilus St-88 рекомендуются для производства ферментативно модифицированной L-аскорбиновой кислоты в присутствии у-ЦД в качестве донора.

2. Метод предварительного комплексообразования с у-ЦД перед трансглюкозилированием рекомендуется для биокаталитической модификации нерастворимых в воде органических соединений со свободными гидроксильными или кетоновыми группами.

3. Термофильная циклодекстрингликозилтрансфераза Thermococcus sp. St-1954 рекомендуется для организации производства высокочистых трансглюкозилированных гликозидов Stevia rebaudiana Bertoni и их смеси с фруктозо-концевыми олигосахаридами.

4. а-Глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp. St-1372 и St-1391 рекомендуются для организации производства изомальтулозы в проточных и непрерывных условиях.

5. /?-Фруктофуранозидазы, продуцируемые штаммами Aspergillus niger St-0018 и Aspergillus foetidus St-0194 и а-глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp. St-1372 рекомендуются для организации производства фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркосян, Аветик Ашотович, Уфа

1. Абелян В.А. II Получение и применение иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов. / Ереван: Изд-во АН Армении. 1989. - 391С.

2. Абелян В.А. II Циклодекстрины: получение и применение. / Ереван: Ван Арьян. 2001. -519 С.

3. Абелян В.А., Адамян М.О., Абелян JI.A., Балаян A.M., Африкян Э.Г. Новая цикломальтодекстрин глюканотрансфераза из галофильного бацилла. // Биохимия. 1995. -Т. 60.-N6.-С. 891-897.

4. Беленький M.JI. // Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. / Л.: Медгиз. 1963. - 152 С.

5. Березин КВ., Антонов В.К., Мартинек К. (ред.) Иммобилизованные ферменты. // Изд-во Московского Университета. 1976. - Т.1,2. - 296 С; 358 С.

6. Билай В.И., Коваль Э.З. // Аспергиллы. Определитель. / К.: Наукова думка. 1988. - 204 С.

7. Вайтилявичус А. И. Определение бактериальной желатиназы простым методом. // Лаборат. Дело. 1977. - N 10. - С. 626-627.

8. Имшенецкий А.А. (ред.) Ферменты микроорганизмов. // Москва, «Наука». 1972.

9. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований // М.: "Медицина". 1978. - 392 С.

10. Леин Л.Н. Способ определения скорости изменения рН среды микроорганизмами. // Тез. Докл. Всес. Конф. "Автоматиз. Биотехнол. пр-в Автоматиз-90 ", Пущино, 24-26 сентября, 1990. С. 39-40.

11. Першин Г.Н. II Методы экспериментальной химиотерапии. / М.: Медицина. 1971. - 540 С.

12. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. И Определение активности ферментов. / Москва: ДеЛи Принт. 2003. - 372 С.

13. Сафразбекян P.P., Сукасян Р.С. // Биол. журн. Армении. 1970. - т. 23. - №9. - С. 31.

14. Скрябин Г.К., Головлева JI.A. И Использование микроорганизмов в органическом синтезе. / Москва: Наука. 1976. - 336 С.

15. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. II Экспериментальная оценка противоопухолевых веществ в СССР и США. / Медицина-М. -1980.

16. Угарова Н.Н., Кутузова Г.Д. II Итоги науки и техники, серия «Биотехнология». / Москва., ВИНИТИ. 1986. - Т. 5 - С. 5-50.

17. Abelyan V.A., Balayan A.M., Ghochikyan V.T., Markosyan A.A. Transglycosylation of stevioside by cyclodextrin glucanotransferases of various groups of microorganisms. // Appl. Biochem. Mikroboil. (Moscow). 2004. - V. 40(2). - P.129-134.

18. Abelyan V.H. II Biocatalytic synthesis: preparation of high value products. / Kuala Lumpur, Stevian Biotechnology Corp. Sdn. Bhd. 2005. - 523P.

19. Abuchowski A., Davis, F.F. II Enzyme as Drugs. / (Holcenberg, J.S., and Robert, J., eds), John Wiley & Sons, New York. 1981. - P. 367-383.

20. Aga H., Yoneyama M., Sakai S., Yamamoto I. Synthesis of 2-O-a-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid by cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus. И Agric. Biol. Chem. -1991.-V. 55.-P. 1751-1756.

21. Akimaru K, Yagi Т., Yamamoto S. Purification and properties of Bacillus coagulans cyclodextrin glucanotransferase. // J. Ferment. Bioengin. -1991. V. 71. - N 1. - P. 63-65.

22. Albrecht H.P. II Naturally Occurring Glycosides. / Ikan R., Ed., John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, New York. 1999. - P. 83-123.

23. Allen P.J., Bacon J.S.D. Oligosaccharides formed from sucrose by fructose-transfering enzymes of higher plants. // Biochem. J. 1956. - V. 63. - P. 200-206.

24. Anastas P.T., Williamson T.C. II Green chemistry: frontiers in benign chemical syntheses and processes. / New York, Oxford University Press. 1998. - P. 1-26.

25. Anastas P. Т., Kirchhoff M.M. Origins and Current Status of Green Chemistry. // Acc. Chem. Res. 2002. - V. 35. - P. 686-694.

26. Arcamone F. И Anticancer agents based on natural product models. / Academic Press, New York. 1980.

27. Atkinson R.S. //Stereoselective Synthesis. / John Wiley & Sons. 1995. - 542P.

28. Bakal A.I., Nabors L.O., Gelardi R.C. //Alternative sweeteners / N.Y.: Marcel Dekker. 1986. - P. 295-307.

29. Ballesteros A. II Stability and stabilization of biocatalysts. / Elsevier. 1998. - 778P.

30. Balls A.K., Walden M.K., Thompson R.R. A crystalline /^-amylase from sweet potatoes. // J. Biol. Chem. 1948. - V. 173. - P. 9-19.

31. BaruaA.B., Olson J.A. Chemical synthesis and growth-promoting activity of all-trans-retinyl i-D-glucuronide. // Biochem. J. 1987. - V. 244. - P. 231-234.

32. Bavelsias V., Mariott J.H., Melin C, Design and Synthesis of Cyclopentag.qinazoline based Antifolates as Inhibitors of Thymidilate Synthetase and potential Antitumor Agents. // J. Med. Chem. - 2000. - N43. - P.1910-1926.

33. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (eds. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G.) // Baltimore, London, Los-Angeles, Sydney: Williams and Wilkins Co. 1986. - V. 2. - P. 1104-1139.

34. Best D., Boross L., Cabral J.S., Tramper J. II Applied Biocatalysis. / CRC Press. 1994. -478P.

35. Biocat 2004. И Book of Abstracts, Second International Congress on Biocatalysis. / 29 August -1 September 2004, Hamburg, Germany.

36. Biocat 2006. II Book of Abstracts, Third International Congress on Biocatalysis. /3-7 September 2006, Hamburg, Germany.

37. Blakely J.A., MacKenzie S.L. Purification and properties of a (3-hexosidase from Sporobolomyces singularis. II Can. J. Biochem. 1969. - V.47. - P. 1021-1025.y I

38. Blaustein M.P. Physiological effects of endogenous ouabain: control of intracellular Ca stores and cell responsiveness//Am. J. Physiol. 1993.- V. 264.-P. 1367-1387.

39. Boger D.L., Honda Т., Menezes R.F., Colletti S.L. Total Synthesis of Bleomycin A2 and Related Agents. Synthesis and Comparative Evaluation of Deglycobleomycin A2, Epideglycobleomycin A2, Deglycobleomycin Ai, and Desacetamido-, Descarboxamido-,

40. Desmethyl-, and Desimidazolyldeglycobleomycin A2. // J. Am. Chem. Soc. 1994. - V. 116.-P. 5631-5646.

41. Bruni C.B., Sica V., Auricchio F.,Covelli I. Further kinetic and structural characterization of the lysosomal a-D-glucoside glucohydrolase from cattle liver. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. -V. 212. - P. 470-477.

42. Carrupt P.A., Testa В., Bechalany A., El Tayar N. Descas P., Perrissoud D. Morphine 6-glucuronide and morphine 3-glucuronide as molecular chameleons with unexpected lipophilicity. // J. Med. Chem. 1991. -V. 34. - P. 1272-1275.

43. Casazza M.A., De Marco A., Bertazzoli C., Formeli F., Giuliani F., Pratesi F. II Curr. Chemother., Proc. Int. Congr. Chemother. 10th. 1978. - P. 502.

44. Cassady J.M., Li G.S., Spitzner E.B., Floss H.G. Ergot alkaloids. Ergolines and related compounds as inhibitors of prolactin release. // J. Med. Chem. 1974. - V. 17. - P. 300-307.

45. Cheetam P.S.J. The extraction and mechanism of a novel isomaltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici. //Biochem. J. 1984. - V. 220. - P. 213-220.

46. Cheetham P.S.J., Imber C.E., Isherwood J. The formation of isomaltulose by immobilized Erwinia rhapontici. II Nature. 1982. - V. 299. - P. 628-631.

47. Chibata I., Tosa Т., Takamatsu S. Industrial production of L-alanine using immobilized Escherichia coli and Pseudomonas dacunhae. II Microbiol. Sci. 1984. - V. 1. - P. 58-62.

48. Chiba S., Okada S., Kitahata S., Shimomura T. A new trisaccharide, 2-a-maltosyl-glucose, synthesized by the transglycosylation reaction of cyclodextrin glycosyltransferase. // Agric. Biol. Chem. 1975. - V. 39. - P. 2353-2357.

49. Crammer В., Ikan R. // Progress in the chemistry and properties of the rebaudioside / (Grenby T.B.) Developments in Sweeteners, London, Elsevier. 1987. - V.3. - P. 45-64.

50. D'Silva C., Williams C.H., Massey V. Identification of methionine-110 as the residue covalently modified in the electrophilic inactivation of D-amino-acid oxidase by 0-(2,4-dinitrophenyl) hydroxylamine. // Biochemistry. 1987. - V. 26. - P. 1717-1722.

51. Darbyshire В., Henry R.J. The distribution of fructans in onions. // New Phytol. 1978. - V. 81.-P. 29-34.

52. Davies J., Davis B.D. Misreading of Ribonucleic Acid Code Words Induced by Aminoglycoside Antibiotics. The Effect of Drug Concentration. // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243.-P. 3312-3316.

53. Davis B.G. Disk-electrophoresis. Method and application to human serum proteins. // Ann.-N.Y.- Acad. Sci. 1964. - V. 121. - P. 404-427.

54. Demain A.L., Davies J.E, Atlas R.M., Cohen G., Hershberger C.L., Ни W.S., Sherman D.H., Willson R.C., David J. H. (Eds.) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology / American Society Microbiology. 1999. - 830 P.

55. DePinto J.A., Campbell L.L. Purification and properties of the amylase of Bacillus macerans. II Biochemistry. 1968. - V. 7. - P. 114-120.

56. DeSantis G., Jones J. B. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality. // Curr. Opinion in Biotechnol. 1999. - V. 10. - P. 324-330.

57. Doi S.A., Landless P.N. Digoxin in clinical practice: sorting out the facts. // Br. J. Clin. Pract. -1995.-V. 49(5).-P. 257-261.

58. Duch D.S., Banks S., Dev I.K. Biochemical and Cellular Pharmacology of 1843U89, A Novel Benzoquinazoline Inhibitor of Thymidilate Synthetase. // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 810818.

59. Eich E., Eichberg D., Schwarz G., Clas F., Loos M. Antimicrobial activity of clavines. // Arzneim-Forsch. Drug Res. 1985. - V. 35 (12). - P. 1760-1762.

60. Fernandez-Lafuente R., Rossel C.M., Alvaro G., Guisan J.M. Additional stabilization of penicillin G acylase-agarose derivatives by controlled chemical modification with formaldehyde. // Enz. Microb. Technol. 1992. - V. 14 . - P. 489-495.

61. Flanagan P.R., Forstner G.G. Purification of rat intestinal maltase/glucoamylase and its anomalous dissociation either by heat or by low pH. // Biochem. J. 1978. - V. 173. - P. 553563.

62. Floss H.G., Gunther H., Mothes U., Becker I. Isolation of elymoclavin-0-/?-D-fructoside from cultures of ergot. IIZ. Naturforsch. 1966 . - V. 22(4). - P. 399-402.

63. French D. //-Amylases. // Boyer, P.D., Lardy, H. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 2nd edn., Academic Press, New York. 1960. - V. 4. - P. 345-368.

64. French D„ Levine M.L., Norberg E., Norden P., Pazur J.H., Wild, G.M. Studies on the Schardinger dextrins. VII. Co-substrate specificity in coupling reactions of Macerans amylase. // J. Am. Chem. Soc. 1954. - V. 76. - P. 2387-2390.

65. Frot-Coutaz J., Letoublon R., DegiuliA., Fayet Y., Audigier-Petit C., Got R. Spatial aspects of mannosyl phosphoryl retinol formation. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V. 841. - P. 299305.

66. Fujii S„ Kishihara S., Komoto M., Shimizu J. Isolation and characterisation of oligosaccharides produced from sucrose by transglucosylation action of Serratia plymuthica. II Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 1983. - V. 30 . - P. 339-344.

67. Fujita К., Нага К., Hashimoto Н, Kitahara S. Transfructosylation catalyzed by /?-fructofuranosidase from Arthrobacter sp. K-l. // Agric. Biol. Chem. 1990. - V. 54. - P. 26552661.

68. Fukunaga Y., Miyata Т., Nakayasu N., Mizutani K., Tanaka O.R. Enzymic transglucosylation products of stevioside: separation and sweetness evaluation. // Agric. Biol. Chem. 1989. - V. 53.-P. 1603-1607.

69. Fulder S. // The Root of Being. Ginseng and the Pharmacology of Harmony. / Hutchinson and Co., Publ. Ltd., London, Melbourne, Sydney, Auckland, Johannesburg. 1980.

70. Fullerton D.S., Kihara M., Deffo Т., Kitatsuji E., Ahmed K, Simat В., From A.H.L., Rohrer D.C. Cardiac glycosides. A systematic study of digitoxigenin D-glycosides. // J. Med. Chem. -1984. V. 27(3). - P. 256-261.

71. Gallup J.M., Barua A.B., Furr H.C., Olson J.A. Effects of retinoid /?-glucuronides and N-retinoyl amines on the differentiation of HL-60 cells in vitro. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1987.-V. 186.-P. 269-274.

72. Ge M., Chen Z., Onishi H.R., Kohler J., Silver L.L., Kerns R., Fukuzawa S., Thompson C., Kahne D. Vancomycin Derivatives That Inhibit Peptidoglycan Biosynthesis Without Binding D-Ala-D-Ala. // Science. 1999. - V. 284 . - P. 507-511.

73. GeunsJ.M.C. Stevioside. // Phytochemistry. 2003. - V. 64. - P. 913-921.

74. Goda Т., Hosoya N. Hydrolysis of palatinose by rat intestinal sucrase-isomaltase complex. //J. Jap. Soc. Nutr. Food Sci. 1983. - V. 36 . - P. 169-173.

75. Gordon R.E., Haynes W.C., Pang C.H. W. The Genus Bacillus. II Agricult. Handbook, Washington D.C. 1973. - N 427. - 283 P.

76. Gotor V., Menendez E. Synthesis of oxime esters through an enzymatic oximolysis reaction. // Synlett. 1990. - V. 11. - P. 699-700.

77. Grdadolnik S.G., Pristovsek P., Mierke D.F. Vancomycin: Conformational Consequences of the Sugar Substituent. // J. Med. Chem. 1998. - V. 41 . - P. 2090-2099.

78. Gregory III J.F. Nutritional Properties and Significance of Vitamin Glycosides. // Annu. Rev. Nutr. 1998 . - V. 18 . - P. 277-296.

79. Gunning D.В., Barua A.B., Lloyd R.A., Olson J.A. Retinoyl /?-glucuronide: A nontoxic retinoid for the topical treatment of acne. // J. Dermatol. Treat. 1994. - V. 5 . - P. 181-185.

80. Hale W.S., Rawlins L.C. Method for reducing sugars determination. // Cereal Chem. 1951. - V. 28. -N 1. - P. 49-58.

81. Hartsel S.C., Benz S.K., Peterson R.P., Whyte B.S. Potassium-selective amphotericin В channels are predominant in vesicles regardless of sidedness. // Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 77-82.

82. Hayashi S., Imada K, Kushima Y. and Ueno H. Observation of the chemical structure of fructooligosaccharide produced by an enzyme from Aureobasidium sp. ATCC 20524. // Curr. Microbiol. 1989. -V. 19 . - P. 175-177.

83. Hayashi S., Ito K, Nonoguchi M., Takasaki Y., Imada K. Immobilization of a fructosyl-transferring enzyme from Aureobasidium pullidans on Shirasu porous glass. // J. Ferment. Bioeng. -1991.-V. 72.-P. 68-70.

84. Hehre E.J. Enzymic synthesis of polysaccharides: a biological type of polymerization. // Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 1951. - V. 11. - P. 297-337.

85. Herve M., Dedouzy J.C., Borowski E., Cybulska В., Gary-Bobo C.M. II Biochim. Biophys. Acta.- 1989.-V. 980. P. 261.

86. Hidaka H., Eida Т., Saitoh Y. Industrial production of fructooligosaccharides and its application for human and animals. // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1987. - V. 61. - P. 915-923.

87. Hidaka H., Eida Т., Takizawa Т., Tokunaga Т., Tashiro Y. Effect of fructooligosaccharides on intestinal flora and human health. // Bifidobacteria Microflora. 1986. - V. 5. - P. 37-50.

88. Hidaka H., Hirayama M., Sumi N. A fructooligosaccharide producing enzyme from Aspergillus niger ATCC 20611. // Agric. Biol. Chem. 1988. - V. 52. - P. 1181-1187.

89. HouC.T. //Handbook of industrial biocatalysis. / Boca Raton, CRC Press-2005. 616P.

90. Huang J.H., Hsu L.H., Su Y.C. Conversion of sucrose to isomaltulose by Klebsiellaplanticola CCRC 19112. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 21. - P. 22-27.

91. Husain S., Jafri F., Saleemuddin M. Effects of chemical modification on the stability of invertase before and after immobilization. // Enz. Microb. Technol. 1996. - V. 18. - P. 275280.

92. Iizuka H., Naito A. II Microbial conversion of steroids and alkaloids. / University of Tokyo Press. 1981.-330P.

93. Jackson R.C., Jackman A.L., Calvert A.H. Biochemical effects of quinazoline inhibitor of thymidilate synthetase CB 3717 on human lymphoblastiod cells. // Biochem. Pharmacol. -1983. V32. - P.3783-3790.

94. Jene Q., Pearson J.C., Lowe C.R. Surfactant modified enzymes: Solubility and activity of surfactant-modified catalase in organic solvents. // Enz. Microbiol. Technol. 1997. - V. 20. -P. 69-74.

95. Jones P.H., Rowley E.K. Chemical modifications of erythromycin antibiotics. 3'-De(dimethylamino)erythromycin A and В. I I J. Org. Chem. 1968. V. 33. P. 665.

96. Jones T.R., Calvert A.H., Jackman A.L. Antitumor quinazoline inhibitor of thymidilate synthetase: Synthesis, biological properties and therapeutic results in mice. // Eur. J. Cancer. -1981. V17. - P. 17-19.

97. Joseph Т., McCormick D.В. Uptake and metabolism of riboflavin-5'-a-D-glucoside by rat and isolated liver cells.//J. Nutr. 1995. - V. 125. - P. 2194-2198.

98. Jurgens C., Strom A., Wegener D., Hettwer S., Wilmanns M., Sterner R. Directed evolution of a (beta alpha)(8)-barrel enzyme to catalyze related reactions in two different metabolic pathways. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. - V. 97(18). - P. 9925-9930.

99. W.Kaneda N., Kasai R., Yamasaki К, Tanaka O. Chemical studies on sweet diterpene glycosides of Stevia rebaudiana: conversion of stevioside into rebaudioside А. И Chem. Pharm. Bull. Jpn. -1977.-V. 25. P. 2466-2467.

100. Kaufmann F., Wohlfarth G., Diekert G. Isolation of O-demethylase, an ether-cleaving enzyme system of the homoacetogenic strain MC. // Arch. Microbiol. 1997. - V.168. - P.136-142.

101. Kawai K„ Okuda Y, Yamashita K. Changes in blood glucose and insulin after an oral palatinose administration in normal subjects. // Endocrinol. Japon. 1985. - V. 32. - P. 933936.

102. Wl.Kawai K., Okuda Y., Chiba Y. and Yamashita K. Palatinose as a potential parenteral nutrient; its metabolic effects and fate after oral and intravenous administration to dogs. // J. Nutr. Sc. Vitaminol. 1986. - V. 32. - P. 297-306.

103. Keller-Juslen C., Kuhn M., von Wartburg A., Stahelin H. J. Synthesis and antimitotic activity of glycosidic lignan derivatives related to podophyllotoxin. // Med. Chem.- 1971. V. 14. - P. 936-940.

104. Kempka G., Roos P.H., Kolb-Bachofen V. A membrane-associated form of C-reactive protein is the galactose specific particle receptor on rat liver macrophages. // J. Immunol. - 1990 . — V. 144.-P. 1004-1009.

105. Kida M., Yoshikawa Т., Senda Т., Yoshihiro Y. Formation of fructooligosaccharides from sucrose catalyzed by immobilized /?-fructofuranosidase originated from Aspergillus oryzae. // NipponKagakuKashi. 1988,- V. 11.-P. 1830-1835.

106. King E.O., WardM.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. // J. Lab. Clin. Med. 1954. - V. 44(2). - P. 301-307.

107. Kinghorn A.D., Soejarto D.D. Current status of stevioside as a sweetening agent for human use // Wagner H., Hikino H., Famsworth N.R. Economic and medicinal plant research. Academic Press. 1985.-V. l.-P. 1-52.

108. Kitahata S., Ishikawa H„ Miyata Т., Тапака О. Production of rubusoside derivatives by transgalactosylation of various /?-galactosidase. // Agric. Biol. Chem. 1989. - V. 53. - N 11. -P. 2923-2928.

109. Kohda H., Kasai R„ Yamasaki K, Murakami К, Tanaka O. New sweet diterpene glucosides from Stevia rebaudiana. // Phytochem. 1981. - V. 15. - P. 981-986.

110. Kohda H., Tanaka O. Enzymatic hydrolysis of Ginseng saponins and their related glycosides. // Yakugaku Zasshi. 1975. - V. 95(2). - P. 246-249.

111. Кио C.H., Wells WW. /?-Galactosidase from rat mammary gland. Its purification, properties, and role in the biosynthesis of 6/?-0-D-galactopyranosyl myoinositol. // J. Biol. Chem. 1978. -V. 253. P. 3550-3556.

112. Kuramoto Т., Ito Y„ Oda M. Microbial Production of Glycyrrhetic Acid 3-0-Mono-/?-D-Glucuronide from Glycyrrhizin by Cryptococcus magnus MG-27. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994.-V. 58.-P. 455.

113. Laemmly V.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

114. Lee E.Y.C., Whelan W.J. Glycogen and starch debranching enzymes. // Boyer, P.D. (Ed.), The Enzymes, 3rd edn., Academic Press, New York. 1972. - V. 5. - P. 191-234.

115. Lee Y.J., Kim C.S., Oh D.K. Lactulose production by /?-galactosidase in permeabilized cells of Kluyveromyces lactis. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 64(6). - P. 787-793.

116. Levin Y., Pecht M., Goldstein L., Katchalski E. A water-insoluble polyanionic derivative of trypsin. I. Preparation and properties. // Biochemistry. 1964. - V.3. - N12. - P. 1905-1915.

117. Lockie J.D., Horwitz S.B. Effects of podophyllotoxin and VP-16-213 on microtubule assembly in vitro and nucleoside transport in HeLa cells. // Biochemistry. 1976. - V. 15. - P. 54355443.

118. Lumry R. Some aspects of thermodynamics and mechanism of enzyme catalysis. // Enzymes. -1959.-V. l.-P. 157.

119. Lumry R., Eyring E. Conformation changes of proteins. // J. Phys. Chem. 1954. - V. 58. - P. 110.

120. Lundblad R.L. // Chemical Reagents for Protein Modification. / CRC Press, Boca Raton. -1991.

121. Lynch S.R., Cook J. D. Interaction of vitamin С and iron. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980. - V. 355.-P. 32-44

122. Lyn O'Brien N. II Alternative sweeteners. / Marcel Dakker, Inc.: New York. 2001. - 553P.

123. Lynn K.R. Effects of radiation on a silica-trypsin compound suspended in aqueous buffer. // Radiat. Res. 1972. -V. 51. - P. 265.

124. Mandai Т., Yoneyama M., Sakai S., Muto N., Yamamoto I. The crystal structure and physicochemical properties of L-ascorbic acid 2-glucoside. // Carbohydr. Res. 1992. -V. 232. -P. 197-205.

125. Manners D.J. Enzymic synthesis and degradation of starch and glycogen. // Adv. Carbohydr. Chem. 1962. - V.17. - P.371-430.

126. Manners D.J. Observations on the specificity and nomenclature of starch debranching enzymes. 11 J. Appl. Glycosci. 1997. - V.44. - P.83-85.

127. Mannisto P.T. Catechol O-methyltransferase: characterization of the protein, its gene, and the preclinical pharmacology of COMT inhibitors. // Adv. Pharmacol. 1998. - V. 42. - P. 324328.

128. Markstein R., Seiler M.P., Jaton A., Briner U. Structure-activity relationship and therapeutic uses of dopaminergic ergots. // Neurochem. Int. 1992. - V. 20. - P. 211S-214S.

129. Middleton E., Kandaswami С. II The Flavonoids. / Harborn J.B., (Ed.), Chapman & Hall, London, New York, Madras. 1993. - P. 337-385.

130. Mizutani K., Kuramoto K., Tamura Y., Ohtake N., Doi S., Nakamura M., Tanaka O. Sweetness of glycyrrhetic acid 3-0-/?-D-monoglucuronide and the related glycosides. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. - V. 58. - P. 554-555.

131. Moore M.H., Hunter W.N., d'Estaintot B.L., Kennard O. DNA-drug interactions : The crystal structure of d(CGATCG) complexed with daunomycin. I I J. Mol. Biol. 1989. - V. 206. - P. 693-705.

132. Morita H., Sato Y., ChanK.-T., Choo C.-Y., ItokawaH., Takeya K., KobayashiJ. Samoquazine A, a Benzoqunazoline Alkaloid from Seeds of Annona sqamosa. II J. Nat. Prod. 2000. - V.63. - №12. -P. 1707-1708

133. Mosetting E., Beglinger U., Dolder F., Lichiti H., Quitt P., Waters J.A. The absolute configuration of steviol and isosteviol. // J. Amer. Chem. Soc. 1963. - V. 85. - P. 2303-2305.

134. Mozhaev V.V., Berezin I.V., Martinek K. Structure-stability relationship in proteins: fundamental tasks and strategy for the development of stabilized enzyme catalysts for biotechnology. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1988. -V. 23. - P. 235-284.

135. ПО.Mulder G.J. Pharmacological effects of drug conjugates: is morphine 6-glucuronide an exception? // Trends Pharmacol. Sci. 1992. - V. 13(8). - P. 302-304.

136. Murase #., Moon J.H., Yamauchi R., Kato K„ Kunieda Т., Yoshikawa Т., Terao J. Antioxidant activity of a novel vitamin E derivative, 2-(a-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol. // Free Radic. Biol. Med. 1998. - V. 24(2). - P. 217-225.

137. Murase H., Yamauchi R„ Kato K., Kunieda Т., Terao J. Synthesis of a novel vitamin E derivative, 2-(a-D-glucopyranosyl) methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol, by a-glucosidase-catalyzed transglycosylation. // Lipids. 1997. - V. 32(1). - P. 73-78.

138. МЪ.МШо N., Ban Y., Akiba M., Yamamoto I. Evidence for the in vivo formation of ascorbic acid 2-O-a-glucoside in guinea pigs and rats. // Biochem. Pharmacol. 1991. - V. 42. - P. 625-631.

139. Muto N., Suga S., Fujii K, Goto K, Yamamoto I. Formation of a stable ascorbic acid 2-glucoside by specific transglucosylation with rice seed a-glucosidase. // Agric. Biol. Chem. — 1990b. V. 54. - P. 1697-1703.

140. Пб.МугЬаск К. Invertases. // Boyer, P.D., Lardy, H. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 2nd edn., Academic Press, New York. 1960. - V.4. - P.379-396.

141. Nagai Y., Sugitani Т., Tsuyuki К Characterisation of a-glucosyltransferase from Pseudomonas mesoacidophila MX-45. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. -V. 58. - P. 1789-1793.

142. Nakajima, Y. Palatinose production by immobilized a-glucosyl transferase. // Proc. Res. Soc. Jpn. Sugar Refineries Technol. 1984. - V. 33. - P. 55-63.

143. M.Nakano H„ Gregory III J.F. Pyridoxine-5'-/?-D-glucoside influences the short-term metabolic utilization of pyridoxine in rats. // J. Nutr. 1995. - V. 125(4). - P. 926-932.

144. Nath K, Olson J.A. Natural occurrence and biological activity of vitamin A derivatives in rat bile. // J. Nutr. 1967. - V. 93(4). - P. 461-469.

145. Neumann N.P., Lampen J.O. Purification and properties of yeast invertase. // Biochemistry. -1967.-V. 6.-P. 468-475.

146. Ooshima Т., Izumitani A., Sobue S., Ikahasi N., Hamada S. Non-cariogenicity of the disaccharide palatinose in experimental caries of rats. // Infect. Immun. 1983. - V. 39. - P. 4349.

147. Polleroni N.J., Doudoroff M. Some properties and taxonomic subdivisions of the genus Pseudomonas. //Annu. Rev. Phytopathol. 1972. - V. 10. - P.73-100.

148. Paul D., Standifer K.M., Inturrisi C.E., Pasternak G.W. Pharmacological characterization of morphine-6-/?-glucuronide, a very potent morphine metabolite. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1989. V. 251 (2). - P. 477-483.

149. Pawlak J.L., Padykula R.E., Kronis J.D., Aleksejczyk R.A., Berchtold G.A. Structural requirements for catalysis by chorismate mutase. // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. - P. 3374-3381.

150. Pendergast W., Dickerson S.H., Dev I.K. Benzof.quinazoline Inhibitors of Thymidilate Synthetase: Methyleneamino Linked Aroyl - glutamate Derivatives. // J. Med. Chem. - 1994. -V. 37 - P. 838-844.

151. Rambeck W.A., Weiser H., Meier W., Labler L., Zucker H. Biological activity of the three mono-/?-D-glucopyranosides of 1,25-dihydroxycholecalciferol. // Int. J. Vitam. Nutr. Res. -1985.-V. 55(3).-P. 263-267.

152. Rayburn J.R., Bantle J.A., Friedman M.J. Role of Carbohydrate Side Chains of Potato Glycoalkaloids in Developmental Toxicity. // Agric. Food Chem. 1994. - V. 42. - P. 15111515.

153. Robert S., Domurado D., Thomas D., Chopineau J. Optimization of RNase A artificial hydrophobization in AOT reversed micelles. // Enzyme Engineering XII (Legoy, M.D., and Thomas, D., eds), The New York Acad. Sci., N.Y. 1995. - P.l21-124.

154. Rose R.C., Bode A.M. Biology of free radical scavengers: an evaluation of ascorbate. // FASEB J.- 1993.-V. 7. P. 1135-1142.

155. Sacks L.E., Alderton G. Determination of urease activity. // J. Bacteriol. 1961. - N. 82. - P. 331336.

156. Schwimmer S. Evidence for the purity of Schardinger dextrinogenase. // Arch. Biochem. Biophys. 1953. - V. 43.-P. 108-117.

157. Setahell K.D.R., Lawson A.M., Borriello S.P., Adlercreulz H„ Axelson M. Falk Symp. 31 (Colonic carcinogenesis). 1982. - P. 93.

158. Sowdhamini R., Balaram P. H Thermostability of Enzymes (Gupta, M.N., ed.). / Springer Verlag, Heidelberg/Narosa, India. 1993. - P. 2-21.

159. Spengler M„ Somogyi J.C., Pletcher E, Boehme K. Tolerability, acceptance and energetic conversion of isomalt (Palatinit) in comparison with sucrose. // Akt. Ernahrung. 1987. - V. 12.-P. 210.

160. St anbury P.F., Whitaker A., Hall S. II Principles of Fermentation Technology. / Butterworth

161. Heinemann. 1999. - 376 P. 225.Stubbe J., Kozarich J. W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation. // Chem. Rev.- 1987.-V. 87.-P. 1107.

162. Stirling D.I. The use of aminotransferases for the production of chiral amino acids and amines. // Chirality in Industry. (Collins A.N., Sheldrake G.N., Crosby J., eds.). Wiley. - New York. -1992.-P. 209-222.

163. Summer R. D., French D. Action of /^-amylase on branched oligosaccharides. // J. Biol. Chem.1956.-V. 222.-P. 469-473 22%.Suzuki Y., Suzuki К Enzymatic formation of 4-G-a-glucopyranosyl-rutin. // Agric. Biol. Chem.- 1991. -V.55. -P.l 81-187.

164. Suzuki Y., Uchida K. Formation of ^-galactosyl compounds of arabinosylcytosine in growing culture of Sporobolomyces singularis. II Biosci. Biotech. Biochem. 1994. - V. 58(4). - P. 639-643.

165. Suzuki Y, Uchida K. Riboflavin a-glucoside-synthesizing enzyme from pig liver. // Meth.

166. Tajima S., Pinnell S.R. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Ascorbic acid increases type I procollagen mRNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - V. 106. -P. 632-637.

167. Takazoe I. New trends on sweeteners in Japan. // Int. Dent. J. 1985. - V. 35. - P. 58.

168. Takechi M., Uno C., Tanaka Y. Structure-activity relationships of saponins and cardiac glycosides. /?-L-xylopyranosyl-(l-->6)-ct- and -/7-D-glucopyranosides. // Biol. Pharm. Bull. -1998.-V. 21.-P. 1234-1235.

169. Takechi, M„ Tanaka, Y. Structure-activity relationships of synthetic digitoxigenyl glycosides. // Phytochemistry. 1994. -V. 37(5). - P. 1421-1423.

170. TakeuchiK, SakaiS„ Miyake T. Crystalline erlose. //US Pat. 4,758,660. 1988.

171. Тапака М., Muto N., Yamamoto I. Characterization of Bacillus stearothermophilus cyclodextrin glucanotransferase in ascorbic acid 2-O-a-glucoside formation. // Biochim. Biophys. Acta. 1991.-V. 1078.-P. 127-132.

172. Agents DDATHFLY 254155 and LY 231514.//J.Org.Chem.- 1997,-V. 62. P.5392-5403. 2A\.Thompson C., Ge M., Kahne D. Synthesis of Vancomycin from the Aglycon. // J. Am. Chem. Soc. - 1999.-V. 121.-P. 1237-1244.

173. Tilden E.B., Hudson C.S. Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and Bacilluspolymyxa. // J. Bacterid. 1942. - V. 43. - N 2. - P. 527-544.

174. Tsuge H., Maeno M., Hayakawa Т., Suzuki Y. Comparative study of pyridoxine-a-, /?-glucosides, and phosphopyridoxyl-lysine as a vitamin Вб nutrient. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. -1996.-V. 42(5).-P. 377-386.

175. Uchida K„ Suzuki Y. Enzymatic synthesis of a new derivative of thiamin, O-a-glucosylthiamin. // Biosci. Biotech. Biochem. 1998. - V. 62(2). - P. 221-224.

176. Van Den Tweel W.J.J., Harder A., Buitelaar R.M. Stability and Stabilization of Enzymes. // Int. Symp. Maastricht, 1992 (Studies in Organic Chemistry). Elsevier Science Ltd. 1993 - 520 P.

177. Veronese Т., Perlot P. Mechanism of sucrose conversion by the sucrose isomerase of Serratia plymuthica ATCC 15928. // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. - P. 263-269.

178. Wakamiya H., Suzuki E., Yamamoto I., Akiba M., Arakawa N. In situ intestinal absorption of 2-O-a-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid in guinea pigs. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1995. - V. 41.-P. 265-272.

179. Wakamiya H., Suzuki E., Yamamoto I., Akiba M„ Otsuka M., Arakawa N. Vitamin С activity of 2-O-a-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid in guinea pigs. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1992. - V. 32.-P. 235-245.

180. Wallick E.T., Pitts B.J.R., Lane L.K., Schwartz A. A kinetic comparison of cardiac glycoside interactions with Na+,K+-ATPases from skeletal and cardiac muscle and from kidney. // Arch. Biochem. Biophys. 1980. - V. 202(2). - P. 442-449.

181. Wang H. J., Ughetto G., Quinley G.J., Rich A. Interactions between an anthracycline antibiotic and DNA: molecular structure of daunomycin complexed to d(CpGpTpApCpG) at 1.2A resolution. // Biochemistry. 1987. - V. 26,. - P. 1152-1163.

182. Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.S., DordickJ.S. Sructure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 70-76.

183. Weidenhagen R., Lorenz S. Palatinose 6-(«-Glucopyranoside)-fructofuranose., ein neues bakterielles Umwandlungsproduct der Saccharose. // Z. Zuckerindust. 1957. - V. 7. - P. 533534.

184. Westheimer F.H. Decarboxylation, and Electrostatic Effects. // Tetrahedron. 1995. V. 51(1). -P. 3-20.251 .Weymouth-Wilson A.C. The role of carbohydrates in biologically active natural products. // Nat. Prod. Rep. 1997. -V. 149(2). - P. 99.

185. Williams C.A., Harborne J.B. II The Flavonoids. / Harborn J.B., (Ed.), Chapman & Hall, London, New York, Madras. 1993. - P. 337-385.

186. Williams D.H. The glycopeptide story how to kill the deadly superbugs. // Nat. Prod. Rep. -1996.-V. 13(6).-P. 469.

187. Yamada H„ Nishizawa M. Synthesis and Structure Revision of Intensely Sweet Saponin Osladin. II J. Org. Chem. 1995. - V. 60. - P. 386-397.

188. Yamamoto I., Muto N., Miyake T. a-Glycosyl-L-ascorbic acid, and its preparation and uses. // US Patent 5,137,723. 1992a.с14i 7

189. Yamamoto I., Muto N., Murakami K, Akiyama J. Collagen synthesys in human skin fibroblasts is stimulated by a stable form of ascorbate, 2-O-a-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid. // J. Nutr. 1992b. - V. 122. - P. 871 -877.

190. Yamamoto K, Yoshikawa K., Okada S. Effective production of glucosyl-stevioside by a-1,6-transglycosylation of dextrin dextrinase. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. - V. 58. - N 9. -P. 1657-1661.

191. Yun J.W., Lee M.G., Song S.K. Batch production of high-content fructooligosaccharides from sucrose by the mixed-enzyme system of /?-fructofuranosidase and glucose oxidase. // J. Ferment. Bioeng. 1994.-V. 77.-P. 159-163.

192. Zachman R.D., Dunagin P.E., Olson J.A. Formation and enterohepatic circulation of metabolites of retinol and retinoic acid in bile duct-cannulated rats. // J. Lipid Res. 1966. - V. 7.-P. 3-9.

193. A.Zhang D.H., Li X.Z., Zhang L.H. Isomaltulose synthase from Klebsiella sp. strain LX3: gene cloning and characterization and engineering of thermostability. // Appl. Environ. Microbiol. -2002. V. 68. - P. 2676-2682.

194. Zhang Z., Gregory III J.F., McCormick D.B. Pyridoxine-5'-/?-D-glucoside competitively inhibits uptake of vitamin B6 into isolated rat liver cells. I I J. Nutr. 1993. - V. 123(1). - P. 8589.