Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм генов, связанных с молочной продуктивностью крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм генов, связанных с молочной продуктивностью крупного рогатого скота"

На правах рукописи

005051337

ДРОЗДОВ ЕВГЕНИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 АПР 2т

Санкт-Петербург - Пушкин — 2013

005051337

Работа выполнена в Инновационном научно-образовательном центре биотехнологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Брянский государственный университет им. акад. И.Г.Петровского»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

кафедры ботаники ФГОУ ВПО БГУ Заякип Владимир Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики в ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии

Терлецкий Валерий Павлович

кандидат биологических наук, доцент кафедры селекции и биотехнологии ФГБОУ ВПО СПбГАУ

Митютько Валентина Ивановна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится «19» апреля 2013 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 006.012.01 по защите докторских диссертаций в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 196601, Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе, 55-а, E-mail: spbvMigen@mail.ru. факс: (812)465-99-89

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан « » _2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ' Г. Н. Сердюк

доктор биологических наук, профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Начиная с середины 60-х годов XX века в популяционных и эволюционных исследованиях, а также в селекции всё шире стали использовать данные о биохимическом полиморфизме белков. Позже прогресс в биотехнологии и молекулярной генетике позволил привлекать сведения об изменчивости непосредственно молекул ДНК. Это позволило выявить наличие разнообразных аллельных вариантов, т.е. полиморфизм генов и генотипов искусственных и природных популяций - необходимое условие успешной селекции.

Развитие животноводства на современном этапе трудно представить без внедрения методов оценки признаков продуктивности сельскохозяйственных животных, базирующихся непосредственно на анализе наследственной информации.

Современная сельскохозяйственная биотехнология, по сути дела, основана на развитии ДНК-технологий (Харченко П.Н., Глазко В.И. 2006). Изучение полиморфизма различных геномных элементов - является необходимым условием для внедрения нанобиотехнологий в уже существующие ДНК-технологии (Глазко В.И., Глазко Т.Т. 2008)

Наиболее полно в молекулярно-генетнческом аспекте изучен крупный рогатый скот. Большинство известных на сегодня маркеров продуктивности выявлено именно у КРС. Большинство этих маркеров связаны с показателями молочной продуктивности. Этот количественный признак детерминируется большим числом генов, с разным индивидуальным участием. Эти гены функционально связанные в блоки локусов количественных признаков (ОТЪ). Различное сочетание аллельных вариантов этих генов будут по-разному определять характеристики молочной продуктивности КРС. Для объективной оценки количественных признаков следует учитывать полиморфный вклад многих генов (ЗТЬ.

Изучение генотипической структуры «искусственной популяции» является важнейшим условием для поддержания её устойчивости и хозяйственной ценности. Среди множества генов, влияющих на молочную продуктивность и качество молока, можно выделить группу генов, вносящих наибольший вклад в формирование и

функционирование донного количественного признака. К таким генетическим маркерам относятся гены: каппа-казеина (CSN3), ß-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), ген гипофизарного фактора транскрипции(РГГ-1) и соматотропина(ОН) по Alul и Mspl маркерам.

Активное участие этих генов в формировании признака молочной продуктивности служит основанием для выявления ассоциации их вариантов с параметрами молочной продуктивности и создания на их основе тест-систем, пригодных в генегико-селекционной работе. Российские породы не достаточно изучены в этом отношении. На территории Брянской Области такие исследования не проводились.

Целью настоящей работы является анализ генетического полиморфизма коров в нескольких стадах КРС Брянской области по генам, определяющим молочную продуктивность и качество молока: каппа-казеина, ß-лакгоглобулина, пролактина, пшофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и гену соматотропина по Alul и Mspl маркерам.

Задачи настоящего исследования:

• Генотипирование животных по локусам генов: каппа-казеина (CSN3), ß-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и соматотропина (GH) по Alul и Mspl маркерам;

•Определение частоты встречаемости аллельных вариантов и генотипов по анализируемым генам;

•Проведение сравнительного анализа распределения различных генотипов анализируемых генов в разных породах и группах;

• Оценка показателей молочной продуктивности (средний удой за месяц, процентное содержание жира и белка) у коров чёрно-пёстрой породы с различными генотипами по анализируемым генам;

Научная новизна.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне охарактеризован генофонд стад коров черно-пестрой породы, айрширской породы и частного скота на территории Брянской области по ДНК-маркерам шести локусов, участвующих в формировании признака молочной продуктивности (каппа-казеина (CSN3), ß-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и соматотропина

(ОН) по А1и1 и Мер! маркерам).

Установлено, что некоторые аллели генов, обладающие благоприятным влиянием на показатели молочной продуктивности, встречаются редко или исчезли в анализируемых группах животных, например, В-аллель гена каппа-казенна. В чистопородных стадах, по сравнению с группой частного скота, отмечен высокий уровень неравномерной гомозиготизации.

По гену бета-лактоглобулина было обнаружено нарушение сцепления между двумя мутациями, определяющими отличие А от В аллелей и обнаружены новые аллельные варианты, соответствующие А аллелю по локусу одной мутации и В аллелю по другой.

По двум гена молекулярным маркерам гормона роста была выявлена значительная отрицательная корреляция (-0.8) частот встречаемости «-» аллеля по \1spI-MapKepy н Ь аллеля по А1и1-маркеру гена гормона роста по трем изученным группам животных.

Установлено влияние аллельных вариантов генов бета-лактоглобулина, соматотропина и гипофизарного фактора на показатели молочной продуктивности. Наиболее выраженным действием на удои отличались аллельные варианты гена гормона роста, а самое сильное и достоверное влияние на содержание белка в молоке проявил ген бета-лактоглобулина.

Практическая ценность работы

Проведение оценки генетического потенциала молочной продуктивности крупного рогатого скота по генетическим маркерам позволит начать внедрение методов генетического анализа в практическое животноводство в племенных животноводческих хозяйствах Брянской области и существенно увеличить производство молока, та также продуктов его переработки.

Объем и структура работы. Публикации.

Диссертация изложена на 123 страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками. Синеок цитируемой литературы содержит источников 199 из них 146 на английском языке.

По теме диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых журналах ВАК.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на образцах ДНК, полученных из крови телят (п=16) и коров чёрно-пёстрой породы (п=55) ОАО "Снежка-Госома", коров айрширской породы (п=50) и коров частного содержания (п=146) Жирятинского района Брянской области. В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА (0,5М).

Общая схема исследования приведена на рисунке 1.

ДНК выделяли из 100 мкл цельной крови стандартным методом с ББЗ.

У каждой коровы определяли полиморфизм генов: каппа-казеина (СБОТ), р-лактоглобулина (В1ЛЗ), пролакт1Гна(Р11Ь), гена шпофизарного фактора транскрипции (Р1Т-1) и соматотропина(ОН) по А1и1 и Мвр1 маркерам.

Для всех локусов при изучении полиморфизма ДНК был применен метод полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ).

Нуклеотидные последовательности и температуры отжига праймеров представлены в таблице 1.

В состав ПЦР смеси кроме праймеров и ДНК входили 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата; 2,0 единицы Taq-пoлимepaзы и 2,0 мкл 10-кратного буфера для полимеразы. Состав буфера: 700 тМ Трис-НС1, рН 8.6/25°С, 166 тМ (ЫН4)2504, 25 тМ МёС12. Оптимальное количество каждого специфического праймера составляло 25-30 пмолей на пробу.

Таблица 1.

Нуклеотидные последовательности и температуры отжига праймеров_

Ген Последовательность праймера, 5'- 3' Т. отжига, °С Ссылка

свш ТАТ-САТ-ТТЛ-ТОС-ССЛ-ТТО-иЛС-СЛ СТТ-СТТ-ТОЛ-ТОТ-СТС-СТТ-АОЛ-ОТТ 56 Сулимова, 1991

виз/р-иш СТА-ТТО-ТСС-ТСО-ТАО-АОа-ААО-С А-АОА-ААО-€СС-ТОО-АТА-АСС-АСС-С 60 Гладырь, 2001

ВЬС1/Нас1Т1 ОСТ-ССС-ОПТ-АТА-ТОЛ-ССЛ-ССС-ТСТ ТОТ-ОСТ-ааА-САС-СОА-СТА-САА-ААА-С 55 Ме&апо, 1990

РКЬЛ?5а1 саА-спс-сп-А'га-Аас-ттг.-АТГ-сгг ОСС-ТТС-САО-ААО-ТСО-ТГГ-ОТТ-ТТС 59 МйаА., 1995

011\Мхр1 ССС-АСО-ООС-ААО-ААТ-ОАО-ОС тна-ооа-лст-сса-сюс-псс-сл 62 М1Ь-аА., 1995

СНАШ ост-огт-сст-ОАО-аос-сст-тса ОСО-ССО-ОСА-СТГ-СЛТ-С АС-ССТ 59 8с|1|ее, 1994

Р1Т-1 САА-тоА-олл-лот-тасз-т(;с: ТСТ-СЗСА-ТТС-ОА-САТ-ССТ-С 54 Мо<х1у, 1995

Идентификацию аллелей генов проводили в соответствии с указанными в таблице 1 методиками.

Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология». ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут, а затем проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С - 1мин., отжиг праймеров - 1мин., 72°С -1мин. Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 мин. Температуры отжига праймеров указаны в таблице 1.

Электрофоретический анализ фрагментов ДНК после рестрикции проводили в 6%-ном полиакриламидном геле и в 1%-ном агарозном геле. В качестве маркера молекулярных масс использовали стандартный набор М27 (СибЭнзим).

Определение белка в молоке проводили колориметрическим методом в соответствии с ГОСТ 25179-90.

По данным зоотехнического учета анализировали показатели удоя и содержшше жира в молоке коров опытной группы.

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле: р = n/N, где р - частота генотипа, п — количество особей, имеющих определенный генотип, N— число особей. Частоту отдельных аллелей определяли по формуле: РА = (2пАА+пАВ) : 2N w qB = (2пВВ+пЛВ) : 2N, где Рл- частота аллеля A, qB -частота аллеля В, N - общее число аллелей.

Для оценки достоверности отклонения распределения выявленных частот аллелей от теоретически ожидаемого использовали критерий хи-кадрат.

Статистическую обработку проводили с помощью программ «Statistika 6.О.», «Popgene 1.31.», MS Excel 2003 (Microsoft) и «Pop Stat», разработанной Гусаревой Е. и В. Рюхко, 2001.

Рис. 1 — Общая схема исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Полиморфизм генов каппа-казеина (СвЮ), р-лактоглобулина (ВЬв), пролактипа (РЫЬ), гена гипофизарного фактора транскрипции (Р1Т-1) и соматотрошша (СН) по А1и1 и Мер! маркерам.

Нами были определены генотипы по анализированным генам у 16 телят, 55 коров черно-пёстрой породы ОАО "Снежка-Госома", 50 коров айришрской породы СПХ Сельцо и 146 коров частного содержания на территории трех деревень Жирятинского района Брянской области.

На рисунке 2 представлены примеры электрофореграмм, полученных при определении генотипов коров по анализируемым локусам.

Ш-^ШШШш

'4/f 4/- л -- -

v AA. M AB BB, ЛВ "&A , ¿ДВ

I 3 3 4 5 -6 7 a {>

4 > < > ' •■ > i tv Л} ' , ^ \

■111 Ш Sill

ш

нр

bV ЫГ W lb Lb № Ц/ XL

I®||llf|

лч ли - S3 АЛ, ля НВ АП ВВ

Рис. 2 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции при определении генотипа по исследуемым генам: а - GH по Mspl- маркеру; б - PRL; в - GH по Alu-маркеру; г - PIT-1; д - [3LG; е - CSN3. Генотипы образцов указаны на иллюстрациях.

3.2. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по анализируемым генам.

В таблице 2 представлены частоты аллелей и генотипов анализированных генов.

Проведенный нами анализ показал отсутствие полиморфизма по локусу каппа-казеина. Во всех анализируемых группах был отмечен только генотип АА.

Из таблицы 2 видно, что общим для анализируемых групп животных, является превышение частоты А-аллеля над частой В-аллеля гена пролактина. Максимальная частота А-аллеля зафиксирована в группе коров айрширской породы (0,94).

Таблица 2. Генетическая структура анализируемых групп коров по генам: РЛЬ, р1ЛЗ, йН/Мвр!, вН/АЫ, Р1Т-1

Группа КРС Частоты аллелей и генотипов

Пролактин (Р1Н.) Бега-лакгоглобулин (р!_С) Соматотропин по М<;р1-маркеру Соматотропин по А1и1-маркеру Г Ешофизарный фактор ранскрипции (РГГ-1)

АА АВ ВВ А В АА АВ ВВ А В +/+ +/- + IX ЬУ УУ ь V АА АВ ВВ А в

Коровы черно-пестрой породы ОАО «Снежка-Госома» 0,75 0,21 0,04 0,87 0,13 0,19 0,5 0,3 1,41 3,58 0,6 0,26 0,14 0,72 0,27 0,7 0,3 0 0,85 0,15 0,06 0,12 0,81 0,11 0,88

НоЪз 0,2115 0,5 0,2321 0,3 0,1333

Нех 0,2188 0,493 0,3838 0,255 0,2311

х2 0,754 0,0043 6,358 1,0537 6,753*

Телята черно-пестрой породы ОАО «Снежка-Госома» 0,71 0,28 0 0,84 0,15 0,71 0,14 0,14 0,81 0,18 0,63 0,36 0 0,81 0,19 0 0 1 0 1

НоЪ* 0,2857 нет данных 0,1429 0,3636 0

Нех 0,2449 0,3367 0,2975 0,5

X 0,119 3,336* 0,3399 18,531*

Коровы аГфшнрской породы С1ГХ «Сельцо» 0,87 0,12 0 0,94 0,0 6 0,066 3,313 >,622 0,22 0,77 0,68 0,3 |0,02 0,83 0,17 3,5530,361 0,085 0,74 0,26 0,113 0,227 0,659 0,33 0,77

НоЬБ 0,0816 0,311 0,298 0,362 0,227

Нех 0,115 0,345 0,282 0,390 0,351

X2 1,290 0,8445 0,056 0,0964 6,326*

Коровы частного содержания 0,39 0,55 0,06 0,66 0,33 0,213 0,52 4 0,26 2 0,47 о,5; 0,79 0,14 |о,06 0,85 0,13 0,59 0,36 0,05 0,76 0.22 0,04 0,25 0,71 0,16 0,83

НоЬз 0,5455 0,524 0,1458 0,3585 0,25

Нех 0,4444 0,498 0,2342 0,3604 0,2778

X2 7,243 0,3963 19,5* 0,0514 1,229

*р=0,05; НоЬз-наблюдаемая гетерозиготность; Нех-ожидаемая гетерозиготность

При анализе частот генотипов по этому локусу в группах телят и коров черно-пестрой породы, содержащихся в одном хозяйстве «Снежка — Госома» видно, что в группе телят в отличие от группы коров отсутствует ВВ-генотип. Это, вероятно, указывает на высокую внутривидовую изменчивость частот аллей, быстрое изменение генетической структуры стада, даже внутри одного хозяйства и на тенденцию к исчезновению одного из аллелей гена пролактина.

В группе коров айрщирской породы В-аллель гена пролактина обнаружен только в составе гетерозигот, которые в группе представлены с низкой частотой (12%). Такое распределение частот, вероятно, является следствием гомозиготизации преимущественно по одному аллелю и может привести к потери варианта гена.

В группе частного скота частота В-аллея гена пролактина довольно высока из всех опытных групп (33%). Внутри группы чаще всего встречаются животные с гетерозиготным генотипом, их частота составляет 55%, за счет этого доля В-аллеля в этой группе максимальна (33%), несмотря па то, что частота ВВ-генотипа незначительно отличается от частоты этого генотипа в других группах.

При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина в исследуемых группах КРС в разной степени наблюдается преобладание В-аллеля, максимальная частота этого аллеля зафиксирована в группе коров айрширской породы - 77%. В этой же группе отмечена наивысшая частота АА-генотипа. Иная картина наблюдается в группах коров черно-пестрой породы и частного скота. В этих группах чаше всего встречались животные с гетерозиготным генотипом. В выборке частного скота отмечены близкие значения частот А - и В — генотипов.

Из таблицы 2 видно, что во всех анализируемых группах животных частота (+) -аллель гена сомаготропина значительно превышает частоту (-) - аллеля. Такая же картина наблюдается при анализе частот встречаемости генотипов. Во всех анализируем!,IX группах, коровы с генотипом (+/+) встречаются намного чаше. Так частота встречаемости (+/+)-генотипа в группе частного скота достигает 79%. На фоне преобладания частот (+)-аллеля и (+/+)-геногипа, отмечаются низкие значения частот встречаемости (-)-аллеля и (-/-)-генотипа. В группе коров айрширской породы было встречено только одно животное с (-/-)-генотипом, но частота гетерозиготного генотипа в этой группе максимальна. Несмотря на такое распределение частот

аллелей только в группах телят черно-пестрой породы (в отличие от коров того же хозяйства) и частного скота наблюдается достоверное отклонение выявленных частот аллелей от теоретически ожидаемого. Это говорит о том, что даже внутри одного хозяйства (телята и коровы черно-пестрой породы ОАО «Снежка-Госома») наблюдаются резкие не воспроизводимые в поколениях колебания частот генотипов. Анализируя значения Hobs и Hex видно, что за исключением группы коров айрширской породы, наблюдается значительное отставание наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой.

Данные таблицы 2 показывают, что в группах коров и телят черно-пестрой породы, содержащихся ОАО "Снежка-Госома" отсутствует VV-генотип по Alul-маркеру гена соматотропина. В группах коров айрширской породы и частного скота встречены сдииичные животные с VV генотипом, основная масса V аллеля также находится в гетерозиготном состоянии.

В анализируемых группах крупного рогатого скота отмечено преобладание генотипа ВВ по гену РГГ-1, над остальными вариантами, максимальное значение частоты этого генотипа наблюдается в группе коров черно-пестрой породы (0,81). У телят черно-пестрой породы это единственный встреченный генотип. В трех анализируемых группах, кроме группы частного скота, наблюдается смещение генетического равновесия. В этих группах наблюдаемая гетерозиготность достоверно ниже теоретически рассчитанной.

Таким образом, по анализированным генетическим маркерам (CSN3, PRL, GH/AluI, GH/MspI, PIT-1), за исключением PLG, в исследуемых группах коров, наблюдается преимущественная гомозиготизация в сторону одного из аллелей, приводящая к исчезновению другого. Наиболее гетерогенной группой животных по результатам наших исследований, является частный скот. На фоне отсутствия В-аллеля каппа-казеина, общий уровень гетерозиготности в этой группе по анализируемым маркерам выше, чем в других выборках. Вероятной причиной обеднения генетической структуры стад крупного рогатого скота является то, что процессе ее формирования по разным причинам участвуют только небольшое число избранных особей, как правило, с неизвестными генотипами. При таком способе селекции возрастает роль генетического дрейфа, из-за которого происходит либо

фиксация, либо потеря некоторых хозяйственно ценных аллелей. Потеря аллелей приводит к тому, что генетическая структура стада, вероятно и породы, становится более гомозиготной. Подобная ситуация прослеживается в анализируемых нами группах коров и телят черно-пестрой породы ОАО "Снежка-Госома", генетические структуры которых резко отличатся. Так, например, в отличие от коров в группе телят утеряны аллель А гена Pitl и генотип ВВ гена пролактина, также произошла еще большая гомозиготизация в сторону (+)-аллеля соматотрошша. Использование этих телят в дальнейшей селекционной работе уже не вернет ВВ генотип гена Pitl и в целом вероятно ускорит темпы обеднения генетической структуры стада.

3.3. Анализ сочетания мутаций при определении А и В аллелей гена ß-лактоглобулина.

Изучив полиморфизм гена бета-лактоглобулнна Aschaffenburg и Drewry [1957], установили, что отличие аллеля А от В определяется в аминокислотной позиции 64 (Asp в A, Gly в В) н позиции 118 (Val в A, Ala в В).

Идентификацию аллелыюго полиморфизма ßLG по точечной замене в нуклеотидной последовательности в экзоне 4 предложил Medrano в 1990 году [Medrano et al., 1990]. Эта мутация предполагает появление дополнительного сайта рестрикции для эндонуклеазы НаеШ и замене в пептидной последовательности аминокислоты Val на Ala для В варианта в положении 118.

Другая методика, определения аллелей А, В была разработана Гладырь [Гладырь и др., 2001]. По этой методике вариант В определяется по мутации второго основания триплета GAT>GGT во втором экзоне, приводящего к замене аминокислоты в положении 64.

Типирование А и В аллелей ßLG с помощью метода ПЦР-ПДРФ, основано на выявлении какой-либо одной из этих мутаций.

Выявление аллельных вариантов гена ßLG мы проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежат анализ точечных нуклеотидных замен во втором или четвертом экзонах.

l .i. -2 . 3 4 й ; 5 Si :. 9 ' 10 :":; Ii : 12% 13

i д< m && ж

?var PatI ¿ein

AB BB AB вв ДА BB AB BB

Рис. 3 - Пример несовпадения аллельных вариантов гена ßLG при анализе по методикам Гладырь и др.,2001 и Medrano, et al., 1990. 1 - маркер молекулярных масс М27(СибЭнзим). 2,3,4-анализ образца 23; 5, 6, 7 - образец 99; 8, 9, 10 - образец 109; 11, 12, 13 - образец 96; 14, 15, 16 — образец 181. Каждый первый из тройки трек — рестрикция эндонуклеазой PvuII, каждый второй - продукты рестрикции Pstl, каждый третий - продукты рестрикции НаеШ

Такой анализ, показал несовпадения при определении аллельных вариантов по представленным методикам (рис. 3). Особенно интересен результат рестрикции ПЦР-фрагментов экзонов 2 и 4 полученных на ДНК образца 109 (треки - 8, 9, 10). При рестрикции фрагмента экзона 2 (1247 и.о.) эндонуклеазой PvuTI выявляется типичная картина характерная для для АА - варианта гена бета-лактоглобулина, т.е. отсутствие нуклеотидной замены обеспечивающей появление дополнительно сайта для PvuII описанного для ВВ-варианта. Напротив, при рестрикции ПЦР-фрагмента экзона 4 этого же образца эндонуклеазой НаеШ наблюдается появление специфичных для В-аллеля фрагментов.

Частоты несовпадений при определении генотипов по двум вышеописанным методикам в группах коров черно-пестрой, айрширской пород и частного скота составили - 2,7%, 13,3%, 9,7% соответственно.

В таблице 3 приведены частоты встреченных сочетаний аллельных вариантов при определении полиморфизма гена ßLG по методикам Гладырь и Medrano [Гладырь и др., 2001 и Medrano, et al., 1990]. С наивысшей частотой встречались сочетания АВ/ВВ (0,61) и АА/ВВ (0,22). Сочетание ВВ/АВ было самым редким, а сочетания АВ/АА и ВВ/АА не обнаружены. Генотипы АВ/АВ неотличимы от обычных гетерозигот AB.

Частоты сочетаний мутаций в генотипах КРС при определении полиморфизма гена бета-лактоглобулина по описанным методикам.

Варианты гена р[,0 по методике Гладырь и др.,2001 Варианты гена р1Х} по методике Меёгапо, е! а1.,1990

ВВ АВ АА

АВ 0.61 -

АА 0.22 0.11

ВВ 0.055 -

Приведенные данные указывают на нарушение сцепления между двумя мутациями, определяющими отличие А от В аллелей и на существование новых аллельные вариантов, соответствующих А аллелю по локусу одной мутации и В аллелю по другой.

3.4. Сравнение распространения аллелей V и (-) гена соматотропина по А1и1 - и \IspI - маркерам у КРС в Брянской области и других регионах.

При сопоставлении частот аллелей соматотропина по \ispl- и А1и1 — маркерам, определяемых двумя мутациями расположенными в разных частях гена соматотропина, было обнаружено, что в породах с максимальной частотой М5р[(-)-аллеля частота У-аллелей минимальна и наоборот. Так в стаде зебувидного скота с частотой МзрТ(-)-аллеля 0,94 аллель V отсутствует, а у ярославской породы при частоте М5рТ(-)-аллеля - 0,02, частота У-аллеля соствляет 0,56). Эта зависимость подтвердилась при корреляционном анализе (коэф. коррел.=-0,65).

Аналогичная зависимость прослеживается при сравнении частот (-) и V -аллелей в трёх анализируемых нами группах КРС, значение общего коэффициента корреляции составило -0,80. На рисунке 4 приведена гистограмма с соотношением аллелей гормона роста по обоим маркерам в анализируемых нами группах КРС. Линии тренда проходящие по вершинам столбцов с частотами (+) и У-аллелей в анализируемых группах КРС практически параллельны.

Наличие такой корреляции, возможно, указывает на наличие, наряду с другими сочетаниями мутаций, сцепленных пар М$р(-)-А1и(Ь)-аллелей и Мбр(+)-А1и(У)-аллелей. Остальные сочетания аллей гена соматотропина по обоим маркерам, вероятно, возникли при рекомбинации мутации определяющих Мзр(-)-А1и(Ь) и М5р(+)-А1и(У)-аллели.

м-:-::-:-^ %А1Ы(1.)-аллеля

^^ %А1и1(\/)-аллеля

I-1 %Мзр|(+)-аллеля

%М5р1(-)-аллеля

-Линейный тренд

(%Мзр1{+)-аллеля)

-Линейный тренд (%А!и!(\/)-

аллеля)

Рис. 4 - Соотношение частот аллелей соматотропина по Мер!- и А1и1-маркерам в анализированных группах КРС. 1 - группа коров черно-пестрой породы, ОАО «Снежка-Госома; 2 - частный скот (Жирятинский р-н, Брянской области); 3 - группа коров айрширской породы, СПХ Сельцо.

Таким образом, при отборе Мзр(-)-аллеля, с которым связана высокая жирность молока, в стаде может происходить обеднение У-аллелем, также благоприятным с хозяйственной точки зрения и наоборот.

3.5. Анализ влияния аллельных вариантов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности КРС.

В нашем исследовании мы попытались выявить связь вариантов генов лактоглобулина (Р1ЛЗ), гена гипофизарного фактора транскрипции (РТТ-1) и соматотропина(СН) по А1и1 и Мэр! маркерам с параметрами молочной продуктивности. Анализ проводили в группе коров черно-пестрой породы ОАО «Снежка-Госома». В связи с тем, что в анализируемой группе коров отмечен низкий уровень полиморфизма генов каппа-казеина и пролактина, проанализировать их влияние на параметры молочной продуктивности не представилось возможным.

3.6. Анализ ассоциаций генотипов бета-лактоглобулина с параметрами молочной продуктивности КРС.

Полученные нами результаты по продуктивности группы коров чёрно-пёстрой породы ОАО «Снежка-Госома», приведенные в таблице 4, указывают на близкие показатели по среднему удою за месяц животных с генотипами АВ и ВВ, но в молоке коров с генотипом ВВ достоверно выше содержание жира. Животные с генотипом АА достоверно по среднему удою за месяц слабее других вариантов, но превосходят их по содержанию белка в молоке.

группы КРС

Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы с различными генотипами бета-лактоглобулина.

генотип Средний надой за месяц жирность,% Белок,%

ВВ 519,1±6,95а 3,693±fl,0034 а 3,50±0,27 а

AB 515,70±9,9а 3,й25±0,(Ю21 b 4,45±0,15Ь

АА 484,21±16,98 b 3,687±0,0015 с 5,1±0,35с

Р<0,05; а — отличие от групп b и с достоверно; b — отличие от групп а и с достоверно; с — отличие от групп а и b достоверно; значения, обозначенные одной и той же буквой достоверно не отличаются.

Среди коров с генотипом АА по гену бета-лактоглобулина преобладают особи со значением надоя менее 500 кг в месяц. В группе животных с генотипом ВВ наибольшая доля особей с надоем более 500 кг в месяц. Среди особей с генотипом AB присутствуют животные с надоем более 550 кг. Это может свидетельствовать о положительном влиянии В-аллеля ß-лактоглобулина на уровень надоя.

3.7. Анализ ассоциаций аллельных вариантов гена соматотропнна по Mspl-маркеру с параметрами молочной продуктивности КРС.

Соматотронин - важнейший регулятор соматического роста животных, обладающий лактогенным, инсулиноподобным, жиромобилизирующим действием.

По нашим данным, приведенным в таблице 5 видно, что животные с (-V)-генотипом по Mspl-маркеру достоверно показывают наивысший средний за месяц удой и содержание белка в молоке.

Таблица 5.

Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы с различными генотипами соматотропнна по МврТ-маркеру.

генотип Средннй надой за месяц кг контр, дойка, кг 3KIfpHOCTL,% белок,%

+\+ 477,3±4,4* 15,80±0,47 3,694±0,009 4,Ю4±0,017

506,2±5,0* 16,93±0,61 3,66б±0,005 4,04±0,090

526,6±7,1» 17,30±0,21 3,60±0,002 4,765±0,029*

•Р<0,05

Результаты нашего исследования свидетельствуют, что для коров с (+/+)-генотипом в большей степени характерно значением удоя менее 500 кг. В группе животных с (+/-) генотипом больше всего коров с удоем 500-550 кг в месяц. Таким

образом, (-)-аллель гена оказывает благоприятное воздействие на рассмотренные параметры молочной продуктивности.

3.8. Анализ ассоциаций аллельных вариантов гена соматотропииа по А1и1-маркеру с параметрами молочной продуктивности КРС.

Полученные нами данные, приведенные в таблице 6, свидетельствуют, что животные с генотипом Ы_ по удою и содержанию белка в молоке достоверно превосходят животных с гетерозиготным генотипом, которые в свою очередь имеют самое высокое содержание жира в молоке. Так как в исследуемой группе животных мы не выявили генотипа УУ, оценить его влияние на параметры молочной продуктивности не удалось.

Таблица 6.

Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы с различными генотипами соматотропина по А1и1-маркеру

генотип Средний надой за месяц кг контр, дойка, кг. жирность,% Белок,%

LL 508,0±9,1* 16,82±0,95 3,6693±,0012* 4,64±0,47*

LV 474,7±8,7* 14,92±0,67 3,7283±0,0034* 3,67±0,56*

W - - - -

*р<0,05

В группе коров с генотипом LL максимальное количество особей имеет удоем более 500 кг в месяц. В этой же группе присутствуют коровы с удоем более 550 кг. Среди гетерозигот (LV) таких животных не обнаружено, но в этой группе более 70% коров со средним значением удоя менее 500 кг в месяц.

3.9. Комплексное влияние вариантов гена соматотропина по Alul- и Mspl -маркерам на молочную продуктивность.

В исследуемой группе коров черно-пестрой породы мы обнаружили пять сочетаний генотипов соматотропина по Alul- и Mspl - маркерам (табл. 7). Анализ их комплексного влияния на средний удой за месяц показал, что наиболее продуктивными по этому параметру являются животные с комплексным генотипом LL (-/-). Присутствие (+)-аллели заметно снижает этот показатель. Наименьший удой зафиксирован в группе животных с генотипом LV (+/+). Разница между ними составляет 61,4 килограмма в месяц.

Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы с комплексными генотипами соматотропина по Alul- и Mspl-маркерам.

Комплексный генотип гена соматотротта по Alul-и Mspl-маркерам Средний надой за месяц, кг

LL(-A) 536,15±5,12а

LL (-/+) 506,92±4.73 b

LL (+/+) 505,68±4,91 b

LV (+/-) 478,50±4,80 с

LV (+/+) 474,75±4,88 с

Р^ 0,05, а - отличие от групп b п с достоверно; b - отличие от групп а и с достоверно; с - отшгчие от групп а и b достоверно; значения, обозначенные одной и тон же буквой достоверно не отличаются.

ЗЛО. Анализ ассоциаций аллельных вариантов гена гинофнзарного фактора транскрипцип (PIT-1) с параметрами молочной продуктивности КРС

Интенсивность экспрессии генов гормонов гипофиза находится под контролем клеток пшоталамической области, выделяющие стимулирующий фактор — РГГ-1.

По нашим данным, приведенным в таблице 8 видно, что особи с генотипом АА гена PIT-1 по среднему надою за месяц достоверно превосходят животных с друпгми генотипами. Относительно показателей процентного содержание жира в молоке коров с разными генотипами по этому гену статистически достоверных различий не выявлено.

Таблица 8.

Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы с различными генотипами Pit-1.

геногии Средний надой за месяц контр, дойка, кг. жирность,%

ВВ 488,86±4,034 а 1б,905±0,03 3,662±0,0015 а

AB 492,6±4,33 а 13,8±1,7 3,663±0,0021 а

АА 508,9±7,792 b 17,65±0,045 3,645±0,017а

Р-0,05; а — отличие от групп b и с достоверно; b — отличие от групп а и с достоверно; с — отличие от групп а и b достоверно; значения, обозначенные одной и той же буквой достоверно не отличаются.

Нами установлено, что в группе коров с генотипом АА присутствуют особи с продуктивностью более 550 кг молока в месяц. В группах животных с другими генотипами таких особей не выявлено. В группах коров с AB и ВВ генотипами наблюдали примерно одинаковое распределение коров с минимальной и средней продуктивностью.

выводы

1. Общий анализ частот встречаемости аллельных вариантов генов связанных с молочной продуктивностью в трех группах животных Брянской области показал, что по некоторым генам наблюдается значительное преобладание одних аллельных вариантов и уменьшение частот или исчезновение других аллелей, некоторые из которых обладают положительным влиянием на показатели молочной продуктивности (В аллель каппа-казеина, (-)-аллель соматотропина и др.). Вероятными причинами могут быть голштинизация и генетический дрейф.

2. В анализируемых группах коров черно-пестрой, айрширской породы и частного скота не выявлено полиморфизма гена капа-казеина. Во всех группах определен только А-аллель этого гена.

3. Во всех опытных группах выявлено преобладание частоты В-аллеля гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) над А-аллелем. Частота В-аллеля в группах коров черно-пестрой, айрширской породы и частного скота составляет 0,88; 0,77; 0,83 соответственно.

4. Частота А-аллеля гена пролактина во всех опытных группах значительно превышает частоту В-аллеля. В группе коров айрширской породы В-аллель обнаружен только в составе гетерозигот, частота которых составляет -12%. Максимальная частота А-аллеля - зафиксирована в группе коров айрширской породы (94%). В группах коров черно-пестрой и айрширской породы частота доминирующего АА-генотипа достигает - 75% и 87% соответственно. В группе частного скота преобладает гетерозиготный генотип (АВ) - 55%.

5. В изученных группах КРС преобладает (+)-аллель и гомозиготный генотип (+/+) по Mspl-маркеру гена соматотропина. Чаще (+)-аллель встречался в группе частных коров (85%). В группах коров черно-пестрой и айрширской пород частота этого аллеля равна - 72% и 83% соответственно. Наименьшая частота (-/-)-генотипа зафиксирована в группе коров айрширской породы - 2%.

6. В анализируемых группах КРС преобладает (Ь)-аллель и гомозиготный генотип (LL) по AluI -маркеру гена соматотропина. Максимальная частота (Ь)-аллеля зафиксирована в группе коров черно-пестрой породы (85%). В этой же группе, в отличие от остальных, не выявлено гомозиготного генотипа W. В группах коров айрширской породы частного скота частота этого аллеля составляет - 74% и 76% соответственно.

7. В разной степени в исследуемых группах животных доминирует В-аллель гена Р-лактоглобулина. Максимальна частота этого аллеля отмечена в группе коров айрширской породы - 77%. В этой же группе, в отличие от остальных, преобладающая доля животных имеет ВВ-генотип по этому гену - 66%. В группах коров черно-пестрой породы и частного скота преобладает АВ-генотип с частотой -50%, 52,4% соответственно.

8. Выявлена зависимость в распределении аллелей гена соматотропина по МярТ-и А1и1-маркерам - в группах КРС с максимальной частотой Мяр1(-)-аллсля частота V-аллелей минимальна и наоборот. По результатам анализа данных литературных источников коэффициент корреляции между частотами встречаемости этих аллелей составляет - (-0.65). При анализе полученных нами данных коэффициент корреляции по частотам встречаемости аллелей этого гена М5р(-) и А1и(Ь) (или Мвр(+) и А1и(У)-аллелей), равен - (-0,8). Эти данные указывают на сцепленность приведенных пар аллелей.

9. По гену бета-лактоглобулина обнаружено нарушение сцепления между двумя мутациями, определяющими отличие А от В аллелей и обнаружены новые аллельньге варианты, соответствующие А аллелю по локусу одной мутации и В аплелю по другой. При определении характерных для В-аллеля мутаций с наивысшей частотой (0,61) встречалось сочетание АВ/ВВ по второму и четвертому экзонам гена [?-лактоголобулина, соответственно.

10. Коровы черно-пестрой породы с генотипом А А рьв достоверно лидируют по содержанию белка в молоке. Коровы с генотипом ВВ достоверно превосходят по содержанию жира в молоке (Р<0,05) животных с другими генотипами.

11. Коровы черно-пестрой породы с (Л-)-генотипом соматотропина по Мяр1-маркеру достоверно (р<0,05) показывают наивысший средний удой за месяц и содержание белка в молоке (526,6±7,1кт., 4,765±0,029% соответственно). Наименьший средний удой за месяц выявлен в группе коров с (+\+)-генотипом -477,3±4,4кг.

12. Животные с 1Х-генотнпом соматотропина по А1и1-маркеру по удою и содержанию белка в молоке (508,0±9,1%, 4,64%±0,47 соответственно) достоверно превосходят животных с гетерозиготным генотипом, которые в свою очередь имеют

самое высокое содержание жира в молоке (3,7283%±0,0034).

13. При изучении комплексного влияние генотипов гена соматотропина по АЫ- и Мяр1 - маркерам на молочную продуктивность бьшо выявлено, что наиболее продуктивными по удою являются животные с комплексным генотипом IX (-/-) (р<0,05). Появление (+)-аллели заметно снижает этот показатель. Наименьший удой зафиксирован в группе животных с генотипом ЬУ (+/+). Разница между ними составляет 61,4 килограмма в месяц.

14. Коровы черно-пестрой породы с генотипом А А гена Р1Т-1 по среднему надою за месяц достоверно (р<0,05) превосходят животных с другими генотипами. Относительно показателей процентного содержание жира и белка в молоке животных с разными генотипами Р1Т-1 статистически достоверных различий не выявлено.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ К ПРОИЗВОДСТВУ

На основании полученных нами результатов рекомендовать следующие мероприятия:

1. В связи с отсутствием хозяйственно-полезных В-аллеля гена каппа-казеина в анализированных группах крупного рогатого скота, необходимо использование спермы быков с ВВ генотипом или проведение генетического тестирования быков-производителей, с целью выявления животных несущих этот аллель и включение их в племенную работу.

2. Проводить племенную работу на повышение частоты встречаемости (-)-аллеля гена соматотропина, ассоциированного с наивысшим средним удоем и содержанием белка в молоке.

3. С целью повышения продуктивности молочного животноводства проводить мониторинг генетической структуры по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки с помощью молекуляно-генетических и биотехнологических подходов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Дроздов Е.В., Анализ сочетания мутаций при определении А и В аллелей гена В-лактоглобулина у КРС / Заякин В.В., Нам И.Я. // Вестник Брянского гос. университета,- 2010. - № 4.- С. -136-140.

2. Дроздов Е.В. Влияние аллельных вариантов гена гормона роста на параметры молочной продуктивности КРС черно-пестрой породы в Брянской области / Заякин ВВ., Нам И.Я. //Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и биологии: Сб. трудов междунар. научно-практ. конф. СПб. - 2010. - С. -214-219.

3. Дроздов Е.В.,. Аллельный полиморфизм гена Р1Т-1 в стадах крупного рогатого скота Брянской области и его связь с молочной продуктивностью / Заякин

B.В., Нам И.Я // Известия Самарского цента Российской академии наук. - 2011,- Т 13, - №5(3). - С.- 235-239.

4. Дроздов Е.В. Освоение метода Г1ЦР-ПДРФ для анализа аллельного полиморфизма генов каппа-казеина и пролактина КРС / Заякин В.В., Нам И.Я. // Сборник студенческих научных работ. - 2009. - С. 92-94.

5. Дроздов Е.В. Анализ полиморфизма генов каппа-казеина, р-лактоглобулина, пролактина, ген рилизинг-фактора и соматотропина по А1и1 и \ispl маркерам у коров айрширской породы / Заякин В.В., Нам И.Я. // Вестник Брянского гос. ун-та. - 2009. -

C. 119-125.

Публикации в рецензируемых журналах ВАК.

Подписано в печать 27.02.2013 г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага офсетная. Усл. п.л. 1,5. Тираж 100экз. Заказ№27/2.

Отпечатано в типографии РИО БГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дроздов, Евгений Владимирович, Санкт-Петербург - Пушкин

БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА

И.Г. ПЕТРОВСКОГО

На правах рукописи

ДРОЗДОВ ЕВГЕНИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.02.07- генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СО ' Научный руководитель -

О доктор биологических наук,

СМ профессор Заякин В.В.

Ю О

Санкт-Петербург - Пушкин - 2013

Список сокращений

QTL (ЛКП) - локус количественных признаков CSN3 - ген каппа-казеина ßLG — ген бета-лактоглобулина PRL - ген пролактина

PIT - ген гипофизарного фактора транскрипции GH - ген соматотропина

GH/Alu -аллельные варианты гена соматотропина по Alu-маркеру GH/MspI - аллельные варианты гена соматотропина по Mspl-маркеру ПЦР - полимеразная цепная реакция

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11 1.1. Молекуляно-генетический анализ количественных признаков 11 1.2 Подходы для выявления аллельного полиморфизма 15

1.3. Характеристика генов основных белков молока 24

1.3.1. Каппа-казеины молока 25

1.3.2. Бета-лактоголобулин 29

1.3.3. Альфа-лактальбумин 30

1.4. Характеристика генов гормонов, влияющих на параметры молочной продуктивности 31

1.4.1. Соматотропин (GH) 31

1.4.2. Пролактин 34

1.5. Гипофизарный фактор транскрипции (PIT-1) 38

2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41

2.1. Выделение ДНК из крови 42

2.2. Определение белка в молоке 42

2.3. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина (CSN3) 44

2.4. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина 45

2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (PLG) по методике Medrano, etal., 1990 г. 45

2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина ((3LG) по методике Гладырь Е.А., 2001г. 46

2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по Mspl-маркеру (GH/MspI) 46

2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по Alul-маркеру (GH/AluI) 47

2.7. Анализ полиморфизма гена пролактина (PRL) 48

2.8. Анализ полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) 48

2.9. Статистическая обработка результатов 49

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

3.1. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену каппа-казеина (СБШ) 50

3.2. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по

гену пролактина (РЯЬ) 53

3.3. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену гипофизарного фактора транскрипции (РІТ-І) 58

3.4. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену соматотропина (ОН) 62

3.4.1. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по МзрІ-маркеру гена соматотропина 62

3.4.2. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по АІиІ-маркеру гена соматотропина 65

3.5. Сравнение распространения аллелей гена соматотропина по МзрІ- и АІиІ - маркерам у КРС в Брянской области и других регионах 68

3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина ((ЗЬС) 71

3.7. Анализ сочетания мутаций при определении А и В аллелей гена [3-лактоглобулина 77

3.8. Определение гетерозиготности в изучаемых группах крупного рогатого скота 81

3.9. Оценка состава комплексных генотипов в исследуемых группах КРС 84 4.0. Анализ влияния аллельных вариантов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности КРС 86

4.1.1. Изучение связи генотипов бета-лактоглобулина с параметрами молочной продуктивности КРС 87

4.1.2. Определение влияния аллельных вариантов гена соматотропина по МБрІ-маркеру на параметры молочной продуктивности КРС 89

4.1.3. Анализ связи аллельных вариантов гена соматотропина по АІиІ-маркеру с параметрами молочной продуктивности КРС 91

4.1.4. Комплексное влияние вариантов гена соматотропина по АІиІ- и ІУкрІ -маркерам на молочную продуктивность 93

4.1.5. Анализ связи аллельных вариантов гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) с параметрами молочной продуктивности КРС

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ К ПРОИЗВОДСТВУ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Молочное скотоводство стремится к достижению положительных результатов в вопросах как увеличения производства молока, так и улучшения его качества.

Традиционно сложившаяся система отбора племенных животных, к сожалению, не учитывает их генотипичесую индивидуальность, отражающую уровень и направление процессов, протекающих в организме [Кудрин А.Г. 2006].

В основе современной селекции животных лежит отбор по комплексу признаков. Животные, сочетающие желательные качества, считаются наиболее ценными в племенном отношении. Цели, намеченные селекционером, можно достичь, зная биологическую природу высокой продуктивности, рассматривая организм животного как целое.

Молочное скотоводство является одной из важнейших отраслей сельского хозяйства нашей страны. За последние пять лет объемы производства молока сократились на треть. В 2005 году производство молока в хозяйствах всех категорий сократилось на 1028 тысяч тонн по сравнению с 2004 [Лях В.Я. 2008]. Это связано с сокращением численности животных и пород (с 25 млн. до 13 млн. голов) и снижением их продуктивности. При этом возросла доля импортной продукции [Вагапова O.A., 2006]. Из 66 пород КРС, разводившихся в 80-90 годах XX века в СССР на 2001 год в Российской Федерации осталось только 33 породы, из них только 16 имеют достаточную численность для нормального воспроизводства [Алтухов и др., 2004].

На 2006 год производство молока в Брянской области сократилось на 61,7 тысяч тонн по сравнению с 2004 годом [Лях В.Я. 2008]. Расчеты показывают, что в 2005 году только в 20 регионах страны объем производства молока на сельскохозяйственных предприятиях превысил объемы переработки на предприятиях молочной отрасли. Среди этих регионов Брянской области нет.

Несмотря на успехи молочного животноводства в странах Европы и Северной Америки, наблюдаются серьезные проблемы, связанные с резким преобладанием в животноводческих хозяйствах голштинской породы КРС. Это привело к значительному сокращению численности других пород, и к сокращению общего генетического разнообразия генофонда КРС. Обеднение генофонда КРС в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям.

Аналогичный процесс идет и в России: на 01.01.2004 г. в Российской Федерации зарегистрированы 33 породы КРС, в том числе 24 молочного и 9 -мясного направления [Столповский Ю.А., Захаров И.А., 2006]. Стало неэффективным разводить многочисленные локальные породы, и они интенсивно поглощаются современными многозональными породами [Эрнст Л.К., 2008].

В последние годы в нашей стране проводится массовая голштинизация крупного рогатого скота отечественных пород, зачастую без достаточного изучения влияния скрещивания на качество молока и молочных продуктов. Вагапова O.A. отмечает, что с увеличением доли кровности по голштинской породе повышается требовательность животных к условиям кормления и содержания. В связи с «затруднительным» положение многих хозяйств такие животные в полной мере не раскрывают свой потенциал [Вагапова O.A., 2006].

Повышение рентабельности молочного скотоводства, ускорение темпов совершенствования племенных и продуктивных качеств животных вызывает необходимость более раннего прогнозирования продуктивности. Требуются надежные, достоверные приемы прогноза, которые имели бы хорошую повторяемость и достаточно высокую наследуемость. Выполнение этих условий вполне возможно при разработке и внедрении методов биотехнологии и изучении генетического потенциала КРС. Кольцов Н.К. в 1926 году отметил, что задача животновода состоит, прежде всего в том, чтобы изучить породы с генетической стороны, оценить их наследственные

достоинства и недостатки [Кольцов H.A., 1926].

Для повышения генетического потенциала молочной продуктивности поголовья крупного рогатого скота в России и в Брянской области необходимы надежные критерии тестировании их генетической предрасположенности к высоким показателям молочной продуктивности.

В последнее время в селекционной работе активно идет поиск генов, которые можно использовать в качестве маркеров параметров молочной продуктивности.

Первоначально в качестве информационных критериев (маркеров) использовались морфологические (фенотипческие) признаки, однако количество маркеров этого типа ограничено и они имеют сложный характер наследования. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии позволили создать новые тест-системы, позволяющие определять генетический полиморфизм на уровне генетического материала клетки [Сулимова Г.Е., 2006, Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006].

Использование ДНК-маркеров расширяет возможности селекционной работы и позволяет выявлять закономерности проявления признака у животного, независимо от внешних факторов. Селекция по генотипу способствует надежной идентификации животных по QTL и быстрому наращиванию предпочтительных аллелей с целью повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород животных.

Целью настоящей работы является анализ генетического полиморфизма коров в нескольких стадах КРС Брянской области по генам, определяющим молочную продуктивность и качество молока: каппа-казеина, ß-лактоглобулина, пролактина, гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и гену соматотропина по Alul и Mspl маркерам.

Задачи настоящего исследования:

• Генотипирование животных по локусам генов казеина (CSN3), (3-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), гена гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и соматотропина (GH) по Alul и Mspl маркерам;

• Определение частоты встречаемости аллельных вариантов и генотипов по анализируемым генам;

• Проведение сравнительного анализа распределения различных генотипов анализируемых генов в разных породах и группах;

• Оценка показателей молочной продуктивности (средний удой за месяц, процентное содержание жира и белка) у коров чёрно-пёстрой породы с различным сочетанием генотипов анализируемых генов;

Научная новизна.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне охарактеризован генофонд стад коров черно-пестрой породы, айрширской породы и частного скота на территории Брянской области по ДНК-маркерам шести локусов, участвующих в формировании признака молочной продуктивности (каппа-казеина (CSN3), р-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), гипофизарного фактора транскрипции (PIT-1) и соматотропина (GH) по Alul и Mspl маркерам).

Установлено, что некоторые аллели генов, обладающие благоприятным влиянием на показатели молочной продуктивности, встречаются редко или исчезли в анализируемых группах животных, например, В-аллель гена каппа-казеина. В чистопородных стадах, по сравнению с группой частного скота, отмечен высокий уровень неравномерной гомозиготизации.

По гену бета-лактоглобулина было обнаружено нарушение сцепления между двумя мутациями, определяющими отличие А от В аллелей и обнаружены новые аллельные варианты, соответствующие А аллелю по локусу одной мутации и В аллелю по другой.

По двум гена молекулярным маркерам гормона роста была выявлена значительная отрицательная корреляция (-0.8) частот встречаемости «-»

аллеля по МБр1-маркеру и Ь аллеля по А1и1-маркеру гена гормона роста по трем изученным группам животных.

Установлено влияние аллельных вариантов генов бета-лактоглобулина, соматотропина и гипофизарного фактора на показатели молочной продуктивности. Наиболее выраженным действием на удои отличались аллельные варианты гена гормона роста, а самое сильное и достоверное влияние на содержание белка в молоке проявил ген бета-лактоглобулина.

Практическая ценность работы

Проведение оценки генетического потенциала молочной продуктивности крупного рогатого скота по генетическим маркерам позволит начать внедрение методов генетического анализа в практическое животноводство в племенных животноводческих хозяйствах Брянской области и существенно увеличить производство молока, а также продуктов его переработки.

По материалам диссертации опубликованы 5 научных работ. В том числе в журналах «Вестник БГУ» и «Вестник Самарского научного центра Российской академии наук» включенных в перечень рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Объем диссертации составляет 123 страницы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, выводов, предложений производству и списка литературы. Диссертация содержит 17 таблицы и 20 рисунков. Список использованной литературы включает 199 источников, в том числе 146 работ иностранных авторов.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Молекуляно-генетический анализ количественных признаков.

Генетический полиморфизм, т. е. существование в популяции нескольких форм гена или признака, встречающихся с определенной частотой, служит мерой генетической изменчивости популяции [Сулимова, 1993]. В свою очередь, изменчивость лежит в основе таких фундаментальных биологических процессов, как адаптация и эволюция, а следовательно, и связана с селекционными процессами, базирующимися на тех же механизмах преобразования фенотипов.

Генетический полиморфизм, сосуществование в пределах популяции двух или нескольких различных наследственных форм, находящихся в динамическом равновесии в течение нескольких и даже многих поколений [Тимофеев-Ресовский Н. В., Свирежев Ю. М, 1967].

Чаще всего генетический полиморфизм обусловливается либо варьирующими давлениями и векторами отбора в различных условиях, либо повышенной относительной жизнеспособностью гетерозигот.

Генетический полиморфизм проявляется на разных уровнях: морфологическом, клеточном, молекулярном, изучение которых предполагает использование различных методических подходов. Морфологическая изменчивость характеризуется огромным размахов и определяется по масти, телосложению, массе и другим метрическим признакам [Тимофеев-Ресовский, Яблоков, 1973; Столповский, Захаров, 2006].

В 70-80-х годах XX века в арсенал исследователей вошли биохимические методы исследования белков, например, альбуминов, глобулинов, изоферментов, - применение которых привело к возникновению понятия «биохимический полиморфизм». Под биохимическим полиморфизмом подразумевается наличие в одной и той же популяции различных молекулярных форм белков, в частности изоферментов. Во многих природных популяциях биохимический полиморфизм обнаруживают более

30% из числа изученных генетических локусов [Алтухов, Рычков, 1972; Айяла, 1984].

Расшифровка первичной последовательности ДНК различных организмов позволила получить новые представления о структуре генома прокариот и эукариот. Значительную долю генома высших эукариот составляют повторяющиеся неэкспрессирующиеся последовательности сателлитной ДНК (до 50%), к тому же экспрессируемые гены сильно интронированы - длина интронов может составлять до 95% размера гена. Поэтому при анализе белкового полиморфизма от внимания исследователей ускользает большая часть генома - до 90%. При этом в состав неэкспрессируемых последовательностей могут входить функционально значимые участки. Так, современные представления о механизмах реализации генетической информации отводят важную роль регуляторным участкам, расположенным вне гена, иногда на значительном расстоянии от кодирующей последовательности [Сулимова, 2006, Глазко В. И., Глазко Г. В., 2003]. В связи с этим перспективно проведение анализа генетического полиморфизма на уровне ДНК.

Основными причинами, приводящими к возникновению полиморфизма ДНК, являются точечные мутации, затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции, а также крупные делеции и вставки, транспозиции мобильных генетических элементов и т. п.

В последние десятилетия в изучение генетического полиморфизма большое значение приобрели молекулярные маркеры, которые по праву занимают важное положение в различных областях генетических исследований [Caetano-Anolles, 1993; Mohan et al., 1997]. Большую роль молекулярные маркеры играют в разработке таких направлений генетических исследований, как идентификация и маркирование генов селекционно-ценных признаков [Messeguer et al. 1991; Barzen et al., 1997].

Большинство признаков и свойств организмов характеризуются количественным типом индивидуальной изменчивости, для которой типично

непрерывное изменение величины признака у особей какой-либо группы. Даже в пределах достаточно однородной по полу, возрасту, породе группы животных у близкородственных особей наблюдается индивидуальная изменчивость признака. К количественным признакам относят хозяйственно ценные (живая масса, величина, удой, настриг шерсти и др.) и физиологические признаки. Они характеризуются типичным непрерывным изменением этих показателей у особей конкретной группы.

Специфическое воздействие генотипа по отдельному гену на фенотип особи в значительной мере зависит от окружающей его «генетической среды», которую можно �