Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ (H-FABP), И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ХОЗЯЙСТВЕННО-ПОЛЕЗНЫЕ ПРИЗНАКИ СВИНЕЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ (H-FABP), И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ХОЗЯЙСТВЕННО-ПОЛЕЗНЫЕ ПРИЗНАКИ СВИНЕЙ"

Учреждение всероссийский государственный научно-исследовательский институт

ЖИВОТНОВОДСТВА РОССИЙСКОЙ академии СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ наук

На правах рукописи

АРСИЕНКО РОМАН ЮРЬЕВИЧ

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ (Н-РАВР), И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ХОЗЯЙСТВЕННО-ПОЛЕЗНЫЕ ПРИЗНАКИ СВИНЕЙ

Специальность: 03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы-2003

Работа выполнена в отделе биотехнологии учреждений Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Зиновьева Наталия Анатольевна Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук

Шмаков Юрий Иванович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Марзанов Нурбнй Сафарбиеанч кандидат биологических наук, доцент Новикова Людмила Федоровна

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия имени КА Тимирязева

Защита диссертации состоится « ^ » 2003 года, в 10 часов, на

заседании диссертационного совета Д006.013.01 при учреждении Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. йубротци, ВИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖз.

Автореферат разослан _ 2003 г.

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

На формирование продуктивное™ сельскохозяйственных животных оказывают

влияние как генетические, так средовые факторы. В этой связи, при традиционно«

отборе животхых по фенотипическому проявлению признаков оценка истинного

генетического потенциала животных может быть занижена. С развитием

молекулярной генет,™ и молекулярной биологии сташеигся возможным

Идентификация генетически маркеров, напрямую или косвенно связанных с

хозяиственно-полезными признаками (Fovster, 1997}, Выявление предпочтительных с

точки зрения селекции вариантов таких генов позволит дополнительно к

традиционному отбору животных, например, по уровню удоя, содержания жира и т п

проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК, то есть по генотипу (маркер-зависимая селекция). /ire

Преаде чем внедрить использование генетических маркеров в селещию животных, необходимо выполнить ряд мероприятий: (1) Выделить спектр генов-кандидатов, которые могут служить молекулярно-генетическими маркерами локусов количественных признаков - QTL. (2} Разработать тест-системы для анализа их «ного полиморфизма. (3) Определить частоты встречаемости аллельных вариантов данных генов у различных пород сельскохозяйственных животных. « Провести корреляционный анализ с хоаяйственно-лшезньш признаками (5) Оценить эффективность использования генетических маркеров в селекции

Одним« из важнейших селекционных признаков свиней являются мясная продуктивность и качество мяса. Преимущественная селекция свиней по «ясности приводит к значительному ухудшению качества свинины (Meatus et э!„ 2001 Seitens et at, 1999). Прямая селекция свиней по качеству мяса и мясной лродутшносш традиционными методами затруднена из-за низкого коэффициента наследуемости признака. В этой связи, возникает необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, напрямую или косвенно связанных с качественными и количественными признаками мясной продуктивности,

В качестве возможных маркеров признаков мясной продуктивности и качества мяса свинец рассматриваются гены семейства белшв, связывающих жирные кислоты (FABP). Одним из генов этого семейства является H-FA6P, представляющий большой интерес в качестве маркера содержания внутримышечного жира у свиней {Ge/bens et a!., 1997, Ovüoetal., 2000].

ЦКБ MOXA фонд научной л*г

Цепь и задачи исследования.

Целью диссертационной работы являлось выявление полиморфизма гена белка, связывающего жирные кислоты {Н-РАВР), и установление его влияния на проявление хозяйственно-полезных признаков свиней различных пород.

Для достижения цепи диссертационной работы были поставлены и решены следующие задачи:

1. Пополнить банк ДНК свиней различных пород и популяций.

2. Усовершенствовать методику определения полиморфизма гена Н-РАВР свиней на основе анализа ПЦР-ПДРФ.

3. Установить частоты встречаемости аллелей и генотипов гена Н-РАВР у различных пород и популяций свиней России,

4. Провести анализ взаимосвязи генотипов гена Н-РАВР с содержанием внутримышечного жира.

5. Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов гена Н-РАВР с рядом хозяйственно-полезных признаков свиней.

Научная новизна.

Предложена методика определения аллельных вариантов гена Н-РАВР у различных пород свиней РФ. Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов гека Н-РАВР у шеста популяций трех пород свиней, разводимых в Российской Федерации, Изучено влияние вариантов исследуемого гена на содержание внутримышечного жира и другие хозяйственно-полезные признаки свиней.

: Практическая ценность работы.

Пополнен банк ДНК свиней различных пород и созданы базы данных хозяйственно-полезных признаков свиней трех пород. Предложена методика выявления аллельных вариантов гена Н-РАВР для проведения популяционно-генетических исследований. Показана связь генотипа РЭ гена Н-РАВР с большей толщиной шпика и повышенным содержанием жира в тушах свиней. Основные положения, выносимые на защиту.

• Создан банк ДНК свиней трех пород (крупная белая - 6 популяций, белая

короткоухая, уржумская). •' Предложен усовершенствованный метод выявления полиморфных вариантов

гена Н-РАВР свиней.

• Выявлены различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов исследуемого гена у свиней трех пород.

• Установлены тенденции влияния генотипов H-FABP на проявление хозяйственно-полезных признаков свиней.

Структура и объем работы.

Диссертация написана на 97 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает 27 таблиц и 11 рисунков.

Публикации результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы.

Апробация работы.

Материалы диссертационный работы были доложены на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, 2000 год; на международной научной конференции «Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2001 год, на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2002 год, на конференции отдела биотехнологии ВИЖ, 2003 гад.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.

В опытах были использованы б популяций свиней крупной белой породы из следующих племенных хозяйств: ГПЗ «Большое Алексеевское», ГПЗ «Никоновское», ГПЗ «Талдом» Московской области, ГПЗ сСоюловка» Кировской области, ГПЗ «Индустрия» Могилевской области и ГПЗ «Заднепровский» Витебской области; белой короткоухой породы ГПЗ «Сампурский» Тамбовской обпасти; уржумской породы ГПЗ «Мухинсхий» Кировской облает.

От животных отбирали пробы шни (ушной вы щип) или пробы крови. Пробы крови консервировали путем добавления кислого цитратного раствора (ACD), добавляя на каждые 6 объемов крови 1 объем ACO [Gusíaireon ef a/., f987, Зиновьева и др., 2000}. Пробы ткани после их взятия замораживали при температуре -20вС и хранили в таком состоянии до момента использования. ДНК выделяли посредством солевой экстракции, лизиса в буфере Кавасаки или лерхлорагным методом с модификациями /Зиновьева и др., (998; Гпадырь и др. 2001}. Качество очистки и концентрацию выделенной ДНКопределяли по методике Зиновьевой и др. [19981.

Рис. 1. Схема исследований

Отбор проб выделение ДНК

Создание банка ДНК |

-С

Сознание баз данных

Помесные свиньи, б=41 Белая Короткоухая, №=36 Крупная белая, п=483 Уржумская, п=178

1 1

Г 1 1 1 1 1

т

с ■8

Е

в 8.

Н К

С и С

>й $ § л а я.

О ч

5 о

х а

I §

С1 о

г-1/1

Э- о

о >а & °

9 « | 8

В о

и 3

I

с

"8

>3

§

& г

А "Л й> гл

§ 1

0 с

СЙ *

и В

2 ° а е

1 § « I

~ И

Ёо

I

оо

ГЛ

£ » с

1 ^

X щ §2

5 1

и 2

о

<м И

® £

0

1 § м I 5 I

(л <->

00 г»

«г

Ч *

II

Й о л1 х

Щ а

о & Ей

ПЦР-ГЩРФ анализ полиморфизма гена Н-РАВР

]>т»п

Н-тип

Частоты аллелей Частоты генотипов

1 1 1

3 -о

а

пл

Частоты аллелей

Н К

Частоты генотипов

I

Анализ взаимосвязи с признаками продуктивности свиней

Содержание внутримышечного жира

Толщина шпика

Собственная продуктивность

Морфо логичес кий состав туш

Вес н процент внутреннего жира

Выделенную ДНК тестировали по типу А гена Н-РАВР методом ПЦР-ПДРФ по методике, разработанной ИесШЬегдег с соавторами [2001], и по типам Э и Н по методикам ПЦР-ПДРФ, оптимизированным в ходе выполнения диссертационной работы. Реакции проводили в конечном объеме 25 ииклс 1 хПЦР буфером (16,6 мМ (N84)2304; 67,7 мМ Трис - НС1, рН = 8,8; 0,1 Тшеп 20), 1,5 мМ МдС12, 200мкМ диоксинуклеозидтрифосфатов, 30 л моль каждого иг праймеров и 1 Ед Тач -полимеразы. Последовательности праймеров, используемых для ПЦР, представлены в таблице!.

Тэбл. 1. Посл^оеательности используемых праймеров

Название Ориентация Последовательность 5'—+3' Позиции

Генный банк №У16№

РАВРЗ (и АТТ ЦАГ ЦТА ЦТЦ АГЦ ТГГ ТТЦ Ц 1615-1636

РАВР4 га ААЦ ААА ЦТЦ ТЦА ГГА АТГ ГГА Г 2204-2225

Генный банк №Х98558

РАВР5 ААГ АГГ АЦЦ ААГ АТГ ЦЦТ АЦГ 1121-1142

РАВР6 т ТГЦ ТГТ ЦЦА ЦТА ГЦТ ТЦЦ АГГ 1660-1680

Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК гена Н-РАВР проводили стандартным методом ПЦР анализа е? а/., /387, $э/И е1 а!., 1988}. После начальной денатурации при температуре 95°С в течение 5 минут выполняли 35 циклов амплификации в следующем температурном режиме: 95"С -1 мин., 60°С ( Н аллель) и 58'С (О аллель) -1 мин., 72"С -1 мин.

Полиморфизм по типу Н (5'1ЛК) выявляли посредством энзим этического гидролиза с использованием рестриктазы ИМ с последовательностью узнавания О'АЫТО (генный банк № Х98558, позиции 1321-1325}. Отсутствие рестрикционного сайта соответствует алпелю к в то время как его наличие - аллепю Н. Наличие рестрикционого сайта эццонукпеазы НаеШ или ВзиИ с последовательностью узнавания Св^СС в интроне 2 гена РАВР {генный банк № VI6? 80, гашции 1810-1313] позволяет идентифицировать аллель (I, в то время как его отсутствие соответствует аллелю О.

Для анализа амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов рестрикции использовали метод гель-электрофореза. Злекгрофоретическое разделение проведали при 120В в 1 ,&% агарозном геле в буфере ТАЕ с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 нг/мл, после чего выполнял« визуализацию продуктов ПЦР-ПДРФ под ультрафиолетовым светом. Документацию результатов осуществляли, используя программу ВюТей Зй,

Статистическую обработку данных проводил» по стандартным методикам ¡Меркурьева и др., 1991]. Расчет средних значений (X) и стандартных отклонений (о) в выборках вели с использованием программы Microsoft Excel. Стандартное отклонение для признаков, выраженных в процентах, находили по формуле cr=^(p*q), где р и q - частоты встречаемости признаков, выраженные в процентах. Ошибку средней находили по формуле М*= оНп, где п - число значений признака. Достоверность разницы между признаками определяли на основании сравнения коэффициента достоверности (То) с коэффициентами по таблице Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Создание банка ДНК свиней.

В рамках выполнения данной работы нами были собраны пробы и выделена ДНК из 697 образцов от 8-ми популяций свиней трех пород, которые представлены в

таблице 2.

Табл. 2, Характеристика банка ДНК свиней отдала биотехнологии ВИЖ.

Порода Популяция Группа Число голов

Крупная белая ГПЗ «Кораблино» Тульской обл. свиноматки 47

ГПЗ «Константинове» Москов. обл. хряки и матки 195

ГПЗ «Соколовка» Кировской обл. . хряки иматки 46

Крупная белая ГПЗ «Б, Мексееескоеэ Москоа. обл. хряки 35

ГПЗ «Ник0Н0вск0е»М0с«0е.0бл.;;- хряши матки ...- 38 ;

с/х «Заднет^ровскмй» Витеб. обл./ .хряки 47. .

ПЗ«Иццусгрия» Могилевской обл.;'. хряки 57 V

ГПЗ«ТалДомэМосковскойобл;.. хряки и матки 260 .

СМ-1 ГПЗ им. Горького Липецкой обл. хряки и матки 76

Бел. короткоух. ГПЗ «СамЛурский »Тамбовской обл. свиноматки

Уржумская ГПЗ «Мухикский» Кировской оол. хряки и матки - 178

Круп, черная ГПЗ «Большевик» Тульской обл. хряки и матки 22

ИТОГО: 1037

Примечание: серым цветом указаны популяции свиней, от которых пробы ДНК были получены в рамках диссертационной работы.

Как следует из данных таблицы 2, в настоящее время банк ДИК свиней насчитывает 1037 проб ДНК племенных хряков и свиноматок 5-ти пород свиней, в том числе: крупная белая (8 популяций) - 725 образцов; крупная черная (1 популяция) -22 образцов; белая короткоухая (1 популяция) - 36 образцов; уржумская {1

популяция) - 178 образцов; скороспелая мясная (1 популяция) - 76 образцов. Образцы ДНК хранятся лри температуре -20°С и могут быть использованы для проведения молекулярногенетических и популяционно-генетмческих исследований.

32. Оптимизация тест-систем для выявления полиморфизма гена Н-РАВР.

Следующим этапом в работе явилась оптимизация тест-систем для анализа аллепьного полиморфизма гена Н-РАВР. Недостатком существующих тест-систем является ограниченная длина амллифицируемых фрагментов, а так же относительно близкое расположение участков рестрикции то отношению к одному праймеров, что значительно затрудняет интерпретацию результатов. Существующие тест-системы анализа Н-РАВР требуют проведения электрофореза в высокопроцентном геле длиной не менее 5-7 см, что увеличивает, с одной стороны, расход дорогостоящей агарозы (стоимость 1 грамма агарозы составляет более 20 рублей), с другой стороны, - затраты времени на проведение электрофореза до 30-40 минут.

Как известно, ген Н-РАВР характеризуется тремя типами аллельного полиморфизма, что приводит к наличию аллелей А, а; 0, с!; и Н, Ь. Проведенные нами исследования полиморфизма по типу А в трех популяциях свиней крупной белой породы (ГПЗ «Большое Апексеевское», ГПЗ «Никоновское» Московской области и ГПЗ «Соколовка» Кировской области) не выявили наличия аллеля а. Учитывая это, в дальнейшем оптимизацию тест-системы для диагностики аллельного полиморфизма гена Н-РАВР проводили по двум типам - О и Н.

Предложенный нами дизайн праймеров (последовательности праймеров указаны в разделе «Материалы и методика исследований», предусматривает амплификацию фрагментов оптимальной длины (611 и.о. для типа й и 560 п.о, для типа Н) с расположением участков рестрикции приблизительно на расстоянии 1/3 длины от одного из концов амллифицируемых фрагментов.

Предлагаемые нами праймеры позволяют легко идентифицировать, как рестрицированные фрагменты ПЦР, так и нерестрицированный фрагмент амплификации, образующие в результате ПДРФ анализа.

Дизайн праймеров для анализа аллелей 0,с1 и Н, Ь гена Н-РАВР с указанием длин амллифицируемых и образующихся в ходе рестрикции фрагментов схематично представлен на рисунке 2.

Как следует из данных, представленных на рисунке 2, при диагностике аллелей О и с! гена Н-РАВР наличие нерестрицированного фрагмента длиной 611 л.о. соответствует генотипу ОО, двух фрагментов длиной 414 и 197 п.о. - генотипу (1с1, в то время как наличие трех фрагментов длиной 611, 414 и 197 л.о. соответствует генотипу Ой.

Рис. 2. Схема ПЦР'ПДРФ анализа гена Н-РАВР по типам йиН

611 п.о.

1811/1812

1 .■■- . ■

1615 Т 2225

НаеШ

0 611 п.о.

а 197 п.о. 414 п.0.

560п.о.

1321/1322 1380/1381

1121 1 1 1Ш

Н 'тД Ниф.

Ь 260 п.& 300 гил

Н 201 п.о. 59п.о. ЗООп.0.

Позиции 5- и 3'-концов фрагментов и точек рестрикции указаны в соответствии с ЕМВ1У16180 (0-пм)иХ98558 (Н-тип).

При диагностике аллелей Н и 1т гена Н-РАВР диагностируется общий для обоих аллелей фрагмент длиной 300 п.о, Наличие одного дополнительного фрагмента длиной 260 п.о. соответствует генотипу ЬЬ, двух фрагментов длиной 201 и 59 п.о, -генотипу НН, в то время как наличие трех фрагментов длиной 260, 201 59 п.о. соответствует генотипу НЬ.

3.3. Диагностика полиморфизма гена Н-РАВР.

Анализ различных пород популяций свиней (уржумская, крупная белая, белая короткоухая) позволил выявить частоты встречаемости аллелей и генотипов типа О гена Н-РАВР, Результаты анализа суммированы в таблице 3.

Табл. 3. Частоты встречаемости аллелей и генотипов й-типа гена Н-РАВР свиней

Порода Число голое Частоты встречаемости

генотипы, % аллели

0(1 (1(1 О <1

Крупная белая 38« 63,2 28,9 7,9 0,78 0,22

352 20,0 57,1 , 22,9 0,49 0,51

463 13,0 52,2 34,8 0,39 0,61

Уржумская 163« 41,1 48,47 10,43 0,65 0,35

Белая короткоухая 365 25,0 58,3 16,7 0,54 0,46

'/773 'Никоновское" Моск. обл., 2ГПЗ 'Большое Апвксеевское' Моек, обл., 3ГШ "Сокопша" Кировской обл., 4ГПЗ "Мухиншй" кировской обл., ЧТО Сл^а-пу^«.^ Тамбовской обл.

Как следует из представленных в таблице 3 данных, частоты встречаемости предпочтительного генотипа сИ варьировали у свиней крупной белой породы от 7,9% до 34,8%. В уржумской породе доля животных с генотипом (М была на уровне 10%, белая короткоухая порода занимала промежуточное положение (16,7%).

Следует отметить большие различия в частотах встречаемости генотипа 00 и аллеля 0 в различных популяциях свиней крупной белой породы: соответственно, от 13,0% и 0,39 в ГПЗ "Соколовка" Кировской области до 63,2% и 0,78 в ГПЗ "Никоновское' Московской области. Вероятно, это связано с разными селекционными подходами, применяемыми в хозяйствах, что приводит к накоплению определенных генотипов, иногда даже противоположных, но наиболее хорошо реализующихся в условиях данного хозяйства.

На рисунке 3 представлены данные о частотах встречаемости аллелей покуса О гена Н-ГАВР в различных семействах свиней уржумской породы. Как следует из данных рисунка 3, частота встречаемости предпочтительного с точки зрения содержания внутримышечного жира аллеля с) варьировала в зависимости от семейства от 0,25 до 0,50, при этом максимальная частота аллеля отмечалась в семейства Линзы, а минимальная - в семействе Юбилейной.

Частоты встречаемости аллелей и генотипов по типу Н гена Н-РАВР представлены в таблице 4.

Рис. 3. Частоты встречаемости аллелей Dud гена H-FABP свиней уржумской породы

Табп. 4. Частоты встречаемости аллелей и генотипов Н-систеиы гена Н-РАВР у различных пород свиней

Порода Число голов Частоты встречаемости

аллели, % генотипы

НН Hh hh Н h

Крупная белая 321 71,9 25,0 3.1 0,84 0,16

35г 71,4 28,6 0 0,86 0,14

433 100 0 0 1,0 0,0

Уржумская 172« 92,4 7,6 0 0,96 0,04

Белая короткоухая 495 89,8 10,2 0 0,95 0,05

'ГШ "Никоновское" Московской обл., гГПЗ 'Большое Алвхсеевское" Московской обл., 3ГПЗ "Соколовка" Кировской обл., 4ГПЗ "Мухинский" Кировской обп,, 5Г/73, Тамбовской обл.

Частота предпочтительного по содержанию внутримышечного жира генотипа НН в зависимости от порода составляет 71,4-100%. Наибольший разброс показателей наблюдается внутри крупной белой породы свиней (71,4-100%). Уржумская и белая короткоухая породы занимают промежуточное положение, с частотами встречаемости генотипа НН, соответственно, 92,4 и 89,8%.

На рисунке 4 представлены данные о частотах встречаемости аллелей Н и II гена Н-РАВР у свиней уржумской породы.

Рис. 4. Частоты встречаемости аллелей Kuh гена H-FABP свиней уржумской породы

Как следует из данных рисунка 4, частота встречаемости аллеля h была наивысшей в семействе Линзы (0,167) и в других семействах варьировала от 0 до 0,083.

3.4. Полиморфизм гена H-FABP во взаимосвязи с хозяйственно-полезными признаками.

С целью оценки возможности использования гена H-FABP в селекции были выполнены исследования корреляции между генотипами H-FABP и признаками продуктивности свиней.

3.4.1. Анализ содержания внутримышечного жира.

С целью установления корреляций между содержанием внутримышечного жира в длиннейшей мышце спины, а также откормочными качествами свиней и генотипами по H-FABP был проведен контрольный откорм помесной синтетической популяции животных ГПЗ 'Заречье" Кировской области. В таблице 5 суммировав] данные о содержании жира в длиннейшей мышце свиней в зависимости от генотипа по H-FABP.

Табл. 5. Содержание жира в длиннейшей мышце спины в зависимости от генотипа ло гену H-FABP

Генотип п Содержание внутримышечного жира Соотношение генотипов Разница la Р

DD 3 6,750±0,418 Dd>DD +0,720 1,111 <0,95

Dd 27 7,470±0,495 DdXtd +1,028 1,469 <0,95

dd 11 6,442±0,495 DD>dd -ю.зоа 0,475 <0,95

НН 39 7,133±0,374 Htp-HH +0,182 0,179 <0,95

Hh 2 7,315±0,947

Анализ данных таблицы 5 позволяет сделать вывод об отсутствии достоверной разницы между генотипами по содержанию внутримышечного жира у исследованного поголовья свиней. При сравнении генотипов Ос) и <М наблюдается тенденция по превосходству животных с гетерозиготным генотипом над животными с генотипом

Исследование сочетаний генотипов выявило 4 из 9 возможных комбинаций. В таблице 6 суммированы данные о взаимосвязи двух типов генотипов по Н-РАВР с содержанием внутримышечного жира

Табл. в. Содержание жира в длиннейшей мышце спины в зависимости от сочетаний генотипов по гену Н-РАВР.

Генотип п Содержание внутримышечного жира Соотношение генотипов Разница Т(1 Р

ННОО . 3 6,75±0,418 ННОО>НН<М +0,308 0,457 <0,95

ННОй 25 7,483±0,533 НШХМйМ +0,168 0,154 <0,95

ННсМ 11 6,442±0,495 НН0с1>НН<1с1 +1,041 1,431 <0,95

НЬРс! 2 7,315±1,414 НЬЕМ>ННОО +0,556 0,547 <0,95

Как и в случае полиморфизма по типу О, достоверная разница между различными комбинациями генотипов Н-РАВР отсутствует. В качестве тенденции можно отметить лишь незначительное превосходство гетерозигот над гомозиготами, что соответствует соотношению генотипов Ы>00><}&

3.4.2. Анализ темпов роста.

Проведенные нами исследования не выявили различий в темпах роста различных групп помесных свиней ГПЗ «Заречье» Кировской области (генотипы 00, Ос1, (И) в период от рождения до 9 месяцев. Незначительное превосходство одного из генотипов над другими по живой массе свиней в возрасте 2,3 и 7,5 месяцев (р>0,05) полностью нивелировалось по достижении животными возраста 9 месяцев. Не было установлено различий в темпах роста свиноматок крупной белой породы в возрасте 14-15 месяцев. Лишь при исследовании хряков уржумской породы в возрасте 12-ти и 24-х месяцев были выявлены незначительные различия между генотипами по темпам роста (ОООФсМ) и по возрасту достижения живой массы 100 кг (¿Й>00>0с/). Учитывая, что генотип 00 характеризуются повышенным накоплением жира в туше, увеличение темпов роста хряков в группе 00 можно объяснить тем, что прирост живой массы происходит, главным образом, за счет отложения жира. Таким образом, влияние полиморфизма гена Н-РАВР на темпы роста свиней проявляется только при сочетании аллелей, свойственных определенным породам и популяциям.

3.4.3. Анализ толщины шпика и состава туш.

Обнадеживающие результаты были получены при исследовании содержания жира в туше помесных свиней ГПЗ «Заречье». Так, по показателю толщины шпика наблюдалось заметное уменьшение толщины шпика у животных, несущих в генотипе аллель (1, по сравнению с животными с генотипом 00, причем данная тенденция сохранялась во всех шести точках, в которых проводилось измерение (рис. 6}.

Рис. 6. Зависимость толщины шпика от генотипа по Н-РАВР

в-7 р#6ро яойЁннця крестец 1 кр*е-»ц 2 яр»ст*ц 3 ярьствц ср

Как показано на рисунке 6, наибольшая толщина шпика в отдельных точках измерения отмечалась у животных с генотипом 00 - 34,0-35,0 мм. У животных с генотипами Ос! и сМ, толщина шпика варьировала, соответственно, от 29,7 до 47,0 мм и от 31,1 до 47,8 мм. Таким образом, наблюдается заметное уменьшение толщины шпика у свиней, несущих в своем генотипе аллель (1 ло сравнению с группой свиней, имеющих генотип ОО: у гетерозиготных животных в зависимости от точки измерения от 3,0 до 5,7 мм, а у свиней с генотипом сМ - от 2,3 до 3,5 мм.

Различия в толщине шпика у свиней, несущих аллель с1 ло сравнению с генотипом 00 в абсолютном (мм) и относительном (%) выражении представлены в таблице 7. В среднем по шести измерениям уменьшение толщины шпика у свиней с генотипами Ой и <1с1 по сравнению с генотипом 00 составляло, соответственно, 4,5 и 3,3 мм (р<0,01).

Табл. 7. Толщина шпика у евшей е зависимости от генотипа по Н-ГАвР

Генотип Толщина шпика, мм Разница в %% к 00 Достоверность разницы

мм %

00 40,58±0,53

Ой 36,05+0,46 -4,5 -11.2 И<00, р<0.01

37,27±0,71 -3,3 -8,2 <М<00, р<0,01

Тенденция пониженной жирности свиней с генотипами <№ и 04 по сравнению с генотипом 00 сохранялась и по показателю содержания внутреннего жира (табл. 8). Табл. 8. Изменение содержания внутреннего жира в тушах свиней в

зависимости ш генотипа по Н-РАВР

Генотип Содержание внутреннего жира

кг %

в среднем в %% к 00 в среднем в%% кОО

00 2,9±0,2 2,8±0,3

0(1 2,6*0.1 -9,2 2,0*0.1 -28,6*

с1(1 2,7±0,1 -7,7 2,5±0,1 -10,0

* ТФ8Д р<0,01

Таким образом, по показателю толщины шпика и внутреннего жирз выявлялась тенденция соотношения генотипов гена Н-РАВР - £>0>сй>Ш.

Выявленная тенденция пониженной жирности свиней, имеющих в генотипе аллель с1, сохранялась и при исследовании содержания сала в туше исследуемых свиней после обвалки (рис. 7). Процентное содержание сапа в тушах свиней с генотипами 0с1 и по сравнению с животными с генотипом 00 было ниже, соответственно, на 8,9 и 11,5% при увеличении доли мяса, соответственно, на 7,0 и 10,9%. Как и предполагалось, по содержанию костей существенных различий между группами выявлено не было.

Рис. 7. Морфологический состав туш свиней в зависимости от генотипа по Н-РАВР

На основании полученных данных можно сделать вывод, что ло содержанию сала в туше свиней наблюдается соотношение генотипов Ш>Ш>й/, в то время как по содержанию мяса отмечается противоположная тенденция - ёс!>ОФОО.

Исследование взаимосвязи показателя толщины шпика с генотипа«« по гену Н-РАВР было так же выполнено на свиноматках уржумской породы ГПЗ «Мухинский» Кировской области (табл. 9).

Табл. 9. Изменение толщины шпика у свиней уржумской породы в зависимости от генотипа по Н-РАВР

Генотип Число голов Толщина шпика при живой массе 100 кг, мм

00 15 26,98±0,61

ем 17 25,95±0,47

<И 2 26,70±0,30

р<0,05

Как следует из данных таблицы 9, наибольшая толщина шпика отмечалась у свиней с генотипом 00. У животных, несущих генотипы Ой и <М, уменьшение толщины шпика составляло, соответственно, 1,03 и 0,28 мм или 3,8 и 0,8%. Следует отметить, что лишь незначительное уменьшение толщины шпика у животных с генотипом <14 может быть обусловлено недостаточным числом исследованных животных (п=2), в связи с чем рассчитанная нами толщина шпика не отражает средний показатель толщины шпика у животных с генотипом сИ в популяции. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что у свиней уржумской породы наблюдалась тенденция, аналотчная выявленным нами данным при исследовании помесных свиней ГПЗ «Заречье»: 01>с№£)с/.

Исследования толщины шпика у хряков уржумской породы в возрасте 12 и 24 месяцев показали, что уменьшение толщины шпика у животных с генотипом 0с1 по сравнению с генотипом 00 в возрасте 24-х месяцев составило 2,3 мм или 8,5% (р<0,05) (тай). 10).

Табп, 10. Толщина шпика у хряков уржумской породы в зависимости от генотипа по гену Н-РАВР е возрасте 12 и 24 месяцев

Показатель Воз- Генотип по гену Н-РАВР

раст, 00 ст 64

мес. п М±Мх П М±Мх п М±Мх

Толщина шпика, мм 12 8 27,6±1,2 1 27,0 1 29

24 3 27,0+2,0 3 24,7+2.2 1 29

р<0,05

Результаты анализа толщины шпика у свиноматок крупной белой породы ГПЗ «Никоновское» в возрасте 24-ех месяцев представлены в таблице 11.

Габл. 11. Толщина шпика свиноматок крупной белой породы ГПЗ «Никоновское» Московской обл.

Показатель Генотип по Н-РАВР

00* М* ООНН оанн

Число голов 8 5 7 3

Толщина шпика, мм 25,8±1,2 24,7+0,7 26,0±1,6 24,5±1,5

* Группы сформированы без учета генотипа по Н-системв гена Н-РАВР.

Как следует из данных таблицы 11, наличие в генотипе свиноматок агшеля <1 приводило к уменьшению толщины шпика на 1,1 мм или 4,2% (без учета генотипа по типу Н) и на 1,5 мм или 5,9% (у свиноматок, гомозиготных по аллелю Н). Таким образом, в данной популяции свиней подтверждалось уже выявленное нами ранее соотношение генотипов гена Н-РАВР по толщине шпика - Ос/.

3.4.4. Анализ развития свиней.

Результаты анализа развития свиноматках крупной белой породы ГПЗ «Соколовка» Кировской области во взаимосвязи с генотипами по Н-РАВР суммированы в таблице 12.

Табл. 12. Развитие свиноматок крупной белой породы ГПЗ «Сотговка» в зависимости от генотипа по Н-РАВР.

Показатель Генотип по Н-РАВР

00 (п=4) 0(3 (п=11) с!с1(п=12)

Возраст оценки, мес. 14,0±0,4 15,2±0,3 15,0±0,6

Живой вес, кг 1В6,8±5,1 188,5±3,3 191,4±2,5

Длина туловища, см 146,5*3,1 150,8±2,1 150,4±1,8

Как следует из данных таблицы 12, достоверных различий по показателям развития свиноматок с различными генотипами й-системы гена Н-РАВР выявлено не было.

В таблице 13 показаны данные развития хряков уржумской породы ГПЗ «Мухинский» в возрасте 12-ти и 24-х месяцев в зависимости от генотипа.

Табл. 13. Развитие хряков уржумской породы в зависимости от генотипа по гену Н-РАВР в возрасте 12 и 24 месяца

Показатель Воз- Генотип по гену Н-РАВР

раст, 00 Ос! (1с1

мес. п М±Мх П М±Мх п М±Мх

Живая масса, кг 12 16 196,2+7,3 8 185,0±5,1 3 183,0±6,7

24 8 310,3±8,0 5 296,0±9,4 2 291,0±9,0

Длина туловища., см 12 16 161,6±1,5 8 159,111,8 3 159,3±3,8

24 8 181.6+1,7 5 180,0±1,8 2 177,5±4,5

Возраст 100 кг, дн 19 216,6+3,3 9 240,6±14,6 3 235,4±3,3

Анализ данных таблицы 13 позволяет сделать вывод о тенденции повышения темпов роста хряков с генотипом ОЭ по сравнению с генотипами 0с1 и (М, Так, в возрасте 12 месяцев хряки с генотипом 00 превосходили хряков с генотипами 0(1 и сИ, соответственно, на 6,1 и 7,2%, а в возрасте 24 месяцев - соответственно, на 4,8 и 6,6%. Хряки с генотипом 00 достигали живой массы 100 кг, соответственно, на 24 и 19 дней раньше по сравнению с хряками, имеющими генотипы 0(1 и с!<1.

Характеризуя показатели собственной продуктивности хряков уржумской породы в цепом, следует отметить, что по темпам роста хряков в возрасте 12 и 24-х месяцев наблюдается следующее соотношение генотипов; Р0>0Фч}<], в то время как по возрасту достижения живой массы 100 кг - ёФООСк!.

3.4.5. Анализ продуктивности свиней.

Как и при исследовании селекционных признаков, описанных выше, однозначней зависимости показателей собственной продуктивности свиней от генотипа по Н-РАВР выявлено не было.

Так, по показателю многоплодия свиней уржумской породы в среднем по трем опоросам наблюдалось превосходство свиноматок с генотипом <М по сравнению с генотипами 00 и 0(1, соответственно, на 1,4 и 1,5 поросенка на опорос (р<0,01). Хотя у ошей крупной белой подобная тенденция сохранялась, различия между группами были менее выражены - соответственно, 0,7 и 0,3 поросенка на опорос (р<0,05).

Если по показателю молочности свиноматок уржумской породы различий между группами выявлено не было, то свиноматки крупной белой породы ГПЗ «Соколов ка» с генотипами (М и Ос1 имели более высокую молочность по сравнению со свиньями, имеющими генотип 00 - соответственно, на 7,9 и 5,1 кг. Молочность свиноматок с генотипом 0(1 в популяции свиней крупной белой породы из ГПЗ «Никоновское» превышала данный показатель у свиней с генотипом 00 на 5,6 кг (в исследовании участвовали только две группы свиней с генотипами 00 и Ой).

По показателю веса гнезда в 60 дней, как у свиней уржумской породы, так и крупной бетой породы наблюдалось превосходство свиноматок с генотипом сМ над свиноматками, имеющими генотипы Ос) и 00: в уржумской породе - соответственно, на 31,4 и 15,6 кг, в крупной белой породе - соответственно, на 6,9 и 8,3 кг. Если у свиней уржумской породы выявленные различия были обусловлены, с одной стороны, большим числом поросят в возрасте 60-ти дней (соответственно, на 1,3 и 0,4 поросенка на опорос), с другой стороны, большим весом одного поросенка (соответственно, на 1,4 и 0,9 кг), то у свиноматок крупкой белой породы с генотипом сМ повышенный вес гнезда в 60 дней достигапся, главным образом, за счет большего числа поросят (на 0,9 поросенка).

4. ВЫВОДЫ.

1. Пополнен банк ДНК 697 образцами, полученными от 8-ми популяций свиней трех пород (крупная белая, белая короткоухая, уржумская).

2. С помощью модификации ПЦР-ПДРФ анализа предложена методика диагностики полиморфизма гена белка, связывающего жирные кислоты (Н-РАВР) свиней, что позволило увеличить точность результатов и сократить временные затраты.

3. Выявлен полиморфизм по типам 0 и Н гена Н-РАВР у пород свиней: крупная белая, уржумская и белая короткоухая. Доли предпочтительных генотипов М и НН варьировали в зависимости от породы и составляли у свиней крупной белой породы от 71,9 до 100%, уржумской - 92,4% и белой короткоухой -89,8%.

4. Содержание внутримышечного жира у свиней с генотипом Ос1НН в среднем составляло 7,48±0,53%, в то время как у животных с генотипами ООНН и сЮНН -соответственно, 6,75+0,42 и 6,44+0,50%.

5. Установлено снижение жирности туш у свиней, несущих аллель <1 гена Н-РАВР {<¡<1 и Ос! < ОО/, Снижение толщины шпика, веса и процентного содержания внутреннего жира у помесных свиней с генотипом Ос1 составляло, соответственно, 4,5 мм, 0,3 кг и 0,8%, а у животных с генотипом сИ -соответственно, 3,3 мм, 0,2 кг и 0,5% по сравнению с генотипом ОО. Толщина шпика у свиноматок уржумской породы с генотипом Ос) уменьшилась нх 1,0 мм, а с генотипом (М - 0,3 мм. Толщина шпика у свиноматок крупной белой породы с генотипом СШН по сравнению с генотипом ООНН снизилась 5 мм.

6. Выявлено уменьшение доли сапа и увеличение доли мяса в тушах помесных свиней, несущих аллель с) гена Н-РАВР, по сравнению с генотипом 00. У свиней с генотипом Ос! доля сала уменьшилась на 8,9 %, а доля мяса увеличилась на 7,0%, в то время как у животных с генотипом с)с! уменьшение доли сала составило 11,5%, а увеличение доли мяса -10,9%,

7. Установлено превосходство по многоплодию у свиноматок с генотипом по сравнению с генотипами 00 и Ой. Многоплодие свиноматок уржумской породы с генотипом <М в среднем по трем опоросам было выше, соответственно, на 1,4 и 1,5 поросенка на опорос (р<0,01), а у свиноматок крупной белой породы -соответственно, на 0,7 и 0,3 поросенка на опорос (р<0,0$).

8. Выявлена повышенная молочность свиноматок крупной белой породы, несущих аллель с!, по сравнению со свиньями, имеющими генотип 00. Свиноматки ГПЗ «Соколовка» с генотипами сМ имели более высокую молочность на 7,9 кг, а животные с генотипом Ос) - на 5,1 кг. Молочность свиноматок с генотипом Ос) ГПЗ «Никоновское» превышала данный показатель у свиней с генотипом 00 на 5,6 кг.

9. Установлено, что свиноматки с генотипом с)с! превосходили по показателю веса гнезда в 60 дней свиноматок, имеющих генотипы 0(1 и 00. Свиноматки уржумской породы с генотипом сМ имели более высокий вес гнезда по сравнению с животными с генотипами 0(1 и Ой, соответственно, на 31,4 и 15,6 кг, а животные крупной белой породы - соответственно, на 6,9 и 8,3 кг.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Лабораториям, занимающимся мопекулярно-генетическими исследованиями свиней, рекомендуем использовать созданный нами банк ДНК свиней трех пород.

Для проведения диагностики полиморфизма гена Н-РАВР свиней рекомендуем использовать предложенные нами тест-системы.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Гладырь ЕА, Арсиенко Р.Ю., Мичурин В.П., Зыкунов Н.В., Фролкин Д.А., Карамчакова О.Н., Коновалова E.H., Зиновьева H.A. Использование маркерных генов в свиноводстве // Сборник материалов международной научной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», - Дубровицы. - 2001. - С. 64-67.

2. Зиновьева НА., Гладырь Е.А., Фролкин Д.А., Арсиенко Р.Ю., Зыкунов Н.П., Шмаков Ю.И., Костюнина О.В., Карамчакова О.В., Эрнст Л.К. Применение ДНК-диатостики для анализа генов-кандидатов локусов количественных признаков сельскохозяйственных животных II Сборник научных трудов ВИЖ «Животноводство - XXI век», Дубровицы, - 2001. - Вып. 61. -С. 225-228.

3. Арсиенко Р.Ю., Гладырь Е.А, Исследование полиморфизма гена H-FABP во взаимосвязи с хозяйственно-полезными признаками свиней Н Сборник материалов международной научной конференции "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных*. - Дубровицы. - 2002. - С. 94-96.

Издательство РУД ЭЕТЯС 142132, Москивскам обл, ГТолольский р-н, п. Дубровины Тел. (8-27) 65-14-24, (8-27) 65-14-07

Сдако в набор 25.05,03. Подписано в печать 25.05.03 Заказ № 14, Уч.-щц, я. 1Д Тираж 100 экз.