Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах

Павлова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах"

На правах рукописи

ПАВЛОВА Татьяна Владимировна

ПОИСК И ХАРАКТЕРИСТИКА ОНКО-АССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВ НА ХРОМОСОМЕ 3 ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ НА ¡ЧОТ1-МИКРОЧИПАХ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о 2::?

Москва 2009

003483204

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, в сотрудничестве с Департаментом МТС Каролинского института (Стокгольм, Швеция).

Научные руководители:

кандидат биологических наук О.В. Муравенко

кандидат биологических наук Е.Р. Забаровский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков кандидат биологических наук Т.В. Наседкина

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится « У» ё-Мс*-^ 2009 г. в ^¿¿^ч. на заседании Диссертационного совета по защите докторских диссертаций Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта по адресу: 119911, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета, Кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Разработка и совершенствование методик диагностики и терапии раковых заболеваний является актуальной задачей современной науки и медицины. Метилирование генов-супрессоров опухолевого роста (tumor supressor gene, TSG) является одним из ранних событий канцерогенеза, которое может быть диагностировано значительно раньше других изменений в организме. В связи с этим поиск новых TSG как опухолевых маркеров представляет большой интерес.

Показано, что короткое плечо хромосомы 3 (Зр) человека содержит факторы, обладающие способностью подавлять опухолевый рост и подвержено частым аберрациям при многих видах рака; поэтому высказано мнение, что Зр -вероятный участок локализации целого ряда генов-супрессоров опухоли (Killary et al., 1992; Kok et al., 1997; Zabarovsky et al., 2002; Braga et al., 2002; Massion and Carbone, 2003; Angeloni et al., 2007), однако, в настоящее время в этом большом (100 млн.п.н.) районе удалось выделить и охарактеризовать всего несколько TSG. Широко охарактеризованы только некоторые из них: ген VHL (Зр25), подавляющий активность РНК-полимеразы II на стадии элонгации, ген системы репарации MLH1 (Зр22) и ген RASSF1A (Зр21), вовлеченный в регуляцию клеточного цикла. Не вызывает сомнений необходимость более детального анализа этого участка генома для выявления новых TSG.

Одновременное использование комбинаций нескольких маркеров повышает эффективность диагностики опухолей. В этой связи важной задачей является разработка методик мультиплексного скрининга маркеров канцерогенеза и все большее значение приобретает технология микрочипов, которая позволяет одновременно анализировать десятки тысяч генов. (Gray and Collins, 2000; Trevino et al., 2007). Бурно развивающаяся технология микрочипов позволяет изучать дифференциальную экспрессию генов и является эффективным методом в поиске новых генов, вовлеченных в различные заболевания. (Su et al., 2001 ; Macgregor et al., 2003).

Создание новых ДНК-микрочипов имеет принципиальное значение для получения информации, не доступной на уровне мРНК (кДНК): гетерозиготные делеции, метилирование ДНК, ацетилирование гистонов. Метилирование и другие эпигенетические факторы, как известно, являются одними из ключевых механизмов регуляции экспрессии генов и играют важную роль в канцерогенезе. Эпигенетические изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза раковых заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является поиск и характеристика новых генов-супрессоров опухолевого роста на хромосоме 3 человека с помощью технологии гибридизации на МоУ-микрочипах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Модифицирование методики сравнительной геномной гибридизации на МоИ-микрочипах для скринирования хромосомы 3 человека.

2. Анализ геномных и эпигеномных изменений хромосомы 3 человека в образцах опухолей с использованием разработанных ЫоИ-микрочипов и поиск новых кандидатов в ТБв.

3. Исследование изменений геномных локусов, выявленных гибридизацией на МоЙ-микрочипах, с помощью независимых методов: метил-специфичной ПЦР (МСП) и бисульфитного секвенирования.

4. Проверка взаимосвязи метилирования генов - кандидатов в ТЭО с их экспрессией в образцах эпителиальных опухолей.

5. Сравнение данных по метилированию и опухоль-подавляющей способности Т8С ЯЛ^ПЛ и ТБО-кандидата в клеточных линиях и образцах опухолей различной локализации.

6. Оценка способности ТЗО-кандидата ЯА88Р2 к подавлению опухолевого роста в культуре клеток и у иммунодефицитных мышей.

7. Определение частоты возникновения мутаций в ТБО ИАББРЫ и НВЗРЗ хромосомы Зр человека в раковых клеточных линиях и образцах эпителиальных опухолей.

Научная новизна работы

В работе модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на МоЦ-микрочипах, созданных с использованием ШП-связующих клонов (7аЬагоуэку е1 а1, 1990; 1л е1 а1., 2002, международный патент '№002/086163). Нами использованы ИоН-микрочипы для скрининга хромосомы 3 человека, позволяющие одновременно анализировать 181 КоИ-ассоциированный сайт хромосомы 3. Внесен ряд изменений в процесс подготовки проб ДНК-зондов для гибридизации на №>А-микрочипах:

-использование рестрикгазы 8аиЗА1 в комбинации с Т^оИ, дающее возможность получать короткие фрагменты геномной ДНК, эффективно гибридизующиеся на микрочипах;

-использование биотинилированного Notl-линкера и сгрептавидиновых магнитных шариков, позволяющее избавляться от метилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые существенно занижают силу сигнала при гибридизации.

Отработаны условия машинной гибридизации ДНК-проб raNotI-микрочипах.

Модифицирована математическая обработка результатов гибридизации на микрочипах.

С помощью модифицированной технологии сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах проанализированы геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в 250 образцах эпителиальных опухолей и лейкемии. Показано, что причиной инактивации TSG, локализованных в хромосоме 3, могут быть не только мутации и делеции, но и метилирование их промоторных областей. На основании результатов гибридизации на Notl-микрочипах и бисульфитного секвенирования метилирование Notl -локусов в генах NKiRASl, RARbetal, ITGA9, M1NT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B выявлено более чем в 30% образцов опухолей различной локализации. Метилирование генов BHLHB2,1TGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе показано впервые.

Обнаружена взаимосвязь между снижением экспрессии гена RASSF2 и метилированием его промоторной области в клетках рака молочной железы, образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и рака молочной железы. Экспериментально установлено, что обработка с 5-aza-2dC способна восстановить экспрессию RASSF2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В данной работе впервые показана способность гена RASSF2A подавлять рост клеток рака молочной железы in vitro и в иммунодефицитных мышах. Обнаружено, что в образцах опухоли почки и НМРЛ, где метилированы промоторные области генов HYAL2, RBSP3, RASSF1A, ITGA9, снижен уровень мРНК этих генов.

Впервые выявлена повышенная частота мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста RASSF1A и RBSP3 и показано, что мутации могут снижать опухоль-подавляющую способность этих генов.

Практическая значимость работы

Практическая ценность работы заключается в модификации методики гибридизации на Notl-микрочипах, позволяющей одновременно определять наличие геномных и эпигеномных изменений в геноме опухолевых клеток. Модифицированная методика позволяет достаточно быстро выявлять новые онко-ассоциированные гены. Идентифицированные в данной работе новые 9 генов-кандидатов в TSG на хромосоме 3 человека могут быть использованы в качестве

маркеров для ранней диагностики и мониторинга эффективности лечения онкозаболеваний, а также представляют потенциальный интерес для генной терапии.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на International Conference "Genetics in Russia and in the World", Moscow, July 2006; 11th Annual Human Genome Meeting, Helsinki, 2006; IACR Workshop (The International Agency for Research on Cancer, IARC), Lion, France, June, 2006; 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th Internationa] Symposium on Molecular Medicine October 12-14, 2006, Hersonissos, Crete, Greece; 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007; The 12th World Congress on Advances in oncology and 10th International Symposium on Molecular Medicine, 11-13 October, 2007, Hersonissos, Crete, Greece; The EMBO/FEBS workshop «Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer» on the Island of Spetses, Greece August 15-24, 2007.

По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи в международных и отечественных рецензируемых журналах и 7 сообщений в виде тезисов научных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список

цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста

и содержит_иллюстраций (рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография

включает_наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Образцы ДНК, выделенной из биопсий нормальной ткани и рака почки, легкого, яичника, простаты, шейки матки, кишечника, молочной железы предоставлены Лабораторией структурно-функциональной геномики Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва (В.Н. Сенченко и сотр.), Институтом Молекулярной биологии и генетики НАНУ, г. Киев (А.В. Рындич и сотр.), Государственным научно-исследовательским институтом генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва (Э.А. Брага и сотр.). Образцы лейкемии получены из Института биомедицинских исследований, г. Бермингем (Ф. Латиф и сотр.).

Методы. Сравнительную геномную гибридизацию проводили на сконструированных Notl-микрочипах, на которых был иммобилизован 181 Notl-связующий клон (размером до 15 т.п.н.) из Notl-библиотеки хромосомы 3 человека (Zabarovsky et al., 1990, Kashuba et al., 1999, Li et al., 2002). В качестве отрицательного контроля при гибридизации использована ДНК Е. coli. Плазмидную ДНК, содержащую Notl-связующие клоны из хромосомы 3 человека, наносили на поверхность силиконизированных стекол в концентрации 0.25 мкг/мкл с помощью печатающего устройства QarrayMini («Genetix», Англия).

Подготовку проб для гибридизации на микрочипах проводили согласно модифицированной методике. Гибридизация 250 образцов проведена на приборе Lucidea Base («Amersham Pharmacia Biotech», США). Микрочипы сканировали на приборе GenePix 4000В и затем полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения GenePix Pro (версия 5.0) фирмы «Amersham Pharmacia Biotech», США.

Бисульфитное секвенирование и метил-специфичную ПЦР проводили согласно стандартным методикам.

ДНК была секвенирована на приборах Applied Biosystems 373 или 377 (Strech), с использованием кита Tag Didroxy Terminator Cycle (Applied Byosystmes, Фостер Сити, Калифорния) с праймерами к вектору или к специфической последовательности клонов.

Трансфекцию раковых клеток трансгенами проводили с использованием реагента LipofectAMINE PLUS Reagent (Life Technologies, Rockville, MD) согласно протоколу производителя. Селекцию позитивных клонов, тесты на эффективность формирования колоний клетками раковых опухолей и выращивание опухолей у иммунодефицитных мышей проводили, как описано ранее у Protopopov et al., 2002 и Kashuba et al., 2004.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модификация методики гибридизации на Notl-микрочипах

Подготовка Notl-обогащенных проб ДНК-зондов

В данной работе модифицирована методика сравнительной геномной гибридизации HaNotI-микрочипэх для получения более эффективной гибридизации и интенсивного флуоресцентного сигнала.Использование рестрикгазы Notl легло в основу создания Notl-микрочипов, на которых одновременно можно выявлять геномные (делеции и амплификации) и эпигеномные (метилирование) изменения ДНК (Li et а]., 2002). Notl-cairr (GCGGCCGC) содержит два CpG динуклеотида, в которых может быть метилирован цитозин. Ресгрикгаза Notl - фермент, чувствительный к метилированию. Notl не распознает и не расщепляет сайт, в котором метилирован цитозин хотя бы в одном из двух CpG-динуклеотидов. CpG-островки связаны с промогорными областями многих генов и часто метилированы в различных типах опухолей человека, например, гены RB, р!б, VHL, RASSF1A (Zöchbauer-Mülleretal.,2001).

В данной работе внесен ряд модификаций в процесс подготовки Notl-обогащенных проб ДНК-зондов для гибридизации на Notl-микрочипах:

-для получения коротких фрагментов геномной ДНК размером от 100 до 500 п.н., эффективно гибридизующихся на микрочипах; впервые использована комбинацию рестриктаз Notl и Sau3AI;

-для избавления от метилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые могут существенно занижать интенсивность сигнала при гибридизации, впервые использованы биотинилированный Notl-линкер и стрептавидиновые магнитные шарики.

В результате гибридизационная проба, в основном, обогащена короткими ДНК-последовательностями, гомологичными Notl-связующим клонам. При этом в пробе остается только 0.1-0.5% ДНК полного генома и не более 10% повторов.

В данной работе подготовку проб ДНК для гибридизации на микрочипах проводили по уникальной модифицированной методике. Одинаковые количества ДНК опухолевой и нормальной ткани параллельно расщепляли рестриктазой Notl. После этого ДНК лигировали с биотинилированным Notl-линкером. Далее ДНК обрабатывали рестриктазой Sau3AI и иммобилизовали на стрептавидиновых магнитных шариках. Не связавшуюся ДНК отмывали, а ДНК, иммобилизованную на магнитных шариках, лигировали с БаиЗА-специфичным линкером. После лигирования полученные фрагменты ДНК амплифицировали с помощью ПЦР. Далее проводили повторную ПЦР для мечения ДНК флуорохромами: ДНК

опухолевых клеток - dCTP-Cy5 (цитозин с сигналом флуоресцентной эмиссии 670), а ДНК нормальных клеток - dCTP-Cy3 (цитозин с сигналом флуоресцентной эмиссии 570 нм) («Amersham»). Равные количества флуоресцентно меченных Notl-обогащенных ДНК-зондов опухолевых и нормальных клеток использовали для сравнительной гибридизации на микрочипах. Схема последовательной подготовки ДНК-зондов представлена на рис.1. Также отработаны условия гибридизации на Notl-микрочипах на приборе Lucidea Base («Amersham Pharmacia Biotech», США).

________________ДНК

Расщепление с NotI

Лигирование с биотинилированным Notl-линкером

.^аААЛ

Расщепление с Sau3AI 2

Связывание ДНК со стрептавидиновыми магнитными шариками

Лигирование с Sau3A-линкером, ПЦР, ре-ПЦР с Су5/СуЗ

Су5 Су5 Су5 J_I_L_

-1-1-

Cy5 Cy5

Гибридизация и сканирование

—I—I—

СуЗ СуЗ

О Гомозит. дел./мет. О Гемизиг. дел./мет О Без изменений О Ам пл ификация/де

'вОООу ' О ООО/

Су5/СуЗ

-Str-

СуЗ СуЗ СуЗ J_I_L_

Рис. 1. Схематичное представление технологии обработки проб ДНК для гибридизации на №>й-микрочипах.

Примечания: N - NotI сайт; В - биотин; S - Sau3AI, Str - стрептавидин, Су5 - dCTP-Cy5, Cy3-dCTP-Cy3 (флуоресцентные красители)

Модификация обработки результатов гибридизации на микрочипах

В результате обработки данных гибридизации получали схематические изображения микрочипов, несущие в каждой точке красный (Су5) и зеленый цвета (Су3). Соотношение, отражающее интенсивность гибридизации зондов, меченных соответствующими флуорохромами, отражает различие в содержании ДНК в образцах опухолевых клеток относительно нормы. Коэффициенты отношений сигналов опухоль/норма были сгруппированы в следующие интервалы согласно учитываемому содержанию примеси нормальных клеток в образцах опухоли: до 0.35 - гомозиготная делеция/метилирование в образце опухоли, от 0.35 до 0.85 -гемизиготная делеция/метилирование, от 0.85 до 1.5 — отсутствие изменений, свыше 1.5 - амплификация/деметилирование (Рис. 2).

Соотношение сигналов Су'/Су3 проверено в контрольном эксперименте для МоО-ассоцииро ванных локусов генов с известным числом копий ДНК.

Геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в опухолях, выявленные гибридизацией на Notl-микрочипах

С помощью метода сравнительной гибридизации на Notl-микрочипах для скрининга хромосомы 3 проанализировано 250 образцов опухоли относительно нормы: 40 образцов рака легкого, 43 образца рака шейки матки, 39 - рака почки, 47 - рака молочной железы, 20 - рака яичника, 8 - рака простаты, 24 - рака кишечника и 20 образцов лейкемии.

Метилирование/делеции локусов генов NKiRASl, RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B, связанных с сайтами Notl, выявлены в 30-60% образцов опухолей различной локализации (таблица 1).

По данным литературы, некоторые гены, для которых в ходе исследования показано изменение в опухолевых образцах, связан с различными видами карцином. Геномный локус M1NT24 ассоциирован с раком толстого кишечника (Toyota et al., 1999).

Ген BHLHB2 (альтернативные названия: DEC1; STRA13; Stral4; SHARP-2) вовлечен в механизмы контроля клеточной дифференцировки. Изменения этого гена обнаружены при раке поджелудочной железы (Yoon et al., 2001).

Гиперметилирование гена RARBetal, кодирующего рецептор ретиноидной кислоты, отмечено для рака шейки матки (Feng et al., 2005), рака пищевода, рака печени (Kuroki et al., 2003).

Ген RBSP3 (альтернативные названия: CTDSPL; PSR1; SCP3; HYA22; C3orß) является геном-супрессором рака почки и легкого (Kashuba et al., 2004). Белковый продукт гена принадлежит семейству малых CTD (C-Terminal Domain) сериновых фосфатаз, катализирующих дефосфорилирование сериновых остатков С-концевого домена большой субъединицы РНК полимеразы II и других белков.

Ген-супрессор опухолевого роста VHL подавляет активность РНК-полимеразы II в процессе элонгации. Наследование инактивированного аллеля гена VHL вызывает предрасположенность к развитию синдрома фон Хиппеля-Линдау и раку почек. Инактивация гена VHL характерна и для ряда форм ненаследственных опухолей (Kuroki et al., 2003).

Для гена LRRC3B недавно было показано гиперметилирование промотора гена, вызывающее снижение экспрессии, при раке желудка и раке кишечника (Kim et al., 2008, Tian et al., 2008). Нами была обнаружена высокая частота и степень метилирования этого гена и для других типов эпителиальных опухолей (таблица 1).

По данным SAGE, отмечено снижение экспрессии гена ITGA9 в опухолях легкого. Ген ITGA9 принадлежит к семейству интсгринов - поверхностных гликопротеинов клетки, обеспечивающих адгезию между клетками, а также клетками и внеклеточным матриксом.

Таблица 1. Частота изменений (делеций/метилирования) геномных локусов, связанных с сайтами Notl хромосомы 3 человека в образцах опухолей.

Геномные Notl- гсокусы Рак почки Рак легкого Рак шейки матки Рак молочной железы Рак яичника Рак кишечника Рак простаты

NKIRAS1 53% (20/38) 55,3% (21/38) 51% (21/42) 54% (25/46) 40% (8/20) 36% (4/11) 29% (2/7)

RARBetal 40% (12/30) 61,1% (22/36) 56% (14/25) 54% (22/41) 53% (10/19) 40% (4/10) 80% (4/5)

MINT24 47% (17/36) 52,5% (21/40) 45% (19/42) 40% (18/45) 21% (4/19) 33% (4/12) 29% (2/7)

VHL 38% (14/37) 43,2% (16/37) 43% (17/40) 31% (14/45) 15% (3/20) 50% (5/10) 14% (1/7)

LRRC3B 55% (17/31) 51,4% (18/35) 78% (18/23) 67% (18/27) 55% (11/20) 44% (4/9) 25% (2/8)

ITGA9 30% (10/33) 57,9% (22/38) 51% (20/39) 48% (19/40) 40% (8/20) 55% (5/11) 50% (4/8)

BHLBH2 31% (9/29) 25% (10/40) 47% (15/32) 31% (13/42) 10% (2/20) 10% (1/Ю) 38% (3/8)

UBE2E2 30% (9/30) 40% (16/40) 35% (11/31) 28% (12/43) 37% (7/19) 27% (З/П) 0 (0/4)

ZIC4 39% (12/31) 38,9% (14/36) 63% (15/25) 36% (13/36) 37% (7/19) 40% (4/10) 17% (1/6)

GATA2 23% (6/26) 56,3% (18/32) 29% (6/21) 64% (18/28) 35% (7/20) 36% (4/11) 50% (2/4)

RBSP3 43% (12/28) 60,5% (23/40) 44% (11/25) 30% (8/27) 35% (7/20) 36% (4/11) 100% (7/7)

Примечание: приведен процент образцов с изменениями в данном геномном локусе и количество измененных образцов из общего количества проанализированных.

Рис. 2. Фрагмент сводной таблицы данных, полученных в результате сравнительной геномной гибридизации ДНК образцов рака молочной железы (25 пар опухоль/норма) на>1о11-микрочипах.

Примечания: зеленый квадрат - гомозиготная делеция или метилирование; зеленый квадрат со штриховкой - гетерозиготная делеция или метилирование; желтый - нет изменений; красный - амплификация или деметилирование; белый квадрат - нет информации.

Анализ изменений геномных 1>Ы1-локусов, показанных при гибридизации на [Ч'оИ-микрочнпах, с помощью независимых методов

Снижение количества тех или иных геномных фрагментов в пробах ДНК опухолевых образцов относительно нормы, обнаруженное при гибридизацией на микрочипах, может быть обусловлено как делецией этих фрагментов, так и их метилированием.

А 1 2

СССТССССТСССАССССАСАССбТССССССАСАСССССТАСАСТТСТСТСС

3 4 5

ТССвССССССАССТАбАСТСвСС

6 7 8 9

ТТСАСТСТСТСААТССААААСТААСТТСССТССТСТ6ССТСС66(?ССССС^ 10 11 ССССТбССССАСССАбССТССТС

12 13 14

ААССТСССАбССССТССАССАСТССССССАСТбСАССТССАССССТССССб сттттсссс^сссстсдссддссдстдтдссстстс

СрО Т1 Т2 тз Т4 Т5 N1 N2 N3 N4 N5

1 + + + - - - - - -

2 + + + - - - - - -

3 + + + - - - - -

4 - + - - - - - - -

5 + + + - - - -

б + + + - - - - -

7 + - + - - - - -

« + + + - - - - -

9 + + - - - - -

10 + + - - - - - -

11 + + - - - - - -

12 + - + - - - - -

13 + + + - - - - - -

14 + + + - - - - - -

Рис. 3. Метилирование промоторной области гена 1ША9 в образце рака

шейки матки, выявленное с помощью бисульфитного секвенирования.

А - Последовательность №И-ассоциированной области промотора гена. Жирным шрифтом обозначены СрО-динуклеотиды, курсивом выделен и подчеркнут №Я-сайт. Срв динуклеотиды пронумерованы по порядку. Б - Таблица метилирования СрО-динуклеотидов. В первой колонке указаны их порядковые номера в локусе. Ы1-К5, Т1-Т5 - номера клонов, несущих клонированный фрагмент геномной ДНК из образцов нормы и опухоли, соответственно. «+»- метилирование,«-»- нет метилирования.

Примечание: Отношение сигналов опухоль/норма по результатам Т^оН-гибридизации равно 0.19.

Рис. 4. Проверка метилирования гена ТНШ в образцах опухоли почки методом метил-специфичной ПЦР.

А - ПЦР с олигонуклеотидами к неметилированной нуклеотидной последовательности гена. Б - ПЦР с олигонуклеотидами к метилированной нуклеотидной последовательности гена.

Примечания: Отношения интенсивности сигналов гибридизации ДНК опухоль/норма на ЫоИ-микрочипах: 0.56 (для № 1); 1.30 (для № 2)

Над электрофореграммами указаны отношения интенсивности сигналов ПЦР-продуктов опухоль/норма.

Соотношения интенсивности сигналов, отображающих количество ПЦР продукта, показывало отношение неметилированных (рис. 4А) и метилированных (рис. 4Б) СрО-динуклеотидов в опухоли по сравнению с нормой. Как видно из рисунка, ген ТНЯВ в первом образце опухоли метилирован (а не делегирован), а во втором - не метилирован, что подтверждает результаты, полученные в ходе сравнительной гибридизации на ЫоИ-микрочипах.

В сотрудничестве с группой В.Н. Сенченко (Лаборатория структурно-функциональной геномики, ИМБ) было показано, что метилирование промоторов генов НУАП, 1ТОА9, ЯВБРЗ, ЫРШ2, связано со снижением уровня

экспрессии этих генов в образцах опухоли рака почки и легкого от двух до ста раз.

Таким образом, в геномных Notl-локусах, в которых были обнаружены изменения в результате гибридизации на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов было подтверждено метилирование. Для некоторых генов в ряде образцов метилирование подтверждено не было. Вероятно, такие гены делегированы по двум или одному из аллелей в соответствующих образцах.

Метилирования промоторов генов RASSF1A и RASSF2 в опухолях и раковых клеточных линиях

Гены RASSF1A и RASSF2 принадлежат к одному семейству генов RASSF. Ген-супресор опухолевого роста RASSF1 локализован в Зр21, ген-кандидат в TSG RASSF2 — в 20р13. Так же, как и RASSFIA, RASSF2 часто эпигенетически

инактивирован в опухолях посредством метилирования (Hesson et al., 2005).

RASSF2 может опосредовать остановку прохождения клеточного цикла и апоптоз (Vos et al., 2003). Ранее продемонстрировано, что TSG RASSF2 часто метилирован в колоректальных опухолях и аденомах (Hesson et al., 2005). Также показано, что метилирование промотора RASSF2 соответствует потере экспрессии в первичных опухолях и в раковых клеточных линиях.

В данной работе нами совместно с профессором Ф. Латиф (Институт Биомедицинских исследований, Бермингем, Англия) проведен ряд экспериментов по исследованию гена RASSF2. Был определен статус метилирования промотора гена с использованием комбинированного бисульфитного рестрикционного анализа и прямого бисульфитного секвенирования. Показано, что промотор гена RASSF2 метилирован в 13 из 20 (65%) клеточных линий рака молочной железы. В образцах опухоли молочной железы промотор гена RASSF2 метилирован в 38%, (15/40) (Рис. 5А), а промотор гена RASSFJ - в 56% (18/32) случаев.

Обнаружено метилирование промотора гена RASSF2 и в образцах НМРЛ (44%, 22/50) (Рис. 5Б). Статус метилирования промотора гена RASSFIA в этой серии образцов опухолей определен ранее (Agathanggelou et al., 2001). Статусы метилирования генов RASSF2 и RASSF1 сравнены нами в данной работе.

В образцах опухоли яичника не выявлено метилирования промотора RASSF2 (0/17) (рис. 5В). Метилирование промотора гена RASSFIA показано для 10 из 17 этих образцов (59%) опухоли яичника.

Корреляции между метилированием промоторов генов RASSFIA и RASSF2 не наблюдали, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью тотально метилированного генома (Cooper et al., 2007).

А 43Т 320Т 439Т 1116Т 379Т 207Т 125Т KQHI

мнмнмнмн мнмнмнмн

160 ГШ.

160 пл. Б

207Н 320Н 498Н 284Н 379Н 441Н 1116Н MCF7 копт МНМНМНМН мнмнмнмнмн

64 57 80 51 137 77 10 14 2 79 MHMH МН MH MHMHMH MHMHMH

160 пл.

83 59 60 63 65 67 82 76 69 70 МНМН МН МН MHMHMH MHMHMH

160 пл.

53Н 53Т 83Н 83Т 1Н 1Т 75Н 75Т 55Н 55Т МНМН МН МН МНМНМНМНМНМН

160 ПЛ.

1122 41 42 44 46 59 1171 OVCA кош МНМНМНМН МНМНМНМНМН

160 ПЛ.

Рис. 5. Статус метилирования CpG-островка промотора гена RASSF2 в первичных опухолях (№№Т) и соответствующих образцах нормальной ткани (№№Н), определенный МСП.

А - анализ метилирования промотора гена RASSF2 в образцах опухолей молочной железы. Клеточная линия MCF7 - позитивный контроль для М ПЦР, вода - негативный контроль; Б - анализ метилирования в образцах НМРЛ;

В - опухоль-специфичное метилирование CpG-островка промотора RASSF2 в НМРЛ; Г - анализ метилирования в образцах опухолей яичника. В качестве позитивного контроля для М и для Н OVCA28 - клеточная линия рака яичника с частичным метилированием RASSF2.

Примечания: М - ПЦР с праймерами к метилированной последовательности; Н - ПЦР с праймерами к неметилированной последовательности.

Экспериментально установлено, что обработка с 5-aza-2dC способна восстановить экспрессию RASSF2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В образцах нормальной ткани легкого и молочной железы не показано метилирование, так же, как ранее установлено для кишечника (Hesson et al., 2005; Park et al., 2007) и для эпителия носоглотки (Zhang et al., 2007). Можно предположить, что метилирование промотора

- процесс, не протекающий в нормальной ткани, и является потенциальным биологическим маркером опухолеобразования.

Подавление роста клеток рака молочной железы геном RASSF2 in vitro и in vivo

Ранее показана способность гена RASSF2 подавлять опухоль in vitro в тестах на миграцию клеток рака кишечника и мелкоклеточного рака легкого (MPJ1), прогрессию клеточного цикла и формирование колоний (Vos et al.; 2003, Akino et al. 2005; Zhang et al., 2007).

Нами продолжены исследования этого кандидата в TSG. Показано, что ген RASSF2 может функционировать как TSG in vitro, ингибируя рост клеток рака молочной железы в тесте на формирование колоний (Рис. 6А) и в тесте на рост в мягком агаре (Рис. 6В). Он также может подавлять формирование опухоли in vivo, когда клетки, экспрессирующие RASSF2, подкожно инокулированы иммунодефицитным мышам (Рис. 6Г).

д --В U0]- 140i-

100 ---ш 120 -1--<в 120 -j-

'I ад __я 100 ---гс 100 --

|;§ ао ■ :м_И--" 80 Ш -

165 .. Ш " 'I « —■-¡--!»-■-

S J ï 40 —-5 40 ■-g 40--H-

—■ Ш- § *> и и

5в| о'—^—'—я™— # ol—-— # oJ——.——

i вектор RASSF2A вектор клон 3 .

? к вектор клон 4

áb

♦RASSF2A

® 20 1 10

L^Bemopl

_а_Векгор2 -é—RASSF2A кл. 3

_—RASSF2A кп. 4 Л

--— л- 1

-ф.—w——

7 10 14 17 22 25 28 31 35 ДНИ

Рис. 6. Подавление роста клеток молочной железы in vitro и развития опухоли in vivo в результате введения гена RASSF2.

А - тест на формирование колоний, Б - проверка экспрессии трансгенов с помощью Nothem-гибридизации, В - тест на формирование колоний в агаре, Г - рост опухоли в иммунодефицитных мышах.

Это первая работа, выявившая способность гена RASSF2 подавлять развитие опухоли у экспериментальных животных.

Все полученные нами и описанные ранее факты предполагают, что метилирование RASSF2 - раннее, частое и специфичное для опухоли событие для ряда эпителиальных опухолей (включая НМРЛ, молочную железу, кишечник). RASSF2, как и RASSF1A, можно рассматривать как потенциальный маркер для ранней диагностики раковых заболеваний и для разработки новых терапевтических методов, учитывая показанную сильную опухоль-подавляющую способность.

Анализ частоты мутаций в генах RASSF1 и RBSP3 в образцах опухолей и раковых клеточных линиях

Одним из признаков TSG является наличие в нем мутаций в биопсиях опухолей. Мутации способны снижать или полностью инактивировать супрессорную функцию гена. Нами проведен анализ частоты мутаций, возникающий в генах-супрсссорах опухолевого роста хромосомы 3 RASSF1 и RBSP3.

Частота мутаций в гене RASSF1

Белок RASSF1A играет важную роль в передаче сигнала от поверхности клетки в ядро (Lerman and Minna, 2000; Zabarovsky et al., 2002; Hesson et al., 2007) и участвует в регуляции клеточного цикла. В 144 секвенированных клонах гена RASSF1, полученных из единичных клеток лимфомы Беркитта BL2 и клеток почечной карциномы KRC/Y, было обнаружено 139 мутаций. Средняя частота мутаций составила 0.25/100 п.н. (табл. 4).

На примере клеточной линии KRC/Y нами показано, что у гена RASSF1A, содержащего две мутации (Cys65Arg и Val211Ala), существенно снижена способность подавлять рост опухолевых клеток в культуре (Рис. 8А).

Частота мутаций в гене RBSP3

Ген - супрессор RBSP3 (альтернативное название CTDSPL) из региона Зр21

имеет две изоформы, A (NM_001008392, 4455 п.н.) и В (NM_005808, 4422 п.н.).

Белковый продукт гена принадлежит семейству малых CTD (С-Terminal Domain)

сериновых фосфатаз, катализирующих дефосфорилирование сериновых остатков С-

концевого домена большой субъединицы РНК полимеразы II и других белков (Yeo.,

et al., 2003; Kashuba et al. 2004; Zabarovsky et al., 2005). Согласно данным SAGE, не

выявлено изменения экспрессии гена ЯВ5РЗ в нормальных тканях, в то время как в различных эпителиальных опухолях отмечено ее снижение или даже отсутствие.

Для ЯВЗРЗ было проанализировано в общей сложности 85 клонов, полученных из клеток почечной карциномы КМУУ и мелкоклеточного рака легкого (МРЛ) АСС-ЬС5, а также из образцов почечноклеточного рака, в которых найдено 89 мутаций (78 из которых - разные). Среди них было обнаружено 5 нонсенс-мутаций и 7 нуклеотидных замен в некодирущем регионе. Среди остальных 77 мутаций было 68 миссенс-мутаций и 9 синонимных. Средняя частота мутаций составила 0.10/100 п.н. (табл. 4).

Для изучения влияния мутаций в гене ЯВБРЗ на его способность -подавлять образование опухоли, клеточную линия КЯС/У трансфицировали мутировавшими вариантами гена, изолированными из раковых клеточных линий и биопсий опухоли. Обнаружено существенное снижение супрессорной активности на формирование опухоли у иммуннодефицитных мышей для вариантов гена, содержащих по три мутации (Рис. 8Б).

Таблица 4. Частота мутаций генов ЯА85Г1 и ЯВБРЗ, обнаруженная в образцах опухолей и раковых клеточных линиях.

Ген, п.о. Кол-во секвениро-ванных клонов Общая длина, тыс. п.о. Количество мутаций Частота мутаций на 100 п.о.

МББРМ, Экз. 1-2,391 п.о. 144 56.3 139 0.25

МБРЗ, Экз. 1-8,1003 п.о. 85 85.3 89 0.10

Расчетная допустимая частота мутаций, возникающих вследствии ошибок используемой АссиРп'ше™Я/с ДНК-полимеразы, которая делает максимально одну ошибку на 3x106 п.о., на два порядка ниже экспериментально полученных значений. Следовательно, наблюдаемые мутации нельзя объяснить ошибкой полимеразы.

Накопление мутаций в гене ЯАБЗРМ в клонах клеток

Доказательством того, что мутации возникают в единичной клетке, а не в пробирке, могло бы служить то, что при росте клона из одной клетки определённая фракция плазмидных клонов должна нести одну и ту же (первичную) мутацию. На

примере гена ЛА^РМ построена схема накопления мутаций в клонах клеток, выросших из одной клетки

Клеточный клон № 9

11е139Аэп

Основная мутация 1

НеЫЬАяп

Основная мутация 2

УаП66А1а с

штш .

Плазмидные клоны с экзонами 3-5

ЫиПШу РгоШРго

Рис. 7. Схема, показывающая накопление мутаций в гене (экзоны 3-5)

в клоне клеток почечноклеточной карциномы.

Примечания: Мутация Рго122Рго вызвана изменением одного нуклеотида в триплете АТС—»ААС. Мутация СГС—>СГЛ также не приводит к изменению аминокислоты (Уа1174Уа1).

. В ряде клонов обнаружена общая (первичная) мутация и индивидуальные мутации, возникшие, вероятно, в клетках с уже мутированным геном. Пример накопления мутаций, доказывающий существование первичной мутации, приведен на рис. 7.

А 80

& 6,0

-ЯАББПА-чг^, +доксициклин/ген не зкспр -Яу^ЗЯ/Д-мут, -доксициклин/ген зкспр ~РА83Р1А. -доксициклин/ген экспр ~ПАЗЗР1А, +доксициклин/ген не экспр

ШРЗЛ ЯВЯРЗА РВХРЗВ

МУТАНТ ИЗ N417 МУТАНТ ИЗ N417 МУТАНТ ИЗКЖУУ

100

1 т 75

§*

1* 50

<п 0

Я я § § £

о; ос 'й.

а I е

МП

Рис. 8. Изменение опухоль-подавляющей способности генов ИА8БР1А и ЯВЗРЗ в результате мутаций.

А - Рост клонов КЯС/У, стабильно экспрессирующих нормальный ген ЙЛ.ЙЭТЛ и мутированный. Б - Влияние нормальных и мутированных вариантов генов ЯВЗРЗА и ЯВЗРЗВ на эффективность формирования колоний клетками КЯС/У.

Сравнение частоты мутаций в генах и ЯВ.ЧРЗ с мутациями в других

генах

РАЯЯР'М и ЯВЗ/'З имеют высокое содержание СО, хотя и различное: /?ЛЖУ'7/1 - 59.8% (6 экзонов), КВБРЗ - 54.3% (8 экзонов). Однако, в данной работе показано, что другие Сй богатые гены: вРЯН (72.5%); р1б/МК4а (71.6%); инсулин (61.6%), не проявляют такой высокой частоты мутаций. ЛЛХОТЛ и ЯВБРЗ - первые гены в негематопоэтических клетках, в которых обнаружена такая высокая частота мутаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые представлена модифицированная методика сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах для анализа хромосомы 3 человека, перспективная для одновременного масштабного анализа геномных (делеции и амплификации) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток.

С помощью модифицированной методики гибридизации на Notl-микрочипах проанализированы изменения хромосомы 3 в 250 образцах злокачественных опухолей различной локализации: почки, легкого, молочной железы, яичника, шейки матки, простагы, кишечника, лейкемии. В 30-60% исследованных образцов обнаружены изменения (метилирование/делеции) Notl-локусов генов NKiRASl, RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B. Метилирование генов в большинстве проанализированных образцов подтверждено с помощью независимых методов: МСП и бисульфитного секвенирования. Участие некоторых из этих генов в развитии опухолевых заболеваний той или иной локализации ранее описано в литературе: LRRC3B (Kim et al., 2008), RBSP3 (Kashuba et al., 2004), MINT24 (Toyota et al., 1999), VHL (Kuroki et al., 2003), ITGA9 (Hibi et al., 2004; Li et al., 2004; Senchenko et al., 2004). Впервые выявлено метилирование генов GORASPI, BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе.

Результаты, полученные в данной работе с помощью гибридизации на Notl-микрочипах, бисульфитного секвенирования, МСП и ПЦР-РВ, свидетельствуют о взаимосвязи между метилированием/делециями промоторов генов HYAL2, ITGA9, RBSP3, NPRL2, RASSF1A и RASSF2 и снижением количества мРНК в образцах опухоли.

Впервые показана способность гена RASSF2 подавлять рост клеток рака молочной железы в культуре и развитие опухоли у иммунодефицитных мышей.

Выявлено снижение опухоль-подавляющей способности генов RASSF1A и RBSP3 в результате мутаций.

Подводя итоги работы, можно сказать, что модифицированная методика гибридизации на Notl-микрочипах позволяет достаточно быстро выявлять новые онко-ассоциированные гены.

11 генов хромосомы 3 человека, для которых были выявлены наиболее частые изменения в опухолевых образцах: NKiRASl, RARbetal, 1TGA9, M1NT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B, могут быть использованы в качестве комбинации опухолевых маркеров для диагностики и мониторинга эффективности лечения онкозаболеваний, а также представлять потенциальный интерес для генной терапии.

выводы

1. Модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, разработанных в Каролинском институте Швеции. В результате ряда модификаций в протоколе подготовки проб ДНК-зондов, повышена эффективность гибридизации и интенсивность флуоресцентного сигнала. Усовершенствована система обработки результатов гибридизации.

2. Проанализированы изменения хромосомы 3 в 250 образцов рака почки, шейки матки, молочной железы, яичника, легкого, простаты, кишечника, лейкемии с помощью модифицированной методики гибридизации на Notl-микрочипах. Более чем в 30% образцов опухолей выявлены метилирование/гетерозиготные делеции Notl-ассоциированных локусов 11 генов хромосомы 3 человека: NKiRASI, RARbetal, 1TGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B.

3. Метилирование геномных Notl-локусов в биопсиях опухолей подтверждено с помощью независимых методов: МСП и бисульфитным секвенированием для большинства образцов опухоли.

4. Обнаружено, что в биопсиях опухолей с метилированными/делетированными промоторами генов HYAL2, ITGA9, RBSP3, NPRL2, RASSF1A и RASSF2 экспрессия этих генов снижена от двух до ста раз, что позволяет рассматривать эти гены как потенциальные маркеры для ранней диагностики эпителиальных опухолей.

5. Выявлено метилирование промоторов генов RASSF1A и RASSF2 в образцах опухоли молочной железы и HMPJI. В образцах опухоли яичника промотор гена RASSF1A метилирован, промотор RASSF2 - нет. Не обнаружено корреляции между статусами метилирования RASSF1A и RASSF2, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью генерализованно метилированного фенотипа.

6. Впервые показана способность гена RASSF2 подавлять рост опухолевых клеток молочной железы в культуре и в иммунодефицитных мышах, что подтверждает его свойства как гена-супрессора опухолевого роста и может служить для разработки новых терапевтических методов.

7. Обнаружена исключительно высокая частота спонтанного возникновения мутаций в генах RASSF1A (0.25 на 100 п.н.) и RBSP3 (0.10 на 100 п.н.) хромосомы 3. Это первые гены в негематопоэтических клетках, для которых показан такой высокий уровень мутаций. Продемонстрировано, что мутации могут снижать способность RASSF1A и RBSP3 к подавлению опухолевого роста.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Cooper WN, Dickinson RE, Dallol A, Grigorieva EV, Pavlova TV, Hesson LB, Bieche I, Broggini M, Maher ER, Zabarovsky ER, Clark GJ, Latif F. Epigenetic regulation of the ras effector/tumour suppressor RASSF2 in breast and lung cancer. //Oncogene. 2008. 27,1805-1811.

2. Павлова T.B., Кашуба В.И., Муравенко O.B., Енамандра С. П., Иванова Т.А., Забаровская В.И., Рахманалиев Э.Р., Петренко JI.A., Пронина И.В., Юркевич О.Ю., Киселев Л.Л., Зеленин А.В., Забаровский Е.Р. Технология анализа эпигенетических и структурных изменений хромосомы 3 человека с использованием гибридизации на Notl-микрочипах.// Молекулярная биология. 2009. 2, 339-347.

3. Kashuba V, Pavlova Т, Grigorieva Е, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J , Wang F, Protopopov A , Zabarovska V, Senchenko V, Haraldson K, Eshchenko T, Kobliakova J, Vorontsova O, Kuzmin I, Braga E, Blinov V, Kisselev L, Zeng Y, Ernberg I, Lerman M, Klein G. High Mutability of the Tumor Suppressor Genes RASSF1 and RBSP3 (CTDSPL) in cancer. // PLoS ONE. 2009. 4, e5231.

4. Dunwell TL, Hesson LB, Pavlova T, Zabarovska V, Kashuba V, Catchpoole D, Chiaramonte R, Brini AT, Griffiths M, Maher ER, Zabarovsky E, Latif F. Epigenetic analysis of childhood acute lymphoblastic leukemia.// Epigenetics. 2009. 4, 185-193.

Тезисы конференций

1. Zabarovsky E.R., Pavlova Т., Ivanova Т., Petrenko L., Rakhmanaliev E., Muravenko O., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Skrypkina I., Rynditch A., Grigorieva E., Kiseljova N., Kiseljov F.L., Kisselev L.L., Klein G., Kashuba V., Zelenin A.V. Epigenetic analysis of cancer cells using NotI microarrays. // Abstracts of Human Genome Meeting, 2006 (HGM2006), Helsinki, Finland, May 31 - June 3, 2006, page 215.

2. Zabarovsky E.R., Pavlova Т., Ivanova Т., Petrenko L., Rakhmanaliev E., Li J., Wang F, Haraldson K., Muravenko O., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.-P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Skrypkina I., Rynditch A., Grigorieva E., Kiseljova N., Zelenin A.V., Kiseljov F.L., Kisselev L.L., Lerman M., Kashuba V., Ernberg I., Klein G. Epigenetic analysis of epithelial malignancies using NotI microoarrays: identification of tumor suppressor genes. // Epigenetics and Cancer. IACR Workshop, Lion, France, June 22-23, 2006.

3. Ivanova Т., Pavlova Т., Skrypkina I., Petrenko L., Rakhmanaliev E., Muravenko O., Pronin I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Rynditch A., Zelenin A.V., Eschenko Т., Grigorieva E.,

Kisseljova N., Kisseljov F.L., Kisselev L.L., Klein G., Kashuba V., Zabarovsky E.R. Epigenetic analysis of different cancers using NotI microarrays. // 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine October 12-14,2006, Hersonissos, Crete, Greece, page 10.

4. Grigorieva E., Wang F., Li J., Pavlova Т., Eschenko Т., Kashuba V.I., Lerman M., Klein G., Zabarovsky E. HYAL1, HYAL2 and tumor supressor genes with asymmetric supressor effect in vitro and in vivo. // The 11th World Congress on Advances in Oncology, and 9th International Symposium on Molecular Medicine, 12-14 October, 2006, Hersonissos, Crete, Greece. - P. 53.

5. Пронина И.В., Логинов В.И., Иванова T.A., Павлова Т., Сараев Д., Гарькавцева Р.Ф., Муравенко О.В., Брага Э.А., Зеленин А.В., Киселев Л.Л., Кашуба В.И., Забаровский Е.Р. Поиск новых онкозначимых генов с использованием NotI микропанелей и Notl-репрезентативных проб. Тезисы 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007, // «Вопросы Онкологии» 2007, т. 53, № 1: стр. 21

6. Pavlova Т., Ivanona Т., Skrypkina I., Yenamandra P.S., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Rynditch A., Zelenin Т., Eschenko Т., Grigorieva E., Kisseljova N., Kisselev F., Kisselev L., Klein G., Ernberg I., Kashuba V., Zabarovsky E.R. // Restriction site tagged microarrays (NMA) to study complex biological systems as cancer cells and human Gut Flora // The 12th World Congress on Advances in Oncology, and 10,h International Symposium on Molecular Medicine, 11-13 October, 2007, Hersonissos, Crete, Greece.-P. 75.

7. Pavlova Т., Haraldson K., Skrypkina I., Yenamandra S.P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Eschenko Т., Grigorieva E., Lifu H., Ernberg I., Lerman M.I., Klein G., Kashuba V., Zabarovsky E. NotI microarrays (NMA) for epigenetic profiling and identification of cancer-causing genes. // The 13th World Congress on Advances in Oncology, and 11th International Symposium on Molecular Medicine, 9-11 October, 2008, Hersonissos, Crete, Greece. - P. 353.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Татьяна Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гены - супрессоры опухолевого роста

1.2. Эпигеномные изменения при канцерогенезе

1.2.1. Эпигеномные процессы

1.2.2. CpG островки и метилирование ДНК

1.2.3. Метилтрансферазы

1.2.4. Метилирование опухолевого генома 23 1.3. Локализация ряда TSG на хромосоме 3 человека

1.3.1. Нарушения на хромосоме 3 в карциномах различных органов

1.3.2. Анализ 3p21.3C - LUCA-региона

1.3.3. Анализ 3p21.3T- АР20-региона 32 1.4. Сравнительная геномная гибридизация (Comparative genome hibridization, CGH)

1.4.1. Современные методы CGH на микрочипах

1.4.2. Notl-микрочипы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Генетические конструкции для трансфекции клеток

RBSP3 и RASSF1A

2.1.2. Фрагменты геномной ДНК и кДНК генов

2.1.3. Клеточные линии

2.1.4. Образцы биопсий опухоли и нормальной ткани

2.2. Методы

2.2.1. Изготовление Notl-микрочипов

2.2.2. Блокировка микрочипов

2.2.3. Методика получения Notl-обогащенных ДНК-проб для

2.2. Методы

2.2.1. Изготовление Notl-микрочипов

2.2.2. Блокировка микрочипов

2.2.3. Методика получения Notl-обогащенных ДНК-проб для гибридизации

2.2.4. Гибридизация Notl-обогащенных проб

2.2.5. Анализ результатов гибридизации

2.2.6. Трансфекция и селекция позитивных клонов

2.2.7. Тест на эффективность формирования колоний

2.2.8. Тест на эффективность формирования колоний в жидком агаре

2.2.9. Формирование опухоли в иммунодефицитных мышах

2.2.10. Стандартные биологические процедуры 49 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Модификация технологии сравнительной геномной гибридизации с Notl-микрочипами

3.1.1. Nqtl-микрочипы

3.1.2. Модифицированная технология подготовки Notl-обогащенных проб ДНК для гибридизации с Notl-микрочипами

3.1.3. Обработка результатов гибридизации

3.1.4. Особенности биоинформатической обработки результатов гибридизации

3.1.5. Преимущества метода гибридизации на Notl-микрочипах

3.2. Эпигеномные и структурные изменения хромосомы 3, выявленные гибридизацией на Notl-микрочипах в разных типах опухоли

3.3. Анализ метилирования геномных Notl-локусов, показавших изменения в результате гибридизации на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов

3.3.1. Бисульфитное секвенирование Notl-локусов

3.3.2. Метил-специфичная амплификация Notl-локусов

3.4. Анализ метилирования TSG RASSF1A из хромосомы 3 человека и RASSF2 из хромосомы 20 в опухолях и раковых клеточных линиях

3.4.1. Семейство генов RAS

3.4.2. Эпигеномная регуляция гена RASSF

3.4.3. Анализ метилирования RASSF2 в раковых клеточных линиях молочной железы

3.4.4. Анализ метилирования промоторов генов RASSF2 и RASSF1A в опухоли молочной железы, HMPJI и яичника

3.5. Проверка опухоль-подавляющей способности гена RASSF in vitro и in vivo

3.5.1. Тест на формирование колоний

3.5.2. Тест на формирование колоний в жидком агаре

3.5.3. Формирование опухоли в иммуннодефицитных мышах с RASSF

3.6. Анализ мутационных изменений TSGRASSF1 иRBSP3 из хромосомы Зр человека в образцах опухолей и раковых клеточных линиях

3.6.1. Частота мутаций в гене RASSF1A

3.6.2. Поиск первичных мутаций в гене RASSF1A в клонах из единичной клетки

3.6.3. Частота мутаций RBSP

3.6.4. Сравнение частоты мутаций в генах RASSF1A и RBSP3 с мутациями в других генах

3.6.5. Влияние мутаций в генах RASSF1A и RBSP3 на их опухоль-подавляющую способность

3.6.6. Поиск мотивов - мишеней в генах RASSF1A и RBSP3 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

MPJT - мелкоклеточный рак легкого

МСП - метил-специфичная полимеразная цепная реакция

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

ФБС - фетальная бычья сыворотка

5-aza-2dC - 5-аза-2'деоксицитидин

CoBRA - combined bisulphite restriction analysis, комбинированного бисульфитного рестрикционного анализа

GIT - gene inactivation test, тест на инактивацию гена

LOH (Lost of heterozygosity) - потеря гетерозиготности

LUCA (Lung cancer) - рак лёгкого

NMA (Notl-microarray) - Notl-микрочип

RNAP II - РНК-полимераза II

SCID - тяжёлая комбинированная иммунная недостаточность

SCP - семейство малых CTD-фосфатаз

SDS - (Sodium Dodecyl Sulfat) додецил сульфат натрия

SSC - (Saline-Sodium Citrate buffer) цитрат натрия

SSCP - анализ полиморфизма одиночной нуклеотидной цепочки

TSG - tumor supressor gene, ген-супрессор опухолевого роста

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах"

Актуальность проблемы

Показано, что короткое плечо хромосомы 3 (Зр) человека содержит факторы, обладающие способностью подавлять опухолевый рост и подвержено частым аберрациям при многих видах рака; поэтому высказано мнение, что Зр - вероятный участок локализации целого ряда генов-супрессоров опухоли (Killary et al., 1992; Kok et al., 1997; Zabarovsky et al., 2002; Braga et al., 2002; Angeloni, 2007), однако, в настоящее время в этом большом (100 млн.п.н.) районе удалось выделить и охарактеризовать всего несколько TSG. Широко охарактеризованы только некоторые из них: ген VHL (Зр25), подавляющий активность РНК-полимеразы II на стадии элонгации, ген системы репарации MLH1 (Зр22) и ген RASSF1A (Зр21), вовлеченный в регуляцию клеточного цикла. Не вызывает сомнений необходимость более детального анализа этого участка генома для выявления новых TSG.

Создание новых ДНК-микрочипов имеет принципиальное значение для получения информации, не доступной на уровне мРНК (кДНК): гетерозиготные делеции, метилирование ДНК, ацетилирование гистонов. Метилирование и другие эпигеномные факторы, как известно, являются одними из ключевых механизмов регуляции экспрессии генов и играют важную роль в канцерогенезе. Эпигеномные изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза раковых заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является поиск и характеристика новых генов-супрессоров опухолевого роста на хромосоме 3 человека с помощью технологии гибридизации на Notl-микрочипах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Модифицирование методики сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах для скринирования хромосомы 3 человека.

2. Анализ геномных и эпигеномных изменений хромосомы 3 человека в образцах опухолей с использованием разработанных Notl-микрочипов и поиск новых кандидатов в TSG.

3. Исследование изменений геномных локусов, выявленных гибридизацией на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов: метил-специфичной ПЦР (МСП) и бисульфитного секвенирования.

4. Проверка взаимосвязи метилирования генов - кандидатов в TSG с их экспрессией в образцах эпителиальных опухолей.

5. Сравнение данных по метилированию и опухоль-подавляющей способности TSG RASSF1A и TSG-кандидата RASSF2 в клеточных линиях и образцах опухолей различной локализации.

6. Оценка способности TSG-кандидата RASSF2 к подавлению опухолевого роста в культуре клеток и у иммунодефицитных мышей.

7. Определение частоты возникновения мутаций в TSG RASSF1A и RBSP3 хромосомы Зр человека в раковых клеточных линиях и образцах эпителиальных опухолей.

Научная новизна работы

В работе модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, созданных с использованием Notl-связующих клонов (Zabarovsky et al., 1990; Li et al., 2002, международный патент W002/086163). Нами использованы Notl-микрочипы для скрининга хромосомы 3 человека, позволяющие одновременно анализировать 181 Notl-ассоциированный сайт хромосомы 3. Внесен ряд изменений в процесс подготовки проб ДНК-зондов для гибридизации на Notl-микрочипах:

-использование рестриктазы Sau3AI в комбинации с NotI, дающее возможность получать короткие фрагменты геномной ДНК, эффективно гибридизующиеся на микрочипах;

-использование биотинилированного Notl-линкера и стрептавидиновых магнитных шариков, позволяющее избавляться от метилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые существенно занижают силу сигнала при гибридизации.

Отработаны условия машинной гибридизации ДНК-проб на Notl-микрочипах.

Модифицирована математическая обработка результатов гибридизации на микрочипах.

С помощью модифицированной технологии сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах проанализированы геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в 250 образцах эпителиальных опухолей и лейкемии. Показано, что причиной инактивации TSG, локализованных в хромосоме 3, могут быть не только мутации и делеции, но и метилирование их промоторных областей. На основании результатов гибридизации на Notl-микрочипах и бисульфитного секвенирования метилирование NotI -локусов в генах RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B выявлено более чем в 30% образцов опухолей различной локализации. Метилирование генов BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе показано впервые.

Обнаружена взаимосвязь между снижением экспрессии гена RASSF2 и метилированием его промоторной области в клетках рака молочной железы, образцах немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) и рака молочной железы. Экспериментально установлено, что обработка с 5-aza-2dC способна восстановить экспрессию RASSF2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В данной работе впервые показана способность гена RASSF2A подавлять рост клеток рака молочной железы in vitro и в иммунодефицитных мышах. Обнаружено, что в образцах опухоли почки и HMPJI, где метилированы промоторные области генов HYAL2, RBSP3, RASSF1A, ITGA9, снижен уровень мРНК этих генов.

Практическая значимость работы

Модифицированная методика позволяет достаточно быстро выявлять новые онко-ассоциированные гены. Идентифицированные в данной работе новые 10 генов-кандидатов в TSG на хромосоме 3 человека могут быть использованы в качестве маркеров для ранней диагностики и мониторинга эффективности лечения онкозаболеваний, а также представляют потенциальный интерес для генной терапии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гены — супрессоры опухолевого роста

В основе образования злокачественных клеток и опухолей лежат наследственные или случайные дефекты генома. Большинство раковых заболеваний возникает из-за мутаций ДНК, приводящих к изменению функционирования генов, которые регулируют нормальное деление, рост, дифференцировку и старение клеток. В результате происходит образование постоянно пролиферирующих раковых клеток, которые, разрастаясь, могут привести к гибели целый организм.

На сегодняшний день признано, что рак возникает в результате комплексного процесса. Для 17 наиболее часто встречаемых типов рака была обнаружена логарифмическая зависимость частоты заболеваний от возраста (Armitage et al., 1954), которая указывает на то, что этому процессу предшествует множество событий. На основании этих данных был сделан вывод о том, что карциногенез — это сложный процесс, включающий в себя, по крайней мере, 6 или 7 стадий. В настоящее время разработана модель многостадийной прогрессии рака кишечника от аденомы до карциномы, в которой указано, что развитие спорадических форм данного клинического вида рака происходит в шесть стадий с участием различных классов генов: генов — супрессоров раковой опухоли, онкогенов и генов, вызывающих мутации (Sharrard et al., 1992).

Гены - супрессоры раковой опухоли принимают непосредственное участие в контроле клеточного цикла, обеспечивают клеточные контакты, поддерживают стабильность генома. Потеря или инактивация таких генов является онкогенной. Мутации генов — супрессоров раковой опухоли в зародышевых клетках (первичных клетках) являются предпосылкой развития рака. При спорадических формах рака обнаружены мутации этих же генов в соматических клетках (Tomlinson et al., 1996).

Открытие новых qTSG расширяет возможности создания маркеров для ранней диагностики и прогностики рака, а также создает основу для разработки подходов к генотерапии онкологических заболеваний. Локализация, идентификация и понимание функций генов — супрессоров опухолевого роста составляют одно из главных направлений в исследовании рака.

Изучение гибридов соматических клеток, полученных в результате слияния нормальных и опухолевых клеток, показало утрачивание злокачественных свойств гибридными клетками, т.е. подавление злокачественного фенотипа. Гибриды клеток проявляли себя как нормальные клетки при введении в организм иммуно-компромиссного хозяина, что указывало на их первоначальную неонкогенность. Однако, было установлено, что гибриды восстанавливали способность образовывать опухоль в случае утраты хромосом или участков хромосом, несущих гены-супрессоры раковой опухоли (Harris et al., 1986; Harris et al., 1988). Доказательством существования генов-супрессоров раковой опухоли в геноме человека является подавление роста разных типов опухолей, наблюдаемое при слиянии опухолевых клеток с микроклетками человека, содержащими отдельные хромосомы человека (Sager et al., 1985, 1986) .

В большинстве случаев для подавления роста опухоли in vitro или in vivo достаточным является введение единственной копии нормальной хромосомы (Sager et al., 1985, 1986; Shimizu et al., 1990; Tanaka et al., 1991; Dowdy et al., 1991; Banerjee et al., 1992).

Изучение наследственных онкологических заболеваний предоставило новые доказательства существования генов-супрессоров раковой опухоли. Кнудсон выдвинул гипотезу двух ударов (two-hits hypothesis), основанную на статистическом анализе частоты возникновения ретинобластомы в зависимости от возраста для наследственной и спорадической формы болезни. Согласно этой гипотезе возникновение ретинобластомы является результатом двух последовательных мутационных событий на двух аллелях одного и того же гена. Гипотеза Кнудсона в значительной степени способствовала открытию гена ретинобластомы (RB) в 1986 (Knudson, 1985; Klein, 1987). С тех пор было идентифицировано около 30 генов-супрессоров раковой опухоли, которые участвуют в контроле клеточного цикла, регулируют рост и транскрипцию, передачу сигналов, ангиогенезис и развитие, что указывает на широкий спектр функций этих генов. Предполагается, что гены-супрессоры раковой опухоли могут найти широкое применение в антиопухолевой терапии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Павлова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ

2. Проанализированы изменения хромосомы 3 в 250 образцов рака почки, шейки матки, молочной железы, яичника, легкого, простаты, кишечника, лейкемии с помощью модифицированной методики гибридизации на Notl-микрочипах. Более чем в 30% образцов опухолей выявлены метилирование/гетерозиготные делеции Notl-ассоциированных локусов 10 генов хромосомы 3 человека: RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B.

5. Выявлено метилирование промоторов генов RASSF1A и RASSF2 в образцах опухоли молочной железы и HMPJL В образцах опухоли яичника промотор гена RASSF1A метилирован, промотор RASSF2 — нет. Не обнаружено корреляции между статусами метилирования RASSF1A и RASSF2, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью генерализованно метилированного фенотипа.

7. Обнаружена исключительно высокая частота спонтанного возникновения мутаций в генах RASSF 1А (0.23 на 100 п.н.) и RBSP3 (0.10 на 100 п.н.) хромосомы 3. Это первые гены в негематопоэтических клетках, для которых показан такой высокий уровень мутаций. Продемонстрировано, что мутации могут снижать способность RASSF1A и RBSP3 к подавлению опухолевого роста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые представлена модифицированная технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, перспективная для масштабного скринирования структурных (делении и амплификации) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток. Информация об этих изменениях может служить предварительной базой для выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста и наиболее перспективных опухолевых маркеров. Описанная модифицированная технология приготовления NotI-npo6 из геномной /ТНК" для сравнительной геномной гибридизации имеет три основных преимущества. Первое: использование чувствительной к метилированию рестриктазы NotI, благодаря чему не только в случае делеции, но и в случае гомо- или гемизиготного метилирования Notl-сайта в меченой пробе этот локус отсутствует полностью или частично. Второе: использование рестриктазы Sau3AI в паре с NotI, позволяющее получать короткие фрагменты меченой ДНК размером от 100 до 500 п.н. Третье: биотинилированный Notl-линкер дает возможность избавиться от фрагментов ДНК, не содержащих Notl-сайта и потому не связавшихся с магнитными шариками. В результате, гибридизационная проба, в основном, обогащена короткими ДНК-последовательностями, гомологичными Notl-связующим клонам. При этом в пробе остается и метится флуоресцентными красителями только 0.1-0.5% ДНК полного генома.

Метод Notl-микрочипов может быть применен для сканирования всего генома человека либо для определенной его части.

В данной работе проведен пилотный эксперимент, в котором с помощью Notl-микрочипов к хромосоме 3 нами проанализированы изменения на этой хромосоме в 250 образцах опухолей: 40 образцах рака легкого, 43 образцах рака шейки матки, 39 - рака почки, 47 - рака молочной железы, 20 - рака яичника, 8 - рака простаты, 24 - рака кишечника, 20 образцов лейкемии.

Метилирование Notl-локусов генов RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, RPL15, THRB выявлено на Notl-микрочипах и подтверждено с помощью МСП и бисульфитного секвенирования в 30-60% образцов. Участие некоторых из этих генов в развитии опухолевых заболеваний той или иной локализации было ранее описано в литературе: RBSP3 (Kashuba et al., 2004), MINT24 (Toyota et al., 1999), VHL (Kuroki et al., 2003).

Метилирование промоторов генов BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе ранее не описано в литературе. Для геномных локусов hmm210782, hmm57278, hmml44092, NBEAL2, FLJ32332, продемонстрировавших изменения больше чем в 30% образцов опухоли, не найдено литературных данных об их связи с онкозаболеваниями либо отсутствует информация об их функциях. Представляется интересным дальнейшее изучение роли этих генов в канцерогенезе.

Для генов HYAL2, ITGA9, RBSP3, NPRL2, RASSF1A и RASSF2 показана корреляция снижения уровня мРНК с метилированием промоторов генов в образцах опухоли.

Нами показано метилирование промоторов генов семейства RAS: RASSF1A (Зр21) - 56% и RASSF2 (20р13) - 38%, в образцах опухоли молочной железы.

В образцах опухоли яичника обнаружено метилирование только RASSF1A (59%), но не RASSF2 (0/17).

Метилирование RASSF2 выявлено в 44% образцов HMPJI. В литературе сообщалось о метилировании гена RASSF1A в 34% тех же образцов (Agathanggelou et al., 2001).

Не выявлено корреляции между статусами метилирования RASSF1A и RASSF2 в проанализированных образцах, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью генерализованно метилированного фенотипа.

Показано метилирование промотора RASSF2 в 13 из 20 (65%) клеточных линий рака молочной железы, где экспрессия гена снижена или отсутствовала. В результате обработки клеточных линий с «молчащим» из-за метилирования промотора RASSF2 с помощью 5-aza-2dC (5-аза-2'деоксицитидином) экспрессию гена реактивировали. Отсюда следует предварительное заключение, что утрата экспрессии RASSF2 коррелирует с метилированием промотора гена в раковых клеточных линиях молочной железы.

Все полученные нами и описанные ранее данные предполагают, что метилирование промоторов TSGs RASSF 1А и RASSF2 - ранние, частые и специфичные для опухоли события для ряда эпителиальных опухолей (включая HMPJI, молочную железу, кишечник). RASSF1A и RASSF2 можно рассматривать как потенциальные маркеры для ранней диагностики раковых заболеваний. Впервые показано, что экспрессия RASSF2 значительно подавляет рост опухолевых клеток молочной железы MCF7 в культуре (20% колоний от числа колоний контрольных клеток) и в иммунодефицитных мышах. Эндогенная экспрессия гена в клетках MCF7 отсутствует вследствие метилирования промоторной области. Предполагается возможность разработки новых терапевтических методов с использованием RASSF2, учитывая показанную им сильную опухоль-подавляющую способность.

Подводя итоги, можно сказать, что метилирование промоторов ряда генов из хромосомы 3 человека — раннее и частое событие в различных эпителиальных опухолях, вызывающее полное или частичное подавление экспрессии. Возможность открытия метилирования TSG на ранних стадиях канцерогенеза может стать революционным в диагностике рака, так как позволит существенно раньше выявлять и прогнозировать возникновение онкологических заболеваний.

Впервые обнаружена исключительно высокая частота спонтанного возникновения единичных мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста RASSF1A (0.23 на 100 п.н.) и RBSP3 (0.10 на 100 п.н.) из хромосомы Зр, in vitro и in vivo. В нашей работе впервые показан такой высокий уровень мутаций. Частота мутаций RASSF1A и RBSP3 сходна с таковой для онкогенов Rho/TTF (0.17), МУС (0.12) и BCL6 (0.69) в крупноклеточных лимфомах (Pasqualucci et al., 2001). Продемонстрировано, что мутации могут снижать опухоль-подавляющую способность генов.

Следует отметить, что продукты генов RASSF1A (TSG из региона LUCA) и RBSP3 (TSG из региона АР20) могут вместе участвовать в индуцировании остановки клеточного цикла: первый ингибирует циклин D1, а второй активирует pRB белок.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика. 2006. 9, 1186-1189.

2. Корочкин JI. И. Что такое эпигенетика. Генетика. 2006. 9, 1156-1164.

3. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 527 с.

4. Allen NP, Donninger H, Vos MD, Eckfeld K, Hesson L, Gordon L, Birrer MJ, Latif F, Clark GJ. RASSF6 is a novel member of the RASSF family of tumor suppressors. Oncogene. 2007.26, 6203-6211.

5. Allikmets R, Kashuba VI, Huebner K, LaForgia S, Kisselev LL, Klein G, Dean M, Zabarovsky ER. Mapping of 22 Notl linking clones on human chromosome 3 by polymerase chain reaction and somatic cell hybrid panels. Chromosome Res. 1996. 1,33-37.

6. Allikmets RL, Kashuba VI, Pettersson B, Gizatullin R, Lebedeva T, Kholodnyuk ID, Bannikov VM, Petrov N, Zakharyev VM, Winberg G. Notl linking clones as a tool for joining physical and genetic maps of the human genome. Genomics. 1994. 19, 303-309.

7. Alves G, Tatro A, Fanning T. Differential methylation of human LINE-1 retrotransposons in malignant cells. Gene. 1996. 176, 39-44.

8. Angeloni D, Duh FM, Wei MF, Johnson BE, Lerman MI. A G-to-A single nucleotide polymorphism in intron 2 of the human CACNA2D2 gene that maps at 3p21.3. Mol Cell Probes. 2001. 15, 125-127.

9. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct Genomic Proteomic. 2007. 6, 19-39. Review.

10. Antequera F., Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 1993. 90, 11995-11999.

11. Arenstorf HP, Kandpal RP, Baskaran N, Parimoo S, Tanaka Y, Kitajima S, Yasukochi Y, Weissman SM. Construction and characterization of a Notl-BsuE linking library from the human X chromosome. Genomics. 1991 11, 115-123.

12. Armitage P., Doll R. The age distribution of cancer and a multi-stage theory of carcinogenesis. Br J Cancer. 1954. 8, 1-12.

13. Batova A, Diccianni MB, Yu JC, Nobori T, Link MP, Pullen J, Yu AL. Frequent and selective methylation of pi 5 and deletion of both pi 5 and pl6 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 1997. 57, 832-836.

14. Baylin SB, Hoppener JW, de Bustros A, Steenbergh PH, Lips CJ, Nelkin BD. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. Cancer Res. 1986. 46, 2917-2922.

15. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res. 1998. 72, 141-196.

16. Baylin and Herman, DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics.Trends Genet. 2000. 16, 168-174. Review.

17. Belinsky SA. Role of the cytosine DNA-methyltransferase and pl6INK4a genes in the development of mouse lung tumors. Exp Lung Res. 1998. 24, 463-479.

18. Bhattacharya SK, Ramchandani S, Cervoni N, Szyf M. A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA. Nature. 1999. 397, 579-583.

19. Beale RC, Petersen-Mahrt SK, Watt IN, Harris RS, Rada C, Neuberger MS. Comparison of the differential context-dependence of DNA deamination by APOBEC enzymes: correlation with mutation spectra in vivo. J Mol Biol. 2004. 337, 585-596.

20. Bird A.P. The relationship of DNA methylation to cancer. Cancer Surv. 1996. 28, 87-101. Review.

21. Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell. 1985. 40, 91-99.

22. Brena R.M., Huang Т.Н., Plass C. Quantitative assessment of DNA methylation: Potential applications for disease diagnosis, classification, and prognosis in clinical settings. J. Mol. Med. 2006. 84, 365-377.

23. Bouchard J, Momparler RL. Incorporation of 5-Aza-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate into DNA. Interactions with mammalian DNA polymerase alpha and DNA methylase. Mol Pharmacol. 1983. 24, 109-114.

24. Brandeis M, Frank D, Keshet I, Siegfried Z, Mendelsohn M, Nemes A, Temper V, Razin A, Cedar H. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature. 1994. 371, 435-438.

25. Cheng Y, Poulos NE, Lung ML, Hampton G, Ou B, Lerman MI, Stanbridge EJ. Functional evidence for a nasopharyngeal carcinoma tumor suppressor gene that maps at chromosome 3p21.3. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. 95, 3042-3047.

26. Chuang LS, Ian HI, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl. Science. 1997. 277, 1996-2000.

27. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994. 22, 2990-2997.

28. Conticello SG, Thomas CJ, Petersen-Mahrt S, Neuberger MS. Evolution of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases. Mol Biol Evol. 2005. 22, 367-377.

29. Cooper DN, Taggart MH, Bird AP. Unmethylated domains in vertebrate DNA. Nucleic Acids Res. 1983. 11, 647-658.

30. Cooper DN, Youssoufian H.The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum Genet. 1988. 78, 151-155.

31. Costello JF, PI ass C. Methylation matters. J Med Genet. 2001. 38, 285303.

32. Costello JF, Smiraglia DJ, Plass C. Restriction landmark genome scanning. Methods 2002;27:144-149

33. Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nat Genet. 1994. 6, 236-244.

34. Cross SH, Lee M, Clark VH, Craig JM, Bird AP, Bickmore WA. The chromosomal distribution of CpG islands in the mouse: evidence for genome scrambling in the rodent lineage. Genomics. 1997. 40, 454-461.

35. Csoka AB, Frost GI, Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 2001. 20, 499-508.

36. Curley SA, Lott ST, Luca JW, Frazier ML, Killary AM. Surgical decisionmaking affected by clinical and genetic screening of a novel kindred with von Hippel-Lindau disease and pancreatic islet cell tumors.Ann Surg. 1998. 227, 229-235.

37. Del Senno L, Maestri I, Piva R, Hanau S, Reggiani A, Romano A, Russo G. Differential hypomethylation of the c-myc protooncogene in bladder cancers at different stages and grades. J Urol. 1989. 142, 146-149.

38. Denissenko MF, Chen JX, Tang MS, Pfeifer GP. Cytosine methylation determines hot spots of DNA damage in the human P53 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94, 3893-3898.

39. Doerfler W. DNA methylation and gene activity. Annu Rev Biochem. 1983. 52, 93-124.

40. Dowdy SF, Fasching CL, Araujo D, Lai KM, Livanos E, Weissman BE, Stanbridge EJ. Suppression of tumorigenicity in Wilms tumor by the pi 5.5-pl4 region of chromosome 11. Science. 1991. 254, 293-295.

41. Esteller M, Herman JG. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol. 2002. 196, 1-7.

42. Feinberg AP. Imprinting of a genomic domain of llpl5 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer Res. 1999. 59, 1743-1746.

43. Feinberg AP, Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature. 1983. 301, 89-92.

44. Feng Q, Balasubramanian A, Hawes SE, Toure P, Sow PS, Dem A, Dembele B, Critchlow CW, Xi L, Lu H, Mcintosh MW, Young AM, Kiviat NB. Detection of hypermethylated genes in women with and without cervical neoplasia. J. Natl. Cancer. 2005. 97, 273-278.

45. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo КС, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic cids Res. 1983. 11, 6883-6894.

46. Gama-Sosa MA, Wang RY, Kuo КС, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of highly repeated sequences in human DNA. Nucleic Acids Res. 1983. 11, 3087-3095.

47. Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol. 1987. 196, 261-282.

48. Gearhart PJ, Wood RD. Emerging links between hypermutation of antibody genes and DNA polymerases. Nat Rev Immunol. 2001. 1, 187— 192.

49. Gray JW, Collins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis. 2000. 21, 443-452.

50. Goldberg M, Rummelt C, Laerm A, Helmbold P, Holbach LM, Ballhausen WG. Epigenetic silencing contributes to frequent loss of the fragile histidine triad tumour suppressor in basal cell carcinomas. Br J Dermatol. 2006. 155, 1154-1158.

51. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res. 1994. 54, 4855-4878.

52. Harris N. The analysis of malignancy by cell fusion: the position in 1988. Cancer Res. 1988. 48, 3302-3306.

53. Harris N. The genetic analysis of malignancy. Cell Sci Suppl. 1986. 4, 431-444.

54. Hattori M, Toyoda A, Ichikawa H, Ito T, Ohgusu H, Oishi N, Капо T, Kuhara S, Ohki M, Sakaki Y. Sequence-tagged Notl sites of human chromosome 21: sequence analysis and mapping. Genomics. 1993. 17, 3944.

55. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin S.B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93, 9821-9826.

56. Hesson L, Dallol A, Minna JD, Maher ER, Latif F. NORE1A, a homologue of RASSF 1A tumour suppressor gene is inactivated in human cancers. Oncogene. 2003. 22, 947-954.

57. Hesson L, Bieche I, Krex D, Criniere E, Hoang-Xuan K,Maher ER, Latif F. Frequent epigenetic inactivation of RASSF 1A and BLU genes located within the critical 3p21.3 region in gliomas. Oncogene. 2004. 23, 24082419.

58. Hesson L, Dallol A, Minna JD, Maher ER, Latif F. NORE1A, a homologue of RASSF 1A tumour suppressor gene is inactivated in human cancers. Oncogene. 2004. 22, 947-954.

59. Hesson LB, Cooper WN, Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer. Dis Markers. 2007. 23, 73-87. Review.

60. Hibi K, Yamakawa K, Ueda R, Horio Y, Murata Y, Tamari M, Uchida K, Takahashi T, Nakamura Y, Takahashi T. Aberrant upregulation of a novel integrin alpha subunit gene at 3p21.3 in small cell lung cancer. Oncogene. 1994. 9, 611-619.

61. Holliday R, Pugh JE. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science. 1975. 187, 226-232.

62. Holschneider CH, Baldwin RL, Tumber K, Aoyama C, Karlan BY. The fragile histidine triad gene: a molecular link between cigarette smoking and cervical cancer. Clin Cancer Res. 2005. 11, 5756-5763.

63. Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER. Search for unknown tumour-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003. 38, 307-321.

64. Irimia M, Fraga MF, Sanchez-Cespedes M, Esteller M. CpG island promoter hypermethylation of the Ras-effector gene NORE1A occurs in the context of a wild-type K-ras in lung cancer. Oncogene. 2004. 23, 86958699.

65. Issa JP. CpG-island methylation in aging and cancer. Curr Top Microbiol Immunol. 2000. 249, 101-118.

66. Ito T, Sakaki Y. A novel procedure for selective cloning of NotI linking fragments from mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 1988. 16, 91779184.

67. Jahner D, Stuhlmann H, Stewart CL, Harbers K, Lohler J, Simon I, Jaenisch R. De novo methylation and expression of retroviral genomes during mouse embryogenesis. Nature. 1982. 298, 623-628.

68. Janisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression. Nature Genetics. 2003. 33, 245-254.

69. Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet. 1999. 21, 163-167.

70. Jones PA. The DNA methylation paradox. Trends Genet. 1999. 15, 34-37.

71. Kafri T, Ariel M, Brandeis M, Shemer R, Urven L, McCarrey J, Cedar H, Razin A. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. Genes Dev. 1992. 6, 705-714.

72. Kashuba VI, Li J, Wang F, Senchenko VN, Protopopov A, Malyukova A, Kutsenko AS, Kadyrova E, Zabarovska VI, Muravenko OV, Zelenin AV,

73. Kisselev LL, Kuzmin I, Minna JD, Winberg G, Ernberg I, Braga E, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER. RBSP3 (HYA22) is a tumour suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101,4906-4911.

74. Killary AM, Wolf ME, Giambernardi ТА, Naylor SL. Definition of a tumor suppressor locus within human chromosome 3p21-p22. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89, 10877-10881.

75. Kim YI, Giuliano A, Hatch KD, Schneider A, Nour MA, Dallal GE, Selhub J, Mason JBXjlobal DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma. Cancer. 1994. 74, 893-899.

76. Kim YI. Folate and cancer prevention: a new medical application of folate beyond hyperhomocysteinemia and neural tube defects. Nutr Rev. 1999. 57, 314-321.

77. Klein G. The approaching era of the tumor suppressor genes. Science. 1987. 238, 1539-1545.

78. Knudson AG Jr. Genetics of human cancer. Annu Rev Genet. 1986. 20, 231-251.

79. Knudson AG Jr. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res. 1985. 45, 1437-1443.

80. Kovacs G, Erlandsson R, Boldog F, Ingvarsson S, Miiller-Brechlin R, Klein G, Stimegi J. Consistent chromosome 3p deletion and loss of heterozygosity in renal cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85,1571-1575.

81. Lapeyre JN, Becker FF. 5-Methylcytosine content of nuclear DNA during chemical hepatocarcinogenesis and in carcinomas which result. Biochem Biophys Res Commun. 1979. 87, 698-705.

82. Leonhardt H, Page AW, Weier HU, Bestor TH. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 1992. 71, 865-873.

83. Lerman MI. The RASSF 1A tumor suppressor gene is inactivated in prostate tumors and suppresses growth of prostate carcinoma cells. Cancer Res. 2002. 62, 3498-3502.

84. Li J, Protopopov Al, Gizatullin RZ, Kiss C, Kashuba VI, Winberg G, Klein G, Zabarovsky ER. Identification of new tumour suppressor genes based on in vivo functional inactivation of a candidate gene. FEBS Lett. 1999. 451,289-294.

85. Li J, Wang F, Protopopov A, Malyukova A, Kashuba V, Minna JD, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky E. Inactivation of RASSF1C during in vivo tumor growth identifies it as a tumor suppressor gene. Oncogene. 2004. 23, 5941-5949.

86. Li J.L., Fei Q., Yu J., Zhang H.Y., Wang P., Zhu J.D. Correlation between methylation profile of promoter cpg islands of seven metastasis-associated genes and their expression states in six cell lines of liver origin. Ai Zheng. 2004. 23,985-991.

87. Liu Z, Wang L, Wang LE, Sturgis EE, Wei Q. Polymorphisms of the DNMT3B gene and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck: A case-control study. Cancer Lett. 2008. 268, 158-165.

88. Lutecij LJ, Randerath E, Randerath K. DNA hypomethylation in Morris hepatomas. Cancer Lett. 1983. 19, 231-239.

89. Macgregor P.F. Gene expression in cancer: the application of microarrays. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2003. 3, 185-200.

90. McQueen HA, Fantes J, Cross SH, Clark VH, Archibald AL, Bird AP. CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes. Nat Genet. 1996. 12, 321-324.

91. Maliukova AV, Loginov VI, Khodyrev DS, Kadyrova EL, Pronina IV, Ivanova ТА, Kiselev FL, Zabarovskii NP, Braga EA. Methylation of the putative tumor suppressor gene, RASSF1A, in primary cervical tumors. Mol Biol (Mosk). 2004. 38, 1005-1013.

92. Monk М, Boubelik М, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development. 1987. 99, 371-382.

93. Nancarrow DJ, Handoko HY, Smithers BM, Gotley DC, Drew PA, Watson DI, Clouston AD, Hayward NK, Whiteman DC. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet. 1999. 23, 41-46.

94. Narayan A, Ji W, Zhang XY, Marrogi A, Graff JR, Baylin SB, Ehrlich M. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer. 1998. 77, 833-838.

95. Pan ZG, Kashuba VI, Liu XQ, Shao JY, Zhang RH, Jiang JH, Guo C, Zabarovsky E, Ernberg I, Zeng YX. High frequency somatic mutations in RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Biol Ther. 2005. 4, 11161122.

96. Park HW, Kang HC, Kim IJ, Jang SG, Kim K, Yoon HJ, Jeong SY, Park JG. Correlation between hypermethylation of the RASSF2A promoter and

97. K-ras/BRAF mutations in microsatellite-stable colorectal cancers. Int J Cancer. 2007. 120, 7-12.

98. Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Nanjangud G, Chaganti RS, Kiippers R, Dalla-Favera R. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas. Nature. 2001. 412, 341

99. Pfeifer GP, Dammann R. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Mosc). 2005. 70, 576-583. Review.

100. Pollack J.R., Perou C.M., Alizadeh A.A., Eisen M.B., Pergamenschikov A., Williams C.F., Jeffrey S.S., Botstein D., Brown P.O. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat. Genet. 1999. 23, 41-46.

101. Protopopov A, Kashuba V, Zabarovska VI, Muravenko OV, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER. An Integrated Physical and Gene Map of the 3.5Mb Chromosome 3p21.3 (AP20) Region Implicated in Major Human Epithelial Malignancies. Cancer Res. 2003. 63, 404-412.

102. Qu GZ, Grundy PE, Narayan A, Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumors of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16. Cancer Genet Cytogenet. 1999. 109, 34-39.

103. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3 a. Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97, 5237-5242.

104. Rideout WM, Coetzee GA, Olumi AF, Jones PA. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. Science. 1990. 249, 1288-1290.

105. Riggs AD, Jones PA. 5-methylcytosine, gene regulation, and cancer. Adv Cancer Res. 1983. 40, 1-30.

106. Robertson KD, Wolffe AP. DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet. 2000. 1, 11-19.

107. Rogozin IB, Pavlov YI, Bebenek K, Matsuda T, Kunkel ТА. Somatic mutation hotspots correlate with DNA polymerase eta error spectrum. Nat Immunol. 2001. 2, 530-536.

108. Roll JD, Rivenbark AG, Jones WD, Coleman WB. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.Mol Cancer. 2008. 25, 7-15.

109. Roth S.Y., Allis C. D. Chromatin condensation: does histone HI dephosphorylation play a role? Trends Biochem Sci. 1992. 17, 93-98.

110. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet. 2000. 25, 269-277.

111. Sadikovic В., Andrews J., Rodenhiser D.I. DNA methylation analysis using CpG microarrays is impaired in benzopyrene exposed cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007. 225, 300-309.

112. Sadikovic В., Andrews J., Carter D., Robinson J., Rodenhiser D.I. Genome-wide H3K9 histone acetylation profiles are altered in benzopyrene treated MCF7 breast cancer cells. J. Biol. Chem. 2007. 283, 4051-4060.

113. Sager R. Genetic suppression of tumor formation. Adv Cancer Res. 1985. 44, 43-68.

114. Sager R. Genetic suppression of tumor formation: a new frontier in cancer research. Cancer Res. 1986. 46, 1573-1580.

115. Saito A, Abad JP, Wang DN, Ohki M, Cantor CR, Smith CL. Construction and characterization of a NotI linking library of human chromosome 21. Genomics. 1991. 10, 618-630.

116. Sanchez Y, el-Naggar A, Pathak S, Killary AM. A tumor suppressor locus within 3pl4-pl2 mediates rapid cell death of renal cell carcinoma in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1994. 91, 3383-3387.

117. Schmutte C, Jones PA. Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis. Biol Chem. 1998. 379, 377-388.

118. Sharif J, Muto M, Takebayashi S, Suetake I, Iwamatsu A, Endo ТА, Shinga J, Mizutani-Koseki Y, Toyoda T, Okamura K, Tajima S, Mitsuya K,

119. Okano M, Koseki H. The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmtl to methylated DNA. Nature. 2007. 450, 908-912.

120. Sharrard RM, Royds JA, Rogers S, Shorthouse AJ. Patterns of methylation of the c-myc gene in human colorectal cancer progression. Br J Cancer. 1992. 65, 667-672.

121. Shen JC, Rideout WM, Jones PA. The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 1994. 22, 972976.

122. Shimizu M, Yokota J, Mori N, Shuin T, Shinoda M, Terada M, Oshimura M. Oncogene. 1990. 5, 185-194.

123. Silva AJ, White R. Inheritance of allelic blueprints for methylation patterns. Cell. 1988. 54, 145-152.

124. Sims III R.G., Nishioka K., Reinberg D. Histone lysine methylation: a signature for chromatin function. Trends Genet. 2003. 19, 629-639

125. Sperling J., Sperling R. Photochemical cross-linking of histones to DNA nucleosomes. Nucl. Acids Res. 1978. 5, 2755-2773.

126. Stallcup M.R. Role of protein methylation in chromatin remodeling and transcriptional regulation. Oncogene. 2001. 20, 3014-3020.

127. Sugimura T, Ushijima T. Genetic and epigenetic alterations in carcinogenesis. Mutat Res. 2000. 462, 235-246. Review.

128. Tanaka K, Oshimura M, Kikuchi R, Seki M, Hayashi T, Miyaki M. Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18. Nature. 1991. 349, 340-342.

129. Thayer RE, Singer MF, Fanning TG. Undermethylation of specific LINE-1 sequences in human cells producing a LINE-1-encoded protein. Gene. 1993. 133, 273-277.

130. Thoma F., Koller Т.Н. Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. J. Cell Biol. 1979. 83, 403-427.

131. Tian XQ, Zhang Y, Sun D, Zhao S, Xiong H, Fang J. Epigenetic silencing of LRRC3B in colorectal cancer. Scand J Gastroenterol. 2009. 44, 79-84.

132. Tommasi S, Dammann R, Jin SG, Zhang XF, Avruch J, Pfeifer GP. RASSF3 and NORE1: identification and cloning of two human homologues of the putative tumor suppressor gene RASSF1. Oncogene. 2002. 21, 2713— 2720.

133. Tomlinson IP, Bodmer WF. Chromosome llq in sporadic colorectal carcinoma: patterns of allele loss and their significance for tumorigenesis. J Clin Pathol. 1996. 49, 386-390.

134. Toyota M., Ho C., Ahuja N., Jair K.W., Li Q., Ohe-Toyota M., Baylin S.B., Issa J.P. Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res. 1999. 59, 2307-2312.

135. Trevino V., Falciani F., Barrera-Saldana H.A. DNA microarrays: a powerful genomic tool for biomedical and clinical research. Mol. Med. 2007. 13, 527-541.

136. Туско В. Epigenetic gene silencing in cancer. J Clin Invest. 2000. 105, 401-407.

137. Vachtenheim J, Horakova I, Novotna H.Hypomethylation of CCGG sites in the 3' region of H-ras protooncogene is frequent and is associated with H-ras allele loss in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 1994. 54, 11451148.

138. Vos MD, Ellis CA, Elam C, Ulku AS, Taylor BJ, Clark GJ. RASSF2 is a novel K-Ras-specific effector and potential tumor suppressor. J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28045-51. Epub 2003 May 5.

139. Wallace MR, Fountain JW, Brereton AM, Collins FS. Direct construction of a chromosome-specific NotI linking library from flow-sorted chromosomes. Nucleic Acids Res. 1989. 17, 1665-1677.

140. Wang Q., Yang C., Zhou J., Wang X., Wu M., Liu Z. Cloning and characterization of full-length human ribosomal protein LI5 cDNA which was overexpressed in esophageal cancer. Gene. 2001. 263, 205-209.

141. Warnecke P.M., Stirzaker C., Song J., Grunau C., Melki J.R. and Clark S.J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 2002. 27, 101-107.

142. Woodcock DM, Lawler CB, Linsenmeyer ME, Doherty JP, Warren WD. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human LI retrotransposon.J Biol Chem. 1997. 272, 7810-7816.

143. Xie S, Wang Z, Okano M, Nogami M, Li Y, He WW, Okumura K, Li E. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene. 1999. 236, 87-95.

144. Yan PS, Chen CM, Shi H, Rahmatpanah F, Wei SH, Caldwell CW, Huang TH. Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays.Cancer Res. 2001. 61, 8375-8380.

145. Yan PS, Wei SH, Huang TH. Differential methylation hybridization using CpG island arrays. Methods Mol Biol. 2002. 200, 87-100.

146. Yeo M, Lin PS, Dahmus ME, Gill GN. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5. J Biol Chem. 2003. 278, 26078-26085.

147. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet. 1997. 13, 335-340.

148. Yoon D.Y., Buchler P., Saarikoski S.T., Hines O.J., Reber H.A., Hankinson O. Identification of genes differentially induced by hypoxia in pancreatic cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 288, 882— 886.

149. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002. 21, 6915-6935.

150. Zabarovsky ER, Kashuba VI, Pettersson B, Petrov N, Zakharyev V, Gizatullin R, Lebedeva T, Bannikov V, Pokrovskaya ES, Zabarovska VI, et al. Shot-gun sequencing strategy for long-range genome mapping: a pilot study. Genomics. 1994. 21, 495-500.

151. Zardo G, Caiafa P. The unmethylated state of CpG islands in mouse fibroblasts depends on the poly(ADP-ribosyl)ation process. J Biol Chem. 1998.273, 16517-16520.

152. Zeng X, Winter DB, Kasmer C, Kraemer KH, Lehmann AR, Gearhart PJ. DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes. Nat Immunol. 2001. 2, 537-541.

153. Zhang Y., Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 2001. 15. 2343-2360.

154. Zhang Z, Sun D, Van do N, Tang A, Hu L, Huang G. Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 2007. 120, 32—38.

155. Zhou D., Qiao W., Yang L., Lu Z. Bisulfite-modified target DNA array for aberrant methylation analysis. Anal. Biochem. 2006. 351, 26-35.

156. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Virmani A.K., Geradts J., Gazdar A.F., Minna J.D. Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers. Cancer Res. 2001. 61, 249 -255.

157. Zochbauer-Muller S, Minna JD, Gazdar AF. Aberrant DNA methylation in lung cancer: biological andclinical implications. Oncologist. 2002. 7, 451457. Review.§ Благодарности

158. Огромная благодарность моей маме за неустанную заботу и поддержку. Искреннюю признательность выражаю Инне Носовой и Елизавете Стародубовой за дружеское отношение и помощь в решении организационных вопросов при оформлении диссертации.

159. Я искренне признательна всем, кто оказал мне помощь в работе и дружескую поддержку.

Информация о работе

Павлова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы