Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе

Ковальчук, Наталья Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе"

На правах рукописи

КОВАЛЬЧУК НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

ПЛАЗМИДНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОВАРОВ САЛЬМОНЕЛЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СИСТЕМЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ

03.00.07. — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, лауреат Государственной премии СССР Ф.Н. Шубин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бузолева Любовь Степановна кандидат медицинских наук Янькова Вера Иннокентьевна

Ведущая организация - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, (г. Москва).

Защита состоится 9 июня 2004 г. на заседании Диссертационного совета ДМ 005.005.03 в Тихоокеанском институте биоорганической химии (690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тихоокеанского института биоорганической химии (690022, г. Владивосток, проспект. 100-лет Владивостоку, 159).

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О. И. Недашковская

Актуальность темы

Заболеваемость, вызванная сальмонеллами, продолжает оставаться актуальной во всем мире. Сальмонеллезы распространены настолько широко, что в настоящее время ни в одной стране мира не стоит вопрос об их ликвидации, а говорят только о снижении уровня заболеваемости и ограничении распространения возбудителя среди основных источников этой инфекции.

Микробиологическому мониторингу, как важнейшей части эпидемиологиического надзора за сальмонеллезом, всегда уделялось важное внимание. Обычно для типирования возбудителей сальмонеллеза применяют биотипирование, фаготипироьание, определение устойчивости или чувствительности к антибиотикам. Помимо некоторых преимуществ, которые свойственны этим методам (простота и достаточная оперативность), они имеют ряд существенных недостатков, связанных с тем, что основаны на регистрации фенотипических признаков. В настоящее время известно, что фенотип возбудителей бактериальных инфекций подвержен значительной вариабельности, а это снижает эффективность внутривидового типирования исследуемых штаммов микробов. В связи с этим разработка эффективных методов внутривидового типирования возбудителей сальмонеллеза является весьма актуальной.

В последние годы для внутривидового типирования сальмонелл широко применяются молекулярно-генетические методы, среди которых наиболее распространенным является плазмидный анализ. Этот метод в комплексе с рестрикционным анализом очищенных плазмидных ДНК является наиболее удобным и широко используемым методом оценки геномного полиморфизма сальмонелл. Применение плазмидного анализа позволяет дифференцировать отдельные серовары сальмонелл на" плазмидные варианты (плазмидовары), что открывает перспективу для изучения структуры популяции микроба, фенотипических и генотипических характеристик отдельных плазмидоваров возбудителя [Беляков и др. 1990].

В работе использована номенклатура сальмонелл в соответствии с которой выделяется вид Salmonella enterica (ex Kauffman et Edvards 1952) Le Minor et Popoff 1987, который хоть и не входит в Approved Lists of Bacterial Names, Validation Lists и Notification Lists, но используется многими учеными (e.g. Brenner 2000). Все исследованные нами серовары сальмонелл, включая S. enteritidis, S. typhimurium и другие (77 сероваров) относятся к Salmonella enterica subs, enterica (ex Kauffman et Edvards 1952) Le Minor et Popoff 1987. Цель исследования •

Изучение фенотипических и плазмидных характеристик различных сероваров сальмонелл и возможности их использования для внутривидового типирования возбудителя и микробиологического мониторинга при

¡ НОС. НАЦИОНАЛЬНА*

I БИБЛИОТЕКА

Задачи исследования

1. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов S. enteritidis, циркулирующих в Приморском крае.

2. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов S. typhimurium, вызывающих два типа инфекции — зоонозный и антропонозный.

3. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов сероваров сальмонелл, редко выявляемых на территории края.

4. Изу- ить генотипическое родство штаммов доминирующих плазмидоваров S. enteritidis на основе рестрикционного анализа мелких критических плазмид и генотипическое родство штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения на основе рестрикционного анализа плазмиды массой 60 MDa.

5. Выяснить возможность использования плазмидного анализа в комплексе с рестрикционным анализом отдельных плазмид и ПЦР-диагностикой плазмид вирулентности в системе длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга при сальмонеллезе.

Научная новизна

Установлено, что штаммы всех сероваров сальмонелл гетерогенны по спектру плазмид и характеризуются значительным количеством плазмидоваров возбудителя.

По наличию плазмид все штаммы S. enteritidis были распределены на 59 плазмидоваров. Выявлены доминирующие и редко выявляемые плазмидовары. S. enteritidis. Выяснено, что доминирующие плазмидовары характеризуются различной этиологической значимостью, способной изменяться не только ежегодно, но и по месяцам.

Выявлены различия между штаммами S. typhimurium возбудителя зоонозного и госпитального сальмонеллеза. Большинство штаммов S. typhimurium,. вызывающих пищевую инфекцию, содержат плазмиду вирулентности молекулярной массой 60 MDa, вирулентны для белых мышей и чувствительны к антибиотикам. Штаммы S. typhimurium госпитального происхождения несут коньюгативную R-плазмиду, кодирующую полиантибиотикорезистентность, обладают сниженной вирулентностью для мышей и не имеют плазмиды вирулентности.

Рестрикционный анализ плазмиды массой 60 МБа в комплексе с ПЦР-тестированием на наличие -гена позволил дополнительно

дифференцировать штаммы S. typhimurium зоонозного происхождения на штаммы содержащие плазмиду вирулентности и штаммы содержащие криптические плазмиды той же молекулярной массы.

Полученные результаты доказали действенность использования плазмидных характеристик для внутривидового типирования различных сероваров сальмонелл/Показана высокая эффективность их использования в

системе длительного централизованного микробиологического мониторинга при сальмонеллезах, что позволяет решать конкретные вопросы эпидемиологии: установление генетического родства штаммов сальмонелл, определение значимости доминирующих плазмидоваров в этиологии болезни, установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции и установление эпидемиологической связи заболевания с определенным пищевым продуктом.

Практическая значимость

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- на основе плазмидного анализа разработан метод внутривидового типирования сальмонелл, который используется для централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга за микробом в Приморском крае. Все результаты мониторинга представлены Центрам ГСЭН в Приморском крае в виде 18 выпусков «Ежемесячного информационного бюллетеня о штаммах сальмонелл в Приморском крае»;

- разработаны, утверждены главным государственным санитарным врачом Приморского края и внедрены в практику методические указания «Предэпидемическая диагностика и профилактика госпитального сальмонеллеза»;

- материалы работы используются в учебном процессе- на кафедре инфекционных болезней ВГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы бактерий всех исследованных сероваров в Приморском крае гетерогенны по характеристике выявляемых у них плазмид

2. Штаммы бактерий серовара S. enteritidis разделены на доминирующие и редко выявляемые плазмидовары. Доминирующие плазмидовары характеризуются различной этиологической значимостью, но только по годам, но и по месяцам.

3. Система микробиологического молекулярно-генетического мониторинга, основанная на плазмидных характеристиках штаммов сальмонелл, позволяет осуществлять эффективное слежение за возбудителем.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 2004).

Материалы диссертации представлены и обсуждены на пяти конференциях:

- научно-практической конференции, посвященной 75-летию санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, Владивосток, 1997 год,

- научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах

Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 1998 год,

- 2-й международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с

инфекциями», Санкт-Петербург, 1998 год,

- юбилейной научно-практической конференции, посвященная 50-летию

санитарно-эпидемиологической службы Приморья, Владивосток, 1999

год,

- American Society for Microbiology Conference on Salmonella: Pathogenesis,

Epidemiology, and Vaccine Development, Alghero, Sardinia, Italy, 2003

год. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 научные работы в центральной и региональной печати.

Струю-ура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа представлена на 181 странице текста, включает 30 таблиц и 19 рисунков. Указатель литературы содержит ПО отечественных и 154 иностранных источников.

Собственные исследования

Материалы - и методы исследования

В работе использованы 3020 бактериальных штаммов Salmonell enterica subsp. enterica, принадлежащих к 79 сероварам и относящихся к группам В,

Культуры были изолированы от людей, животных, из пищевых продуктов и объектов окружающей среды в период с 1995 по 2000 г.г. Все штаммы для исследования плазмидного спектра получены в результате принятого решения об организации централизованного микробиологического мониторинга за возбудителями сальмонеллеза, в соответствии с которым культуры сальмонелл, выделенные в крае направлялись в НИИ эпидемиологии и микробиологии для дальнейшего изучения.

Изучение биохимической активности штаммов проводили по общепринятой методике на средах Гисса в соответствии с руководством [103]. Определение антибиотикорезистентности исследуемых штаммов проводили с помощью дисков методом диффузии в агар путем посева суточной бактериальной взвеси исследуемого штамма на чашку со средой АГВ в соответствии с методическими указаниями "Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам" [Ведьмина и др. 1979].

Минимальную-ингибирующую концентрацию (MIC) определяли методом серийных разведений в пробирках с -бульоном по наибольшему их разведению, задерживающему рост микроорганизмов.

Вирулентность штаммов сальмонеллезного микроба определяли по методу А. М. Зарицкого на нелинейных белых мышах с массой тела 12-14 грамм, используя не менее 5 животных на одно исследование с расчетом содержания 5 млрд. мк. кл. в 0,05 мл (доза заражения). За животными наблюдали в течение 14 суток [Зарицкий 1988].

Плазмидный анализ. Выделение плазмидной ДНК для гельэлектрофореза проводили щелочным методом [Kado et al. 1981] Бактериальную массу наращивали в чашках Петри с питательным агаром в течение 18 часов при температуре 37°С. Небольшое количество культуры суспендировали в 20 мкл форезного буфера, добавляли 230 мкл лизирующей смеси (60мг Трис, 6,9 мл дистиллированной воды, 32 мкл ION NaOH, 3 мл 10 % раствора додецилсульфат натрия), прогревали 10 минут при температуре 65°С. Экстракцию белков проводили добавлением 250 мкл смеси фенол-хлороформа в соотношении 1:1. После центрифугирования в течении 10 минут при 14000 об/мин получали плазмидную ДНК в супернатанте. Визуализацию плазмидной ДНК после проведения фореза осуществляли путем окрашивания геля в течение 20 мин бромистым- этидием в концентрации 0,5 мкг/мл и фотографированием результатов электрофореза. Определение молекулярной массы исследуемых плазмид проводили в сравнении с лодвижностью набора известных плазмид (j)VM 82- 82 MDa, Sa - 26 MDa, pCT105- 7.5 MDa, pBR322 - 2.8 MDaX используя компьютерную программу "Restriction fragment sizinig program".

Рестрикционный анализ плазмид. Выделение ДНК проводили по модифицированной методике щелочной денатурации

Микробную массу наращивали в течение 18-20 часов при температуре 37°С, осаждали центрифугированием при 14000 об/мин и осадок ресуспендировали в растворе I (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ Трис, 2 мкг/мл лизоцима, рН 8,0). Затем добавляли 200 мкл раствора II (0,2 М NaOH, 1% SDS) и выдерживали 10 минут при 0°С. После добавления 150 мкл раствора III (3 М ацетат Na, рН-4,8) центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут. Очистку плазмидной ДНК, находящейся в супернатанте, проводили этанолом, и после осаждения центрифугированием растворяли в 15 мкл ТЕ буфера.

Реакцию рестрикции проводили в течение часа при 37°С. Мы использовали 2-3 ВД. активности фермента на 1 мкг исследуемой плазмидной ДНК. После остановки реакции прогреванием при 65°С препарат наносили на гель. Разделение линейных фрагментов плазмидной ДНК вели в 1% агарозном геле в трис-боратной буферной системе в течение 3-5 часов при напряжении Молекулярную массу линейных фрагментов

определяли в сравнении с подвижностью стандартных линейных фрагментов.

Мультиплекс-полимеразная цепная реакция. Праймеры /VjvA-I и invА-2 гибридизовались с фрагментом гена инвазивности, локализованном в структуре островка патогенности сальмонелл в хромосоме в области

63,1 ценгисом (амплифицируемый фрагмент 240 п.о.). Праймеры ipvC-1 и spvC-2 гибридюовались с фрагментом гена spvC,, локализованном1 на плазмиде вирулентности (571 п.о.).

Пробирки помешали в термоциклер Eppendorf Mastercycler Personal (США) со следующей программой:

1) преденатурация при температуре 94°С - 3 минуты,

2) денатурация при температуре 94°С -1 минута,

3) отжиг при температуре 50°С — 1 минута,

4) плавление при температуре 72°С - 1 минута,

5) постплавление при температуре 72°С - 5 минут.

Этапы 2-4 повторялись 35 циклов. Гель-электрофорез проводили в трис-боратной буферной системе в течение 50-60 минут при напряжении 5 V/CM. Визуализацию продуктов полимеразной цепной реакции после проведения фореза осуществляли путем фотографирования результатов электрофореза. Определение молекулярной массы исследуемых продуктов полимеразной цепной реакции проводили в сравнении с подвижностью маркеров молекулярной массы рестрицированная эндонуклеазой ).

Коньюгативный перенос детерминант резистнентности проводили методом простого скрещивания в жидкой питательной среде (Bergjust et al 1982]. В качестве реципиента использовали штамм Ecsherichia coli C600, резистентный к налидиксовой кислоте, что использовалось нами для контрселекции. Отдельные колонии донорного и реципиентного штамма засевали в 2 мл -бульона при соотношении одна донорская клетка на пять реципиентных. Культуры инкубировали при температуре 37°С в течении одного часа. После этого готовили несколько десятикратных разведений и высевали на чашки с добавлением хлорамфеникола, тетрациклина, гентамицина, канамицина, ампициллина, стрептомицина, и налидиксовой кислоты. Через 18-20 часов инкубирования при температуре 37°С на чашках получали колонии трансконъюгантов.

Статистическая обработка количественных результатов. Формулы для статистической обработки взяты из книги И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева «Статистические методы в микробиологических исследованиях» [Ашмарин, Воробьев 1962].

Результаты_и_обсуждение

Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов S. enteritidis в Приморском крае.

В период с 1995 по 2000 годы исследовано 2572 штамма S. enteritidis. В табл. 1 представлены результаты изучения спектра плазмид этих штаммов микроба. Наиболее часто выделяли штаммы 12 плазмидоваров, которые получили название основных. В структуре основных плазмидоваров выделяются три доминирующих плазмидовара со следующим набором

плазмид: 38 МБа; 38 : 1,4 МБа; 38 : 2,3 МБа. Их доля составила 83 % от общего количества штаммов. Наиболее часто изолировались штаммы плазм-

Та блица 1.

Плазмидовары 8. еМегМ^ в Приморском крае в 1995-2000 годах

Количество штаммов

Плазмвдовары микроба (в МЭа) данных плазмидоваров

абс. %

38 748 29,1±0,89

38:1,4 1040 40,4±0,96

38:2,3 348 13,5±0,67

Всего штаммов доминирующих плазмидоваров 38:2,6 2136 75 83±0,57 2,9±0,33

38:2,8 68 2,6±0,31

38:4,2 51 2,0±0,26

38:3,0:1,4 30 1,2±0,21

50:38 :1,4 12 0,5±0,13

38:3,4 10 0,4±0,12

1,4 17 0,7±0,16

2,3 13 0,5±0,13

Бес плазм вдные 48 1,9±0,27

Всего штаммов основных плазмидоваров 2460 95,7±0,39

Редко выявляемые плаз модные варианты (47 плазмидоваров) Итого 112 2572 4,3±0,39 100,0

идовара 38 : 1,4 МБа, впервые появившиеся в 1995 году. Их доля в структуре исследованных культур составила 40,4 %. Вторыми по частоте встречаемости являлись штаммы плазмидовара 38 МБа, на долю которых пришлось 29,1 % исследованных штаммов (различия достоверны, р>0,001). Третьими по частоте встречаемости были штаммы со спектром плазмид 38 : 2,3 МБа. Штаммы данного плазмидного варианта 8. еМегМ^ составили 13,5 °А

Три плазмидовара, отнесенные к основным, по частоте встречаемости являлись примерно равными. Штаммы плазмидовара 38 : 2,6 МБа впервые были изолированы в 1998 году и на его долю пришлось 2,9 % всех исследованных культур. Штаммы плазмидовара 38 : 2,8 МБа изолировались с 1995 г. по 1998 г. и их доля составила 2,6 % Штаммы плазмидовара 38 : 4,2 МБа впервые появились в 1997 году и на их долю пришлось 2,0 % всех исследованных культур. Штаммы остальных плазмидоваров, отнесенных в группу основных, выделялись значительно реже, и их этиологическая значимость в развитии сальмонеллеза колебалась от 0,4 % для штаммов

плазмидовара 38 : 3,4 MDa до 1,2 %у штаммов плазмидовара 38 : 3,0 : 1,4 ^ИВя. Доля бесплазмидных штаммов составила 1,9 %

Отдельную группу составили 49 редко выявляемых плазмидоваров 8. enteritidis. Главная их особенность состоит в том, что штаммы данных плазмидоваров микроба не играли существенной роли в этиологии сальмонеллеза, и на их долю приходится лишь 4,2 % всех исследованных культур.

Следовательно, гетерогенность популяции 8. enteritidis, обусловлена наличием основных и ре.. о выявляемых плазмидоваров микроба. Популяция 8. enteritidis является достаточно стабильной, за счет наличия в ней доминирующих плазмидоваров, выделяющихся ежегодно и объединяющих 83 % всех исследованных штаммов. Степень гетерогенности популяции 8. enteritidis определяется количеством выявленных плазмидоваров микроба - наиболее гетерогенна она была в 1999 г., когда популяция была представлена 11 основными и 17 редко выявляемыми плазмидоварами и наименее гетерогенна в 1996 г. (7 основных и 6 редко выявляемых плазмидоваров).

Таким образом, учитывая, что по своим фенотипическим характеристикам исследованные штаммы 8. enteritidis, вне зависимости от года, места и источника выделения, представляют собой, за небольшим исключением, однородную группу, плазмидный анализ можно считать эффективным методом внутривидового типирования микроба. Данный метод позволяет изучить следующие характеристики популяции: гетерогенность её, обусловленную наличием основных и редко выявляемых плазмидоваров; ежегодно меняющуюся степень её гетерогенности; стабильность, определяемую ежегодным выделением доминирующих плазмидоваров и ее изменчивость, выражающуюся соотношением плазмидоваров в структуре популяции.

Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов S. typhimuгium в Приморском крае.

8. typhimurium является вторым по значимости сероваром в этиологии сальмонеллеза в Приморском крае. За период с 1995 по 2000 годы исследовано 208 штаммов 8. typhimurium, изолированных из различных источников. Плазмидный анализ выявил высокую степень гетерогенности штаммов данного серовара. В табл. 2 представлены результаты изучения спектра плазм ид в штаммах 8. typhimurium. В этот период изолировались два варианта микроба - штаммы, выделенные при зоонозном типе инфекции (39,4 %), в основном содержащие плазмиду с молекулярной массой 60 MDa, и штаммы, выделенные при нозокомиальном типе инфекции, характеризующиеся присутствием высокомолекулярной плазмиды 80 MDa (60,6 %). Первая группа штаммов вызывала обычную пищевую сальмонел-лезную инфекцию, тогда как вторая группа штаммов выделена в основном в

период вспышек госпитальной сальмонеллезной инфекции в Центральной Городской больнице г. Находка в 1995-1997 годах.

Среди S. typЫmurшm, выделенных при зоонозном типе инфекции, штаммы, содержащие плазм иды, составили 92,7 % от всех исследованных культур, причем, серовароспецифическая плазмида массой 60 MDa выявлена у 74,4 % изолятов. Наиболее часто выделялись штаммы с одной плазмидой 60 MDa (31,7 %). Вторыми по частоте выделения оказались штаммы плазми-

Таблица 2

Плазмидная характеристика штаммов S. typhimurium

Количество штаммов данных

Плазмвдовар (МЭа) плазм идовара

Всего %±ш

60 26 31.7 ±5.1

60:2,4 4 .4,9 ±0,7

60:1.9 3 ' 3,7 ±2.0

60 :30 :1,9 4 4,9 ±0,7

60 :40 :4,0 2 2,43 ±1.6

60 :2,4 :2,3 9 11,0 ±3,45

60:2,3 2 2,43 ± 1,6

60:1,6 1 1 / 1,21 ± 1,2 1,21

60:4,2 3 3,7 ±2,0

Другие (15шшмвдоваров) 22 28,05± 4,2

Бе с плазм ид ные 6 7,3 ±2,8

Всего 82 100

80 :40 :4.8 106 84,1±33

80 :60 :40 :4,8 3 " 2,4 ± 1.3

80:40 3 2.4 ± 1,3

80 :40 :4,8 :3,0 1 0,8 ±0,7

80 :50 :40:4.8 7 5,5 ± 2,0

80 :40 :30 :4,8 1 0,8 ±0,7

80 1 0,8 ± 0,7

80:2,7 1 0,8 ±0.7

80 :7,0 :4,8 1 0,8 ±0,7

70:40 : 4,8 1 0,8 ± 0,7

80:4,9 1 0,8 ±0,7

Всего 126 100

Итого... 208

довара 60 : 2,4 : 2,3 MDa, впервые появившиеся в 1998 году (11,0 %). Штаммы остальных плазмидоваров выделялись редко. Большинство штаммов зоонозного происхождения были чувствительными к антибиотикам и вирулентными для белых мышей при пероральном заражении.

Среди госпитальных доминировали штаммы плазмидовара 80 : 40 : 4,8 MDa, доля которых составила 84,1 % от исследованных культур. Доля

штаммов плазмидовара 80 : 50 : 40 : 4,8 MDa, изолированных в 1996 году, в структуре госпитальных штаммов составила 5,5 %. Штаммы остальных плазмидоваров играли в этиологии болезни незначительную роль, и на их общую долю пришлось 10,3 % Изучение фенотипических признаков госпитальных штаммов показало их множественную устойчивость к антибиотикам и слабую вирулентность для белых мышей при пероральном заражении. Плазмида массой 80 MDa у госпитальных штаммов является конъюгативной плазмидой резистентности, определяющей устойчивость к ампициллину, карбенициллину, хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину, гентомицину и канамицину (частота конъюгации - 104).

Для оценки генетического родства зоонозных штаммов использован рестрикционный анализ плазм иды массой 60 MDa (рис. 1). Выяснилось, что ДНК плазмид молекулярной массой 60 MDa имеет различную структуру и дифференцирована на три типа (А, В и С). Следовательно, рестрикционный анализ плазмид, молекулярная масса которых близка к 60 MDa, имеет значение для внутривидового типирования S. typЫmurшm, так как позволяет дифференцировать штаммы микроба, содержащие плазмиды близкие по молекулярной массе, но различающиеся по типу рестрикционного профиля.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Электрофоретическое разделение в 1 %агарозном геле фрагментов, образующихся при расщеплении рестриктазой EcoRI ДНК плазмиды 60 MDa

из штаммов S. typhimurium различных плазмидоваров 1, 3, 6,7 - фрагменты ДНК плазмид, (тип А); 2 - фрагменты ДНК гшазмиды, (тип С); 4, 5 - фрагменты ДНК плазмид, (тип В).

Для определения принадлежности к плазмиде вирулентности плазмид, обнаруживших разные типы рестрикционных профилей, изучено присутствие в них 5/>уС-геид с помощью ПЦР, где праймеры были подобраны к фрагменту ,т/л.'С-гена. В исследуемых штаммах плазмидоваров 60 MDa и 60

: 1,6 МБа, содержащих плазм иды 60 МБа с рестрикционным профилем типа А, амплифицируется фрагмент 5/п-'С-гена (571 п.о.). Следовательно, такая плазмида является плазмидой вирулентности. У штаммов с плазмидами 60 МБа, обладающими рестрикционным и профилями типа В и С, специфический ампликон отсутствовал, плазмиды этих штаммов не содержат ¡руС-евт и не являются плазмидой вирулентности. Исследование вирулентности в штаммах, несущих плазмиды с различным рестрикционным профилем, показало, что вирулентными оказались только штаммы несущие плсзмиды с рестрикционным профилем типа А.

Таким образом, основными особенностями штаммов зоонозного происхождения являются наличие плазмиды вирулентности массой 60 МБ и, как следствие, их высокая патогенность для белых мышей, а также их чувствительность к антибиотикам. Для госпитальных штаммов характерна сниженная вирулентность для белых мышей, обусловленная отсутствием плазмиды вирулентности, и наличие коньюгативной Е-плазмиды массой 80 МБа, обеспечивающей полиантибиотикорезистентность.

Плазмидный анализ штаммов 8. 1урЫтигшт позволил выявить гетерогенность их по плазмидному профилю и установить, что госпитальным штаммам присущи специфические плазмидные профили, отличающиеся от плазмидных профилей штаммов зоонозного происхождения. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, в совокупности с тестированием -гена позволил дифференцировать плазмиду вирулентности у штаммов зоонозного происхождения от криптических плазмид с одинаковыми молекулярным и массам и.

Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл в Приморском крае.

В Приморском крае в этиологии сальмонеллезов доминируют два серовара сальмонелл - 8. е^егШ^ и 8. 1урЫтигшт. Доля остальных сероваров, которые мы назвали редко выявляемыми, невелика и не превышает 7,9 % Однако наше внимание привлекло разнообразие таких сероваров. С 1995 и по 2000 гг. на территории Приморского края изолировано 240 штаммов сальмонелл, принадлежащих к 77 сероварам. Хотя число заболеваний, связанных с редко выявляемыми сероварам и, невелико, их выделение представляет эпидемиологический интерес, прежде всего, в плане установления возможных факторов передачи инфекции. Все серовары сальмонелл разделены на две группы: к первой группе мы отнесли 40 сероваров микроба, каждый из которых был представлен только одним штаммом микроба. Вторую группу составили штаммы 37 сероваров, каждый из которых представлен несколькими изолятами - от 2 до 21 (штаммов). Целью нашего исследования являлось изучение штаммов редко выявляемых сероваров, их фенотипических характеристик и спектра плазмид для выбора наиболее обоснованного метода их внутривидового типирования.

Из 40 единичных штаммов различных сероваров сальмонелл 26 (65%) содержали плазм иды, различные по молекулярной массе. Чаще всего эти штаммы содержали одну плазмиду массой от 2,2 MDa до 71 MDa.

Больший интерес представляют те серовары сальмонелл, которые представленые двумя и более культурами. Они разделены на три группы: выделенные только от людей, только из пищевых продуктов и объектов окружающей среды и смешанная группа, в которой штаммы одного серовара изолированы от людей и из продуктов. Плазм иды содержали 79,5 % штаммов сероваров, изолированных от людей. Все штаммы, относящиеся к серозарам

имеют индивидуальные

наборы плазмид. Напротив, все штаммы или часть из них сероваров S. braenderup, S. galiema, S. colindale, S. narashino, S. emek и S. paris, обладали однотипным спектром плазмид, но их наборы у каждого серовара были индивидуальными.

Из 40 штаммов сальмонелл, выделенных только из пищевых продуктов 85 % содержали плазмиды и оказались гетерогенными по спектру плазмид. Как и в первой группе, штаммы, выделенные из пишевых rOQUXKTOB имели как индивидуальный набор плазмид (S. schwarzengrund, S. bochum, S. Oranienburg, S. kentucky), так и сходный плазмидный спектр у штаммов одного серовара (S. massenya, S. virchow, S. panama, S. amager). Каждый из 21 серовара третьей группы, выделенные из пищевых продуктов и окружающей среды и от людей, представлен различным количеством культур - от 4 до 21. Плазмиды содержали 99 из 126 (78,6 %) исследованных штаммов этой группы. Штаммы этих сероваров также оказались гетерогенны по составу плазмид. Внутри сероваров штаммы были дифференцированы на плазмидовары - от 2 до 10.

Таким образом, исследование штаммов сальмонелл редко выявляемых сероваров показало, что большинство изолятов содержали различное количество плазмид, представленных элементами с различной молекулярной массой. Штаммы всех сероваров сальмонелл оказались гетерогенными по составу плазмид, что позволило дифференцировать внутри сероваров микроба плазмидные варианты.

Учитывая, что по своим фенотипическим характеристикам исследованные штаммы сальмонелл представляют собой, за небольшим исключением, однородную группу, плазмидный анализ можно считать высоко эффективным методом внутривидового типирования всех редко выявляемых сероваров микроба.

Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг за возбудителями сальмонеллеза

Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг приобретает особую значимость при решении научных и прикладных вопросов эпидемиологии: установлении источников и факторов передачи

возбудителей инфекции, выявлении или исключении эпидемиологических связей между случаями заболеваний, дифференциации завозных и местных штаммов, расшифровке механизмов формирования очагов болезни [Хазенсон и др. 1996]. Теоретическое обоснование систематического мониторинга построено на клональной концепции структуры популяции бактерий [Selander 1987, Шубин 1997, Шагинян 2000]. В соответствии с этой концепцией динамический мониторинг ведется не просто за определенным видом патогенного микроба, а за динамическим изменением клоновой структуры его популяции. Изучение. штаммов сальмонелл, изолированных на территории Приморского края, показало их фенотипическую однородность. Следовательно, штаммы, имеющие идентичный плазмидный спектр, могут быть генетически близкородственными и представлять собой отдельные клоны клеток. Наши исследования направлены, прежде всего, на изучение генетического родства штаммов сальмонелл доминирующих плазмидных вариантов микроба. Известно, что плазмида вирулентности с

молекулярной массой 38 MDa является высоко консервативно [Mills et а! 1995, Ревина 1998]. Естественен вопрос о родстве более мелких, критических плазмид с одинаковой молекулярной массой в различных штаммах микроба. Установлено, что расщепление плазмиды массой 1,4 MDa, ведет к образованию четырех фрагментов, идентичных во всех штаммах плазмидовара 1,4 MDa (рис.2, дорожки 1-3). Фрагменты такой же массы выявлены в виде ярких полос при рестрикции суммарной плазмидной ДНК

Рис. 2. Электрофоретическое разделение в 1,7 %агарозном геле фрагментов, образующихся при расщеачении рестриктазой TagI ДНК плазмид из штаммов 8. еП:ег1Ш18 плазмидоваров 1,4 МБа; 38 : 1,4 МБа; 2,3 МБа и 38 : 2,3 МБа.

га штаммов плазмидовара 38 : 1,4 МБа на фоне более бледных фрагментов

плазмиды 38 МБа (дорожки 4 - 7). Подобные же результаты получены при анализе плазмид массой 2,3 МБа из штаммов плазмидовара 2,3 МБа (дорожки 9-11) и 38 : 2,3 МБа (дорожки 12-13). Представленные результаты позволяют говорить об идентичности плазмид 1,4 МБа в штаммах плазмидоваров 1,4 МБа и 38 : 1,4 МБа и плазмид 2,3 МБа в штаммах соответствующих им плазмидоваров. Таким образом, можно говорить о клональном происхождении штаммов 8. еМегШШз плазмидовара 38 : 1,4 МБа. Подобный же вывод можно сделать и в отношении штаммов плазмидовара 38 :2,3 МБа.

Существование в структуре популяции 8. еМегШ&з в Приморском крае трех доминирующих плазмидоваров, маркированных плазмидами 38 МБа; 38 : 1,4 МБа и 38 : 2,3 МБа, играющих основную роль в этиологии инфекции, поставило вопрос о мониторинге их значимости в развитии болезни на протяжении всего периода наших наблюдений за микробом. Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров подвержена не только годичной изменчивости, но она может меняться и по месяцам. Помесячный анализ штаммов доминирующих плазмидоваров выявил несколько типов их этиологической значимости. На рис. 3 представлен первый тип этиологически значимости штаммов 8. еМегШШз, для которого характерно преобладание двух плазмидоваров. Такой же этиологический тип популяции прослеживался, помимо 1998 года и в 1995, 1996 и 1997 г.г. Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров в 1999 г. выглядит несколько иначе (рис. 4). В течение этого года в этиологии болезни 8. ейегШШз преобладал только один плазмидовар.

—ста«

-38 МОа.....38 14 МОа 38 2 3 МОа

Рис. 3. Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров 8. еМегШШз в Приморском крае в 1998 г (п==492).

Третий этиологический тип популяции 8. еМегШШз, где роль всех трех доминирующих плазмидоваров значительна и вариабельна по месяцам,

выявлен в 2000 г. и представлен на рис. 5. Штаммы 8. е^егШШв плазмидовара 38 МБа играли наиболее значимую роль в этиологии инфекции в мае, составив 35,5±4,6 % Штаммы плазмидовара 38 : 1,4 МБа преобладали в этиологии болезни в январе, апреле и в период с августа по октябрь, когда их роль была достоверно выше значимости плазмидовара 38 : 2,3 МБа (р-0,05). Штаммы плазмидовара 38 : 2,3 МБа преобладали в феврале и июне, когда их этиологическая значимость в эти месяцы была несколько больше остальных доминирующих плазмидоваров и составила 34,9±7,3% и 39,0±5,4

Рис. 4. Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров 8. еп1егШ(Ив в Приморском крае в 1999г Гп==461).

% соответственно.

г«

-38 МС>а.....38 14 МОа —38 2.3 Ша

Рис. 5. Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров 8. еПегШ^ в Приморском крае в 2000 г (п=497).

Проведенные исследования позволяют высказать следующие обобщения. Длительный централизованный микробиологический мониторинг за возбудителем позволил получить данные об этиологической значимости доминирующих плазмидоваров микроба, которые характеризуется изменчивостью этиологической роли каждого из

плазмидоваров не только по годам, но и по месяцам. Выявлено три типа участия плазмидоваров в этиологии болезни: при первом типе в течение года имеет место преобладание значимости двух плазмидоваров микроба; второй тип характеризуется увеличением роли одного из плазмидоваров на фоне сниже-ния значимости двух других; для третьего типа характерно участие в этиологии болезни всех трех плазмидоваров с периодическим увеличением роли каждого из них.

Возможность использования плазмидного анализа для установления связи заболевания с определенным пищевым продуктом прослежена на примере штаммов Salmonella редко выявляемых сероваров. Идентичность плазмидного спектра штаммов сальмонелл позволила связать заболеваемость людей с рядом пищевых продуктов. Два плазмидовара S. saint-paul были общими для людей и продуктов. От больных в апреле 1997 г. были выделе ны штаммы S. saint-paul с плазмидным спектром 38 : 2,1 : 1,4 MDa (рис.6, дорожка 6). В июне этого же года из фарша индюшки и куриных окороков были выделены культуры с идентичным набором плазм ид (рис 6., дорожка 4). Второй плазмидовар 1,7 : 1,4 MDa S. saint-paul связал штаммы, изолированные в 1999 г. от индюшки и от больных (рис .6, дорожка 8).

123456789

Рис. 6. Электрофореграмма некоторых плазмидоваров S. saint-paul

Плазмидный профиль 55 : 2,6 MDa связал три штамма S. heidelberg, выделенные из фарша индюшки (2 штамма), и штамм, изолированный 2 месяца спустя от больного. Штамм S. heidelberg, выделенный из куриных окорочков, нес единственную плазмиду с молекулярной массой 2,0 MDa, как и штамм, изолированный от больного. Два штамма S. glostrup, выделенные из фарша индюшки в п. Тернее в 1997 и 1998 годах имели одинаковый плазмидный профиль, со штаммом изолированным от больного

во Владивостоке в 1999 г. Аналогично плазмидовар 130 : 1,4 MDa объединил штаммы S. anatum, выделенные из фарша индюшки и от больного.

Наличие эпидемиологической связи заболеваний людей с фаршем индюшки, куриными и индюшачьими окороками подтверждается

совпадением времени их выделения от больных и из пищевых продуктов и генотипическим. родством штаммов микроба. Учитывая, что большинство штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, обнаружено в крае впервые, а также тот факт, что штаммы этих сероваров выделяются только из поставляемой в край мясной продукции, можно полагать, что штаммы сероваров сальмонелл, выделенных только от людей, также завезены в край с еще не установленными пищевыми продуктами.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности плазмидного анализа для внутривидового туширования редко выявляемых сероваров сальмонелл, и возможности его использования для установления эпидемиологической связи заболевания с определенными пищевыми продуктами в процессе длительного централизованного микробиологического мониторинга при сальмонеллезах..

Обоснование возможности построения1 длительного

централизованного микробиологического мониторинга за сальмонеллезами на основе плазмидных характеристик микроба получено также при изучении-шести вспышек сальмонеллеза с общим числом заболевших 244 человека. В соответствии с плазмидной характеристикой. S. enteritidis по две вспышки были вызваны штаммами плазмидоваров 38 : 1,4 MDa и 38 MDa и по одной вспышке - штаммами плазмидоваров 38 : 2,6 MDa и 38 : 2,3 MDa. Во всех-случаях штаммы микроба, выделенные. от больных и предполагаемых, факторов передачи инфекции, относились к идентичному плазмидовару. Подобные же результаты были получены при анализе 37 семейных очагов сальмонеллеза с общим числом заболевших 81 человек. Несмотря на то, что в этиологии инфекции в различных очагах принимали участие штаммы всех основных плазмидоваров, в каждом конкретном очаге штаммы, выделенные от больных, были идентичны по профилю плазм ид.

Таким образом, применение плазмидного анализа в системе длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга выявило его высокую эффективность при* решении конкретных вопросов эпидемиологии: установлении генетического родства штаммов сальмонелл, определении значимости доминирующих плазмидоваров в этиологии болезни, установлении источников и факторов передачи возбудителей инфекции.

Выводы

1. Плазм иды содержат большинство штаммов всех сероваров сальмонелл, при этом штаммы несут от одной до пяти плазмид молекулярной массой от 0,8 MDa до 130 MDa. Популяции бактерий Salmonella enterica subsp. enterica всех исследованных сероваров гетерогенны по характеристике выявляемых у них плазмид и характеризуется значительным количеством плазмидоваров микроба у каждого из сероваров.

2 Штаммы каждого из изученных сероваров Salmonella enterica subsp. entenca, принадлежащие к одному плазмидовару, представляют собой однородную группу по биохимической активности и антибиотикорезистентности.

3. Популяция S. enteritidis в Приморском крае характеризуется наличием доминирующих плазмидоваров - 38 MDa, 38 : 1,4 MDa, 38 : 2,3 MDa. Штаммы доминирующих плазмидоваров S. enteritidis помимо плазмиды вирулентности 38 MDa, содержат и низкомолекулярные плазмиды - 1,4 MDa в плазмидоваре 38 : 1,4 MDa и 2,3 MDa - в 38 : 2,3 MDa. Идентичность низкомолекулярных плазмид одинаковой молекулярной массы в штаммах данных плазмидоваров вне зависимости от места, времени и источника выделения подтверждает клональность происхождения этих плазмидоваров.

4. Динамический мониторинг за сальмонеллами выявил вариа-бельность значимости доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в этиологии инфекции не только по годам, но и по месяцам. Установлено три типа их участия в этиологии болезни, характеризующиеся преобладанием в течение года одного, двух или всех трех плазмидоваров.

5. Установлено существование различий между штаммами S. typhimurium возбудителями пищевой и госпитальной инфекции. Большинство штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения характеризуются наличием плазмиды вирулентности массой 60 MDa и, как следствие, их высокой патогенностью для белых мышей, а также чувствительностью к антибиотикам. Для госпитальных штаммов характерна сниженная вирулентность для белых мышей, обусловленная отсутствием плазмиды вирулентности, и наличие коньюгативной R-плазмиды массой 80 MDa, обеспечивающей полиантибиотикорезистентность.

6. Штаммы S. typhimurium зоонозного происхождения дополнительно дифференцируются с помощью рестрикционного анализа плазмид в комплексе с ПЦР-тестированием spvC-гена на штаммы, содержащие плазмиду вирулентности, и штаммы с криптической плазмидой такой же молекулярной массы.

7. Установлена высокая эффективность длительного централизованного микробиологического мониторинга за сальмонеллами, основанного на анализе их плазмидных характеристик. Осуществление мониторинга позволяет оценивать этиологическую значимость доминирующих плазмидоваров; проводить дифференциацию возбудителей, вызывающих госпитальную и пищевую сальмонеллезную инфекцию; устанавливать источники и факторы передачи инфекции.

Список работ опубликованных по теме диссетрации

1. Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Кузнецова НА, Нечаева Т.В., Хорошевская Ю.Н., Долотов В.Л., Шубин Ф.Н. Плазмидная

характеристика сероваров сальмонелл, редко выявляемых в Приморском крае // «Вопросы региональной гигиены, санитарии и эпидемиологии». Респ. сб. науч. работ, Якутск, 1997, С. 197-198.

2. Гребенькова Л.К., Кошелева Н.Г., Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И. О роли молекулярно-генетического мониторинга за возбудителями сальмонеллеза в расшифровке внутрибольничной заболеваемостив центральной городской больнице г. Находки. // «Актуальные проблемы гигиены, эпидемиологии и санитарно-эпидемиологического надзора в Приморском крае» Мат. науч. практ. конф., посв. 75-летию сан. эпид. службы РФ, Владивосток, 1997, С. 109-110.

3. Ковальчук Н.И., Шубиь Ф.Н., Хорошко В.А., Шевердина Ф.Н., Тарасенко Т.Т., Кошелева Н.Г. Сравнительная характеристика сероваров сальмонелл, редко выявляемых в Приморском крае // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1997, №5, С88-91.

4. Ковальчук Н.И., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Хорошко В.А., Кошелева Н.Г., Долотов В.Л., Тарасенко Т.Т., Шубин Ф.Н. Редко выявляемые серовары сальмонелл в Приморском крае, их плазмидная характеристика и эпидемиологическое значение. // «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Тез. докл. науч. конф., Новосибирск, 1998, С.44-45.

5. Ковальчук Н.И., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Шубин Ф.Н. Плазмидовары S.enteritidis в Приморском крае. // «Проблемы, инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Тез. докл. науч. конф., Новосибирск, 1998,С.45-46.

6. Кузнецова Н.А., Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Тарасенко Т.Т., Кошелева Н.Г. Эпидемиологическая значимость различных плазмидоваров S.enteritidis в Приморском крае. // «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Тез. докл. науч. конф., Новосибирск, 1998, С.47-48.

7. Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Белоголовкина Н.А., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Музыко И.В., Иванов А.В., Полежаева В.Г. Молекулярная эпидемиология сальмонеллеза, вызванного S. typhimurium в Приморском крае. // «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Тез. докл. науч. конф., Новосибирск, 1998, С.85.

8. Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Кузнецова Н.А., Шубин Ф.Н. Плазмидовары S.enteritidis и их фенотипические особенности. // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» Тез. докл. 2-й межд. конф., Санкт-Петербург, 1998,СЛ36.

9. Ковальчук Н.И., Шубин Ф.Н., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Хорошко В.А., Тарасенко Т.Т. Плазмидная характеристика сероваров сальмонелл, редковыявляемых в Приморском крае и их

эпидемиологическое значение. // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» Тез. докл. 2-й межд. конф., Санкт-Петербург, 1998, С.136.

10. Кузнецова Н.А., Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Тарасенко Т.Т. Молекулярная эпидемиология сальмонеллеза, вызванного различными плазмидоварами S.enteritidis в Приморском крае. // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» Тез. докл. 2-й межд. конф., Санкт-Петербург, 1998, С. 137.

11. Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Белоголовкина К А. Ревина Г.В., Кузнецова НА, Кошелева Н.Г., Музыко И.В., Баранова И.О. Молекулярная эпидемиология госпитального сальмонеллеза, вызванного S. typhimuiium в Приморском крае. // «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» Тез. докл. 2-й межд. конф., Санкт-Петербург, 1998, С. 151.

12. Ковальчук Н.И., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Сырцова Н.А. Плазмидная характеристика S.enteiitidis в Приморском крае и ее связь с заболеваемостью населения. // Мат. юб. науч. практ. конф., поев. 50-летию сан.-эпид. службы Приморья, Владивосток, 1999, С.261-262.

13. Гребенькова Л.К., Кузнецова НА, Ковальчук Н.И., Шубин Ф.Н., Маслов Д.В., Толдинов СА, Ковбасюк А.Н., Полевикова Н.Я. Территориальное распределение основных плазмидоваров S.enteritidis в Приморском краею // Мат. юб. науч. практ. конф., поев. 50-летию сан.-эпидем. службы Приморья, Владивосток, 1999, С.263-264.

14. Кузнецова НА, Ковальчук Н.И., Тарасенко Т.Т., Хорошко В.А., Ревина Г.В., , Гребенькова Л.К., Шубин Ф.Н. Сезонная динамика этиологической значимости плазмидоваров S.enteiitidis в заболеваемости населения в Приморском крае. // Мат. юб. науч. практ. конф., поев. 50-летию сан.-эпид. службы Приморья, Владивосток, 1999, С.264-265.

15. Кузнецова НА, Тутубалина Г.Н., Ковальчук Н.И., Терех А.П., Шубин Ф.Н. Значение S. enteritidis в этиологии госпитального сальмонеллеза в г. Владивостоке. // Мат. юб. науч. практ. конф., поев. 50-летию сан.-эпид. службы Приморья, Владивосток, 1999, С.269-270.

16. Кошелева Н.Г., Ковальчук Н.И., Кузнецова НА, Гребенькова Л.К., Маслов Д.В., Иванов А.В., Левина Л.Н., Шубин Ф.Н. О механизмах формирования очага госпитального сальмонеллеза в г. Находке. // Мат. юб. науч. практ. конф., поев. 50-летию сан.-эпид. службы Приморья, Владивосток, 1999,С.270-271.

17. Кузнецова Н.А., Раков А.В., Ковальчук Н.И., Гребенькова Л.К., Кошелева Н.Г., Шубин Ф.Н. Эпидемиологический анализ внекишечного сальмонеллеза, вызванного S. enteiitidis. // Тихоокеанский медицинский журнал, 2001, № 2, С. 122-123.

18. Кузнецова Н.А., Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Тарасенко Т.Т., Сырцова Н.А. Особенности молекулярной эпидемиологии сальмонеллеза, вызванного различными плазмидоварами S. enteritidis. // Тихоокеанский медицинский журнал, 2001, № 2, С. 123.

19. Кузнецова Н.А., Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Белоголовкина Н.А., Гребенькова Л.К., Кошелева Н.Г. Значение основных плазмидоваров S. enteritidis в заболеваемости населения г. Владивостока. // Тихоокеанский медицинский журнал, 2001, № 2, С. 123.

20. Ра.:ов А.В., Шубин Ф.Н., Иванис В.А., Кузнецова К А., Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Гребенькова Л.К. Сравнительная характеристика сальмонеллеза, вызванного различными плазмидоварами Salmonella enteritidis. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, № 5, С.50-54.

21. Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Кузнецова Н.А., Ревина Г.В., Раков А.В., Белоголовкина Н.А., Нечухаева Е.М. Микробиологический мониторинг за Salmonella enteritidis в Приморском крае. Фенотипическая и плазмидная характеристика возбудителя. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2002, № 1, С.36-40.

22. Шубин Ф.Н., Кузнецова Н.А., Ковальчук Н.И., Ревина Г.В., Кошелева Н.Г., Тарасенко Т.Т., Гребенькова Л.К. Микробиологический мониторинг за Salmonella enteritidis в Приморском крае. Характеристика заболеваемости, вызванной различными плазмидоварами микроба в г. Владивостоке. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2002, №1, С.40-43.

23.Kovalchuck N., Shubin F. Main plasmid variants Salmonella Enteritidis and their etiological value. // Abstracts of the American Society for Microbiology Conference on Salmonella: Pathogenesis, Epidemiology, and Vaccine Development, September 20 - 24, Alghero, Sardinia, Italy, 2003.

24. Kovalchuck N., Shubin F. Etiological value rarely detected Salmonella serovars. // Abstracts of the American Society for Microbiology Conference on Salmonella: Pathogenesis, Epidemiology, and Vaccine Development, September 20 - 24, Alghero, Sardinia, Italy, 2003.

Подписано к печати 21.04.2004 г. Формат 60x84/16. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 29.

$•94 65

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковальчук, Наталья Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Характеристика бактерий рода Salmonella.

1.1. История открытия.

1.2. Классификация.

1.3. Биологическая характеристика сальмонелл.

1.4. Антигенная структура и серологическая идентификация.

1.5. Вирулентность.

Глава 2. Внутривидовое типирование.

2.1. Фенотипические методы внутривидового типирования.

2.1.1. Биотипирование.

2.1.2.0пределение антибиотикограммы.

2.1.3. Фаготипирование.

2.2. Генотипические методы внутривидового типирования.

2.2.1. Плазмидный анализ.

2.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле.

2.2.3. Риботипирование.

2.2.4. ПЦР-генетическое типирование.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Материалы исследования.

3.2. Методы исследования.

Глава 4. Фенотипическая и плазмидная характеристика S. enteritidis в Приморском крае

4.1. Плазмидная характеристика S. enteritidis

4.1.1. Плазмидная характеристика популяции S. enteritidis в различные годы наблюдения

4.2. Фенотипическая характеристика плазмидоваров Б. еШегШсНБ.

4.2.1. Биохимическая активность штаммов Б. егиегШсИз.

4.2.2. Антибиотикорезистентность штаммов 8. егЛегШсНэ.

4.2.2.1. Я-плазмиды штаммов 8. ег^егШсНз.

4.3. Характеристика штаммов Б. егйегШсПз, не содержащих плазмиду вирулентности.

Глава 5. Фенотипическая и плазмидная характеристика 8. 1урЫтигшт в Приморском крае.

5.1. Плазмидная характеристика 1урЫшигшш.

5.1.2. Структурная характеристика плазмиды 60 МОа штаммов Б. 1урЫтипшп, выделенных при зоонозном типе инфекции.

5.1.3. Функциональная характеристика плазмиды 60 МБа штаммов Б. 1урЫтипшп, выделенных при зоонозном типе инфекции.

5.2. Фенотипическая характеристика 8.1урЫтигшт.

5.2.1. Биохимическая активность штаммов 8.1урЫшипиш.

5.2.2. Вирулентность штаммов 1урЫтипит, возбудителей зоонозного и нозокомиального сальмонеллеза

5.2.3. Антибиотикорезистентность штаммов 8.1урЫшигшш.

5.2.3.1. Я-плазмиды штаммов 8.1урЫшигшш.

Глава 6. Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл в Приморском крае.

6.1. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, выделенных в единичном экземпляре.

6.2. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, представленных несколькими культурами.

Глава 7. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг за возбудителями сальмонеллеза.

7.1. Мониторинг генетического родства штаммов S. enteritidis, на основе рестрикционного анализа криптических плазмид с малой молекулярной массой.

7.2. Мониторинг этиологической значимости плазмидоваров S. enteritidis.

7.3. Установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции в процессе микробиологического мониторинга на примере редко выявляемых сероваров сальмонелл.

7.4. Использование плазмидных характеристик в организации микробиологического мониторинга за сальмонеллезами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе"

Изучение этиологической структуры сальмонеллезов и сероварного пейзажа сальмонелл у людей и животных позволяет решать один из ключевых вопросов эпидемиологии сальмонеллезов - выявить основные источники и факторы передачи возбудителей инфекции.

Микробиологическому мониторингу, как важнейшей части эпидемиологического надзора за сальмонеллезом, всегда уделялось важное внимание. Обычно для типирования возбудителей сальмонелл еза применяют биохимические методы, фаготипирование, определение устойчивости или чувствительности к антибиотикам. Помимо некоторых преимуществ, которые свойственны этим методам (простота и достаточная оперативность), они имеют ряд существенных недостатков, связанных с тем, что основаны на регистрации фенотипических признаков. В настоящее время известно, что фенотип возбудителей бактериальных инфекций подвержен значительной вариабельности, а это снижает эффективность внутривидового типирования исследуемых штаммов микробов. В связи с этим разработка эффективных методов внутривидового типирования возбудителей сальмонелл еза является весьма актуальной.

В последние годы для внутривидового типирования сальмонелл широко применяются молекулярно-генетические методы, среди которых наиболее распространенным является плазмидный анализ. Этот метод в комплексе с рестрикционным анализом очищенных плазмидных ДНК является наиболее удобным и широко используемым методом оценки геномного полиморфизма сальмонелл. Он основан на относительной консервативности плазмид и стабильности наследования их в процессе культивирования микробов. Сущность его заключается в изучении плазмидных профилей (спектра плазмид) у штаммов микроба. Применение плазмидного анализа позволяет дифференцировать отдельные серовары сальмонелл на плазмидные варианты (плазмидовары), что открывает перспективу для изучения структуры популяции микроба, фенотипических и генотипических характеристик отдельных плазмидоваров возбудителя [16].

Цель исследования

Задачи исследования

1. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов Б. е^егШсИБ, циркулирующих в Приморском крае.

2. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов Б. 1урЫтигшт, вызывающих два; типа инфекции — зоонозный и антропонозный.

4. Изучить генотипическое родство штаммов доминирующих плазмидоваров Б. е^егШШБ на основе рестрикционного анализа мелких криптических плазмид и генотипическое родство штаммов Б. 1урЫтигшт зоонозного происхождения на основе рестрикционного анализа плазмиды массой 60 МБа.

5. Выяснить возможность использования плазмидного анализа в комплексе с рестрикционным анализом отдельных плазмид и ГЩР-диагностикой' плазмид вирулентности в системе длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга при сальмонелл езе.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

По наличию плазмид все штаммы Б. егЛегШсНБ были распределены на 59 плазмидоваров. Выявлены доминирующие; и редко выявляемые плазмидовары Б. ег^егШсЦэ. Выяснено, что доминирующие плазмидовары характеризуются различной этиологической значимостью, способной изменяться не только ежегодно, но и по месяцам.

Выявлены различия между штаммами 8. 1урЫтигшт возбудителя зоонозного и госпитального сальмонеллеза. Большинство штаммов Б. 1урЫтипит, вызывающих пищевую инфекцию, содержат плазмиду вирулентности молекулярной массой 60 1УГОа, вирулентны для белых мышей и чувствительны к антибиотикам. Штаммы Б. 1урЫшигшш госпитального происхождения несут коньюгативную Я-плазмиду, кодирующую полиантибиотикорезистентность, обладают сниженной вирулентностью для мышей и не имеют плазмиды вирулентности.

Рестрикционный анализ плазмиды массой 60 МБа в комплексе с ПЦР-тестированием на наличие БруС-гена позволил дополнительно дифференцировать штаммы Б. 1урЫтигшт зоонозного происхождения, содержащие плазмиду вирулентности и штаммы содержащие криптические плазмиды той же массы.

Полученные результаты доказали действенность использования плазмидных характеристик для внутривидового типирования различных сероваров сальмонелл. Показана высокая эффективность их использования в системе длительного централизованного микробиологического мониторинга при сальмонеллезах, что позволяет решать конкретные вопросы эпидемиологии: установление генетического родства штаммов сальмонелл, определение значимости доминирующих плазмидоваров в этиологии болезни, установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции и установление эпидемиологической связи заболевания с определенным пищевым продуктом.

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость работы состоит в том, что:

- материалы работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней ВГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы бактерий всех исследованных сероваров гетерогенны по характеристике выявляемых у них плазмид

2. Штаммы бактерий* серовара Enteritidis разделены на доминирующие и редко выявляемые плазмидовары. Доминирующие плазмидовары ' характеризуются различной этиологической значимостью, но только по годам, но и по месяцам.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на пяти конференциях:

- научно-практической конференции, посвященной 75-летию санитарноэпидемиологической, службы Российской Федерации; Владивосток, 1997 г.;

- научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах

Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 1998 год, -2-й международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 1998 г.;

- юбилейной научно-практической конференции, посвященная' 50-летию санитарно-эпидемиологической службы Приморья, Владивосток, 1999 г.;

- American Society for Microbiology Conference on Salmonella: Pathogenesis,

Epidemiology, and Vaccine Development, Alghero, Sardinia, Italy, 2003 r. и

По материалам диссертации опубликовано 24 научные работы в центральной и региональной печати.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность доктору медицинских наук Ф.Н. Шубину за предоставленную тему, руководство, помощь в работе и создание условий для ее выполнения. Особую благодарность автор выражает директору НИИЭМ СО РАМН, академику РАМН, доктору медицинских наук H.H. Беседновой и академику РАМН, доктору медицинских наук Г.П. Сомову за создание условий для выполнения диссертации.

За оказанную консультативную помощь и помощь в освоении методик автор искренне благодарен сотрудникам лаборатории молекулярной эпидемиологии НИИЭМ СО РАМН: научному сотруднику, к. м. н.^ А. В. Ракову, младшему научному сотруднику H.A. Кузнецовой и ст. лаборанту JI.H. Алейниковой.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ковальчук, Наталья Ивановна

149 Выводы

1. Плазмиды содержат большинство штаммов всех сероваров сальмонелл, при этом штаммы несут от одной до пяти плазмид молекулярной массой от 0,8 MDa до 130 MDa. Популяции бактерий Salmonella enterica subsp. enterica всех исследованных сероваров гетерогенны по характеристике выявляемых, у них плазмид и характеризуется значительным количеством плазмидоваров микроба у каждого из сероваров.

2. Штаммы каждого из изученных сероваров Salmonella enterica subsp. enterica, принадлежащие к одному плазмидовару, представляют собой однородную группу по биохимической активности и антибиотикорезистентности.

3. Популяция S. enteritidis в Приморском крае характеризуется наличием доминирующих плазмидоваров - 38 MDa, 38 : 1,4 MDa, 38 : 2,3 MDa. Штаммы доминирующих плазмидоваров S. enteritidis помимо плазмиды вирулентности 38 MDa, содержат и низкомолекулярные плазмиды - 1,4 MDa в плазмидоваре 38: 1,4 MDa и 2,3 MDa - в 38 : 2,3 MDa. Идентичность низкомолекулярных плазмид одинаковой молекулярной массы в: штаммах данных плазмидоваров вне зависимости от места, времени и источника выделения подтверждает клональность происхождения этих плазмидоваров.

4. Динамический мониторинг за сальмонеллезами выявил вариабельность значимости доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в этиологии инфекции не только по годам, но и по месяцам. Установлено три типа их участия в этиологии болезни, характеризующиеся преобладанием в течение года одного, двух или всех трех плазмидоваров.

5. Устрновлено существование различий между штаммами S. typhimurium возбудителями пищевой и госпитальной инфекции.

Большинство штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения характеризуются наличием плазмиды вирулентности массой 60 MDa и, как следствие, их высокой патогенностью для белых мышей, а также чувствительностью к антибиотикам. Для госпитальных штаммов характерна сниженная вирулентность для белых мышей, обусловленная отсутствием плазмиды вирулентности, и наличие коньюгативной R-плазмиды массой 80 MDa, обеспечивающей полиантибиотикорезистентность.

6. Штаммы S. typhimurium зоонозного происхождения дополнительно дифференцируются с помощью рестрикционного анализа плазмид в комплексе с ПЦР-тестированием j/JvC-гена на штаммы, содержащие плазмиду вирулентности, и штаммы с криптической плазмидой такой же молекулярной массы.

Заключение *

Сальмонеллезы - главная, значительно возрастающая? причина пищевых отравлений повсюду в мире. Количество случаев сальмонеллезной инфекции? прогрессивно растет. Значительную актуальность приобрел и госпитальный сальмонеллез, который нередко проявляется крупными; вспышками инфекции в хирургических, родильных и педиатрических отделениях и стационарах: Эти вспышки характеризуются длительностью; течения? и высокой смертностью [7, 79]: Данный; тип сальмонеллезной инфекции; существенно; отличается характером: эпидемического процесса, биологическими- особенностями < возбудителя и клиническим1 течением, инфекции [2, 4].

Однако; как показала практика, для изучения характеристик популяций возбудителей; болезней использование традиционных фенотипических тестов * (биотипирование, фаготипирование, колицинотипирование, изучение-антигенной структуры и; антибиотикорезистентности) оказалось, недостаточным [98, 262]. Объясняется это, прежде всего, тем, что один■и тот же фенотипический признак может кодироваться разными генетическими-структурами: Поэтому, применение даже исключительно* сложного ш трудоемкого метода нумерической таксономии, основанного на сотнях фенотипических признаков микроорганизма, не позволяет оценить, степень генетического родства сравниваемых между собой штаммов»микроба одного вида [16, 75, 233]. Развитие молекулярно-генетических методов в последние годы позволило по-новому взглянуть на проблему сальмонеллеза; Прежде всего, возникла потребность исследования характеристик популяций! микроорганизмов. I

В последние годы эти эпидемиологические; исследования были« усовершенствованы применением молекулярно-генетических приемов; таких как анализ плазмидного профиля, рестрикционный анализ плазмидной и хромосомной ДНК и;мультилокусный энзимный электрофорез. Различные исследователи используют комбинации плазмидного анализа с другими молекулярно-генетическими методами. Наиболее часто используют сочетание плазмидного анализа с пульс-электрофорезом хромосомной ДНК [113, 201, 212, 220, 248], с 18200-типированием [230, 239], с риботипированием [181], с рестрикционным анализом хромосомы [138] и RAPD-типированием [189]. Ценность этих новых методов типирования микроорганизмов заключается в том, что они позволяют оценить степень генетических различий между штаммами бактерий одного и того же вида и проследить направление эволюции видов.

В настоящее время плазмидный анализ в комплексе традиционными методами типирования бактерий получил широкое распространение. В литературе имеются примеры эффективного использования плазмидного анализа для внутривидового типирования микроба [12, 28, 101], что было использовано для решения практических задач эпидемиологии болезни: установления источников и факторов передачи [96, 99, 113], а также расшифровки вспышек внутрибольничных инфекций [35, 93]. Однако мы не нашли сведений* о попытках применения плазмидного анализа в; системе длительного централизованного микробиологического мониторинга. Во всех случаях исследовалась либо коллекция штаммов за несколько лет, либо штаммы, собранные за определенный период времени в определенном месте (чаще на территории госпиталя или в месте возникновения вспышки) [221, 222,223,236].

Исследования, проведенные нами в 1995-2000 г.г., позволили составить представление о гетерогенности популяции сальмонелл различных сероваров в Приморском крае, их плазмидной характеристике. Выявлены плазмидовары S. enteritidis, играющие основную роль в этиологии болезни. Установлены основные различия между штаммами S. typhimurium, вызывающими пищевой и госпитальный сальмонеллезы. В своей работе мы предприняли попытку расширить область применения плазмидного анализа, а именно использовать его в системе: длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга при сальмонеллезе.

Для изучения; характеристики структуры популяции: сальмонелл мы дополнили традиционные методы типирования изучением спектра плазмид в штаммах микроба с. исследованием отдельных плазмид в рестрикционном анализе и ПЦР-диагностикой плазмид вирулентности. Выбор этих методов обусловлен тем, что плазмидный анализ, дополненный при необходимости рестрикционным анализом либо ПЦР, является достаточно специфичным и информативным методом [26, 73, 146]. Сущность этого метода заключается в изучении плазмидного спектра у исследуемых штаммов. Для этого проводится электрофоретическое разделение выделенных и очищенных плазмидных молекул в агарозном геле, что позволяет установить количество и молекулярную массу содержащихся в исследуемых штаммах плазмид.

Изучение 3020 штаммов сальмонеллезного микроба, изолированного в разных городах и районах края от больных людей, животных, из продуктов и объектов окружающей среды? в: период с 1995 по 2000 год, показало, что большинство штаммов i (2572, 85,2 %) принадлежит к серовару S. enterítidis, 208. штаммов > (6,9 %) - к S. typhimurium. Остальные 240 штаммов (7,9 %) относились к 77 сероварам.

Исследование состава плазмид показало, что S. enterítidis характеризуется наличием вариабельного количества плазмид, но подавляющее большинство штаммов (96,3 %) содержат плазмиду с молекулярной ; массой 38 MDa. Одним1 из наиболее часто е выявляемых во всех странах плазмидоваров S. enterítidis, явились штаммы, несущие единственную плазмиду молекулярной массой 38 MDa (57 kb), которая является плазмидой вирулентности (плазмида pSEV) [126, 134, 140; 156, 161]. Штаммы данного плазмидного варианта в Приморском крае принадлежат к доминирующему плазмидовару и занимают второе место по выделению от больных, что составило 29,1%

748 штаммов). Ряд авторов [161, 169] связывают наличие данной плазмиды с увеличением вирулентности штаммов для белых мышей.

Дополнительные плазмиды находились в штаммах в виде тех или иных наборов, что позволило нам выделить 59 плазмидных вариантов микроба. Используя плазмидный анализ, как метод внутривидового типирования 8. е^егШсНэ, мы получили возможность проанализировать структуру популяции „ микроба, которая характеризуется, прежде всего, гетерогенностью. В популяции 8. етегШсНБ выделены доминирующие варианты микроба, изолируемые чаще, чем остальные. Плазмидный анализ позволил дифференцировать в структуре возбудителя 3 доминирующих плазмидовара со следующим набором плазмид: 38 МБа; 38 : 1,4 МБа; 38 : 2,3 МБа. Их доля составила 83 % от общего количества штаммов. Близкие результаты получены и в других странах, ряд авторов« сообщает о применении плазмидного анализа для внутривидового типирования сальмонелл, в результате чего были также выделены доминирующие плазмидовары [221, 222, 223; 224]. Например, в США была исследована коллекция из 154 культур, изолированных от людей и животных в период с 1979 по 1989 г. Было выявлено 16 плазмидоваров. Из них два (38 МБа и 38 : 3,1 МБа) объединили; 76 % всех представленных штаммов [223]. В Испании аналогично при исследовании коллекции из 255 "вспышечных" и спорадических штаммов при анализе плазмидного состава было выделено 15 групп. Так же лишь два плазмидовара (38 МБа и 38 : 30 МБа) объединили большинство представленных культур [221, 222].

Общность биохимических свойств и антибиотикочувствительности штаммов доминирующих плазмидоваров указывают на высокую степень фенотипической однородности 8. еп1егк!с11з. Штаммы доминирующих плазмидоваров 8. е^егШсПБ, имеющие идентичный набор плазмид, генетически близкородственны и имеют общее клональное происхождение. Это подтверждается наличием высоко консервативной плазмиды вирулентности массой 38 MDasво всех штаммах, высокая степень гомологии которой показана в литературе [150] и исследованиями в нашейf лаборатории [65]j а также выявленной нами идентичностью низко^молекулярных плазмид массой 1,4 MDa в штаммах плазмидовара 38 : 1,4 MDa- и идентичностью плазмид 2,3 MDa в штаммах плазмидовара 3 8 : 2,3 MDa.

Динамический мониторинг за сальмонеллезами выявил вариабельность значимости доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в этиологии' инфекции? не только по годам, но и по месяцам. Выявлено! три этиологических типа; популяции: — с ежегодным; преобладанием одного плазмидовара, двух или с участием в этиологии болезни; всех трех плазмидоваров с периодическим увеличением роли каждого из них.

В настоящее время« сальмонеллез,. вызванный; S. typhimurium, имеет небольшой удельный; вес в заболеваемости; населения, но: актуальность инфекции; определяется! возможностью: реализации госпитального сальмонеллеза. Микробиологический? мониторинг за: S.typhimurium в Приморском крае, основанный; на; изучении биотипа, антибиотикорезистентности ■ ш плазмидной характеристики; штаммов микроба, позволил дифференцировать два типа штаммов - зоонозные и госпитальные: Плазмидный анализ; выявил высокую степень гетерогенности* штаммов данного серотипа. Обе группы штаммов были дифференцированы по составу плазмид.

Штаммы S; typhimurium! возбудителя; зоонозного сальмонеллеза характеризуются, как правило, чувствительностью; к антибиотикам, присутствием плазмиды вирулентности: массой; 60 MDa и высокой; вирулентностью для белых мышей: Среди штаммов возбудителя пищевой инфекции выявлено 25 плазмидоваров. Большинство штаммов, помимо плазмиды вирулентности, содержало;ряд плазмид молекулярной массой от 1,1 MDa до 95 MDa: Однако надо отметить, что плазмида вирулентности S. typhimurium содержалась только у 67 % исследованных штаммов зоонозного происхождения. Эти данные подтверждаются данными и других авторов [119, 148,225].

Применение рестрикционного анализа плазмид массой 60 МБа в совокупности с тестированием этих же плазмид при помощи, ПЦРГ на наличие в них С-гена, позволило дополнительно дифференцировать штаммы микроба зоонозного происхождения, содержащие плазмиду вирулентности, от штаммов, содержащих криптические плазмиды с такой же молекулярной массой: Рестрикционный профиль А объединил большинство плазмид массой 60 МБа в этих штаммах (при их расщеплении ферментом ЕсоШ образовалось 9 линейных фрагментов). Кроме того; исследование плазмид с данным рестрикционным профилем на наличие в них $/п>С-гена с помощью ПЦР, показало, что все они являются плазмидами вирулентности; Рестрикционные профили В (13 фрагментов) и С (8 фрагментов) отличались и друг от друга и от профиля А разным количеством линейных фрагментов и их молекулярной массой. Кроме того, в штаммах с плазмидами, принадлежащими рестрикционным профилям В и С, фрагмент $руС-гена (571 п.о.) не амплифицировался, и, следовательно, эти плазмиды не являются плазмидами вирулентности. Таким образом, использование рестрикционного анализа плазмид открывает дополнительную возможность дифференциации штаммов Б; 1урЫтипиш зоонозного происхождения на основе функционального значения плазмид массой 60 МБа.

Возбудитель госпитального сальмонеллеза, в отличие от зоонозного, устойчив к, антибиотикам, содержит коньюгативную Я-плазмиду массой 80 МБа, у него снижена вирулентность для белых мышей , что указывает на отсутствие плазмиды вирулентности. Среди госпитальных штаммов выявлено 11 плазмидоваров. У штаммов, вызвавших госпитальный сальмонеллез, выявлен доминирующий плазмидовар - 80 : 40 : 4,8 МБа. Похожие результаты были получены при исследовании госпитальных штаммов в Иркутске, где вспышка была вызвана штаммами одного плазмидовгра 75 : 4,8 МБа [12], в Чите, где при исследовании госпитальных штаммов Б. 1урЫтипит выявлены три плазмидовара - 82 : 36 : 4,8 МБа, 82 : 4,8 МБа и 82 МБа [35] и в Нальчике, где в начале 90-х годов вспышка госпитального сальмонеллеза была вызвана штаммами, которые содержали две плазмиды - крупная с мол. массой 80-100 МБа и мелкая, массой 5-10 МБа [36].

Более высокая гетерогенность штаммов зоонозного происхождения определяется, по-видимому, тем, что эти штаммы вызывают только спорадическую заболеваемость.

Долу остальных сероваров, которые мы назвали редко выявляемыми, в этиологии сальмонеллезов в Приморском крае невелика. Однако их многообразие вызывает интерес в плане установления источников инфекции, а также путей их проникновения в Приморский край. Единичными штаммами были представлены 40 сероваров микроба, 65 % из них содержали плазмиды. Остальные 37 сероваров представлены несколькими культурами -от 2 до 21. Штаммы большинства сероваров оказались гетерогенными по составу плазмид, что позволило дифференцировать их внутри сероваров на плазмидные варианты. Штаммы части сероваров выделялись только из продуктов и объектов окружающей среды. Другая группа сероваров изолировались только от людей - больных и бактерионосителей. В третью группу включены штаммы сероваров, которые выделялись как от людей, так и из пищевых продуктов. В этой группе генетическое родство штаммов пяти сероваров объединенных общим временем выделения и идентичным плазмидным спектром, указывает на связь заболевания людей с определенным пищевым продуктом. По нашему мнению, более интенсивное обследование пищевых продуктов позволило бы выявить те дополнительные серовары, штаммы которых выделялись только от людей.

Так кглс практически все серовары оказались, в большинстве своем, однородными по своим биохимическим характеристикам, плазмидный анализ можно считать высоко эффективным методом внутривидового типирования сальмонелл, пригодным для осуществления на его основе длительного динамического слежения за возбудителем.

Изучение антибиотикорезистентности штаммов; различных сероваров показало, что штаммы S. enteritidis, а также штаммы редко выявляемых сероваров, за небольшим исключением, представляют собой однородную группу бактерий чувствительную ко - всем исследованным: антибиотикам. Дифференциация по отношению к антибиотикам оказалась возможна лишь для штаммов S. typhimurium. Госпитальные штаммы, несущие R-плазмиду, обладали устойчивостью к широкому спектру антибиотиков — от 8 до 19. Однако небольшое количество штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения, как и некоторые, штаммы S. enteritidis так же несли R-плазмиды, кодирующие устойчивость к тем или иным антибиотикам.

Накопленные и: обобщенные: данные о: структурных характеристиках популяции Salmonella enterica subsp. enterica в Приморском крае позволило нам подойти к решению: вопроса об организации системы микробиологического молекулярно-генетического мониторинга за возбудителями! сальмонеллезов. Организация подобной системы предполагает,, в первую; очередь, длительное, динамическое наблюдение, основанное на плазмидном анализе изолированных штаммов, рестрикционном анализе ДНК отдельных плазмид и ПЦР-диагностике плазмид вирулентности.

Применение микробиологического молекулярно-генетического мониторинга выявило его высокую эффективность при решении конкретных вопросов, эпидемиологии. Сведения о плазмидной характеристике сальмонелл успешно использованы для решения вопроса об источнике сальмонеллезной инфекции, для выявления завозных случаев болезни, для дифференциации клонов сальмонелл, возбудителей зоонозного и госпитального (антропонозного) сальмонеллезов.

В целом, проведенные исследования позволили сформулировать задачи мониторинга - изучение плазмидных характеристик (плазмидоваров) возбудителей; оценка этиологической значимости доминирующих плазмидоваров; раннее выявление новых плазмидоваров бактерий, способных вызывать повышенную заболеваемость; дифференциация возбудителей, вызывающих госпитальную и пищевую сальмонеллезную инфекцию; установление источников и факторов ее передачи; установление или исключение эпидемиологической связи между случаями болезни.

Таким образом, микробиологический молекулярно-генетический мониторинг является важной структурной частью эпидемиологического надзора, реальной основой оптимизации профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковальчук, Наталья Ивановна, Владивосток

1. Акимкин В. Г. Нозокомиальный сальмонеллез как' самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1998.- №4.- С.106-110.

2. Акимкин В. Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №2. — С.49-54.

3. Акимкин В. Г. Роль медицинского персонала в поддержании очага нозокомиального сальмонеллеза// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. -1997.-№4.-С.36.

4. Акимкин В. Г. Характерные эпидемиологические черты нозокомиального сальмонеллеза в лечебно-профилактических учреждениях для взрослых// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол./- 1998. №3. - С.27-31.

5. Акимкин В. Г. Эпидемиология и профилактика нозокомиального сальмонеллеза в стационарах для взрослых// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №3. - С. 18-24.

6. Акимкин В. Г., Беляков В. Д. Сальмонеллезная инфекция в крупном многопрофильном стационаре// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №6. - С.32-36.

7. Акимкин В. Г., Покровский В. И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. М.: РАМН, 2002. 30с.

8. Аксенов М. Ю., Гинцбург А. Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции// Мол. генетика, микробиолог, и вирусол. 1993. - №4. - С.-38.

9. Арбузова В. А. Дезентирия, ишхериозы, сальмонеллезы. Л.: Мысль, 1978. 92-97с.

10. Арбузова В.А. Современное состояние вопроса о внутрибольничных сальмонеллезныхч инфекциях// Острые кишечные инфекции. Респ. сб. -Ленинград. Выпуск 2. - 1978. - С.31-38 (20).

11. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологии. Л.: Медицина, 1962.- 256с.

12. Беляков В. Д., Акимкин В. Г. Клинико-эпидемиологические особенности нозокомиального сальмонеллеза// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. -1997. №4. - С.34-36. '

13. Беляков В. Д., Голубев Д. Б., Каминский Г. Д., Тец В. В. Саморегуляция паразитарных систем (молекулярно-генетические механизмы)* Л.: Медицина, 1987.- 139с.

14. Беляков В. Д., Ряпис Л:.А., Каминский Г. Д. Типирование возбудителей инфекционных болезней на современном этапе// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1990. - №3. - С. 98-103.

15. Блохина Н. FL, Бруснигина Н. Ф., Скобло Л. Е., Мазепа В. Н., Барышева Н. Н. Применение молекулярной гибридизации для изучения энтеротоксигенных свойств сальмонелл// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1990, - №6.-С.20-23.

16. Бойченко М. Н. Сальмонеллез: распространение возбудителя в организме// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1984.- №10. -С.3-5.

17. Бойченко М. Н., Воробьев А. А. Генетическая регуляция вирулентности бактерий рода Salmonella!7 Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1990.-№2.- С.68-74.

18. Бондаренко В. М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1997.- №4.- С.20-26.

19. Бородулина О. В., Доморадский И. В., Барсанова Т. Г., Осадчая А. В., Рудченко О. Н., Вучетич Л. В. Ферментация инозита бактериями рода Salmonella!I Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол./ — 1988. №2.- С.8-10.

20. Брода П. Плазмиды. М.: Мир, 1982. - 222с.

21. Бродов Л. Е., Малеев В. В., Ющук Н. Д., Клиника и патогенез осложнений пищевых токсикоинфекций (сальмонеллез)// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.- 1996. - №2. - С.95-97.

22. Бродов Л. Е., Малеев В. В., Ющук Н. Д., О нозопаразитической форме сальмонеллеза// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №1. -С.78-80.

23. Бруснигина Н. Ф., Волчкевич Ж. А., Дегтева Г. К., Белова Т. Н. Белки наружной мембраны в характеристике сальмонелл различного происхождения// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1988. - №8. -С. 10-13.

24. Вартанян М. К., Казанчян А. Ф., Амирханова Л. М., Агабалян А. С., Захарян Р. А. Плазмидные ДНК Salmonella derby// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.; 1982. - №8. - С.42-45.

25. Ведьмина Е. А., Власова И. В., Гившталь Н. И. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Методическиеуказания4. М:: МЗ СССР,5 ЦОЛИУВ, -1979: 43с.

26. Габрилович И. М., Цуканова А. М. Эпидемиологическое маркирование -> штаммов Salmonella typhimurium// Журн. микробиол., эпидемиол., ииммунол. 1999: - №6. - С. 84-85.

27. Гриднев В. А. Влияние приобретенной лекарственной устойчивости на фаговар сальмонелл//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1987.-№6.-С. 159-116.

28. Гриднев В: А. Микробиологическая и генетическая- характеристика лекарственноустойчивых возбудителей сальмонеллезов: Автореф. дис. докт. мед. наук. М:, 1990. — 27с.

29. Гриднеь В. А., Ливкина Е. Г., Назарова В; С., ПашковаГ. К., Батуренко Л.

30. Mi, Бадерина Л. В. Биологические свойства культур сальмонелла тифимуриум, выделенных при различных эпидемических ситуациях/Юстрые кишечные инфекции. Л; Выпуск 2. - 1978. - С. 61-65.

31. Домарадский И. В. О «побочных» эффектах; плазмид (R-плазмиды и вирулентность)// Молекул, ген., микробиол. и вирусол. — 1987. № 6. - С. 3-9.

32. Домбровский А. М. Границы биохимической изменчивости выделенных от людей сальмонелл и возможность их идентификации// Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1982. №11. - С.55-58.

33. Жарков Л. П., Лапа С. Э., Шаликова Г. Г., Крюкова Э. А. и соавт. О некоторых результатах слежения за спектром плазмид штаммов

34. Salmonella typhimurium, изолированных в лечебно-профилактических учреждениях г. Читы в 1997-99гг.// Сб., поев. 60-летию Центра ГСЭН в Читин. об. Чита. - 2000. - С. 125-126.

35. Жугова Т. Ч., Казаков А. М., Кягова J1. JL, Нагоев Б. G. Ппазмидный состав клинических штаммов сальмонелл// Бактериальные плазмиды: Тез. докл. научн. конф. Нальчик. - 1990. - С.- 106-107.

36. Зарицкий А. М. Сальмонеллезы. Киев: Здоровья, 19881 -160с.

37. Ильина T. С. Структурная организация и механизмы перемещений генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий// Молекул, генетика^- 2001. №1. - С. 3-12.

38. Калуцкий П. В., Бельский В. В. Влияние состояний иммунной системы организма* на структуру популяции Salmonella typhimurum по признакам ; антибиотикорезистентности и вирулентности// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1989. - №5. - С.8-12.

39. Каменская. И Н., Маркина Е. Ю., Чернышева HI А., Ермоленко 3. Н. Биологические особенности: Salmonella typhimurium, полученные из разных источников в 1975-1980гг.// Журн. микробиол., эпидемиол. m иммунол.- 1983. -№3. С.26-31.

40. Каминский Г. Д., Крупенко М. А. Гетерогенность плазмид штаммов Shigella Sonnei I и II фаз// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1989.-№1К-С. 28-32.

41. Кафтырева JI. А. Исследование по проблеме кишечных инфекций в институте имени Пастера// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Тез. докл. второй межд. конф. С. П6.-1998. - С 123а-123б. (.

42. Кафтырева JI. А. Эпидемиологическое значение этиологического фактора при сальмонеллезах// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Тез. докл. второй межд. конф. С. Пб. -1998. - С 135.

43. Кафтырева JI. А., Нарвская О. В., Борисов JI. Б., Хазенсон JI. Б. Влияние плазмид множественной устойчивости, к антибиотикам на изменениефаговара Salmonella typhimurum// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1984. - №10. - С. 49-52.

44. Килессо В. А., Чиракадзе И. Г., Худченко Г. В. Фаготипирование штаммов ' S^ typhimurium, выделенных при различных эпидемических ситуациях, сприменением двух схем типирования// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1981.-№10.-С. 110-111.

45. Лебедев Н. И., Плахотя Л. П. Значение серовара сальмонелл и биологических свойств возбудителей в эпидемическом процессе сальмонеллезов// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.— 1986. №8.- С.24-28.

46. Магдей М. В., Слюсарь В. Н., Рожнова С. Ш. Особенности сальмонеллезов в республике Молдова в разные периоды эпидемического неблагополучия// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1993. - №3.- С.43-48.

47. Магдей М. В., Слюсарь В. Н., Рожнова С. Ш. Анализ групповой заболеваемости сальмонеллезами в республике Молдова// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1993. - №4. - С.47-52.

48. Медицинская микробиология. / Под. ред. В. И. Покровского, О. К. Поздеева. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, - 1999. - 1200с.

49. Милютина Л: И., Рожнова С. Ш., Цешковский И. С. Клинические аспекты лекарственной * резистентности сальмонелл// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №1. - С.33-37.

50. Пак С. Г., Турьянов М. X., Пальцев М. А. Сальмонеллез. М: Медицина, 1988.- 5с.

51. Петровская В. Г. Проблемы вирулентности бактерий.-Л.: Наука, 1967.-52с.

52. Петрюк В. А., Пилипенко Т. Д., Архипова Н. М., Арапова В. И. и др. Особенности этиологической структуры сальмонеллеза на территории Карачаево-Черкесии в 1985-1994 г.г.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №6. - С.75-76.

53. Плазмиды. Методы., Бергквист П., Харди К., Оудега Б., Панайотатос Н., Пагсли С., Томас К., Янгмен Ф. М.; под ред. К Харди: М.: Мир, 1990. -11с.

54. Покровский В. И., Килессо В. А., Ющук Н. Д. Сальмонеллезы, результаты и перспективы научных исследований-М.: Сов. мед., 1981. - С. 3-8.

55. Раков А. В. Микробиолого клинические параллели при сальмонеллезной инфекции: Диссертация канд. мед. наук. 03.00.07/ НИИЭМ СО РАМН.-Владив.-2002.-142с.

56. Рачковская Ю. К. Некоторые аспекты эпидемиологического надзора за сальмонеллезами// Острые кишечные инфекции: сб. науч. тр. НИИЭМ им. Пастера, Л., - 1980. - Вып. 4. - С. 43-48.

57. Ревина Г. В. Рестрикционный анализ плазмид как метод внутривидового типирования сальмонелл// Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Тез. докл. науч. конф., -Новосиб., 1998. - С. 64-65.

58. Рожнова С. Ш. Биологические свойства S. typhimurium, выделенных при различных эпидемических ситуациях: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1979.- 135с.

59. Рожнова С. Ш. Сальмонеллезы: проблемы и решения// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1999. - №2. - С.39-41.

60. Рожнова С. Ш., Кафтырева JI. А. Значение плазмид в эволюции возбудителей и эпидемического процесса внутрибольничных сальмонеллезов// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 2000. - №5. - С.25-27.

61. Рожнова С. Ш., Килессо В. А., Александрова Н. 3. Этиологическая структура сальмонеллезов и серотиповой пейзаж сальмонелл, выделенных на отдельных территориях страны в 1980-1982гг.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1985.- №11. - С.60-64.

62. Рожнова С. Ш., Сечкарова А., Яноушкова Ю., Приказка В., Глотова Е., Соловьева Н. К. Некоторые аспекты лекарственной устойчивости сальмонелл// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1991. - №8. -С.27-30.

63. Романова Ю. М., Ильина Т. С., Гинцбург А. Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий// Вест: Российск. Академии Наук, М.: Медицина, 2001.- С. 15-20.

64. Рябченко Л. Е., Рашидов А. М., Ряпис JI. А. Скрининг и рестрикционный анализ плазмидных ДНК штаммов Salmonella enteritidis// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1994. - №5: - С. 17-19.

65. Ряпис JI. А. Клональность, фазовая изменчивость бактериальных видов и их связь с проявлениями эпидемического процесса// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1995. - №1*, - С.109-111.

66. Ряпис JI. А., Беляков В. Д. Проблемы номенклатуры и классификации сальмонелл и сальмонеллезов//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1995.-№4.-С. 115-118.

67. Ряпис JI. Я., Липницкий А. В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1998. - №6. - С.109-113.

Информация о работе

Ковальчук, Наталья Ивановна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы