Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмидные гены, определяющие синтез микроцина С51, и регуляция их экспрессии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фоменко, Дмитрий Эдуардович, Москва

ч. * *

^ ^ / J ^ т

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ФОМЕНКО ДМИТРИЙ ЭДУАРДОВИЧ

ПЛАЗМИДНЫЕ ГЕНЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СИНТЕЗ МИКРОЦИНА С51, И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ ЭКСПРЕССИИ

Специальность 03.00.03-молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор И.А. Хмель

Москва-1999

Содержание

Стр.

Введение.........................................................................................................................................4

Обзор литературы.....................................................................................................................9

1. Общая характеристика микроцинов.........................................................................9

2. Микроцины типа В...........................................................................................................10

2.1. Микроцин В17............................................................................................................10

2.1.1. Структура и биосинтез микроцина В17...............................................10

2.1.2. Механизм антибиотического действия микроцина В17...............13

2.1.3. Генетический контроль синтеза микроцина

В17 и иммунитета к нему.......................................................................................14

2.2. Другие микроцины типа В...................................................................................17

3. Микроцины типа С...........................................................................................................19

3.1. Структура и действие.............................................................................................19

3.2. Генетический контроль синтеза микроцинов С типа...............................20

4. Микроцины типа Б...........................................................................................................22

5. Микроцин типа Е...............................................................................................................23

6. Микроцин типа Н..............................................................................................................24

7. Микроцин 125......................................................................................................................25

8. Микроцины типа А..........................................................................................................26

9. Колицины V как микроцины........................................................................................27

Материалы и методы..............................................................................................................29

Результаты и обсуяедение.....................................................................................................36

1. Анализ продуктов экспрессии генов рекомбинантных плазмид, определяющих синтез микроцина С51.........................................................................36

2. Определение нуклеотидной последовательности

микроцинового оперона......................................................................................................41

3. Изучение функций отдельных генов микроцинового оперона....................63

4. Изучение регуляции экспрессии генов микроцинового оперона................69

5. Влияние продукции микроцина С51 на свойства вакцинного

штамма Shigella flexneri.......................................................................................................86

Заключение..................................................................................................................................89

Выводы...........................................................................................................................................92

Литература...................................................................................................................................93

Введение

Актуальность темы.

Проблема антагонистических взаимоотношений микроорганизмов в природных экологических системах вызывает пристальное внимание исследователей - специалистов различных областей биологии и медицины. Одним из существенных аспектов этой проблемы является изучение способности микроорганизмов продуцировать антибиотические вещества. Работы, связанные с поиском и исследованием новых и уже известных антибиотиков, проводятся в большом количестве лабораторий во всех развитых странах мира; эти исследования имеют огромное значение для современной медицины.

В 1976 г. в результате поиска антибиотических веществ при выращивании бактерий семейства Enterobacteriaceae на бедных питательных средах была обнаружена новая группа антибиотиков, названных микроцинами. Микро-цины - это низкомолекулярные антибиотики пептидной природы с широким спектром действия; они активны, главным образом, в отношении грамотрица-тельных бактерий. При исследовании микроцинов были выявлены новые, необычные химические структуры. В биосинтезе наиболее исследованного мик-роцина В17 были обнаружены новые типы посттрансляционных модификаций. Микроцины вызывают сейчас большой интерес. Свидетельством этого может быть цитата из статьи д-ра J. Liu (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, 91:4618): "Среди недавно открытых антибиотиков микроцины являются ярчайшим примером богатства химии и биологии... и изобретательности природы в создании широкого разнообразия необычных структур антибиотиков, которые химики-синтетики могли бы вообразить лишь в самых горячих мечтах".

Синтез микроцинов и иммунитет к собственному микроцину клетки-продуцента в большинстве изученных случаев определяются плазмидами. Исследование новой группы специфических плазмидных генов, участвующих в синтезе микроцинов, продуктов этих генов, регуляции их экспрессии представляет несомненный интерес. Изучение генетического контроля синтеза

микроцинов является частью более широкой проблемы регуляции синтеза вторичных метаболитов бактерий. Система плазмидных генов, определяющих продукцию микроцинов - удобная модель для изучения экспрессии генов при замедлении и прекращении роста бактерий, т.е. в условиях, в которых синтезируются многие полезные для человека метаболиты бактерий. Выяснение особенностей и механизмов регуляции экспрессии генов в период отсутствия активного роста может открыть новые перспективы увеличения продукции этих веществ.

Несомненно, важен и экологический аспект изучения микроцинов и генетических детерминантов, определяющих их синтез. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что синтез микроцинов обеспечивает селективные преимущества клеткам-продуцентам. В практическом отношении гены, определяющие синтез микроцинов, могут быть использованы для создания штаммов бактерий-антагонистов с целью получения бактериальных препаратов для борьбы с заболеваниями человека и животных.

В диссертационной работе исследовался генетический контроль синтеза микроцина С51, обнаруженного в Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН. Микроцин С51 - низкомолекулярный нуклеотидпептидный антибиотик с наиболее широким из известных микроцинов спектром действия и необычной структурой.

Цель работы.

Целью настоящей работы было изучение организации и функциональной роли плазмидных генов, ответственных за синтез микроцина С51, а также исследование особенностей генетического контроля синтеза микроцина на транскрипционном уровне. Прикладным аспектом работы было выяснение возможностей использования генов, определяющих продукцию микроцинов, для улучшения штаммов аттенуированных вакцин (на модельной системе).

Конкретными задачами работы были: -определение и анализ нуклеотидной последовательности генов оперона микроцина С51;

-идентификация продуктов экспрессии генов микроцинового оперона; -изучение функций отдельных генов микроцинового оперона и оценка-возможной роли продуктов этих генов в процессе биосинтеза микроцина С51 и обеспечении иммунитета к нему клетки-продуцента;

-исследование особенностей регуляции транскрипции микроцинового оперона;

-оценка возможности использования генов микроцина С51 для улучшения защитных свойств штамма аттенуированной вакцины.

Научная новизна В настоящей работе была уточнена локализация плазмидных генов, детерминирующих синтез микроцина С51 и иммунитет к нему. Клонированы отдельные гены и их комбинации. Определена нуклеотидная последовательность генов микроцинового оперона. Идентифицированы продукты экспрессии соответствующих генов. Показано, что по крайней мере три гена тссА, тссВ, тссИ принимают участие в биосинтезе микроцина С51; два гена, тссС и тссЕ, участвуют в экспрессии иммунитета к микроцину. На основании сведений, полученных путем анализа аминокислотных последовательностей отдельных белков показана их возможная роль в процессе биосинтеза микроцина С51.

Показано, что маленький структурный ген тссА (21 п.н.) кодирует гепта-пептид, входящий в состав молекулы микроцина С51; синтез его происходит на рибосомах. Выявлены два предшественника микроцина С51 с антибиотической активностью, изучение структуры которых позволит установить роль отдельных генов в модификации предшествеников антибиотика.

Обнаружены короткие прямые повторы, фланкирующие микроциновый оперон; наличие этих повторов позволяет предположить возможность передачи микроциновых генов путем рекомбинации.

Клонирован и секвенирован участок плазмиды, содержащий промотор-ную область микроцинового оперона. В экспериментах, проведенных с использованием однокопийной конструкции, содержащей клонированную про-моторную область, слитую с лактозным опероном, было показано, что при переходе клеток в стационарную фазу происходит активация транскрипции с этого промотора. Показано, что транскрипция микроцинового оперона зависит от продуктов генов глобальных регуляторов транскрипции rpoS (os-субъединица РНК-полимеразы)4 сгр и суа. Белок OmpR и гистоноподобные белки Е. coli IHF и Fis не оказывают существенного влияния на транскрипцию с исследованного промотора.

На модельной системе показано, что гены, определяющие продукцию микроцина С51, могут быть использованы для улучшения защитных свойств вакцинного штамма Shigella ßexneri.

Практическая значимость

Несколько аспектов определяют практическую ценность работы.

1. Полученные в работе микроциновые гены могут быть использованы для создания новых препаратов-пробиотиков и вакцинных штаммов для борьбы с заболеваниями человека и животных.

2. Микроцины интересны как новые антибиотики с необычной структурой, активные против грамотрицательных бактерий. Гены, участвующие в процессе биосинтеза микроцина С51, кодируют продукты, осуществляющие посттрансляционную модификацию пептида. Они могут быть использованы в белковой инженерии и инженерии пептидов, для конструирования штаммов бактерий, продуцирующих новые антибиотики и другие биологически активные вещества.

3. Промоторная область оперона микроцина С51, определяющая активацию транскрипции при переходе клеток в стационарную фазу роста, может быть использована для создания векторов, обеспечивающих индукцию синтеза продуктов метаболизма в отсутствие активного роста клеток. Изучение подобных регуляторных областей может дать ценную информацию для создания новых и улучшения существующих искуственных регулируемых промоторов, применяемых в биотехнологии.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (26-28 марта 1996 г., Москва), Втором съезде биохимического общества РАН (19-23 мая 1997 г., Москва), Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (17-19 декабря 1997 г., Москва), Конференции "Новые направления биотехнологии" (апрель 1998, Москва), Первом мировом конгрессе по вакцинам и иммунизации (апрель 1998, Стамбул).

Обзор литературы

1.0бщая характеристика микроцинов

С начала XX века объектом пристального внимания исследователей было взаимодействие микроорганизмов в природных экологических системах. Одним из существенных аспектов этого взаимодействия является синтез антибиотических веществ.

Антибиотические вещества, продуцируемые энтеробактериями, были обнаружены еще в 1925 году (Gratia, 1925). В настоящее время известно, что многие грам-положительные и грам-отрицательные бактерии синтезируют антибиотические вещества белковой природы, названные бактериоцинами. Бактериоцины обладают узким спектром действия и активны в основном против близкородственных штаммов. Наиболее изученными бактериоцинами являются колицины, продуцируемые Е. coli. В настоящее время известно более 25 колицинов. Большинство колицинов являются крупными белками с молекулярной массой до 90 кДа. Известны ферментативные свойства некоторых колицинов: например, колицин Е2 расщепляет ДНК, ЕЗ -РНК, другие взаимодействуют с клеточными мембранами, нарушая их электрический потенциал и изменяя проницаемость (Konisky, 1982; Рекеш и др., 1987).

На протяжении длительного времени колицины считались единственной группой антибиотиков, продуцируемых кишечными бактериями семейства Enterobacteriaceae. В 1976 году испанскими исследователями была обнаружена новая группа антибиотических веществ, продуцируемых энтеробактериями (в основном Е. coli) и обладающих более широким, по сравнению с бактериоцинами, спектром действия. Благодаря небольшому молекулярному весу эти антибиотики были названы микроцинами (Asensio et al., 1976).

Микроцины были обнаружены в результате поиска антибиотических веществ при выращивании бактерий на бедных питательных средах. По мнению исследователей, обнааруживших их, эти условия роста, с ограниченным доступом питательных веществ, соответствуют условиям обитания кишечных

бактерий в организме человека и животных (Baquero and Moreno, 1984). По данным испанских исследователей 10-15% изолятов энтеробактерий из кишечника здоровых людей продуцируют микроцины (Asensio et al., 1976).

В настоящее время выделены и изучаются семь типов микроцинов: А, В, С, D, Е, Н и J (Baquero and Moreno, 1984; Lavina et al., 1990; Salomon and Farias, 1992). Синтез большинства микроцинов определяется плазмидами, которые определяют также иммунитет клетки продуцента к собственному мик-роцину (Baquero et al., 1978; Baquero and Moreno, 1984),

Микроцины классифицируют, прежде всего, по критерию перекрестного иммунитета, т.е. устойчивости штаммов-продуцентов к действию микроцинов того же типа и чувствительности к микроцинам другого типа. Кроме того, микроцины различаются по свойствам и структуре антибиотиков, механизмам действия и спектрам антибиотической активности.

Большинство микроцинов термостабильны; многие микроцины устойчивы к экстремальным значениям рН (от 1,0 до 12,0) (Asensio et al., 1976; Baquero and Moreno, 1984).

В настоящий момент лучше всего исследованы микроцины В17, С7 и С51, как с точки зрения их структуры, так и в отношении генетических детерминантов, определяющих их продукцию. При изучении этих микроцинов и генетического контроля их синтеза выявлены особенности, представляющие общебиологический интерес.

2,Микроцины типа В.

2.1. Микроцин В17.

2.1.1. Структура и биосинтез микроцина В 17

Микроцин В17 является наиболее изученным представителем микроцинов типа В и микроцинов вообще. Его химическая структура была утановлена первой из микроцинов. По химическому строению В17 представляет собой модифицированный гидрофобный пептид с молекулярной массой 3255 Да, чувствительный к термолизину, проназе и протеиназе К, при этом он устойчив

к действию трипсина и химотрипсина (Baquero and Moreno, 1984; Davagnino et al., 1986). Активная молекула антибиотика состоит из 43 аминокислотных остатков, из которых 26 являются остатками глицина. Электронно-микроскопическое исследование выявило наличие у В17 высоко организованной четвертичной структуры (Davagnino et al., 1986).

Микроцин В17 принадлежит к классу рибосомально синтезируемых антибиотиков. В просессе биосинтеза антибиотика можно выделить три основных этапа. На первом этапе происходит транскрипция структурного гена (тсЪА) и рибосомальный синтез микроцинового предшественника, состоящего из 69 аминокислот и названного премикроцином (рис. 1).

На втором этапе происходит посттрансляционная модификация 14 аминокислотных остатков основной цепи премикроцина. При этом из двух Gly-Cys аминокислотных остатков образуются два тиазольных кольца, из двух Gly-Ser остатков - два оксазольных кольца, и из двух трипептидных остатков Gly-Cys-Ser и Gly-Ser-Cys образуются тиазол-оксазольные кольца. Это происходит путем конденсации соответствующих Ser и Cys остатков с карбонильными группами предшествующих аминокислотных остатков и последующего а, ß-дегидрирования.

Модификации в молекуле микроцина В17 - это принципиально новый тип посттрансляционной модификации полипептидов. В случае микроцина В17 были впервые обнаружены тиазольные и оксазольные кольца в молекулах полипептидов, синтезируемых на рибосомах. При этом посттрансляционной модификации подвергается основная цепь аминокислотных остатков в полипептиде (Bayer A. et al., 1993,. Yorgey Р et al., 1994, Kolter R. et al., 1992).

Третий этап биосинтеза микроцина В17 - превращение промикроцина в зрелый микроцин - происходит при удалении лидерной последовательности -26 N-терминальных аминокислотных остатков, которое осуществляется про-теазой хромосомного происхождения, кодируемой, по-видимому, геном ртЬА (Yorgey et al., 1993, Rodrigues-Sainz et al., 1990, Li et al., 1996). Лидерная последовательность предшественника микроцина В17 не является типичной сиг-

1 27

MEIiCASEFGVVl^VDALKI^RQSPLGVGIGGGGGœSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSm

Рге-МсВ17

Премикроцин В17 Поспрансляционная модификация

8 HjO, 8 Hj

О 0 0 О О О

H Si H Si H Si o-^

0 0 о

H Ol H p-^ О О

ю

Промикроцин В17 Отщепление лидерного пептида

vohgg«*^^

О 0 0 О О о

МикроцинВ17

Рис. 1. Химическая структура микроцина В17

нальной последовательностью, присутствующей в мол