Первичное действие аденовирусного онкогена E1A на JNK/cJUN путь и регуляцию клеточного цикла у трансформантов E1A+E1B-19кДа и E1A+cHa-Ras

Бричкина, Анна Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Первичное действие аденовирусного онкогена E1A на JNK/cJUN путь и регуляцию клеточного цикла у трансформантов E1A+E1B-19кДа и E1A+cHa-Ras
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Первичное действие аденовирусного онкогена E1A на JNK/cJUN путь и регуляцию клеточного цикла у трансформантов E1A+E1B-19кДа и E1A+cHa-Ras"

На правах рукописи

БРИЧКИНА Анна Игоревна

ПЕРВИЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ АДЕНОВИРУСНОГО ОНКОГЕНА Е1А НА ЖК/сЛЛЧ ПУТЬ И РЕГУЛЯЦИЮ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА У ТРАНСФОРМАНТОВ Е1А+Е1В-19кДа И Е1А+сНа-11а8

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург и Институте токсикологии и генетики, Карлсруэ (Германия)

кандидат биологических наук Поспелова Татьяна Викторовна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

профессор, доктор Питер Херрлих Институт Токсикологии и Генетики, Карлсруэ, Германия

кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук проф. Михельсон Виктор Михайлович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: ГУ НИИ Институт экспериментальной

медицины РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится «25» ноября 2005 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « 25 » октября 2005 года

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета гТжРЛсо

кандидат биологических наук - и Е.В. Каминская

1М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из основных направлений современной клеточной биологии является изучение молекулярных механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую. Известно, что процесс канцерогенеза является многоэтапным и связан с совместной активацией протоонкогенов и инактивацией опухолевых супрессоров. В нормальных клетках протоонкогены участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенных сигналов: от тирозин-киназных рецепторов и сигнальных белков, таких как ras, c-src, до ядерных транскрипционных факторов (с-тус, c-jun, c-fos). Опухолевые супрессоры, например р53, семейство pRb, контролируют прохождение по клеточному циклу, и их инактивация приводит к нарушению строгого контроля целостности генома. В результате опухолевого перерождения клетки приобретают признаки полной морфологической трансформации: автономную пролиферацию, отсутствие контактного ингибирования пролиферации, независимость роста от субстрата и генетическую нестабильность (Hanahan and Weinberg, 2000).

Трансформация клеток может быть вызвана ранними генами ДНК-содержащих вирусов, в частности аденовирусным геном El А. Онкобелок Е1А взаимодействует и изменяет активность многочисленных клеточных белков-регуляторов пролиферации, большинство из которых - продукты протоонкогенов или опухолевых супрессоров. Показано, что основными мишенями El А являются негативные регуляторы клеточного цикла - белки семейства ретинобластомы (pRb), ингибиторы циклиновых киназ p21/Wafl и p27/Kip, инактивация которых за счет взаимодействия с El А достаточна для перехода клеток из фазы G1 в S. El А может напрямую влиять на транскрипционную программу клетки, изменяя cJun-зависимую транскрипцию генов. Известно, что транскрипционный фактор cJun необходим для пролиферации клеток, поэтому влияние Е1А на cJun может быть важным этапом Е1А-индуцированной трансформации. Менее изученным способом влияния Е1А на экспрессию генов является изменение активности хроматина за счет взаимодействия с белками рЗОО/СВР, PCAF и CfflP, модулирующими ацетилирование гистонов (Frisch and Mymryk, 2002). Белок El А имеет преимущественно ядерную локализацию и, соответственно, ядерные мишени. Однако ряд данных свидетельствует о наличии мишеней El А среди цитоплазматических белков, таких как RACK1, Ran и регуляторные субъединицы 26S протеасомы, что говорит в пользу возможного влияния Е1А на сигнальные компоненты клетки. El А является хорошо изученным и часто используемым онкогеном в работах по выяснению механизмов трансформации клеток. В итоге многочисленных исследований были каршрованы сайты взаимодействия онкобелка El А с клеточными белками-регуляторами пролиферации, а с помощью генетических подходов были выявлены районы, ответственные за иммортализацию и трансформацию клеток грызунов. Поиск мишеней онкобелка El А может служить перспективным направлением для выявления новых клеточных мишеней - потенциальных кандидатов на роль онкогенов или опухолевых супрессоров. _____

Известно, что введение гена Е1А в первичные клетки грызунов одновременно со стимуляцией пролиферации запускает программу апоптоза, и с низкой частотой Е1А иммортализует клетки грызунов. Поэтому для изучения первичного действия онкогена Е1А на клетку используют систему с его временной или индуцибельной экспрессией. Другим перспективным подходом является получение трансформированных клеточных линий, в которых одновременно с геном Е1А экспрессируется второй «цитоплазматический» онкоген с антиапоптотическими свойствами: такими онкогенами могут быть аденовирусный ген Е1В-19кДа или онкогенный cIIa-Ras. Белки Е1В-19кДа и cHa-Ras существенно отличаются по действию на цитоплазматические сигнальные каскады, поэтому они могут модифицировать способность Е1А нарушать строгий контроль за регуляцией клеточного цикла и, соответственно, определять проявление признаков трансформированного фенотипа. В связи с этим изучение регуляции клеточного цикла в стабильных трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и EIA+cHa-Ras является информативным подходом для выяснения механизмов трансформации клеток аденовирусным онкогеном Е1А. Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение первичного действия онкогена Е1А на клетки грызунов и его роль в регуляции клеточного цикла при трансформации клеток онкогеном Е1А в комплементации с геном Е1В-19кДа или cHa-Ras. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить механизм активации транскрипционного фактора cJun онкобелком Е1 А.

2. Изучить функционирование JNK/cJun пути в трансформаптах, полученных из эмбриональных фибробластов крысы путем стабильной интеграции онкогена Е1А в комплементации с геном Е1В-19кДа или cHa-Ras.

3. Оценить различия в регуляции клеточного цикла у стабильных трансформантов, полученных переносом онкогенов Е1А+Е1В-19кДа и EIA+cHa-Ras.

4. Исследовать участие онкобелка Е1А в инактивации опухолевых супрессоров pRb и p21/Wafl и нарушении работы контрольных точек клеточного цикла у трансформантов Е1А+Е1В-19кДа и EIA+cHa-Ras после повреждения Д1ПС облучением.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Онкобелок Е1А активирует в цитоплазме Cdc42->MEKK1->MKK4,7->JNK сигнальный каскад, что приводит к активации транскрипционного фактора cJun.

2. Первичное действие онкобелка Е1А, вызывающее кратковременную активацию JNK и cJun, сохраняется в стабильных Е1А-трансформантах и приобретает долговременный характер за счет комплементации со вторым онкогеном.

3. Комплементация Е1А с онкогеном cHa-Ras вызывает полную морфологическую трансформацию эмбриональных фибробластов крысы, при которой нарушается работа контрольных точек клеточного цикла, тогда как онкоген Е1В-19кДа в паре с Е1А позволяет получить линию с сохранением способности осуществлять Gl/S-блок клеточного цикла после повреждения ДНК облучением.

4. В процессе трансформации мишенями онкобегаса Е1А являются негативные регуляторы клеточного цикла - pRb и p21/Wafl, которые инактивируются независимо от действия комплементирующего онкогена.

Научная новизна работы

Впервые обнаружено, что онкобелок El А влияет на транскрипционную программу клетки в цитоплазме, активируя стресс-киназу JNK через N-концевой участок, что приводит к активации транскрипционного фактора cJun. Онкобелок Е1А активирует TNK/cJun путь путем активации Cdc42->MEKK1->MKK4,7 сигнального каскада. Показано, что первичное действие онкобелка El А, вызывающее активацию JNK и cJun, сохраняется в стабильных Е1А-трансформантах. Обнаружено, что кооперация El А с онкогеном cHa-Ras приводит к потере контроля за клеточным циклом и формированию полностью морфологически трансформированного фенотипа, тогда как введение онкогенов El А и Е1В-19кДа позволяет получить частично трансформированную линию с сохранением способности осуществлять Gl/S-блок клеточного цикла. В процессе трансформации эмбриональных фибробластов крысы онкобелок Е1А инактивирует негативные регуляторы клеточного цикла - pRb и p21/Wafl, однако их инактивация не является достаточным условием для нерегулируемой пролиферации Е1А-трансформантов. Полная дерегуляция клеточного цикла возможна при конститутивной активности всех циклин-Сс1к2 комплексов, что наблюдается при комплементации онкогенов El А и cHa-Ras. Блок G1/S после облучения у трансформантов Е1А+Е1В-19кДа, связанный с подавлением активности комплексов CyclE-Cdk2, не зависит от характера фосфорилирования опухолевого супрессора pRb. Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов трансформации клеток и закономерностей регуляции клеточного цикла как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Клетки ElA+cHa-Ras могут быть использованы как новая модель трансформированных клеток с неконтролируемой пролиферацией и высокой про-апоптотической активностью. Данные об активации киназы JNK дают начало работам по поиску новых мишеней онкобелка Е1А среди компонентов сигнальных каскадов в цитоплазме. Система гибридных конструкций E1A-ER может быть использована в дальнейших экспериментах для изучения первичного действия онкогена Е1А на клетку. Теоретические результаты работы могут быть использованы в учебных спецкурсах по клеточной биологии и биологии опухолевых клеток, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений. Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисных сообщений, представленных на Всероссийских симпозиумах: «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1999), «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); на международных конференциях: «Cancer Genetics & Tumor Suppressor Genes» (Cold Spring Harbor, 2000), ISREC Conference on Cell and Molecular Biology of Cancer (Lausanne, Switzerland, 2003), Beatson International Cancer Conference "Cell Cycle,

Senescence, Apoptosis and Cancer" (Glasgow, Scotland, 2004); на международной летней школе «Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease" (Spetses, Greece, 2003) и "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer" (Spetses, Greece, 2005).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материал и методика», «Результаты», «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы. Иллюстрационный материал представлен 34 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Клеточные линии и их культивирование, получение стабильных трансформантов, временные трансфекции. В работе использовали клеточную линию NIH3T3, эмбриональные фибробласты крысы (REF) и трансформированные линии, полученные из REF путем переноса онкогенов. Для трансформации использовали ранний район ДНК аденовируса 5-го типа человека (EíAad5) в комплементации с онкогеном cHa-Ras (аминокислотные замены в положениях 12 и 61) или район вируса HindlIIG, кодирующий белки El А и Е1В-19кДа, трансфицированный вместе с плазмидой, несущей ген устойчивости к генетицину. Клетки El A+cHa-Ras были получены как фокусы морфологической трансформации, El А+Е1В - селекцией в присутствии генетицина.

Для анализа временной активации киназ онкобелком El А клетки NIH3T3 были ко-трансфицированы кальций-фосфатным методом плазмидами, кодирующими Е1А-ER, HA-JNK1, НА-МКК4 или тус-МКК7. Для анализа трансактивации cJun клетки были трансфицированы либо кальций-фосфатным методом, либо с использованием реагента Lipofectamine2000 (Invitrogene). Через 12 ч после трансфекции клетки промывали PBS, и, чтобы избежать спонтанной активации ER-индуцибельной конструкции и киназ JNK-пути, культивировали в течение 24 ч в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 0,5% бесстероидной сыворотки. Для активации слитого белка E1A-ER клетки обрабатывали ß-эстрадиолом (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл.

Анализ клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии

Клетки пермеабилизовали 0,01%-ным раствором сапонина в течение 30 мин, промывали PBS, обрабатывали раствором РНКазы А (0,1 мг/мл) и окрашивали ДНК йодидом пропидия (40 мкг/мл) в течение 15 мин при 37 °С. Образцы анализировали, используя проточный цитофлуориметр Odam (Brucker). Конструирование плазмид

Для получения плазмиды, кодирующей гибридный белок E1A-ER, последовательность ДНК 12S сплайс-формы гена EiА была клонирована в рамку считывания с последовательностью лиганд-связывающего домена человеческого эстрогенового рецептора (ER) альфа (282-595 а.к.). Шесть делеционных мутантов El А имеют международную номенклатуру и были любезно предоставлены Стивом Бэйли (МакМастерский университет, Канада): dl 1101: делеция 4-25 а.к., dl 1102: 2635 а.к., dl 1103: 30-49 а.к., dlll04: 47-60 а.к., dl 1107: 112-124 а.к., dl 1108: 125-129 а.к. Последовательность ядерного экспорта (NES), кодирующая 9 аминокислот

белка PKI (heat-stable protein kinase inhibitor, 37-46 а.к.), была клонирована между последовательностью El А и ER. Для заякоривания белка El A-ER в плазматической мембране была использована последовательность мотива СААХ вместе с многоосновным доменом белка K-Ras(B):

agatgagcaaagatggtaaaaagaagaaaaagaagtcaaagtgtgtaateatg, клонированная в рамку считывания непосредственно к 3'-концу ER-последовательности. Конструкции НА-JNK1, НА-МКК4 и доминантно-негативные мутанты киназ МКК4 и МЕКК1 были любезно предоставлены Майклом Карином (Калифорнийский университет, Сан Диего, США), тус-МКК7 и доминантно-негативные мутанты киназ МКК7 и MLK3 -Ллойдом Грином (Университет Колумбии, США), доминантно-негативные Cdc42 и Racl, СЗ-трансфераза - Сюзанной Вег-Ремерс (Институт токсикологии и генетики, Карлсруэ, Германия), конструкции c-jun-luc, Gal4-cJun и gal4-Iuc - Питером Ангелом (Немецкий институт рака, Гейдельберг, Германия).

Иммуноблотинг и иммунопреципитация. Клетки лизировали в буфере, содержащем 20 mM Tris, рН 7,5, 137 mM NaCl, 2 тМ EDTA, 1% Triton Х100, 10% глицерина, 1 тМ DTT и ингибиторы протеаз и фосфатаз: 25 шМ р-глицерофосфата, 1 mM Na3VC>4, 1 тМ PMSF, 25 тМ NaF, 10 мкг/мл леупептина и апротинина. Белки разделяли в SDS-PAAG. После электропереноса мембрану инкубировали 1 ч в 5%-ном растворе обезжиренного молока, приготовленном в буфере PBS, содержащем 0,1% Tween20 (PBS-T). Окраску белков проводили в растворе первых антител в буфере PBS-T, содержащем 5% молока. В качестве вторых антител, использовали конъюгаты с пероксидазой хрена, которые выявляли методом ECL. Для иммунопреципитации использовали 500 мкг белка тотальных клеточных лизатов и 1 мкг антител. Для осаждения иммунных белковых комплексов пробы инкубировали с 15 мкл 50%-ной суспензии протеин-A сефарозы в течение 2 ч. Осадок промывали лизирующим буфером, растворяли в двукратном буфере Лэммли, кипятили и использовали для электрофореза с последующим выявлением ко-преципитированных белков методом иммуноблотинга.

Анализ киназной активности in vitro. Ко-трансфицированные киназы HA-JNK1, НА-МКК4 или тус-МКК7 были преципитированы с помощью анти-НА или анти-тус антител, заранее конъюгированных с протеин-A агарозой. Иммунокомплексы на агарозе промывали лизирующим буфером, затем киназным буфером (25 мМ HEPES рН 7,4, 25 мМ MgCl2,25 мМ Р-глицерофосфата, 1 мМ DTT, 0,1 мМ Na3V04). Киназную реакцию проводили 30 мин при 30°С в киназном буфере с добавлением 4 мкКи [у-32Р]АТР (Amersham) и 2 мкг gst-cJun 1/166 как субстрата для INK или gst-JNK1 - для МКК4 и 7. Киназную реакцию для оценки активности, ассоциированной с Cdk2, проводили в буфере, содержащем 20 мМ HEPES рН 7,9,20 мМ MgCl2, 2 мМ MnCI2, 1 мМ DTT, 50 мкМ АТР, 4 мкКи [у-32Р]АТР, 10% глицерина и 2 мкг гистона HI. Киназная реакция была приостановлена добавлением буфера Лэммли с последующим кипячепием. Меченые белки разделяли в SDS-PAAG, гель высушивали, излучение регистрировали на рентгеновской пленке. Оценка люциферазной активности для тестирования активации транскрипционного фактора cjun.

Для оценки cJun-завиеимой активации гена c-jun клетки трансфицировали плазмидой c-jun-luc, в которой ген люциферазы находился под контролем промоторной области гена c-jun (c-jun2-TRE: -J600/+740). Для оценки трансактивации белка cJun были использованы слитые конструкции, в которых трансактивирующий домен транскрипционного фактора cJun (1-166 а.к.) был слит с ДНК-связывающей последовательностью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4 (плазмида Gal4-cJun). Репортерная плазмида gal4-luc содержала пентамер Оа14-связывающего сайта с аденовирусным промотором Е4, слитого с геном люциферазы. Временные трансфекции проводили либо кальций-фосфатным методом, либо с использованием реагента Lipofectamine2000, оба метода дали сходные результаты. Трансфицированные клетки, культивируемые 24 ч на среде без фенолового красного с 0,5% бесстероидной сыворотки, инкубировали 7 ч с эстрадиолом, затем лизировали 10 мин в пассивном лизирующем буфере (Promega). Для анализа люциферазной активности 50 мкл лизата смешивали с 350 мкл раствора, содержащего 50 мкМ люциферина, 25 мМ глицил-глицина, 15 мМ MgS04, 4 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ АТР. Активность измеряли с помощью Berthold luminometer. Результаты нормализовали относительно активности ко-трансфицированной люциферазы Renilla reniformis, которую измеряли по расщеплению субстрата коелентерацина, смешивая 10 мкл лизата с 490 мкл буфера, содержащего 25 нМ коелентерацина, 0,1 М калий-фосфата, 0,5 М NaCl, 1 гаМ EDTA, рН 7,6.

Специфический ингибитор киназы JNK SP600I25 (Caibiochem) был добавлен в конечной концентрации 10 мкМ/мл за 5 мин до обработки клеток эстрадиолом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние очкобелка Е1А на активность JNK/cJun пути

Ранее было обнаружено, что при экспрессии онкогена Е1А в мышиных клетках происходит активация генов, регулируемых димерами cJun/ATF2 транскрипционного фактора API, в состав которых входит белок cJun (van Dam et al., 1993; Pospelova et al., 1999). Известно, что cJun участвует в проявлении признака независимости пролиферации от ростовых факторов и прикрепления к субстрату, необходим для трансформации клеток, отмечена также его роль в индукции апоптоза. В связи с этим активация транскрипционного фактора cJun при экспрессии Е1А может иметь важное значение в становлении трансформированного фенотипа. Показано, что экспрессия Е1А вызывает фосфорилирование трансактивирующего домена cJun по положениям Ser63/73 (Hagmeyer et al., 1993), что может быть основной причиной высокой активности димеров cJun/ATF2. Известно, что стресс-киназа JNK отвечает за активационное фосфорилирование cJun именно по этим положениям. Поэтому мы предположили, что активация cJun онкобелком Е1А может быть связана с активацией киназы JNK. Стоит отметить, что причиной направленного изучения действия онкобелка Е1А на киназу JNK послужили полученные нами данные об отсутствии активации киназ Erkl ,2 и слабой активации киназы р38 онкобелком Е1 А, которые также участвуют в активации cJun-содержащих димеров (Brichkina et al., 2005, готовится к печати).

1.1. Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок Е1А.

Поскольку длительная экспрессия онкогена Е1А в клетках вызывает их апоптотическую гибель, мы использовали систему с индуцибельной экспрессией El А. Для этого мы использовали ДНК-конструкцию E1A-ER. в которой гормон-связывающий домен эстрогенового рецептора (Estrogen Receptor) был слит с последовательностью 12S сплайс-формы аденовирусного гена El А (схема плазмиды на рис. 1А). Преимущество такой конструкции в том, что белок El А проявляет свои свойства только тогда, когда эстрадиол взаимодействует с эстрогеновым рецептором, приводя к мгновенному разворачиванию белка, позволяя El А ассоциироваться со своими мишенями. Чтобы выяснить, какой участок EJA отвечает за активацию JNK/cJun пути, и предположить потенциальных кандидатов на роль активаторов JNK, мы сконструировали 6 делеционных мутантов белка El А, охватывающих все функционально важные домены (схема на рис. 1Б).

A El A ER В

NES СААХ

Б CRI_ÇR2_

1 46 76 112 139 243 а.к

mutl

muU 26 35

mut3 30"~î9 ml"5 пГ"124_

mut4 4f—M mut6 125 129

Рис. 1. A) Схематическое строение плазмиды, кодирующей гибридный белок E1A-ER, в котором последовательность El А слита с последовательностью гормон-связывающего домена эстрогенового рецептора (ER). Указано расположение дополнительных последовательностей: сигнал ядерного экспорта NES и сигнал заякоривания белка в плазматическую мембрану - СААХ Б) Схема доменной структуры 12S сплайс-формы онкобелка El А и его делеционных мутантов (mut 1-6). В) Анализ активации киназы JNK онкобелком E1A-ER (wtElA) и его делеционньми мутантами (mutl-6). Клетки NIH3T3 были ко-трансфицированы плазмидами, кодирующими Е1А-ER (или пустой вектор без El А как негативный контроль: vect) и киназу HA-JNK1. После суточного сывороточного голодания к клеткам добавляли эстрадиол (Ег, 1 мкМ) на 10 или 60 мин. Активность преципитированной HA-JNK1 оценивалась по степени фосфорилирования субстрата gst-cJun.

1.2. Е1А кратковременно активирует киназу JNK

Для экспериментов использовались мышиные фибробласты линии NIH3T3, которые ко-трансфицировали плазмидами, кодирующими гибридный белок E1A-ER и киназу JNK1 с пришитым гемагглютининовым тагом (HA-JNK1). Методом оценки киназной активности JNK in vitro по фосфорилированию субстрата gst-cJun мы обнаружили, что El А активирует киназу JNK1 уже через 10 мин инкубации с эстрадиолом и такая активация кратковременная, поскольку через 30-60 мин она снижается до исходного уровня (рис. 1В). Обнаружено, что только мутант с делецией N-концевого участка белка El А (аминокислоты 4-26) не способен

vect wtElA mutl тд«2

- 10 UV - 10 60 - 10 60 - 10 60 МИН.Е,

mut3 mut4 mut5 muté

10 60 - 10 60 - 10 60 - 10 60 мин E,

активировать киназу JNK. Таким образом, мы показали, что Е1А кратковременно активирует киназу JNK посредством своего N-концевого участка.

1.3. Е1А активирует транскрипционный фактор cJun за счет активации киназы JNK.

Поскольку обнаруженная активация JTNK онкобелком El А происходит быстро и кратковременно, сразу же встал вопрос, имеет ли она отношение к функционированию транскрипционного фактора cJun, ее прямой мишени. Методом ко-трансфекции конструкций E1A-ER вместе с репортерными плазмидами Gal4-cJun и gal4-luc мы обнаружили, что El А активирует с Jim, поскольку инкубация с эстрадиолом вызывала семикратное увеличение люциферазной активности (рис. 2). N-концевой мутант (mutl), который не способен активировать JNK, также не влиял на активность cJun. Используя специфический ингибитор JNK SP600125 мы доказали, что активация cJun онкобелком El А зависит от активации киназы JNK (рис. 2). Таким образом, мы показали, что N-концевой участок белка Е1А ответственен за активацию cJun путем активации киназы JNK.

Рис. 2. Анализ трансактивации cJun онкобелком E1A-ER. Клетки NIH3T3 были ко-трансфицированы плазмидами, кодирующими пустой вектор (vect-ER), E1A-ER или его делеционный мутант, вместе с конструкциями Gàl4-cJun и gal4-luc. Через 7 ч инкубации клеток с эстрадиолом (Ег) активность Gal4-cJun оценивалась по степени расщепления субстрата люциферина. Ингибитор JNK SP добавляли за 5 мин до обработки эстрадиолом в конц. 10 мкг/мл. Результаты нормализованы относительно активности ко-трансфицированной люциферазы Renilla. 5 независимых экспериментов дали сходные результаты, один из которых приведен на рисунке.

1.4. El А активирует киназу JNK в цитоплазме

Е1А был охарактеризован как белок с ядерной локализацией, имеющий в качестве мишеней белки-регуляторы транскрипционной программы: pRb, рЗОО/СВР, PCAF и др. (Frisch and Mymryk, 2002). Однако ряд данных свидетельствует, что около 10-20% общего количества бежа El А локализуется в цитоплазме (Douglas and Quinlan, 1996). Были обнаружены несколько цитоплазматических мишеней El А

- RACK1, Ran, регуляторные субъединицы 26S протеасомы (Severino et al., 2004; De Luca et al., 2003; Turnell et al., 2000). Известно, что киназа JNK локализуется как в цитоплазме, так и в ядре, однако нет однозначного ответа, где JNK должна быть активирована. Для того чтобы выяснить, где El А активирует JNK, в цитоплазме или в ядре, были проведены эксперименты по обогащению цитоплазматического пула белка Е1А: к последовательности Е1А были пришиты ротационные последовательности, заставляющие Е1А находиться вне ядра. Мы использовали две конструкции, в одной к Е1А был пришит сигнал ядерного экспорта (NES), в другой

- вместе с NES была добавлена последовательность мотива СААХ с многоосновным доменом белка K-Ras(B) для заякоривания белка El А в цитоплазматической мембране (схема на рис. 1А). После разделения цитоплазматической и мембран-растворимой фракции (Ц) трансфицированных клеток от ядерной (Я) мы

обнаружили, что белок El А с ротационными модификациями локализуется преимущественно в цитоплазме, где также выявляется эндогенная ГТФаза Cdc42, что свидетельствует о чистоте выделения цитоплазматической фракции (рис. ЗА). Мы показали, что белок El А с сигналом NES и, в особенности El А, заякоренный в мембране, активируют как киназу JNK (рис. ЗБ), так и транскрипционный фактор cJun (рис. ЗВ) сильнее, чем немодифицированный El А с преимущественно ядерной локализацией. Можно заключить, что активация киназы JNK онкобелком El А происходит в цитоплазме. Согласно принятому мнению, для трансформации клеток грызунов необходима комплементация двух онкогенов, один из которых «ядерный», такой как Е1А или с-тус, т.е. его белковый продукт функционирует в ядре и напрямую влияет на транскрипционную программу, второй «цитоплазматический» (ras, c-src или El В), который системно модулирует передачу сигнала в цитоплазме клетки. Данные о цитоплазматических функциях «ядерного» онкогена El А заставляют более осторожно подходить к такой строгой классификации онкогенов, так как влияние онкобелка El А на транскрипционную программу может начинаться в цитоплазме.

vect wtElA +NES +СААХ

я ц я ц я ц я ткл

wtElA +NES +СААХ

] E1A-ER Cdc42

Ej gst-cJun

- + - + - + Ej wtElA +NES +CAAX

Рис. 3. A) Ядерно-цитоплазматическое распределение белков E1A-ER дикого типа (wtElA) и модифицированного добавлением ротационных сигналов NES или СААХ, и эндогенной ГТФазы Cdc42 Б) Анализ активации киназы JNK и (В) трансактивации Gal4-cJun белком E1A-ER дикого типа и модифицированного добавлением последовательностей NES или СААХ.

1.5. Активация ШК1сЗип пути онкобелком Е1А опосредована активацией Cdc42->MEKK1->MKK4,7 сигнального каскада

Мы показали, что белок Е1А может влиять на систему передачи сигнала в клетке, в частности, активируя в цитоплазме киназу ЖК. Однако в настоящее время пока не выявлено никаких конкретных белков из компонентов ЖК-сигнального каскада, которые могли бы быть мишенями Е1А. Поскольку Е1А активирует ЖК быстро, то, по всей видимости, Е1А либо напрямую взаимодействует и активирует ЖК, либо активирует вышележащие компоненты по каскадному принципу, не требуя дополнительного синтеза белка. Мы не обнаружили прямой ассоциации Е1А с киназой ЖК, поэтому проверили способность Е1А активировать вышележащие сигнальные белки ЖК-каскада. Известно, что для активации ЖК необходимо ее фосфорилирование киназами МКК4 и МКК7. Методом ко-трансфекции Е1А-ЕЯ вместе с киназой НА-МКК4 или тус-МКК7 обнаружено, что Е1А активирует киназу МКК7 и в меньшей степени МКК4 (рис. 4Б). Чтобы оценить причастность

вышележащих компонентов к активации JNK/cJun пути онкобелком Е1А, в Gal4-cJun репортерном анализе были использованы доминантно-негативные мутанты потенциальных активаторов JNK-иути: киназ МКК4, МКК7, МЕКК1, MLK3 и малых ГТФаз Cdc42 и Racl. Малую ГТФазу RhoA ингибировали токсином СЗ-трансферазы. Оказалось, что наиболее сильное подавление активации cJun белком Е1А наблюдается при использовании доминантно-негативных мутантов киназ МКК7, МЕКК1 и малой ГТФазы Cdc42 (рис. 4А). Таким образом, мы показали, что активация JNK/cJun-пути онкобелком Е1А опосредована активацией Cdc42->МЕКК1->МКК4,7 цитоплазматического сигнального каскада. Впервые полученные данные об активации Cdc42 онкобелком Е1А можно интерпретировать как еще один способ плейотропного влияния Е1А на клеточные системы регуляции. Возможно, активация Cdc42 выступает важным этапом трансформирующего действия онкогена Е1А, причем вероятно не только па уровне активации JNK/cJun-каскада, но и влияя на другие системы, в частности на структуру цитоскелета. Однако остается открытым вопрос, какой белок является прямой мишенью Е1А в активации JNK. Наиболее вероятной мишенью Е1А является белок из числа факторов обмена гуанидиновых нуклеотидов (GEF-белки: Guanidine nucleotide Exchange Factors), которые активируют Cdc42 за счет перевода в активное ГТФ-связанное состояние.

-+ -+ -+ -+ .+ МКК4 МКК7 МЕКК1 Ml,КЗ Cdc42

Рис. 4. А) Анализ активации Оа14-с1ип СААХ-

модифицированным белком Е1А-ЕК в присутствии доминангно-негативных мутантов (ДНмут.) сигнальных компонентов,

участвующих в активации ЖК. Оценка активное™ проводилась как в предыдущих экспериментах. Б) Анализ активации киназ МКК4 и МКК7 онкобелком Е1А-ЕЯ. ■ЕЯ и НА-МКК4 или тус-МКК7, киназ оценивалась по степени

Ríe СЗ-traiuf. ДНмут

Клетки NIH3T3 были ко-трансфицированы плазмидами Е1А-эстрадиол-индуцированная активация преципитированных фосфорилирования субстрата gst-JNKl.

1.6. Анализ функционирования JNK/cJun пути у Е1А-трапсформантов.

Использовав индуцибельную систему, мы обнаружили кратковременную активацию JNK онкобелком El А. Поскольку процесс трансформации клеток является длительным процессом, то, по всей видимости, активация JNK и cJun онкобелком El А должна быть постоянной, чтобы вносить вклад в становление трансформированного фенотипа. Известно, что морфологическая трансформация первичных клеток онкогеном Е1А возможна только при его комплементации со вторым онкогеном, обладающим антиапоптотическими свойствами. Нами были получены из эмбриональных фибробластов крысы (REF) две трансформированные клеточные линии, в которые онкоген El А был введен либо с аденовирусным геном Е1В-19кДа, либо с онкогеном cHa-Ras. Мы решили выяснить, сохраняется ли активация киназы JNK и транскрипционного фактора cJun при длительной

экспрессии онкогена Е1А в стабильных трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и Е1 А+сНа-Яая. Мы обнаружили, что киназная активность ЖК, протестированная по фосфорилированию субстрата §з1-сТип, повьппена у Е1А-трапсформантов по сравнению с клетками ЯЕР, причем у клеток Е1А+Яаз в большей степени. В обеих Л7Л-экспрессирующих линиях наблюдается повышенное содержание белка сХип и его фосфорилирование в трансактивационном домене по сравнению с родительскими клетками КЕБ (рис. 5А). Очевидно, более высокая активность ЖК у трансформантов Е1 А+Иая по сравнению с клетками Е1А+Е1В и 11ЕР вызывает более сильное фосфорилирование с1ип, определяющееся по выявлению дополнительной верхней менее подвижной полосы фосфорилированного с1ип (рис. 5А). Таким образом, повышенная активность ЖК и с.Тип у Е1А-трансформантов сохраняется, однако степень активации зависит от функционирования второго онкогена.

gst-cJun

]p-cJun

REF Е1А+В E1A+R

□

REF Е1А+В E1A+R

Рис. 5. А) Киназная активность ЖК, уровень экспрессии и фосфорилирования сЛт (р-сЛш) в клетках ПЕР и с1ип трансформантах Е1А+Е1В и Е1 А+Ка.ч. Обработка анизомицином (50 нг/мл) в течение 10 мин использована как позитивный контроль активации сЛш. Б) Анализ трансактивации (ЗаМ-сДии и (В) самого гена с-/ил. Активно растущие клетки, трансфицированные Оа14-с./ип и gal4-luc плазмидами (Б) или с-}ип-1ис, кодирующей ген люциферазы с промоторной областью гена с-у'ш (В), были лизированы, активность люциферазы оценена по степени расщепления субстрата люциферина. Результаты нормализованы относительно активности ко-трансфицированной люциферазы ЯепШа, данные контрольных клеток ЯЕР приняты за единицу.

Чтобы проверить, сказывается ли повышенное фосфорилирование cJun на усилении его трансактивации при комплементации гена El А с онкогеном Е1В или Ras, мы трансфицировали трансформанты Е1А+Е1В и ElA+Ras слитыми конструкциями Gal4-cJun и gal4-luc и обнаружили, что присутствие El А в трансформантах обуславливает усиление трансактивационной способности cJun, однако у клеток ElA+Ras активация cJun в 5 раз выше по сравнению с его активацией при комплементации онкогенов Е1А+Е1В (рис. 5Б).

Известно, что транскрипционный фактор cJun функционирует в виде гомо- и гетеродимеров, и мишенью гетеродимеров cJun/ATF2 является сам ген c-jun, экспрессия которого в клетках повышена в присутствии El А. Чтобы проверить активность димеров cJun/ATF2, мы временно трансфицировали клетки REF и Е1А-трансформанты репортерной плазмидой, в которой ген люциферазы находился под контролем промоторной области гена c-jim (c-jun2-TRE: -1600/+740). Оказалось, что

у обоих Е1А-трансформантов активность димеров cJun/ATF2 повышена, однако по сравнению с нормальными клетками при комплементации El А с онкогеном EIB активность увеличена только в 5 раз, тогда как с онкогеном cHa-Ras значительно выше - в 45 раз (рис. 5В). По всей видимости, у трансформантов El A+Ras действие онкобелка Ras дополнительно усиливает транскрипцию гена c-jun за счет активации всех интегральных МАР-киназ: JNK, р38 и Erkl,2, и проявляется не только на уровне трансактивации белка cJun, но в повышении ДНК-связывающей активности cJun или активации партнера ATF2.

Таким образом, мы обнаружили, что первичное действие онкобелка El А, вызывающее активацию киназы JNK и транскрипционного фактора cJun, проявляется также в стабильных Е^-трансформированных клеточных линиях. Второй онкоген, в частности cHa-Ras, может модифицировать действие El А, что проявляется в усилении активности димеров cJun/ATF2. Поскольку белки Е1В-19кДа и cHa-Ras различаются по действию на цитоплазматические сигнальные каскады, мы решили выяснить, каким образом функционирование разных онкогенов Е1В-19кДа и cHa-Ras при комплементации с El А может влиять на формирование признаков морфологической трансформации у Е1А-трансформантов и строгую регуляцию событий клеточного цикла - основного процесса, который должен быть нарушен при трансформации клеток.

2. Исследование способности £7Л-экспрессирующих трансформантов

регулировать прохождение по клеточному циклу.

2.1 Характеристика Е1А-трансформантов.

Ранее нами были получены иммортализованные клетки, экспрессирующие только El А, однако уровень онкопродуктов El А в них был крайне низок, но даже в этом случае это приводило к апоптотической гибели клеток при любых стрессорных воздействиях (Кураш и др., 1998). Высокий уровень экспрессии El А и трансформация первичных клеток возможны только при комплементации Е1А со вторым антиапоптотическим онкогеном: Е1В-19кДа или cHa-Ras. Оказалось, что комплементация El А с онкогеном cHa-Ras приводит к селекции трансформантов с подавлением Е1А-индуцированного апоптоза, но крайне чувствительных к действию ДНК-повреждающих агентов и сывороточному голоданию. Только комплементация онкогена El А с геном Е1В-19кДа полностью подавляет Е1А-индуцированный апоптоз, и такие трансформанты устойчивы к любым стрессорным воздействиям. Кроме того, стабильные -экспрессирующие линии различаются по признакам полной морфологической трансформации. Клетки El A+Ras обладают всеми признаками морфологической трансформации: способны расти без прикрепления к субстрату, обладают многослойным ростом в условиях повышенной плотности и пролиферируют независимо от наличия ростовых факторов в среде культивирования. Комплементация онкогенов Е1А и Е1В-19кДа не приводит к полной морфологической трансформации клеток REF: такие клетки формируют мелкие «абортивные» колонии в агаре, не обладают многослойным ростом, приостанавливают деление в отсутствие ростовых факторов сыворотки и высокой плотности, хотя не полностью по сравнению с родительскими клетками REF,

которые для пролиферации нуждаются в сыворотке и прикреплении к субстрату (Бричкина и др., 2001).

Генетическая нестабильность как один из основных признаков неопластической трансформации клеток является следствием потери контроля целостности генома из-за нарушения работы контрольных точек клеточного цикла после повреждения ДНК. Поэтому мы проанализировали способность Е1А-трансформантов отвечать на повреждение ДНК блоками клеточного цикла. В качестве ДНК- по вреждающего воздействия было выбрано рентгеновское облучение дозой 6 Гр, при котором нормальные клетки полностью останавливают пролиферацию. По результатам проточной цитометрии в нормальных клетках REF повреждение ДНК приводит к появлению отчетливых длительных блоков в контрольных точках G1/S и G2/M (рис. 6). Способность останавливаться в цикле обнаружена и у трансформантов Е1А+Е1В. Они реализуют оба блока G1/S и G2/M после облучения, однако, в отличие от нормальных REF, эти блоки кратковременные. Наиболее существенное снижение доли S-фазных клеток наблюдается через 18 ч после облучения, однако через 24 ч часть клеток Е1А+Е1В выходит из фаз Gl и G2 и начинает пролиферировать. Таким образом, задержка клеток на границе G1/S в популяции трансформантов Е1А+Е1В длится несколько часов. У клеток EIA+Ras блок G1/S после облучения не выявляется (рис. 6).

Рис.6. Цитофлуориметрический анализ распределения

эмбриональных фибробластов крысы (REF), трансформантов Е1А+Е1В и EIA+Ras по фазам клеточного цикла в контроле (к) и через 4, 18 или 24 ч после облучения рентгеновскими лучами дозой 6 Гр. ДНК окрашена йодицом пропидия, по оси абсцисс - содержание ДНК, по оси ординат -количество клеток. Указан процент клеток в фазе S.

REF

Е1А+В

E1A+R

2N 4N SN 2N 4N 8N 2N 4N 8N IN 4N 8N

Таким образом, трансформанты Е1А+Е1В уже потеряли признаки нормальных клеток, но не достигли полной морфологической трансформации, присущей клеткам Е1 А+Яая. Вместе с устойчивостью к апоптотическим стимулам трансформанты Е1А+Е1В приобрели способность контролировать прохождение по клеточному циклу, тогда как E1A+Ras обладают нерегулируемой пролиферацией. Можно заключить, что признаки трансформированного фенотипа и способность Е1 А-трансформантов осуществлять СЛ/Я-блок клеточного цикла зависят от типа комплементирующего онкогена.

2.2. Анализ функционирования ингибитора циклин-зависимых киназ p21/Wafl у ElA-траисформаитов

Обнаруженный нами феномен реализации Gl/S-блока клеточного цикла в присутствии El А у трансформантов Е1А+Е1В является неожиданным, поскольку действие Е1А может полностью снимать контроль за Gl/S-переходом и заставляет клетку постоянно реплицировать ДНК. Кроме того, ранее показано, что стабильные линии, экспрессирующие только EIA, не способны блокировать клеточный цикл на стадии G1/S после облучения (Кураш и др., 1998). Поэтому особый интерес представляет факт восстановления контроля за клеточным циклом на стадии G1/S при введении Е1А в паре с онкогеном Е1В. Чтобы понять, каким образом трансформанты Е1А+Е1В с высоким уровнем экспрессии El А сохраняют контроль за клеточным циклом, а комплементация EIA+Ras приводит к нерегулируемой пролиферации, было проведено сравнение основных механизмов регуляции прохождения клеток по циклу.

Известно, что основными регуляторами прохождения клеток по циклу являются комплексы циклинов и киназ. Известно, что блок G1/S после облучения является р53-зависимым и опосредован накоплением ингибитора p21/Wafl в комплексах с циклин-зависимыми киназами, что приводит к их инактивации. Нами было показано, что в исследуемых Е1А-трансформантах присутствие El А не препятствует р53-зависимому накоплению белка p21/Wafl после облучения (рис. 7А). Существуют данные, что ингибитор циклин-зависимых киназ p21/Wafl является мишенью онкобелка El А и его инактивация необходима для снятия контроля за клеточным циклом при экспрессии El А в клетках (Frisch and Mymryk, 2002). Методом ко-иммунопреципитации было обнаружено, что ингибитор p21/Wafl накапливается с одинаковой динамикой после облучения в комплексах с онкобелками Е1А как у трансформантов Е1А+Е1В, так и у EIA+Ras (Булавин, Тарарова, Бричкина и др., 2002). Такое взаимодействие приводит к функциональной инактивации ингибитора р21 /Wafl, поскольку в обоих Е1А-трансформантах наблюдается достаточно высокая активность циклин-киназных комплексов, ассоциированных с p21/Wafl уже в необлученных клетках, и эта активность растет после облучения пропорционально накоплению самого ингибитора (рис. 7Б).

REF Е1А+В E1A+R IP

В REF Е1А+В E1A+R p21/Wafl

0 4 18 0 4 18 0 4 18 ч

I p21AVafl

REF Е1А+В E1A+R

—шит «k2

■8 о 18 ч тмтшггшшшт

НН1

Рис. 7 А) Накопление ингибитора р21ЛЛ'аП после облучения. Б) Уровень циклин-киназной активности, ассоциированной с ингибитором р21Л¥аП у клеток ИНР и Е1А-трансформантов после облучения. Из тотального клеточного лизата преципитировали белок р21ЛУаА, ассоциированная с ним киназная активность оценивалась по фосфорилированию субстрата циклиновых киназ гистона Н1 (НН1) В) Взаимодействие ингибитора р21/\УаА с мишенями - Сс1к2 и циюганом Е (Сус1Е) после облучения.

Таким образом, в момент реализации блока 01/8 у трансформантов Е1А+Е1В ингибитор выявляется в составе активных циклин-киназных комплексов, в то время как у нормальных клеток ЯЕР ингибитор р21/\УаП выявляется только в полностью неактивных циклин-киназных комплексах (рис. 7Б).

Существуют данные, что механизм инактивации р21/\УаЯ белком Е1А связан с закрыванием сайтов взаимодействия ингибитора со своими мишенями - циклинами и киназами (СЬапорасйуау е1 а1., 2001). Однако мы показали, что в Е1А-трансформантах р21Л¥аЯ находится в комплексах в Сс1к2 и циклином Е, причем количество комплексов увеличивается после облучения у трансформантов Е1А+Е1В; у автономно пролиферирующих клеток Е1А+Иа5 ингибитор р21/\УаП находится в комплексах с циклинами и киназами на постоянно высоком уровне (рис. 7В). Таким образом, ингибитор р21 /\Vafl является функциональной мишенью Е1А и инактивирован в трансформантах Е1А+Е1В и Е1 А+Яав, при этом сохраняя способность взаимодействовать с циклинами и киназами. Инактивация р21 1 не мешает трансформантам Е1А+Е1В реализовать блок 01/8 клеточного цикла после повреждения ДНК.

2.3. Анализ активности циклин-киназных комплексов ЗД/в-фазы у Е1А-трансформантов

Согласно современным представлениям, блок 01/8 после повреждения ДНК является результатом подавления активности циклин-киназных комплексов 01-фазы. Чтобы выяснить причины различия в функционировании контрольной точки 01/8 у Е1А-трансформантов после облучения был проведен анализ активности главных регуляторов перехода 01/в - комплексов циклинЕ-С<1к2 (Сус1Е-Сс1к2) и циклинА-Сс!к2 (Сус1А-Сёк2). Обнаружено, что у трансформантов Е1А+Е1В после облучения падает активность только комплексов Сус1Е-С<1к2. Подавления Сус1А-ассоциированной и общей Сёк2 активностей не выявляется, по сравнению с контрольными ПЕР клетками, у которых облучение вызывает подавление активности всех Сус1-Сёк2 комплексов (рис. 8).

КЕР

4 18 24

Е1А+Е1В

О 4 18 24

Сус1Е Сус1А Cdk2

Е1А+Иа8 О 4 18 24

ЯтаКМК. шяшш

НН1

Рис. 8. Анализ активности циклин-киназных комплексов у клеток 1ШР, Е1А+Е1В и Е1А+Яаз после облучения. Клетки лизированы через 4, 18 или 24 ч после облучения, активность преципитированных Сс1к2, Сус1Е, Сус1А оценивалась по фосфорилированию субстрата гистона Н1

Отсутствие блока 01/8 у трансформантов Е1 А+Яаэ коррелирует с поддержанием высокой активности всех циклин-киназных комплексов после облучения. Таким образом, кратковременный блок 01/8 у трансформантов Е1А+Е1В, по всей видимости, связан с избирательным подавлением активности комплексов Сус1Е-

Cdk2, но не CyclA-Cdk2. Причем регуляция активности комплексов CyclE-Cdk2 осуществляется не за счет действия ингибитора p21/Wafl, который ипактивирован вследствие взаимодействия с El А.

Поскольку ингибитор p21/Wafl у трансформантов Е1А+Е1В не участвует в регуляции активности комплексов CyclE-Cdk2, то основная причина подавления их активности после облучения, скорее всего, связана с изменением характера фосфорилирования Cdk2. Однако мы не обнаружили, что фосфатаза Cdc25A и киназа САК, которые являются основными регуляторами фосфорилирования Cdk2, вовлечены в регуляцию активности комплексов CyclE-Cdk2 у трансформантов Е1А+Е1В после облучения (Бричкина и др., 2003). Вероятно, регуляция активности комплексов CyclE-Cdk2 путем фосфорилирования у клеток Е1А+Е1В обеспечивается какими-то другими, пока не идентифицированными киназами. Наиболее вероятно, у трансформантов EIA+Ras функционирование этих киназ не регулируется, и они конститутивно активны независимо от стрессорных воздействий на клетки, тогда как у клеток Е1А+Е1В эти кипазы напротив, способны к изменениям после облучения. Наиболее реальными претендентами на роль киназ, которые могли бы влиять на подавление активности комплексов Cycl-Cdk2, являются интегральные киназы Erkl,2 МАР-киназного пути (Lents et al., 2002). Ранее было показано, что у трансформантов EIA+Ras киназы Erkl,2 конститутивно активны и не регулируются в частности при сывороточном голодании, тогда как у клеток Е1А+Е1В характер регуляции активности киназ Erkl,2 сходен с нормальными клетками REF (Савельева и др., 2003). Мы обпаружили, что подавление активности киназ Erkl,2 специфическим ингибитором PD98059 приводит к подавлению CyclE-Cdk2 активности у трансформантов Е1А+Е1В, тогда как трансформанты EIA+Ras не чувствительны к действию ингибитора, который не менял активность киназных комплексов. По всей видимости, у трансформантов EIA+Ras многофункциональность онкобелка Ras полностью нарушает регуляцию сигнальных каскадов, поэтому при стрессорных воздействиях не происходит должного сопряжения работы сигнальных компонентов и циклин-зависимых киназ, характерного для нормальной клетки. При комплементации онкогена Е1А с Е1В система передачи сигнала в клетке, по всей видимости, полностью не нарушается и, очевидно, отчасти может регулироваться при действии на клетку агентов, в норме останавливающих прохождение по клеточному циклу.

2.4. Состояние фосфорилирования белков семейства pRb у Е1А-грансформантов.

Как известно, ключевым событием, которое лежит в основе блока G1/S после действия ДНК-повреждающих агентов, является фосфорилирование основной мишени циклин-киназных комплексов - белков семейства ретинобластомы. Белки pRb после фосфорилирования комплексами CyclE-Cdk2 инактивируются и высвобождают транскрипционно активный фактор E2F1, регулирующий транскрипцию S-фазных генов. В нормальных клетках это является необходимым шагом для их вступления в фазу S. В связи с тем, что мы выявили существенное падение активности CyclE-Cdk2 в трансформантах Е1А+Е1В, можно было бы предполагать, что одна из причин Gl/S-блока у этих трансформантов связана непосредственно с изменением фосфорилирования pRb. Мы обнаружили, что у

обоих Е1 А-трансформантов независимо от состояния активности комплексов Сус1Е-Сс1к2 и способности останавливаться в цикле после облучения или в условиях сывороточного голодания белок рШэ постоянно находится в неактивном фосфорилированном состоянии (рис. 9А). У нормальных клеток ПЕР белок рШэ после облучения переходит в более подвижную в геле нефосфорилированную форму, которая связывает транскрипционный фактор Е2Р1 и таким образом блокирует продвижение клеток по циклу на границе фаз 01/8. Причиной сходного характера фосфорилирования р!?Ь у Е1 А-трансформантов является взаимодействие с ним белка Е1А, выявляемое как в контроле, так и после облучения и сывороточного голодания клеток (рис. 9Б).

REF Е1А+В E1A+R в REF Е1А+В E1A+R лиз ipeiA

Рис. 9. Уровень фосфорилирования белка pRb после облучения (А) и сывороточного голодания (Б) Активная нефосфорилированная форма - нижняя полоса, неактивная - верняя. (В) Взаимодействие онкобелка.ЩД с pRb в контрольных клетках (к), после облучения (у) и в условиях сывороточного голодания (сыв). Е1А иммунопреципитировали из лизатов клеток (лиз), на мембране выявляли pRb.

Таким образом, фосфорилирование белка pRb у El А-трансформантов не зависит от активности комплексов Cyc!E-Cdk2, а определяется взаимодействием с El А. Следовательно, у трансформантов Е1А+Е1В блок G1/S реализуется в обход классического пути, связанного с инактивацией белков pRb, а мишенями комплексов CyclE-Cdk2 могут выступать другие белки, участвующие в репликации ДНК, например NPAT или Cdc45. Однако необратимого блока G1/S после облучения трансформанты Е1А+Е1В все-таки реализовать не могут. Очевидно, долговременный блок G1/S возможен только при нормальном функционировании pRb-пути и подавлении активности не только CyclE-, но и CyclA-Cdk2 комплексов. Очевидно, что инактивации pRb еще недостаточно для нерегулируемой пролиферации El А-трансформантов, поскольку клетки Е1А+Е1В осуществляют блок G1/S на фоне инактивации pRb.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы выявили новый аспект плейотропнош действия онкобелка El А - влияние на транскрипционную программу клетки непосредственно в цитоплазме, где происходит активация Cdc42->MEKK1->MKK4,7->JNK сигнального каскада, приводящая в конечном итоге к активации транскрипционного фактора cJun. Ранее уже отмечалось, что El А может влиять на активность Cdc42, но на уровне транскрипции (Thomas et al., 2000), тогда как мы показали прямое действие El А на Cdc42—>JNK сигнальный каскад. По всей

видимости, активация Cdc42 может выступать важным этапом трансформирующего действия онкогена El А, причем, возможно, не только на уровне активации JNK/cJun каскада, как мы обнаружили, но и, вероятно, за счет реорганизации цитоскелета.

Эксперименты по изучению первичного действия Е1А позволили выявить участок белка El А, отвечающего за активацию cJun - это крайний N-концевой участок (а.к. 4-26). Ранее было показано, что онкоген Е1А с делегированным N-концевым участком не может трансформировать клетки. Кроме того, известно, что клетки cJun-/- плохо пролиферируют, быстро стареют и не могут быть трансформированы онкогенами. Следовательно, активация именно JNK/cJun пути, вероятно, является одним из важнейших событий в процессе Е1А-индуцированной трансформации.

Первичное действие онкогена El А на активность cJun как транскрипционного фактора проявляется и в стабильных Е1А-трансформировапных клеточных линиях, где Е1А ко-экспрессируется с генами Е1В-19кДа или cHa-Ras. Однако действие онкобелка Ras дополнительно усиливает активность димеров cJun/ATF2 за счет активации всех интегральных МАР-киназ, чего не происходит при комплементации El А с геном El В. Показано, что повышенная активация димеров cJun/ATF2 может быть причиной независимости пролиферации от ростовых факторов, поэтому не исключено, что у трансформантов ElA+Ras высокая активность cJun/ATF2 является основой становления признака автономной пролиферации.

Мишенями El А в клетке являются как протоонкоген c-jun, так и опухолевые супрессоры pRb и p21/Wafl, изменение функционирования которых может быть достаточным для индукции пролиферации онкобелком El А. Однако, как мы показали, инактивации pRb и p21/Waf недостаточно для полной потери контроля за клеточным циклом у £//4-экспрессирующих клеток. Функционирование опкогена Е1В-19кДа приводит к появлению у Е1А-трансформантов способности осуществлять блок G1/S клеточного цикла, который связан с подавлением активности комплексов Cycffi-Cdk2, но не за счет действия ингибитора p21/Wafl, а, вероятно, за счет изменений на уровне фосфорилирования Cdk2. Ключевыми мишенями комплексов Cycffi-Cdk2, определяющими вход в фазу S, являются не белки семейства pRb, а другие регуляторы индукции репликации ДНК.

Известно, что действие онкобелка El А на транскрипционный фактор cJun и опухолевые супрессоры pRb и p21/Wafl связано как со стимуляцией пролиферации клеток, так и одновременно с запуском программы апоптотической гибели клетки. Вызовет ли онкоген El А трансформацию клетки с полной потерей контроля за прохождением по клеточному циклу или такой контроль сохранится; будет ли клетка иметь высокую про-апоптотичскую готовность или станет устойчивой к повреждающим воздействиям - это исход, который будет зависеть от того, как будет изменена система передачи сигнала в цитоплазме клетки вторым онкогеном. Обнаруженное нами парадоксальное действие антиапоптотического гена El В, связанное не только с подавлением программы Е1А-индуцированного апоптоза, но и с восстановлением способности клеток блокировать прохождение по клеточному циклу после действия повреждающих агентов, свидетельствует о более сложных механизмах проявления трансформированного фенотипа.

ВЫВОДЫ

1. Онкобелок El А активирует в цитоплазме Cdc42->MEKKl->MKK4,7-> JNK сигнальный каскад, что приводит к активации транскрипционного фактора cJun.

2. За активацию JNK/cJun пути отвечает N-концевой участок онкобелка Е1А (а.к. 4-26).

3. Первичное действие онкобелка El А, вызывающее активацию JNK и cJun, сохраняется в стабильных Е1А-трансформантах при комплементации со вторым онкогеном, подавляющим Е1А-индуцированный апоптоз. Активность cJun-димеров в стабильных Е1А-трансформантах связана не только с действием онкобелка El А, а дополнительно модифицируется комплементирующим онкогеном.

4. Комплементация Е1А с онкогеном cHa-Ras вызывает полную морфологическую трансформацию эмбриональных фибробластов крысы, при которой нарушается работа контрольных точек клеточного цикла, тогда как онкоген Е1В-19кДа при комплементации с Е1А позволяет получить линию с сохранением способности осуществлять Gl/S-блок клеточного цикла после повреждения ДНК.

5. В процессе трансформации мишенями онкобелка Е1А являются негативные регуляторы клеточного цикла - pRb и p21/Wafl, которые инактивируются независимо от действия комплементирующего онкогена. Инактивация pRb и p2I/Wafl не является достаточным условием для нерегулируемой пролиферации El А-трансформантов.

6. Блок G1/S после облучения у El А-трансформантов, связанный с подавлением активности комплексов CyclE-Cdk2, не зависит от характера фосфорилирования опухолевого супрессора pRb.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

/ 1. Бричкина А.И., Тарарова Н.Д., Аксенов Н.Д., Поспелова Т.В. Изучение функционирования ингибитора циклин-зависимых киназ p27/Kip в клетках-трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras, различающихся по способности реализовать Gl-блок при сывороточном голодании. Цитология. 2000. 42 (12): 11481153.

2. Бричкина А.И., Тарарова Н.Д., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Трансформанты, полученные из эмбриональных фибробластов крысы комплементацией онкогенов Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras, различаются по способности реализовать блок G1/S в условиях сывороточного голодания. Цитология. 2001.43 (11): 1024-1030.

3. Булавин Д.В., Тарарова Н.Д., Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Перенос онкогенов Е1А и Е1В-19кДа в эмбриональные фибробласты крысы не отменяет способности трансформантов останавливаться в клеточном цикле после у-облучения. Мол. Биол. 2002. 36 (1): 58-65.

4. Бричкияа А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ механизмов реализации кратковременного блока G1/S в трансформантах Е1А+Е1В-19кДа после облучения. Цитология. 2003. 45 (12): 1203-1210.

5. Brichkina A., Aksenov N., Pospelov V., Pospelova Т. Mechanism of Gl/S check-point control in ElA+ElB-19kDa transformed cells following DNA damage. ISREC Conference on Cell and Molecular Biology of Cancer. Lausanne, Switzerland, January 2225,2003. P. 33.

6. Brichkina A., Angel P., Herrlich P. Activation of JNK kinase by El A oncoprotein. The International Summer School: Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease. Island of Spetses (Greece), 29 August - 08 September 2003.

7. Brichkina A., Angel P., Herrlich P. Activation of JNK kinase by E1A oncoprotein. Beatson International Cancer Conference "Cell Cycle, Senescence, Apoptosis and Canccr". Glasgow, Scotland, June 20-23,2004. Abstract book, № 42.

8. Brichkina A., Angel P., Pospelova Т., Herrlich P. Activation of JNK/cJun by adenoviral E1A oncoprotein. FEBS-EMBO Advanced Lecture Course: Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer. Island of Spetses (Greece), August 15-26, 2005.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Бричкина А.И., Тарарова Н.Д., Аксенов Н.Д., Поспелова Т.В. Изучение функционирования ингибитора циклин-зависимых киназ p27/Kip в клетках-трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras, различающихся по способности реализовать Gl-блок при сывороточном голодании. Цитология. 2000. 42 (12): 11481153.

Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ механизмов реализации кратковременного блока G1/S в трансформантах Е1А+Е1В-19кДа после облучения. Цитология. 2003.45 (12): 1203-1210.

Булавин Д.В., Тарарова Н.Д., Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Перенос онкогенов Е1А и Е1В-19кДа в эмбриональные фибробласты крысы не отменяет способности трансформантов останавливаться в клеточном цикле после у-облучения. Мол. Биол. 2002. 36 (1): 58-65.

Кураш Ю.К., Розанов Ю.М., Булавин Д.В., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ структуры клеточного цикла и апоптоза El Aad5-HMM0pTann30BaHHbix клеток крысы после действия ДНК-повреждающих агентов. Мол. Биол. 1998. 32 (2): 349357.

Савельева И.А., Быкова Т.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ МАР-киназных каскадов у трансформантов, различающихся по способности осуществлять блок клеточного цикла на границе фаз G1/S после сывороточного голодания. Цитология. 2003. 45 (5): 493-499.

Brichkina A., Wilhelm D., Diekmann A., Pospelova Т., Angel P., Herrlich P. Extranuclear adenoviral El A activates JNK through Cdc42. 2005. In progress.

Chattopadhyay D., Ghosh M., Mai A., Harter M. Inactivation of p21 by El A leads to the induction of apoptosis in DNA-damaged cells. 2001. J. Virol. 75: 9844-9856.

De Luca A., Mangiacasale R., Severino A,, Malquori L., Baldi A., Palena A., Mileo A., Lavia P., Paggi M. El A deregulates the centrosome cycle in a Ran GTAase-dependent manner. Cancer Res. 2003. 63:1430-1437.

Douglas J. and Quinlan M. Structural limitations of the Ad5 E1A 12S nuclear localization signal. Virology. 1996.220: 339-349.

Frisch S. and Mymryk J. Adenovirus-5 E1A: paradox and paradigm. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002.3:441-454.

Hagmeyer B., Konig H., Herr I., Offringa R., Zantema A., Van der Eb A. J., Herrlich P., Angel P. Adenovirus El A negatively and positively modulates transcription of AP-1 dependent genes by dimer-specific regulation of DNA binding and transactivating activities of Jun. EMBO J. 1993.12: 3559-3572.

Hagmeyer B., Angel P., van Dam H. Modulation of AP-l/ATF transcription factor activity by the adenovirus-El A oncogene products. Bioessays. 1995. 17: 621-629.

HanahanD. and Weinberg R. The hallmarks of cancer. Cell. 2000.100: 57-70.

Lents N., Keenan S., Bellone C., Baldassare J. Stimulation of the Raf/MEK/ERK cascade is necessary and sufficient for activation and Thr-160 phosphorylation of a nuclear-targeted CDK2. J Biol Chem. 2002.277:47469-47475.

Pospelova T.V., A.V. Medvedev, A.N. Kukushkin, S.B. Svetlikova, A.J. van der Eb, J.C. Dorsman, V.A. Pospelov. ElA+cHa-ras transformed rat embryo fibroblast cells are characterized by high and constitutive DNA binding activities of AP-1 dimers with significantly altered composition. Gene Expression. 1999. 8: 19-32.

Severino A., Baldi A., Cottone G., Han M., Sang N., Giordano A., Mileo A., Paggi M., De Luca A. RACK1 is a functional target of the E1A oncoprotein. J Cell Physiol. 2004 199: 134-139.

Thomas A., Gieser T., White E. p53 mediates bcl-2 phosphorylation and apoptosis via activation of the Cdc42/JNK1 pathway. Oncogene. 2000. 19: 5259-5269.

Turnell A., Grand R., Gorbea C., Zhang X., Wang W., Mymrik J., Gallimore P. Regulation of the 26S proteasome by adenovirus El A. EMBO. 2000. 19:4759-4773.

van Dam H., Duyndam M., Rottier R., Bosch A., de Vries-Smits L., Herrlich P., Zantema A., Angel P., van der Eb AJ. Heterodimer formation of cJun and ATF-2 is responsible for induction of c-jun by the 243 amino acid adenovirus El A protein. EMBO J. 1993.12:479-487.

№ Г

1 073

РНБ Русский фонд

2006-4 17353

Отпечатано в Санкт-Петербургской торгово-промышленной палате. Подписано в печать 21.10.2005 Тираж 100 экз. Зак. № 70-444/05

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бричкина, Анна Игоревна

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи исследования.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общая характеристика фенотипа трансформированных клеток.

2.2. Аденовирусный онкоген El А: структура и клеточные функции.

2.2.1. Мишени белка El А - регуляторы клеточного цикла.

2.2.2. El А в регуляции транскрипции на уровне модуляции активности хроматина.

2.2.3. Транскрипционный фактор API как мишень онкобелка El А.

2.2.4. Цитоплазматические мишени Е1А.

2.2.5. El А как «опухолевый супрессор».

2.2.6. Индукция апоптоза белком El А: секвестрирование р53.

2.3. Клеточные функции белка Е1В-19кДа.

2.4. Функции белка Ras в проведении сигнала и трансформации клеток.

2.5. Регуляция клеточного цикла.

2.5.1. Комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами как ключевые регуляторы прохождения клетки по циклу.

2.5.2. Белки семейства ретинобластомы - негативные регуляторы перехода G1/S.

2.6. Транскрипционный фактор API.

2.6.1. Структура и регуляция активности cJun.

2.6.2. cJun в пролиферации.

2.6.3. cJun в трансформации и опухолевой прогрессии клеток.

2.6.4. cJun как регулятор апоптоза.

2.7. Стресс киназы семейства JNK.

2.7.1. Регуляция активности киназ JNK.

2.7.2. JNK как регулятор транскрипционного фактора API.

2.7.3. Роль JNK в пролиферации и опухолевой прогрессии.

2.8. Малые ГТФазы семейства Rho.

2.8.1. Роль Rho ГТФаз в реорганизации цитоскелета и трансформации клеток.

2.8.2. Роль белков Rho в регуляции транскрипции генов и пролиферации.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

3.1. Клеточные линии и их культивирование, получение стабильных трансформантов, временные трансфекции.

3.2. Анализ клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии.

3.3. Конструирование плазмид.

3.4. Иммуноблотинг и иммунопреципитация.

3.5. Анализ киназной активности in vitro.

3.6. Метаболическое мечение.

3.7. Оценка люциферазной активности для тестирования активации JNK/cJun пути.

3.8. Оценка роста клеток в полужидком агаре.

3.9. Оценка апоптотической гибели клеток методом фрагментации ДНК.

3.10. Кривая роста.

3.11. Ядерно-цитоплазматическое фракционирование клеток.

3.12. Оценка активности малой ГТФазы Cdc42.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Влияние онкобелка Е1А на активность JNK/cJun пути.

4.1.1. Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок El А.

4.1.2. Е1А временно активирует киназу JNK.

4.1.3. Е1А активирует транскрипционный фактор cJun за счет активации киназы JNK.

4.1.4. Е1А активирует киназу JNK в цитоплазме.

4.1.5. Активация JNK/cJun пути онкобелком Е1А опосредована активацией Cdc42->MEKK1->MKK4,7 сигнального каскада.

4.1.6. Анализ функционирования JNK/cJun пути у Е1Аэкспрессирующих трансформантов.

4.2. Исследование способности Е1А-экспрессирующих трансформантов регулировать прохождение по клеточному циклу.

4.2.1. Характеристика Е1А-экспрессирующих трансформантов.

4.2.2. Анализ содержания циклинов и киназ G1-фазы и формирование их комплексов после облучения.

4.2.3. Анализ функционирования ингибитора p21/Wafl у Е1А-экспрессирующих трансформантов после облучения.

4.2.4. Анализ активности циклин-зависимых киназ после облучения.

4.2.5. Роль фосфорилирования в регуляции функционирования циклин-зависимых киназ у El А-трансформантов.

4.2.6. Состояние фосфорилирования белков семействаpRb у ElА-трансформантов.

Г JIB ABA 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Первичное действие аденовирусного онкогена E1A на JNK/cJUN путь и регуляцию клеточного цикла у трансформантов E1A+E1B-19кДа и E1A+cHa-Ras"

1.1. Актуальность проблемы

Одним из основных направлений современной клеточной биологии является изучение молекулярных механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую. Значительный прогресс в исследовании молекулярных механизмов канцерогенеза связан с открытием группы генов, которые были названы протоонкогенами. В нормальных клетках они участвуют в регуляции клеточной пролиферации на всех уровнях передачи митогенных сигналов: от рецепторов и промежуточных белков сигнальных каскадов (ras, c-src) до ядерных транскрипционных факторов (с-тус, c-jun, c-fos). Другим достижением клеточной биологии стало открытие так называемых опухолевых супрессоров (р53, семейство pRb) -клеточных генов, инактивация которых резко увеличивает вероятность развития новообразований в связи с нарушением строгого контроля целостности генома. Большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома и дифференцировку. Превращение нормальных клеток в опухолевые является многоэтапным процессом, связанным с совместной активацией протоонкогенов и инактивацией опухолевых супрессоров, приводящих к приобретению клетками признаков неопластической трансформации: автономной пролиферации, отсутствия контактного ингибирования пролиферации и независимости роста клеток от субстрата, генетической нестабильности (Hanahan and Weinberg, 2000).

В случае вирус-индуцированной трансформации было показано, что продукты ранних генов ДНК-содержащих вирусов, в частности гена Е1А аденовирусов, взаимодействуют и изменяют активность многочисленных клеточных белков. Основными мишенями El А являются негативные регуляторы клеточного цикла, транскрипционные факторы и белкимодуляторы активности хроматина, большинство из которых либо опухолевые супрессоры, либо протоонкогены. Е1А взаимодействует с опухолевыми супрессорами - белками семейства ретинобластомы (pRb), ингибиторами циклиновых киназ p21/Wafl и p27/Kip, инактивация которых достаточна для перехода клеток из фазы G1 в S. Е1А может напрямую влиять на транскрипционную программу клетки, изменяя cJun-зависимую транскрипцию генов. Известно, что транскрипционный фактор cJun необходим для пролиферации клеток, поэтому влияние Е1А на cJun может быть важным этапом Е1А-индуцированной трансформации. Менее изученным способом влияния Е1А на экспрессию генов является изменение активности хроматина за счет взаимодействия с белками рЗОО/СВР, PCAF и CtBP, модулирующими ацетилирование гистонов (Frisch and Mymryk, 2002). Белок El А имеет преимущественно ядерную локализацию и, соответственно, ядерные мишени. Однако ряд данных свидетельствует о наличии мишеней Е1А среди цитоплазматических белков, таких как RACK1, Ran и регуляторные субъединицы 26S протеасомы, что говорит в пользу возможного влияния Е1А на сигнальные компоненты клетки. Е1А является хорошо изученным и часто используемым онкогеном в работах по выяснению механизмов трансформации клеток. В итоге многочисленных исследований были картированы сайты взаимодействия онкобелка Е1А с клеточными белками-регуляторами пролиферации, а с помощью генетических подходов были выявлены районы, ответственные за иммортализацию и трансформацию клеток грызунов. Поиск мишеней онкобелка Е1А может служить перспективным направлением для выявления новых клеточных мишеней - потенциальных кандидатов на роль онкогенов или опухолевых супрессоров.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бричкина, Анна Игоревна

ВЫВОДЫ

1. Онкобелок Е1А активирует в цитоплазме Сёс42->МЕКК1->МКК4,7-> ЖК сигнальный каскад, что приводит к повышению трансактивации транскрипционного фактора с1ип.

2. За активацию ЖК/с1ип пути отвечает Ы-концевой участок онкобелка Е1А (а.к. 4-26).

3. Первичное действие онкобелка Е1А, вызывающее активацию ЖК и с.Гип, сохраняется в стабильных Е1А-трансформантах при комплементации со вторым онкогеном, подавляющим Е1А-индуцированный апоптоз. Активность с.Гип-димеров в стабильных Е1А-трансформантах связана не только с действием онкобелка Е1А, а дополнительно модифицируется комплементирующим онкогеном.

4. Комплементация Е1А с онкогеном cHa-Ras вызывает полную морфологическую трансформацию эмбриональных фибробластов крысы, при которой нарушается работа контрольных точек клеточного цикла, тогда как онкоген Е1В-19кДа при комплементации с El А позволяет получить линию с сохранением способности осуществлять Gl/S-блок клеточного цикла после повреждения ДНК.

5. В процессе трансформации мишенями онкобелка El А являются негативные регуляторы клеточного цикла - pRb и p21/Wafl, которые инактивируются независимо от действия коплементирующего онкогена. Инактивация pRb и p21/Wafl не является достаточным условием для нерегулируемой пролиферации Е1А-трансформантов.

6. Блок G1/S после облучения у Е1А-трансформантов, связанный с подавлением активности комплексов CyclE-Cdk2, не зависит от характера фосфорилирования опухолевого супрессора pRb.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Бричкина А.И., Тарарова Н.Д., Аксенов Н.Д., Поспелова Т.В. Изучение функционирования ингибитора циклин-зависимых киназ p27/Kip в клетках-трансформантах Е1А+Е1В-19кДа и ElA+cHa-Ras, различающихся по способности реализовать G1-блок при сывороточном голодании. Цитология. 2000. 42 (12): 1148-1153.

4. Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Анализ механизмов реализации кратковременного блока G1/S в трансформантах Е1А+Е1В-19кДа после облучения. Цитология. 2003. 45 (12): 1203-1210.

7. Brichkina A., Angel P., Herrlich P. Activation of JNK kinase by El A oncoprotein. Beatson International Cancer Conference "Cell Cycle, Senescence, Apoptosis and Cancer". Glasgow, Scotland, June 20-23, 2004. Abstract book, № 42.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы выявили новый аспект плейотропного действия онкобелка Е1А на клетку - быстрое влияние на транскрипционную программу начиная с цитоплазмы, где он вызывает активацию Сс1с42->МЕКК1->МКК4,7->ЖК сигнального каскада, приводящую в конечном итоге к активации транскрипционного фактора сЛт. Ранее уже отмечалось, что Е1А может влиять на активность Сс1с42, но на уровне транскрипции, тогда как мы впервые показали прямое действие Е1А на Сс1с42—>ЖК->с1ип сигнальный каскад. По всей видимости, активация Сс1с42 может выступать важным этапом действия онкогена Е1А, причем, возможно, не только на уровне активации ЖК/с-Гип каскада, как мы обнаружили, но и, вероятно, за счет реорганизации цитоскелета.

Эксперименты по изучению первичного действия Е1А позволили выявить участок белка Е1 А, отвечающего за активацию сЛт - это крайний ]Ч-концевой участок (а.к. 4-26). Ранее было показано, что онкоген Е1А с делетированным ТЧ-концевым участком не может трансформировать клетки. Кроме того, известно, что сМп-/- клетки плохо пролиферируют, быстро стареют и не могут быть трансформированы онкогенами. Следовательно, активация именно JNK/cJun пути, вероятно, является одним из важнейших событий в процессе Е1А-индуцированной трансформации.

Первичное действие онкогена Е1А на активность cJun как транскрипционного фактора проявляется и в стабильных Е1А-экспрессирующих клеточных линиях, в которых El А интегрирован в геном вместе с генами Е1В-19кДа или cHa-Ras, блокирующими апоптоз и вызывающими трансформацию. Однако действие онкобелка Ras дополнительно усиливает активность димеров cJun/ATF2 вероятно за счет постоянной активации разных ветвей МАР-киназного каскада, чего не происходит в случае комплементации El А с геном El В. Так как известно, что повышенная активация димеров cJun/ATF2 может быть причиной независимости пролиферации от ростовых факторов, поэтому не исключено, что у трансформантов ElA+Ras высокая активность cJun/ATF2 может являться основой становления признака автономной пролиферации.

Мишенями El А в клетке являются как протоонкоген c-jun, так и опухолевые супрессоры pRb и p21/Wafl, изменение функционирования которых может быть достаточным для индукции пролиферации онкобелком El А. Однако, как мы показали, инактивации pRb и p21/Waf недостаточно для полной потери контроля за клеточным циклом у Е1А-экспрессирующих клеток. Функционирование онкогена Е1В-19кДа приводит к появлению у Е1А-трансформантов способности осуществлять блок G1/S клеточного цикла, который связан с подавлением активности комплексов CyclE-Cdk2, но не за счет действия ингибитора p21/Wafl, а, вероятно, за счет изменений уровня фосфорилирования Cdk2. Ключевыми мишенями комплексов CyclE-Cdk2, определяющими вход в фазу S, являются не белки семейства pRb, а другие регуляторы индукции репликации ДНК.

Известно, что действие онкобелка Е1А на транскрипционный фактор с1ип и опухолевые супрессоры рШэ и р21/^аП связано как со стимуляцией пролиферации клеток, так и одновременно с запуском программы апоптотической гибели клетки. Вызовет ли онкоген Е1А трансформацию клетки с полной потерей контроля прохождения по клеточному циклу или такой контроль сохранится; будет ли клетка иметь высокую про-апоптотичскую готовность или станет устойчивой к повреждающим воздействиям - это исход, который будет зависеть от того, как будет изменена система передачи сигнала в цитоплазме клетки вторым онкогеном. Обнаруженное нами парадоксальное действие антиапоптотического гена Е1В, связанное не только с подавлением программы Е1А-индуцированного апоптоза, но и с восстановлением способности клеток блокировать прохождение по клеточному циклу после стрессорных воздействий, свидетельствует о более сложных механизмах становления и проявления трансформированного фенотипа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бричкина, Анна Игоревна, Санкт-Петербург

1. Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2003. Анализ механизмов реализации кратковременного блока в 1/8 в трансформантах Е1А+Е1В-19кДа после облучения. Цитология. 45 (12): 1203-1210.

2. Копнин Б.П. 2002. Неопластическая клетка. Основные свойства и механизмы их возникновения. Практическая онкология. 3 (4): 229235.

3. Кураш Ю.К., Розанов Ю.М., Булавин Д.В., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 1998. Анализ структуры клеточного цикла и апоптоза Е1Ааё5-иммортализованных клеток крысы после действия ДНК-повреждающих агентов. Мол. Биол. 32 (2): 349-357.

4. Adler V., Franklin C.C., Kraft A.S. 1992. Phorbol esters stimulate the phosphorylation of c-Jun but not v-Jun: regulation by the N-terminal delta domain. Proc Natl Acad Sci USA. 89(12): 5341-5.

5. Akusjarvi G. 1993. Proteins with transcription regulatory properties encoded by human adenoviruses. Trends Microbiol. 1:163-170

6. Alevizopoulos K., Catarin В., Vlach J., Amati B. 1998. A novel function of adenovirus El A is required to overcome growth arrest by the Cdk2 inhibitor p27Kip. EMBO J 17: 5987-5997.

7. Alevizopoulos K., Vlach J., Hennecke S., Amati B. 1997. Cyclin E and c-Myc promote cell proliferation in the presence of pl6INK4a and of hypophosphorylated retinoblastoma family proteins. EMBO J. 16: 53225333

8. Angel P., Karin M. 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta. 1072(2-3): 129-57.

9. Aprelikova O., Xiong Y., Liu E.T. 1995. Both pl6 and p21 families of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors block the phosphorylation of cyclin-dependent kinases by the CDK-activating kinase. J. Biol. Chem. 270: 18195-18197.

10. Arata Y., Fujita M., Ohtani K., Kijima S., Kato J.Y. 2000. Cdk2-dependent and -independent pathways in E2F-mediated S phase induction. .J Biol. Chem. 275:6337-45

11. Arias J., Alberts A.S., Brindle P., Claret F.X., Smeal Т., Karin M., Feramisco J., Montminy M. 1994. Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on a common nuclear factor. Nature. 370(6486): 226-9.

12. Bagchi S., Raychaudhuri P., Nevins JR. 1990. Adenovirus E1A proteins can dissociate heteromeric complexes involving the E2F transcription factor: a novel mechanism for El A trans-activation. Cell. 62(4):659-69.

13. Bakiri L., Lallemand D., Bossy-Wetzel E., Yaniv M. 2000. Cell cycle-dependent variations in c-Jun and JunB phosphorylation: a role in the control of cyclin D1 expression. EMBO J. 19(9):2056-68.

14. Barlat I., Fesquet .D, Brechot C., Henglein B., Dupuy d'Angeac A., Vie A., Blanchard J.M. 1993. Loss of the Gl-S control of cyclin A expression during tumoral progression of Chinese hamster lung fibroblasts. Cell Growth Differ. 4(2):105-13.

15. Bartek J., Lukas J. 2001 a. P27 destruction: Cksl pulls the trigger. Nat. Cell. Biol. 3:95-98.

16. Bartek J., Lukas J. 2001 6. Are all cancer genes equal? Nature 411: 10011002.

17. Bayley S. and Mymryk J. 1994. Adenovirus El A proteins and transformation. Int. J. One. 5: 425-444.

18. Behrens A., Jochum W., Sibilia M., Wagner E.F. 2000. Oncogenic transformation by ras and fos is mediated by c-Jun N-terminal phosphorylation. Oncogene. 19(22): 2657-63.

19. Behrens A., Sibilia M., Wagner E.F. 1999. Amino-terminal phosphorylation of c-Jun regulates stress-induced apoptosis and cellular proliferation. Nat Genet. 21(3): 326-9.

20. Ben-Porath I. and Weinberg R. 2005. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37(5): 961-76.

21. Binetruy B., Smeal T., Karin M. 1991. Ha-Ras augments c-Jun activity and stimulates phosphorylation of its activation domain. Nature. 351(6322): 122-7.

22. Boguski M.S., MacCormick F. 1993. Proteins regulating Ras and its relatives. Nature 366: 643- 654.

23. Bossy-Wetzel E., Bakiri L., Yaniv M. 1997. Induction of apoptosis by the transcription factor c-Jun. EMBO J. 16(7): 1695-709.

24. Bottazzi M.E., Zhu X., Bohmer R.M., Assoian R.K. 1999. Regulation of p21(cipl) expression by growth factors and the extracellular matrix reveals a role for transient ERK activity in G1 phase. J. Cell Biol. 146: 1255-1264

25. Boyle W.J., Smeal T., Defize L.H., Angel P., Woodgett J.R., Karin M., Hunter T. 1991. Activation of protein kinase C decreases phosphorylation of c-Jun at sites that negatively regulate its DNA-binding activity. Cell. 64(3): 573-84.

26. Braga V. 1999. Small GTPases and regulation of cadherin dependent cell-cell adhesion. J. Clin. Pathol. 52: 197-202.

27. Braga V. 2000. The crossroads between cell-cell adhesion and motility. Nat Cell Biol. 2(10): E182-4.

28. Brichkina A., Wilhelm D., Diekmann A., Pospelova T., Angel P., Herrlich P. 2005. Extranuclear adenoviral El A activates JNK through Cdc42. In progress.

29. Bringold F., Serrano M. 2000. Tumor suppressors and oncogenes in cellular senescence. Exp. Gerontol. 35:317-329

30. Brown P.H., Alani R., Preis L.H., Szabo E., Birrer M.J. 1993. Suppression of oncogene-induced transformation by a deletion mutant of c-jun. Oncogene. 8(4):877-86.

31. Cai K., Dynlacht B.D. 1998. Activity and nature of p21(WAFl) complexes during the cell cycle. Proc Natl Acad Sci USA. 95(21):12254-9.

32. Cajal S., Sanchez-Prieto R. Modulation of PI3K/Akt pathway by Ela mediates sensitivity to cisplatin. Oncogene. 21 (46): 7131-6.

33. Campbell S.L., Khosravi-Far R., Rossman K. L., Clark G.J., Der C.J. 1998. Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene 17: 1395-1413.

34. Chattopadhyay D., Ghosh M.K., Mai A., Harter M.L. 2001. Inactivation of p21 by El A leads to the induction of apoptosis in DNA-damaged cells. J. Virol. 75: 9844-9856.

35. Chen G., Branton P.E., Yang E., Korsmeyer S.J., Shore G.C. 1996. Adenovirus E1B 19-kDa death suppressor protein interacts with Bax but not with Bad. J. Biol. Chem. 271:24221-24225.

36. Chen S., Gardner D.G. 2004. Suppression of WEE 1 and stimulation of CDC25A correlates with endothelin-dependent proliferation of rat aortic smooth muscle cells. J Biol Chem. 279(14): 13755-63.

37. Chen J., Saha P., Kornbluth S., Dynlacht B.D., Dutta A. 1996. Cyclin-binding motifs are essential for the function of p21CIPl. Mol. Cell. Biol. 16: 4673-4682.

38. Cheng M., Olivier P., Diehl J.A., Fero M., Roussel M.F., Roberts J.M., Sherr C.J. 1999. The p21(Cipl) and p27(Kipl) CDK 'inhibitors' are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts. EMBOJ. 18: 1571-1583.

39. Chiariello M., Gomez E., Gutkind J. 2000. Regulation of cyclin-dependent kinase (Cdk) 2 Thr- 160 phosphorylation and activity by mitogen-activated kinase in late G1 phase. Biochem. J. 349: 869-876

40. Chiou S.K., Tseng C.C., Rao L., White E. 1994. Functional complementation of the adenovirus E1B 19-kilodalton protein with Bcl-2 in the inhibition of apoptosis in infected cells. J Virol. 68:6553-6566

41. Chiou S.K., White E. 1998. Inhibition of ICE-like proteases inhibits apoptosis and increases virus production during adenovirus infection. Virology 244:108-118

42. Clark W., Gillespie D.A. 1997. Transformation by v-Jun prevents cell cycle exit and promotes apoptosis in the absence of serum growth factors. Cell Growth Differ. 8(4): 371-80.

43. Classon M., Dyson N. 2001. P107 and pl30: versatile proteins with interesting pockets. Exp. Cell. Res. 264: 135-147.

44. Clurman B.E., Sheaff R.I., Thress K., Groudine M., Roberts J. 1996. Turnover of cyclin E by the ubiquitin-proteasome pathway is regulated by cdk2 binding and cyclin phosphorylation. Genes. Dev. 10: 1979-1990

45. Cobrinik D. 2005. Pocket proteins and cell cycle control. Oncogene. 24(17): 2796-809.

46. Coso O.A., Chiariello M., Yu J.C., Teramoto H., Crespo P., Xu N., Miki T., Gutkind JS. 1995. The small GTP-binding proteins Racl and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell. 81(7): 1137-46.

47. Coverley D., Pelizon C., Trewick S., Laskey R.A. 2000. Chromatin-bound Cdc6 persists in S and G2 phases in human cells, while soluble Cdc6 is destroyed in a cyclin A-cdk2 dependent process. J. Cell Sci. 113:1929-38

48. Dannenberg J.H., van Rossum A., Schuijff L., te Riele H. 2000. Ablation of the retinoblastoma gene family deregulates G(l) control causing immortalization and increased cell turnover under growth-restricting conditions. Genes Dev. 14(23): 3051-64.

49. Davis RJ. 2000. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. Cell. 103(2):239-52.

50. De Gregori J., Leone G., Miron A., Jakoi L., Nevin J.R. 1997. Distinct roles for E2F proteins in cell growth control and apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 7245-7250.

51. Debbas M., White E. 1993. Wild-type p53 mediates apoptosis by E1A, which is inhibited by E1B. Genes Dev. 7: 546-554.

52. Delavaine L., La Thangue N.B. 1999. Control of E2F activity by p21Wafl/Cipl. Oncogene 18: 5381-5392.

53. Deleu L., Shellard S., Alevizopoulos K., Amati B., Land H. 2001. Recruitment of TRRAP required for oncogenic transformation by El A. Oncogene. 20 (57): 8270-5.

54. Devary Y, Gottlieb RA, Lau LF, Karin M. 1991. Rapid and preferential activation of the c-jun gene during the mammalian UV response. Mol Cell Biol. 11(5): 2804-11.

55. Diffley J.F. 2001. DNA replication: building the perfect switch. Curr.1. Biol. 11(9): 367-370

56. Douglas J. and Quinlan M. 1996. Structural limitations of the Ad5 El A 12S nuclear localization signal. Virology 220:339-49.

57. Duyndam MC., van Dam H., Smits PH, Verlaan M., van der Eb A., Zantema A. 1999. The N-terminal transactivation domain of ATF2 is a target for the co-operative activation of the c-jun promoter by p300 and 12S E1A. Oncogene. 18 (14): 2311-2321.

58. Duyndam MC., van dam H., van der Eb A., Zantema A. 1996. The CR1and CR3 domains of the adenovirus type 5 El A proteins can independently mediate activation of ATF-2. J Virol. 70 (9): 5852-9.

59. Dyson N. 1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes. Dev. 12: 2245-62.

60. Eferl R., Wagner EF. 2003. AP-1: a double-edged sword in tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 3(11): 859-68.

61. El Deiry W.S., Tokino T., Vlculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M., Lin D., Merser W.E., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1993. Wafl, a potential mediator of p53 tumor supression. Cell 75: 817-825.

62. Endter C, Dobner T. 2004. Cell transformation by human adenoviruses.

63. V Curr Top Microbiol Immunol. 273: 163-214.

64. Evan G.I., Wyllie A.H., Gilbert C.S., Littlewood T.D., Land H., Brooks M., Waters C.M., Penn L.Z., Hancock D.C. 1992. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell 69:119-28

65. Ewen M.E. 2000. Where the cell cycle and histones meet. Genes Dev. 14: 2265-2270

66. Ezhevsky S.A., Nagahara H., Vocero-Akbani A.M., Gius D.R., Wei M.C., Dowdy S.F. 1997. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10699-10704

67. Faha B., Harlow E., Lees E. 1993. The adenovirus ElA-associated kinase consists of cyclin E-p33cdk2 and cyclin A-p33cdk2. J. Virol. 67: 24562465.

68. Falck J., Mailand N., Syljuasen R.G., Bartek J., Lukas J. 2001. The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature 410: 766-767.

69. Farrow S.N., White J.H., Martinou I., Raven T., Pun K.T., Grinham C.J., Martinou J.C., Brown R. 1995. Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus E1B 19K. Nature 375: 431-436

70. Findeisen M., El-Denary M., Kapitza T., Graf R., Strausfeld U. 1999. Cyclin A-dependent kinase activity affects chromatin binding of ORC, Cdc6, and MCM in egg extracts of Xenopus laevis. Eur. J. Biochem. 264:415-426

71. Flinterman M., Guelen L., Ezzati-Nik S., Killick R., Melino G., Tominaga K., Mymryk JS., Gaken J., Tavassoli M. 2005. El A activates transcription of p73 and Noxa to induce apoptosis. J Biol Chem. 280(7): 5945-59.

72. Frisch SM. and Mymryk JS. 2002. Adenovirus-5 E1A: paradox and paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (6): 441-52.

73. Frisch SM. 1991. Antioncogenic effect of adenovirus El A in human tumor cells.Proc Natl Acad Sei USA. 88(20): 9077-81.

74. Frisch SM. 1994. E1A induces the expression of epithelial characteristics. J Cell Biol. 127 (4): 1085-96.

75. Galaktionov K., Chen X., Beach D. 1996. Cdc25 cell-cycle phosphatase as a target of c-myc. Nature 382: 511-517.

76. Galaktionov K., Lee A.K., Eckstein J., Draetta G., Meckler J., Loda M., Beach D. 1995. CDC25 phosphatases as potential human oncogenes. Science 269: 1575-1577.

77. Gallo KA., Johnson GL. 2002. Mixed-lineage kinase control of JNK and p38 MAPK pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 3(9):663-72

78. Geng Y, Whoriskey W, Park MY, Bronson RT, Medema RH, Li T, Weinberg RA, Sicinski P. 1999. Rescue of cyclin D1 deficiency by knockin cyclin E. Cell. 97(6):767-77.

79. Geng Y., Yu Q., Sicinska E., Das M., Schneider JE., Bhattacharya S., Rideout WM., Bronson RT., Gardner H., Sicinski P. 2003. Cyclin E ablation in the mouse. Cell. 114(4): 431-43.

80. Graham FL., van der Eb AJ. 1973. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52(2): 456-67.

81. Grigoriadis AE., Schellander K., Wang ZQ., Wagner EF. 1993. Osteoblasts are target cells for transformation in c-fos transgenic mice. J Cell Biol. 122(3):685-701.

82. Grooteclaes ML., Frisch SM. 2000. Evidence for a function of CtBP in epithelial gene regulation and anoikis. Oncogene. 19(33):3823-8.

83. Grossman S.R. 2001. p300/CBP/p53 interaction and regulation of the p53 response. Eur J. Biochem. 268:2773-2778

84. Gupta S., Barrett T., Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Sluss H.K., Derijard B., Davis RJ. 1996. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors. EMBO J. 15(11):2760-70.

85. Guttridge D.C., Albanese C., Reuther I.Y., Pestell R.G. Baldwin A.S. 1999. NF-kappaB controls cell growth and differentiation through transcriptional regulation of cyclin Dl. Mol. Cell Biol. 5785-5799.

86. Hagmeyer B.M., Angel P., van Dam H. Modulation of AP-l/ATF transcription factor activity by the adenovirus-ElA oncogene products. Bioessays. 1995. 17: 621-9.

87. Hahn W. and Weinberg R. 2002. Rules for making human tumor cells. N Engl J Med. 347 (20): 1593-603.

88. Ham J., Babij C., Whitfield J., Pfarr C.M., Lallemand D., Yaniv M., Rubin L.L. 1995. A c-Jun dominant negative mutant protects sympathetic neurons against programmed cell death. Neuron. 14(5):927-39.

89. Han J., Sabbatini P., Perez D., Rao L., Modha D., White E. 1996. The E1B 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes Dev. 10: 461477

90. Hanahan D. and Weinberg R. 2000. The hallmarks of cancer. Cell. 100(1): 57-70.

91. Hancock J.F., Paterson H., Marshall C.J. 1990. A polybasic domain or palmitoylation is required in addition to the CAAX motif to localize p21ras to the plasma membrane. Cell. 63(1): 133-9.

92. Harbour J.W., Dean D.C. 2000 a. The Rb/E2F pathway: expanding roles and emerging paradigms. Genes. Dev. 14: 2393-2409.

93. Harbour J.W., Dean D.C. 2000 b. Chromatin remodeling and Rb activity. Curr. Opin. Cell. Biol. 12: 685-689

94. Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K., Elledge S.J. 1993. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816.

95. Hatakeyama M. and Weinberg R.A. 1995. The role of pRb in cell cycle control. Progress in Cell Cycle Res. 1:9-19.

96. Helt A.M. and Galloway D.A. 2003. Mechanisms by which DNA tumor virus oncoproteins target the Rb family of pocket proteins. Carcinogenesis. 24 (2): 159-69.

97. Henry H., Thomas A., Shen Y., White E. 2002. Regulation of the mitochondrial checkpoint in p53-mediated apoptosis confers resistance to cell death. Oncogene. 21(5): 748-60.

98. Herber B., Truss M., Beato M., Muller R. 1994. Inducible regulatory elements in the human cyclin D1 promotor. Oncogene. 9: 2105-2107.

99. Herrera R.E., Sah V.P., Williams B.O., Makela T.P., Weinberg R.A., Jacks T. 1996 Altered cell cycle kinetics, gene expression, and G1 restriction point regulation in Rb-deficient fibroblasts. Mol. Cell. Biol. 16: 2402-2407.

100. Hibi M., Lin A., Smeal T., Minden A., Karin M. 1993. Identification of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev. 7(11):2135-48.

101. Hicks G.G., Egan S.E., Greenberg A.H., Mowat M. 1991. Mutant p53 tumor suppressor alleles release ras-induced cell cycle growth arrest. Mol. Cell Biol. 11:1344-52

102. Hitomi M., Shu J., Agarwal M., Agarwal A., Stacey D. 1998. P2 jWafi inhibits the activity of cyclin dependent kinase 2 by preventing its activating phosphorylation. Oncogene. 17: 959-969.

103. Hofmann F., Livingston D.M. 1996. Differential effects of cdk2 and cdk3 on the control of pRb and E2F function during G1 exit. Genes Dev. 10:851-61

104. Holmes J.K., Solomon M.J. 2001. The role of Thrl60 phosphorylation of Cdk2 in substrate recognition. Eur. J. Biochem. 268: 4647-4652.

105. Huang D.C., Cory S., Strasser A. 1997. Bcl-2, Bcl-XL and adenovirus protein ElB19kD are functionally equivalent in their ability to inhibit cell death. Oncogene 14:405-414

106. Hung M.C., Wang S.C. 2000. Suppressing HER2/neu-mediated cell transformation by transcriptional repressors. Breast Dis. 11: 133-44.

107. Hunter T., Pines J. 1994. Cyclins and cancer. II: Cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell. 79(4):573-82.

108. Ikeda M.A. and Nevins J.R. 1993. Identification of distinct roles for separate El A domains in disruption of E2F complexes. Mol Cell Biol. 13(11): 7029-35.

109. Ip Y.T. and Davis R.J. 1998. Signal transduction by the c-Jun N-terminal kinase (JNK)--from inflammation to development. Curr Opin Cell Biol. 10(2): 205-19.

110. Iwasa H., Han J., Ishikawa F.2003. Mitogen-activated protein kinasep38 defines the common senescence-signalling pathway. Genes Cells. 2003 8(2): 31-44.

111. Jochemsen AG., Bernards R., van Kranen HJ., Houweling A., Bos JL, van der Eb AJ. 1986. Different activities of the adenovirus types 5 and 12 El A regions in transformation with the EJ Ha-ras oncogene. J Virol. 59(3): 684-91.

112. Jochum W., Passegue E., Wagner EF. 2001. AP-1 in mouse development and tumorigenesis. Oncogene. 20(19):2401-12.

113. Johnson RS., van Lingen B., Papaioannou VE., Spiegelman BM. 1993. A null mutation at the c-jun locus causes embryonic lethality and retarded cell growth in culture. Genes Dev. 1993. 7(7B):1309-17.

114. Joyce D., Bouzahzah B., Fu M., Albanese C., D'Amico M., Steer J.,

115. Klein JU., Lee RJ., Segall J.E., Westwick J.K., Der CJ., Pestell RG. 1999. Integration of Rac-dependent regulation of cyclin D1 transcription through a nuclear factor-kappaB-dependent pathway. J Biol Chem. 274(36):25245-9.

116. Kaldis P., Russo A.A., Chou H.S., Pavletich N.P., Solomon M.J. 1998. Human and yeast cdk-activating kinases (CAKs) display distinct substrate specificities. Mol. Biol. Cell. 9 (9): 2545-2560.

117. Kaldis P., Solomon M.J. 2000. Analysis of CAK activities from human cells. Eur. J Biochem. 267:4213-4221Kaldis P. 1999. The cdkactivating kinase (CAK): from yeast to mammals. Cell. Mol. Life. Sci.55:284-96

118. Kannabiran C., Morris G.F., Mathews M.B. 1999. Dual action of the adenovirus El A 243R oncoprotein on the human proliferating cell nuclear antigen promoter: repression of transcriptional activation by p53. Oncogene 18:7825-33

119. Karin M. 1992. Casein kinase II is a negative regulator of c-Jun DNA binding and AP-1 activity. Cell. 70(5):777-89.

120. Kasof G.M., Goyal L., White E. 1999. Btf, a novel death-promoting transcriptional repressor that interacts with Bcl-2-related proteins. Mol. Cell Biol. 19:4390-4404.

121. Katabami M., Donninger H., Hommura F., Leaner VD., Kinoshita I., Chick JF., Birrer MJ. 2005. Cyclin A is a c-Jun target gene and is necessary for c-Jun-induced anchorage-independent growth in RAT la cells. J Biol Chem. 280(17): 16728-3 8.

122. Kawasaki M., Hisamoto N., lino Y., Yamamoto M., Ninomiya-Tsuji J., Matsumoto K. 1999. A Caenorhabditis elegans JNK signal transduction pathway regulates coordinated movement via type-D GABAergic motor neurons. EMBO J. 18(13): 3604-15.f

123. Keblusek P., Dorsman J.C., Amina F.S., Teunisse S., Teunissen H.,van der Eb A. J., Zantema A. 1999. The adenoviral El A oncoprotein interfere with the growth-inhibiting effect of the Cdk-inhibitor p21CIPI/wafi. j Qf General vir0i0gy. go; 381-390.

124. Keenan SM, Bellone C, Baldassare JJ. 2001. Cyclin-dependent kinase 2 nucleocytoplasmic translocation is regulated by extracellular regulated kinase. J Biol Chem. 276(25): 22404-9.

125. Kennedy N.J. and Davis R.J. 2003. Role of JNK in tumor development. Cell Cycle. 2(3): 199-201.

126. Kennedy N.J., Sluss H.K., Jones SN., Bar-Sagi D., Flavell R.A., Davis R.J. 2003. Suppression of Ras-stimulated transformation by the JNK signal transduction pathway. Genes Dev. 17(5): 629-37.

127. Kirkin V., Joos S., Zornig M. 2004. The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta. 1644(2-3): 229-49

128. Kjoiler L. and Hall A. 1999. Signaling to Rho GTPases. Exp Cell Res. 253(1): 166-79.

129. Kleinberger T. and Shenk T. 1991. A protein kinase is present in a complex with adenovirus El A proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (24): 11143-7

130. Kohl N.E., Ruley H.E. 1987. Role of c-myc in the transformation of REF52 cells by viral and cellular oncogenes.Oncogene 2:41-8

131. Kolbus A., Herr I., Schreiber M., Debatin K.M., Wagner EF., Angel P. 2000. c-Jun-dependent CD95-L expression is a rate-limiting step in the induction of apoptosis by alkylating agents. Mol Cell Biol. 20(2):575-82.

132. Kouzarides T. 1999. Histone acetylases and deacetylases in cell proliferation. Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 40-48.

133. Kovary K., Bravo R. 1991. The jun and fos protein families are both required for cell cycle progression in fibroblasts. Mol Cell Biol.11(9):4466-72.

134. Lawler S., Fleming Y., Goedert M., Cohen P. 1998. Synergistic activation of SAPK1/JNK1 by two MAP kinase kinases in vitro. Curr Biol. 8(25): 1387-90.

135. Lee W.H., Shew J.Y., Hong F.D., Sery T.W., Donoso L.A., Young L.J., Bookstein R., Lee E.Y. 1987. The retinoblastoma susceptibility gene encodes a nuclear phosphoprotein associated with DNA binding activity. Nature 329: 642-645.

136. Lees E. 1995. Cyclin dependent kinase regulation. Curr. Opin. Cell. Biol. 7: 773-780.

137. Lees E., Faha B., Dulic V., Reed S.I., Harlow E. 1992. Cyclin E/cdk2 and cyclin A/cdk2 kinases associate with pi07 and E2F in a temporally distinct manner. Genes. Dev. 6: 1874-1885.

138. Lei K., Davis R.J. 2003. JNK phosphorylation of Bim-related members of the Bcl2 family induces Bax-dependent apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA.

139. Le-Niculescu H., Bonfoco E., Kasuya Y., Claret FX., Green DR., Karin M. 1999. Withdrawal of survival factors results in activation of the JNK pathway in neuronal cells leading to Fas ligand induction and cell death. Mol Cell Biol. 19(1):751-63.

140. Lents N.H., Keenan S.M., Bellone C., Baldassare J.J. 2002. Stimulation of the Raf/MEK/ERK cascade is necessary and sufficient for activation and Thr-160 phosphorylation of a nuclear-targeted CDK2. J Biol Chem. 277(49):47469-75

141. Liao Y. and Hung MC. Regulation of the activity of p38 mitogen-activated protein kinase by Akt in cancer and adenoviral protein E1A-mediated sensitization to apoptosis. Mol Cell Biol. 23 (19): 6836-48.

142. Lin A., Frost J., Deng T., Smeal T., al-Alawi N., Kikkawa U., Hunter T., Brenner D., Karin M. 1992. Casein kinase II is a negative regulator of c-Jun DNA binding and AP-1 activity. Cell. 70(5): 777-89.

143. Lin A. 2002. Activation of the JNK signaling pathway: breaking the brake on apoptosis. Bioessays. 25(l):17-24.

144. Liu F., Matsuura I. 2005. Inhibition of Smad antiproliferative function by CDK phosphorylation. Cell Cycle. 4(1): 63-6.

145. Liu F. and Green MR. 1990. A specific member of the ATF transcription factor family can mediate transcription activation by the adenovirus El A protein. Cell. 61 (7): 1217-1224.

146. Lomonosova E., Subramanian T., Chinnadurai G. 2005. Mitochondrial localization of p53 during adenovirus infection and regulation of its activity by E1B-19K. Oncogene. 24(45): 6796-808.

147. Lowe S.W. 1999. Activation of p53 by oncogenes. Endocr. Relat. Cancer. 6:45-48.

148. Lowe S.W., Ruley H.E. 1993. Stabilization of the p53 tumor suppressor is induced by adenovirus 5 El A and accompanies apoptosis. Genes Dev. 7: 535-545.

149. Lozano E., Betson M., Braga V.M. 2003. Tumor progression: Small GTPases and loss of cell-cell adhesion. Bioessays. 25(5): 452-63.

150. Lucas J., Herzinger T., Hansen K., Moroni M., Reznizky D., Helin K., Reed S., Bartek J. 1997. CyclinE-induced S phase whithout inactivation pRb/E2F pathway. Genes Dev. 11: 1479-1492.

151. Lukas J., Lukas C., Bartek J. 2004. Mammalian cell cycle checkpoints: signalling pathways and their organization in space and time. DNA Repair (Amst). 3(8-9):997-1007.

152. Madison DL., Yaciuk P., Kwok RP., Lundblad JR. 2002. Acetylation of the adenovirus-transforming protein El A determines nuclear localization by disrupting association with importin-alpha. J Biol Chem. 277 (41): 38755-63.

153. Mailand N., Falck J., Lukas C., Syljuasen R.G., Welcker M., Bartek J., Lukas J. 2000. Rapid destruction of human Cdc25A in response to DNA damage. Science 288: 1425-1429.

154. Maity A., McKenna W.G., Muschel R.J. 1995. Evidence for post-transcriptional regulation of cyclin B1 mRNA in the cell cycle and following irradiation in HeLa cells. EMBO J. 4: 603-609

155. Mai A., Chattopadhyay D., Ghosh M.K., Poon R.Y., Hunter T., Harter M.L. 2000. P21 and retinoblastoma protein control the absence of DNA replication in terminally differentiated muscle cells. J Cell. Biol. 149: 281-292.

156. Malliri A., van Es S., Huveneers S., Collard JG. 2004. The Rac exchange factor Tiaml is required for the establishment and maintenance of cadherin-based adhesions. J Biol Chem. 279(29): 30092-8.

157. Mann D.J., Jones N.C. 1996. E2F-1 but not E2F-4 can overcome pl6-induced G1 cell-cycle arrest. Curr. Biol. 6:474-483

158. McCabe M.T., Azih OJ., Day ML. 2005. pRb-Independent growth arrest and transcriptional regulation of E2F target genes. Neoplasia. 7(2): 14151.

159. McMahon M., Woods D. 2001. Regulation of the p53 pathway by Ras, the plot thickens. Biochim. Biophys. Acta 1471:63-71

160. Medema R.H., Klompmaker R., Smits V.A., Rijksen G. 1998. P21wafl can block cells at two points in the cell cycle, but does not interfere with processive DNA-replication or stress-activated kinases. Oncogene 16(4): 431-441.

161. Minden A., Lin A., Claret FX., Abo A., Karin M. 1995. Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell. 81(7): 1147-57.

162. Montminy M. 1994. Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on a common nuclear factor. Nature. 370(6486):226-9.

163. Moroy T, Geisen C. 2004. Cyclin E. Int J Biochem Cell Biol. 36(8): 1424-39

164. Morrison A.J., Sardet C., Herrera R.E. 2002. Retinoblastoma protein transcriptional repression through histone deacetylation of a single nucleosome. Mol Cell Biol. 22(3):856-65.

165. Morris L., Allen K., La Thangue N. 2000. Regulation of E2F transcription by CyclinE-Cdk2 kinase mediated through p300/CBP co-activators. Nat. Cell Biol. 2: 232-239.

166. Morrison D.K., Cutler R.E. 1997. The complexity of Raf-1 regulation. Curr. Opin. Cell. Biol. 9:174-9

167. Morton S., Davis R.J., McLaren A., Cohen P. 2003. A reinvestigation of the multisite phosphorylation of the transcription factor c-Jun. EMBO J. 2003. 22(15):3876-86.

168. Mymryk J.S., Shire K., Bayley S.T. 1994. Induction of apoptosis by adenovirus type 5 El A in rat cells requires a proliferation block. Oncogene 9:1187-93

169. Mymryk J.S. and Bayley S.T. 1993. Multiple pathways for gene activation in rodent cells by the smaller adenovirus 5 El A protein and their relevance to growth and transformation. J Gen Virol. 74 (10): 213141.

170. Mymryk J.S. 1996. Tumour suppressive properties of the adenovirus 5 E1A oncogene. Oncogene. 13(8): 1581-9.

171. Nishina H., Wada T., Katada T. 2004. Physiological roles of SAPK/JNK signaling pathway. J Biochem (Tokyo). 136(2):123-6.

172. Noda A., Nigg Y., Venable S.F., Pereira-Smith O.M., Smith J.R. 1994. Cloning of senescent cell-derived inhibitors of DNA synthesis using an expression screen. Exp. Cell Res. 211: 90-98.

173. Nomura H., Sawada Y., Ohtaki S. 1998. Interaction of p27 with El A and its effect on CDK kinase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 248 (2): 228-34.

174. O'Brien V. 1998. Viruses and apoptosis. J Gen. Virol .79:18331845

175. Offringa R., Smits A.M., Houweling A., Bos J.L., van der Eb AJ. 1988. Similar effects of adenovirus El A and glucocorticoid hormones on the expression of the metalloprotease stromelysin. Nucleic Acids Res. 16: 0973-84.

176. Offringa R., Gebel S., van Dam H., Timmers M., Smits A., Zwart R., sten B., Bos JL., van der Eb A., Herrlich P. 1990. A novel function of the transforming domain of El a: repression of AP-1 activity. Cell. 62 (3): 527-38.

177. Ohtsubo M. and Roberts J.M. 1993. Cyclin-dependent regulation of G1 in mammalian fibroblasts. Science 259: 1908-1912

178. Ohtsubo M., Theodoras A.M., Shumacher J., Roberts J.M., Pagano M. 1995. Human cyclin E, nuclear protein essential for the Gl-to-S transition. Mol. cell Biol. 15: 2612-2624.

179. Olson M.F., Paterson H.F., Marshall C.J. 1998. Signals from Ras and Rho GTPases interact to regulate expression of p21Wafl/Cipl. Nature. 394(6690):295-9.

180. O'Reilly L.A,. Huang D.C., Strasser A. 1996. The cell death inhibitor Bcl-2 and its homologues influence control of cell cycle entry. EMBO J. 15(24): 6979-90.

181. Pagano M., Pepperkok R., Verde F., Ansorge W., Draetta G. 1992. Cyclin A is required at two points in the human cell cycle. EMBO J. 11:961-971

182. Papavassiliou AG. 1993. c-Jun phosphorylation in signal transduction and gene regulation. Anticancer Res. 13(6A):2213-20.

183. Pardee A.B. 1974. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. 71: 1286-1290.

184. Petersen B.O., Lukas J., Sorensen C.S., Bartek J., Helin K. 1999. Phosphorylation of mammalian CDC6 by cyclin A/CDK2 regulates its subcellular localization. EMBO J. 18:396-410

185. Phillips A.C., Bates S., Ryan K.M., Helin K., Vousden K.H. 1997. Induction of DNA synthesis and apoptosis are separable functions of E2F-1. Genes Dev. 11: 1853-1863.

186. Potapova O., Gorospe M., Bost F., Dean N.M., Gaarde W.A., Mercola D., Holbrook NJ. 2000. c-Jun N-terminal kinase is essential for growth of human T98G glioblastoma cells. J Biol Chem. 275(32): 24767-75.

187. Pulverer B.J., Kyriakis J.M., Avruch J., Nikolakaki E., Woodgett J.R. 1991. Phosphorylation of c-jun mediated by MAP kinases. Nature. 353(6345):670-4.

188. Quinlan M.P. 1993. E1A 12S in the absence of E1B or other cooperating oncogenes enables cells to overcome apoptosis. Oncogene. 8(12): 3289-96.

189. Rank K.B., Evans D.B., Sharma S.K. 2000. N-terminal domains of cyclin-dependent kinase inhibitory proteins block the phosphorylation ofcdk2/Cyclin E by the CDK-activating kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: 469-473

190. Rao L., Modha D., White E. 1997. The E1B 19K protein associates with lamins in vivo and its proper localization is required for inhibition of apoptosis. Oncogene 15:1587-1597

191. Rebollo A., Dumoutier L., Renauld J.C., Zaballos A., Ayllon V., Martinez-A C. 2000. Bcl-3 expression promotes cell survival following interleukin-4 deprivation and is controlled by API and API-like transcription factors. Mol Cell Biol. 20(10):3407-16.

192. Rennefahrt U.E., Illert B., Kerkhoff E., Troppmair J., Rapp UR. 2002. Constitutive JNK activation in NIH 3T3 fibroblasts induces a partially transformed phenotype. J Biol Chem. 277(33): 29510-8.

193. Resnitzky D., Reed S.I. 1995. Different roles for cyclins D1 and E in regulation of the Gl-to-S transition. Mol. Cell Biol. 15:3463-3469

194. Ridley A.J. 2004. Rho proteins and cancer. Breast Cancer Res Treat. 84(1): 13-9.

195. Rodrigues G.A., Park M., Schlessinger J. 1997. Activation of the JNK pathway is essential for transformation by the Met oncogene. EMBO J. 16(10): 2634-45.

196. Russo A.A., Jeffrey P.D., Patten A.K., Massague J., Pavletich N.P. 1996. Crystal structure of the p27Kipl cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Nature. 382: 295-296.

197. Sabapathy K., Hochedlinger K., Nam S.Y., Bauer A., Karin M., Wagner E.F. 2004. Distinct roles for JNK1 and JNK2 in regulating JNK activity and c-Jun-dependent cell proliferation. Mol Cell. 15(5): 713-25.

198. Sabapathy K., Wagner E.F. 2004. JNK2: a negative regulator of cellular proliferation. Cell Cycle. 3(12): 1520-3.

199. Sabbatini P., Chiou S.K., Rao L., White E. 1995. Modulation of p53-mediated transcriptional repression and apoptosis by the adenovirus E1B 19K protein. Mol. Cell Biol. 15: 1060-1070

200. Sage J., Mulligan G.J., Attardi L.D., Miller A., Chen S., Williams B., Theodorou E., Jacks T. 2000. Targeted disruption of the three Rb-related genes leads to loss of G(l) control and immortalization. Genes Dev. 14(23): 3037-50.

201. Saha P., Chen J., Thome K.C., Lawlis S.J., Hou Z.H., Hendricks M., Parvin J.D., Dutta A. 1998. Human CDC6/Cdcl8 associates with Orel and cyclin-cdk and is selectively eliminated from the nucleus at the onset of S phase. Mol. Cell Biol. 18:2758-2767

202. Saha P., Eichbaum Q., Silberman E.D., Mayer B.J., Dutta A. 1997. P21CIP1 and Cdc25A: competition between an inhibitor and an activator of cyclin-dependent kinases. Mol. Cell. Biol. 17(8): 4338-4345.

203. Schmidt A., Hall A. 2002. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. Genes Dev. 16(13): 1587-609.

204. Schneider E, Montenarh M, Wagner P. 1998. Regulation of CAK kinase activity by p53 .Oncogene. 17(21 ):2733-41.

205. Schreiber M., Kolbus A., Piu F., Szabowski A., Mohle-Steinlein U., Tian J., Karin M., Angel P., Wagner E.F. 1999. Control of cell cycle progression by c-Jun is p53 dependent. Genes Dev. 13(5):607-19.

206. Schulze A., Mannhardt B., Zerfass-Thome K., Zwerschke W., Jansen-Durr P. 1998. Anchorage-independent transcription of the cyclin A gene induced by the E7 oncoprotein of human papillomavirus type 16. J Virol.72(3):2323-34.

207. Schutte J., Minna J.D., Birrer M.J. Deregulated expression of human c-jun transforms primary rat embryo cells in cooperation with an activated c-Ha-ras gene and transforms rat-la cells as a single gene. Proc Natl Acad SciUS A. 86(7):2257-61.

208. See R.H, Shi Y. 1998. Adenovirus E1B 19,000-molecular-weight protein activates c-Jun N-terminal kinase and c-Jun-mediated transcription. Mol. Cell Biol. 18:4012-4022

209. Serrano M., Lee H., Chin L., Cordon Cardo C., Beach D. and DePinho R.A. 1996. Role of the JNK4a locus in tumor supression and cell mortality. Cell 85: 27-37.

210. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88:593-602

211. Severino A., Baldi A., Cottone G., Han M., Sang N., Giordano A., Mileo A., Paggi M., De Luca A. RACK1 is a functional target of the El A oncoprotein. J Cell Physiol. 2004 199:134-9

212. Sewing A., Wiseman B., Lloyd A.C., Land H. 1997. High-intensity Raf signal causes cell cycle arrest mediated by p21Cipl. Mol. Cell Biol. 17:5588-97

213. Shan B., Lee W.H. 1994. Deregulated expression of E2F-1 induces S-phase entry and leads to apoptosis. Mol. Cell Biol. 14:8166-8173

214. Shaulian E., Karin M. 2001. AP-1 in cell proliferation and survival. Oncogene. 20: 2390-2400.

215. Shaulian E., Karin M. 2002. AP-1 as a regulator of cell life and death. Nature Cell Biol. 4: E131-E136.

216. Shaulian E., Schreiber M., Piu F., Beeche M., Wagner E.F., Karin M. 2000. The mammalian UV response: c-Jun induction is required for exit from p53-imposed growth arrest. Cell. 2000 Dec 8;103(6):897-907.

217. Sherr C.J, Weber J.D. 2000. The ARF/p53 pathway. Curr. Opin. Genet. Dev. 10:94-99

218. Sherr C.J., RobertsJ.M. 1995. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases. Genes Dev., 9: 1149-1163.

219. Sherr C.J., Roberts J.M. 1999. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes. Dev. 13: 1501-1512

220. Sherwin S.A., Rapp U.R., Benveniste R.E., Sen A., Todaro G.J. 1978. Rescue of endogenous 30S retroviral sequences from mouse cells by baboon type C virus. J Virol. 26:257-64

221. Shields JM., Pruitt K., McFall A., Shaub A., Der CJ. Understanding Ras: 'it ain't over 'til it's over'. Trends Cell Biol. 2000 Apr; 10(4): 147-54.

222. Shim J., Lee H., Park J., Kim H., Choi E.J. 1996. A non-enzymatic p21 protein inhibitor of stress-activated protein kinases. Nature 381:804806

223. Smeal T., Binetruy B., Mercola D.A., Birrer M., Karin M. 1991. Oncogenic and transcriptional cooperation with Ha-Ras requires phosphorylation of c-Jun on serines 63 and 73. Nature. 1354(6353):494-6.

224. Smits V.A., Klompmaker R., Vallenius T., Rijksen G., Makela T.P., Medema R.H. 2000. P21 inhibits Thrl61 phosphorylation of Cdc2 to enforce the G2 DNA damage checkpoint. J. Biol. Chem. 275 (39): 3063830643.

225. Smits VA, Medema RH. 2001. Checking out the G(2)/M transition. Biochim Biophys Acta. 1519(1-2): 1-12.

226. Song H., Hanlon N., Brown N.R., Noble M.E., Johnson L.N., Barford D. 2001. Phosphoprotein-protein interactions revealed by the crystal structure of kinase-associated phosphatase in complex with phosphoCDK2. Mol. Cell. 7: 615-626.

227. Sulciner D.J., Irani K., Yu Z.X., Ferrans V.J., Goldschmidt-Clermont P., Finkel T. 1996. Racl regulates a cytokine-stimulated, redox-dependent pathway necessary for NF-kappaB activation. Mol Cell Biol. 16(12): 7115-21.

228. Takuwa N., Takuwa Y. 1997. Ras activity late in G1 phase required for p27kipl downregulation, passage through the restriction point, and entry into S phase in growth factor-stimulated NIH 3T3 fibroblasts. Mol. Cell Biol. 17:5348-58

229. Teodoro J.G., Shore G.C., Branton P.E. 1995. Adenovirus E1A proteins induce apoptosis by both p53-dependent and p53-independent mechanisms. Oncogene. 11:467-474.

230. Thomas A., Giesler T., White E. 2000. P53 mediates Bcl-2 phosphorylation and apoptosis via activation of the Cdc42/JNK1 pathway. Oncogene. 19: 5259-5269.

231. Thomas A., White E. 1998. Suppression of the p300-dependent mdm2 negative-feedback loop induces the p53 apoptotic function. Genes Dev. 12:1975-1985

232. Thompson T.A., Kim K., Gould M. N. 1998. Harvey ras results in a higher frequency of mammary carcinomas than Kirsten ras after direct retroviral transfer into the rat mammary gland. Cancer Res. 58: 50975104.

233. Tin Su T. 2001. Cell cycle: How, when and why cells get rid of cyclin A. Curr. Biol. 11: 467-469

234. Tournier C., Hess P., Yang D.D., Xu J., Turner T.K., Nimnual A., Bar-Sagi D., Jones S.N., Flavell R.A., Davis R.J. 2000. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway. Science. 288(5467): 870-4.

235. Trentin J.J., Yabe Y., Taylor G. 1962 The quest for human cancer viruses: a new aproach to an old problem reveals cancer induction in hamster by human adenoviruses. Science. 137: 835-41.

236. Turnell A., Grand R, Gorbea C., Zhang X., Wang W., Mymrik J., Gallimore P. 2000. Regulation of the 26S proteasome by adenovirus El A. EMBO. 19: 4759-73

237. Van Dam H., Offringa R., Meijer I., Stein B., Smits AM., Herrlich P., Bos JL., van der Eb A. 1990. Differential effects of the adenovirus El A oncogene on members of the AP-1 transcription factor family. Mol Cell Biol. 10(11): 5857-64.

238. Vigo E., Muller H., Prosperini E., Hateboer G., Cartwright P., Moroni M.C., Helin K. 1999. CDC25A phosphatase is a target of E2F and is required for efficient E2F-induced S phase. Mol. Cell. Biol. 19 (9): 6379-6395.

239. Viniegra J.G., Losa J.H., Sanchez-Arevalo V.J., Parada Cobo C., Soria V.M., Ramon y Cajal S., Sanchez-Prieto R. 2002. Modulation of PI3K/Akt pathway by Ela mediates sensitivity to cisplatin. Oncogene. 21(46):7131-6.

240. Vogt P.K., Bader A.G. 2005. Jun: stealth, stability, and transformation. Mol Cell. 19(4):432-3.

241. Vogt P.K. 2001. Jun, the oncoprotein. Oncogene. 20(19): 2365-77.

242. Vries R.G., Prudenziati M., Zwartjes C., Verlaan M., Kalkhoven E., Zantema A. 2001. A specific lysine in c-Jun is required for transcriptional repression by El A and is acetylated by p300. EMBO J. 20 (21): 20952103.

243. Wada T. and Penninger JM. 2004. Stress kinase MKK7: savior of cell cycle arrest and cellular senescence. Cell Cycle. 3(5):577-9.

244. Wang J., Chenivesse X., Henglein B., Brechot C. 1990. Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma. Nature. 343(6258): 555-7.

245. Watson A., Eilers A., Lallemand D., Kyriakis J., Rubin L.L., Ham J.1998. Phosphorylation of c-Jun is necessary for apoptosis induced by survival signal withdrawal in cerebellar granule neurons. J Neurosci. 18(2): 751-62.

246. Weber J.D., Taylor L.J., Roussel M.F., Sherr C.J., Bar-Sagi D.1999. Nucleolar Arf sequesters Mdm2 and activates p53. Nat. Cell Biol. 1:20-6

247. Weinberg R.A. 1995. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 81: 323-330.

248. Weiss C., Schneider S., Wagner E.F., Zhang X., Seto E., Bohmann D. JNK phosphorylation relieves HDAC3-dependent suppression of the transcriptional activity of c-Jun. EMBO J. 2003 Jul 15;22(14):3686-95.

249. Welsh C.F. 2004. Rho GTPases as key transducers of proliferative signals in gl cell cycle regulation. Breast Cancer Res Treat. 84(l):33-42.

250. Wen W., Taylor S.S., Meinkoth J.L. 1995. The expression and intracellular distribution of the heat-stable protein kinase inhibitor is cell cycle regulated. J Biol Chem. 270(5): 2041-6.

251. Weston C.R., Davis R.J. 2002. The JNK signal transduction pathway. Curr Opin Genet Dev. 12(1): 14-21.

252. White E. 1998. Regulation of apoptosis by adenovirus El A and E1B oncogenes. Seminars in Virology 8: 505-513.

253. White E., Cipriani R. 1989. Specific disruption of intermediate filaments and the nuclear lamina by the 19-kDa product of the adenovirus E1B oncogene. Proc. Natl. Acad .Sci U S A 86:9886-90

254. White E., Cipriani R. 1990. Role of adenovirus E1B proteins in transformation: altered organization of intermediate filaments in transformed cells that express the 19-kilodalton protein. Mol. Cell Biol. 10:120-130

255. White E., Grodzicker T., Stillman B.W. 1984. Mutations in the gene encoding the adenovirus early region IB 19,000-molecular-weight tumor antigen cause the degradation of chromosomal DNA. J Virol. 52:410-419

256. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C., Yasuda J., Davis R.J. 1998. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation. Science. 281(5383): 1671-4.

257. Whitmarsh A.J., Davis R.J. 1998. Structural organization of MAP-kinase signaling modules by scaffold proteins in yeast and mammals. Trends Biochem Sci. 23(12):481-5.

258. Whyte P., Williamson N.M., E. Harlow. 1989. Cellular targets for transformation by the adenovirus El A proteins. Cell 56: 67-75.

259. Wilkinson M.G., Millar J.B. 2000. Control of the eukaryotic cell cycle by MAP kinase signaling pathways. FASEB J. 14:2147-57.

260. Wisdom R., Johnson R.S, Moore C. 1999. c-Jun regulates cell cycle progression and apoptosis by distinct mechanisms. EMBO J. 4; 18(1): 18897.

261. Wohlschlegel J.A., Dwyer B.T., Takeda D.Y., Dutta A. 2001. Mutational analysis of the Cy motif from p21 reveals sequence degeneracy and specificity for different cyclin-dependent kinases. Mol. Cell. Biol. 21:4868-4874.

262. Woo M.S., Sanchez I., Dynlacht B.D. 1997. P130 and pl07 use a conserved domain to inhibit cellular cyclin-dependent kinase activity. Mol. Cell. Biol. 17: 3566-3579.

263. Yamamoto K., Ichijo H., Korsmeyer S.J. 1999. BCL-2 is phosphorylated and inactivated by an ASKl/Jun N-terminal proteinkinase pathway normally activated at G(2)/M. Mol Cell Biol. 19(12): 8469-78.

264. Yamazaki D., Kurisu S., Takenawa T. 2005. Regulation of cancer cell motility through actin reorganization. Cancer Sci. 96(7): 379-86.

265. Yu D.H., Scorsone K., Hung M.C. 1991. Adenovirus type 5 El A gene products act as transformation suppressors of the neu oncogene. Mol Cell Biol. Mar; 11(3): 1745-50.

266. Yujiri T., Sather S., Fanger G.R., Johnson G.L.1998. Role of MEKK1 in cell survival and activation of JNK and ERK pathways defined by targeted gene disruption. Science. 1998. 282(5395):1911-4.

267. Zarkowska T. and Mittnacht S. 1997. Differential phosphorylation cf the retinoblastoma protein by Gl/S cyclin-dependent kinases. J. Biol. Chem. 19: 12738-12746.

268. Zerler B., Moran B., Maruyama K., Moomaw J., Grodzicker T., Ruley H.E. 1986. Adenovirus El A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Mol Cell Biol. 6(3):887-99.

269. Zhang H. Xiong Y., Beach D. 1993. Proliferating cell nuclear antigen and p21 are components of multiple cell cycle kinase complexes. Mol. Biol. Cell. 4 (9): 897-906.

270. Zhang H.S., Gavin M., Dahiya A., Postigo A.A., Ma D., Luo R.X., Harbour J.W., Dean D.C. 2000. Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF andRb-hSWI/SNF. Cell 101: 79-89.

271. Zhao J., Kennedy B.K., Lawrence B.D., Barbie D.A., Matera A.G., Fletcher J.A., Harlow E. 2000. NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent histone gene transcription. Genes Dev. 14:2283-2297

272. Zhou B.B., Elledge S.J. 2000. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature 408: 433-439.

273. Zhu J., Woods D., McMahon M., Bishop J.M. 1998. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes Dev. 12:2997-3007

274. Zindy F., Eischen C.M., Randle D.H., Kamijo T., Cleveland J.L., Sherr C.J., Roussel M.F. 1998. Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes Dev. 12:2424-24331791. БЛАГОДАРНОСТИ

275. Отдельное спасибо моему «немецкому» руководителю Питеру Херрлиху за возможность работать в его институтах в Германии, веру в меня и развитие во мне самостоятельности в научной работе.

276. Я благодарю заведующего лабораторией Валерия Анатольевича Поспелова за научные дискуссии, под держку и интерес к моей работе.

277. Особое спасибо моему второму «немецкому» соруководителю Питеру Ангелу (Немецкий центр рака, Гейдельберг, Германия) за научные консультации и экспериментальную помощь в работе.

278. Я благодарю Николая Аксенова за помощь в проведении экспериментов проточной цитометрии.

279. Огромное спасибо моим коллегам и сотрудникам нашей лаборатории за помощь и прекрасную душевную атмосферу, делающую работу в радость. Отдельное спасибо Татьяне Вадимовне Быковой и Ане Нелюдовой за стилистические правки при прочтении автореферата.

280. Спасибо моим друзьям, родителям и близким за заботу и поддержку.

Информация о работе

Бричкина, Анна Игоревна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.25

Диссертация

Первичное действие аденовирусного онкогена E1A на JNK/cJUN путь и регуляцию клеточного цикла у трансформантов E1A+E1B-19кДа и E1A+cHa-Ras - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы