Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Первичная структура генов фибера и гексона аденовирусов птиц и разработка новых методов диагностики аденовирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобанов, Владислав Анатольевич, Владимир

^ ^ ; и с/ - х / V X V ~

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ЛОБАНОВ Владислав Анатольевич

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОВ ФИБЕРА И ГЕКСОНА АДЕНОВИРУСОВ ПТИЦ И РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06 "Вирусология"

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ДРЫГИН Владимир Викторович

Научный консультант -кандидат ветеринарных наук БОРИСОВ Владимир Владимирович

Владимир -1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ГТЦ - гуанидинтиоцианат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСБ - ДНК-связывающий белок

ДСН - додецилсульфат натрия

ИКП - инвертированные концевые повторы

ИПТГ - изолропилтио-р-О-галактопиранозид

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы

КРС - крупный рогатый скот

КЭ - куриный эмбрион

мРНК - матричная РНК

н.о. - нуклеотидное основание

ОП - основание пентона

ОРТ - открытая рамка трансляции

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РДП - реакция диффузной преципитации

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РН - реакция нейтрализации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РСК - реакция связывания комплемента

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

СГПК - синдром гидроперикардита кур

ТБ - терминальный белок

Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан

ХАО - хорио-аллантоисная оболочка

ЦПИ - цитопатические изменения

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭИДбо - доза вируса, вызывающая гибель 50% инфицированных эмбрионов

BAV - bovine adenovirus - аденовирус КРС

CAV - chicken anemia virus - вирус анемии кур

CELO - chick embrio lethal orphan - аденовирус птиц FAVI

EDS-76 - egg drop syndrome virus - вирус синдрома снижения яйценоскости

(ССЯ-76)

FAV - fowl adenovirus - аденовирус птиц

HAV - human adenovirus - аденовирус человека

НЕ - hemorrhagic enteritis - геморрагический энтерит

Ну - гидрофобный аминокислотный остаток

HVR - hyper-variable region - высоко-вариабельная область

MAV - murine adenovirus - аденовирус мышей

MSD - marble spleen disease - болезнь мраморной селезенки

dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат

OAV - ovine adenovirus - аденовирус овец

QBV - quail bronchitis virus - вирус бронхита перепелов

SPF - specific pathogen free - свободный от специфических патогенов

YA-PHK - virus-associated - ассоциированная с вирусом РНК

Vp - вирусный белок (Virus protein)

X - любой аминокислотный остаток

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................11

1.1. Аденовирусы как этиологические агенты некоторых заболеваний

птиц.........................................................................................................11

1.2. Классификация аденовирусов.................................................................16

1.3. Структурная организация аденовирусов птиц.......................................21

1.3.1. Строение вириона.................................................................................21

1.3.2. Структурная организация аденовирусного генома.............................26

1.3.3. Сравнительный анализ геномов аденовирусов птиц

и млекопитающих.................................................................................32

1.4. Структура фибера и его значение в патогенезе аденовирусной

инфекции...............................................................................................35

1.5. Структура и функции белка гексона.......................................................39

1.6. Репликация аденовирусной ДНК............................................................42

1.7. Лабораторная диагностика аденовирусов птиц.....................................47

1.7.1. Выделение и культивирование аденовирусов птиц.............................48

1.7.2. Серологические и молекулярно-биологические методы, используемые для лабораторной диагностики

аденовирусов птиц...............................................................................50

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................55

2.1. Материалы...............................................................................................55

2.2. Методы.....................................................................................................58

2.3. Результаты собственных исследований..................................................64

2.3.1. Разработка метода выявления генома вируса

в различных пробах с использованием ПЦР и

секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера......64

2.3.1.1. Выявление локализации в геноме вируса ЕВБ-76 и определение нуклеотидной последовательности

гена, кодирующего полипептид фибера.............................................65

2.3.1.2. Анализ нуклеотидной последовательности гена и предсказанной аминокислотной последовательности

белка фибера вируса ЕОБ-76...............................................................70

2.3.1.3. Использование ПЦР и секвенирования

амплифицированных фрагментов гена фибера для

индикации вируса Е08-76...................................................................75

2.3.2. Выявление и характеристика этиологического агента

синдрома гидроперикардита кур........................................................76

2.3.2.1. Характеристика вспышки синдрома гидроперикардита

кур на птицефабрике "Красноярская"................................................76

2.3.2.2. Выявление возможной роли РНК-содержащих

вирусов в возникновении СГПК........................................................78

2.3.2.3. Электронно-микроскопическое исследование препарата, полученного в результате выделения вируса из

гомогената печени павших в течение эксперимента цыплят.............80

2.3.2.4. Изучение молекулярно-биологических свойств вируса КИ.95........81

2.3.3. Разработка метода индикации геномов аденовирусов птиц с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена гексона.................................84

2.3.3.1. Выявление локализации в геноме вируса КЯ95

и определение нуклеотидной последовательности гена гексона......84

2.3.3.2. Анализ нуклеотидной и предсказанной

аминокислотной последовательности гена гексона..........................87

2.3.3.3. Использование ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена гексона для выявления

и штаммовой дифференциации аденовирусов птиц.........................96

2.3.3.4. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности консервативной области гена гексона аденовирусов.......................................................................................99

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................106

4. ВЫВОДЫ..................................................................................................112

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................114

6. ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................134

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Семейство Adenoviridae включает в себя вирусы лишенные оболочки с икосаэдрической структурой капсида и геномом, представленным линейной двухцепочечной молекулой ДНК. Среди аденовирусов птиц, объединенных в род Aviadenovirus, выделяют три группы (I, II и III) на основании отличий группоспецифических антигенов. Представители группы I выделены от кур (FAV1-12), гусей (GAV1-3), уток (DAY2), индюков (TAY1-2), а также голубей [104]. В то время как установлено, что единственный представитель группы III - вирус синдрома снижения яйценоскости (EDS-76) и представители группы II (вирус геморрагического энтерита индюков и вирус болезни мраморной селезенки фазанов) способны вызывать специфические заболевания у птиц, роль аденовирусов птиц группы I как первичных патогенов остается предметом дискуссий, поскольку представителей группы I выделяют как от клинически здоровых, так и от больных птиц [143]. В связи с этим существуют предположения о том, что аденовирусы птиц группы FAV являются частью этиологии многофакторных заболеваний. Однако, в последнее время все чаще появляются данные о выделении высокопатогенных штаммов аденовирусов группы I от кур, павших в период эпизоотий в Пакистане, Австралии, Новой Зеландии, США, Германии с такими особенностями, как гепатит с тельцами-включениями и синдром гидроперикардита [151]. С начала 90-х годов вспышки синдрома гидроперикардита кур с высоким уровнем смертности регистрируют на территории России.

Широкое распространение аденовирусов птиц подтверждено серологическими исследованиями, проведенными в различных странах с развитым промышленным птицеводством. Птицеводческие стада обычно содержат антитела против различных серотипов группы I, демонстрируя то, что заражение аденовирусом, относящимся к определенному серотипу, не защищает от заражения аденовирусами других серотипов [153].

Аденовирусы часто выступают в роли вторичного фактора при других инфекционных болезнях, особенно при инфекционном бронхите кур, микоплазмозе и других заболеваниях респираторных органов птицы. Вследствие вертикальной передачи аденовирусы птиц, контаминируя

эмбрионы, часто являются помехой в использовании эмбрионов с целью репродукции других вирусов, что затрудняет проведение лабораторной диагностики других вирусных инфекций птиц.

В настоящее время лабораторная диагностика аденовирусной инфекции основана главным образом на выделении вируса в клеточной культуре и последующей идентификации выделенного вируса с использованием РН и рестрикционного анализа ДНК, а также на выявлении антител в сыворотке крови в РН, РДП и ИФА. Кроме того, используют трансмиссионную электронную микроскопию негативно-контрастированных препаратов и гистологические методы, такие как иммунофлюоресцентный метод [63, 207] и метод иммунопероксидазного окрашивания [86, 209]. Основными недостатками вышеперечисленных методов являются либо длительность постановки, либо неспособность выявлять латентную аденовирусную инфекцию.

Способность аденовирусов персистировать в организме птиц без клинических проявлений инфекции и реактивироваться на фоне иммуносупрессии или стресса, вызванного началом яйцекладки, а также возможность вертикальной передачи делают важной проблему разработки более быстрых и чувствительных методов дифференциальной диагностики аденовирусной инфекции.

Одним из направлений, способных решить эту проблему, является использование метода ПЦР, который основан на энзиматической амплификации фрагмента вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Благодаря высокой специфичности и чувствительности ПЦР позволяет выявлять даже отдельные фрагменты вирусного генома. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов дает возможность установить генетические связи между исследуемыми штаммами и изолятами.

Однако, применение молекулярно-биологических методов и ПЦР в частности для диагностики аденовирусной инфекции птиц ограничено малым количеством данных о структуре геномов представителей рода Aviadenovirus.

В связи с этим является актуальной задача изучения структурных генов аденовирусов птиц с целью создания тест-систем на основе ПЦР.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы явилось исследование первичной структуры гена фибера вируса ЕБ8-76 и гена гексона вируса КЯ95 с целью создания новых средств диагностики аденовирусной инфекции птиц с использованием методов ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить локализацию в геноме вируса Е08-76 гена, кодирующего полипептид фибера и сконструировать рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК вируса Е08-76, пригодные для определения первичной структуры гена фибера;

- определить первичную структуру гена фибера вируса Е08-76;

- изучить возможность использования гена фибера для индикации и штаммовой дифференциации вируса ЕВ8-76 с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК;

- выявить локализацию гена гексона в геноме аденовируса КЯ95 и получить клон, содержащий фрагмент ДНК КЯ95, включающий ген гексона;

- определить первичную структуру гена, кодирующего полипептид мономера гексона вируса КЯ95 и провести сравнительный анализ предсказанной аминокислотной последовательности гексона вируса КЯ95 с первичными последовательностями гексонов других штаммов аденовирусов млекопитающих и птиц, опубликованными ранее;

- разработать метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов птиц с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена гексона;

- определить спектр изолятов аденовирусов птиц, являющихся причиной возникновения вспышек синдрома гидроперикардита кур на птицефабриках России.

Научная новизна исследований. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена фибера штамма 127, а также нуклеотидные

последовательности З'-концевой области гена фибера штаммов В8/78, В-93 и изолята L497 вируса EDS-76.

Показано, что этиологическим агентом вспышки синдрома гидроперикардита кур, произошедшей на одной из птицефабрик России, является аденовирус группы I (KR95).

Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего полипептид мономера гексона аденовируса KR95, а также нуклеотидные последовательности консервативной области гена гексона восьми референтных штаммов и двенадцати российских изолятов аденовирусов птиц.

Установлено, что изоляты аденовирусов птиц, выявленные в пробах органов кур, павших в результате вспышек синдрома гидроперикардита на различных птицефабриках России, генетически наиболее близки к штамму серотипа FAY4.

Практическая значимость. Разработан метод индикации генома вируса EDS-76 в различных вируссодержащих образцах с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера.

Выявлен и охарактеризован этиологический агент синдрома гидроперикардита кур, что позволило провести работу по оптимизации условий культивирования вируса с целью производства инактивированной вакцины.

Разработан метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов птиц с помощью ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов консервативной области гена гексона. С использованием разработанной тест-системы проведена идентификация 12 изолятов аденовирусов птиц, выделенных на территории России в 1998 г.

Разработанные методы индикации генома вируса EDS-76 и выявления геномов и штаммовой дифференциации аденовирусов птиц с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК в настоящее время используются для диагностики аденовирусной инфекции птиц.

Положения, выносимые на защиту:

- определение нуклеотидной последовательности гена и предсказанной аминокислотной последовательности полипептида фибера вируса EDS-76 и

сравнительный анализ установленных структур с аналогичными структурами других аденовирусов млекопитающих и птиц;

- экспресс-метод индикации генома вируса Е08-76, основанный на ПЦР и определении первичной структуры амплифицированных фрагментов гена фибера;

- выявление и характеристика этиологического агента вспышки синдрома гидроперикардита кур, произошедшей на птицефабрике "Красноярская";

- определение первичной структуры гена и полипептида гексона аденовируса КЯ95 и сравнительный анализ установленных структур с аналогичными структурами других аденовирусов млекопитающих и птиц;

- разработка метода индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов птиц с помощью ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена гексона и определение с помощью данного метода спектра изолятов, ассоциированных со вспышками синдрома гидроперикардита в различных птицехозяйствах России.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 248 источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 8 таблицами.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1996-1998 г.г. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ВНИИСБ РАСХН (г. Москва): к.б.н. Акопиан Т. А., Юрову Г. К., Шмарову М. М., а также сотрудникам ВНИИЗЖ: к.б.н. Колосову С. Н., к.х.н. Ломакину А. И., к.б.н. Грибанову О. Г., к.б.н. Щербакову А. В., к.б.н. Щербаковой Л. О., к.б.н. Фалиной Г. М., к.б.н. Мудрак Н. С., Бочкову Ю. А. - за помощь в выполнении отдельных этапов работы, и д.б.н. Перевозчиковой Н. А. - за ценные замечания, сделанные при оформлении работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аденовирусы как этиологические агенты некоторых заболеваний

птиц

Многочисленные сообщения о выделении аденовирусов от различных видов домашних и диких птиц появились впервые в конце 40-х начале 50-х годов. В 1949 году аденовирус был выделен от виргинской перепелки (Colinus virginianus) с симптомами тяжелого респираторного заболевания [166]. Позже установили, что вирус бронхита перепелов (QBV) серологически сходен с вирусом, ассоциированным с гибелью эмбрионов и изолированным Yates в 1952 году. Последний обозначили как CELO (chick embryo lethal orhan) [241].

В то время как представители некоторых серотипов рода Av¿adenovirus признаются этиологическими агентами отдельных