Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Первичная характеристика плазмид возбудителя мелиоидоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Первичная характеристика плазмид возбудителя мелиоидоза"

Pío ОД

На правах рукописи

АНТОНОВ Багеряй Алексе-; а

ПЕРВИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛАЗШД ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛШИДОЗА

СЗ.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученей степени

кандидата медицинских наук

Слрзтов - 1995 г.

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовг: »лъскоы противочумном институте.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор В.И. Илюхин; кандидат медицинских наук. старший научный сотрудник B.C. Замараев.

Официальные оппоненты: доктор биологических нау.-с, профессор

Ю.А. Попов; доктор медицинских наук, профессор Т.И. Анисимова.

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоится - - - - /- -1995 г. в {С/ часов

на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" ( 410071 г.Саратов, Университетская, 46 ). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "/3 " ¿eg igо лЛ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических каук, профессор Корнеев Г. А.

Актуальность проблемы.

Внехромоссмные факторы наследственности играют существенную роль в биологии различных видов микроорганизмов. С момента открытия у бактерий плазмид, кодирующих устойчивость к химическим и физическим агентам, катаболизм органических соединений и синтез бактериоцинов, интерес к внехромосомным элементам наследственности продолжает повышаться (Кудлай Д.Г.1977, Воронин A.M. 1983, 1984, Пеков А.П. 1986 и др.).

I | » 1*5»Л1ТП » 1ЯГ1ПЛ1^« " tl/1ftA»«t - Л |»п»»лул»л л к «л* л •» «»» "11/tMnl I

для изучения основных элементарных генетических процессов, они составляют основу генноинженерных работ, поскольку используются в качестве векторов для клонирования различных генов (Харди К. 198У, Гловер Д.1988, 1989)

Особое внимание заслужили плазмиды в связи с детерминированием вирулентных свойств патогенных бактерий. В первую очередь, это касается токсинопродукции и капсулообразования, ко-дирсзания ферментов агрессии л адгезинов, • цитотоксинов и различных видоспецифических белков поверхностных структур микробных клетск (Пехов А.П. 1986, Uchida I. 1985, Mikesei 1 P. 1983, Ferber D.M., Brubaker R.R. 1981 и др.).

Плазмиды широко распространены среди представителей рода Pseudomonas. Достаточно хорошо изучены половые факторы, плазмиды антибиотикорезистентности и бисдеградации, обеспечивающие псевдомонадам адаптации к разнообразным условиям существования а природе. Разнообразие биосинтетических и клтаболических реакций у представителей рода Pseudomonas, широко населяющих биосферу и принимающие активное участке в сцчщросах минерализации органических соединений, очистке окружающей среды от загрязнений, прямо или косвенно связано с плазмидными решшконами (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. 1990, Воронин A.M. 1983, Рубан Е.Л. 1936, Chakrabarty 1976).

Научный и практический интерес к бактериям данного рода дополнительно связан с возможностью псевдомонад вызывать различные заболевания у растений, животных и человека (Смирнов В. в.. Киприанова К. А. 1990, Вегцал Г. 1981). Из всех псеяломо-кад медицинского значения Pseudomonas pseudomallel и Pseudomonas mallei до настоящего времени остаются в числе сравнительно малоизученных возбудителей тяжелых инфекционных заболеваний

(Беляков В.Д.. Рипис Л.А., Илюхин В.И. 1990).

Культуральные и биохимические свойства возбудителя мелиои доза изучены достаточно подробно (Беляков В. Д., Ряпис Л.А. Илюхин В.И. 1990. Ширяев Д.Т. 1976, Fournier J., Chambón L 1958). В то же время, генетика данного вида микроорганизма ос тается одним из наименее исследованных разделов. Методически приемы работы с внехромосомными факторами наследственное; P.pseudacnalleí разработаны недостаточно. В литератур» имеете: сравнительно небольшой материал об особенностях наследования i экспрессии плазмид 1псР-1 группы в штаммах возбудителей сапа i мелиоидоза и условиях передачи в бактерии данных видов различных плазмид антибиотикорезистентности (Агеева Н.П., Меринов, Л.К. 1986, Петере М.К., Шиповская Н.П., МериноваЛ.К. 1983 Сеимова И.К., 1988, Абаев И.В. 1995).

Собственные плазмиды P.pseudomallel остаются практичесга не изученными. В единичных публикациях сообщается лишь о выявлении плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза (Петере М.К. 1982, Tanphaichltra D. 1989). Однако, обнаружение плазмидных ДНК в одном или двух штаммах не дает представления с природном носительстве, закономерности выделения плазмид ) P.pseudomallel и их функциональной значимости. Следует заметить, что в литературе отсутствуют данные о размере плазмид i их физической структуре, нуклеотидном составе и гомологии нук-леоткдных последовательностей.

Учитывая, что в литературе отсутствуют сведения о плазмид-ном анализе, структурной организации, и функциональной значимости плазмид P.pseudomallel, представлялись весьма актуальными исследования, направленные на изучение внехромосомных репликонов возбудителя мелиоидоза.

Дель работы заключалась в изучении плазмидногс спектра штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в различных географических регионах, проведении первичной характеристики плазмид и оценки возможности их использования в качестве маркеров при внутривидовом типировании штаммов P.pseudomallel. а также для конструирования на их основе ДНК-зонда.

Основные задачи исследования:

1. Отработать эффективный метол плазмидного скрининга и препаративного выделения плазмидных ДНК P.pseudomallel.

- Б

2. Провести сравнительный рестршиокний аяагиэ обнярухея-мх плазмид.

3. Изучить гомологию ДНК слазмид P-pseudanallel на внутри-!Идоеом к межвидовом уровнях и оценить возкожностъ кокструиро-laHKs на кх основе специфического ДКК- зонда.

4. Осусествить передачу плазмид P. pseudcmallei в гетероло-'лчкь'е виды микроорганизмов для последующего изучения свойств юлучекшл гибридных £Т£А£МОВ.

Научная новизна, i»«.«.™«

шил« япп-»п»<-.~ " ""¿„J^.ol ici - иило»оот~ « "СЛ-Л/Г-.....- ¡ eO¡ рп-

;ичес!Г.!Х регионах. Предложен ускоренный вариант скрининга ггаммов P.pseudomallei на наличие в нехромосомных репликонов и 1тра5отан метод препаративного выделения плазмид возбудителя (елиоидоза, позволяющий проводить их молекулярно-биологическое гсследование. Впервые изучена взаимная гомология криптическкх иазмнд возбудителя мелиоидоза и гомология ДКК плазмид с ге-гомной ДНК близкородственных и гетерологичньк видов иикроорг«-мзмоа. На основе фрагмента крипгической плазмиды pPMl создал ■руппоспенифический гибридизационный ДНК-зонд для идентификации патогенных псевдсмонаа. Осуществлена передача плазмидкых ¡еплиданоз Р. pseudamalleí в Етачм Р.га!lei, определен плазмид-¡ый профиль и изучены отдельные фенотипические свойства Полуниных культур.

Практическая ценность.

Практическая ценность работы заключается в конструировании ■руппоспециф|{ческого ДНК-зонда, с помощью которого возможна иентификация патогенных псевдомонал от лпугкх представителей ода Psf'iido.'Donas методом молекулярной гибридизации, выявлении ¡азличных типов плазмид, которые исгут Сыть использованы ДЛЯ ■.арактеристихи стаммов и создания векторов для P.pseudomallei, i также получении набора штаммов патогенных псевдомонад, поз-галяввего изучать свойства плазмиднкх реплнконов возбудителя (елиоидоза.

Материалы диссертационной работы использованы при оформле-ми методических рекомендаций "Ускоренный метод обнаружения ¡лазмид в бактериях пода Psoudoronas", утвержденных 16 декабря зззг. директором Волгоградского НИПЧИ проф. Н.Г.Тихоновым: !етодических рекомендаций "Лабораторная диагностика, лечение и

- б -

профилактика мелиоидоза", утвержденных i ноября 1994г. зам. председателя Госкомсанэпиднадэора России Г.Г.Онгааенко.

Плазмвдный анализ и отработанная методика выделения внех-ромосомных репликонов P.pseudomallel используется в лабораториях Волгоградского НИПЧИ при изучении инсерционных мутантов и генетически измененных штаммов патогенных псевдомонад.

Положения, выносимые на защиту:

1. В штаммах P.pseudomallel выявлены внехромосоын^-- репли-коны различного размера, что открывает возможность использования пдазмидного анализа для внутривидового типирования итаммов возбудителя мелиоидоза.

2. Идентичные по размеру и рестрикционному профилю плазми-ды обнаружены в штаммах P.pseudomallel, выделенных в различных географических регионах.

3. Плазмиды возбудителя мелиоидоза обладают взаимной ксш-лементарностью и гомологией к ДНК P.pseudomallei, P.mallei и P. cepacia.

4. Сконструирован рекомбинантный фаг М13РМ, содержащий фрагмент критической плазмиды рРШ, который может быть использован в качестве продуцента группоспецкфического ДНК-зонда для идентификации P.pseudomallel и P.mallei.

5. Штаммы возбудителя сапа являются реципиентами критических плазмид P.pseudomallel, пригодными для изучения структурной организации и функциональной значимости плазмидных репликонов возбудителя мелиоидоза.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ (Волгоград, 1990, 1991, 1993), на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992).

По материалам диссертации опубликовано б научных статей.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 169 источников, в том числе 86 отечественных и 83 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 24 рисунками.

- ? -

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и .методы. В данном разделе диссертации содержится описание испальзованках а работе штаммов P.pseudocalîei, P.mallet, P.cepacia. P.fluoresceins, P.maltophllla P.putida. P. aeruginosa и E.coli. Приведены питательные среды и условия культивирования микроорганизмов, препараты и способы их применения.

Для выделения геномной ДНК использовали модифицированный метод Мармура. Скришшг штамипп „„«.г«"" "

ы^»»"»"1 "!!'. г*о .:. <. í va и н Gas-

ee. г. viy/'j; с собственными модификациями. Для препаративного выделения ДНК мелиоидозных плазмид использовали модифицированную методику Casse (1S79).

Докорные атаммы E.coli для размножения фага М13 культивировали на минимальной среде М9 без пролина. Для накопления фага М13 использовали жидкую среду 2х TY. 8 качестве селективных агентов в среды добавляли антибиотики: ампишшшн , тетг-п"-:-лин и стр^птс^тапг s необходимых для каждого штамма концентрациях. Идя селекции рекембинанткых фаговых клонов к зерхне-wv агару добавляли кеутилизируемый субстрат XGAL и индуктор лак-тозного оа«-рока fPTG. Препаративное выделение оцЯНК фага Mis проводили согласно руководству (.Messing J. 1G83).

Трансформация клеток кизечной палочки, подготовку нитро-цедлшозакх фильтров для зьгпериме.чтов по гибридизации, ферментативные реакции. электрофоре? в агарозном геле и выделение Фрагм-нтсз ДНК из игдрозного геля осуществляли по общепринятым методикам.

%кктрифореграммы сканировали на денситометре G3-30Q/CCC ("НоеГег"). Запись денситограчм осуществляли с помощью коммерческого пакета программ Scan GS 360 ("Hoefer") на компьютере класса PC/XT. Дальнейшая обработка и анализ данных оптического сканирования проводилась по алгоритму, разработанному в лаборатории. на основе собственных и коммерческих программ. В качестве маркеров для определений размеров фрагментов и молекулярных масс плззмкд использовали HindiII - рестрикционкые Фрагменты фага лямбда.

в -

Одноцепочечный зонд, полученный на основе нитеввдногфага UlânplS метили двумя различными методами: с использованием гкбркдизационного и секвенационного праймеров (Мааин A.B. и др. 1990). В работе использовали меченые нуклеотиды 32-Р dNTP производства объединения "Изотоп" (Ташкент) и немеченые dNTP ("Serva"), a Tarase ДНК-пояимеразу I НПО "Фермент" (Вильнюс).

Реакцию ДНК-ДНК гибридизации проводили в гибридизационной смеси при температуре 42°С с использованием 502 форма\гида и в условиях жесткой отмывки фильтров. После гибридизации фильтры экспонировали в кассете с рентгеновской пленкой в течении Z суток. Наличие гиОридизационного связывания зонда оценивали по засвечиванию пленки в месте нанесения пятна соответствующего препарата тотальной ДНК исследуемого штамма.

Коныэгашгаяные скрещивания проводили на поверхности F-агара, используя фильтры "Владилор N4", в условиях, оптимальных для переноса плазмиды RP4. Мобилизацию критических плазмид осуществляли в системе трехродительских скрещивании по методу, предложенному U. David (1981).

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) определяли методом двукратных серийных разведений в бульоне. Суспензию клеток всех штаммов (104/мл ) готовили из суточной агаровой культуры.

Вирулентность исследуемых культур определяли на золотистых хомячках, которые наиболее чувствительны к возбудителю медиои-доза. Животных заражали суспензией суточной агаровой культуры подкожно, в область внутренней поверхности бедра. ДД50 рассчитывали по методу Кербера. Зараженных животных наблюдали в течение месяца, после чего их забивали и внутренние органы высевали на плотные питательные среды. В процессе наблюдения павших животных вскрывали, высевая внутренние органы на пластинки питательного агара для подтверждения специфичности инфекции. Все манипуляции с животными проводились согласно Санитарным правилам работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности.

Результаты исследования и ах

обсуждение.

Эффективность плазмидного анализа во многом зависит от выбранного метода выделения плазаидных ДНК, имеющего свои особенности лля каждого конкретного вида микроорганизма. В основе большинства существующих методик выделения внехромосомных реп-ликоноз из бактериалыгых клеток лежит принцип избиачтотп-u^.i щелочной денатупяпи« да »«rrrüT от.".?

ей кййн.«»нтч? Кольцовых молекул плазыкдной

ДНК (Харди К. 1989).

Ранее при выделении плазмидных репликонов из штаммов возбудителя мелиоидоза методом, предложенным С. I. Kado СЛ., S.T.Llu (1981), удалось обнаружить плазмиду в штамме P.pseudo-nallel ВКМ-900, обозначенную как pFWl (Петере М.К. 1982).

Однако, предложенная методика, дающая четкую идентификацию плазмид. содержащихся в ита.'.мах Е.coli и. з отдельных случаях, s етакмах псевдомонад, а целом не обеспечивала достаточной воспроизводимости результатов при работе с культурами Р. pseu-lomallei.

Высокомолекулярные плазмизы при использовании рутинных методов выделения были обнаружены только в единичных итаммах возбудителя мелиоидоза, что потребовало от нас дополнительных исследований по подработке методик выделения плазмидных ДНК из э.pseudomall ei. В связи с этим, метод щелочной экстракции ДНК, 5ыл дополнен модификациями, которые позволили оптимизироря.-гь троцедуру выделения ДНК из ыта«мов возбудителя ме-

зисидоза.

Учитывая, что работа проводилась с возбудителем особо опасного инфекционного заболевания, выращивание исследуемых «ультур проводили на плотных питательных средах, что позволило юключить этап центрифугирования заразного материала и уменьшить время на проведение исследования.

8 качестве питательной основы для культивирования втаммов '.pseudomallet была предложена среда, приготовленная на основе :ердечно-чозгс2сго перевара (SHI,"Difco").

Результаты исследования показали, что для эффективного вычленил плазмидиой ДНК длительность культивирования не должна

превышать 24 часов. Использование более поздних культур приводило к морфологической диссоциации колоний возбудителя мелиоидоза и ухудшению лизиса бактериальных клеток, что, в конечном итоге, сказывалось на выделении плаамидной ДНК и качестве электрофореза.

Существенным моментом являлся исходный обьем и плотность бактериальной взвеси в .визирующем растворе. В целях стандартизации механических воздействий при скрининге штаммов возбудителя мелиоедоза и препаративного выделения плаамидной ДНК для перемешивания лизата использовали магнитную мешалку.

При выделении высокомолекулярных плазмид из штаммов Р.рзе-ис1апа11е1 воспроизводимость результатов была связана главным образом с этапом фенол-хлороформбной обработки лизата. В связи с этим, указанный этап бьц заменен процедурой нейтрализации лизата 2М раствором Тг1з-НС1 (рН 8,0). Пробы для электрофореза отбирали после депротеинизации и обработки лизата клеток смесью хлороформ - изоамиловый спирт (24:1). После этого этапа препарат являлся обеззараженным и работа с ним проводилась как с незаразным материалом. В процессе работы были определены оптимальные условия лизиса, депротеинизации и нейтрализации лизата, что позволило стабилизировать условия выделения плаамидной ДНК и увеличить эффективность выявления высокомолекулярных решшконов Р.рзеисЗошаПе!.

Внесенные модификации способствовали оптимизации метода щелочной денатурации при проведении плаамидного анализа музейных штачаюв воабудителя мелиоидоза. хранящихся в коллекционном центре ВолгНИПЧИ, а также полученных в процессе работы изоген-ных по плазмидному составу штаммов и инсерционных мутантов патогенных псевдомонад.

При изучении плазмидного спектра 32 штаммов Р.рэеисЗотаНе! плазмидные репликоны были выявлены в 30 штаммах возбудителя мелиоидоза. В процессе исследования обнаружено 4 типа плазмид, отличающихся по электрофоретической подвижности. Плазмиды были обозначены рРШ, рСМ2, рСМЗ и рСМ4.

С помощью рестрикционного анализа были определены размеры плазмид, обнаруженных в различных штаммах Р.рзеисЫаИе! и подтверждено разделение плазмид на различные типы по электрофоретической подвижности. Показано, что плазмидные репликоны

- ti -

одного размера независимо от места н времени выделения пгггасчЭи возбудителя узлиоидоаа образуют идентичные профили рестрикции.

5 11 ста«*: lk ?.pseudo¡nal!eí была выявлена олазмнда рСМ2. размером 4á,5 т.п.н., в 10 стаммзх - плазмидная ДНК рСКВ. размером lf.S т. п. к. Плазмиду. выявляемую pafíee только в стамме P.pseudomallei ВКМ-900, обнаружили в 5 нггамччх тозбудителя ме-лиокдоза. Е'тачм Р. pseucícmileí по. содержал высокомолекулярную плазмиду, размером 160 т.п.н.. обозначенную рСМ4. У отдельных штаммов возбудителя меллоидоза выявлялось пл по-.

UHTTHI-'V г.^гт ш»омм г» "lid ICS Unlit-""*3-* TJ1ZZ.

««»и rJ" Г, .-íi-—¡л pseiularollei 133 наряду с плазми-

дой рОУЗ, выявлялась плазмидная ДНК pFMl, размером 13 т.п.н.

При скринкровании штаммов P.pseudonallel 97, 93, 103, 57562, 57582 были обнаружены плазмиды с относительно низкой электрофоретической подвижностью, однако выделить плазмидную ДНК в препаративных количествах из них не удалось.

В процессе работы корреляции между устойчивостью к антибиотикам, вирулентностью и наличием плазмид у исследуемых атам-моз Р.pseaciorr.alleí не было обнаружено.

Идентичные по размеру плазмидные ДНК были обнаружены в вт&ммах, выделенных в различных географических регионах. В тс же время, лтаммы одного географического региона содержали различные плазмиднне репликош;, отличзюэдеся по размеру и рест-рикционному спектру.

Плазмидная ДНК рС!>'2 встречалась з штаммах возбудителя мели-оидоза всех географических регионов. Илазмида pRvíl была обнаружена в отдельных штатах возбудителя, выделенных в Таиланде, Вьетнаме и двстрат::;:. Плазмида рСМЗ, выявлялась в штаммах, выделенных как е Австралии так и Таиланде, т.е. территориально не связанных и удаленных друг от друга географических зонах. Плазмидная ДНК рСМ4 была уникальна, так как обнаружена только в одном штамме P.pseudcmallei 110, выделенном а Австралии. Следует отметить, что в штаммах, выделенных во Вьетнаме и хранящихся длительное вреда в музейных условиях (более 20 дет), отсутствовали плазмкды рСМЗ и рСМ4 (Табл. !).

Таблиц-. I

Пдазмидный состав штаммов Р.рзеис1ота11е1, выделенных в различных географических регионах

I-1---1-1

I | Наличке пдазмид I

Штаммы | Место выделения, год |-\-1-(-|

I | рРШ | рСМ2| рСМЗ| пСШ 1

-1_1_I_I_1___I

56770 Вьетнам н - + - -

56812 и - + - -

56830 н - + - -

59214 ___ ««_ и - + - -

59437 н - + - -

60263 н - + - -

60806 н - + - -

60913 к + - - -

611083 н - + - -

98 Нет данных - + - г

100 Нет данных - + -

110 Австралия 1981 - - +

111 1981 - + -

114 1981 + - - -

118 в и 1981 - - + -

128 Нет данных - - + -

129 Нет данных - - + -

130 Нет данных - - + -

132 Таиланд 1986 - - + -

133 1986 + + ■ - -

134 1986 - - + -

136 1986 - - +

139 1986 - + +

ВКМ-900 Нет данных + - - -

ССЕВ-860 — О— ■+ - - -

Примечание: н - нет данных. Штаммы получены из Ростовского НИПЧИ в 1972 г.; (+) - наличие плаз «иды в исследуемом штамме, (-) - отсутствие плаамиды

Исследуемые плазмиды сохранялись в штамма:-: P.pseudomailel после многократных пересевов на плотных питательных средам. Тот факт, что плазмиды выявлялись в штаммах, которые длительное время хранились в условиях музея (более ю лет) к пассировались на плотшэг питательных средах в отсутствие селективных условий, указывает на стабильное наследование алаамид Р.Pseudoallel.

Наличие iuia-w у Г.^ш«»!"" "rt"™; цй«лппг*»«г; --„ > и молеку-'ярно-Окологичес-

ких исследований на модели возбудителя мелиоидоза. Выявление плазмид различной молекулярной массы открывает возможность их использования в качестве маркеров для внутривидового титрования P.pseudomallel. в то же время, обнаружение идентичных плазмид, которые стабильно наследовались в штаммах возбудителя мелиоидоза, выделенных в различных географических регионах, может свидетельствовать о возможном значении плазмиднкх репли-iX'KG» для реализации существенных, видовых свойств P.pseudomal-lel. Наиболыий интерес представляет плазмида рСУ2, которая была обнаружена з отдельных штаммах возбудителя мелиоидоза всех представленных географических регионов.

Для установления биологических особенностей плазмид и кх эволюционной близости к возможному кругу хозяев, важлое значение играют знания о гомологии нуклестндных последовательностей плазмидкых репликонов с геномной ДНК вида, из которого получены плазмиды, и с хромосомной ДНК близкородственных и гетереле-гичных вилок микроорганизмов. Исходя из ятого, нами был проведен ряд экспериментов по ДНК-ДНК гибридизации. Наткьные препараты ДНК ллазмид метили в реакции кик-трансляции. ДНК-гибридизацию проводили с фиксированными на НЦ фильтрах плазмидными ДНК исследуемых штаммов P.pseudomallei и ДНК плазмлд, выделенных из гетерелогичных видов микроорганизмов.

в процессе исследований было выявлено, что все исследуемые криптические плазмкдк, выделенные из штаммов P.pseudcwallei ССЕВ-860 ( pPMl). Ill (pQß). 130 (рСМЗ) и iiü (PCM4), обладали взаимной гомологией. Не было отмечено гибридизацконнного связывания с плазмидными ДНК, выделенными из штаммов гетероло-гичных видов бактерий.

Наличие взаимной гомологии плазмидкых решшконов P. pseudo-mallei и отсутствие таковой с плазмвдачи. выделенными из штаммов гетерологичных видов микробов, подтвердило генетическое родство исследуемых мелиоидозных плазмид, выделенных из различных штаммов возбудителя.

При проведении ДНК-ДНК гибридизации данных плазмид с геномными ДНК различных штаммов P.pseudomallei, близкородственных псевдомонад и других гетеродогичных видов микроорганизмов, было установлено, что все исследуемые плазмидные репляконы обладали выраженной гомологией с геномными ДНК штаммов P. pseudo-mallei и P.mallei. Сигнал радиоавтографа с ДНК штаммов P.cepacia был меньшей интенсивности. Следовательно, можно предположить, что плазмидные ДНК возбудителя мелиоидоза имеют с ДНК P.cepacia менее протяженные гомологичные последовательности. Не было выявлено гомологии с ДНК гетерологичных видов микробов: бацилл, кишечной палочки и в том числе псевдомонад, не входящих в соответствии с классификацией N.G.Palleroni (1984) в группу P.pseudomallel - cepacia (P.aeruginosa. P.putida, P.maltophllia).

Известно, что хромосомная ДНК P.pseudomallel гкбридизуется только с геномной ДНК штаммов P.pseudomallel, P.mallei, и P. cepacia. Не отмечено гибридизации ДНК с другими представителями рода Pseudomonas и гетерологичными микроорганизмами (Ro-gul М. 1970, Ballard R.W. 1970, Palleroni N.J. 1984). Плазмидные ДНК, обнаруженные у возбудителя мелиоидоза. в реакциях гибридизации проявляли себя также, как и хромосомная ДНК P.pseudomallei. Это с одной стороны подтверждает генетическое родство данных микроорганизмов, а с другой стороны позволяет сделать предположение, что плазмидные репликоны, выявленные у возбудителя мелиоидоза, обладают филогенетической близостью с геномной ДНК P.pseudomallei.

Из всех исследуемых решшконов P.pseudomallei, глазмида рШ1 имеет наименьший размер и ее более просто выделить в препаративных количествах. Это позволило нам определить дальнейшую тактику по конструированию ДНК-аовда для идентификации патогенных псевдомонад. В ее основу было положено определение гомологии рестрикционных фрагментов исследуемой плазмиды с геномной ДНК гомологичных и гетерологичных видов микроорганиамов

и клонирование данных фрагментов в составе векторных решгико-ноз. В результате исследований было выявлено, что все SalGI фрагменты плазмиды рРМ1 обладали гомологией с ДНК P. pseudomal-lei, P.mallei • и P.cepacia, входящими в одну группу рРНК-ДНК гибридизации (Palleronl N.J. 1984).

При конструировании ДНК-зонда, необходимым условием, наряду со специфичностью, является его незначительный размер. Поэтому SalG I - фрагмент плазмиды pR.il, имеющий наименьший пая-Мер (400 п.Н.), был KJOHirnnno» - zi^ioaa . ^

"ICUäö. »«таучсвйЛ шж»«бяяггптнц5 обозначенный ШЗВ4. кмаощиа з ссоем составе искомый фрагмент плазмиды pFWl, в дальнейшей работе использовался в качестве продуцента группос-пецифического ДНК-зонда для идентификации патогенных псевдоыо-над. Использование рекомбинантяого фага M1SFM в реакции ДНК-ДНК гибридизации позволило исключить этап работы с заразным материалом при подготовке молекулярного ДНК-зонда, упростить процедуру его накопления и увеличить эффективностью внесения радиоактивной метки.

Для изучения плазмид, наряду со сведениями об их размере, физической структуре и гомологии нуклеотидных последовательностей, ватаое значение имеют знания о возможности их передачи в реципиенткке штаммы, которые не обладают такими плазмидами. Осуществление передачи плазищных ДНК в гетерологичные виды бактерий позволяет не только выявить вероятный круг хозяев, определить способность к поддержанию в них, но и установить функциональную значимость плазмид с неустановленным фенотипом.

Несмотря на приролну» компетентность возбудителя иелисидо-за, трансформация не мотет служить эффективным методом переноса плазмид P.pseudomallel, в связи с отсутствием известных селективных маркеров для отбора клонов трансформантов, содержащих в своем составе крипгическне плазмиды.

В этом случае альтернативным методом передачи может служить мобилизация исследуемых репликонов. Особенностью возбудителя мелкоидоза является его природная устойчивость к целому ряду антибиотиков, что определило необходимость тщательного подбора декорных и реципиентных штаммов, а также условий селекции при выборе мобилизующих плазмид. Эффективное применение метода мобилизации неконьюгативных репликонов RSF1010 и неко-

торых других плазмид Р-1 группы несовместимости, в том числе рекомбинантных ДНК. в штаммы патогенных псевдомонад было отмечено ранее (Анювенко М.А. 1992. Абаев И.В. 1995).

Для получения донорных штаммов P.pseudomallel ВКМ-900. 97, 130 и 139 методом конъюгации из штаммов E.coll передавали плазмвды RP1: :Тп10, R 388, R 245. рТНЮ, pRP19.6 и RPl-ts. Выбор данных плазмид был основан на том, что они коньюгативкы, обладают низкой хозяйской специфичностью и способны эффективно мобилизовать неконьюгативные репликоны. При использовании плазмиды RP1::ТпЮ предполагали, что последняя может быть использована в дальнейшем для маркирования плазмид возбудителя мелиоидоза путем включения в их состав транспоэона ТпЮ.

Попытки коньюгационной передачи в исследуемые штаммы возбудителя мелиоидоза плазмидных репликонов 1пс-Р1 группы рТНЮ, PRP19.6 и RPl-ts оказались безуспешными. Плаэмида R 245, принадлежащая к N-группе несовместимости, также не передавалась при коньюгационных скрещиваниях в анализируемые штаммы P.pseu-danallei. Известно, что штаммы возбудителя мелиоидоза в большей или меньшей степени способны участвовать в процессе бактериальной конъюгации, воспринимать и наследовать различные R-плазмкды (Петере М.К. 1983, Абаев И.В. 1995). В то же время нави результаты не противоречат данным ряда авторов, которые подчеркивали штаммовые различия возбудителя мелиоидоза в способности воспринимать плазмиды лекарственной устойчивости (Анищенко М.А. 1992, Сеимова К.К. 1988).

Плазмида RPl::Tnl0 была передана в штаммы возбудителя мелиоидоза ВШ-900, 130, 133. а мобилизующая плазмида R 388 -только в штаммы P.pseudomallel 130 и 139. Все переданные плазмиды сохраняли фенотип резистентности к антибиотикам в новом хозяине. При сохранении маркера антибиотикоустойчивости к три-иетоприму. по которому проводили отбор клонов P.pseudomallel, в штаммах P.pseudomallel 130 и 139 был обнаружен делеционкый вариант плазмиды R 388. обозначенный R 388del.

Дальнейшее хранение полученных культур на питательных средах без селективного давления антибиотиков не приводило к элиминации воспринимаемых плазмид, которые стабильно поддержива-. лись в штаммах P.pseudomallel.

С целью передачи криптических плазмид P. pseudocallel в ге-терологичные виды микроорганизмов, полученные рекшбинаятные возбудителя мелиокдоза были использованы в качестве доноров плазмид при коныогацконных скрещиваниях с различными реципиентами штачмами Б.coli. P.aeruginosa и P.mallei.

При проведении коныогационных скрещиваний устойчивых к триметоприму клонов возбудителя мелиокдоза 130 (рСМЗ, R C88del) и P.pseudomallel 139 (рСМ2, dC!¿3 о »o^i; _ ^ü«...-

ентюлги ив^«----^ " 1Г1 "i nil" "

Z.CHii HZ "If, несудав! мутации резистентности к рифампици-ну, отсутствовала коньюгационная активность плазмиды R SSSdel, что возможно было связано со структурными изменениями данной плазмиды в птачыах P.pseudomallel. •

В процессе конъюгации устойчивых к тетрациклину клонов P.pseudomallel 130 (рСМЗ, RPl::Tnl0) и 139 (рСМ2, рСМЗ, . RPl::Tnl0) с клетками E.coll и P.aeruginosa, в траясконьгйлтах обнаруживали только мобилизующую плазмнду RPl::TnlO, а выявить варианты, содержащие криптические плазмиды P.pseudomallel не удало;ь.

Передача криптических плазмид рСМ2 и рСЗЛЗ в гетерологичный вид микроорганизма была осуществлена при использовали; в качестве реципиента Р.ял11е1 Ц4 Rlfr. Донорами плазмид в данных экспериментах являлись штаммы P.pseudomallel 130 (RPl::Tnl0, рСМЗ) н 139 (RP1:: TnlO, рQS2. рСМЗ).

Клоны трансконьюгантол, полученные в процессе скрещивания P.pseudomallel 130 (RPl::Tnl0, рСМЗ) и P.mallei "4 Rlr наряду с уоб'.{л::5укаС'Л плазмвдой содержали плазмицу рСМЗ. В тоже ?р-г-мя, в отдельных клонах выявлялась талька мобилизуемая плазмида рСМЗ, а мобилизующая плазмида RPl::Tnl0 не обнаруживалась.

При анализе клонов траксконьюгантов, полученных при скрег щиванки P.pseudomallel 139 (RP!::TnlO. рСМ2, рСМЗ) и Р.mal lei Ц4 Rífr, было показано, что мобилизушая плазмида RPl::TnlO присутствовала во всех исследуемых клонах. Среди клонов, устойчивых к тетрациклину, были выявлены клоны, содержащие в автономном состоянии плазмкды RPi::?nl0 и pCU3. В отдельных клонах трансконьюгантов были выявлены три плазмидпых репликона -RP1::Тп10, рСМ2 и рСМЗ. Траясконьвганты,' содержащие в СЕоем составе только криптическую плазмиду рСМ2 не были обнаружены.

Результаты межвидовых скрещиваний свидетельствуют о том, что возбудитель сапа может служить реципиентом критических плазмид возбудителя мелиоидоза рСМ2 и рСМЗ. для мобилизации которых в клетки Р. mal leí пригодна плазмида RPl::TnlO.

Для определения функциональной роли исследуемых плазмид возбудителя мелиоидоза, нами было проведено сравнительное изучение отдельных фенотипических свойств родительских штаммов р.mal lei и штаммов возбудителя сапа, полученных в процессе коньюгационных скрещиваний.

При изучении устойчивости к антибиотикам исследуемых штаммов возбудителя мелиоидоза, реципиентного штамма P.mallei Ц4 Rlfr и полученных в процессе коньюгационных скрещиваний тракс-коньюгантов, несущих криптические плазмиды P.pseudofnalleí, не было выявлено изменений в чувствительности данных трансконь-югантов к гентамицину, доксициклину, левсмицетину, стрептомицину и бисептолу. На этом основании было сделано предположение, что исследуемые криптические плазмиды возбудителя мелиоидоза не имеют в своем составе генов антибиотикорезистентности к перечисленному ряду антибиотиков.

Передача плазмиды RP1: :Тп10 в штаммы P.pseudomallel не оказывала какого-либо влияния на вирулентные свойства возбудителя. В то же время мобилизация плазмиды RPl::TalO в штамм P.trallei Ц4 Rífr приводила к утрате вирулентности реципиента. Так, если ДД50 исходного штамма Р.mallei Ц4 Rifr составляла для золотистых хомячков Ю2 м.к., то штамм P.mallei Д4 Rlfг (RP1: :ТпЮ) был авирулентным Ш50 > 10® м.к.).

Следует отметить тот факт, что трансконьюганты возбудителя сапа, содержащие наряду с плазмидой RP1 : : ТпЮ мелиоидозные плазмиды рСМ2 и рСМЗ, оставались вирулентными для золотистых хомячков - ДД50 штамма P.mallel Ц4 Rlfr (RPl::TnlO, рСМ2, рае) составляла 105 м.к.

Плазмидкый профиль данного штамма претерпевал изменения после пассажа на лабораторных животных. . Это было выявлено при анализе клонов, выделенных от павших животных, зараженных штаммом P.mallel Ц4 Rifr (RPl::TnlO, рСМ2, рСМЗ). В процессе работы обнаружена структурная перестройка плазмиды РСМ2, которая выражалась в уменьшении ее размера до 15 т.п.н. Делецион-ный вариант данной плазмиды был обозначен pCW-del. Дальнейшее

культивирование дачного штамма, обозначенного как p.nallei 1И Rifr (RP1: :TnlO, рСМЗ. pCM2-del), на плотных питательных средах не приводило к изменениям в его плазмидном составе. Плаз-мида pCM2-del стабильно сохранялась и поддерживалась в автономно« состоянии, наряду с плазмидачи КР1::Тп10 и рСМЗ.

Возбудители сапа и мелиоидоза являются тачсонсиически близкородственными микроорганизмами, однако данные возбудители отличаются друг от друга по поввпсвип » ^ ^„п«»™

Witîîtnî". С»«укгур-2я псрс-ст-криигическоа плазкзди рСЦ2 была отмечена при пассаяе 1п vivo только у штамма возбудителя сапа. Плазмкда EPI : : TnlO не оказывала существенного влияния на вирулентно свойства возбудителя мелиоидоза. В то же зре!й, передача данной плазмиды в штамм P.mallei Ц4 Rlfr приводила к полной утрате вирулентности. У штамма возбудителя сапа, в который наряду с плазмидой RP1::Тп10, были переданы криптические реплззюны P.pseucteRnJleí рСЗ.2 и рСМЗ, происходило частичное восстановление вирулентности P.mallei.

Таким образен, возможность передачи мэлиоидозных плазмид э штамм P.irai leí отбывает перспективу использования этего ?нда микроорганизма в качестве реципиентов криптичоских плазмид возбудителя медиовдоза. Полученный набор штаммов патегешпа псевдомонат, имеющих различный плазмкдный состав, мо:.:эт бчгь использован в дальнейших исследованиях, направленных ял изучение структурной а функциональной организации плазмид возбудителя мелиоидоза, которые ло ндстоящто остаются крип-тическимн.

На данном этапе р-зботи Сила осуществлена первичная характеристика плазмид P.pseudanallei и освещены лишь отдельные свойства выявленных плазмидных реплкконоз. Проведение нами исследования позволили выявить в штаммах возбудителя мелиоидоза плазмиднке репликоны с различной молекулярной массой. Стабильность наследования плазмид открнвазт зогмгхчость кх использования в качестве эпидемиологических маркера* для внутривидового тиякровакиа атаммов P.pssudoaalldi, з также для мовс-труирования на основе мелиоидозных плазмид векторов для P.pse-udonalîei и диагностических ДНК-зондов. Полученные дачные ио-гут являться основой для даль'нейпих генетических и колекуляр-

ко-биологических исследований, направленных на изучение структурной организации, природного носительства и закономерности выделения плазмид у P.pseudomallel.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены и охарактеризованы криптические плазмиды возбудителя мелиоидоза, обозначенные pFMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4, имеющие размер 13 т.п.н., 43,5 т.п.н., 160 т.п.н. и 168 т.п.н., соответственно. Плазмиды стабильно наследуются в процессе хранения и пассажей втаммов P.pseudomallel In vitro и in vivo, что открывает возможность использования плазмидного анализа для внутривидового типирования культур возбудителя мелиоидоза.

2. Установлено, что в штаммах P.pseudomallel, выделенных в различных, территориально не связанных географических регионах, содержатся идентичные по размеру и рестрикционному профили плазмиды. Это указывает на возможное значение внехромосом-ных репликонов для реализации существенных видовых свойств возбудителя мелиоидоза.

3. Плазмидные ДНК рРШ. рСМ2, рСМЗ и рСМ4 выделенные из различных штаммов возбудителя мелиоидоза обладают взаимной гомологией и комплементарностью с геномной ДНК P.pseudociallei, P.mallel й частично P.cepacia.

4. Показано, что сконструированный рекомбинантный фаг ШЗШ, имеющий в своем составе фрагмент крилтической плазмиды pFMl может быть использован в качестве продуцента группоспеци-фического ДНК-зонда для идентификации патогенных псевдомонад.

б. Осуществлена передача криптических плазмид P.pseudomal-leí рСМ2 и рСМЗ в штамм P.mallei Ц4 с помощью мобилизующей плазмиды RP1: :Тп10. При культивировании рекомбинаитного штамма на питательных средах плазмидные репликоны возбудителя мелиоидоза стабильно наследуются в данном микроорганизме. При пассат же данного штамма на болотистых хомячках происходит структурная перестройка репликона рСМ2, выражающаяся в уменьшении его размера от 43,5 т.п.н. до 15 т.п.н.

6. Передача плазмиды КР1::Тп10 в штамм P.mallei Ц4 приводит к утрате его вирулентности для золотистых хомячков. При-

сутствиз в трансконьюгантах, наряду с мобилизующей плазмидой RP1: :Тп10, мелиоидозных плазмид рСМ2 и рСМЗ обеспечивает частичное сохранение вирулентности, свидетельствующее об их опосредованном влиянии на данный процесс.

Список работ, опубликованных по темедиссертации.

1. . Ги*™»

W5TC rossi ¿ля илэдпфкзпии возбудителей сала и мелиоидоза. -Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. Тезисы докладов, 21-22 октября 1992 г., Волгоград, 1992, С. 143.

2. Антонов В.А., Тимошин В.Б. Использование рестрикционно-го анализа для изучения инсерционных мутантов возбудителя ме-лиоидоза. - Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. Тезисы докладов, 21 - 22 октября 1992 г., Волгоград.

1992, С. 8.

3. Антонов В.А., Тимошин В.Б. Метод схрияирсзаиия ига>люа Pseudomonas pseudotnallel и Pseudomonas mallei на наличие плаз-мид. - Информационный бюллетень, Саратов. 1993 - N 2.- С. £5.

4. Антонов В.А., Замараев B.C., Тимошин В.Б. Выявление гомологии нуклеоткдкых последовательностей фага М13 и генома возбудителя мелиоидоза. - Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опаг.я^х

болезней. Геаисы докладов научной конференция, Омск, октябрь

1993, Ставрополь. 1993, С. ]Пб - 167.

5. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К., Захарова И. Б. Изучение криптических плазмид возбудителя мелиоидоза.т Информационный бюллетень, Саратов, 1994 - N 3.- С.32.

6. Илюхин В.И., Агеева Н.П., Антонов В.А.. Ватманов 8.П.. Будченко A.A., Дунаев Г.С., Замараев B.C.. Замарин А.Е., Ларионов Г.М., Пиьень H.H.. Яковлев А.Т., Гришина Т.А. Лабораторная диагностика, лечение к профилактика нелиокдова. // Mesae-домственкый научный совет по санитарно-эпидемиологической охране территории FQ. Информ. бюлл. - Саратов, 1994. - С.30.